ES2942657T3 - Un método para el desarrollo de anticuerpos monoclonales - Google Patents
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Abstract
Esta invención proporciona un método y un kit para el desarrollo rápido y robusto de anticuerpos monoclonales. El método no requiere tecnologías híbridas ni requiere manipulaciones de células individuales. El método permite la eliminación de anticuerpos cruzados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Un método para el desarrollo de anticuerpos monoclonales
Campo de la invención
Esta invención se refiere a métodos y kits para desarrollar anticuerpos monoclonales específicamente adecuados para la producción recombinante en sistemas de células de mamíferos.
Antecedentes
El desarrollo de anticuerpos monoclonales que se puedan producir de forma recombinante en cultivos de células de mamíferos tiene un objetivo de alta prioridad en las áreas médicas y de investigación. La etapa crucial en este proceso es la determinación de las secuencias de los dominios de unión al antígeno de los anticuerpos con las propiedades deseadas. Se describen muchas técnicas diferentes para esto, pero estas técnicas también tienen deficiencias relacionadas con el consumo de tiempo, el costo o la eficiencia de la producción de secuencias. Por esta razón existe la necesidad de un método robusto, rápido, económico y flexible para el desarrollo de anticuerpos monoclonales adecuados para la producción en fábricas de células de mamíferos.
Generalmente, los anticuerpos monoclonales (MAb) son producidos por células inmunitarias idénticas y tienen afinidad monovalente o monoespecífica: se unen al mismo epítopo. Sin embargo, hay anticuerpos, que son producidos por células inmunitarias no idénticas completamente diferentes, que se unen al mismo epítopo. La alta afinidad y la unión selectiva de los MAb a sus antígenos los hacen muy potentes para su uso en bioquímica, biología molecular y medicina.
Históricamente, el primer método para el aislamiento de anticuerpos monoclonales fue la tecnología de hibridomas. Esta tecnología se basa en la formación de líneas celulares híbridas (hibridomas) mediante la fusión de células B productoras de anticuerpos con una célula de mieloma. Los anticuerpos producidos por el clon de hibridoma particular son todos de una única especificidad. Por tanto, los clones individuales se criban para la identificación del anticuerpo con las propiedades deseadas. Sin embargo, la producción de los MAb por tecnología de hibridoma también tiene algunas deficiencias: el proceso necesita un tiempo relativamente largo (hasta varios meses) y presenta complicaciones si se aplica a organismos distintos de las especies murinas. Además, el método no pone directamente a disposición ninguna información sobre la secuencia del anticuerpo. Por tanto, cuando el anticuerpo cribado de hibridoma se selecciona para un mayor desarrollo (por ejemplo, para desarrollar productos terapéuticos), los dominios variables de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) que juntos determinan las propiedades de unión al antígeno del anticuerpo deben aislarse de las células de hibridoma y secuenciarse. En última instancia, se necesitan datos de secuencia para la producción recombinante del producto del MAb final, así como también para mejoras, como humanización, conversión de isotipos, maduración por afinidad, etc.
Por el contrario, las tecnologías de aislamiento de anticuerpos recombinantes normalmente no incluyen la etapa de la línea celular híbrida, sino que implican la obtención de secuencias de dominio VH y VL a partir de células de origen que expresan anticuerpos (por ejemplo, células B del bazo, médula ósea o sangre). Comúnmente, los ADNc de VH y VLse amplifican a través de la p CR-Tr mediante el uso de ARNm aislado de las células. Mediante estrategias basadas en bibliotecas combinatorias, se amplifica un gran repertorio de diferentes secuencias de VH y VL a partir de la población de células (por ejemplo, millones de células B aisladas de animales inmunizados). Posteriormente, los productos amplificados se usan para la construcción de bibliotecas combinatorias mediante el emparejamiento aleatorio de dominios VH y VL. Por tanto, las estrategias combinatorias implican necesariamente la etapa de selección para el cribado de los anticuerpos (combinaciones de VH y VL) con las propiedades deseadas de grandes bibliotecas. Estos métodos de cribado implican técnicas de visualización de anticuerpos in vitro, tales como la visualización de fagos y la visualización de ribosomas, así como también de plataformas de visualización in vivo, tales como bacterias, levaduras y, recientemente, también cribados de superficie de células de mamíferos. La presentación de células de mamífero tiene una serie de características que son ventajosas para seleccionar anticuerpos para la producción recombinante. Por ejemplo, mediante el uso de células de mamífero para el cribado se garantiza que más tarde no habrá pérdida de actividad del MAb cuando el anticuerpo se produzca como una molécula de IgG natural modificada postraduccionalmente en células de mamífero. La pérdida de actividad es una complicación que a veces se asocia con los MAb cribados en sistemas de presentación de fagos, bacterias e incluso levaduras. En cambio, realizar el cribado en células de mamífero garantiza que el anticuerpo activo recuperado se sintetice, modifique, ensamble y secrete a través de las vías celulares de mamífero auténticas.
Los métodos recombinantes también incluyen estrategias no combinatorias que se basan en la recuperación de secuencias de anticuerpos de células B únicas o una progenie expandida clonalmente de una sola célula. De esta forma, los pares originales de cadenas ligeras y pesadas se mantienen juntos durante el proceso de desarrollo. Esto puede lograrse mediante la amplificación del ADNc de la región VH y VL reorganizados de una célula B particular mediante métodos basados en la PCR-TR de una sola célula técnicamente desafiantes. También las células B individuales aisladas pueden amplificarse en cultivo celular. Los métodos incluyen la inmortalización de las células B diferenciadas, por ejemplo, mediante el uso del virus de Epstein-Barr (EBV), oncogenes retrovirales, ligandos TLR o
cultivo en condiciones específicas con células de timoma irradiadas o usando tratamiento con IL4 y activación de CD40. Además, se desarrollan técnicas para facilitar o aumentar la eficiencia de las estrategias no combinatorias, por ejemplo, mediante el enriquecimiento de las células B fuente que expresan los anticuerpos con la afinidad deseada. Por ejemplo, se ha usado la captura de linfocitos (selección) en la superficie recubierta de antígeno para el establecimiento de cultivos de células B retenidas que se usaron como fuente de secuencias VH y VL. Se han usado métodos de clasificación basados en fluorescencia o ensayo de chip de matriz de micropocillos para la identificación y el aislamiento de células que secretan anticuerpos con las propiedades deseadas. Sin embargo, todos los métodos no combinatorios implican manipulaciones unicelulares complicadas y/o el establecimiento de cultivos celulares primarios estériles a partir de materiales biológicos, equipos especializados y suplementos costosos.
Por ejemplo, Lightwood DJ y otros (2006, Journal of Immunological Methods vol 316, núm. 1-2, páginas 133 - 143) describen un método para la generación de anticuerpos monoclonales de alta afinidad, que combina el poder de las respuestas inmunitarias naturales con selección in vitro, cultivo de células B, PCR-TR y expresión del producto recombinante.
Los métodos y el kit que se describen más abajo proporcionan soluciones a las deficiencias de las tecnologías actualmente existentes.
Resumen
Aquí se describe una nueva tecnología para el desarrollo de anticuerpos monoclonales. El método combina elementos de estrategias combinatorias y no combinatorias y el cribado se realiza mediante el uso de células de mamífero. El método tiene características únicas que permiten una alta tasa de recuperación de los anticuerpos desarrollados. El método es universal y aplicable a cualquier especie para la que esté disponible la información de la secuencia del anticuerpo para diseñar los cebadores para la amplificación del ADNc de VH y VL. La propiedad clave de la tecnología es un flujo de trabajo rápido y sólido: se tarda aproximadamente 10 días desde la recolección del material de origen hasta la información de la secuencia, y no necesita el establecimiento de cultivos de células B estériles, manipulaciones de células individuales o materiales especializados. Adicionalmente, el método puede incluir opcionalmente una etapa de selección negativa para eliminar el aislamiento de anticuerpos dirigidos a dianas no deseadas.
La tecnología se ilustra aquí mediante ejemplos detallados de recuperación de secuencias de anticuerpos monoclonales de ratón, conejo y pollo de animales inmunizados. Se muestra que los anticuerpos son funcionales en diferentes inmunoensayos, como ELISA, inmunofluorescencia e inmunotransferencia. Además, el ejemplo específico ilustra la modificación opcional del método mediante la etapa de selección negativa usada para evitar la recuperación de anticuerpos dirigidos a dianas no deseadas.
Es un objeto de esta invención proporcionar un método rápido y robusto para desarrollar anticuerpos monoclonales.
Es un objeto de esta descripción proporcionar un método para desarrollar anticuerpos monoclonales, dicho método comprende las etapas de:
a) Capturar las células de origen que expresan anticuerpos específicos de antígeno en una matriz sólida cubierta con el antígeno;
b) Amplificar el ADNc de cadena pesada variable (VH) y cadena ligera variable (VL) de las células capturadas; c) Construir una biblioteca combinatoria de VH-VL en un vector de expresión de mamífero; e
d) Identificar combinaciones apropiadas de VH-VL mediante el uso de un cribado de mamíferos.
e) Construcción de un anticuerpo monoclonal auténtico a partir de las secuencias amplificadas de VH y VL f) Identificar el anticuerpo específico de la diana adecuado expresado a partir de las células de mamífero mediante el uso del cribado de mamíferos
Es otro objeto de esta descripción proporcionar un método para desarrollar anticuerpos monoclonales en donde las células de origen son células de bazo del homogeneizado crudo de bazo de un animal inmunizado. Las células de origen también pueden ser células de médula ósea o de sangre periférica.
Es otro objeto de esta descripción proporcionar un método para desarrollar anticuerpos neutralizantes de virus monoclonales. Los anticuerpos pueden ser contra el VPH, el Ébola, el Chikunguña o el VIH.
Otro objeto más de esta descripción es proporcionar un método para producir anticuerpos monoclonales, en donde después de identificar un anticuerpo específico diana expresado a partir de una célula de mamífero, las células de mamífero se cultivan a gran escala para la producción de anticuerpos.
Es un objeto adicional de esta descripción proporcionar un método para producir anticuerpos monoclonales donde los anticuerpos están libres de afinidad de la diana no deseada.
Otro objeto más de esta descripción es proporcionar un método para producir anticuerpos monoclonales para uso terapéutico, producción de vacunas, especialmente para vacunas contra infecciones virales.
Otro objeto más de esta descripción es proporcionar anticuerpos monoclonales producidos por el método descrito en la presente descripción.
Es un aspecto adicional de esta descripción proporcionar un kit para desarrollar anticuerpos de acuerdo con esta descripción.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Flujo de trabajo general del método HybriFree. Las etapas clave incluyen: (ETAPA 1) el enriquecimiento del material de origen mediante la captura de productores de anticuerpos específicos; (ETAPA 2) amplificación del ADNc de VH y VL, (ETAPA 3) construcción de biblioteca combinatoria de v H-VL en formato de ADN de plásmido de expresión de scFv-Fc (o IgG) y (ETAPA 4) cribado de combinaciones adecuadas de VH-VL después de la expresión de los MAb en células de mamíferos.
Figura 2. Amplificación de los ADNc de VH y VL de las células de bazo capturadas en la superficie recubierta de antígeno. Los ADNc se prepararon a partir de células capturadas en la superficie recubierta de antígeno (+) y a partir de pocillos de control recubiertos con BSA(-). A. Esplenocitos de pollo inmunizados con proteína Dnasa I humana B. Homogeneizado de bazo de ratón aislado después de la inmunización con proteína de artemina humana. C. Homogeneizado de bazo de conejo inmunizado con proteína de fusión GST-E2C.
Figura 3. Análisis ELISA ilustrativos de bibliotecas de anticuerpos scFv construidas. A-C. Los gráficos representan los resultados de ELISA obtenidos mediante el uso de diluciones en serie de sobrenadantes de 72 horas en un punto temporal de células CHOEBNALT85 transfectadas con 1 |jg de ADN de grupos de bibliotecas HybriFree construidas a partir de las regiones VH y VL (que se muestran en la figura 2) amplificadas a partir de células capturadas: pollo inmunizado con Dnasa humana I A); ratón inmunizado con artemina humana (B) y conejo inmunizado con proteína GST-E2C (C). El vector de expresión para el vector scFv-Fc no relevante se usó como control negativo en cada transfección. D. Los resultados del cribado de un solo clon del grupo de biblioteca de VH1 se muestran en el panel C. Los pocillos G12 y H12 se transfectaron con el grupo de biblioteca o el ADN de control negativo, respectivamente.
Figura 4. Cribado de moléculas de IgG naturales. A. El vector IgG pQMCF se construye mediante el uso de la unión CPEC de una sola etapa de 4 fragmentos: VH, VL, promotores/líderes y vector. Las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se expresan a partir del vector resultante como proteínas separadas que se ensamblan en moléculas de IgG naturales secretadas por las células de mamífero. B. Análisis de inmunotransferencia de la secreción de IgG de conejo a partir de células CHOEBNALT85 transfectadas con el ADN del grupo de biblioteca de IgG pQMCF construido a partir de regiones VH y VL de conejo inmunizado con proteína CD48 de ratón. El vector IgG pQMCF usado contenía regiones constantes de IgG de conejo. El anticuerpo policlonal de cabra contra la cadena pesada de IgG de conejo se usó para la detección de la cadena pesada libre en condiciones de muestra reducidas (DTT+) y la molécula de IgG ensamblada en una muestra no reducida (DTT-). C. Resultados de ELISA de CD48 de ratón obtenidos mediante el uso de las diluciones en serie de la misma muestra de medio de la transfección del grupo de biblioteca como anticuerpo primario.
Figura 5. Desarrollo selectivo de anticuerpos no reactivos cruzados mediante el uso de la etapa de preadsorción. A. Alineación global de secuencias de proteínas maduras de ribonucleasa humana 8 (R8, UniProt ID: Q8TDE3) (SEQ ID NO: 1) y ribonucleasa 7 (R7, UniProt ID: Q9H1E1). B. Resultado del ensayo ELISA obtenido mediante el uso de sobrenadantes de células CHOEBNALT85 transfectadas con 1 jg de ADN de grupo de biblioteca derivado de esplenocitos capturados sin etapa de preadsorción. C. El mismo ensayo ELISA, pero el grupo de biblioteca procedía de esplenocitos capturados con la etapa de preadsorción mediante el uso de la proteína R7 (100 jg/ml). D. Representación del porcentaje de clones de scFv-Fc reactivos con R7 (R7+), reactivos con R8 y solo reactivos con R8 (R8+/R7-) recuperados de la biblioteca preadsorbida y de control, respectivamente.
Figura 6. A. El MAb derivado de conejo inmunizado con VLP del virus del Ébola funciona como reactivo sensible y selectivo para la visualización de la expresión (verde) de la glicoproteína (GP) del virus del Ébola en células humanas mediante inmunofluorescencia. Los núcleos se contrastan con DAPI (azul). B. Los anticuerpos IgY anti-Dnasa I humana se reconstruyeron a partir de secuencias de MAb desarrolladas a partir de pollo. Estos se produjeron en células CHO y pueden usarse para la detección de la banda de hDNasa I de ~35 kD en el ensayo de inmunotransferencia (el vector de expresión que produce IgY no relevante se usa aquí como control negativo).
Descripción detallada
Definiciones:
Por anticuerpo de reactividad cruzada se entiende un anticuerpo que puede unirse a un inmunógeno pero que también tiene una unión significativa (reactividad) a un antígeno que difiere del inmunógeno. Por partículas similares a virus (VLP) se entiende partículas ensambladas en células y que brotan de las células debido a la expresión de proteínas virales estructurales y/o de la cubierta.
Por línea celular CHOEBNALT85 se entiende una derivación de la línea celular de ovario de hámster chino que expresa la proteína del virus de Epstein-Barr denominada EBNA1 y la proteína del virus del polioma de ratón denominada T grande. La línea celular está disponible en Icosagen Cell Factory, Estonia.
Por vector QMCF se entiende plásmidos que llevan replicones híbridos compuestos por un origen de replicación central sin potenciador del poliomavirus de ratón en combinación con sitios de unión a la proteína EBNA-1 del virus de Epstein-Barr (FR - Familia de Repeticiones) como elemento de retención nuclear. Estas proteínas aseguran la replicación y el mantenimiento estables de los vectores de expresión QMCF en células QMCF, ambos disponibles en Icosagen Cell Factory, Estonia.
El método de acuerdo con esta descripción puede usarse para el desarrollo rápido y fiable de anticuerpos monoclonales que se producen subsecuentemente en células de mamífero. El proceso es simple y no necesita cultivo de células B o manipulaciones de células individuales. Además, el método no requiere sino equipo de laboratorio de biología molecular habitual. El método es aplicable a cualquier especie para la que se disponga de información sobre la secuencia del ADNc del anticuerpo.
El método se muestra esquemáticamente en la Figura 1 y las etapas clave incluyen: (i) enriquecimiento del material de origen mediante la captura de células específicas en cuya superficie se exponen los anticuerpos sobre las superficies de plástico cargadas con antígeno; (ii) amplificación de ADNc codificantes de VH y VL; (iii) construcción de una biblioteca combinatoria de VH-VLen formato deADN de plásmido de expresión en mamíferos; e (iv) identificación de las combinaciones de VH-VL de unión a antígeno específicas apropiadas después de la expresión de anticuerpos en células de mamífero. El cribado se realiza mediante la transfección deADN individuales en células de mamífero en un formato de múltiples pocillos (por ejemplo, 96 pocillos) que permite el cribado de un número limitado de clones en una sola ronda. Para garantizar que se descubran las combinaciones adecuadas de VH-VL a partir de un número limitado de clones, es crucial mantener la diversidad de la biblioteca en un intervalo estrecho al implicar condiciones estrictas para la interacción paratopo-epítopo.
Preferentemente, la biblioteca incluye solo aquellas regiones VH y VL que se encuentran en los anticuerpos que reconocen el antígeno de interés. Aquí, la limitación de la diversidad se logra mediante la selección funcional de las células de origen antes de que se aíslen las regiones VH y VL. Esto se asegura mediante la captura de las células de origen en la superficie sólida de la placa ELISA bien recubierta con el antígeno de interés (etapa 1 en la Figura 1). La captura se realiza a través de interacciones entre las moléculas de inmunoglobulina de superficie (sIg) en la célula de origen y el antígeno inmovilizado. El homogeneizado crudo de bazo que contiene las células intactas sirve bien como material de origen en el método de esta descripción.
Para asegurar una etapa de captura eficiente y de bajo fondo, las condiciones de la etapa de captura se ajustaron cuidadosamente y los ajustes se correlacionaron con mejoras sorprendentes. Los ajustes incluyen medio de captura que contiene 0,5 % de BSA y 0,1 % (ambos p/v) de NaN3. Es importante destacar que se obtuvo una mejora significativa tanto en la eficiencia cuando se añadió NaN3 al medio de captura. Se sugiere que esto está relacionado con el bloqueo de la internalización de anticuerpos por parte de las células y/o la degradación del ARN en condiciones de actividad metabólica celular inhibida por NaN3. Otras condiciones ajustadas son el número de células de origen tomadas por muestra, al capturar el tiempo suficiente para la unión, pero no lo suficientemente largo como para causar una degradación importante del ARN sin síntesis de novo y protocolo de lavado para la eliminación de células apenas adheridas. Estas modificaciones se describen en detalle en los ejemplos más abajo.
En la segunda etapa del método, las células de origen capturadas se someten directamente al aislamiento del ARN y la preparación del ADNc (etapa 2 en la Figura 1), seguido de la construcción de una biblioteca de anticuerpos combinatorios en el vector de expresión de mamíferos (etapa 3 en la Figura 1).
La calidad de la biblioteca puede evaluarse mediante la transfección del ADN del grupo de biblioteca (mezcla de todos los miembros de la biblioteca) y el análisis de la secreción de aglutinantes específicos de antígeno en el medio de cultivo. Se transfectan clones de ADN únicos preparados a partir de colonias bacterianas y se evalúa la producción de anticuerpos específicos de antígeno para cada clon para el aislamiento de los MAb individuales (etapa 4 en la Figura 1). Finalmente, se identifica la información de la secuencia de VH y VL para los clones positivos seleccionados.
En los ejemplos proporcionados más abajo, hemos usado la línea celular CHO-S modificada CHOEBNALT85 para el cribado del grupo o clones individuales de los anticuerpos. Estas células crecen en un medio químicamente definido sin suero y aseguran una alta eficiencia de transfección en una variedad de escalas, que incluye el ensayo de alto rendimiento basado en 96 pocillos. En asociación con el vector pQMCF, las células CHOEBNALT85 aseguran niveles de producción transitoria relativamente altos de moléculas similares a IgG (típicamente decenas de microgramos por mililitro en un punto de tiempo de 72 horas mediante el uso de una escala de cultivo de 2 ml). Además, las mismas células que usamos habitualmente para la producción de anticuerpos recombinantes a mayor escala. El uso de las mismas celdas para el cribado y la producción brinda buenas posibilidades de que no haya problemas posteriores con la productividad. Sin embargo, un experto en la técnica entiende que cualquier vector de expresión adecuado o línea celular de mamífero que pueda transfectarse eficazmente con ADN plasmídico puede usarse para la etapa de cribado de este método.
El aislamiento de pares VH y VL específicos de antígeno en el cribado de scFv-Fc sin duda proporciona suficiente información para la construcción de vectores de expresión para la producción recombinante de anticuerpos IgG naturales ensamblados por dos cadenas pesadas y dos ligeras que se expresan en las células como polipéptidos
separados. Sin embargo, son necesarios la resíntesis de ADNc (mediante la PCR o síntesis de genes), el cambio del vector de expresión y etapas de clonación adicionales. Esto hace que todo el proceso sea engorroso y lento. Por tanto, modificamos nuestro método para cribar las combinaciones de VH y VL para que se formen moléculas de IgG naturales intactas en lugar de anticuerpos scFv-Fc.
Por tanto, existe la necesidad de que los MAb reconozcan proteínas diana específicas o incluso isoformas de proteínas, pero no antígenos de la diana no deseada que compartan algunos epítopos homólogos o incluso idénticos. Nos hemos enfrentado a los problemas de que los MAb recuperados de inmunizaciones con proteínas de longitud completa tienen niveles inaceptables de reactividad cruzada y es engorroso clasificar el pequeño número de MAb "correctos" de la población de anticuerpos recuperados. Por lo tanto, hemos introducido una etapa opcional en el método cuando las células de origen se adsorben brevemente con una cantidad excesiva de antígenos de la(s) diana(s) no deseada(s) antes de capturarlos con la diana deseada. De esta forma, todos los sitios de unión en las células que reaccionan de forma cruzada con dianas no deseadas pueden saturarse antes y ya no pueden unirse al antígeno diana.
Los métodos usados en el desarrollo de la invención se describen más abajo, después de lo cual se describe el método y el kit de esta invención por medio de ejemplos no limitativos.
Métodos
Inmunización de animales
Pollo: Se inmunizaron pollos Hy-Line de seis a 8 meses de edad mediante cuatro inyecciones intramusculares (im) (semanas 0, 2, 4 y 18) de 0,5 mg de antígeno proteico en adyuvante de Freund completo (inmunización inicial) o incompleto (inmunizaciones subsecuentes). El refuerzo de antígeno se administró 2 semanas después de la inyección final como 0,1 mg de proteína en PBS por vía intravenosa (iv).
Ratones: Se inmunizaron inicialmente ratones BalbC hembra de cuatro a 6 semanas de edad por vía intraperitoneal (ip) con ~50 |jg de antígeno proteico en adyuvante completo de Freund (semana 0), seguido de 4 administraciones ip (semanas 3, 7, 16 y 2 veces en la semana 17) con la misma cantidad de antígeno en PBS. Conejos: Se inmunizaron inicialmente conejos de Nueva Zelanda de aproximadamente 5 meses de edad mediante 2 inyecciones subescapulares (en ambos lados del cuerpo). El antígeno proteico o las VLP se administraron 4-5 veces en una cantidad de 0,1-0,4 mg en adyuvante de Freund completo (solo primera inmunización) o en adyuvante de Freund incompleto. Finalmente, la respuesta se reforzó mediante inyección intravenosa de 0,1 mg de antígeno proteico.
Recolección, almacenamiento y preparación de células de origen
Después de la confirmación de la respuesta de anticuerpos específicos de antígeno en preparaciones de yema de huevo de pollos (IgY) o en suero sanguíneo de ratones y conejos (IgG), se recogieron los bazos 2-4 días después de la inmunización final (refuerzo). Los animales fueron anestesiados y se usó punción cardíaca para recolectar sangre. Se extrajo el bazo y se almacenó en hielo hasta su preparación (dentro de una hora). Para la preparación del homogeneizado celular, se homogeneizó el bazo en PBS enfriado con hielo mediante el uso de un tamiz de disociación celular de 40 jm . El material se recogió en un tubo de cultivo celular de 50 ml, se precipitó por centrifugación (300 * g, 5 min, 4 °C). Las células se resuspendieron en 50 ml de PBS enfriado con hielo y se centrifugaron nuevamente. Finalmente, las células precipitadas se suspendieron en 5 ml de medio de congelación enfriado con hielo (suero bovino fetal inactivado por calor DMSO al 10 %), se distribuyeron en crioviales (1 ml por tubo) y se congelaron lentamente a -80 °C. Para un almacenamiento más prolongado, los tubos se transfirieron a nitrógeno líquido después de 4-5 días.
Aislamiento de ARN y síntesis de la primera cadena de ADNc
Para el aislamiento del ARN total, 200 j l TriReagent® (Molecular Research Center, Estados Unidos) y se añadieron 1 2 jg de ARNt de levadura (Life Technologies, Estados Unidos) por pocillo individual de la placa de 96 pocillos usada para la captura de células. El aislamiento de ARN se realizó de acuerdo con lo proporcionado por el fabricante TriReagent®. Las muestras de ARN aisladas se disolvieron en 8 j l de agua libre de nucleasas y se sometieron a la síntesis de la primera cadena de ADNc mediante el uso de Sistema de Síntesis de Primera Cadena SuperScript® III para la PCR-TR (Life Technologies, Estados Unidos) e instrucciones del fabricante. Finalmente, rindió 20 j l de reacción de ADNc por muestra.
Cebadores VH y VL y amplificación mediante la PCR
Las reacciones de la PCR se realizaron en 50 j l mediante el uso de un total de 35-40 ciclos con ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion Green Hot Start II (Life Technologies, Estados Unidos) y condiciones preoptimizadas para cada reacción. Los cebadores para la amplificación de las regiones VH y VL del anticuerpo se diseñaron con el propósito de cubrir al máximo la variedad de secuencias VH y VL. Se diseñaron pares de cebadores para la amplificación de las regiones de pollo IgY en base a datos publicados [Andris-WidhopfJ., RaderC., Steinberger P., FullerR., Barbas C.F., 3ra: Methods forthe generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 2000,
242(1-2): 159-181], y se usa para la amplificación de las regiones VH y VL de IgY de pollo. Los cócteles de cebadores de ratón para la amplificación de las secuencias VH y VLk se diseñaron según datos publicados [Schaefer JV, Honegger A, Plückthun A: Construcción de fragmentos de scFv a partir de hibridomas o células de bazo mediante ensamblaje mediante la PCR. En: Ingeniería de anticuerpos. Editado por Kontermann R., Dübel S., vol. 1, 2. ed. Heidelberg: Springer; 2010: 21-44.] y las secuencias de ADNc de las regiones V y J disponibles en el sistema de información internacional ImmunoGeneTics® (IMGT®) recursos en línea [http://www.imgt.org/IMGTrepertoire]. Para la construcción de fragmentos scFv, los cócteles de cebadores VH y VL de conejo se diseñaron según los datos de la ref. [Rader C., RitterG., Nathan S., Elia M., Gout I., Jungbluth A.A., Cohen L.S., Welt S., Old L.J., Barbas C.F., 3ra: The rabbit antibody repertoire as a novel source forthe generation oftherapeutic human antibodies. J Biol Chem 2000, 275 (18): 13668-13676.]; y los cebadores usados para la construcción de bibliotecas que expresan moléculas de IgG de conejo intactas se diseñaron mediante secuencias de conejo almacenadas en IMGT® [http://www.imgt.org/IMGTrepertorio]. Con fines de clonación, se añadieron 20-23 nucleótidos adicionales complementarios a las regiones del vector de expresión mediante cebadores a los extremos de los fragmentos que se unieron con los otros fragmentos. Los cebadores inversos VH y los cebadores directos VL usados para la construcción de scFv contenían las regiones en sus extremos 5' que formaban la secuencia codificante del enlazador flexible (GGGS)3 entre los dominios VH y VL.
Construcción de bibliotecas combinatorias de VH-VL
Método de Clonación por Extensión de Polimerasa Circular (CPEC) independiente de restricción/ligadura [Quan J, Tian J: Circular polymerase extension cloning for high-throughput cloning of complex and combinatorial DNA libraries. Nat Prot 2011, 6(2): 242-251] se usó para la construcción de bibliotecas mediante clonación dirigida en marco de regiones VH y VL amplificadas en el plásmido de expresión en mamíferos pQMCF (Icosagen Cell Factory, Estonia). Las secuencias de dominio variable amplificadas se mezclaron con los fragmentos de vector en la mezcla de reacción de 20 |jl. Se usaron cinco microlitros para la transformación de células competentes de la cepa TOP 10 F' o DH5a de E. coli. Aproximadamente 1/10 de la mezcla de transformación se usó para la inoculación directa de 2 ml de medio de crecimiento líquido que contenía carbenicilina selectiva seguido de extracción de ADN plasmídico del cultivo durante la noche (grupo de biblioteca). Otra parte de la mezcla de transformación se sembró en medio sólido que contenía carbenicilina para obtener clones individuales. Los clones bacterianos se amplificaron y las minipreparaciones de ADN plasmídico se purificaron con el kit de minipreparaciones plásmidos Zyppy™-96 (Zymo Research, Estados Unidos) o el kit de plásmidos de 96 pocillos de FavorPrep™ (Favorgen Biotech Corp., Taiwán) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Células, transfección y recolección de muestras para el cribado de mamíferos
Células de ovario de hámster chino (CHO) derivadas de la línea celular CHOEBNALT85 (Icosagen Cell Factory, Estonia) que crecían en un medio químicamente definido libre de suero se usó para el cribado de mamíferos. La línea celular expresa la proteína EBNA1 del EBV y la proteína T grande del poliomavirus y está diseñada específicamente para la producción prolongada y de alto nivel de proteínas en asociación con vectores pQMCF. Las células se transfectaron mediante el uso del reactivo de transfección química 007 (Icosagen Cell Factory, Estonia) de acuerdo con los protocolos proporcionados por el fabricante [Karro K, MannikT, MannikA, Ustav M: DNATransfer into Animal Cells Using Stearylated CPP Based Transfection Reagent. Methods Mol Biol 2015, 1324: 435-445.]. Se transfectó un microgramo de a Dn de plásmido en formato de placa de 6 pocillos para analizar grupos de bibliotecas y se usaron aproximadamente 0,2 - 0,5 jg de ADN por muestra en transfección de placa de 96 pocillos de alto rendimiento para el cribado de clones individuales. Setenta y dos horas después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes para su análisis. Cuando fue necesario, la concentración de moléculas de scFv-Fc en las muestras se determinó mediante el uso de FastELISA para la cuantificación de IgG humana (RD Biotech, Francia).
ELISA
Las placas ELISA (Nunc™MaxiSorp™, Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) se recubrieron a 4 °C durante la noche con solución de antígeno (5 jg/m l) o suspensión de partículas similares a virus (VLP) (20 jg/m l) en PBS, se lavaron con solución de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %) y se incubó de 1-2 horas con una solución de bloqueo (PBS que contenía BSA al 2 % y Tween 20 al 0,05 %) a temperatura ambiente. Después de lavar los sobrenadantes de cultivo (diluidos en solución de bloqueo, si es necesario) se incubaron 1-2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar 4 veces, se realizó una segunda incubación con anticuerpo IgG anti-humano de cabra (para scFv-Fc) o anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con HRP (LabAs, Estonia). Las señales se desarrollaron con sustrato TMB VII (Biopanda Diagnostics, Reino Unido). Las reacciones se detuvieron al añadir H2SO4 0,5 M y los valores de absorbancia se midieron a 450 nm.
Análisis de secuencia
Las secuencias de proteínas de las secuencias VH y VL de los anticuerpos identificados se analizaron mediante alineaciones globales por pares exhaustivas y ensamblaje progresivo de alineaciones mediante el uso de la filogenia de unión de vecinos para la determinación de la similitud. Esto se hizo mediante el uso de Clone Manager Professional (software científico y educativo) y el software BioEdit Sequence Alignment [Hall TA: BioEdit: a user-friendly biological
sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucí Acids Symp Ser 1999, 41: 95-98.]. Las regiones determinantes complementarias (CDR) en las secuencias de aminoácidos de VH y VL se determinaron mediante el uso de la ref. [Andris-Widhopf J., Rader C., Steinberger P., Fuller R., Barbas C.F., 3ra: Methods forthe generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 2000, 242(1-2): 159-181.] y datos en la página web de IMGT® [http://www.imgt.org/IMGTrepertoire].
La descripción se describe ahora por medio de ejemplos no limitantes. Se hace referencia a las Figuras 1-6.
Ejemplo 1. Captura de células que expresan anticuerpos específicos
El proceso de captura se ilustra con ejemplos mediante el uso de un bazo de pollo inmunizado con proteína DNasa I humana, un ratón inmunizado con proteína artemina humana y un conejo inmunizado con el dominio de proteína E2 de HPV18 fusionado con GST (GST-HPV18 E2C).
La muestra congelada se descongeló y se transfirió a 10 ml de medio de cultivo celular RPMI1640 a temperatura ambiente. Las células se recogieron por centrifugación (300 x g, 5 minutos, temperatura ambiente), se resuspendieron en 10 ml de RPMI1640 suplementado con penicilina/estreptomicina y 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor (esplenocitos de conejo o ratón) o suero de pollo (esplenocitos de pollo). Las células se sembraron en una placa de cultivo celular de 100 mm y se incubaron ~1 hora a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5-8 %. Las células adherentes al plástico se agotaron de los linfocitos durante la incubación y las células que flotan libremente se recogen cuidadosamente. Luego, las células viables se contaron mediante el uso de exclusión con azul de tripano. Las células se precipitaron nuevamente por centrifugación y se resuspendieron en el medio de captura. Solo para preparaciones de esplenocitos de pollo contaminadas con grandes cantidades de eritrocitos, Optiprep™ adicional (yodixanol al 60 %, Axis-Shield PoC AS, Noruega) la purificación en gradiente se realizó mediante la sedimentación de los linfocitos en una barrera de densidad antes de la resuspensión en el medio de captura.
Los pocillos de superficie MaxiSorp™ (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) se recubrieron con el antígeno (20 |jg/ml en PBS, 4 °C, durante la noche) y se bloquearon durante 1-2 horas con BSA al 2 % en PBS. Se cargaron cien microlitros de suspensión celular que contiene 2 x 104 células vivas en medio de captura en un solo pocillo. Como medio de captura usamos RPMI1640 complementado con BSA al 0,5 % y NaN3 al 0,1 %. La placa se centrifugó (200 x g, 5 minutos) para forzar las células a la superficie recubierta de antígeno y dejar que se unieran al antígeno en el entorno ambiental. Usamos un tiempo de captura preoptimizado de ~ 45 minutos suficiente para que las células se unan al antígeno, pero no demasiado tiempo que pueda causar una degradación importante del ARNm celular sin síntesis de novo. Luego, se descartó el medio y se eliminaron las células sueltas al lavarlos de 4-5 veces con PBS, y pipetear suavemente de arriba hacia abajo cada vez (3-4 veces) en el borde del pocillo. Finalmente, las células restantes se lisaron en pocillos y se sometieron a aislamiento de ARN y preparación de ADNc. Hemos encontrado que a partir de 2-6 x 104 esplenocitos de mamíferos y 4-8 x 104 esplenocitos de pollo por cada muestra de ADNc suelen ser bastante óptimos si los animales están bien inmunizados. Para aumentar el número de los MAb recuperados, configurar más reacciones de captura es una opción viable en lugar de aumentar el número de células por muestra. Por tanto, el material de 2 (ratón, conejo) u 8 (pollo) pocillos se agruparon juntos durante el aislamiento del ARN.
El éxito de la captura de células específicas de antígeno se sugirió por primera vez mediante electroforesis en gel de agarosa de productos de amplificación de VH y VL de ~400 pb que se muestran en la figura 2A-C. En los carriles marcados con (+), las células se capturaron en el antígeno diana relevante. Como reacciones control, también se realizaron procedimientos de captura idénticos mediante el uso de BSA como proteína no relevante (carriles marcados con (-) en la figura 2). Al comparar las intensidades de señal de los productos de la PCR entre los carriles (+) y (-) en la figura 2, es obvio que, en el caso de todos los animales de origen, los productos VH y VL se amplificaron solo o mucho más eficientemente cuando las células eran de pocillos (+).
Ejemplo 2. Construcción de bibliotecas scFv-Fc y cribado de los MAb
A continuación, se construyeron bibliotecas combinatorias VH-VL a partir de las regiones VH y VL amplificadas que se muestran en la figura 2 mediante el uso de la técnica CPEC. Para los esplenocitos de conejo, se usaron dos reacciones de la PCR (VH1 y VH2) para una mejor cobertura de los ADNc de VH (figura 2C). Por tanto, se realizaron dos reacciones de clonación separadas y se combinó el producto VH1 o el producto VH2 con el producto VLk. Durante la reacción de CPEC de 3 fragmentos (vector, VH, VL) se formaron vectores pQMCF scFv-Fc mediante emparejamiento aleatorio de fragmentos VH y VL y unión en marco de scFv ADNc en los extremos 5' y 3' con ADNc del péptido líder de secreción de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón y ADNc de la región Fc de IgG1 humana, respectivamente (etapa 3 en la figura 1). La reacción de CPEC se inicia mediante la hibridación y la extensión de cadenas de ADN complementarias en los extremos de los fragmentos de ADN unidos. Por tanto, añadimos la secuencia del extremo 3' del ADNc del péptido líder al extremo 5' del fragmento VH (durante la reacción de la PCR del ADNc) y la secuencia del extremo 5' de la región Fc al extremo 3' del fragmento VL para iniciar la unión de los 3 fragmentos sin nucleótidos adicionales entre el vector y la inserción. De manera similar, se crea el enlazador flexible (GGGGS)3 entre la VH y la VL. En los ejemplos descritos aquí, la expresión del scFv-Fc estaba controlada por la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor. Se prepararon muestras de grupos de bibliotecas (mezcla de todos los miembros de la biblioteca) y minipreparaciones de ADN de un solo clon (mediante el uso de un método conveniente de 96 pocillos
de alto rendimiento) a partir de células de E. coli transformadas directamente con reacción CPEC. El análisis de la PCR de las colonias bacterianas mostró una alta eficiencia de la clonación y habitualmente >90 % de los clones CPEC contienen inserción VH-VL dirigida en el vector (datos no mostrados).
La eficiencia de la reconstrucción del MAb específico de antígeno a partir de las combinaciones de VH y VL se analizó inicialmente mediante la transfección de grupos de bibliotecas. Los ADN se transfectaron en las células CHOEBNALT85 y 72 horas más tarde los sobrenadantes de cultivo se evaluaron en ELISA para determinar la secreción de moléculas scFv-Fc que reconocen antígenos. Como se ve en la figura 3A-C, se observaron señales positivas cualitativamente diferentes de los controles en todas las muestras, lo que sugiere la presencia de MAb adecuados en las bibliotecas. Como etapa siguiente, se identificaron los MAb individuales con afinidad específica mediante el cribado de minipreparaciones de ADN plasmídico derivadas de clones únicos. Se analizaron una o dos placas de 96 pocillos (que incluye los controles positivos y negativos apropiados) por cada biblioteca. Las señales positivas las determinamos arbitrariamente como al menos 2-3 veces más que el control negativo (vector de expresión vacío o que expresa un scFv-Fc no relevante). Sin embargo, medido en el punto de tiempo 72 horas después de la transfección, las señales positivas típicamente discriminaron cualitativamente de las muestras negativas dando lecturas 10 o más veces más altas (figura 3D). Entre diferentes antígenos y animales la eficiencia del cribado (porcentaje de aciertos positivos) en nuestros experimentos ha variado entre un 7 % y un 60 %.
Ejemplo 3. Cribado de moléculas de IgG naturales
Para la clonación de las bibliotecas que expresan moléculas de IgG naturales en lugar de scFv-Fc, la estrategia de CPEC se modificó para dirigir la unión en marco de los 4 fragmentos (VH, VL, promotores/líderes y vector). Aquí, las VH y VL se unen con el ADNc del péptido líder de secreción en su extremo 5' y el ADNc de dominio constante en el extremo 3' sin nucleótidos adicionales entre el vector y la inserción. El producto final de la reacción de la CPEC es el vector IgG pQMCF con casetes de expresión separados para la cadena pesada y ligera de IgG, respectivamente (figura 4A). Para garantizar el ensamblaje eficiente de la CPEC, las regiones complementarias en el extremo de los fragmentos se optimizaron cuidadosamente mediante el uso de reemplazos de sinónimos en el péptido líder y los ADNc de la región constante. La modificación del método se ilustra aquí mediante el desarrollo de MAb de conejo contra la proteína CD48 de ratón. Los fragmentos de VH y VL se crearon a partir de células de bazo capturadas en pocillos recubiertos con CD48 de ratón. La reacción de clonación se realizó mediante el uso del vector IgG pQMCF que contenía ADNc optimizados por codón de región constante de cadena pesada y ligera (kappa) de IgG de conejo. La cadena pesada y ligera de IgG formada se expresó bajo el control del promotor RSV LTR y CMV, respectivamente. El análisis de restricción inicial del ADN del grupo de biblioteca y la PCR de colonias de 38 colonias bacterianas individuales indicó una eficiencia del 100 % del ensamblaje del vector IgG pQMCF de los 4 fragmentos. El análisis de inmunotransferencia de la muestra del medio de cultivo de células CHO85EBNALT transfectadas con el ADN del grupo de biblioteca confirmó el predominio de moléculas de IgG de conejo intactas ensambladas a partir de las cadenas pesada y ligera expresadas por separado (figura 4B). El análisis de la misma muestra de medio de transfección del grupo de biblioteca en ELISA de c D48 de ratón demostró la presencia de anticuerpos específicos de antígeno (figura 4C). Finalmente, el análisis de 95 clones bacterianos dio como resultado >50 % de los pocillos como fuertemente positivos y dio valores de OD > 3,0 frente a OD = 0,1 en el pocillo de control negativo.
Ejemplo 4. Captura selectiva mediante el uso de la preadsorción de células de origen
Para ilustrar cómo puede usarse la tecnología de esta descripción para la recuperación de los MAb muy específicos, se describe aquí el desarrollo de los MAb contra la proteína ribonucleasa 8 (R8) humana a partir de células de bazo del conejo inmunizado. El objetivo era obtener los MAb anti-R8 que tuvieran una reactividad cruzada mínima con la ribonucleasa 7 (R7) humana altamente homóloga (figura 5A) y, por tanto, se incluyó una etapa de preadsorción con R7 antes de la captura celular. Precisamente, las células de bazo de conejo inmunizadas con la proteína R8 se capturaron de dos maneras: simplemente mediante el uso de la superficie recubierta con R8 y el medio de captura como se describió en la sección "Captura de células B específicas de antígeno" anterior; o al complementar el medio con proteína R7 (100 pg/ml) e incluir una etapa de preadsorción breve (15 minutos) en suspensión antes de que las células se centrifugaran hasta el fondo de los pocillos recubierto con R8. Como se ilustra en la figura 5B, el grupo de biblioteca de células no adsorbidas previamente proporcionó lecturas relativamente bajas. Lo más sorprendente es que las respuestas fueron incluso más altas para la proteína R7 y las lecturas de la unión de la proteína R8 fueron ligeramente superiores al fondo. Esto puede indicar que los epítopos antigénicos dominantes en la proteína R8 expuesta in vivo no estaban igualmente disponibles en el antígeno unido a plástico in vitro. Por el contrario, se detectó una potente respuesta anti-R8 en el grupo de biblioteca obtenido mediante el uso de la preadsorción con la proteína R7. También hubo alguna respuesta al r 7, pero el título fue significativamente mayor para el R8 (figura 5C). Se cribaron noventa y dos clones individuales de cualquiera de las bibliotecas para la unión a la proteína R8 y R7, respectivamente. Los resultados mostrados en la figura 5D estaban de acuerdo con los datos de los análisis de grupos de bibliotecas. Los MAb reactivos con R7 con lecturas débiles dominaron en la biblioteca preparada sin adsorción previa y los aciertos reactivos con R8 prevalecieron cuando se usó la preadsorción. Solo del grupo preadsorbido encontramos los MAb deseados que reaccionaban con el R8 pero que tenían poca o ninguna reactividad cruzada con la proteína R7 (R8+/R7- en la figura 5D).
Creemos que este tipo de preadsorción también debería ser útil para el cribado de anticuerpos de organismos inmunizados con antígenos complejos. Por ejemplo, el uso de VLP pseudotipadas de proteínas de superficie viral en lugar de solo proteínas de superficie purificadas para la inmunización generalmente brinda mejores posibilidades de que surjan anticuerpos neutralizantes de virus [30]. El uso de las mismas VLP para la captura de células que expresan antígenos, así como también para el cribado, brinda la oportunidad de aislar y clonar dichos anticuerpos. Sin embargo, el uso de las VLP para la inmunización generalmente da como resultado una respuesta mixta que incluye muchos MAb específicos para dianas no deseadas, por ejemplo, dirigidos a componentes estructurales de las VLP. Por tanto, puede ser útil inhibir la recuperación de los anticuerpos para dianas no deseadas mediante la adsorción previa de las células de origen que expresan anticuerpos con VLP no pseudotipadas.
La gemación de las VLP se induce mediante la expresión intracelular de la proteína estructural viral, como la proteína gag retroviral (por ejemplo, el VIH o el virus de la leucemia murina) o la proteína VP40 del virus del Ébola, como ejemplos no limitantes. Si las mismas células también expresan una proteína que consiste en un dominio extracelular y un dominio asociado a la membrana, esta proteína puede incorporarse (pseudotiparse) en las VLP de manera que el dominio extracelular quede expuesto en la superficie de las VLP Por ejemplo, este tipo de proteína que consiste en un dominio extracelular y un dominio asociado a la membrana puede ser una proteína de superficie viral o una proteína celular o una proteína quimérica artificial construida mediante la fusión recombinante del dominio asociado a la membrana y el dominio extracelular. La VLP pseudotipada puede usarse como inmunógeno efectivo para la inducción de una respuesta de anticuerpos contra el dominio extracelular expuesto en la superficie. Como la proteína pseudotipada en las VLP se parece a la exposición de la proteína en las partículas virales, al usar la estrategia con proteínas de superficie viral (o dominios extracelulares de estas) existe una buena posibilidad de inducir los anticuerpos que reconocen la proteína cuando se expone en su medio natural en la partícula viral. Por tanto, el uso de dichas VLP para la inmunización, así como también para el aislamiento de MAb mediante la descripción aumenta las posibilidades de aislar anticuerpos neutralizantes antivirales. Sin embargo, el uso de las VLP para la inmunización generalmente da como resultado una respuesta mixta que incluye muchos MAb específicos de dianas no deseadas, por ejemplo, dirigidos a componentes estructurales de las VLP en lugar de la proteína de superficie pseudotipada. Para evitar el cribado de estos MAb, pero enriquecerlos en los MAb frente a la proteína diana, se usa la etapa de preadsorción como se describió en el Ejemplo 4. En este caso, las VLP "vacías" o no pseudotipadas producidas por expresión de proteína estructural solamente se usan para la preadsorción. Posteriormente, las células de origen se capturan mediante el uso de las mismas VLP, pero se pseudotipifican con el inmunógeno diana.
Ejemplo 5. Validación y análisis de secuencia de los MAb obtenidos por el método
Hemos practicado con éxito el método HybriFree mediante el uso de mamíferos y aves inmunizados, así como también diferentes antígenos virales y celulares. La variedad de MAb que hemos desarrollado mediante el método incluye aquellos que reconocen epítopos lineales y son útiles para la detección en ensayos como inmunofluorescencia (figura 6A) e inmunotransferencia (figura 6B). Los antígenos diana incluyen proteínas virales, como la glicoproteína del virus del Ébola y la proteína E2 del virus del papiloma humano, así como también proteínas celulares humanas, como (artemina, CD48, DNasaI, ribonucleasa 8, Factor de Crecimiento Nervioso). Los anticuerpos incluyen también aquellos que se unen a epítopos conformacionales y tienen un interés potencial en el desarrollo de productos con actividad biológica. Mediante el uso de la información de la secuencia obtenida por el método, hemos producido anticuerpos scFV-Fc y anticuerpos IgG e IgY naturales en producción a mayor escala en células CHO85EBNALT y purificadas.
Ejemplo 6: Anticuerpos monoclonales específicos de la glicoproteína completa del virus del Ébola
El conejo se inmunizó con las VLP producidas por expresión de la proteína VP40 del virus Ébola en células 293 humanas. Debido a la coexpresión de la glicoproteína (GP) de longitud completa del virus del Ébola, las VLP se pseudotiparon con GP procesada proteolíticamente correctamente. Las VLP se precipitaron del sobrenadante del cultivo libre de suero, se resuspendieron en PBS y se usaron directamente de la inmunización. Después de 4 rondas de inmunizaciones y refuerzo con GP purificada, se detectó una respuesta anti-GP significativa en el suero sanguíneo. El bazo se recogió y preparó como se describió en los Métodos anteriores. La captura de células se realizó en las VLP pseudotipadas de Gp recubiertas en el fondo de los pocillos MaxiSorp como se describió en el ejemplo 1, pero que incluye una etapa de preincubación de 10 minutos antes de la captura. Durante esta etapa de preincubación, las células de bazo de origen se incubaron al mezclarlas suavemente en medio de captura que contenía las VLP del virus del Ébola (50 pg/ml) producidas por la expresión de solo la proteína VP40, pero no la GP en las mismas células 293. Se esperaba que, durante esta etapa previa a la adsorción, los sitios de unión de las inmunoglobulinas de superficie que se dirigen a otros componentes de la VLP que no sean GP estén saturados y, por tanto, no puedan ser reactivos en la siguiente etapa de captura. Después de capturar, la muestra se procesó como se describió en los Ejemplos 2 y 3 y esto produjo los MAb que eran específicos de GP y reconocían la GP presente en las VLP
Claims (5)
1. Un método in vitro para desarrollar anticuerpos monoclonales, dicho método comprende las etapas de:
(a) enriquecimiento del material de origen mediante la captura de células específicas en cuya superficie se exponen los anticuerpos sobre las superficies plásticas cargadas con antígeno, en donde la captura incluye un medio de captura que comprende 0,5 % p/v de BSAy 0,1 % p/v de NaN3
(b) amplificación de los ADNc codificantes de VH y VL;
(c) construcción del formato de ADN de plásmido de expresión en mamífero de biblioteca de VH-VL combinatoria; y
(d) identificación de las combinaciones de VH-VL de unión a antígeno específicas apropiadas después de la expresión de anticuerpos en células de mamífero.
2. El método de la reivindicación 1, en donde las células de origen se seleccionan del grupo que consiste en células de bazo del homogeneizado crudo de bazo, médula ósea y células de sangre periférica de un animal inmunizado.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la etapa a) está precedida por una etapa de preadsorción en el que las células de origen se preadsorben brevemente con una cantidad excesiva de antígenos diana no deseados.
4. Un método para producir anticuerpos monoclonales, en donde los anticuerpos se desarrollan de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y las células de mamífero identificadas en la etapa d) se cultivan adicionalmente a gran escala para la producción de anticuerpos.
5. El método de la reivindicación 3, en donde los anticuerpos están libres de afinidad por diana no deseada.
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