CN108884442A - B细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本文报道用于共培养一个或多个B细胞的方法,其包括将该一个或多个B细胞与EL4‑B5细胞培育的步骤,由此该EL4‑B5细胞获自/来自具有600,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml的细胞密度的EL4‑B5细胞培养物。
Description
本文报道用于将B细胞与从某细胞密度的EL4-B5细胞培养物获得的EL4-B5饲养细胞共培养、获得由单个B细胞分泌的单克隆抗体的至少可变结构域的氨基酸序列的方法,以及用于产生该抗体的方法。
背景技术
为了获得分泌单克隆抗体的细胞,广泛使用Koehler和Milstein发展的杂交瘤技术。但在杂交瘤技术中,只有一部分从所免疫的实验动物获得的B细胞可以融合和繁殖。B细胞的来源通常是所免疫的实验动物的器官,如脾脏。
Zubler等在1984年开始发展用于获得分泌单克隆抗体的细胞的不同方法(参见例如Eur.J.Immunol.14(1984)357-363,J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)。其中,从所免疫的实验动物的血液获得B细胞,并在包含细胞因子的饲养混合物存在下与鼠EL-4B5饲养细胞共培养。借助这种方法,在共培养10-12天后可以获得至多50ng/ml抗体。
Weitkamp,J-H.等,(J.Immunol.Meth.275(2003)223-237)报道了从用荧光病毒样颗粒选择的单抗原特异性B细胞产生抗轮状病毒的重组人单克隆抗体。US 2006/0051348中报道了产生抗多个关连抗原的多个分离的抗体的方法。在WO 2008/144763和WO 2008/045140中,分别报道了抗IL-6抗体及其用途和用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法。US 2007/0269868中报道了用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法。Masri等(Mol.Immunol.44(2007)2101-2106)报道了在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达从抗炭疽毒素的单人淋巴细胞获得的功能性Fab片段。WO 2007/031550中报道了用于制备免疫球蛋白文库的方法。
WO 2011/147903中报道了单B细胞培养方法。
WO 2013/076139中报道了表达CD40L的哺乳动物细胞及其用途。
WO 2013/092716中报道了用于克隆和表达关连抗体可变区基因区段的快速方法。
US 7,807,415中报道了用于产生稳定永生化B淋巴细胞的方法。EP 0488 470中报道了用于产生抗体的方法。
Seeber,S.等报道了用来自外周血的兔B细胞产生功能性重组单克隆抗体的稳定高通量平台(PLOS One 9(2014)e86184/-14)。
US 2007/065919中报道了产生稳定B淋巴细胞的方法。
WO 2012/178150中报道了用于开发产生抗原特异性抗体的细胞系和单克隆抗体的方法。
Kwekkeboom,J.等报道了用于基于鼠胸腺瘤细胞系对人B淋巴细胞的活化产生人单克隆抗体的有效方法(J.Immunol.Meth.160(1993)117-127)。
Weber,M.等报道了组合基于EL4-B5的B细胞刺激和噬菌体展示技术用于成功分离人抗Scl-70自身抗体片段(J.Immunol.Meth.278(2003)249-259)。
Dohmen,S.E.等报道了关于从抗原选择的单B细胞产生重组Ig分子和抗D抗体对Ig基因区段的限制使用(J.Immunol.Meth.298(2005)9-20)。
发明概述
本文报道用于将单个沉积(deposited)B细胞(其可以是任意来源)与饲养细胞在适宜的共培养培养基中共培养的方法。
本发明至少部分基于这样的发现,用于共培养的EL4-B2饲养细胞可以获自具有超过500,000细胞/ml、尤其是在600,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml范围内的细胞密度的EL4-B5细胞培养物,即已将EL4-B5细胞培养至该细胞密度。
本发明还至少部分基于这样的发现,取决于收获EL-4-B5细胞时的EL-4-B5培养物密度,所有IgG阳性孔中抗原结合和IgG阳性孔的总体频率提高,即如果将获自在EL-4-B5细胞收获时具有更高细胞密度的EL4-B5培养物的EL-4-B5细胞用于B细胞共培养,则可以获得前面提到的频率提高。在将获自细胞密度至多1,500,000细胞/ml的EL4-B5细胞培养物的EL4-B5细胞用于共培养时观察到了这种作用。这就是说,在已将EL-4-B5细胞培养至至多1,500,000细胞/ml的最终细胞密度时,将与前述相同浓度的EL-4-B5细胞用于共培养导致抗原结合和IgG阳性孔的频率提高。
本文报道的单个方面是用于以下的方法:
i)从B细胞群体分离B细胞或B细胞克隆,由此该分离的B细胞或B细胞克隆产生特异性结合靶标的抗体;
ii)共培养单个沉积B细胞;和
iii)产生抗体。
与该方法并行,还涵盖和公开相应的用途。
本文报道的一个方面是用于共培养一个或多个B细胞的方法,其包括步骤:
-将该一个或多个B细胞与EL4-B5细胞培育;
由此该EL4-B5细胞获自/来自具有600,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml的(最终)细胞密度的EL4-B5细胞培养物。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物具有650,000细胞/ml至1,450,000细胞/ml的(最终)细胞密度。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物具有650,000细胞/ml至825,000细胞/ml的(最终)细胞密度。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物具有1,400,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml的(最终)细胞密度。
本文报道的一个方面是用于共培养一个或多个B细胞的方法,其包括步骤:
-将EL4-B5细胞培养至约600,000细胞/ml至约1,500,000细胞/ml的细胞密度;和
-将该一个或多个B细胞与前一步骤的EL4-B5细胞培养物的EL4-B5细胞/来自前一步骤的EL4-B5细胞培养物(即来自具有约600,000细胞/ml至约1,500,000细胞/ml的细胞密度的EL4-B5细胞培养物)的EL4-B5细胞的整分试样培育。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物达到约650,000细胞/ml至约1,450,000细胞/ml的(最终)细胞密度。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物达到约650,000细胞/ml至约825,000细胞/ml的(最终)细胞密度。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物达到约1,400,000细胞/ml至约1,500,000细胞/ml的(最终)细胞密度。
在所有方面的一个实施方案中,在加入该一个或多个B细胞之前用γ-辐射照射该EL4-B5细胞。该γ-辐射的剂量是亚致死剂量。在一个实施方案中,在该EL4-B5培养物具有约600,000细胞/ml至约1,500,000细胞/ml的细胞密度时收获EL4-B5细胞,调节收获物中细胞密度至约1x106细胞/ml的细胞密度,用50Gy剂量的γ-辐射照射细胞密度经调整的EL4-B5细胞悬液,并将经照射的各整分试样加至该一个或多个B细胞。在一个实施方案中,该整分试样为约104至105个EL-4-B5细胞/B细胞。
在所有方面的一个实施方案中,将该一个或多个B细胞与约104至105个EL-4-B5细胞/B细胞培育。在所有方面的一个实施方案中,将该一个或多个B细胞与约1×104至约5×104个EL4-B5细胞/B细胞培育。在所有方面的一个实施方案中,将该一个或多个B细胞与约2×104个EL4-B5细胞/B细胞培育。因此,加至该一个或多个B细胞的EL4-B5细胞培养物的整分试样为约104至105、或约1×104至约5×104、或约2×104个EL4-B5细胞/B细胞。
在所有方面的一个实施方案中,该培育还在饲养混合物的存在下。
在一个实施方案中,该饲养混合物包含以下一种或多种:
i)白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子α;
ii)白细胞介素-2(IL-2)和/或白细胞介素-10(IL-10);
iii)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowan菌株细胞(SAC);
iv)白细胞介素-21(IL-21)和可选地白细胞介素-2(IL-2);
v)肿瘤坏死因子家族的B细胞活化因子(BAFF);
vi)白细胞介素-6(IL-6);
vii)白细胞介素-4(IL-4);和
viii)胸腺细胞培养上清。
在一个实施方案中,该饲养混合物包含金黄色葡萄球菌Cowan菌株细胞(SAC)和胸腺细胞培养上清。
在所有方面的一个实施方案中,该方法用于共培养一个B细胞。在一个优选实施方案中,该一个B细胞是单个沉积B细胞。
在所有方面的一个实施方案中,该培育持续5至14天。
本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法,其包括本文报道的共培养方法,从而产生抗体。
本文报道的所有方面(方法和用途)包括以下步骤:
-将(每一单个沉积或混合)B细胞与饲养细胞在补充了饲养混合物的共培养培养基中(分别)共培养/培育。
共培养的结果是B细胞克隆,即B细胞群体,其是单个B细胞的后代。
在一个实施方案中,本文报道的方法在共培养步骤之前包括以下步骤:
-将B细胞群体的带有1至3个或1至4个荧光染料/荧光团标记的那些B细胞沉积为单个细胞。
在一个实施方案中,本文报道的方法在共培养步骤之前包括以下步骤:
-将B细胞群体的已与1至4种各特异性结合不同B细胞表面抗原的抗体接触的那些B细胞沉积为单个细胞,由此各抗体与不同荧光染料缀合,但仅用1至4种荧光染料标记。
在一个实施方案中,通过使B细胞群体(顺次或同时)与1至4种荧光标记抗体接触来进行标记。由此获得标记B细胞制备物。每种荧光标记抗体结合不同的B细胞表面标志/靶标。
通过将标记B细胞制备物引入流式细胞仪并使带有1至4个荧光标记的那些细胞沉积为单个细胞来进行沉积。由于可能使细胞与如用于在细胞分选仪中选择细胞的那些荧光染料的更多荧光染料培育,可以针对存在特异性表面标志且(可选地)同时缺乏其他表面标志来选择细胞。
进行标记和单细胞沉积,以通过排除不可能产生具有预期特征的抗体的那些B细胞来降低B细胞群体的复杂性。标记抗体结合展示在B细胞表面的特异性多肽,因此提供正选择标记。同样,还可能选择这样的细胞,该细胞仅带有与B细胞与之培育的标记抗体的数目相比数目减少的荧光染料标记,例如具有两种荧光标记中的一种(即进行了与两种荧光标记抗体的培育,但只有其中之一结合B细胞)或三种荧光标记中的两种的细胞。基于荧光标记抗体与B细胞群体的单个B细胞的结合/不结合,可能用微流分选仪鉴定和分离靶标B细胞。还可以在选择的同时测定标记的量。
在一个实施方案中,本文报道的方法包括在单细胞沉积之前在共培养培养基中培育B细胞群体的步骤。在一个实施方案中,该培育在约37℃进行。在一个实施方案中,该培育进行0.5至2小时。在一个实施方案中,该培育进行约1小时。在一个优选实施方案中,该培育在约37℃进行约1小时。
在一个实施方案中,本文报道的方法在沉积步骤之后和共培养步骤之前包括离心单细胞沉积B细胞的步骤。在一个实施方案中,该离心进行约1分钟至约30分钟。在一个实施方案中,该离心进行约5分钟。在一个实施方案中,该离心在约100x g至约1,000x g。在一个实施方案中,该离心在约300x g。在一个优选实施方案中,该离心在约300x g进行约5分钟。
在一个实施方案中,用于选择/获得B细胞(克隆)的方法包括以下步骤:
a)用1至4种荧光染料标记B细胞群体的B细胞(可选地通过使B细胞群体与2至4种特异性结合2至4种不同的预先确定的B细胞表面标志的荧光标记抗体培育);
b)可选地在共培养培养基中培育细胞;
c)使B细胞群体的带有1至4种荧光染料标记(和可选地不带有其他一种或多种荧光染料标记)的那些B细胞作为单细胞沉积在预先加入的饲养细胞上;
d)可选地离心具有预先加入的饲养细胞的单个沉积B细胞;
e)将各单个沉积B细胞与饲养细胞在补充了饲养混合物的共培养培养基中(分别)共培养;
f)选择在步骤e)中增殖并分泌抗体的B细胞克隆。
在一个实施方案中,用于产生特异性结合靶标的抗体的方法包括以下步骤:
a)用1至4种荧光染料标记B细胞群体的B细胞(可选地通过使B细胞群体与2至4种特异性结合2至4种不同的预先确定的B细胞表面标志的荧光标记抗体培育);
b)可选地在共培养培养基中培育细胞;
c)使B细胞群体的带有1至4种荧光染料标记(和可选地不带有其他一种或多种荧光染料标记)的那些B细胞作为单细胞沉积在预先加入的饲养细胞上;
d)可选地离心具有预先加入的饲养细胞的单个沉积B细胞;
e)将各单个沉积B细胞与饲养细胞在补充了饲养混合物的共培养培养基中(分别)共培养;
f)选择步骤e)的分泌抗体的B细胞克隆;
g)i)从步骤f)中选择的B细胞克隆获得一个或多个编码所分泌的抗体可变结构域的核酸;
ii)如果B细胞克隆不是人B细胞克隆,则人源化可变结构域并提供各自的编码核酸;和
iii)将该一个或多个核酸引入一个或多个表达载体;
h)培养用步骤g)的一个或多个表达载体转染的细胞,从细胞或培养上清回收抗体,从而产生抗体。
在一个实施方案中,用于产生抗体的方法包括以下步骤:
a)用1至4种荧光染料标记B细胞群体的B细胞(可选地通过使B细胞群体与2至4种特异性结合2至4种不同的预先确定的B细胞表面标志的荧光标记抗体培育);
b)可选地在共培养培养基中培育细胞;
c)使B细胞群体的带有1至4种荧光染料标记(和可选地不带有其他一种或多种荧光染料标记)的那些B细胞作为单细胞沉积在预先加入的饲养细胞上;
d)可选地离心具有预先加入的饲养细胞的单个沉积B细胞;
e)(分别)将各单个沉积B细胞与饲养细胞在补充了饲养混合物的共培养培养基中共培养;
f)测定单个B细胞培养基中分泌的抗体的结合特异性;
g)通过反转录酶PCR和核苷酸测序从B细胞克隆获得一个或多个编码所分泌的抗体可变结构域的核酸(从而获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域编码核酸);
h)如果B细胞是非人B细胞,则人源化可变轻链和重链结构域并提供编码人源化可变结构域的核酸;
i)将单克隆抗体可变轻链和重链可变结构域编码核酸引入一个或多个用于表达(人或人源化)抗体的表达载体;
j)将该一个或多个表达载体引入细胞;
k)培养细胞并从细胞或细胞培养物上清回收抗体,从而产生抗体。
在一个实施方案中,从B细胞克隆获得一个或多个编码所分泌的抗体可变结构域的核酸包括以下步骤:
-从产生抗体的B细胞克隆提取总RNA;
-进行所提取的polyA+mRNA的单链cDNA合成/反转录;
-用一组物种特异性引物进行PCR;
-可选地去除PCR引物/纯化PCR产物;
-可选地测序PCR产物。
在一个实施方案中,将单克隆抗体可变轻链和/或重链可变结构域编码核酸引入用于表达(人或人源化)抗体的表达载体包括以下步骤:
-可变轻链和重链可变结构域的T4聚合酶培育;
-表达载体的线性化和扩增;
-所扩增的表达载体的T4聚合酶培育;
-可变结构域编码核酸的序列和连接依赖性克隆入所扩增的表达载体;和
-从载体转化的大肠杆菌细胞混合物制备一个或多个载体。
在所有方面的一个实施方案中,该方法在紧靠标记步骤之前包括以下步骤:
-使B细胞群体与固定在固体表面的(靶)抗原培育,并(仅)回收结合于固定化抗原的B细胞。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是非人动物B细胞群体。在一个实施方案中,该B细胞群体是小鼠B细胞群体、或仓鼠B细胞群体、或兔B细胞群体。在一个优选实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体获自免疫后4天的非人动物的血液。在一个实施方案中,该B细胞群体获自免疫后4天至至多13天的非人动物的血液。
在一个实施方案中,该B细胞群体是人B细胞群体。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是通过密度梯度离心从血液获得。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞是成熟B细胞。
在所有方面的一个实施方案中,单细胞(单个)沉积入多孔板的孔中。
在所有方面的一个实施方案中,该饲养混合物是天然胸腺细胞培养上清(TSN)或合成饲养混合物。在一个实施方案中,该胸腺细胞培养上清获自幼小动物的胸腺。
在所有方面的一个实施方案中,该饲养混合物是合成饲养混合物。在一个实施方案中,该合成饲养混合物包含:
i)白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子α;和/或
ii)白细胞介素-2(IL-2)和/或白细胞介素-10(IL-10);和/或
iii)金黄色葡萄球菌Cowan菌株细胞(SAC);和/或
iv)白细胞介素-21(IL-21)和可选地白细胞介素-2(IL-2);和/或
v)肿瘤坏死因子家族的B细胞活化因子(BAFF);和/或
vi)白细胞介素-6(IL-6);和/或
vii)白细胞介素-4(IL-4)。
在所有方面的一个实施方案中,该饲养细胞是鼠EL-4B5细胞。
在一个实施方案中,该饲养细胞是鼠EL-4B5细胞,该饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-10及选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6的一种或多种。
在一个实施方案中,该饲养细胞是鼠EL-4B5细胞,该饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-10、SAC和IL-2。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该饲养细胞是鼠EL-4B5细胞,该饲养混合物胸腺细胞培养上清。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该饲养细胞是鼠EL-4B5细胞,该饲养混合物包含IL-1β、TNF-α及IL-2、IL-6和IL-10中的任意两种。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该饲养细胞是鼠EL-4B5细胞,该饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该饲养细胞是鼠EL-4B5细胞,该饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-10、SAC和IL-2或IL-6。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该饲养细胞是鼠EL-4B5细胞,该饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-21及IL-2、IL-10和IL-6中的至少一种。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该饲养细胞是表达兔CD40L的CHO细胞。在一个实施方案中,该饲养混合物包含IL-1和IL-21,并可选地包含IL-6。
在所有方面的一个实施方案中,该抗体是单克隆抗体。
在所有方面的一个实施方案中,该沉积细胞带有一个或四个荧光染料标记,该培育是与2至4种荧光标记抗体培育。
在所有方面的一个实施方案中,B细胞群体的B细胞的标记导致(总)B细胞群体中0.1%至2.5%的细胞的标记。
在所有方面的一个实施方案中,该标记是标记B细胞表面IgG。
在所有方面的一个优选实施方案中,该培育是与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG和细胞表面IgM),该选择是选择细胞表面IgG为阳性且细胞表面IgM为阴性的细胞(导致IgG+IgM-B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个优选实施方案中,该培育是与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗IgM抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG和细胞表面IgM),该选择是选择细胞表面IgG为阳性且细胞表面IgM为阴性的细胞(导致IgG+IgM-B细胞的单细胞沉积),由此使B细胞群体与固定在固体表面的(靶)抗原培育,并(仅)回收结合于固定化抗原的B细胞,并使之与荧光标记抗体培育。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该培育是与荧光标记的抗IgG抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG),该选择是选择细胞表面IgG为阳性的细胞(导致IgG+B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该培育是与荧光标记的抗CD138抗体培育(该标记是标记细胞表面CD138),该选择是选择细胞表面CD138为阳性的细胞(导致CD138+B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该培育是与荧光标记的抗IgG抗体和荧光标记的抗CD138抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG和细胞表面CD138),该选择是选择细胞表面IgG为阳性且细胞表面CD138也为阳性的细胞(导致IgG+CD138+B细胞的单细胞沉积)。
在所有方面的一个优选实施方案中,该B细胞群体是兔B细胞群体,该培育是与荧光标记的抗IgG抗体、荧光标记的抗IgM抗体和在人转基因兔的情况下与荧光标记的抗人IgG轻链抗体培育(该标记是标记细胞表面IgG、细胞表面IgM和可选地标记细胞表面人IgG轻链),该选择是选择细胞表面IgG为阳性、细胞表面IgM为阴性和可选地细胞表面人IgG轻链为阳性的细胞(导致IgG+IgM-B细胞(可选地gG+IgM-huIgGLC+B细胞)的单细胞沉积)。
在所有方面的一个实施方案中,该共培养是在包含补充了10%(v/v)FCS、1%(w/v)含有青霉素和链霉素的200mM谷氨酰胺溶液、2%(v/v)100mM丙酮酸钠溶液及1%(v/v)1M2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI 1640培养基的共培养培养基中。在一个实施方案中,该共培养培养基进一步包含0.05mMβ-巯基乙醇。
在一个实施方案中,该动物是实验动物。在一个实施方案中,该实验动物选自小鼠、仓鼠和兔。在一个实施方案中,该实验动物是兔。
附图简述
图1.IgG阳性孔中抗原特异性IgG阳性孔的平均频率。
图2.IgG阳性孔中抗原特异性IgG阳性孔的平均频率。
定义
“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明,本文所用的“结合亲和力”指内在的结合亲和力,其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域公知的方法来测量,包括本文中所述的那些。用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案在下文中描述。
本申请内所用的术语“氨基酸”指羧基α-氨基酸(carboxyα-amino acid)的组,其可以由核酸直接编码或以前体的形式编码。单个氨基酸由三个核苷酸组成的核酸(所谓的密码子或碱基三联体)编码。每种氨基酸由至少一个密码子编码。这称为“遗传密码的简并性”。本申请内所用的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸,包括丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:A)、精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his,H)、异亮氨酸(ile,I)、亮氨酸(leu,L)、赖氨酸(lys,K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser,S)、苏氨酸(thr,T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr,Y)和缬氨酸(val,V)。
本文中用术语“抗体”来指天然存在的抗体,包括其天然存在的结构变体。
例如,天然(人、小鼠、大鼠、兔)IgG抗体是分子量约为150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。天然IgG抗体由包含链间和链内二硫键的两条相同轻链和两条相同重链组成,使得全部四条链彼此共价连接。从N端至C端,每条重链具有可变区(VH),也称为可变重链结构域或重链可变结构域,随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3),由此柔性铰链区位于第一和第二恒定结构域之间。取决于其序列和结构域结构,可将抗体重链分配至称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的五种类型之一(抗体的“种类”)。这些中的几种可以进一步划分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。类似地,从N端至C端,每条轻链具有可变区(VL),也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域,随后是恒定轻链结构域(CL)。根据其恒定结构域的氨基酸序列,可以将抗体轻链分配至称为κ和λ的两种类型之一。
例如,天然(骆驼科动物,即来自胼足亚目(sub-order Tylopoda)骆驼科(Camelidae),其包括骆驼、单峰驼和羊驼)仅含重链的抗体(VHH)不包含见于常规IgG重链中的经典CH1结构域,因此表达为直接与抗体铰链区-CH2-CH3结构域融合的VHH结构域。来自羊驼来源的VHH抗体的可变区序列例如类似于人VH3家族可变结构域中的序列(Schroeder等,Int.Immunol.2(1989)41-50)。与IgG类型抗体相比,L.llama VHH结构域中的CDR3结构域氨基酸序列平均比大多数含有重链和轻链的经典IgG类型抗体的CDR3结构域长。与经典IgG抗体一样,可通过本领域公知的方法(参见US 5,637,677)来确定VHH抗体中CDR的位置。残基11、37、44、45和47对链界面的形成很重要(参见例如WO 99/42077)。
“抗体片段”指除完整抗体(IgG/VHH=四链/两链)以外的仅包含完整抗体的部分且结合该完整抗体所结合的相同抗原的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2;双抗体;线性抗体;单链抗体分子(例如scFv);单结构域抗体;及从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“细胞”包括用于繁殖质粒的原核细胞和用于表达核酸的真核细胞二者。在一个实施方案中,该真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中,该哺乳动物细胞是CHO细胞,可选地是CHO K1细胞(例如ATCC CCL-61或DSM ACC 110)、或CHO DG44细胞(也称为CHO-DHFR[-],例如DSM ACC 126)、或CHO XL99细胞、CHO-T细胞(参见例如Morgan,D.等,Biochemistry 26(1987)2959-2963)、或CHO-S细胞、或Super-CHO细胞(Pak,S.C.O.等Cytotechnol.22(1996)139-146)、或BHK细胞、或NS0细胞、或Sp2/0细胞、或HEK 293细胞、或HEK 293EBNA细胞、或PER.细胞、或COS细胞。如果这些细胞不适应在无血清培养基中生长或悬浮生长,则可在用于本发明前进行修改。本文所用的表述“细胞”包括主题细胞及其后代。因此,词语“转化体”和“转化细胞”包括原代主题细胞和从其衍生的培养物,不考虑转移或传代的次数。还应理解,所有后代可由于故意或非故意的突变而在DNA含量上并非精确相同。具有与在最初转化的细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的变体后代也包括在内。
术语“克隆”指产生自/源自单个B细胞的分裂且分泌抗体的B细胞的群体。因此,B细胞克隆是B细胞的同质群体,且产生单克隆抗体。
术语“抗体可变结构域关连对”指从单个分泌抗体的B细胞(克隆)获得的抗体可变结构域对,即其在动物免疫反应期间由于与免疫原性分子接触而作为一对产生或在展示方法期间随机组装。
术语“实验动物”指非人动物。在一个实施方案中,该实验动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、骆驼、羊驼、非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、鲨鱼和爬行动物。在一个实施方案中,该实验动物是兔。
本文所用的术语“表达”指细胞内发生的转录和/或翻译和分泌过程。可以基于细胞中存在的相应mRNA的量来测定目的核酸序列在细胞中的转录水平。例如,可通过qPCR或RT-PCR或通过Northern杂交来定量从目的序列转录的mRNA(参见Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。核酸编码的多肽可通过多种方法来定量,例如,通过ELISA,通过测定多肽的生物学活性,或通过利用独立于这种活性的测定,如使用识别并结合该多肽的免疫球蛋白的Western印迹或放射免疫测定(参见Sambrook等,(1989),上文)。
将例如多肽的氨基酸序列转化为编码此氨基酸序列的相应核酸序列的流程和方法为本领域技术人员公知,反之亦然。因此,核酸的特征在于其核酸序列包含单个核苷酸以及由其编码的多肽的氨基酸序列。
“表达盒”指包含在细胞中表达所包含的至少一个核酸所必需的调节元件(如启动子和聚腺苷酸化位点)的构建体。
表达可以作为瞬时表达或稳定表达进行。抗体通常由产生它的细胞分泌入培养基。因此,未成熟的抗体链包含抗体转运/分泌通过细胞壁进入胞外培养基所必需的N端延长(也称为信号序列)。通常,用于重组产生抗体的信号序列可以源自编码分泌性多肽的任意基因。如果使用异源信号序列,则它应是宿主细胞可识别和加工(即通过信号肽酶切割)的信号序列。对于酵母中的分泌,例如,可将待表达的异源基因的天然信号序列替换为源自分泌性基因的同源酵母信号序列,如酵母转化酶信号序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula)α因子前导序列,第二种描述于US 5,010,182中)、酸性磷酸酶信号序列、或白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶信号序列(EP 0 362 179)。在哺乳动物细胞中,天然信号序列可满足需要,但其他哺乳动物信号序列可以是适宜的,如来自相同或相关物种的其他分泌性多肽的信号序列以及病毒分泌信号序列,例如单纯疱疹病毒糖蛋白D信号序列。编码这种前区段的DNA片段与编码抗体链的DNA片段符合读框地连接,即有效连接。
术语“表达机器”指细胞的酶、辅因子等的总和,其涉及以核酸或基因的转录步骤(即也称为“基因表达机器”)开始至核酸所编码的多肽的翻译后修饰的基因表达步骤。表达机器例如包含DNA转录为前mRNA、前mRNA剪接为成熟mRNA、mRNA翻译为多肽和多肽翻译后修饰的步骤。
“表达质粒”或“表达载体”是提供在宿主细胞中表达所包含的一个或多个结构基因所需的全部元件的核酸。通常,表达质粒/载体包含含有复制起点的例如用于大肠杆菌的原核质粒繁殖单位,选择标记,真核选择标记,及用于表达一个或多个目的结构基因的一个或多个表达盒,该表达盒各含有启动子、结构基因、可选地转录终止子和聚腺苷酸化信号。通常将基因表达置于启动子的控制下,这种结构基因称为与启动子“有效连接”。类似地,如果调节元件调节核心启动子的活性,则调节元件和核心启动子有效连接。
术语“饲养混合物”指促进B细胞的活化和/或存活和/或抗体分泌的不同添加剂(如生长因子、细胞因子和/或其他蛋白质)的组合。饲养混合物可以是例如获自胸腺细胞培养上清(TSN)的天然饲养混合物,胸腺细胞培养上清是细胞因子的非确知组合。备选地,饲养混合物可以是合成饲养混合物,合成饲养混合物是促进B细胞的活化和/或存活和/或抗体分泌的不同重组产生或化学合成添加剂(如生长因子、细胞因子和/或其他蛋白质)的确知组合。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用,指已将外源核酸引入其中的细胞,包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”或“转染体”和“转化细胞”和“转染细胞”,其包括最初转化细胞及从其衍生的后代,而不考虑传代数。后代的核酸含量可以并非与亲本细胞完全相同,而是可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体,该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。此人抗体定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“个体(individual或subject)”是脊椎动物。在一个实施方案中,该脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类,如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中,该个体是人。在其他实施方案中,该个体是兔。
术语“标记”指用于确定表面标志的存在或缺乏的方法,该表面标记可以通过标记的抗表面标志抗体与细胞的特异性结合的结合/非结合来测定。因此,在使细胞或细胞群体与各特异性结合和标记的抗表面标志抗体培育后,例如在荧光标记的情况下通过荧光的存在确定标明标志的存在,而通过荧光的缺乏确定标明标志的缺乏。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自由单细胞克隆产生的基本同质的抗体群体的抗体,即除了例如包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现的可能的变体抗体(这类变体通常以较小的量存在)外,包含该群体的单种抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体抗抗原上的单个决定簇。因此,修饰词“单克隆”指抗体获自基本同质的抗体群体的特性,而不解释为需要通过任意具体方法来产生该抗体。例如,将要按照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备,其包括但不限于利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文描述用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
术语“核酸”和“核酸序列”指包含单核苷酸(也称为碱基)a、c、g和t(或RNA中的u)(例如DNA、RNA)或其修饰的聚合分子。此多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或合成多核苷酸分子或一个或多个天然存在的多核苷酸分子与一个或多个合成多核苷酸分子的组合。此定义还涵盖其中改变(例如通过诱变)、缺失或添加了一个或多个多核苷酸的天然存在的多核苷酸分子。核酸可以是分离的,或整合在另一核酸中,例如表达盒、质粒/载体或宿主细胞染色体中。核酸的特征在于其核酸序列包含单核苷酸。
“有效连接的”指两种或多种成分的并列,其中所述成分处于允许它们以其预期方式发挥作用的关系中。例如,如果启动子和/或增强子顺式作用来控制或调节所连接的序列的转录,则它与编码序列有效连接。通常,但并非必然,“有效连接的”DNA序列是相邻的,且在有必要连接两个蛋白质编码区(如分泌前导序列和多肽)时是相邻和符合(可读)框的。但是,虽然有效连接的启动子通常位于编码序列的上游,但它并非必然与该编码序列相邻。增强子无需是相邻的。如果增强子增加编码序列的转录,则该增强子与该编码序列有效连接。有效连接的增强子可以位于编码序列上游、编码序列内或编码序列下游,且距启动子相当的距离。如果聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游端,使得转录通过该编码序列进入该聚腺苷酸化序列,则它与该编码序列有效连接。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游端(3’端),使得翻译通过该编码序列行进至该终止密码子并在此处终止,则它与该外显子核酸序列有效连接。通过本领域已知的重组方法来实现连接,例如,使用PCR法和/或通过在方便的限制位点处连接。如果不存在方便的限制位点,则按照常规实施使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“结构基因”指不含信号序列的基因区域,即编码区。
术语“特异性结合”及其语法等同形式指抗体以10-7M或更小、在一个实施方案中以10-8M至10-13M、在另一实施方案中以10-9M至10-13M的解离常数(KD)结合其靶标。该术语进一步用来指抗体不特异性结合所存在的其他生物分子,即它以10-6M或更大、在一个实施方案中以10-6M至1M的解离常数(KD)结合其他生物分子。
“转染质粒/载体”是提供在宿主细胞中表达该转染质粒/载体中所包含的一个或多个编码核酸/结构基因所需的全部元件的核酸(也称为核酸分子)。转染质粒/载体包含转而含有复制起点的例如用于大肠杆菌的原核质粒繁殖单位,赋予对原核选择剂的抗性的核酸,转染质粒/载体进一步包含一个或多个赋予对真核选择剂的抗性的核酸,及一个或多个编码目的多肽的核酸。赋予对选择剂的抗性的核酸和编码目的多肽的一个或多个核酸各置于表达盒内,由此各表达盒包含启动子、编码核酸和转录终止子(包括聚腺苷酸化信号)。通常将基因表达置于启动子的控制下,这种结构基因称为与启动子“有效连接”。类似地,如果调节元件调节核心启动子的活性,则调节元件和核心启动子有效连接。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及抗体与其抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构,每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt,T.J.等,KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外,可以通过分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补的VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体(参见例如Portolano,S.等,J.Immunol.150(1993)880-887;Clackson,T.等,Nature 352(1991)624-628)。
术语“幼小动物”指性成熟发生之前的动物。幼小仓鼠例如是年龄小于6周、尤其是小于4周的仓鼠。幼小小鼠例如是年龄小于8周、尤其是小于5周的小鼠。
发明详述
本发明至少部分基于这样的发现,从其取得用于与B细胞共培养的EL4-B5饲养细胞的培养细胞密度对在B细胞和EL-4-B5饲养细胞共培养中获得的分泌抗原特异性抗体的B细胞克隆的频率(即相对数目)有影响。此发现令人惊奇,因为本领域教导,单纯EL-4B5培养中不应超过1,000,000细胞/ml的最大EL4-B5细胞密度。已发现,情况并非如此,可以使用甚至更高的细胞密度,其允许更有效地产生EL4-B5细胞,即可以减少培养的次数,因为可以使用更高细胞密度而不改变用于共培养的EL4-B5细胞数目。
本发明至少部分基于这样的发现,在用于共培养的EL-4B5细胞获自在收获EL-4B5细胞时具有高于所公开的细胞密度(即高于500,000细胞/ml)的EL-4B5细胞密度的培养物时,所有IgG阳性孔中抗原结合和IgG阳性孔的总体频率提高。在至多1,500,000细胞/ml的细胞密度观察到了此效应。
免疫
为了产生治疗性抗体,或者用治疗靶标(单独或与免疫原性刺激组合)免疫非人动物以引发免疫应答,或者使用合成方法,如噬菌体展示文库。如果使用转基因动物(即具有人免疫系统)或人噬菌体展示文库,则获得人抗体。否则获得将在之后进行人源化的非人动物抗体。获得潜在治疗性抗体的罕见可能性是从已从疾病恢复的人类的血液获得。
通常用非人动物(如小鼠、兔、仓鼠和大鼠)作为动物模型来评价基于抗体的治疗。因此,通常需要提供结合非人动物抗原以及人抗原的交叉反应性抗体。
在本文报道的方法中,可以使用获自任意来源(例如人、小鼠、仓鼠或兔)的B细胞。取决于B细胞的来源,调整/选择饲养细胞和饲养混合物。
在兔B细胞的情况下,饲养细胞是EL4-B5细胞或表达兔CD40L的哺乳动物细胞,如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞。在一个实施方案中,该兔选自新西兰白(NZW)兔、齐默尔曼兔(ZIKA)、艾丽西亚突变品系兔、巴西利亚突变品系兔、具有人免疫球蛋白基因座的转基因兔、rbIgM敲除兔及其杂交种。
在人B细胞的情况下,饲养细胞是EL4-B5细胞或表达人CD40L的哺乳动物细胞,如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞。
在鼠B细胞的情况下,饲养细胞是EL4-B5细胞或表达小鼠CD40L的哺乳动物细胞,如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞。在一个实施方案中,该小鼠是NMRI小鼠或balb/c小鼠。
在仓鼠B细胞的情况下,饲养细胞是EL4-B5细胞或表达仓鼠CD40L的哺乳动物细胞,如CHO细胞或BHK细胞或HEK细胞。在一个实施方案中,该仓鼠选自亚美尼亚仓鼠(Cricetulus migratorius)、中国仓鼠(Cricetulus griseus)和叙利亚仓鼠(Mesocricetulus auratus)。在优选实施方案中,该仓鼠是亚美尼亚仓鼠。
B细胞的来源和分离
血液提供高多样性的产抗体B细胞。从其获得的B细胞克隆分泌在CDR内几乎没有相同或重叠的氨基酸序列的抗体,因此显示高多样性。
在一个实施方案中,例如来自血液的B细胞获自免疫后4天至免疫后至多14天或最近一次加强免疫的非人动物。此时间跨度允许本文报道的方法中的高度灵活性。在此时间跨度内,提供最精炼抗体的B细胞可能从脾脏迁移至血液(参见例如Paus,D.等,JEM 203(2006)1081–1091;Smith,K.G.S.等,The EMBO J.16(1997)2996–3006;Wrammert,J.等,Nature 453(2008)667-672)。
来自例如非人动物血液或来自人血液的B细胞可以用本领域已知的任意方法获得。例如,可以使用密度梯度离心(DGC)或红细胞细胞裂解(裂解)。与低渗裂解相比,密度梯度离心提供了更高的总体产率,即B细胞克隆数。此外,从通过密度梯度离心获得的细胞,更大量的细胞在共培养步骤中分裂和生长。与用不同方法获得的细胞相比,所分泌的抗体浓度也更高。因此,在一个实施方案中,通过密度梯度离心提供B细胞群体。
备选地,可以从脾脏或其他次级免疫器官如淋巴结或淋巴集结获得B细胞。
共培养前的选择步骤
可以从外周血单核细胞(PBMC)富集产生特异性结合抗原的抗体的B细胞。因此,在本文报道的所有方法的一个实施方案中,从外周血单核细胞(PBMC)富集B细胞群体。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中,该PBMC排除了巨噬细胞。对共培养步骤而言,这对兔来源的B细胞尤其有利。
可以通过黏附于细胞培养板表面来从PBMC排除巨噬细胞(参见预培育步骤)。
与从非人动物(在一个实施方案中,该非人动物是兔)的血液分离并可选地富集B细胞群体后直接沉积单细胞相比,在单细胞沉积前在共培养培养基中培育B细胞群体可增加在单细胞沉积后获得的抗体分泌细胞的总数。具体而言,该培育是在EL-4B5培养基中在约37℃进行约1小时,例如使用细胞培养箱。
在本文报道的方法的一个实施方案中,该细胞来自蛋白质免疫的动物,并在标记前排除巨噬细胞。
通过使用淘选方法,可以分别减少或富集不产生结合抗原的抗体的细胞或产生结合抗原的抗体的细胞。其中各抗原附着于表面呈递,在进一步处理结合细胞的情况下选择性富集细胞群体中与之结合的细胞,或在进一步处理保留在溶液中的细胞的情况下减少细胞群体中与之结合的细胞。
在一个实施方案中,本文报道的方法在单细胞沉积前包括选择步骤,其中基于细胞表面标志和荧光激活细胞分选/门控选择产生特异性和/或非交叉反应性抗体的B细胞。在一个实施方案中,分选/富集/选择成熟B细胞。为了从不同的非人动物物种选择B细胞,可以使用不同的细胞表面标志。
通过标记非靶细胞群体和非特异性结合淋巴细胞,可能选择性排除这些细胞。在此排除步骤中,仅可达到部分排除。虽然此排除不是定量的,但它减少或甚至消除随后荧光标记剩余细胞中的干扰细胞数目。通过使用标记的荧光激活细胞分选对成熟B细胞(记忆B细胞、亲和力成熟的浆母细胞和将细胞)进行的单细胞沉积,可以在共培养步骤中获得更高数目的IgG+孔/细胞克隆。
可以通过使用不同表面标志来标记不同细胞群体,如CD3+细胞(T细胞)、CD19+细胞(B细胞)、IgM+细胞(成熟的幼稚B细胞)、IgG+细胞(成熟B细胞)、CD38+细胞(例如浆母细胞)和IgG+CD38+细胞(前浆细胞)。
可获得用于选择成熟IgG+B细胞(如记忆B细胞、浆母细胞和浆细胞)的免疫荧光标记。为了选择或富集B细胞,对细胞进行单标记、双标记或三标记。
表:用于测定成熟小鼠(A-J)、仓鼠(K)和兔(L-N)B细胞的免疫荧光标记。
B细胞来源 | 用以下分选B细胞 | 所有活细胞的比例(%) |
小鼠 | IgG+CD19+ | 0.5±0.2n=14 |
小鼠 | IgG+CD38+ | 0.8±0.5n=9 |
小鼠 | IgG+CD138+ | 0.06±0.07n=6 |
小鼠 | IgG-CD138+ | 0.6±0.5n=6 |
小鼠 | IgG+CD27+ | 0.1±0.1n=8 |
小鼠 | CD27+CD138+ | 1.5±0.5n=2 |
小鼠 | CD27+IgG+CD3- | 0.10±0.04n=3 |
小鼠 | CD3-CD27+ | 1.33n=1 |
小鼠 | IgG+CD268+ | 0.8n=1 |
小鼠 | CD38+CD3- | 12±7n=2 |
仓鼠 | IgG+IgM- | 0.6±0.1n=15 |
兔 | IgG+ | 0.6±0.2,n=5 |
兔 | IgG+IgM- | 0.4±0.2,n=2 |
兔 | IgG+CD138+ | 0.3±0.1,n=5 |
在一个实施方案中,该方法包括排除B细胞群体的巨噬细胞和富集B细胞群体的分泌特异性结合靶抗原的抗体的B细胞的步骤。
单细胞沉积
本文报道的方法包括将B细胞群体的B细胞沉积为单细胞的步骤。在本文报道的所有方法的一个实施方案中,沉积为单细胞是通过荧光激活细胞分选(FACS)。用于FACS单细胞沉积所需的标记的表面标志可以使用本文所列特异性标志组合。
单细胞沉积之后和共培养之前的附加离心步骤可以增加抗体分泌细胞的数目和所分泌的IgG的量。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中,该方法在共培养之前包括离心单个沉积细胞的步骤。在一个优选实施方案中,该离心按300xg进行5分钟。
共培养
在饲养混合物存在下将单个沉积B细胞与鼠EL-4-B5饲养细胞共培养。
如上文所述,通过适宜的免疫荧光标记可以达到共培养步骤中产率(IgG+孔/细胞克隆的数目以及IgG浓度)的提高以及来自PBMC的鼠IgG+B细胞的富集或分离。
用于获自实验非人动物血液的B细胞的免疫荧光标记也可以用于标记获自实验非人动物(如小鼠、仓鼠和兔)的脾脏和其他免疫器官的B细胞。对于兔血液来源的B细胞,在排除巨噬细胞后发现0.2%的IgG+细胞。在排除巨噬细胞后,来自兔的淋巴集结显示0.4%的IgG+细胞,脾脏显示0.3%的IgG+细胞。
对于本文报道的方法,在共培养约七(7)天后,即5、6、7或8天后、尤其是7或8天后,可以获得约30ng/ml至15μg/ml或更高的抗体浓度(平均值约500ng/ml)。对于由此提供的抗体量,可以进行高数目的不同分析来例如就结合特异性更详细地表征抗体。通过在筛选/选择过程的此早期阶段改善抗体表征,可能减少必须进行的所需的核酸分离和测序反应的数目。此外,B细胞克隆提供了一定量的允许使用简并PCR引物的编码单克隆抗体轻链和重链可变区的mRNA,避免了高特异性引物的需要。所需PCR循环数也减少。因此,在一个实施方案中,反转录酶PCR是使用轻链和重链可变结构域的简并PCR引物。
与饲养细胞的共培养步骤可以提前以及后加许多附加步骤。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中,该饲养混合物是胸腺细胞培养上清。在具体实施方案中,该胸腺细胞培养上清获自各非人动物胸腺的胸腺细胞。
由于饲养混合物的来源(其源自培养的胸腺细胞的上清(胸腺细胞培养上清-TSN)),可以出现显著的批次与批次的变异。
为了克服此变异性,可以利用包含合成成分的合成饲养混合物。
从Tucci,A.等,J.Immunol.148(1992)2778-2784已知包含IL-1β(白细胞介素-1β)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-2(白细胞介素-2)和IL-10(白细胞介素-10)的合成饲养混合物。
用于合成饲养混合物的B细胞物种特异性添加剂可导致各B细胞克隆所分泌的抗体的量增加。同时,高产细胞包含更多mRNA,这转而便于例如用冗余、非特异性引物组反转录和测序编码核酸。
通过加入SAC(金黄色葡萄球菌Cowan菌株细胞,使用单个SAC批次),可以提高分泌抗体的B细胞的数目和共培养后上清中的平均IgG浓度。对于在共培养中加入SAC,可以定义浓度范围,因为SAC浓度的降低以及提高减少所分泌的抗体的量。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中,用于共培养鼠B细胞的合成饲养混合物包含IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α和BAFF。在一个实施方案中,按5ng/ml的浓度加入BAFF。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中,用于共培养仓鼠B细胞的合成饲养混合物包含IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α、IL-6和SAC。在一个实施方案中,按10ng/ml的浓度加入IL-6。在一个实施方案中,按1:75,000的比例加入SAC。
在EL-4B5饲养细胞存在下,小鼠、仓鼠和兔B细胞的共培养至少需要IL-1β和TNF-α。对于鼠细胞的共培养,可以省去IL-2和IL-10。仓鼠B细胞可以在缺乏IL-2或IL-10的情况下培养。兔B细胞可以在缺乏IL-2或IL-10或IL-6的情况下培养。
在一个实施方案中,IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-10和IL-21是重组的鼠IL-1β、鼠TNF-α、鼠IL-2、鼠IL-10和鼠IL-21。
在一个实施方案中,按5ng/ml的浓度加入BAFF。
在一个实施方案中,按10ng/ml的浓度加入IL-6。
在一个实施方案中,按1:75,000的比例加入SAC。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中,该共培养是在具有圆底孔的聚苯乙烯多孔板中。在本文报道的所有方法的一个实施方案中,孔的工作体积为50μl至250μl。在一个实施方案中,该孔至少部分用从聚合物塑料树脂和两亲性分子的混合物制备的非纤维底材包被,其中两亲性分子包含亲水部分和疏水区,其中疏水区锚定在底材内,亲水部分暴露在底材上。在一个实施方案中,该两亲性分子选自乙氧基化烷基胺、聚(乙烯亚胺)、辛基德洒明碱(octyldecamine)或其混合物(参见例如EP 1 860 181)。
共培养细胞的表征
为了在共培养后(定性和定量)测定所分泌的IgG,通常可以使用本领域技术人员已知的所有方法,如ELISA。在本文报道的所有方法的一个实施方案中,使用ELISA。
取决于表征结果,可以获得(即选择)B细胞克隆。术语“克隆”指产生自/源自单个B细胞的分裂且分泌抗体的B细胞的群体。因此,B细胞克隆产生单克隆抗体。
mRNA的分离、克隆和测序
可以从B细胞分离总mRNA,并转录为cDNA。使用特异性引物,可以扩增关连VH和VL区编码核酸。几乎未获得相同的序列。该方法提供高度多样的结合相同抗原的抗体。
用于扩增VH编码核酸的引物可以用于从来自NMRI小鼠、亚美尼亚仓鼠、Balb/c小鼠以及叙利亚仓鼠和兔的细胞获得的cDNA。
在本文报道的所有方法的一个实施方案中,氨基酸序列源自所扩增的VH编码核酸,通过将氨基酸序列EVQL/QVQL(SE ID NO:40和41)定位至VSS(VH区)(SEQ ID NO:42)和DIVM/DIQM(SEQ ID NO:43和44)定位至KLEIK(VL区)(SEQ ID NO:45)来鉴定精确的起始点和结束点。
本文还报道用于产生抗体的方法,其包括以下步骤:
a)提供(获自实验非人动物血液的)(成熟)B细胞群体;
b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中,用1至4种或2至4种荧光染料)染色B细胞群体的细胞;
c)在单个容器(在一个实施方案中,容器是多孔板的孔)中沉积经染色的B细胞群体的单细胞;
d)在饲养细胞和饲养混合物(在一个实施方案中,饲养细胞是EL-4B5细胞,在一个实施方案中,饲养混合物是天然TSN,在一个实施方案中,饲养混合物是合成饲养混合物)的存在下培养沉积的单B细胞;
e)测定单B细胞培养中分泌的抗体的结合特异性;
f)通过反转录酶PCR和核苷酸测序及由此获得单克隆抗体可变轻链和重链结构域编码核酸来确定特异性结合抗体的可变轻链和重链结构域的氨基酸序列;
g)将单克隆抗体轻链和重链可变结构域编码核酸引入用于表达抗体的表达盒;
h)将核酸引入细胞;
i)培养细胞,并从细胞或细胞培养物上清回收抗体,从而产生抗体。
在一个实施方案中,该非人动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。
本文报道的方法
本发明至少部分基于这样的发现,在与B细胞共培养中使用获自具有超过500,000细胞/ml、尤其是在600,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml范围内的(最终)细胞密度的EL4-B5细胞培养物的EL4-B5饲养细胞是有利的。
本文报道的一个方面是用于共培养一个或多个B细胞的方法,其包括步骤:
-使该一个或多个B细胞与EL4-B5细胞培育;
由此该EL4-B5细胞获自/来自具有600,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml的细胞密度的EL4-B5细胞培养物。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物具有650,000细胞/ml至1,450,000细胞/ml的细胞密度。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物具有650,000细胞/ml至825,000细胞/ml的细胞密度。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物具有700,000细胞/ml至775,000细胞/ml的细胞密度。
在一个实施方案中,该EL4-B5细胞培养物具有1,400,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml的细胞密度。
下文中以两种表达具有不同结合特异性的抗体的B细胞制备物示例该方法。
在第一个实例中,使用获自用人CDCP1免疫的兔的B细胞。
在多孔板(各三块96孔板;每种EL4-B5细胞密度252个孔)的孔中将获自免疫的兔的B细胞沉积为单细胞。在TSN和SAC存在下将各单沉积细胞与50,000个用50戈瑞照射的EL4-B5细胞共培养7天。
无论从其取得EL4-B5细胞的培养物细胞密度是多少,IgG阳性孔(即可以在其中的共培养上清中检测到IgG的孔)的平均频率都相当(参见下表)。
表.
EL4-B5培养物细胞密度[x1000/ml] | 285 | 435 | 535 | 655 | 775 |
每块板的IgG阳性孔[%] | 49.6 | 42.4 | 39.7 | 38.9 | 42.1 |
无论从其取得EL4-B5细胞的培养物细胞密度是多少,平均生产力也相当(参见下表)。
表.
EL4-B5培养物细胞密度[x1000/ml] | 285 | 435 | 535 | 655 | 775 |
每块板的平均IgG浓度[μg/ml] | 1.2 | 1.0 | 1.1 | 1.5 | 0.9 |
只有对于从其取得EL4-B5细胞的低和高细胞密度培养物,总孔的抗原特异性IgG阳性孔(即其中产生特异性结合靶抗原的IgG的孔)的平均频率相当(参见下表)。
表.
EL4-B5培养物细胞密度[x1000/ml] | 285 | 435 | 535 | 655 | 775 |
每块板的抗原特异性IgG孔[%总孔] | 24.6 | 13.5 | 15.9 | 25.4 | 28.6 |
只有对于从其取得EL4-B5细胞的高细胞密度培养物,IgG阳性孔的抗原特异性IgG阳性孔(即其中产生特异性结合靶抗原的IgG的孔)的平均频率相当(参见下表和图1)。
表.
EL4-B5培养物细胞密度[x1000/ml] | 285 | 435 | 535 | 655 | 775 |
每块板的抗原特异性IgG孔[%IgG阳性孔] | 51.5 | 32.6 | 39.2 | 65.6 | 68.6 |
在第二个实例中,使用获自用人血清白蛋白免疫的兔的B细胞。
在多孔板(各两块96孔板;每种EL4-B5细胞密度168个孔)的孔中将获自免疫的兔的B细胞沉积为单细胞。在TSN和SAC存在下将各单沉积细胞与50,000个用50戈瑞照射的EL4-B5细胞共培养7天。
从其取得EL4-B5细胞的培养物中直至1,450,000细胞/ml的细胞密度,IgG阳性孔(即可以在其中的共培养上清中检测到IgG的孔)的平均频率都相当(参见下表)。
表.
EL4-B5培养物细胞密度[x1000/ml] | 295 | 510 | 700 | 1100 | 1450 | 1710 | 2275 |
每块板的IgG阳性孔[%] | 70.3 | 61.3 | 65.5 | 67.3 | 53.0 | 38.1 | 55.4 |
从其取得EL4-B5细胞的培养物中直至1,450,000细胞/ml的细胞密度,平均生产力也相当(参见下表)。
表.
EL4-B5培养物细胞密度[x1000/ml] | 295 | 510 | 700 | 1100 | 1450 | 1710 | 2275 |
每块板的平均IgG浓度[μg/ml] | 4.8 | 4.1 | 4.4 | 3.9 | 3.8 | 2.3 | 2.1 |
从其取得EL4-B5细胞的培养物中直至1,450,000细胞/ml的细胞密度,总孔的抗原特异性IgG阳性孔(即其中产生特异性结合靶抗原的IgG的孔)的平均频率相当(参见下表)。
表.
EL4-B5培养物细胞密度[x1000/ml] | 295 | 510 | 700 | 1100 | 1450 | 1710 | 2275 |
每块板的抗原特异性IgG孔[%总孔] | 23.8 | 20.3 | 26.2 | 23.2 | 21.5 | 8.4 | 7.8 |
在从其取得EL4-B5细胞的培养物中约700,000细胞/ml和约1,450,000细胞/ml的细胞密度下,IgG阳性孔的抗原特异性IgG阳性孔(即其中产生特异性结合靶抗原的IgG的孔)的平均频率提高(参见下表和图2)。
表.
提供以下实施例和序列来辅助理解本发明,本发明的真实范围在所附权利要求书中显示。应理解,可在所示流程中进行修改而不背离本发明的精神。
实施例
材料和方法
重组DNA技术
用Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所述的标准方法来操作DNA。分子生物学试剂按厂家说明书使用。
培养基和缓冲液
用于ELISA的封闭缓冲液包含1X PBS和1%BSA。
用于ELISA的包被缓冲液包含4.29g Na2CO3*10H2O和2.93g NaHCO3,加水至1L终体积,用2N HCl调节pH9.6。
用于RNA分离的乙醇溶液包含70%乙醇或80%乙醇。
用于免疫荧光染色的FACS缓冲液包含1X PBS和0.1%BSA。
用于ELISA的IMDM缓冲液包含1X PBS、5%IMDM和0.5%BSA。
用于ELISA的培育缓冲液1包含1X PBS、0.5%CroteinC。
用于ELISA的培育缓冲液2包含1X PBS、0.5%CroteinC和0.02%Tween 20。
用于ELISA的培育缓冲液3包含1X PBS、0.1%BSA。
用于ELISA的培育缓冲液4包含1X PBS、0.5%BSA、0.05%Tween、PBS(10X)、0.01MKH2PO4、0.1M Na2HPO4、1.37M NaCl、0.027M KCl、pH 7.0。
PCR缓冲液包含500mM KCl、15mM MgCl2、100mM Tris/HCl、pH 9.0。
用于ELISA的洗涤缓冲液1包含1X PBS、0.05%Tween 20。
用于ELISA的洗涤缓冲液2包含1X PBS、0.1%Tween 20。
用于ELISA的洗涤缓冲液3包含水、0.9%NaCl、0.05%Tween 20。
EL-4B5培养基包含补充了10%FCS(Hyclone,Logan,UT,USA)、2mM谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素溶液(PAA,Pasching,奥地利)、2mM丙酮酸钠、10mM HEPES(PAN Biotech,Aidenbach,德国)和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco,Paisley,Scotland)的RPMI 1640(PanBiotech,Aidenbach,德国)。
动物管理和免疫
按照德国动物保护法(TierSCHG)以及按照各欧洲指南饲养实验动物。
抗原首先与弗氏完全佐剂(CFA)一起应用。其他应用是使用弗氏不完全佐剂(IFA)。皮下应用含抗原的乳剂,由此取决于接受实验动物的重量,乳剂包含50至100μg抗原量。
用NZW兔(Charles River Laboratories International,Inc.)进行免疫。将抗原按1mg/ml的浓度溶解在K3PO4缓冲液pH 7.0中,并与弗氏完全佐剂混合(1:1),直至产生稳定乳剂。兔接受2ml乳剂皮内(i.d.)注射,然后按一周间隔接受各1ml的第二次肌内(i.m.)注射和第三次皮下(s.c.)注射。两周后进行第四次1ml i.m.注射,然后按四周间隔再进行两次1ml s.c.注射。
免疫期间,用抗原特异性测定测定血清抗体效价。在IC50为1:10000的抗体效价,取出免疫动物的血液或脾脏。为了再活化抗原特异性B细胞,在取出血液或脾脏前三天对实验动物静脉内应用30μg至50μg抗原。
器官、血液和巨噬细胞的取出
通过穿刺眼球后(retrobulberic)静脉来从小鼠和仓鼠获得血液。通过穿刺耳静脉或对于更大体积通过穿刺耳动脉来从兔获得血液。在第三、第四、第五和第六次免疫后4-6天从兔采集全血(10ml),用于通过FACS进行单细胞分选。
通过附着于细胞培养塑料来从所获得的血液分离巨噬细胞。对于小鼠和仓鼠,通过此方法可从每只动物获得约3*105个巨噬细胞。
如果需要更大量的小鼠或仓鼠巨噬细胞,则分离腹膜巨噬细胞。对此,动物必须具有至少3月龄。为了取出腹膜巨噬细胞,处死动物,立即将5ml温度为37℃的EL-4B5培养基注入腹腔。按摩动物腹部5分钟后,取出含有细胞的溶液。
用1xPBS将含EDTA的全血稀释两倍,然后在lympholyte mammal(CedarlaneLaboratories)或Ficoll Paque Plus(GE Healthcare,目录号17-1440-03)上进行密度离心,进行这来分离兔PBMC。洗涤PBMC两次,然后用抗体染色。
密度梯度离心
通过按厂家说明书A用(-mammal,Cedarlane)进行密度梯度离心来实现外周血单核细胞(PBMC)的分离。
用磷酸缓冲盐溶液(PBS)2:1稀释所抽的血。在离心管中,提供相同体积的密度分离介质,通过管壁小心加入稀释的血液。离心管800x g无制动离心20分钟。从白色中间层获得淋巴细胞。取出的细胞补充10ml PBS,800x g离心10分钟。弃上清,将沉淀重悬、洗涤、离心。最终沉淀重悬在PBS中。
红细胞的低渗裂解
为了通过低渗裂解破坏红细胞,用水1:10稀释氯化铵溶液(BD LyseTM),并按1:16的比例加至全血。为了裂解红细胞,避光培育混合物15分钟。为了从完整细胞分离细胞碎片,将溶液800x g离心10分钟。弃上清,沉淀重悬在PBS中,再次洗涤,离心,并将沉淀重悬在PBS中。
实施例8。
巨噬细胞的排除
用无菌6孔板(细胞培养级)来通过非特异性黏附排除巨噬细胞和单核细胞。用KLH(匙孔血蓝蛋白)或用链霉抗生物素蛋白和对照肽包被孔。每个孔装入3ml至(最多)4ml培养基和至多6x106个来自免疫的兔的外周血单核细胞,使其在培养箱中37℃结合60至90分钟。然后将含有淋巴细胞的上清转移至离心管,800x g离心10分钟。沉淀重悬在PBS中。
抗原特异性B细胞的富集
用包被缓冲液将各抗原稀释至2μg/ml终浓度。将3ml此溶液加至6孔多孔板的孔,室温过夜培育。使用前,去除上清,用PBS洗涤孔两次。调节B细胞溶液至细胞密度为2x 106细胞/ml,在6孔多孔板的每个孔中加入3ml(每3-4ml培养基至多6x106细胞)。37℃培育平板60至90分钟。去除上清,通过用1xPBS小心洗涤孔1-4次来去除非黏附细胞。为了回收粘性抗原特异性B细胞,向多孔板的孔中加入1ml胰蛋白酶/EDTA溶液,37℃培育10至15分钟。通过加入培养基终止培育,将上清转移至离心管。用PBS洗涤孔两次,将上清与其他上清组合。通过800x g离心10分钟沉淀细胞。细胞在免疫荧光染色前保持在冰上。可选地将沉淀重悬在PBS中。
B细胞和EL-4B5细胞的共培养
a)在圆底96孔多孔板中进行共培养。配制在EL-4B5培养基中包含EL-4B5细胞(1.6x 106细胞/15.2ml)和细胞因子的基础溶液。向多孔板的每个孔中加入200μl基础溶液。通过荧光激活细胞分选向每个孔中加入单个B细胞。加入B细胞后,300x g离心平板5分钟。37℃培育平板七天。
b)在含210μl/孔EL-4B5培养基(含Pansorbin Cells(1:200000)(Calbiochem(Merck),Darmstadt,Deutschland)、5%兔胸腺细胞上清和γ-辐射的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞(2×104/孔))的96孔板中于5%CO2空气的培养箱内37℃培养单个分选的B细胞7天。取出B细胞培养物上清用于筛选,立即收集细胞用于可变区基因克隆或在100μl RLT缓冲液(Qiagen,Hilden,德国)中冷冻于-80℃。
相应地培养人B细胞。
T细胞的活化
分别从3-4周龄小鼠和仓鼠或4-5周龄兔的胸腺分离T细胞。离心细胞并立即培养或按3x 107细胞的整分试样冷冻。胸腺细胞按5x 105细胞/ml的最小细胞密度接种175cm2培养瓶中的EL-4B5培养基,并在37℃培育48小时。
巨噬细胞的培养
分别从至少三月龄的小鼠和仓鼠腹腔分离巨噬细胞。来自小鼠或仓鼠的腹膜巨噬细胞或来自兔的血液单核细胞按至少1x 105细胞/ml的细胞密度在EL-4B5培养基中在175cm2培养瓶中37℃培养1.5小时。然后去除培养基,并通过用温EL-4B5培养基洗涤来从附着的巨噬细胞去除非附着细胞,然后在35ml培养基中培养48小时。
T细胞和巨噬细胞的共培养
将T细胞和巨噬细胞在分开的培养瓶中培养48小时。组合两种细胞群体之前,将T细胞800x g离心10分钟。弃上清,将细胞沉淀重悬在10ml培养基中。调节T细胞至最小细胞密度为5x 105细胞/ml,每毫升培养基加入10pg佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)和5ng或50ng植物凝集素M(PHA-M)。从巨噬细胞去除培养基,向含有巨噬细胞的培养瓶中加入T细胞悬液。共培养36小时后,取出培养基,并称之为TSN溶液。为了去除剩余细胞,将TSN溶液过滤通过0.22μm滤器。TSN溶液按4ml整分试样冷冻于-80℃。
免疫荧光染色
流程1:
取决于待染色细胞的数目,分别在100μl培养基(少于106细胞)或200μl培养基(多于106细胞)中提供细胞。用5%实验动物血清和FACS缓冲液将荧光标记抗体分别稀释至100μl或200μl终体积。在辊架上4℃避光培育反应混合物40分钟。培育后,按300x g 5分钟洗涤细胞两次。将沉淀重悬在400μl PBS中,过滤通过70μm滤网。将过滤的溶液转移至FACS管,在FACS实验前即刻通过加入碘化丙啶(6.25μg/ml)来染色死细胞。如果标记抗体带有生物素标记,则用链霉抗生物素蛋白标记的Alexa Flour(R)647(抗体197)在第二步骤中检测该抗体。
流程2:
用于单细胞分选的抗兔IgG FITC来自AbD Serotec(STAR121F,Düsseldorf,德国)。
对于表面染色,使细胞与最适稀释在PBS中的抗兔IgG FITC抗体4℃避光滚动培育30分钟。离心后,通过吸取去除上清。对PBMC进行两轮离心和冰冷PBS洗涤。最后,将PBMC重悬在冰冷PBS中,并立即进行FACS分析。在FACS分析前加入浓度5μg/ml的碘化丙啶(BDPharmingen,San Diego,CA,USA)来区分死细胞和活细胞。在其他实验中,通过FACS对染色细胞进行单细胞沉积。
用配有计算机和FACSDiva软件(BD Biosciences,USA)的Becton DickinsonFACSAria来采集和分析数据。
增殖测定
a)Cell Titer Glo(CTG)活率测定
按厂家说明书使用CTG活率测定(Promega;#G7571)。
b)3H胸苷测定
培育6天后,加入3H胸苷(0.5μCi/孔),再培育16小时。用微孔板闪烁计数器(Wallac)测定细胞增殖期间的3H胸苷掺入。
c)显微镜分析
为了获取显微图像,使用了与高分辨率相机(Leica DFC290HD)组合的来自Leica的相差显微镜(Leica DM IL)。
d)通过CFSE标记分析B细胞活化。
用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤分离的B细胞。将至多1x107细胞重悬在1ml无蛋白质PBS中,与终浓度2.5μM的CFSE(#C34554,Invitrogen/Molecular Probes)在37℃培育3至10分钟。通过加入过量补充FCS的培养基来终止CFSE加载。用含FCS的培养基充分洗涤后,将B细胞用于共培养实验。在所示时间点后通过流式细胞术分析(FL-1通道)来确认CFSE稀释液引起的CD19+门控(B)细胞的增殖。
IgG的定量
共培养7天后将在其中进行共培养的96孔多孔板300x g离心5分钟。取出150μl上清,用PBS按2:1的比例稀释在第二块96孔多孔板中。
抗体按50ng/ml的浓度使用。如果5分钟培育时间后OD值为1或超过1,则测试0.8至108ng/ml IgG的稀释系列。
抗原特异性IgG的检测
可以就特异性抗原结合来表征由单个沉积和共培养的B细胞或获自免疫的实验动物的B细胞产生的抗体。ELISA在室温进行,单个步骤之间在振荡器上20x g培育ELISA溶液。在第一步中,使抗原结合于96孔多孔板的孔。如果抗原是蛋白质,将它稀释在包被缓冲液中并直接加至平板。肽抗原通过特异性结合对生物素/链霉抗生物素蛋白结合。多孔板的孔可以已经由厂家用可溶性CroteinC(CrC)包被。如果没有,则在固定化抗原后用200μl封闭缓冲液培育孔。分别用每孔100μl抗原溶液(预包被多孔板)或200μl封闭缓冲液培育后,通过用洗涤缓冲液洗涤来去除未结合的抗原或封闭缓冲液。按每孔100μl的体积加入稀释的B细胞上清并培育。培育后,洗涤孔。然后按每孔100μl的体积加入检测抗体。抗体可以缀合辣根过氧化物酶或带有生物素标记。用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物测定检测抗体。培育后,洗涤多孔板,然后每孔加入50μl含有3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)的底物溶液,并培育表X中给出的时间。通过加入50μl硫酸终止酶促反应,用分光光度计(RainbowThermo ELISA Reader)和Xread plus软件在450nm和680nm测定光密度。
核糖核酸(RNA)的分离
首先通过离心沉淀必须从其分离RNA的细胞。通过加入100μl含10μl/mlβ-巯基乙醇的RLT缓冲液来裂解细胞沉淀。通过用移液器多次混合来重悬细胞。将溶液转移至多孔板的孔。将平板200x g短暂离心,冷冻于-20℃。
按照厂家说明书用 Kit(Qiagen,Hilden,德国)进行RNA的分离。
反转录聚合酶链反应
流程1:
在20μl体积中进行反转录。对于每个反应,进行含和不含反转录酶的对照。每个反应预混合1μl dNTP(各10mM)、0.4μl oligo(dT)12-18(0.2μg)和0.6μl随机六聚体(0.03μg),并加至8.5μl水中的RNA。65℃培育反应混合物5分钟,然后直接转移至冰上。然后预混合2μlRT缓冲液(10x)、4μl MgCl2(25mM)、2μl DTT(0.1M)和1μl RNAse OutTM(40单位),并加至冰冷的反应混合物。室温2分钟培育时间后,加入0.5μl SuperscriptTM II反转录酶(25单位)。室温培育反应混合物10分钟。在42℃进行翻译50分钟。翻译后,通过在70℃培育15分钟来失活反转录酶。cDNA保存于-20℃。
流程2:
通过按厂家说明书用Super Script III first-strand synthesis SuperMix(Invitrogen)反转录mRNA来产生cDNA。在第一步中,将6μl分离的mRNA与1μl退火缓冲液和1μl(50μM)oligo dT混合,65℃培育5分钟,然后立即置于冰上约1分钟。然后,在仍置于冰上的同时,加入10μl 2x First-Strand Reaction Mix和SuperScriptTMIII/RNaseOUTTMEnzyme Mix。混合后,50℃培育反应50分钟。通过在85℃培育5分钟来终止反应。终止后,将反应混合物置于冰上。
聚合酶链反应
流程1:
按照厂家说明书用Taq PCR Core Kit(Qiagen,Hilden,德国)进行聚合酶链反应。在20μl体积中进行PCR。将样品转移至温度为95℃的
流程2:
按照厂家说明书用AccuPrime Pfx SuperMix(Invitrogen)进行聚合酶链反应。在分开的反应中扩增轻链和重链可变区。使用与靶抗体表达载体具有25bp重叠的PCR引物(0.2μM/反应)。PCR后,用8μl PCR反应混合物在48孔eGels(Invitrogen)上分析。
测序:
通过在SequiServe GmbH(Vaterstetten,德国)进行的双链测序来测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
用GCG(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)的软件包10.2版和Infomax的Vector NTI Advance软件包8.0版进行序列创建、作图、分析、注释和说明。
基因分析
由Geneart GmbH(Regensburg,德国)制备希望得到的编码cDNA的基因区段。在基因区段侧翼放置单个限制性内切酶切割位点以便于下文所述表达构建体克隆。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。
抗原上的淘选
a)平板包被
生物素/链霉抗生物素蛋白:用PBS中浓度为0.5-1(2)μg/ml的生物素化抗原室温培育无菌链霉抗生物素蛋白包被6孔板(细胞培养级)1小时。使用前在无菌PBS中洗涤平板三次。
共价结合蛋白质:用含2μg/ml蛋白质的碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠、34mM碳酸氢二钠,pH 9.55)4℃过夜包被无菌细胞培养6孔板。使用前在无菌PBS中洗涤平板三次。
b)在抗原上淘选B细胞
用每4ml培养基至多6x106细胞接种各抗原包被的6孔组织培养板,使其在培养箱中37℃结合1小时。通过用1x PBS小心洗涤孔1-2次来去除未黏附的细胞。通过用胰蛋白酶在培养箱中37℃处理10分钟来脱附剩余的黏性细胞,然后在培养基中洗涤两次。细胞在免疫荧光染色前保持在冰上。
质粒DNA的制备
待用作克隆编码抗体重链和轻链可变结构域的PCR产物的受体的质粒DNA先通过限制酶消化来线性化。随后,通过制备型琼脂糖电泳纯化线性化质粒DNA,并从凝胶提取(QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen)。将此纯化质粒DNA作为模板加至使用与待克隆的PCR产物重叠(20-25bp)的引物的PCR流程。用AccuPrime Pfx SuperMix(Invitrogen)进行PCR。
克隆
用Haun,R.S.等(BioTechniques 13(1992)515-518)和Li,M.Z等(Nature Methods4(2007)251-256)所述的“位点和连接依赖性克隆”方法(SLIC)将PCR产物克隆入表达载体。纯化的载体和插入片段都在缺乏dNTP的情况下用每1μg DNA0.5U T4DNA聚合酶(RocheApplied Sciences,Mannheim,德国)在25℃处理45分钟,以产生匹配的单链突出端。通过加入1/10反应体积的10mM dCTP Solution(Invitrogen)来终止反应。将T4处理的载体和插入DNA片段按质粒:插入片段为1:2(w/w)(例如100ng:200ng)组合,并通过加入RecAProtein(New England Biolabs)和10x RecA37℃反应30分钟来重组。然后,使用标准化学转化流程,用5μl所产生的各重链和轻链表达质粒来转化MultiShot Strip Well TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)。再生(转化的大肠杆菌细胞37℃震荡45分钟)后,将全部转化混合物转移入每孔含有2ml补充了氨苄青霉素的LB培养基的DWP 96(深孔板)。振荡器中37℃培育细胞20小时。在下一步中,用NucleoSpin 96Plasmid Mini Kit(Macherey&Nagel)纯化编码免疫球蛋白重链和轻链的质粒DNA,用所选择的限制酶消化,并在48孔eGels(Invitrogen)上分析。同时,制备甘油原种用于保存。
重组抗体在真核细胞中的转染和表达
HEK293细胞在含8%CO2的空气中37℃、120转/分钟震荡培养于F17培养基(Gibco)中。转染前一天传代(split)细胞,按0.7-0.8x 106细胞/ml的密度接种。转染当天,用0.5μgHC质粒加0.5μg LC质粒转染2ml体积中的1-1.5x 106HEK293细胞,悬浮在48孔深孔板中的1μl无293培养基(Novagen)和80μl 培养基(Gibco)中。培养物37℃、8%CO2、180转/分钟培育7天。7天后,收获培养物上清,过滤,并分析抗体含量和特异性。
引物
a)用于表达兔抗体的B细胞的B细胞PCR的引物
引物组1:
LC引物
HC引物
引物组2:
LC引物
HC引物
用于扩增重链表达质粒骨架的引物:
用于扩增κ轻链表达质粒骨架的引物:
b)用于表达人抗体的兔B细胞(源自转基因兔)的B细胞PCR的引物用于扩增重链可变结构域的引物
用于扩增轻链可变结构域的引物
c)用于扩增重链质粒骨架的引物:
d)用于扩增κ轻链质粒骨架的引物:
e)用于来自人供体的B细胞的B细胞PCR的引物:
用于扩增重链可变结构域的引物
-hu-CH1γ-rev(SEQ ID NO:14):
GTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTT
用于扩增κ轻链可变结构域的引物
用于扩增λ轻链可变结构域的引物
f)用于扩增人免疫球蛋白表达质粒的引物
重链表达质粒骨架的扩增:
-huIg-PCR-载体引物-as(SEQ ID NO:34):GGAATGCACACCTGTAGCTGTTGCTA
-huIg-PCR-载体引物-VH-s(SEQ ID NO:35):AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC
κ轻链表达质粒骨架的扩增:
-huIg-PCR-载体引物-asκ(SEQ ID NO:36):GGAATGCACACCTGTAGCTGTTGCTA
-huIg-PCR-载体引物-VK-s(SEQ ID NO:37):GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
λ轻链表达质粒骨架的扩增:
-huIg-PCR-载体引物-asλ(SEQ ID NO:38):
GGAATGCACACCTGTAGCTGTTGCTA
-huIg-PCR-载体引物-VL-s(SEQ ID NO:39):
GAAGGGAGCACCGTGGAGA
细胞因子
Zubler Mix:2ng/ml小鼠IL-1β、50ng/ml小鼠IL-2、10ng/ml小鼠IL-10和2ng/ml小鼠TNFα(终浓度)。
为建立确定的细胞因子混合物而测试的细胞因子(在未另行说明的情况下作为终浓度给出):
兔B细胞培养基
兔B细胞培养基添加剂
抗体表型分析/分选
山羊抗兔IgG Fc抗体 AbDSerotec STAR121F
大鼠抗兔CD138抗体 Roche GlycArt AG
抗人CD40mAb(克隆Mab89) Beckman Coulter IM1374
抗人/鼠(兔交叉反应性)
抗CD40L抗体:
抗muCD40L抗体 R&D systems AF1163
抗huCD40L抗体 R&D systems AF617R
驴抗山羊IgG抗体Alexa 488 Molecular Probes A11055
其他
实施例1
EL-4B5细胞的培养
在37℃水浴中快速融化冷冻的EL-4B5细胞,并用10ml EL-4B5培养基稀释。300x g离心10分钟后,弃上清,将沉淀重悬在1ml培养基中。
将EL-4B5细胞按8x 10细胞/ml的细胞密度接种在T175培养瓶中。每两天测定细胞密度,并调整至8x 104细胞/ml。细胞具有约18小时的倍增时间。然后,按3x 104至4x 105细胞/ml的细胞计数接种细胞,以达到至多2275x 105细胞/ml的不同最终细胞密度。
收获细胞并调整至1x106细胞/ml的细胞密度,然后按50Gy进行γ-辐射。
实施例2
B细胞和EL-4B5细胞的共培养
在含200μl/孔EL-4B5培养基(含Pansorbin Cells(1:100000)(Calbiochem(Merck),Darmstadt,Deutschland)、5%兔胸腺细胞上清和γ-辐射的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞(5×104/孔))的96孔板中于5%CO2空气的培养箱内37℃培养单个分选的B细胞7天。取出B细胞培养物上清用于筛选,立即收集细胞用于可变区基因克隆或在100μl RLT缓冲液(Qiagen,Hilden,德国)中冷冻于-80℃。
Claims (13)
1.用于共培养一个或多个B细胞的方法,其包括步骤:
-将EL4-B5细胞培养至600,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml的细胞密度;和
-将一个或多个B细胞与前一步骤中获得的EL4-B5细胞的整分试样培育。
2.权利要求1的方法,其中培养EL4-B5细胞至650,000细胞/ml至1,450,000细胞/ml的细胞密度。
3.权利要求1的方法,其中培养EL4-B5细胞至超过1,000,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml的细胞密度。
4.权利要求1至2中任一项的方法,其中培养EL4-B5细胞至650,000细胞/ml至825,000细胞/ml的细胞密度。
5.权利要求1至3中任一项的方法,其中培养EL4-B5细胞至1,400,000细胞/ml至1,500,000细胞/ml的细胞密度。
6.权利要求1至5中任一项的方法,其中所述培育还在饲养混合物的存在下。
7.权利要求6的方法,其中饲养混合物包含以下一种或多种:
i)白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子α;
ii)白细胞介素-2(IL-2)和/或白细胞介素-10(IL-10);
iii)金黄色葡萄球菌Cowan菌株细胞(SAC);
iv)白细胞介素-21(IL-21)和可选地白细胞介素-2(IL-2);
v)肿瘤坏死因子家族的B细胞活化因子(BAFF);
vi)白细胞介素-6(IL-6);
vii)白细胞介素-4(IL-4);和
viii)胸腺细胞培养上清。
8.权利要求6的方法,其中饲养混合物包含IL-1β、TNF-α、IL-10及选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6的一种或多种。
9.权利要求1至8中任一项的方法,其中EL4-B5细胞在培养之后和培育之前用γ-辐射照射。
10.权利要求1至9中任一项的方法,其中所述方法用于共培养一个B细胞。
11.权利要求10的方法,其中一个B细胞是单个沉积B细胞。
12.权利要求1至11中任一项的方法,其中所述培育进行5至14天。
13.用于产生抗体的方法,其包括权利要求1至12中任一项的方法,从而产生抗体。
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