JP2017516496A5 - - Google Patents
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Description
本特許出願は、B細胞培養分野にある。本明細書において、抗体分泌細胞、例えば活性化B細胞、形質芽細胞、およびホルボールミリステートアセテートの存在下での、免疫されたヒツジから単離されたB細胞の刺激および拡大のための培養系を報告する。
異なる種由来の単離されたB細胞、形質芽細胞および形質細胞はin vitroでの培養が困難であることが報告されてきている。実際、これは通常、初代B細胞をハイブリドーマパートナーと融合させることによる不死B細胞株の生成または不死化によって克服されている。ウサギに関してはまた、形質細胞腫融合パートナーも開発された(Spieker−Polet, H.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 9348−9352)が、ハイブリドーマ技術は、ウサギにおいてはうまく働かない。ヒツジに関して、ハイブリドーマ技術もまた記載されてきている(例えば、Osborne, J.ら, Hybridoma 18 (1999) 183−191)が、やはりこれらのハイブリドーマは不安定であり、そして生産性が劣る傾向がある。in vitroでのB細胞の生存持続のためには、本質的な活性化刺激および生存因子を提供することが必要である。IL−2、IL−4、IL−10等の多様な化合物が記載されてきている(例えば、Zubler, R.ら, Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357−363およびJ. Exp. Med. 160 (1984) 1170−1183)。
生理学的に、B細胞は、特定の抗原との遭遇に際して、例えばCD40/CD40L経路を通じた(Neron, S.ら, Arch. Immunol. Ther. Exp. 59 (2011) 25−40に概説される)、そして/または例えば樹状細胞による天然背景からまたはT細胞の補助に際して得られるサイトカインおよび/または増殖因子を通じたさらなる活性化を加えて、活性化される。
in vitro系において、CD40/CD40L相互作用は、EL4−B5胸腺腫細胞との共培養、あるいは可溶性または固定化抗CD40抗体またはCD40Lの添加によって模倣されうる。単一の系は十分な強度を欠き、そして異なるフィーダー混合物(例えばZubler混合物; IL−4、IL−10等)(Zubler, R.、上記)または胸腺細胞上清(TSN)いずれかを用いたさらなる必要な刺激と組み合わせてしか記載されていない。
Weitkamp, J−H.ら(J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223−237)は、蛍光ウイルス様粒子で選択した単一抗原特異的B細胞からの、ロタウイルスに対する組換えヒトモノクローナル抗体の生成を報告する。複数の同族(cognate)抗原に対する複数の単離された抗体を産生する方法は、US 2006/0051348に報告される。抗原特異的B細胞のクローン集団を得るための培養法は、US 2007/0269868に報告される。免疫グロブリンライブラリーを調製するための方法は、WO 2007/031550に報告される。
Griebel, P.J.らは、非形質転換ヒツジB細胞のクローニングを報告する(J. Immunol. Meth. 237 (2000) 19−28)。CD40シグナル伝達は、ガンマ鎖共通サイトカインファミリーの複数のメンバーに対するB細胞反応性を誘導し、これは、Griebel, P.ら(Int. Immunol. 11 (1999) 1139−1147)により報告される。Miyasaka, M.およびDudler, L.は、ホルボールミリステートアセテートに対する曝露に際してのヒツジ未成熟B細胞の分化を報告する(Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 74 (1984) 281−283).「ヒツジにおけるBリンパ球分化:I.回腸パイエル板細胞の表現型分析および回腸パイエル板におけるsIg+細胞に関する前駆体集団の立証」が、Miyasaka, M.ら(Immunol. 53 (1984) 515−523)によって報告される。Sedgmen, B.J.らは、末梢血白血球における抗原特異的免疫グロブリン産生の検出のためのヒツジ抗体分泌細胞アッセイの最適化を報告する(Immunol. Cell Biol. 81 (2003) 305−310)。
発明の概要
本明細書において、ヒツジB細胞から出発した、ヒツジ抗体の迅速で効率的なそして再現性がある生成のための新規方法であって、少なくとも1つの培養工程を含む前記方法を報告する。
本明細書において、ヒツジB細胞から出発した、ヒツジ抗体の迅速で効率的なそして再現性がある生成のための新規方法であって、少なくとも1つの培養工程を含む前記方法を報告する。
本明細書において、非常に効率的なヒツジB細胞刺激および培養系を提供するため、ヒツジB細胞の培養に関する添加剤としてホルボールミリステートアセテート(PMA)の使用をさらに報告する。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、ヒツジTSNおよびフィーダー細胞の存在下で/これらとともに、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、ヒツジTSNおよびフィーダー細胞の存在下で/これらとともに、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、ヒツジB細胞およびフィーダー細胞を共培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、抗体分泌ヒツジB細胞を培養し、そして培養上清から抗体を回収し、それによってヒツジ抗体を産生する工程を含む、ヒツジ抗体を産生するための方法である。
1つの態様において、ヒツジB細胞は、未刺激(naive)または未成熟ヒツジB細胞である。
1つの態様において、B細胞はIgG陽性B細胞(IgG+)である。IgG陽性B細胞は、検出および標識可能な細胞表面マーカーIgGを提示する。
1つの態様において、B細胞はIgG陽性B細胞(IgG+)である。IgG陽性B細胞は、検出および標識可能な細胞表面マーカーIgGを提示する。
1つの態様において、B細胞はIgG陽性およびCD45R陽性B細胞(IgG+CD45R+)である。IgG陽性B細胞は、検出および標識可能な細胞表面マーカーIgGを提示する。
1つの態様において、B細胞はIgG陽性およびCD21陽性B細胞(IgG+CD21+)である。IgG陽性B細胞は、検出および標識可能な細胞表面マーカーIgGを提示する。
本明細書に報告するような1つの側面は、以下の工程:
a)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、抗体分泌ヒツジB細胞のプールまたは単一で置かれた抗体分泌ヒツジB細胞を培養し、
b)抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
c)1またはそれより多い発現カセット内に、b)において単離された核酸あるいは軽鎖および/または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
d)細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法である。
a)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、抗体分泌ヒツジB細胞のプールまたは単一で置かれた抗体分泌ヒツジB細胞を培養し、
b)抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
c)1またはそれより多い発現カセット内に、b)において単離された核酸あるいは軽鎖および/または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
d)細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法である。
1つの態様において、方法は、以下の工程:
a)抗体分泌(成熟)B細胞の集団(ヒツジ血液から得られるもの)を提供し、
b)少なくとも1つの蛍光色素(1つの態様において、1〜3、または2〜3の蛍光色素)で、B細胞集団の細胞を染色し、
c)B細胞染色集団の単一細胞またはB細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器 に置き(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)、
d)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、置かれた個々のB細胞を培養し、
e)個々のB細胞またはB細胞プールの培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
f)逆転写酵素PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
g)抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
h)細胞において核酸を導入し、
i)細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む。
a)抗体分泌(成熟)B細胞の集団(ヒツジ血液から得られるもの)を提供し、
b)少なくとも1つの蛍光色素(1つの態様において、1〜3、または2〜3の蛍光色素)で、B細胞集団の細胞を染色し、
c)B細胞染色集団の単一細胞またはB細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器 に置き(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)、
d)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、置かれた個々のB細胞を培養し、
e)個々のB細胞またはB細胞プールの培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
f)逆転写酵素PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
g)抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
h)細胞において核酸を導入し、
i)細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む。
1つの態様において、方法は、以下の工程:
a)抗体分泌(成熟)ヒツジB細胞集団を提供し、
b)少なくとも1つの蛍光色素(1つの態様において、1〜3、または2〜3の蛍光色素)で、ヒツジB細胞集団の細胞を染色し、
c)ヒツジB細胞染色集団の単一細胞またはヒツジB細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器に置き(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)、
d)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、置かれたヒツジB細胞を培養し、
e)ヒツジB細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
f)逆転写酵素PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
g)抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
h)細胞において核酸を導入し、
i)細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む。
a)抗体分泌(成熟)ヒツジB細胞集団を提供し、
b)少なくとも1つの蛍光色素(1つの態様において、1〜3、または2〜3の蛍光色素)で、ヒツジB細胞集団の細胞を染色し、
c)ヒツジB細胞染色集団の単一細胞またはヒツジB細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器に置き(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)、
d)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、置かれたヒツジB細胞を培養し、
e)ヒツジB細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
f)逆転写酵素PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
g)抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
h)細胞において核酸を導入し、
i)細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む。
1つの態様において、細胞プールは、約10のB細胞から約1,000,000のB細胞で構成される。1つの態様において、プールは、約500のB細胞から約100,000のB細胞で構成される。1つの態様において、プールは約500のB細胞を含む。
本明細書に報告するような1つの側面は、抗体分泌ヒツジB細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の使用である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、単一で置かれたヒツジB細胞またはヒツジB細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、単一で置かれたヒツジB細胞またはヒツジB細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、細胞増殖を改善するためのヒツジB細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の使用である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、単一で置かれたヒツジB細胞またはヒツジB細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジB細胞の細胞増殖を改善するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、単一で置かれたヒツジB細胞またはヒツジB細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジB細胞の細胞増殖を改善するための方法である。
本明細書に報告する主題は、ヒツジB細胞から出発する、ヒツジ、キメラ(すなわちヒツジ−非ヒツジ種キメラ)、またはヒト化抗体の、迅速で効率的なそして再現性がある生成のためであり、そして少なくとも1つの培養工程を含む、一般的に適用可能な方法を提供する。培地にホルボールミリステートアセテート(PMA)を添加すると、ヒツジB細胞の増殖特性が改善可能であり、すなわち、単一で置かれた細胞または細胞プールとしてのいずれかのヒツジB細胞を、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の非存在下よりもより迅速に高い細胞密度まで増殖させることも可能である。したがって、短期間に、高いヒツジB細胞密度およびそれに対応する培養上清中の高いIgG濃度を得ることが可能である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、ヒツジTSNおよびフィーダー細胞の存在下で/これらとともに、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、ヒツジTSNおよびフィーダー細胞の存在下で/これらとともに、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、ヒツジB細胞およびフィーダー細胞を共培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、抗体分泌ヒツジB細胞を培養し、そして培養上清から抗体を回収し、それによってヒツジ抗体を産生する工程を含む、ヒツジ抗体を産生するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、以下の工程:
a)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、抗体分泌ヒツジB細胞のプールまたは単一で置かれた抗体分泌ヒツジB細胞を培養し、
b)抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
c)1またはそれより多い発現カセット内に、b)において単離された核酸あるいは軽鎖および/または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
d)細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法である。
a)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、抗体分泌ヒツジB細胞のプールまたは単一で置かれた抗体分泌ヒツジB細胞を培養し、
b)抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
c)1またはそれより多い発現カセット内に、b)において単離された核酸あるいは軽鎖および/または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
d)細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、抗体分泌ヒツジB細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の使用である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、単一で置かれたヒツジB細胞またはヒツジB細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、単一で置かれたヒツジB細胞またはヒツジB細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジB細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、細胞増殖を改善するためのヒツジB細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の使用である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、単一で置かれたヒツジB細胞またはヒツジB細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジB細胞の細胞増殖を改善するための方法である。
本明細書に報告するような1つの側面は、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、単一で置かれたヒツジB細胞またはヒツジB細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジB細胞の細胞増殖を改善するための方法である。
本発明を実行するために有用な、当業者に知られる方法および技術は、例えば、Ausubel, F.M.監修, Current Protocols in Molecular Biology, 第I巻〜III巻(1997), Wiley and Sons; Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989)に記載される。
Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989)に記載される。
定義
本明細書の目的のための「アクセプター・ヒト・フレームワーク」は、以下に定義するような、ヒト免疫グロブリン・フレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリン・フレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワーク「由来の」アクセプター・ヒト・フレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことも可能であるし、またはアミノ酸配列変化を含有することも可能である。いくつかの態様において、アミノ酸変化の数は、10またはそれ未満、9またはそれ未満、8またはそれ未満、7またはそれ未満、6またはそれ未満、5またはそれ未満、4またはそれ未満、3またはそれ未満、あるいは2またはそれ未満である。いくつかの態様において、VLアクセプター・ヒト・フレームワークは、VLヒト免疫グロブリン・フレームワーク配列またはヒト・コンセンサス・フレームワーク配列に配列が同一である。
本明細書の目的のための「アクセプター・ヒト・フレームワーク」は、以下に定義するような、ヒト免疫グロブリン・フレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリン・フレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワーク「由来の」アクセプター・ヒト・フレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことも可能であるし、またはアミノ酸配列変化を含有することも可能である。いくつかの態様において、アミノ酸変化の数は、10またはそれ未満、9またはそれ未満、8またはそれ未満、7またはそれ未満、6またはそれ未満、5またはそれ未満、4またはそれ未満、3またはそれ未満、あるいは2またはそれ未満である。いくつかの態様において、VLアクセプター・ヒト・フレームワークは、VLヒト免疫グロブリン・フレームワーク配列またはヒト・コンセンサス・フレームワーク配列に配列が同一である。
「アフィニティ成熟」抗体は、こうした改変を所持しない親抗体に比較して、1またはそれより多い超可変領域(HVR)における1またはそれより多い改変を含む抗体を指し、こうした改変は、抗原に対する抗体のアフィニティの改善を生じる。
用語「アミノ酸」は、本出願において、カルボキシα−アミノ酸群を示し、直接または前駆体の形で、核酸にコードされることも可能である。個々のアミノ酸は、3つのヌクレオチド、いわゆるコドンまたは3つ組塩基からなる核酸によってコードされる。各アミノ酸は、少なくとも1つのコドンによってコードされる。異なるコドンによる同じアミノ酸のコードは、「遺伝暗号の縮重」として知られる。用語「アミノ酸」は、本出願において、天然存在カルボキシα−アミノ酸を示し、そしてアラニン(3文字暗号:ala、1文字暗号:A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、スレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、およびバリン(val、V)を含む。
用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、そして限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および望ましい抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む、多様な抗体構造を含む。
「抗体断片」は、損なわれていない(intact)抗体以外の分子を指し、損なわれていない抗体が結合する抗原に結合する、損なわれていない抗体の一部を含む。抗体断片の例には、限定されるわけではないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2;ディアボディ;直鎖抗体;一本鎖抗体分子(例えば、scFv);および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
用語「キメラ」抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、一方、重鎖および/または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
用語「ヒツジ−非ヒツジ種キメラ抗体」は、親ヒツジ抗体の可変ドメイン、および異なる種の抗体由来、例えばヒト抗体、ネズミ抗体、またはウサギ抗体由来の定常領域を含む抗体を示す。用語「ヒツジ−非ヒツジ種キメラ抗体」は、親ヒツジ抗体の可変領域および異なる種の定常領域を含む抗体を示す。
抗体の「クラス」は、重鎖によって所持される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の5つの主なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、そしてこれらのいくつかは、さらにサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分けられうる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
用語「クローン」は、単一B細胞から生じる/由来する、分裂し、そして抗体を分泌しているB細胞の集団を示す。したがって、B細胞クローンは、モノクローナル抗体を産生する。
用語「発現」は、本明細書において、細胞内で起こる転写および/または翻訳プロセスを指す。細胞に存在する対応するmRNAの量に基づいて、細胞における関心対象の核酸配列の転写レベルを決定することも可能である。例えば、関心対象の配列から転写されるmRNAを、RT−PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化してもよい(Sambrookら、1989、上記を参照されたい)。多様な方法によって、例えばELISAによって、ポリペプチドの生物学的活性に関してアッセイすることによって、あるいはこうした活性とは独立のアッセイ、例えば、ポリペプチドを認識し、そして結合する免疫グロブリンを用いたウェスタンブロッティングまたはラジオイムノアッセイを使用することによって、関心対象の核酸にコードされるポリペプチドを定量化してもよい(Sambrookら、1989、上記を参照されたい)。
「発現カセット」は、細胞において、少なくとも含有される核酸の発現のため、必要な制御要素、例えばプロモーターおよびポリアデニル化部位を含有する構築物を指す。
遺伝子の発現を一過性または永続的発現のいずれかとして行う。関心対象のポリペプチド(単数または複数)は、一般に、分泌ポリペプチドであり、そしてしたがって、細胞壁を通じた、細胞外培地へのポリペプチドの輸送/分泌に必要である、N末端伸張(シグナル配列としてもまた知られる)を含有する。一般的に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来してもよい。異種シグナル配列を用いる場合、好ましくは、宿主細胞によって認識され、そしてプロセシングされる(すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。例えば、酵母における分泌のため、発現させようとする異種遺伝子の天然シグナル配列を、分泌される遺伝子に由来する同種酵母シグナル配列、例えば酵母インベルターゼ・シグナル配列、アルファ因子リーダー(サッカロミセス属(Saccharomyces)、クロイベロミセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、およびハンセヌラ属(Hansenula)α因子リーダーを含む、二番目に記載されるものはUS 5,010,182に記載される)、酸性ホスファターゼ・シグナル配列、またはC.アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼ・シグナル配列(EP 0 362 179)によって置換してもよい。哺乳動物細胞発現において、関心対象のタンパク質の天然シグナル配列は、満足がいくものであるが、他の哺乳動物シグナル配列、例えば同じまたは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、例えばヒトまたはネズミ起源の免疫グロブリン、ならびにウイルス分泌シグナル配列、例えば単純疱疹糖タンパク質Dシグナル配列が適切でありうる。こうしたプレセグメントをコードするDNA断片を、インフレームで、すなわち機能可能であるように、関心対象のポリペプチドをコードするDNA断片に連結する。
遺伝子の発現を一過性または永続的発現のいずれかとして行う。関心対象のポリペプチド(単数または複数)は、一般に、分泌ポリペプチドであり、そしてしたがって、細胞壁を通じた、細胞外培地へのポリペプチドの輸送/分泌に必要である、N末端伸張(シグナル配列としてもまた知られる)を含有する。一般的に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来してもよい。異種シグナル配列を用いる場合、好ましくは、宿主細胞によって認識され、そしてプロセシングされる(すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。例えば、酵母における分泌のため、発現させようとする異種遺伝子の天然シグナル配列を、分泌される遺伝子に由来する同種酵母シグナル配列、例えば酵母インベルターゼ・シグナル配列、アルファ因子リーダー(サッカロミセス属(Saccharomyces)、クロイベロミセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、およびハンセヌラ属(Hansenula)α因子リーダーを含む、二番目に記載されるものはUS 5,010,182に記載される)、酸性ホスファターゼ・シグナル配列、またはC.アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼ・シグナル配列(EP 0 362 179)によって置換してもよい。哺乳動物細胞発現において、関心対象のタンパク質の天然シグナル配列は、満足がいくものであるが、他の哺乳動物シグナル配列、例えば同じまたは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、例えばヒトまたはネズミ起源の免疫グロブリン、ならびにウイルス分泌シグナル配列、例えば単純疱疹糖タンパク質Dシグナル配列が適切でありうる。こうしたプレセグメントをコードするDNA断片を、インフレームで、すなわち機能可能であるように、関心対象のポリペプチドをコードするDNA断片に連結する。
用語「実験動物」は、非ヒト動物を示す。1つの態様において、実験動物は、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ラマ、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、サメおよび爬虫類より選択される。1つの態様において、実験動物はヒツジである。
用語「Fc領域」は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するよう用いられる。該用語には、天然配列Fc領域および変異体Fc領域が含まれる。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで伸張する。しかし、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は存在してもまたはしなくてもよい。本明細書に別に明記しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat, E.A.ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, 米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991), NIH公報91−3242、第1〜3巻に記載されるような、EUインデックスとも称される、EU番号付け系にしたがう。
用語「フィーダー混合物」は、異なる添加物、例えばB細胞の活性化および/または生存および/または抗体分泌を促進する、増殖因子、サイトカインおよび/またはさらなるタンパク質の組み合わせを示す。フィーダー混合物は、天然フィーダー混合物、例えば胸腺細胞(TSN)の培養上清から得られるものであってもよく、これはサイトカインの定義されない組み合わせであるか、あるいは、フィーダー混合物は、例えばIL−21および/またはIL−2および/またはIL−6の混合物を含む、合成フィーダー混合物であってもよい。
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般的に、4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。したがって、HVRおよびFR配列は、一般的に、VH(またはVL)中、以下の順序で現れる:FR1−H1(L1)−FR2−H2(L2)−FR3−H3(L3)−FR4。
用語「細胞」または「宿主細胞」は、核酸、例えば異種ポリペプチドをコードする核酸がトランスフェクション可能であるかまたはトランスフェクションされている細胞を指す。用語「細胞」には、プラスミドの増殖用に用いられる原核細胞、ならびに核酸発現およびコードされるポリペプチドの産生のために用いられる真核細胞の両方が含まれる。1つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。1つの態様において、CHO細胞は、CHO K1細胞(ATCC CCL−61またはDSM ACC 110)、またはCHO DG44細胞(CHO−DHFR[−]、DSM ACC 126としてもまた知られる)、またはCHO XL99細胞、CHO−T細胞(例えば、Morgan, D.ら, Biochemistry 26 (1987) 2959−2963を参照されたい)、またはCHO−S細胞、またはSuper−CHO細胞(Pak, S.C.O.ら. Cytotechnol. 22 (1996) 139−146)である。1つの態様において、HEK細胞はHEK293細胞である。これらの細胞が、血清不含培地または懸濁中での増殖に適応していない場合、本方法で使用する前に適応が実行されるものとする。本明細書において、表現「細胞」には、対象細胞およびその子孫が含まれる。したがって、該単語「形質転換体」および「形質転換細胞」には、初代対象細胞、およびトランスファーまたは継代培養の数にかかわらず、そこから得られる培養が含まれる。また、縮重または偶発性の突然変異のため、すべての子孫が、DNA内容物において正確に同一でない可能性もあることも理解される。元来の形質転換細胞においてスクリーニングされるものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって産生されるか、あるいはヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源から得られる抗体のものに対応する、アミノ酸配列を所持するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。
「ヒト・コンセンサス・フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群由来である。一般的に、配列の下位群は、Kabat, E.A.ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, 米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991), NIH公報91−3242、第1〜3巻におけるような下位群である。1つの態様において、VLに関して、下位群は、Kabatら、上記におけるような下位群カッパIである。1つの態様において、VHに関して、下位群は、Kabatら、上記におけるような下位群IIIである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基およびヒトFR由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、そして典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろうし、ここで、HVR(例えばCDR)のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト抗体のものに対応し、そしてFRのすべてまたは実質的にすべては、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の抗体定常領域の部分を少なくとも含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を経ている抗体を指す。
用語「超可変領域」または「HVR」は、本明細書において、配列中で超可変(「相補性決定領域」または「CDR」)であり、そして/または構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成し、そして/または抗原接触残基(「抗原接触」)を含有する、抗体可変ドメインの領域各々を指す。一般的に、抗体は、6つのHVR;VH中の3つ(H1、H2、H3)およびVL中の3つ(L1、L2、L3)を含む。
本明細書において、HVRには
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia, C.およびLesk, A.M., J. Mol. Biol. 196(1987) 901−917);
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3)で生じるCDR(Kabat, E.A.ら, Sequences of Proteins of
Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, 米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991), NIH公報91−3242);
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、および93〜101(H3)で生じる抗原接触(MacCallumら J. Mol. Biol. 262: 732−745(1996));および
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、および94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組み合わせ
が含まれる。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia, C.およびLesk, A.M., J. Mol. Biol. 196(1987) 901−917);
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3)で生じるCDR(Kabat, E.A.ら, Sequences of Proteins of
Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, 米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991), NIH公報91−3242);
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、および93〜101(H3)で生じる抗原接触(MacCallumら J. Mol. Biol. 262: 732−745(1996));および
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、および94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組み合わせ
が含まれる。
別に示されない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基(例えばFR残基)は、本明細書においてKabatら、上記にしたがって番号付けされる。
用語「標識」は、特異的に結合し、そして標識されている抗表面マーカー抗体の添加によって決定可能な、表面マーカーの存在または非存在を示す。したがって、表面マーカーの存在は、例えば蛍光標識の場合には蛍光の発生によって決定され、一方、表面マーカーの非存在は、それぞれの特異的に結合し、そして標識されている抗表面マーカー抗体とのインキュベーション後の蛍光の非存在によって決定される。
用語「標識」は、特異的に結合し、そして標識されている抗表面マーカー抗体の添加によって決定可能な、表面マーカーの存在または非存在を示す。したがって、表面マーカーの存在は、例えば蛍光標識の場合には蛍光の発生によって決定され、一方、表面マーカーの非存在は、それぞれの特異的に結合し、そして標識されている抗表面マーカー抗体とのインキュベーション後の蛍光の非存在によって決定される。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体は、ありうる変異体抗体、例えば天然発生突然変異を含有するかまたはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じるものを除いて、同一であり、そして/または同じエピトープに結合し、前述の変異体は一般的に少量でしか存在しない。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対して向けられる異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特性を示し、そして何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするとは見なされないものとする。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージ−ディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む、多様な技術によって作製可能であり、こうした方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法を本明細書に記載する。
「天然抗体」は、多様な構造を持つ天然存在免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然IgG抗体は、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合される2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖で構成される。N末端からC末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも称される可変領域(VH)、続いて3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を有する。同様に、N末端からC末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも称される可変領域(VL)、続いて定常軽鎖(CL)ドメインを有する。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と称される2つのタイプの一方に割り当て可能である。
本出願内で交換可能に用いられる用語である「核酸」または「核酸配列」は、個々のヌクレオチド(塩基とも称される)、a、c、g、およびt(またはRNAではu)からなるポリマー分子、例えばDNA、RNA、またはその修飾物を指す。このポリヌクレオチド分子は、天然存在ポリヌクレオチド分子または合成ポリヌクレオチド分子、あるいは1またはそれより多い合成ポリヌクレオチド分子を含む1またはそれより多い天然存在ポリヌクレオチド分子の組み合わせであることも可能である。この定義にやはり含まれるのは、1またはそれより多いヌクレオチドが変化している(例えば突然変異誘発によって)か、欠失しているか、または付加されている、天然存在ポリヌクレオチド分子である。核酸は、別の核酸において、例えば発現カセット、プラスミド、または宿主細胞の染色体において、単離されているかまたは組み込まれているかいずれかであってもよい。核酸は、個々のヌクレオチドからなる核酸配列によって特徴付けられる。
当業者にとって、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換する手順および方法は周知である。したがって、核酸は、個々のヌクレオチドからなる核酸配列によって、そして同様にこれにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列によって、特徴付けられる。
用語「特異的に結合する」およびその文法的同等物は、抗体が10−7Mまたはそれ未満、1つの態様において10−8M〜10−13M、さらなる態様において10−9M〜10−13Mの解離定数(Kd)で、ターゲットに結合することを示す。該用語は、さらに、抗体が、存在する他の生体分子に特異的に結合しない、すなわち10−6Mまたはそれより高い、1つの態様において10−6M〜1Mの解離定数(Kd)で他の生体分子に結合することを示すために用いられる。
「トランスフェクションベクター」は、宿主細胞において、コード核酸/構造遺伝子(単数または複数)で構成されるトランスフェクションベクター中の発現のための必要な要素をすべて提供する核酸(核酸分子ともまた称される)である。トランスフェクションベクターは、例えば大腸菌(E. coli)に関する原核プラスミド増殖単位を含み、次に、原核複製起点、および原核選択剤に対する耐性を与える核酸を含み、さらに真核選択剤に対する耐性を与える1またはそれより多い核酸、および関心対象のポリペプチドをコードする1またはそれより多い核酸を含む。好ましくは、選択剤に耐性を与える核酸および関心対象のポリペプチドをコードする核酸(単数または複数)は、各々、発現カセット内に配置され、これによって、各発現カセットは、プロモーター、コード核酸、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの調節下に置かれ、そしてこうした構造遺伝子は、プロモーターに「機能可能であるように連結される」と言われる。同様に、制御要素およびコアプロモーターは、制御要素がコアプロモーターの活性を調節するならば、機能可能であるように連結されている。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれ、VHおよびVL)は、一般的に、類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存されるフレームワーク配列(FR)および3つの超可変領域(HVR)を含む(例えば、Kindt, T.J.ら, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 91ページ)。単一のVHまたはVLドメインが、抗原結合特異性を与えるために十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを用いて、それぞれ相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングして、該抗原に結合する抗体を単離することも可能である。例えば、Portolano, S.ら, J. Immunol. 150 (1993) 880−887; Clackson, T.ら, Nature 352 (1991) 624−628を参照されたい。
用語「ベクター」は、本明細書において、連結している別の核酸を伝播することが可能な核酸分子を指す。該用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入された宿主細胞ゲノム内に取り込まれるベクターが含まれる。特定のベクターは、機能可能であるように連結された核酸の発現を指示することが可能である。こうしたベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。
用語「若い動物」は、性的成熟が起こる前の動物を示す。若いハムスターは、例えば、6週齢未満、特に4週齢未満のものである。若いマウスは、例えば、8週齢未満、特に5週齢未満のものである。
免疫
本明細書に報告するような方法において、ヒツジから得たB細胞を用いる/プロセシングする。
本明細書に報告するような方法において、ヒツジから得たB細胞を用いる/プロセシングする。
1つの態様において、B細胞はヒツジB細胞である。1つの態様において、ヒツジB細胞は、免疫したヒツジから、または特定の抗原に対してワクチン接種した後のヒツジから得られる。
B細胞の供給源および単離
免疫した実験動物の血液は、非常に多様な抗体産生B細胞を提供する。ここから得られるB細胞は、一般的に、CDR内に、ほぼ同一でないかまたは重複しないアミノ酸配列をを有し、そしてしたがって高い多様性を示す抗体を分泌する。
免疫した実験動物の血液は、非常に多様な抗体産生B細胞を提供する。ここから得られるB細胞は、一般的に、CDR内に、ほぼ同一でないかまたは重複しないアミノ酸配列をを有し、そしてしたがって高い多様性を示す抗体を分泌する。
1つの態様において、例えば実験動物の血液から得られる、実験動物のB細胞は、免疫4日後から、免疫または最も最近の追加免疫の15日後までに得られる。
1つの態様において、B細胞は、免疫または最も最近の追加免疫の4日後から最長9日後までに得られる。
1つの態様において、B細胞は、免疫または最も最近の追加免疫の4日後から最長9日後までに得られる。
この時間枠は、本明細書に報告するような方法において、高い柔軟性を可能にする。この時間枠において、最もアフィニティが高い(affine)抗体を提供するB細胞は、脾臓から血液に遊走するようである(例えばPaus, D.ら, JEM 203 (2006) 1081−1091; Smith, K.G.S.ら, The EMBO J. 16 (1997) 2996−3006; Wrammert, J.ら,
Nature 453 (2008) 667−672を参照されたい)。
Nature 453 (2008) 667−672を参照されたい)。
共培養前の選択工程
抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を、末梢血単核細胞(PBMC)から濃縮することも可能である。したがって、本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、B細胞を末梢血単核細胞(PBMC)から得るかまたはB細胞プールを末梢血単核細胞(PBMC)から濃縮する。
抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を、末梢血単核細胞(PBMC)から濃縮することも可能である。したがって、本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、B細胞を末梢血単核細胞(PBMC)から得るかまたはB細胞プールを末梢血単核細胞(PBMC)から濃縮する。
パニング・アプローチを用いることによって、それぞれ、関心対象の抗原に結合する抗体を産生しない細胞、または同様に、関心対象の抗原に結合する抗体を産生する細胞を、減少させるかまたは濃縮することも可能である。その際、結合パートナーは、表面に付着して提示され、そして結合した細胞をさらにプロセシングする場合、これに結合する細胞が細胞集団において選択的に濃縮され、または溶液中に残る細胞をさらにプロセシングする場合、結合する細胞は細胞集団において減少させられる。
本明細書に報告するような方法は、1つの態様において、選択工程を含み、ここで、特異的抗体を産生するB細胞は、細胞表面マーカーおよび蛍光活性化細胞ソーティング/ゲーティングに基づいて選択される。1つの態様において、成熟B細胞がソーティング/濃縮/選択される。異なる実験動物種からB細胞を選択するため、異なる細胞表面マーカーを用いることも可能である。
非ターゲット細胞集団および非特異的結合リンパ球の標識を用いて、これらの細胞を選択的に枯渇させることが可能である。この枯渇工程において、一般的に、非総枯渇を達成してもよい。枯渇は定量的ではないが、干渉細胞数を減少させるか、またはさらに最小限にすることも可能であるため、残りの細胞の続く蛍光標識において利点を提供する。
異なる表面マーカー、例えば、CD3+細胞(T細胞)、CD19+細胞(B細胞一般)、IgM+細胞(成熟未刺激B細胞)、IgG+細胞(成熟B細胞)、CD38+細胞(例えば形質芽細胞)、およびIgG+CD38+細胞(プレ形質細胞)を用いることによって、異なる細胞集団を標識してもよい。
1つの態様において、IgG陽性およびCD45R陽性(IgG+CD45R+)であるヒツジB細胞(単数または複数)を標識/選択する。
1つの態様において、IgG陽性およびCD21陽性(IgG+CD21+)であるヒツジB細胞(単数または複数)を標識/選択する。
1つの態様において、IgG陽性およびCD21陽性(IgG+CD21+)であるヒツジB細胞(単数または複数)を標識/選択する。
成熟IgG+−B細胞、例えばメモリーB細胞、形質芽細胞、および形質細胞の選択のための免疫蛍光標識を、本明細書に報告するような方法で用いてもよい。
B細胞の選択または濃縮のため、細胞を単一標識、または二重標識、または三重標識のいずれかで標識する。
B細胞の選択または濃縮のため、細胞を単一標識、または二重標識、または三重標識のいずれかで標識する。
単一細胞を置くこと
本明細書に報告するような方法は、1つの態様において、B細胞集団のB細胞を単一細胞として置く工程を含む。
本明細書に報告するような方法は、1つの態様において、B細胞集団のB細胞を単一細胞として置く工程を含む。
1つの態様において、単一細胞として置くことは、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)による。
1つの態様において、特異的に標識されたB細胞を単一細胞として置く。1つの態様において、標識は、蛍光標識抗体での細胞表面マーカーの標識である。
1つの態様において、特異的に標識されたB細胞を単一細胞として置く。1つの態様において、標識は、蛍光標識抗体での細胞表面マーカーの標識である。
1つの態様において、本明細書に報告するような方法は、モノクローナル抗体を提供する。
本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、B細胞は成熟B細胞であり、そして成熟B細胞は単一細胞として置かれる。
本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、B細胞は成熟B細胞であり、そして成熟B細胞は単一細胞として置かれる。
実験動物の血液から得られるB細胞に関して用いられる免疫蛍光標識はまた、実験動物の脾臓および他の免疫学的臓器から得られるB細胞の標識のためにも使用可能である。
多細胞を置くこと
1つの態様において、本明細書に報告するような方法は、B細胞プールを置く工程を含む。B細胞のこのプールにおいて、末梢血からの磁気アフィニティビーズまたはFACS単離後、すべてのB細胞をウェルごとに置く。
多細胞を置くこと
1つの態様において、本明細書に報告するような方法は、B細胞プールを置く工程を含む。B細胞のこのプールにおいて、末梢血からの磁気アフィニティビーズまたはFACS単離後、すべてのB細胞をウェルごとに置く。
1つの態様において、約50のB細胞を置く。
1つの態様において、約500のB細胞を置く。
1つの態様において、約2,500のB細胞を置く。
1つの態様において、約500のB細胞を置く。
1つの態様において、約2,500のB細胞を置く。
置かれたB細胞総数は、例えばヒツジB細胞に関して、単一の実験において、最大90,000のB細胞またはそれより多くまで増加させることも可能である。
培養
本明細書に報告するのは、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下での、B細胞を産生する抗体の培養である。
培養
本明細書に報告するのは、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下での、B細胞を産生する抗体の培養である。
したがって、本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、B細胞プールとしてまたは単一で置かれたB細胞としてのB細胞いずれかを、ホルボールミリステートアセテート(PMA)およびフィーダー細胞とともに/これらの存在下で培養する。
すでに、約3、4、5、6、7、8、10、15、または21日培養後、十分な量/数の抗体分子が上清中に得られる。例えば結合特異性に関して、より詳細に抗体を性質決定するため、これとともに提供される抗体の量を用いて、異なる分析を実行することも可能である。抗体の特性が改善されていれば、スクリーニング/選択プロセスにおけるこの初期段階で、実行しなければならない、必要な核酸単離数および配列決定反応数を減少させることも可能である。
1つの態様において、培養期間は約5〜10日間である。1つの特定の態様において、培養期間は約7日間である。
本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィーダー細胞およびフィーダー混合物の存在下での、抗体産生B細胞の培養がある。
本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、フィーダー細胞およびフィーダー混合物の存在下での、抗体産生B細胞の培養がある。
フィーダー混合物は、天然フィーダー混合物または合成フィーダー混合物であることも可能である。
天然フィーダー混合物は、例えば胸腺細胞上清(TSN)である。これは、適切な可溶因子を含有するが、この試薬は不均質であり、成分は適切には記載されず、そして動物間で異なる。
天然フィーダー混合物は、例えば胸腺細胞上清(TSN)である。これは、適切な可溶因子を含有するが、この試薬は不均質であり、成分は適切には記載されず、そして動物間で異なる。
本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、フィーダー混合物は、ヒツジ胸腺細胞培養上清である。1つの態様において、B細胞はヒツジB細胞である。
1つの態様において、胸腺細胞培養上清は、それぞれの若い動物の胸腺の胸腺細胞の培養から得られる。特に、成体動物血液由来の胸腺細胞の単離と比較して、若い動物の胸腺を使用することが適している。
1つの態様において、胸腺細胞培養上清は、それぞれの若い動物の胸腺の胸腺細胞の培養から得られる。特に、成体動物血液由来の胸腺細胞の単離と比較して、若い動物の胸腺を使用することが適している。
一般的に、本明細書に報告するような方法における、ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下でのヒツジB細胞の培養工程は、いくつかのさらなる工程に先行してもよいし、そしてまたこうした工程に続いてもよい。
本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、抗体産生B細胞およびフィーダー細胞の共培養は、ヒツジ胸腺上清(ヒツジTSN)、および/またはホルボールミリステートアセテート(PMA)、および/またはホルマリン固定ブドウ球菌属(Staphylococcus)A株Cowan 1粒子(SAC)の存在下である。1つの態様において、B細胞はヒツジB細胞であり、そしてフィーダー細胞はネズミEL4B5細胞である。1つの態様において、PMAおよびSACを培地とともに、培養の出発時に添加する。
本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、抗体産生ヒツジB細胞およびフィーダー細胞の培養は、PMAおよびSACの存在下であり、これによって、PMAおよびSACを培地とともに培養出発時に添加する。
B細胞およびPMAを含む培養系の使用は、B細胞の増殖改善を生じる、すなわちPMAを含まない系に比較して、B細胞が、より迅速に分裂し、そして培養上清中で、より短い期間で、それぞれより高い細胞密度および抗体力価が得られうることが見出されてきている。
ヒツジB細胞に関して、PMA、ヒツジTSNおよびSACを含む共培養系が特に適していることがさらに見出されてきている。
IgG産生による共培養細胞の性質決定
共培養後に分泌されるIgGの(定性的および定量的)決定のため、一般的に、当業者に知られるすべての方法、例えばELISAが使用可能である。本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、ELISAを用いる。
IgG産生による共培養細胞の性質決定
共培養後に分泌されるIgGの(定性的および定量的)決定のため、一般的に、当業者に知られるすべての方法、例えばELISAが使用可能である。本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、ELISAを用いる。
性質決定結果に応じて、B細胞クローンを得る、すなわち選択することも可能である。
拡大および増殖による共培養細胞の性質決定
細胞拡大の(定性的および定量的)決定のため、異なる読み取り系(商業的細胞活性試験「cell titer glow」(Promega)、CFSE希釈法、3Hチミジン取り込み、または細胞培養画像)を用いて、共培養B細胞の増殖または生存度を評価することも可能である。
拡大および増殖による共培養細胞の性質決定
細胞拡大の(定性的および定量的)決定のため、異なる読み取り系(商業的細胞活性試験「cell titer glow」(Promega)、CFSE希釈法、3Hチミジン取り込み、または細胞培養画像)を用いて、共培養B細胞の増殖または生存度を評価することも可能である。
mRNAの単離、クローニングおよび配列決定
高い抗体力価を産生するB細胞クローンは、縮重PCRプライマーの使用を可能にする(同族)モノクローナル軽鎖および重鎖可変領域をコードするmRNAのある量を提供し、そして非常に特異的なPCRプライマーの必要性を除去する。PCR周期の必要な数もまた減少する。したがって、1つの態様において、逆転写酵素PCRは、軽鎖および重鎖可変ドメインに関する縮重PCRプライマーを用いる。
高い抗体力価を産生するB細胞クローンは、縮重PCRプライマーの使用を可能にする(同族)モノクローナル軽鎖および重鎖可変領域をコードするmRNAのある量を提供し、そして非常に特異的なPCRプライマーの必要性を除去する。PCR周期の必要な数もまた減少する。したがって、1つの態様において、逆転写酵素PCRは、軽鎖および重鎖可変ドメインに関する縮重PCRプライマーを用いる。
B細胞から総mRNAを単離し、そしてcDNAに転写してもよい。それぞれのプライマーに関して、同族VHおよびVL領域をコードする核酸を増幅することも可能である。
本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、アミノ酸配列は、増幅された可変ドメインコード核酸に由来する。可変ドメインコード核酸の正確な出発点および終点は、アミノ酸配列を位置決定することによって同定され、例えばQVQL/QVRLからVSS/VSK(VH領域)、例えばQAVLTからVLGQP(VLラムダ領域)、および例えばDVVL/DIQVからVEIKRSD(VLカッパ領域)である。
本明細書に報告するようなすべての方法の1つの態様において、アミノ酸配列は、増幅された可変ドメインコード核酸に由来する。可変ドメインコード核酸の正確な出発点および終点は、アミノ酸配列を位置決定することによって同定され、例えばQVQL/QVRLからVSS/VSK(VH領域)、例えばQAVLTからVLGQP(VLラムダ領域)、および例えばDVVL/DIQVからVEIKRSD(VLカッパ領域)である。
プール分析
本発明を例示するため、KLHコンジュゲート化ハプテンで免疫されたヒツジから、PBMCを単離し、そして抗原特異的B細胞を濃縮するため、ビオチン化ハプテンおよび磁気ストレプトアビジンビーズを用いた陽性パニングを経た。続いて、B細胞を表面IgG(sIgG)およびB細胞マーカーCD45RまたはCD21の両方に関して染色した。BD FACS Aria細胞ソーターを用いて、50細胞プール(sIgG+CD45R+またはsIgG+CD21+)を96ウェルプレート内にソーティングした。B細胞増殖ならびにIgG分泌細胞(すなわち形質細胞)への分化を促進する培地組成を同定するため、異なる因子を補充した培地中で細胞を培養した。
本発明を例示するため、KLHコンジュゲート化ハプテンで免疫されたヒツジから、PBMCを単離し、そして抗原特異的B細胞を濃縮するため、ビオチン化ハプテンおよび磁気ストレプトアビジンビーズを用いた陽性パニングを経た。続いて、B細胞を表面IgG(sIgG)およびB細胞マーカーCD45RまたはCD21の両方に関して染色した。BD FACS Aria細胞ソーターを用いて、50細胞プール(sIgG+CD45R+またはsIgG+CD21+)を96ウェルプレート内にソーティングした。B細胞増殖ならびにIgG分泌細胞(すなわち形質細胞)への分化を促進する培地組成を同定するため、異なる因子を補充した培地中で細胞を培養した。
すべての実験において、基本培地に10%FCS、SAC、およびヒツジTSNを補充した。EL4B5フィーダー細胞の存在下で細胞を培養した。
in vitro培養sIgG + CD45R + B細胞によるIgG分泌
抗原濃縮sIgG+CD45R+ B細胞の50細胞/ウェルのプールを、EL4B5フィーダー細胞の存在下、96ウェルプレート中の異なる培地中で培養した。培養1週間後、ヒツジIgG ELISAを用いて、上清のヒツジIgG濃度を分析した。基本培地としてのIMDMに関する結果を図1に提示し、そして基本培地としてのDMEMおよびIMDMに関する結果を、以下の表に提示する。
in vitro培養sIgG + CD45R + B細胞によるIgG分泌
抗原濃縮sIgG+CD45R+ B細胞の50細胞/ウェルのプールを、EL4B5フィーダー細胞の存在下、96ウェルプレート中の異なる培地中で培養した。培養1週間後、ヒツジIgG ELISAを用いて、上清のヒツジIgG濃度を分析した。基本培地としてのIMDMに関する結果を図1に提示し、そして基本培地としてのDMEMおよびIMDMに関する結果を、以下の表に提示する。
表
IMDM=イスコーブの修飾ダルベッコ培地
IL−6=ヒトインターロイキン6
IL−4=ヒトインターロイキン4
LPS=リポ多糖
PMA=ホルボールミリステートアセテート
DMEM=ダルベッコの修飾イーグル培地
ヒツジIgGの有意な濃度(>50ng/ml)を含有したウェルは、それぞれわずか5%または18%であったため、基本培地自体(10%FCS、SACおよびヒツジTNSを補充したDMEMまたはIMDM)は、ヒツジB細胞の増殖/分化を効率的に促進しないことがわかる。IgG含有ウェルの数の増加は、基本培地にIL−4および/またはIL−6またはLPSを補った際に顕著であった。驚くべきことに、PMAを基本培地に添加すると、それぞれ、64%または100%のウェルが、十分な濃度のIgG(>50ng/ml)を含有することが見出された。
IL−6=ヒトインターロイキン6
IL−4=ヒトインターロイキン4
LPS=リポ多糖
PMA=ホルボールミリステートアセテート
DMEM=ダルベッコの修飾イーグル培地
ヒツジIgGの有意な濃度(>50ng/ml)を含有したウェルは、それぞれわずか5%または18%であったため、基本培地自体(10%FCS、SACおよびヒツジTNSを補充したDMEMまたはIMDM)は、ヒツジB細胞の増殖/分化を効率的に促進しないことがわかる。IgG含有ウェルの数の増加は、基本培地にIL−4および/またはIL−6またはLPSを補った際に顕著であった。驚くべきことに、PMAを基本培地に添加すると、それぞれ、64%または100%のウェルが、十分な濃度のIgG(>50ng/ml)を含有することが見出された。
より詳細な分析のため、ウェルの4つのカテゴリーを定義した:IgG産生細胞を含まないウェル(IgG濃度が検出限界未満、すなわち<10ng/ml)、低いIgG濃度を含むウェル(10〜50ng/ml)、平均的なIgG濃度を含むウェル(50〜200ng/ml)、そして高いIgG濃度を含むウェル(200〜400ng/ml)。結果を以下の表に提示する。
表
表
IMDM=イスコーブの修飾ダルベッコ培地
IL−6=ヒトインターロイキン6
IL−4=ヒトインターロイキン4
LPS=リポ多糖
PMA=ホルボールミリステートアセテート
DMEM=ダルベッコの修飾イーグル培地
例えば基本培地としてのIMDMに関して、IL−6および/またはIL−4での培地の補充は、匹敵する効果を有し、平均的なIgG濃度を含むおよそ60〜70%のウェルおよび高いIgG濃度を含む少数のウェル(ウェルのおよそ5〜9%)を生じた。細胞のLPS刺激に関して同様の結果を得た。PMAでの刺激は、50〜200ng/mlの範囲の平均的なIgG濃度を含む100%のウェルを生じる。
IL−6=ヒトインターロイキン6
IL−4=ヒトインターロイキン4
LPS=リポ多糖
PMA=ホルボールミリステートアセテート
DMEM=ダルベッコの修飾イーグル培地
例えば基本培地としてのIMDMに関して、IL−6および/またはIL−4での培地の補充は、匹敵する効果を有し、平均的なIgG濃度を含むおよそ60〜70%のウェルおよび高いIgG濃度を含む少数のウェル(ウェルのおよそ5〜9%)を生じた。細胞のLPS刺激に関して同様の結果を得た。PMAでの刺激は、50〜200ng/mlの範囲の平均的なIgG濃度を含む100%のウェルを生じる。
in vitro培養sIgG + CD21 + B細胞によるIgG分泌
抗原濃縮sIgG+CD21+ B細胞の50細胞/ウェルのプールを、EL4B5フィーダー細胞の存在下、96ウェルプレート中、示す培地中で培養した。培養1週間後、ヒツジIgG ELISAを用いて、上清のヒツジIgG濃度を分析した。基本培地としてのIMDMに関する結果を図2に提示し、そして基本培地としてのDMEMおよびIMDMに関する結果を、以下の表に提示する。
抗原濃縮sIgG+CD21+ B細胞の50細胞/ウェルのプールを、EL4B5フィーダー細胞の存在下、96ウェルプレート中、示す培地中で培養した。培養1週間後、ヒツジIgG ELISAを用いて、上清のヒツジIgG濃度を分析した。基本培地としてのIMDMに関する結果を図2に提示し、そして基本培地としてのDMEMおよびIMDMに関する結果を、以下の表に提示する。
表
IMDM=イスコーブの修飾ダルベッコ培地
IL−6=ヒトインターロイキン6
IL−4=ヒトインターロイキン4
LPS=リポ多糖
PMA=ホルボールミリステートアセテート
DMEM=ダルベッコの修飾イーグル培地
基本培地(10%FCS、SACおよびヒツジTNSを補充したDMEMまたはIMDM)は、sIgG+CD21+ヒツジB細胞の増殖/分化を促進することがわかる。基本培地としてのIMDMに関しては、ウェルのおよそ60%が、ヒツジIgGの有意な濃度(>50ng/ml)を含有した。基本培地にIL−4またはLPSを補充すると、IgG含有ウェル数の増加が認められた。同様に、基本培地にPMAを添加すると、有意なレベルのIgGを含有するウェル数が増加した(およそ90%)
より詳細な分析のため、ウェルの4つのカテゴリーを定義した:IgG産生細胞を含まないウェル(IgG濃度が検出限界未満、すなわち<10ng/ml)、低いIgG濃度を含むウェル(10〜50ng/ml)、平均的なIgG濃度を含むウェル(50〜200ng/ml)、そして高いIgG濃度を含むウェル(200〜400ng/ml)。結果を以下の表に提示する。
IL−6=ヒトインターロイキン6
IL−4=ヒトインターロイキン4
LPS=リポ多糖
PMA=ホルボールミリステートアセテート
DMEM=ダルベッコの修飾イーグル培地
基本培地(10%FCS、SACおよびヒツジTNSを補充したDMEMまたはIMDM)は、sIgG+CD21+ヒツジB細胞の増殖/分化を促進することがわかる。基本培地としてのIMDMに関しては、ウェルのおよそ60%が、ヒツジIgGの有意な濃度(>50ng/ml)を含有した。基本培地にIL−4またはLPSを補充すると、IgG含有ウェル数の増加が認められた。同様に、基本培地にPMAを添加すると、有意なレベルのIgGを含有するウェル数が増加した(およそ90%)
より詳細な分析のため、ウェルの4つのカテゴリーを定義した:IgG産生細胞を含まないウェル(IgG濃度が検出限界未満、すなわち<10ng/ml)、低いIgG濃度を含むウェル(10〜50ng/ml)、平均的なIgG濃度を含むウェル(50〜200ng/ml)、そして高いIgG濃度を含むウェル(200〜400ng/ml)。結果を以下の表に提示する。
表
表
IMDM=イスコーブの修飾ダルベッコ培地
IL−6=ヒトインターロイキン6
IL−4=ヒトインターロイキン4
LPS=リポ多糖
PMA=ホルボールミリステートアセテート
DMEM=ダルベッコの修飾イーグル培地
例えば基本培地としてのIMDMに関して、IL−4またはLPSでの培地の補充は、匹敵する効果を有し、平均的なIgG濃度を含むおよそ70〜90%のウェルおよび高いIgG濃度を含む少数のウェル(ウェルのおよそ5〜10%)を生じる。対照的に、PMAでの刺激は、高いIgG濃度を含むおよそ50%のウェルおよび平均的なIgG濃度を含むおよそ40%のウェルを導く。
IL−6=ヒトインターロイキン6
IL−4=ヒトインターロイキン4
LPS=リポ多糖
PMA=ホルボールミリステートアセテート
DMEM=ダルベッコの修飾イーグル培地
例えば基本培地としてのIMDMに関して、IL−4またはLPSでの培地の補充は、匹敵する効果を有し、平均的なIgG濃度を含むおよそ70〜90%のウェルおよび高いIgG濃度を含む少数のウェル(ウェルのおよそ5〜10%)を生じる。対照的に、PMAでの刺激は、高いIgG濃度を含むおよそ50%のウェルおよび平均的なIgG濃度を含むおよそ40%のウェルを導く。
単一細胞分析
単一sIgG + CD21 + B細胞のソーティングおよび培養
KLHコンジュゲート化ハプテンで免疫されたヒツジから、PBMCを単離し、抗原特異的B細胞を濃縮するため、陽性パニングを経て、そしてヒツジsIgGおよびCD21の両方に関して染色した。BD FACS Aria細胞ソーターを用いて、単一細胞を96ウェルプレート内にソーティングした。10%FCS、SAC、ヒツジTSNおよびPMAを補充したIMDM中で細胞を培養した。EL4B5フィーダー細胞の存在下で細胞を培養した。培養1週後、細胞上清のIgG濃度をELISAによって分析した。結果を図3に示す。
単一sIgG + CD21 + B細胞のソーティングおよび培養
KLHコンジュゲート化ハプテンで免疫されたヒツジから、PBMCを単離し、抗原特異的B細胞を濃縮するため、陽性パニングを経て、そしてヒツジsIgGおよびCD21の両方に関して染色した。BD FACS Aria細胞ソーターを用いて、単一細胞を96ウェルプレート内にソーティングした。10%FCS、SAC、ヒツジTSNおよびPMAを補充したIMDM中で細胞を培養した。EL4B5フィーダー細胞の存在下で細胞を培養した。培養1週後、細胞上清のIgG濃度をELISAによって分析した。結果を図3に示す。
培養1週後、総ウェルの33%がIgG分泌B細胞クローンを含有した(図3の左の列)。順に、IgG分泌クローンを含むこれらのウェルのうち62%が低いIgG濃度(10〜50ng/ml、図3の左から2番目の列)を含有し、24%が平均的なIgG濃度(50〜200ng/ml、図3の右から2番目の列)を含有し、そして14%が高いIgG濃度(200〜400ng/ml、図3の右列)を含有した。
抗原特異的ELISAを用いて、分泌抗体の特異性を分析した(データ未提示)。これらのELISAは、総IgG分泌クローンの38%が、抗原特異的である抗体を産生したことを示す。
この実験を再び行った。別のKLHコンジュゲート化ハプテンで免疫されたヒツジから、PBMCを単離し、抗原特異的B細胞を濃縮するため、陽性パニングを経て、そしてヒツジsIgGおよびCD21の両方に関して染色した。BD FACS Aria細胞ソーターを用いて、二重陽性単一細胞を96ウェルプレート内にソーティングした。10%FCS、SAC、ヒツジTSNおよびPMAを補充したIMDM中、EL4B5フィーダー細胞の存在下で細胞を培養した。対照実験において、PMAの非存在下で、同じ培養条件を用いて、単一細胞を培養した。培養1週後、細胞上清のIgG濃度をELISAによって分析した。培養1週後、PMAの存在下で、総ウェルのおよそ16%がIgG分泌B細胞クローンを含有した。順に、IgG分泌クローンを含むウェルの35%が低いIgG濃度を含有し、35%が平均的なIgG濃度を含有し、そして30%が高いIgG濃度を含有した。PMAの非存在下で、IgG分泌B細胞クローンを含有するウェルはまったくなかった。
さらに、抗原特異的ELISAを用いて、分泌抗体の特異性を分析した(データ未提示)。これらのELISAは、IgG分泌クローンの29%が、抗原特異的である抗体を産生したことを示す。
実験結果を以下の表に要約する。
表
表
特異的態様
1. 以下の工程:
ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、B細胞を培養する
を含むことを特徴とする、B細胞を培養するための方法。
1. 以下の工程:
ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、B細胞を培養する
を含むことを特徴とする、B細胞を培養するための方法。
2. 以下の工程:
ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、抗体分泌B細胞を培養し、そして
培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を産生する
を含むことを特徴とする、ヒツジ抗体を産生するための方法。
ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、抗体分泌B細胞を培養し、そして
培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を産生する
を含むことを特徴とする、ヒツジ抗体を産生するための方法。
3. 抗体分泌B細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の使用。
4. 以下の工程:
ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、B細胞を培養する
を含むことを特徴とする、B細胞の細胞増殖を改善するための方法。
4. 以下の工程:
ホルボールミリステートアセテート(PMA)とともに/その存在下で、B細胞を培養する
を含むことを特徴とする、B細胞の細胞増殖を改善するための方法。
5. B細胞がヒツジB細胞であることを特徴とする、態様1〜4のいずれか一項記載の方法。
6. B細胞が単一で置かれたB細胞または置かれたB細胞プールであることを特徴とする、態様1〜5のいずれか一項記載の方法。
6. B細胞が単一で置かれたB細胞または置かれたB細胞プールであることを特徴とする、態様1〜5のいずれか一項記載の方法。
7. 置かれたB細胞プールが、約10のB細胞〜約1,000,000のB細胞を含むことを特徴とする、態様6記載の方法。
8. 置かれたB細胞プールが、約25のB細胞〜約100,000のB細胞を含むことを特徴とする、態様6〜7のいずれか一項記載の方法。
8. 置かれたB細胞プールが、約25のB細胞〜約100,000のB細胞を含むことを特徴とする、態様6〜7のいずれか一項記載の方法。
9. 置かれたB細胞プールが約50のB細胞を含むことを特徴とする、態様6〜8のいずれか一項記載の方法。
10. 培養がさらに、フィーダー細胞の存在下で/これとともに行われることを特徴とする、態様1〜9のいずれか一項記載の方法。
10. 培養がさらに、フィーダー細胞の存在下で/これとともに行われることを特徴とする、態様1〜9のいずれか一項記載の方法。
11. フィーダー細胞がEL4B5細胞であることを特徴とする、態様10記載の方法。
12. 培養がさらに、胸腺細胞上清(TSN)の存在下で/これとともに行われることを特徴とする、態様1〜11のいずれか一項記載の方法。
12. 培養がさらに、胸腺細胞上清(TSN)の存在下で/これとともに行われることを特徴とする、態様1〜11のいずれか一項記載の方法。
13. TSNがヒツジTSNであることを特徴とする、態様12記載の方法。
14. 培養がさらに、ホルマリン固定ブドウ球菌属A株Cowan 1粒子(SAC)の存在下で行われることを特徴とする、態様1〜13のいずれか一項記載の方法。
14. 培養がさらに、ホルマリン固定ブドウ球菌属A株Cowan 1粒子(SAC)の存在下で行われることを特徴とする、態様1〜13のいずれか一項記載の方法。
15. 培養が、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、ヒツジTSN、SACおよびフィーダー細胞の存在下で/これとともに行われることを特徴とする、態様1〜14のいずれか一項記載の方法。
16. B細胞がIgG陽性B細胞(IgG+)であることを特徴とする、態様1〜15のいずれか一項記載の方法。
17. B細胞が未刺激または未成熟B細胞であることを特徴とする、態様1〜16のいずれか一項記載の方法。
17. B細胞が未刺激または未成熟B細胞であることを特徴とする、態様1〜16のいずれか一項記載の方法。
18. B細胞がIgG陽性およびCD45R陽性B細胞(IgG+CD45R+)であることを特徴とする、態様1〜17のいずれか一項記載の方法。
19. B細胞が成熟B細胞であることを特徴とする、態様1〜16のいずれか一項記載の方法。
19. B細胞が成熟B細胞であることを特徴とする、態様1〜16のいずれか一項記載の方法。
20. B細胞がIgG陽性およびCD21陽性B細胞(IgG+CD21+)であることを特徴とする、態様1〜16および19のいずれか一項記載の方法。
21. 抗原に特異的に結合する抗体を産生するためのものであることを特徴とする、態様1〜20のいずれか一項記載の方法。
21. 抗原に特異的に結合する抗体を産生するためのものであることを特徴とする、態様1〜20のいずれか一項記載の方法。
22. 以下の工程:
a)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、置かれ た抗体分泌B細胞を培養し、
b)抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
c)1またはそれより多い発現カセット内に、b)において単離された核酸あるいは軽鎖および/または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
d)細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含むことを特徴とする、態様1〜21のいずれか一項記載の方法。
a)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で/これとともに、置かれ た抗体分泌B細胞を培養し、
b)抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
c)1またはそれより多い発現カセット内に、b)において単離された核酸あるいは軽鎖および/または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
d)細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含むことを特徴とする、態様1〜21のいずれか一項記載の方法。
23. 以下の工程:
a)抗体分泌B細胞集団を提供し、
b)少なくとも1つの蛍光色素(1つの態様において、1〜3、または2〜3の蛍光色素)で、B細胞集団の細胞を染色し、
c)B細胞染色集団の単一細胞またはB細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器 に置き(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)、
d)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、置かれた個々のB細胞を培養し、
e)個々のB細胞またはB細胞プールの培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
f)逆転写酵素PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
g)抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
h)細胞において核酸を導入し、
i)細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含むことを特徴とする、態様1〜22のいずれか一項記載の方法。
a)抗体分泌B細胞集団を提供し、
b)少なくとも1つの蛍光色素(1つの態様において、1〜3、または2〜3の蛍光色素)で、B細胞集団の細胞を染色し、
c)B細胞染色集団の単一細胞またはB細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器 に置き(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)、
d)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、置かれた個々のB細胞を培養し、
e)個々のB細胞またはB細胞プールの培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
f)逆転写酵素PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
g)抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
h)細胞において核酸を導入し、
i)細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含むことを特徴とする、態様1〜22のいずれか一項記載の方法。
24. 以下の工程:
a)抗体分泌B細胞集団を提供し、
b)少なくとも1つの蛍光色素(1つの態様において、1〜3、または2〜3の蛍光色素)で、B細胞集団の細胞を染色し、
c)B細胞染色集団の単一細胞またはB細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器 に置き(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)、
d)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、置かれたヒツジB細胞を培養し、
e)ヒツジB細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
f)逆転写酵素PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
g)抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
h)細胞において核酸を導入し、
i)細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含むことを特徴とする、態様1〜23のいずれか一項記載の方法。
a)抗体分泌B細胞集団を提供し、
b)少なくとも1つの蛍光色素(1つの態様において、1〜3、または2〜3の蛍光色素)で、B細胞集団の細胞を染色し、
c)B細胞染色集団の単一細胞またはB細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器 に置き(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)、
d)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、置かれたヒツジB細胞を培養し、
e)ヒツジB細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
f)逆転写酵素PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
g)抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
h)細胞において核酸を導入し、
i)細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含むことを特徴とする、態様1〜23のいずれか一項記載の方法。
25. 抗体がヒト化抗体であることを特徴とする、態様2および5〜24のいずれか一項記載の方法。
26. 抗体がキメラ抗体であることを特徴とする、態様2および5〜24のいずれか一項記載の方法。
26. 抗体がキメラ抗体であることを特徴とする、態様2および5〜24のいずれか一項記載の方法。
27. キメラ抗体が、ヒツジ−ネズミ・キメラ抗体またはヒツジ−ウサギ・キメラ抗体またはヒツジ−ヒト・キメラ抗体であることを特徴とする、態様26記載の方法。
28. 態様1〜27のいずれか一項記載の方法で得られる抗体。
28. 態様1〜27のいずれか一項記載の方法で得られる抗体。
本発明の理解を補助するために、以下の実施例、図および配列を提供するが、本発明の真の範囲は付随する請求項に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示される方法において修飾を行いうることが理解される。
材料および方法
ヒツジTSN(胸腺細胞上清)の調製
ヒツジ胸腺細胞の調製:
サフォーク−メリノ種ヒツジから胸腺を除去し、片に切り分け、そして細胞ストレーナーを通じてすりつぶした。胸腺の細胞を、10%FCS(Hyclone、米国ユタ州ローガン)、L−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(1x)(Gibco)、10mM HEPES(Gibco)、2mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)および55μM 2−メルカプトエタノール(Gibco)を補充したRPMI培地(Gibco、英国ペーズリー)に収集した。細胞を800xgで10分間遠心分離し、そして培地中に再懸濁した。生存細胞を計数した後、細胞懸濁物を再び遠心分離し、そして細胞ペレットを凍結培地(20%FCSおよび10%DMSOを含有するRPMI培地)中に1x108細胞/mlで再懸濁した。−80℃でイソプロピルアルコールを充填した細胞凍結容器(Nalgene Mr. Frosty、Thermo Fisher Scientific)を用いて、細胞アリコットを凍結し、そして続いて液体窒素中に保存した。
ヒツジTSN(胸腺細胞上清)の調製
ヒツジ胸腺細胞の調製:
サフォーク−メリノ種ヒツジから胸腺を除去し、片に切り分け、そして細胞ストレーナーを通じてすりつぶした。胸腺の細胞を、10%FCS(Hyclone、米国ユタ州ローガン)、L−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(1x)(Gibco)、10mM HEPES(Gibco)、2mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)および55μM 2−メルカプトエタノール(Gibco)を補充したRPMI培地(Gibco、英国ペーズリー)に収集した。細胞を800xgで10分間遠心分離し、そして培地中に再懸濁した。生存細胞を計数した後、細胞懸濁物を再び遠心分離し、そして細胞ペレットを凍結培地(20%FCSおよび10%DMSOを含有するRPMI培地)中に1x108細胞/mlで再懸濁した。−80℃でイソプロピルアルコールを充填した細胞凍結容器(Nalgene Mr. Frosty、Thermo Fisher Scientific)を用いて、細胞アリコットを凍結し、そして続いて液体窒素中に保存した。
ヒツジ・マクロファージの調製:
およそ50mlのEDTA−血液をサフォーク−メリノ種ヒツジから採取し、そして等体積のPBS(リン酸緩衝生理食塩水)と混合した。希釈した血液15mlのアリコットを、12.5mlのLympholyte(登録商標)−哺乳動物(Cedarlane、カナダ・オンタリオ州)に重層し、そして800xgで30分間遠心分離した。遠心分離後、PBMC(末梢血単核細胞)を収集し、PBSで洗浄し、そして計数チャンバーを用いて計数した。10%FCS(Hyclone)、L−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(1x)(Gibco)、10mM HEPES(Gibco)、2mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)および55μM 2−メルカプトエタノール(Gibco)を補充したRPMI培地(Gibco)中、1x106細胞/mlで、T175細胞培養フラスコ(Greiner Bio−One、ドイツ・フリッケンハウゼン)内に細胞を植え付けた。細胞を加湿大気中、37℃/5%CO2で48時間インキュベーションした。続いて、細胞を培地で穏やかに洗浄することによって非接着細胞を除去し、一方、接着細胞(マクロファージ濃縮集団)を以下に記載するように胸腺細胞と共培養することによって、TSN調製のために用いた。
およそ50mlのEDTA−血液をサフォーク−メリノ種ヒツジから採取し、そして等体積のPBS(リン酸緩衝生理食塩水)と混合した。希釈した血液15mlのアリコットを、12.5mlのLympholyte(登録商標)−哺乳動物(Cedarlane、カナダ・オンタリオ州)に重層し、そして800xgで30分間遠心分離した。遠心分離後、PBMC(末梢血単核細胞)を収集し、PBSで洗浄し、そして計数チャンバーを用いて計数した。10%FCS(Hyclone)、L−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(1x)(Gibco)、10mM HEPES(Gibco)、2mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)および55μM 2−メルカプトエタノール(Gibco)を補充したRPMI培地(Gibco)中、1x106細胞/mlで、T175細胞培養フラスコ(Greiner Bio−One、ドイツ・フリッケンハウゼン)内に細胞を植え付けた。細胞を加湿大気中、37℃/5%CO2で48時間インキュベーションした。続いて、細胞を培地で穏やかに洗浄することによって非接着細胞を除去し、一方、接着細胞(マクロファージ濃縮集団)を以下に記載するように胸腺細胞と共培養することによって、TSN調製のために用いた。
ヒツジ胸腺細胞およびマクロファージの共培養
凍結胸腺細胞を融解し、そして10%FCS(Hyclone)、L−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(1x)(Gibco)、10mM HEPES(Gibco)、2mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)および55μM 2−メルカプトエタノール(Gibco)を補充したRPMI培地(Gibco)中、5x105細胞/mlで、T175細胞培養フラスコ(Greiner Bio−One)内に植え付けた。胸腺細胞を加湿大気中、37℃/5%CO2で48時間インキュベーションした。続いて細胞を採取し、遠心分離によって収集し、そして新鮮な培地中に再懸濁した。胸腺細胞を計数し、そして5μg/ml植物性血球凝集素M(Sigma−Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス)および10ng/mlホルボール12−ミリステート−13−アセテート(Sigma−Aldrich)の添加によって刺激した。
凍結胸腺細胞を融解し、そして10%FCS(Hyclone)、L−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(1x)(Gibco)、10mM HEPES(Gibco)、2mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)および55μM 2−メルカプトエタノール(Gibco)を補充したRPMI培地(Gibco)中、5x105細胞/mlで、T175細胞培養フラスコ(Greiner Bio−One)内に植え付けた。胸腺細胞を加湿大気中、37℃/5%CO2で48時間インキュベーションした。続いて細胞を採取し、遠心分離によって収集し、そして新鮮な培地中に再懸濁した。胸腺細胞を計数し、そして5μg/ml植物性血球凝集素M(Sigma−Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス)および10ng/mlホルボール12−ミリステート−13−アセテート(Sigma−Aldrich)の添加によって刺激した。
刺激胸腺細胞をおよそ2:1(胸腺細胞:マクロファージ)の比でマクロファージに添加した。共培養36時間後、細胞上清(TSN)を採取し、0.2μMフィルターを通じて濾過し、そして−80℃でアリコットで保存した。
抗原特異的ヒツジB細胞プールの単離および培養
免疫原としてKLH共役ハプテン(アジュバント中に配合した500μg用量)を用いて、サフォーク−メリノ種ヒツジを数回免疫した。B細胞単離の5日前、免疫原(アジュバント中に配合した動物あたり500μgの用量)の皮下適用によってヒツジに追加免疫した。B細胞を単離するため、動物からおよそ150mlのEDTA−血液を採取し、そして等体積のPBSと混合した。希釈血液をLeucosepTM試験管(Greiner Bio−One、ドイツ・フリッケンハウゼン)に装填し(試験管あたり20ml)、そして室温、800xgで15分間遠心分離した。遠心分離後、PBMC(末梢血単核細胞)を収集し、PBSで洗浄し、そして計数チャンバーを用いて計数した。
免疫原としてKLH共役ハプテン(アジュバント中に配合した500μg用量)を用いて、サフォーク−メリノ種ヒツジを数回免疫した。B細胞単離の5日前、免疫原(アジュバント中に配合した動物あたり500μgの用量)の皮下適用によってヒツジに追加免疫した。B細胞を単離するため、動物からおよそ150mlのEDTA−血液を採取し、そして等体積のPBSと混合した。希釈血液をLeucosepTM試験管(Greiner Bio−One、ドイツ・フリッケンハウゼン)に装填し(試験管あたり20ml)、そして室温、800xgで15分間遠心分離した。遠心分離後、PBMC(末梢血単核細胞)を収集し、PBSで洗浄し、そして計数チャンバーを用いて計数した。
PBSで洗浄した後、PBMCを5x107細胞/mlでFACS緩衝液(PBS/1%BSA)中に再懸濁した。抗原特異的B細胞の陽性パニングのため、細胞を穏やかに回転させながら、ビオチン化ハプテン(500ng/ml)と4℃で30分間インキュベーションすることによって、標識した。続いて、細胞をPBSで洗浄し、そして90μlあたり1x107細胞で標識緩衝液(PBS/2mM EDTA)中に再懸濁した。細胞を穏やかに回転させながら、磁気ストレプトアビジン・マイクロビーズ(Miltenyi
Biotech、ドイツ・ベルギッシュグラートバハ)と4℃で30分間、インキュベーションした(細胞懸濁物90μlあたりビーズ10μlを用いる)。PBSで洗浄した後、細胞を2x108細胞/mlでMACS緩衝液(PBS/1%BSA/2mM EDTA)中に再懸濁し、そしてMACS緩衝液で平衡化したMACSカラム(Miltenyi Biotec)上に装填した。MACS緩衝液での洗浄後、磁石をカラムから除去し、そして標識された抗原特異的細胞をMACS緩衝液中で溶出させた。
Biotech、ドイツ・ベルギッシュグラートバハ)と4℃で30分間、インキュベーションした(細胞懸濁物90μlあたりビーズ10μlを用いる)。PBSで洗浄した後、細胞を2x108細胞/mlでMACS緩衝液(PBS/1%BSA/2mM EDTA)中に再懸濁し、そしてMACS緩衝液で平衡化したMACSカラム(Miltenyi Biotec)上に装填した。MACS緩衝液での洗浄後、磁石をカラムから除去し、そして標識された抗原特異的細胞をMACS緩衝液中で溶出させた。
B細胞染色のため、溶出した細胞分画をPBSで洗浄し、そして2x107細胞/mlでFACS緩衝液中に再懸濁した。1:50希釈FITC標識抗ヒツジIgGモノクローナル抗体(クローンGT−34)(Sigma−Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス)を1:10希釈RPE標識抗ヒツジCD45R mAb(クローン20.96、AbD Serotec、ドイツ・デュッセルドルフ)またはRPE標識抗ヒツジCD21 mAb(クローンCC21、AbD Serotec)と組み合わせて用いて、細胞を染色した。細胞を穏やかに回転させながら、mAbと4℃で45分間インキュベーションした。対照実験において、細胞アリコットを個々のmAb単独で染色した(単一染色)。未染色細胞は陰性対照として供した。
PBSで洗浄した後、細胞をFACS緩衝液中に再懸濁し、そしてFACS Aria
I細胞ソーター(BD Biosciences、ドイツ・ハイデルベルグ)を用いた細胞ソーティングに供した。表面IgG(sIgG)+CD21+またはsIgG+CD45R+二重陽性B細胞を同定し、そして280μl培地およびγ照射ネズミ胸腺腫EL4B5フィーダー細胞を含有する96ウェルプレート(およそ5x104フィーダー細胞/ウェルをプレート内への細胞ソーティング24時間前に植え付ける)内にソーティングした(50細胞/ウェル)。
I細胞ソーター(BD Biosciences、ドイツ・ハイデルベルグ)を用いた細胞ソーティングに供した。表面IgG(sIgG)+CD21+またはsIgG+CD45R+二重陽性B細胞を同定し、そして280μl培地およびγ照射ネズミ胸腺腫EL4B5フィーダー細胞を含有する96ウェルプレート(およそ5x104フィーダー細胞/ウェルをプレート内への細胞ソーティング24時間前に植え付ける)内にソーティングした(50細胞/ウェル)。
基本培地は、10%FCS(Hyclone、米国ユタ州ローガン)、L−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(1x)(Gibco)、55μM 2−メルカプトエタノール(Gibco)、ヒツジTSN(1:20希釈)および熱殺菌ホルマリン固定黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)細胞(SAC;1:10,000希釈)(Pansorbin(登録商標)、Calbiochem、ドイツ・ダルムシュタット)を補充したDMEM(Gibco、英国ペーズリー)またはIMDM(Gibco)のいずれかであった。基本IMDMは、上述のように補充したものに加えて、0.025%Pluronic F−68(Gibco)を含有した。
ヒツジB細胞の増殖および分化に対する異なる刺激の影響を評価するため、図に示すように、以下の化合物を単独でまたは組み合わせて、基本培地に添加した:10ng/mlヒトIL−4(Peprotech、ドイツ・ハンブルグ)、50ng/mlヒトIL−6(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)、1μg/ml大腸菌由来リポ多糖(LPS)(Sigma−Aldrich)または1μg/mlホルボール12−ミリステート−13−アセテート(PMA)(Sigma−Aldrich)。
加湿大気中、37℃/5%CO2で、培地中、7〜10日間、B細胞をインキュベーションした。続いて、細胞上清を採取し、そして以下に示すように、ELISAによってIgG濃度を決定した。
単一抗原特異的B細胞の単離および培養
免疫動物由来のヒツジPBMCを上述のように単離した。上述のように、ビオチン化抗原および磁気ストレプトアビジン・マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を用いた陽性パニングによって、抗原特異的B細胞を濃縮した。1:50希釈FITC標識抗ヒツジIgGモノクローナル抗体(クローンGT−34)(Sigma−Aldrich)を1:10希釈RPE標識抗ヒツジCD21 mAb(AbD Serotec)と組み合わせて用いて、細胞を染色した。細胞を穏やかに回転させながら、mAbと4℃で45分間インキュベーションした。対照実験において、細胞アリコットを個々のmAb単独で染色した(単一染色)。未染色細胞は陰性対照として働いた。
免疫動物由来のヒツジPBMCを上述のように単離した。上述のように、ビオチン化抗原および磁気ストレプトアビジン・マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を用いた陽性パニングによって、抗原特異的B細胞を濃縮した。1:50希釈FITC標識抗ヒツジIgGモノクローナル抗体(クローンGT−34)(Sigma−Aldrich)を1:10希釈RPE標識抗ヒツジCD21 mAb(AbD Serotec)と組み合わせて用いて、細胞を染色した。細胞を穏やかに回転させながら、mAbと4℃で45分間インキュベーションした。対照実験において、細胞アリコットを個々のmAb単独で染色した(単一染色)。未染色細胞は陰性対照として働いた。
PBSで洗浄した後、細胞をFACS緩衝液中に再懸濁し、そしてFACS Aria
I細胞ソーター(BD Biosciences)を用いた細胞ソーティングに供した。単一sIgG+CD21+二重陽性B細胞を同定し、そして280μl培地およびγ照射ネズミEL4B5フィーダー細胞を含有する96ウェルプレート(およそ5x104フィーダー細胞/ウェルをプレート内への細胞ソーティング24時間前に植え付ける)内にソーティングした(1細胞/ウェル)。
I細胞ソーター(BD Biosciences)を用いた細胞ソーティングに供した。単一sIgG+CD21+二重陽性B細胞を同定し、そして280μl培地およびγ照射ネズミEL4B5フィーダー細胞を含有する96ウェルプレート(およそ5x104フィーダー細胞/ウェルをプレート内への細胞ソーティング24時間前に植え付ける)内にソーティングした(1細胞/ウェル)。
単一ヒツジB細胞の培養用の培地は、10%FCS(Hyclone)、L−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(1x)(Gibco)、55μM 2−メルカプトエタノール(Gibco)、0.025%Pluronic F−68(Gibco)、ヒツジTSN(1:20希釈)、SAC(1:10,000希釈)(Calbiochem)および1μg/ml PMA(Sigma−Aldrich)を補充したIMDM(Gibco)であった。
加湿大気中、37℃/5%CO2で、培地中、7〜10日間、B細胞をインキュベーションした。続いて、細胞上清を採取し、そして以下に記載するように、ELISAによってIgG濃度を決定した。
ELISAによるヒツジIgG濃度の決定
ビオチン・コンジュゲート化モノクローナル抗ヒツジIgG抗体(カタログ番号213−062−177、Dianova、ドイツ・ハンブルグ)を、ストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレート(MicroCoat、ドイツ・ベルンリート)上に固定した。PBS/1%RPLA4(ウシ血漿アルブミン)(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)中、300ng/mlの濃度でmAb(100μl/ウェル)を用い、そしてウェルを室温(RT)で1時間、希釈mAbとインキュベーションした。洗浄緩衝液(0.9%NaCl/0.05%Tween)で洗浄した後、in vitro培養B細胞の上清または精製ポリクローナル・ヒツジIgG(Roche)の連続希釈をプレートに添加し、そしてRTで1時間インキュベーションした。洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビ(horseradish)ペルオキシダーゼ(Dianova、カタログ番号713−035−147)で標識したロバ(donkey)抗ヒツジIgG(H+L)抗体(PBS/1%RPLA4中、1:15,000希釈)と、ウェルをインキュベーションした。RTで1時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質としてABTS溶液(Roche)を用いて、シグナルを検出した。プレートを405nmで(参照波長492nm)マイクロプレート読み取り装置中で読み取った。精製ヒツジIgG(0〜200ng/ml)の連続希釈は標準として働き、そしてこれをB細胞上清のIgG濃度の計算に用いた。
ビオチン・コンジュゲート化モノクローナル抗ヒツジIgG抗体(カタログ番号213−062−177、Dianova、ドイツ・ハンブルグ)を、ストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレート(MicroCoat、ドイツ・ベルンリート)上に固定した。PBS/1%RPLA4(ウシ血漿アルブミン)(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)中、300ng/mlの濃度でmAb(100μl/ウェル)を用い、そしてウェルを室温(RT)で1時間、希釈mAbとインキュベーションした。洗浄緩衝液(0.9%NaCl/0.05%Tween)で洗浄した後、in vitro培養B細胞の上清または精製ポリクローナル・ヒツジIgG(Roche)の連続希釈をプレートに添加し、そしてRTで1時間インキュベーションした。洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビ(horseradish)ペルオキシダーゼ(Dianova、カタログ番号713−035−147)で標識したロバ(donkey)抗ヒツジIgG(H+L)抗体(PBS/1%RPLA4中、1:15,000希釈)と、ウェルをインキュベーションした。RTで1時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質としてABTS溶液(Roche)を用いて、シグナルを検出した。プレートを405nmで(参照波長492nm)マイクロプレート読み取り装置中で読み取った。精製ヒツジIgG(0〜200ng/ml)の連続希釈は標準として働き、そしてこれをB細胞上清のIgG濃度の計算に用いた。
ELISAによるヒツジIgGの抗原特異性の決定
ビオチン・コンジュゲート化抗原を、ストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレート(MicroCoat、ドイツ・ベルンリート)上に固定した。PBS/1%RPLA4(ウシ血漿アルブミン)(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)中、100〜300ng/mlの濃度でビオチン化抗原(100μl/ウェル)を用い、そしてウェルを室温(RT)で1時間、希釈抗原とインキュベーションした。洗浄緩衝液(0.9%NaCl/0.05%Tween)で洗浄した後、in
vitro培養B細胞の上清または精製ポリクローナル・ヒツジIgG(Roche)の連続希釈をプレートに添加し、そしてRTで1時間インキュベーションした。洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(Dianova、カタログ番号713−035−147)で標識したロバ抗ヒツジIgG(H+L)抗体(PBS/1%RPLA4中、1:15,000希釈)と、ウェルをインキュベーションした。RTで1時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質としてABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)を用いて、シグナルを検出した。
ビオチン・コンジュゲート化抗原を、ストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレート(MicroCoat、ドイツ・ベルンリート)上に固定した。PBS/1%RPLA4(ウシ血漿アルブミン)(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)中、100〜300ng/mlの濃度でビオチン化抗原(100μl/ウェル)を用い、そしてウェルを室温(RT)で1時間、希釈抗原とインキュベーションした。洗浄緩衝液(0.9%NaCl/0.05%Tween)で洗浄した後、in
vitro培養B細胞の上清または精製ポリクローナル・ヒツジIgG(Roche)の連続希釈をプレートに添加し、そしてRTで1時間インキュベーションした。洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(Dianova、カタログ番号713−035−147)で標識したロバ抗ヒツジIgG(H+L)抗体(PBS/1%RPLA4中、1:15,000希釈)と、ウェルをインキュベーションした。RTで1時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質としてABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)を用いて、シグナルを検出した。
Claims (13)
- 以下の工程:
ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、ヒツジB細胞を培養する、 ここで該B細胞がIgG陽性B細胞(IgG + )である、
を含むことを特徴とする、ヒツジB細胞を培養するための方法。 - 培養が、ホルボールミリステートアセテート(PMA)、ヒツジTSNおよびフィーダー細胞の存在下であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 以下の工程:
ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で抗体分泌ヒツジB細胞を培養し、そして
培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を産生する
を含む、抗体を産生するための方法。 - ヒツジB細胞が未刺激(naive)または未成熟ヒツジB細胞であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- B細胞がIgG陽性およびCD45R陽性B細胞(IgG+CD45R+)であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- B細胞がIgG陽性およびCD21陽性B細胞(IgG+CD21+)であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 以下の工程:
a)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、抗体分泌ヒツジB細胞のプールまたは単一で置かれた抗体分泌ヒツジB細胞を培養し、
b)抗原に特異的に結合する、抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして重鎖可変ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
c)1またはそれより多い発現カセット内に、b)において単離された核酸あるいは軽鎖および/または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードする該核酸の変異体を含む細胞を培養し、
d)細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗体を産生する
を含むことを特徴とする、請求項3〜6のいずれか一項記載の方法。 - 以下の工程:
a)抗体分泌(成熟)B細胞の集団を提供し、
b)少なくとも1つの蛍光色素で、B細胞集団の細胞を染色し、
c)B細胞染色集団の単一細胞またはB細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器 に置き、
d)ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、該置かれた個々のB細胞を培養し、
e)個々のB細胞またはB細胞プールの培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
f)逆転写酵素PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の 軽鎖および重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を得て、
g)抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
h)細胞において核酸を導入し、
i)細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗体を産生する
を含むことを特徴とする、請求項7記載の方法。 - 抗体分泌(成熟)B細胞の集団がヒツジ血液から得られる、請求項8に記載の方法。
- 少なくとも1つの蛍光色素が、1〜3または2〜3の蛍光色素である、請求項8又は9 に記載の方法。
- 個々の容器がマルチウェルプレートのウェルである、請求項8〜10のいずれか1項に 記載の方法。
- 抗体分泌ヒツジB細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート(PMA)の使用であって、ここで該B細胞がIgG陽性B細胞(IgG + )である前記使用。
- ホルボールミリステートアセテート(PMA)の存在下で、単一で置かれたヒツジB細胞またはヒツジB細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジB細胞の細胞増殖を改善するための方法であって、ここで該B細胞がIgG陽性B細胞(IgG + )である前記方法。
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