JP2014505473A - B7−1−pe40kdel外毒素融合遺伝子に基づくdnaワクチンおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val
20 25 30
Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Pro Ala Gln
35 40 45
Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met
50 55 60
Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe
65 70 75 80
Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser
85 90 95
Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala
100 105 110
Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp
115 120 125
Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile
130 135 140
Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu
145 150 155 160
Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Ser Ala Ile Asn Thr Thr Val
165 170 175
Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp
180 185 190
Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly
195 200 205
His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu
210 215 220
His Phe Pro Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr
245 250 255
Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg
260 265 270
Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln
275 280 285
Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val
290 295 300
Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp
305 310 315 320
Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu
325 330 335
Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly
340 345 350
Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala
370 375 380
Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly
385 390 395 400
Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu
405 410 415
Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe
420 425 430
Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe
435 440 445
Gly Gly Val Arg Ala Arg Asn Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly
450 455 460
Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp
465 470 475 480
Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg
485 490 495
Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu
500 505 510
Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly
515 520 525
His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu
530 535 540
Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr
545 550 555 560
Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Ile Gly Gly
565 570 575
Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala
580 585 590
Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu
595 600 605
1)シグナルペプチドおよびKpnI制限酵素認識部位を含む上流プライマー(P1)、およびXbaI制限酵素認識部位を含む下流プライマー(P2)が設計される。記載された該プライマー配列は、配列番号:4および配列番号:5として示されている。
1. 材料および方法
1.1 プラスミド、細胞および主要な試薬
原核生物発現ベクターpGEMT-B7-1-PE40KDEL(2003.3.3)はわれわれのグループによって構築された。該ベクターを含む株はEschericiah coli DHA5α-pGEMT-B7-PE40KDELと命名され、中国微生物菌株保存管理委員会普通微生物センター(China General Microbiological Culture Collection Center、No 1 Building, No.3, Beichen west Road, Chaoyang district Beijing, China)に受託番号CGMCC NO.4987として2011年6月27日に寄託された。前記発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)は我々の部門に保存されている。ZeocinTM、TRIzolおよびLipofectamineTM2000はInvitrogen Corpから購入された。DMEM/F12培地はGibco Incから購入された。Jurkat細胞およびRaji細胞系は我々の部門に保存されていたものである。CHO-K1-RPE.40細胞系はJM MoehringおよびTJ Moehringにより樹立されたものであり、好意によりSucic Joseph博士から提供された。抗シュードモナス(Pseudomonas)外毒素Aウサギポリクローナル抗体は、Sigma Incから購入された。CD80モノクローナル抗体は、R&D Incから購入された。PVDF膜(ポリフッ化ビニリデン)およびアミコンウルトラ−4(Amicon Ultra-4)はMillipore Incから購入した。超増感化学発光検出試薬はPierce Incから購入された。MTS(CellTiter 96 AQueous One Solution細胞増殖アッセイ)およびPureYieldTMプラスミドミディプレップシステム(midiprep system)はPromega Co. Ltd.から購入された。逆転写キットSYBR(R) Premix Ex TaqTM、KpnI、XbaI、およびT4リガーゼはTaKaRa Bio. Incから購入された。TMB(3,3,5,5'-テトラメチルベンジジン)発色基質溶液および2×Pfu PCR MasterMixはTiangen Biotech(北京)Co., Ltdから購入された。QIAquickゲル抽出キットはQIAGEN Incから購入された。
使用された主な機器には、9700 PCR装置(PerkinElmer)、Du(R)640紫外線検出器(Beckman)、Mini II蛋白電気泳動装置およびセミドライ式蛋白導入装置(Bio-Rad)、Gel-Pro3.1ゲルイメージングシステム(Media Cybernetics)、550 自動マイクロプレートリーダーおよびリアルタイム定量PCR装置(Stratagene、 Mx3005P)が含まれる。
シグナルペプチド配列およびKpnI制限酵素認識部位を含む上流プライマー(P1)と、XbaI制限酵素認識部位を含む下流プライマー(P2)が設計された。シグナルペプチド配列は、Invitrogen Inc.のpSecTag2-Bベクターの配列、すなわちマウスIgのk鎖V-J2-Cのシグナルペプチドに基づくものであって、細胞外空間に大量に分泌されることができるものであった。プライマーの配列は以下のとおりであった:
上流プライマーP1:
P2: 5’TCTAGATTACAGCTCGTCCTTCGGCGG 3’(配列番号:5、下線部はXbaI制限酵素認識部位である。)
シグナルペプチド配列が付加されたP1配列は長すぎるため、スプライスオーバーラップエクステンション(SOE)PCR法が、P1をオーバーラッピング増幅のための2つのプライマーに分割するために用いられた。
5’CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTG 3’ (配列番号:6)
P1-B:
5’GGTACCTATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCA 3’ (配列番号:7)
2×PfuPCRマスターミックス 12.5μl
P1(20μM) 0.5μl
P2(20μM) 0.5μl
pGEMT-B7-1-PE40KDEL(1:50) 3μl
ddH2O 8.5μl
全容積 25μl
10×バッファM 2μl
XbaI 1μl
KpnI 1μl
0.1%BSA 2μl
回収PCR産物およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクター 14μl
全容積 20μl
1)アガロースゲルからの標的バンドは、清潔な刃で切り出され1.5ml EPチューブ内に置かれた。
2×T4リガーゼバッファ 5μl
T4リガーゼ 1μl
二重消化されたPCR産物 3μl
二重消化されたpcDNA3.1/Zeo(+)ベクター 1μl
全容積 10μl
1)5ミリリットルのライゲーション産物および20μlの試薬は滅菌水で100μlに希釈され;それから反応液は後に使用するために氷上に置かれた。
0.5×105-2×105のCHO-K1-RPE.40細胞が6ウェルプレート(2mlの培地:DMEM/F12、7.5%FBS、1×非必須アミノ酸)中に接種された後、リポソームトランスフェクション法が適用された:4μlのプラスミドおよび10μlのLipofectamineTM2000がそれぞれ250μlのOPTI-MEM I培地で希釈され、それから混合され、20分間インキュベートされた。混合液は、ゆっくりと6ウェルプレートに加えられ、それから37℃、5%CO2で6時間インキュベートされた。それから培地は、完全DMEM培地に置き換えられた。48時間後、細胞および上澄み液が集められ、RT-PCRおよびウェスタンプロット解析を用いて選別された。
トランスフェクションから48時間後、増殖相にあるCHO-K1-RPE.40細胞は、PBSで2回洗浄された。TRIzolキットの指示書にしたがって全RNAが抽出され、それから前述のP1およびP2プライマーを用いたPCR増幅のために、cDNAに逆転写された。β-アクチンが対照コントロールとして使用された。
MgCl2 2μl
10×RNA PCRバッファ 1μl
dNTP混合液 1μl
RNaseインヒビター 0.25μl
AMV 0.5μl
オリゴdT 0.5μl
RNA 4.75μl
全容積 10μl
MgCl2 3μl
10×LAバッファ 4μl
ddH2O 31.75μl
LA Taq 0.25μl
P1(20μm) 0.5μl
P2(20μm) 0.5μl
第一鎖(First-Strand)cDNA 10μl
全容積 50μl
上流プライマーP1: 5’CTG TGG CAT CCA CGA AAC TA 3’(配列番号:8)
下流プライマーP2: 5’ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC 3’(配列番号:9)
1)蛋白電気泳動:トランスフェクション後48時間で、CHO-K1-RPE.40細胞培養物の上澄みが収集され、濃縮された。続いて、15μlの試料および15μlの2×SDSローディングバッファが組み合わせられ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)のために5分間煮沸された。蛋白電気泳動は、80Vで蛋白のバンドが濃縮ゲルから泳動するまで行われ、その後、150Vで、蛋白のバンドが分離ゲルの底に到達するまで電気泳動され、その時点で電源が切られた。蛋白電気泳動の配合は以下のとおりである:
10%分離ゲル(5ml) 5%濃縮ゲル(2ml)
ddH2O 1.90ml 1.40ml
30%アクリルアミド 1.70ml 0.33ml
1.5M Tris-HCl(pH 8.8) 1.30ml ―――
1.0M Tris-HCl(pH 6.8) ――― 0.25ml
10%SDS 0.05ml 0.02ml
10%過硫酸アンモニウム 0.05ml 0.02ml
TEMED 0.002ml 0.002ml
リポソームトランスフェクションが、1.4.節で概略が示されたと同様の手順で行われた。トランスフェクションの24時間後、トランスフェクトされた細胞は、1:20の割合で希釈され、ZeocinTMが800μg/mlの濃度まで添加された。培地は4日ごとに交換され、Zeo(+)クローンのサイズが徐々に増大しているときに、細胞は24ウェルのプレートに接種された。細胞がコンフルエントな状態に達したとき、細胞は、複数プレートでの継続的培養のために、6ウェルのプレートに接種された。細胞は、リアルタイム定量RT-PCR法により確認され、陽性細胞クローンは凍結保存され後の使用のために保存された。
1)トランスフェクションの48時間後、安定的にトランスフェクトされた細胞の培養物の上澄みが採集され濃縮された。
CD28を高発現するヒトリンパ腫細胞系のJurkat細胞とpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELで安定的にトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40陽性細胞は、96ウェルプレートで濃度1×105/ml、37℃、5%CO2で48時間、共培養された。それから20μlのMTSが添加され;1時間後、490nmでの吸光度値が測定され、細胞障害活性が算出された。CD28を低発現するヒトBurkitt'sリンパ腫細胞系Rajiがネガティブコントロールとして使用された。細胞死率は以下のように算出された:
細胞死率=(1−安定的にトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40細胞と標的細胞との共培養ウェル中での生存細胞数/トランスフェクトされていないCHO-K1-RPE.40細胞と標的細胞との共培養ウェル中での生存細胞数)×100%
2.1 真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELの構築
B7-1-PE40KDEL融合遺伝子を真核生物細胞中で発現させるために、B7-1-PE40KDELおよびZeo(+)遺伝子を含む真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELが、図1に示すように構築された。設計されたPCRプライマーが、ヒトB7-1-PE40KDELを増幅するために使用され、アガロースゲル電気泳動により分析された。予測される1,850bpの明確なバンドが観察された(図2)。回収された二重消化産物は、真核生物発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)のKpnIおよびXbaI制限酵素認識部位にクローニングされ、組み換えプラスミドpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELが構築され、要請クローンを得るために、その後、抽出され、電気泳動され(図3)、配列決定によりスクリーニングされた(図4.配列は別添1に示されている)。配列決定の結果、シグナルペプチド配列に続く配列中には、いかなる点突然変異もフレームシフトも存在しないことが明らかとなり、原核生物発現プラスミドpRSETA-B7-1-PE40KDELの配列と一致していた。B7-1-PE40KDEL、ヒトB7-1およびPE40間の蛋白の一次構造および二次構造の比較結果は表1に示されている。
正しい配列を有する真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELは、CHO-K1-RPE.40細胞に一過性のトランスフェクトをされ、発現されたB7-1-PE40KDEL融合蛋白を検出するために、以下の方法が用いられた:第一にRT-PCRがトランスフェクトされた細胞中のB7-1-PE40KDEL mRNAの発現を検出するために用いられた。pcDNA3.1/B7-1-PE40KDELでトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40細胞には、1,850bpの明確なバンドが見られ、該明確なバンドは空のベクターでトランスフェクトされたCHO-K1-RPE.40細胞には見られなかった。β-アクチンのPCR産物が内部参照として用いられた(図4)。ウェスタンプロット解析が、細胞培養物の上澄み中のB7-1-PE40KDEL融合蛋白の抗原性と分泌発現を検出するために行われた。結果は、ウサギ抗PEA抗血清またはCD80モノクローナル抗体を用いて62-83kDaの陽性バンドが見られたが、空のベクターでトランスフェクトされた細胞ではバンドは見られなかった(図5)。
スクリーニングされた40クローンのリアルタイム半定量解析により、16クローンが陽性である事が示された。これらの陽性クローンは、その後、培養されバッチで凍結保存された(図6)。安定的にトランスフェクトされた細胞におけるB7-1-PE40KDELの分泌発現量を検出するために、いくつかの陽性クローンの細胞培養物の上澄みをサンプルとして、ELISAおよび既知の濃度のPEAを標準として用いて、蛋白濃度の標準曲線のグラフを描いた(表2、図7)。これらのサンプルからの各上澄みのOD値は、それぞれの安定的にトランスフェクトされたクローンにおける分泌量を得るために標準曲線と比較された。結果は表3に示されている。結果によると、トランスフェクション後24時間で、約287pg/mlのPEA蛋白が1×106の安定的にトランスフェクトされた細胞で発現していることが示されている。
CD28を高発現するヒトリンパ腫細胞系Jurkatが、真核生物で発現したB7-1-PE40KDELの選択的細胞障害活性を検出するために用いられた。CD28を低発現するヒトBurkitt'sリンパ腫細胞系Rajiが、ネガティブコントロールとして使用された。MTTの結果によれば、安定的にトランスフェクトされた細胞とJurkat細胞を一緒にインキュベーションしてから48時間後のOD値は0.782であり、トランスフェクトされていない細胞ではOD値は1.466、Jurkat細胞単独では1.29、安定的にトランスフェクトされた細胞とRaji細胞を共培養した場合は1.296、トランスフェクトされていない細胞単独では1.564であった。前記式によれば、安定的にトランスフェクトされた細胞によるJurkat細胞とRaji細胞の細胞死の率は、92.87%と15%であり、特に、この結果により、真核生物で発現されたB7-1-PE40KDELが、CD28陽性細胞に対して、in vitroで良好な選択的阻害効果を有することが確認された(図8)。
1. 材料および方法
1.1 プラスミド、細胞および主な試薬
真核生物発現ベクターpcDNA3.1/B7-1-PE40KDELが、我々のグループにより構築された。この真核生物現ベクターは、以前にDr. Hong Xueにより構築され保存されていたものである。ウサギ抗シュードモナス(Pseudomonas)外毒素Aポリクローナル抗体は、Sigma Incから購入された。FITC-抗マウスCD3抗体、PE-抗マウスCD28抗体およびPharmlyseTMは、BD Incから購入された。SYBR(R)Premix Ex TaqTM(perfect real-time)は、TaKaRa Bio. Incから購入された。注射用のMTXは、Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.から購入され、シクロスポリンAは、Novartis Pharma Schweiz AGから購入された。マウスリンパ球分離溶液Tianjin Hao Yang Biological Products Co. Ltdから購入された。
in vivo遺伝子導入器具WJ2002(Scientz Biotechnology Co. Ltd.)および自動マイクロプレート読取り機550(Bio-Rad Laboratories, Inc.)が我々の研究で使用された。
レシピエントマウスには、感染を防ぐために、移植の一週間前にゲンタマイシン(32×104U/L)およびエリスロマイシン(250mg/L)を含む飲料水が与えられ、滅菌されたクリーンベンチ(laminar airflow cabinet)内で飼育された。60Coの全身照射(TBI)(8.0Gy、線量率は1.8Gy/分)が、移植の4時間前に施された。
60匹のaGVHDマウスが、ランダムに、各グループがマウス10匹からなる6グループに分けられた:(1)B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループ;(2)B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ;(3)B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ;(4)空のベクターグループ;(5)CsA+MTXポジティブコントロールグループ;および(6)非処置aGVHDグループ。空のベクターおよびDNAワクチンベクターの双方は、生理食塩水に溶解された。プラスミドベクターのRNAのコンタミネーションはなかった。内毒素が除去された。超螺旋性DNAがDNAの70%-80%を占めていた。OD260/OD280率は1.8-2.0の範囲であった。濃度は0.5μg/μlを下回らなかった。予備実験によれば、75μgのB7-1-PE40KDEL DNAワクチンが注入されたとき、aGVHDに対する保護は副作用がほとんどなく良好であった。移植後ただちに、75μgの空のベクターまたはDNAワクチンベクターが、マウスの四頭筋に注射され、遺伝子を効率よく体に送達するために、注射部位に電気パルス仲介刺激が与えられた。パルスのパラメーターは以下のとおりである:電圧、200V/cm;パルス幅、10ms;パルス数、6;周波数、1Hz(Mir LM, Bureau MF, Gehl J, et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96: 4262-4267)。「金基準」であるCsA+MTX養生法は、臨床診療ではよく用いられているが、コントロール薬物として採用された。CsAは、腹腔内注射により1日1回1.5mg/kg.dの用量で投与された。MTXは、腹腔内注射により、1、3、6および11日に0.4mg/kg.dの用量で投与された (Xu K, Li C, Pan X, et al. Study of Relieving Graft-versus-Host Disease by Blocking CD137-CD137 Ligand Costimulatory Pathway in Vitro. Int J Hematol, 2007, 86:84-90.)。
電気パルス仲介筋肉内注射が、75μgの精製されたB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの、標準Balb/Cマウスの四頭筋への注射に使用され、電気刺激が与えられた(200V/cm、10ms、1Hz、6パルス)。1、7、14、21、28、および35日目に、注射後、血液を採集するために眼球が除去され、ヘパリンで処理された。トリゾール(TRIzol)キットが、RNAを抽出するために使用され、RT-PCRが、B7-1-PE40KDEL mRNAの発現を定性的に検出するために使用された。リアルタイム定量PCRが、さらにPE40 mRNAの血液発現レベルを比較するために使用された。β-アクチンが、内部参照として使用された。
MgCl2 2μl
10×RNA PCRバッファ 1μl
dNTP 1μl
RNase阻害因子 0.25μl
AMV 0.5μl
オリゴdT 0.5μl
RNA 0.5μg
全容積 10μl
上流プライマーP1: 5’AGG CAT CCT GAC CCT GAA GTA C 3’(配列番号:10)
下流プライマーP2: 5’TCT TCA TGA GGT AGT CTG TCA G 3’(配列番号:11)
SYBR(R)Premix Ex TaqTM(2×) 12.5μl
ddH2O 10.5μl
P1(20μM) 0.5μl
P2(20μM) 0.5μl
cDNA 1μl
全容積 25μl
リアルタイムPCR反応:
第1部:前変性
反復:1サイクル
95℃で5分間
第2部:PCR反応
反復:35サイクル
94℃で30秒
59℃で30秒
72℃で60秒
第3部:解離
75μgの精製されたB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの注射後、1、7、14、21、28および35日に、マウス眼球が除去され、血液が採集されヘパリンで処理された。FITC-抗マウスCD3抗体およびPE-抗マウスCD28抗体の双方を1マイクロリットル、100μlの抗凝固性の血液に添加し、その後、室温で、暗所で30分間インキュベートした。次に、2mlのPharmlyseTM赤血球溶解素バッファが添加され、その後、室温で、暗所で15分間インキュベートされた。混合液は、それから1500rpmで5分間遠心処理された。上澄みの廃棄後、ペレットはPBSに再懸濁され、その後、1500rpmで5分間遠心処理された。上澄みの廃棄後、0.5mlの2%パラホルムアルデヒド-PBSが検出のために添加された。
B7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射から21日後、マウス眼球が除去され、血液が採集され遠心処理され、後に使用するために血清が-20℃で保存された。ELISAは以下のように実施された:PEA(1mg/mL)がコーティングバッファに溶解され、各ウェルは200ng/100μlでコートされ、その後、4℃で一晩インキュベートされた。翌日、ウェルはPBSTで2-3回洗浄され、それからウシ血清ブロッキング溶液中で、室温で2時間ブロックされた。血清サンプルおよび標準サンプル(100μl/well)は、37℃で1時間インキュベートされ、PBSTで3回洗浄された。次に、1:50,000の割合で希釈された100μlのHRP-抗マウスIgG抗体が各ウェルに添加され、37℃で1時間インキュベートされた。PBSTで4回洗浄した後、100μlのTMB色素溶液が各ウェルに添加され、37℃で15分間インキュベートされた。反応は、50μlの2M H2SO4を各ウェルに添加することで終了され、吸光度値が450nmで測定された。ウサギ抗PEAポリクローナル抗体が、ポジティブコントロールとして用いられ、pcDNA3.1の空のベクターを注射したマウスの血清がネガティブコンとロールとして使用された。
75μgのB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射後、身体的な徴候およびマウスの行動が観察された。加えて、7、14および21日目に、B7-1-PE40KDEL DNAワクチンがマウスにおいて毒性または副作用があるかに関する予備的観察を行うために、心臓、肝臓、脾臓、肺および腎臓が病理組織学的検査のために採取された。
全グループのマウスの体重が毎日測定され、毛、精神および下痢などが観察された。
事前調整の後に、20μlの血液が尾の静脈から採集され、通常の間隔で血球計によりカウントするために380μlの白血球細胞希釈液で希釈され、全グループのマウスにおける血液および造血再生の変化を理解するために使用された。
異なる性のマウスが、骨髄移植におけるドナーおよびレシピエントとして使用された。したがって、ゲノムDNAは、雌レシピエントマウスの末梢血から抽出することができ、Y染色体特異的遺伝子sryのプライマーは、移植の生着の検出のために雄ドナーマウスのY染色体をPCR増幅するために設計することができた。
プライマー2: 5’-ATCAACAGGCTGCCAATAAA-3’(配列番号13).
移植後21日目に、全グループのマウスの肝臓、脾臓、小腸および皮膚が除去され、10%ホルマリン溶液で固定され、その後、組織病理学的変化を観察するために、パラフィン切片が作成されHE染色が行われた。
SPSS 13.0ソフトウェアが、統計的解析のために使用された。t検定が、2つのグループ間の平均測定データにおける相違の統計的有意性を検定するために用いられた。ノンパラメトリック検定(Mann-Whitney検定)が、2つのグループ間の整列されたデータの比較に用いられた。P<0.05の場合に統計的に有意と考えた。SPSS 13.0ソフトウァアは、Kaplan-Meier生存カーブを描くためにも使用された。
2.1 標準マウスにおけるB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの発現
RT-PCRの結果(図9)は、B7-1-PE40KDEL DNAワクチンの注射後、1、7、14、21、28および35日目にB7-1-PE40KDELのmRNAが検出可能であることを示している。我々は、β-アクチンを内部標準として使用した。
B7-1-PE40KDELは、CD28を高レベルで発現している細胞を特異的に殺傷することができるので、B7-1-PE40KDEL DNAワクチンを注射したマウスの末梢血からのCD28+T細胞の除去を分析するために、フローサイトメトリー解析が行われ、幾何平均蛍光強度(Geo mean)として示された(図11)。結果は、B7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射から7日後に、CD28+T除去効果が現れ始め、血液CD28+T細胞の幾何平均蛍光強度がコントロールの標準マウスのそれと比較して低いことを示した。注射後21日目には、CD28+Tの数は最低のレベルに低下した。注射後28および35日目には、CD28+Tの数は徐々に回復したが、CD28+T細胞の幾何平均蛍光強度は、依然として標準マウスより低いままであった。この結果は、B7-1-PE40KDELの発現レベルの低下に伴い、CD3+CD28+T細胞が通常レベルに回復する傾向をみせているということを示唆している(図12)。
ELISAを使用して抗PEA抗体のレベルが検出された。市販の抗PEA抗体が、標準曲線を描くための標準として使用された。OD450が横座標として使用され、抗PEA抗体濃度が縦座標として使用され、CurveExpert 1.3ソフトウェアを使用して標準曲線が描かれた(図13)。二次近似式が抗PEA抗体血清の濃度を産出するために用いられた(表4)。B7-1-PE40KDEL DNAワクチンを筋肉内注射したグループの抗PEA抗体レベルは、ポジティブコントロールグループのそれと比較して有意に低く(p<0.05)、ネガティブコントロールグループ(すなわち空のベクター注射グループ)のそれと比較して差異は見られなかった。
75μgのB7-1-PE40KDEL DNAワクチンの筋肉内注射後、マウスは毎日観察されたが、身体的徴候や行動における異常は見られなかった。注射後7、14およぴ21日目に除去された心臓、肝臓、脾臓、肺および腎臓の病理組織学的検査は、いかなる病理学的変化も示さなかった。
移植の1週間後、レシピエントマウスは、毛色の変化、気力低下、食欲の減少、腹部および頭部における重篤な脱毛、下痢、黒糞、潰瘍および円背のような、典型的なGVHD症状を示し始める(図14)。その平均体重は、ほぼ1g/dayの割合で徐々に減少し、10日目には約14.77±1.66gの低点に到達する。その後、体重は増加し始め、それから14日目以降に再び徐々に減少し始め、死に至る。全体重損失は死亡時に約8gであった(図15)。末梢血中でカウントされる白血球細胞数は、1日目から低下し始め、3〜4日目に最低(0.69±0.18×109/L)となった。カウント数は6日目に回復し始め、14日目にピークに達し、その後低下し続けた。白血球細胞数は、死亡時には1.54±0.14×109/Lであった。移植後35日目には、雄ドナーマウスの特異的Y-染色体sry遺伝子配列を、図16に示すように371-bpの断片として、すべてのレシピエントマウスの末梢血において検出することができ、移植が成功したことを示唆した。病理学的検査により典型的なGVHDの病理学的所見が以下のように示された:(i)腸粘膜における腺上皮細胞の壊死が小腸組織において見られ、上皮細胞および腺腔において壊死細胞の残骸が存在した;腺上皮細胞sは扁平であり、腺は嚢胞性であり、腺の数は減少し、腺は消滅し、および粘膜上皮細胞は脱落した(図17-A);(ii)肝臓組織において、病巣の肝臓細胞の縮退および壊死が起き、リンパ球および好酸球の浸潤が観察された(図17-B)。肝臓細胞は膨化し変質した;(iii)脾臓において、我々は、大量の出血、脾性の繊維症、脾臓洞の拡張および出血、ならびに脾臓細胞の散在を観察した(図17-C);(iv)皮下領域において繊維組織の増殖が観察され、真皮においてリンパ球の浸潤が起こった(図17-D)。GVHDモデルグループのすべてのマウスが放射線照射後24日以内に死亡し、生存時間の中央値は22.7日であった。骨髄移植グループの平均生存時間は60日を越えており、長期生存と考えられる。脾臓細胞注入グループの生存時間の中央値は9.6日であった。放射線照射単独のグループの生存時間の中央値は12.3日であった。すべてのグループのマウスの生存率はKaplan-Meier生存曲線において描かれた(図18)。上に列挙した典型的なGVHD症状のすべてにおいて、我々は安定した急性GVHDマウスモデルが樹立されたことを確認し、成功率は100%近かった。
B7-1-PE40KDEL DNAワクチン(B7-1と呼ぶ。)、B7-2-PE40KDEL DNAワクチン(B7-2と呼ぶ。)、およびB7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン(B7-1+B7-2と呼ぶ)による治療の後、円背および脱毛の症状は他のグループと比較してかなり改善した。組み合わせ治療グループにおける脱毛の始まる時期は、他のグループにおけるより3-6日遅かった。便中の出血や肛門周囲の膨化は見られなかった。マウスの体重減少は、B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループにおいて最も少なく、続いてCsA+MTXグループ、B7-1-PE40KDEL +B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ、およびB7-2-PE40KDEL DNAワクチングループであった。空のベクターグループおよび未処置のGVHDグループ(NSグループ)のマウスは、最大の体重減少を示した。すべてのグループのGVHDマウスの処置後の体重変化を図19に示す。
すべてのグループのaGVHDマウスの末梢血におけるWBC(白血球)の数は、1日目から減少し始め、3〜4日目の約0.6×109/Lの低値に至る。WBC数は、6日目に回復し始め、回復のレベルは、B7-1-PE40KDEL DNAワクチン、B7-2-PE40KDEL DNAワクチン、B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン、およびCsA+MTXのグループにおける方が、空のベクターグループおよび未処置グループよりも高かった。すべてのグループのうち、WBCの回復レベルは、B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループにおいて最大であった。続いて、すべてのグループにおいて、WBC数は、再び>1.0×109/Lまで減少した(図20)。
すべてのグループのマウスの小腸組織に関して、処置後21日目に病理学的解析が行われた(図21)。結果によれば、グループC(B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)およびグループE(CsA+MTX)において、良好な腺上皮細胞の完全性と比較的少ない壊死細胞がみられることが明らかとなった。グループF(未処置のaGVHDグループ)においては、大量の粘液腺上皮細胞の壊死が見られ、粘膜上皮の脱落が最も重篤であった。皮膚の病理学的解析(図22)は、グループD(空のベクターグループ)およびグループF(未処置のaGVHDグループ)における、真皮領域における重篤な繊維組織の増殖を明らかにした。グループA(B7-1-PE40KDEL DNAワクチン)、グループB(B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、グループC(B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチン)、およびグループE(CsA+MTX)においては、病変はより軽度であり、リンパ球浸潤の程度もグループDおよびFにおけるよりも低かった。肝臓の病理学的解析(図23)は、グループAのみにおいて、肝臓細胞の膨化および水腫変性の程度が比較的低いことを明らかにした。他のグループにおいては、病巣の肝臓細胞変性および壊死、リンパ球および好酸球の浸潤、ならびに重篤な肝臓細胞の膨化および変性が見られた。
7-1-PE40KDEL DNAワクチングループのマウスの生存時間は最長であり、生存時間の中央値は、51日であった。B7-2-PE40KDEL DNAワクチンおよびB7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ、空のベクターグループ、CsA+MTXグループ、および未処置グループの生存時間の中央値は、それぞれ41、47、22.5、39.7、および21.5日であった。すべてのグループのマウスの生存率は、Kaplan-Meier生存曲線において描かれた(図24)。
移植後21日目に、雄ドナーマウスの特異的Y-染色体sry遺伝子が、すべての処置グループのマウスの末梢血から検出可能であり(図25)、すべてのグループにおいて移植が成功したことを示唆した。
1. 材料および方法
1.1 実験動物
ドナー雄マウスC57BL/6(H2b)およびレシピエント雌マウスBalb/c(H2d)は、特定の病原体フリーの環境に収容され、実験開始時には体重は16-18gおよび18-22gであった。すべての実験動物は、Animal Center of the Academy of Military Medical Sciencesから提供され、飼育条件は特定の病原体フリー(SPF)のレベルであった。
真核生物発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40KDELが、我々の部門において構築され保存された。真核生物発現ベクターは、第1部で述べたとおりに構築され保存された。注射用のMTXはJiangsu Hengrui Medicine Co., Ltdから購入された。シクロスポリンAはNovartis Pharma Schweiz AG.から購入された。FITC-抗マウスCD3抗体、PE-抗マウスCD28抗体、PE-Cy5-抗マウスCD8抗体、PE-Cy5-抗マウスCD4抗体、PE-抗マウスCD4抗体、およびPE-抗マウスCD25抗体は、すべてBD Incから購入された。Fluorokine MAPマウスインターフェロン(IFN)γ、インターロイキン(IL)-2、IL-4、IL-10、IL-12、腫瘍壊死因子(TNF)αキット、およびサイトカイン検出のためのLuminex液体チップ(liquid chips)は、R&D Incにより提供された。腫瘍成長因子(TGF)βおよびIL-2 ELISAキットは、R&D Incにより提供された。
レシピエントマウスには、感染を防ぐために、移植の一週間前にゲンタマイシン(32×104U/L)およびエリスロマイシン(250mg/L)を含む飲料水が与えられ、滅菌されたクリーンベンチ(laminar airflow cabinet)内で飼育された。60Coの全身照射(TBI)(8.0Gy、線量率は1.8Gy/分)が、移植の4時間前に施された。
B7-PE40KDEL DNAワクチンおよび他の処置処置の保護プロトコルは以下のとおりであった:薬剤は、すべてのグループのマウスに、移植後1日目に投与された。各グループがマウス5匹からなる6グループは以下のとおりであった:(1)B7-1-PE40KDEL DNAワクチングループ;(2)B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ;(3)B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL DNAワクチングループ;(4)空のベクターグループ;(5)CsA+MTXコントロールグループ;(6)未処置のaGVHDグループ;および(7)標準コントロールグループ。空のベクターおよびDNAワクチンベクターの双方は、生理食塩水に溶解された。プラスミドベクターのRNAのコンタミネーションはなかった。内毒素が除去された。超螺旋性DNAがDNAの70%-80%を占めていた。OD260/OD280率は1.8-2.0の範囲であった。濃度は0.5μg/μlを下回らなかった。移植後ただちに、75μgの空のベクターまたはDNAワクチンベクターが、マウスの四頭筋に注射され、注射部位に電気パルス仲介刺激が与えられた。パルスのパラメーターは以下のとおりである:電圧、200V/cm;パルス幅、10ms;パルス数、6;周波数、1Hz。「金基準」であるCsA+MTX養生法は、臨床診療ではよく用いられているが、コントロール薬物として採用された。CsAは、腹腔内注射により1日1回1.5mg/kg.dの用量で投与された。MTXは、腹腔内注射により、1、3、6および11日に0.4mg/kg.dの用量で投与された。
移植後、7、14および21日後に、マウスの眼窩下の静脈叢から血液が吸引された。血清が遠心処理により分離された後、以下の工程が実施された。各サンプルは繰り返し検査された。
20ミリリットルの洗浄バッファ濃縮駅は500mlの洗浄バッファに希釈された;
サンプルは4倍に希釈された:37.5μlのRD6-40+12.5μlのサンプル;
標準サンプルの希釈:標準サンプルは0.9mlのRD6-40により標準カクテルに希釈され、さらに種々の濃度に希釈された;
ミクロスフィアの希釈:50μlのミクロスフィア濃縮液→5mlのミクロスフェア希釈液;
ビオチン抗体の希釈:50μlのビオチン抗体濃縮液→5mlのビオチン抗体希釈液;
スレプトアビジンPEの希釈:55μlのストレプトアビジン濃縮液→5.5mlの洗浄バッファ。
適合するマウスTGFβLuminexキットおよびELISAキットが存在しないため、我々は、ヒトTGF-βとマウスTGF-βが高い相同性を有するという事実を考慮して、ヒトTGF-βELISAキットを代替試薬として用いた。血清IL-2濃度を決定することは困難である。しかし、T細胞が活性化するとIL-2はその受容体に(α、β、およびγサブユニットに)結合し、αサブユニットは細胞表面から脱落し、血清中で検出可能となり、可溶性IL-2受容体(sIL-2R)と呼ばれる。したがって、ELISAキットはマウスにおけるsIL-2Rの再検出に使用できる。
1)室温に予備的に平衡させた後、必要とされるプレートは密閉バッグから取り出された。
CurveExpert 1.3ソフトウェアが、標準曲線を描くために用いられた。標準曲線のグラフを描く際に、標準サンプルの濃度が横座標として用いられ、OD値が縦座標として用いられた。サンプルの濃度はそのOD値を用い標準曲線上で決定することができる。サンプルのOD値が標準曲線の上限よりも高いときは、サンプルは再測定のために適切に希釈される。希釈倍率はその後サンプル濃度を算出する間に増大される。
移植から2週間後、末梢血が吸引されヘパリンナトリウムで処理された。その後、FITC-抗マウスCD3抗体、PE-抗マウスCD28抗体、PE-Cy5-抗マウスCD8抗体、PE-Cy5-抗マウスCD4抗体、PE-抗マウスCD4抗体、およびPE-抗マウスCD25モノクローナル抗体が添加された。CD4+/CD8+およびCD3+CD8+C28-抑制性T細胞亜集団(Ts細胞)およびCD4+CD25+制御性T細胞亜集団(Treg細胞)における変化を検出するために、フローサイトメトリー解析が行われた。方法は以下のとおりであった:
1)1μgの対応する蛍光ラベル抗体が100μlの抗凝固性の血液に添加された後、サンプルは室温、暗所で30分間インキュベートされた。
データはχ+sとして表現され、SPSS 13.0ソフトウェアが統計的解析に用いられた。ANOVAおよびDunnettのt-検定が、グループ間に等分散性がみられた場合の比較に用いられた。P<0.05のときに統計的に有意であると考えられる。ノンパラメトリック解析が、分散の不均一性が見られた場合に用いられた。
2.1 B7-1-PE40KDEL DNAワクチンによる処置後のaGVHDマウスにおける血清サイトカインの変化
移植後7、14および21日目に、Luminex液体チップおよびELISA法が、すべての実験グループのマウスにおける血清サイトカインの変化を検出するために用いられた。結果は、表1に示されている。結果は、aGVHDマウスの中では、標準コントロールグループと比較して、Th1サイトカインの中で、IFNγ、IL-2およびTNFαが有意に高く(P<0.01)、特に発病の開始の初期の段階から移植後7日の期間に高いことが明らかとなった。移植後14日までに、IFNγレベルは徐々に減少し、21日までには、IFNγは通常のレベルに復帰した。対照的にIL-2およびTNFα、すなわちTh1サイトカインのうちの2つ、のレベルは、通常よりも高いまま維持された。IL-4(Th2サイトカイン)およびTGF-β(Th3サイトカイン)のレベルの変化については、実験グループと標準コントロールグループとの間で統計的な相違は見られなかった。驚くべきことに、7および14日目のaGVHDマウスおけるIL-10(Th2サイトカイン)のレベルが、標準コントロールグループと比較して有意に高かった。利用可能な検出方法の感度のため、IL-12を検出することは困難であった。
移植の2週間後、3種のT細胞亜集団(すなわちCD4+/CD8+、CD4+CD25+TregおよびCD8+C28-Ts亜集団)を検出するために、フローサイトメトリー解析が行われた。結果および代表写真が図26-31および表6に示されている。
Claims (11)
- 外毒素融合蛋白B7-1-PE40KDELをコードする遺伝子であって、該遺伝子のヌクレオチド配列が以下の配列である遺伝子。
(1)配列番号:1または配列番号:2に示される配列、
(2)配列番号:1または配列番号:2に示される配列によりコードされる蛋白と同一の蛋白をコードする配列であって、そのヌクレオチド配列は、配列番号:1または配列番号:2に示される配列とは、コドンの縮重により相違している配列、
(3)配列番号:1または配列番号:2に示される配列と厳格なハイブリダイズ条件下でハイブリダイズする配列であって、該配列によりコードされる蛋白が配列番号:1または配列番号:2によりコードされる蛋白と同一または類似の機能を有する配列、または
(4)配列番号:1または配列番号:2に示される配列と、75%を超える、または好ましくは85%を超える同一性を有する配列。 - 請求項1記載の遺伝子によりコードされる外毒素融合蛋白。
- 請求項1記載の遺伝子に機能的に結合された組み換え発現ベクターであって、該発現ベクターは真核生物発現ベクターまたは原核生物発現ベクターから選択され、好ましくは、該遺伝子は、pcDNA3.1/Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLおよびアデノウイルスから選択される発現ベクターのいずれかに機能的に結合している組み換え発現ベクター。
- 請求項3記載の組み換え発現ベクターであって、請求項1記載の遺伝子およびpcDNA3.1/Zeo(+)ベクターとからなる組み換え発現ベクター。
- 請求項1記載の遺伝子、請求項2記載の外毒素融合蛋白、あるいは請求項3または4記載の組み換え発現ベクターを含む組成物。
- 請求項1記載の遺伝子、請求項2記載の外毒素融合蛋白、あるいは請求項3または4記載の組み換え発現ベクター、および医薬的に許容可能なアジュバントを含むワクチン。
- 請求項3または4記載の組み換え発現ベクター、および医薬的に許容可能な免疫アジュバントを含むDNAワクチン。
- 請求項5記載の組成物、請求項6記載のワクチン、または請求項7記載のDNAワクチンの配合物であって、静脈注射、動脈注射、筋肉内注射、皮下注射、臓器注射、胸膜腔内注射および腹腔内注射による投与に適した形態で製造される配合物。
- 請求項5記載の組成物、請求項6記載のワクチン、または請求項7記載のDNAワクチンであって、水溶液または水で戻す凍結乾燥粉末の形態で配合され、注射または粘膜を介した投与法により使用可能なもの。
- 同種異系組織および/または臓器の移植の拒絶反応を治療または予防する方法であって、請求項5記載の組成物、請求項6記載のワクチン、または請求項7記載のDNAワクチンを、それを必要とする患者に有効量投与することを含む方法。
- 請求項5記載の組成物、請求項6記載のワクチン、または請求項7記載のDNAワクチンの使用であって、同種異系組織及び/または臓器の移植の拒絶反応を治療または予防するための医薬の製造における使用。
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