CN1498902A

CN1498902A - 一种新型免疫抑制融合蛋白、其编码核酸及其用途

Info

Publication number: CN1498902A
Application number: CNA021492158A
Authority: CN
Inventors: 奚永志; 袁志宏; 张惠丽; 关海容; 孔繁华
Original assignee: Affiliated Hospital of Academy of AMMS
Current assignee: Affiliated Hospital of Academy of AMMS
Priority date: 2002-11-06
Filing date: 2002-11-06
Publication date: 2004-05-26
Anticipated expiration: 2022-11-06
Also published as: CN1274717C

Abstract

本发明涉及一种新型免疫抑制融合蛋白、其编码核酸及其用途。

Description

一种新型免疫抑制融合蛋白、其编码核酸及其用途

发明领域

本发明属于分子生物学、免疫学和药物设计学领域。更具体地说，本发明涉及一种新型免疫抑制融合蛋白、其编码核酸及其用途。

背景技术

异体造血干细胞移植(HSCT)及实体脏器器官移植已经成为迄今为止医治各种恶性血液病、遗传性疾病、重度放射病以及重症联合免疫缺陷等顽症和各种脏器功能衰竭的最有效方法之一。由于供-受者间组织相容复合体(MHC)的差异(当然还有其它诸多未知因素)，不可避免的要发生移植物抗宿主病(GVHD或GVHR)和宿主抗移植物反应(HVGD)，这是导致异体HSCT和器官移植失败最重要的原因之一。因此，GVHD和HVGD已成为临床上异体HSCT和器官移植面临的最大障碍。然而，目前已研制并使用的多种预防和控制GVHD和HVGD的免疫抑制联合措施存在的最大缺陷就是，靶向特异性差、全身性毒副作用大、免疫耐受期短。因此，迫切需要能改善或克服上述免疫抑制方法存在的弊端，创造出新一代能特异的防治或减弱GVHD和HVGD的措施。

目前公认，在众多参与移植排斥反应的细胞因素中，CD4+、CD8+T细胞处于中枢地位，它从激活到发挥生物效应需经三个阶段。对这三个阶段分别进行的体外阻断实验发现，第一、二阶段的阻断只起到了免疫抑制作用，而阻断第三阶段B7：CD28/CTLA4共刺激信号系统(简称B7：CD28/CTLA4)，T细胞就产生了免疫无能(anergy)。例如在初级免疫应答中，无论使用抗CD28Fab还是CTLA4-Ig阻断B7：CD28/CTLA4共刺激信号系统均能显著地抑制次级免疫应答。更重要的是，在初级免疫应答中只有在B7分子的参与下才能发生次级免疫应答，说明B7：CD28/CTLA4系统无论是在介导初级免疫应答还是次级免疫应答中都起到决定性作用。

更令研究者惊喜的突破性进展是，利用鼠体内模型可完全证明上述体外实验的发现，即当体内阻断了B7：CD28/CTLA4系统后则能导致免疫耐受，不但可使受体鼠长期耐受同种鼠的移植物，而且能长期耐受异种甚或人类抗原。如将人的胰岛细胞移植到人工诱发糖尿病小鼠的肾小囊下并用新型重组CTLA4-Ig进行治疗，结果发现治疗组移植的人胰岛细胞不仅功能正常，而且未出现移植排斥的任何组织学证据；再取原供者人的胰岛细胞移植给这些小鼠，CTLA4-Ig治疗组移植物存活时间明显延长，而Ig对照组则不能。提示CTLA4-Ig在体内能引起宿主对移植物的特异性耐受。随后的异种鼠心脏移植和MHC不匹配动物间的骨髓移植实验均加证实，在特定环境下，CTLA4-Ig可有效地延长移植物的存活时间，而不需要其它免疫抑制剂的参与，并且CTLA4-Ig治疗还不影响造血功能的重建。1999年美国Harvard大学的科学家在国际上首次报道，应用重组CTLA4-Ig阻断B7：CD28/CTLA4系统防治患者造血细胞移植后的GVHD取得显著疗效(Guinan等人，N.Engl.J.Med.1999，340：1704-1714)，从而为这一策略的更深入研究尤其是临床应用奠定了坚实的基础。因此，B7：CD28/CTLA4系统无论是对于诱导免疫耐受还是在防治GVHD方面最为关键，正成为当今异体造血干细胞移植、移植免疫、器官移植和相关新型免疫抑制剂创新性开发研究领域最为关注的焦点。

然而，纵观目前国际上探索B7：CD28/CTLA4系统防治GVHD或诱导免疫耐受的研究手段，采用的均是以抗B7单抗/多抗抑或CTLA4-Ig来进行封闭或阻断。其缺陷在于：第一，无论是抗B7单抗/多抗抑或CTLA4-Ig的封闭或阻断，诱导的免疫耐受期限太短；第二，仅仅封闭B7：CD28/CTLA-4系统所诱导的T细胞免疫耐受可被移植后感染等因素所引起释放的IL-2及其它细胞因子所逆转，导致移植失败；第三，封闭或阻断时所用的抗B7单抗/多抗均为鼠源性，毒副作用大。因此，仍然需要新的免疫抑制剂，以便更为有效地抑制免疫排斥，治疗自身免疫疾病。

本发明的一个目的在于提供一种融合蛋白，其中含有免疫配基或其功能性片段或衍生物与毒素蛋白的融合体，能够特异性靶向淋巴细胞，从而选择性杀伤参与移植排斥或自身免疫疾病的淋巴细胞。

发明简述、

在本领域中众所周知，受体与其相应配基之间具有很高的结合特异性。发明人利用这一特异性来靶向性导入能够杀伤淋巴细胞的毒素蛋白，在选择性阻断免疫系统激活途径的同时还杀死相关淋巴细胞，从而达到特异性防治GVHD及诱导免疫耐受的效果。

本发明一方面提供了一种融合蛋白，其中包含免疫配基与毒素蛋白的融合体。

本发明另一方面提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸。

本发明还提供了含有所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体、宿主细胞。

本发明还提供了所述融合蛋白的生产方法及其用途。

附图说明

图1为B7-2和B7-1胞外区cDNA片段PCR扩增产物的电泳图。M为DL2000PCR分子量标志，泳道1为B7-1 cDNA胞外区扩增产物；泳道2为B7-2 cDNA胞外区扩增产物。

图2为pRSET-B7-2-PE40KDEL重组质粒的结构示意图。

图3为含pRSET-B7-2-PE40KDEL重组质粒的宿主细胞BL-21-CodonPlus-RIL的全细胞裂解产物SDS-PAGE电泳结果。M1为蛋白质分子量标记。泳道1为未诱导的全细胞裂解产物，泳道2和3为诱导的全细胞裂解产物。

图4为表达菌体BL21(DE3)pLysS/pRSETA-B7-2-DE40KDEL融合蛋白含量扫描结果。

图5为pRSETA-B7-2-DE40KDEL重组载体表达情况的Western印迹分析。M2为蛋白质分子量标记；泳道4为未诱导的全细胞裂解产物；泳道5和6为诱导的全细胞裂解产物。

图6为重组融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL对Jurkat和Raji细胞系的细胞毒杀伤活性图。

序列说明

SEQ ID NO：1和3分别为重组免疫抑制融合体B7-2-PE40KDEL的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2和4为重组免疫抑制融合体B7-1-PE40KDEL的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5为正向引物PF7-2A的序列。

SEQ ID NO：6为反向引物PR7-2A的序列。

SEQ ID NO：7为正向引物PF7-1A的序列。

SEQ ID NO：8为反向引物PR7-1A的序列。

SEQ ID NO：9和11分别为B7-2胞外区的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10和12分别为B7-1胞外区的核苷酸序列及相应的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13为正向引物PF7-2B的序列。

SEQ ID NO：14为反向引物PR7-2B的序列。

SEQ ID NO：15为正向引物PF7-1B的序列。

SEQ ID NO：16为反向引物PR7-1B的序列。

SEQ ID NO：17为正向引物PF-PEA的序列。

SEQ ID NO：18为反向引物PR-PEA的序列。

SEQ ID NO：19为反向引物PR-PEB的序列。

发明详述

本发明涉及一种融合蛋白，其中包含免疫配基与毒素蛋白的融合体。

在本发明中，术语“免疫配基”是指能与淋巴细胞，如T淋巴细胞上的细胞受体相结合，参与免疫反应途径如第二信号系统激活的分子，包括天然配基或者其变体、衍生物或部分，它们基本上保留了与相应细胞受体相结合的能力。

在一个实施方案中，所述免疫配基的相应受体存在于部分或全部淋巴细胞上。更优选地，所述配基是B7例如B7-1、B7-2、B7-3、BB1或CD40L等。进一步地，所述配基是B7，其能够与细胞受体CD28相结合。

任选地，所述配基是B7-1。同样优选地，所述配基是B7-2。其可以来源于哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠等。

本发明融合蛋白质中的免疫配基可以是全长蛋白，或者是其片段、衍生物或变体等，它们基本上保留了所希望的目的活性，在此处是指与相应受体相结合的活性。在一个实施方案中，融合蛋白中的免疫配基是包含其胞外结构域的片段。

衍生物可以是下列各种多肽：(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代，或(ii)其中另外的氨基酸与之相融合，如前导序列或分泌序列或用于纯化多肽的序列或蛋白原序列。鉴于本文的教导，本领域技术人员不难掌握这种片段和衍生物。

本领域技术人员应当认识到，免疫配基多肽的一些氨基酸序列可以改变，而不会显著影响蛋白质的结构或功能。如果分析序列中的这种差异，应能记得蛋白质中存在决定活性的至关重要的区域。一般而言，可以取代形成三级结构的残基，只要使用行使类似功能的残基即可。在其它场合下，如果变化发生在蛋白质的非重要区域，那么残基的类型有可能完全不重要。

因此，本发明另外包括基本上表现出能够与相应细胞受体结合的免疫配基的各种变异体和片段。这种变异体包括缺失、插入、倒位、重复和类型取代(如原则是用一种亲水的残基取代另一种亲水的残基，而不是用强亲水的残基取代强疏水的残基)。小的变化或这种“中性的”氨基酸取代一般对活性影响很小。

下文所示的是本领域技术人员熟知的保守氨基酸取代的例子：

芳香族：苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸

疏水的：亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸

极性的：谷氨酰胺，天冬酰胺

碱性的：精氨酸，赖氨酸，组氨酸

酸性的：天冬氨酸，谷氨酸

小的：丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸

用于本发明的毒素蛋白可以是植物毒素如蓖麻毒素、植物凝集素、相思豆毒蛋白或者细菌毒素等对细胞具有杀伤能力的蛋白质，细菌毒素的实例包括但不限于白喉毒素、志贺氏毒素、假单胞菌外毒素如绿脓杆菌外毒素等。

在本发明上下文中，术语“毒素蛋白”不仅包括天然蛋白，也包括其变体、衍生物和片段等，它们具有与亲本蛋白基本相同的杀细胞活性。有关“变体”、“衍生物”、“片段”的定义参见关于“免疫配基”的内容。

在本发明的融合蛋白中，免疫配基可以直接和毒素蛋白相连接。优选地，它们通过包含一或多个氨基酸的连接肽相连。该连接肽可以具有1-100个氨基酸，优选具有1-50、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸。进一步优选地，所述连接肽是(Gly₄Ser)₄。

本发明的融合蛋白可以经基因工程生产，也可以化学合成。或者，本发明的融合蛋白中，可以有一个或多个氨基酸残基包含取代基。另外，本发明的融合蛋白还可以与另外的化合物，如提高多肽半寿期的化合物(如聚乙二醇)相连接。这些衍生物均包括在本发明范围内。

多核苷酸

本发明也包括编码所述融合蛋白的多核苷酸，其中编码序列可以在相同的阅读框中与有助于宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸序列(例如作为分泌序列行使功能以控制从细胞中转运出多肽的前导序列)融合。

本发明的多核苷酸也可以具有在框内与一种标记序列融合的编码序列，所述标记序列可用于纯化本发明的多肽。在宿主为细菌的情况下，该标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记物以纯化与标记序列融合的成熟多肽，或例如，当使用哺乳动物宿主，如COS-7细胞时，标记序列也可以是血凝素(HA)标记物。HA标记物相当于得自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson，I等，细胞，37：767(1984))。

载体和宿主细胞

本发明也涉及包括编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的载体，用重组载体进行基因工程改造的宿主细胞，和通过重组技术生产融合蛋白的方法。

用本发明的载体对宿主细胞进行基因工程改造(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体的形式可以是例如质粒，病毒颗粒，噬菌体等等。

通过重组技术可将本发明的多核苷酸用于生产多肽，因此，例如，所述多核苷酸可包含在多种表达载体中的任一种中以表达多肽。这种载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒和假狂犬病病毒)之联合的载体。然而，只要能在宿主中复制和存活，任何其它的载体都可使用。

表达载体中的DNA序列与适当的表达控制序列(启动子)有效地相连以介导其合成。至于这种启动子的代表性例子，应提及的有：LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp，噬菌体λP_L启动子和已知能控制原核细胞或真核细胞或它们的病毒中的基因表达的其它启动子。表达载体也含有用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体也包括用于增强表达的适当序列。

另外，表达载体优选含有一个或多个选择性标记基因以提供可用于选择已转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。

可使用含有上文所述适当的DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体来转化适当的宿主以使宿主表达蛋白质。

至于适当宿主的代表性例子，应提及的有：细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和Spodoptera Sf9；动物细胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤细胞；腺病毒；植物细胞等。根据本文的教导，本领域技术人员应能掌握如何选择适当的宿主。

使用衍生自本发明DNA构建体的RNA，也可利用无细胞的翻译系统来产生这种蛋白质。可在原核和真核宿主中使用的适当的克隆和表达载体描述于Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约(1989)，该文献已列入本文作为参考。

通过在载体中插入增强子序列可增加高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是对启动子起作用以增加其转录的顺式作用的DNA元件，例子包括巨细胞病毒早期启动子增强子和腺病毒增强子等。

为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔、外周质空间或胞外环境中，可将适当的分泌信号掺入被表达的多肽中。

多肽可以经修饰的形式被表达。多肽不仅可包括分泌信号，也可包括其它的异源功能区域。例如，可在多肽的N-末端加上另外的氨基酸区域，尤其是带电的氨基酸以改善多肽在宿主细胞中、纯化过程中或随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。也可以在多肽中加入肽组成成分以便于纯化，最终制备多肽之前可除去这类区域。本领域技术人员熟知在多肽中加入肽组成成分以引发分泌或外泌，改善稳定性和便于纯化等等，这是本领域内的常规技术。

转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至适当的细胞密度之后，通过适当的方式(如温度变化或化学诱导)诱导选定的启动子，并将细胞再培养一段时间。

一般通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎细胞，保留所得的粗提取物以进一步纯化。

通过包括冷冻-融化循环，超声处理，机械破碎，或使用细胞裂解剂等在内的任何便利方法可破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，这些方法是本领域技术人员所熟知的。

可使用多种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白，哺乳动物表达系统的例子包括Gluzman，细胞，23：175(1981)所述的猴肾成纤维细胞COS-7系，以及能表达可容性载体的其它细胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可含有复制起点，合适的启动子和增强子，和任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’侧翼的非转录序列。可使用得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列提供所需的非转录的遗传元件。

通过包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阳离子或阴离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和凝集素层析等的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明融合蛋白。最后，可使用高效液相层析(HPLC)完成最终的纯化步骤。

本发明的多肽可以是化学合成方法的产物，或由原核或真核宿主(如培养中的细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)通过重组技术产生。取决于重组生产方法中所用的宿主，本发明的融合蛋白可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的融合蛋白也可以包括起始甲硫氨酸残基。

本发明的融合蛋白或多核苷酸可用于抑制过度的或不必要的免疫反应。在一个实施方案中，所述过度的或不必要的免疫反应是移植物抗宿主排斥或宿主抗移植物排斥。在另一个实施方案中，所述免疫反应是自身免疫性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、红斑狼疮、牛皮癣、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病等。

药物组合物

可将本发明的多肽与适当的药用载体联合使用以制成药物组合物。这种组合物含有治疗有效量的本发明融合蛋白和药学可接受的载体或赋形剂。所述载体包括但不限于盐水，缓冲盐溶液，葡聚糖，水，甘油，乙醇及其联合。制剂应适合施用的模式。

本发明的融合蛋白可在药物组合物中与一种或多种药学可接受的赋形剂联合施用。应理解当施用于人患者时，护理医生在正确的医学判断范围内可决定本发明药物组合物每天的总用量。任何具体患者的特定治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括欲达到的反应的类型和程度，所用其它药剂的特殊组合(如果有的话)；患者的年龄，体重，健康状况，性别和饮食；施用的时间，施用的途径和组合物外泌的速率；治疗的期限；与特定组合物联合或同时使用的药物(如化学治疗剂)；和医学领域众所周知的其它因素。本领域已知的适当制剂见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。

考虑到各个患者的临床条件、释放的位点、施用的方法、施用的计划和实际操作人员已知的其它因素，以与良好的医学实践一致的方式配制和服用治疗所用的融合蛋白组合物。因此，通过上述考虑可确定用于本文目的的“有效量”的融合蛋白。

可以简便的方式，如局部，静脉内，腹膜内，肌内，动脉内，皮下，鼻内或皮内途径施用所述药物组合物。所施用药物组合物的量应能有效地治疗和/或预防过度的或不必要的免疫反应。

本发明的融合蛋白也可通过在体内表达而得以应用，这就是常说的“基因疗法”。

因此，例如，可离体用编码本发明融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)对来自患者的细胞进行改造，然后将经改造的细胞提供给需用该融合蛋白治疗的患者。这种方法是本领域所熟知的方法。例如，可以通过本领域熟知的方法，利用含有编码本发明融合蛋白之RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行改造。

类似地，可通过例如本领域熟知的方法，在体内改造细胞以在体内表达融合蛋白。本领域中已知，可给患者施用能产生含有编码本发明融合蛋白之RNA的逆转录病毒颗粒的生产者细胞以在体内改造细胞并在体内表达多肽。鉴于本发明的教导，本领域技术人员可轻易地掌握用来施用本发明融合蛋白的这些和其它方法。例如，用于改造细胞的表达载体不仅可以是逆转录病毒，也可以是腺病毒，所述腺病毒与适当的传递载体联合后可用于在体内改造细胞。其它传递载体的例子包括基于HSV的载体系统，腺相关病毒载体，和惰性的载体，如包被有葡聚糖的铁颗粒。

可从中得到上文所述的逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒，脾坏死病毒，如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemiavirus)，人免疫缺损病毒，腺病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒，和乳癌病毒。在一个实施方案中，逆转录病毒质粒载体得自Moloney鼠白血病病毒。

载体包括一个或多个启动子，可以使用的适当的启动子包括但不限于逆转录病毒的LTR；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller等，生物技术，第7卷，9：980-990(1989))或任何其它的启动子(例如细胞启动子，如包括但不限于组蛋白，polIII和β-肌动蛋白启动子等的真核细胞启动子)。可使用的其它病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子，胸苷激酶(TK)启动子，和B19细小病毒启动子。鉴于本文的教导，合适启动子的选择对于本领域技术人员而言是显而易见的。

编码本发明融合蛋白的核酸序列受适当启动子的控制。可使用的适当启动子包括但不限于腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克蛋白启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR(包括上文所述的经修饰的逆转录病毒LTR)；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子也可以是天然启动子。

可使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产者细胞系。可被转染的包装细胞系的例子包括但不限于PE501，PA317，Ψ-2，Ψ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，ΨCRE，ΨCRIP，GP+E-86，GP+envAm12和Miller，人基因疗法，1：5-14(1990)(全文列入本文作为参考文献)中所述的细胞系。载体可通过本领域已知的任何方法转导包装细胞。所述方法包括但不限于电穿孔，脂质体的应用，和CaPO₄沉淀。或者也可将逆转录病毒质粒载体包裹在脂质体中，或与脂类偶联，然后施用于宿主。

生产者细胞系产生含有编码本发明融合蛋白之核酸序列的感染性逆转录病毒载体颗粒。然后可使用这种逆转录病毒载体颗粒在体内或体外转导真核细胞。经转导的真核细胞会表达编码本发明融合蛋白的核酸序列。

制备方法

本发明还涉及制备本发明融合蛋白的方法，该方法包括(a)在有利于所述融合蛋白产生的条件下培养宿主细胞；和(b)回收该融合蛋白。

在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在适合多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。

可以用本领域已知方法回收所产生的多肽。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。

可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述多融合蛋白，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如，蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

下文以举例说明的方式进一步阐述本发明，但并不意味着对本发明的限制。

实施例

实施例1：B7-2胞外区cDNA的克隆

根据文献已发表B7-2和B7-1基因序列，分别设计扩增编码B7-2胞外区225aa和B7-1胞外区208aa cDNA的引物，并经GOLDKEY软件加以验证。B7-2的引物序列为：正向引物PF7-2A为5’-GCGGATCCGCTGCTCCTCTG-3’(SEQ ID NO：5)，在5’端引入BamHI位点；反向引物PR7-2A为5’-CCCGGGTTAAGGAATGTGGTCTGG-3’(SEQ ID NO：6)，在3端引入终止密码子TAA及SmaI位点。B7-1引物为：正向引物PF7-1A为5’-GCGGATCC-3’(SEQ ID NO：7)，在5’端引入BamHI位点；反向引物PR7-1A为5’-CCCGGGTTA-3’(SEQ ID NO：8)，在3’端引入终止密码子TAA及SmaI位点。引物PF7-2A与PR7-2A以及PF7-1A与PR7-1A分别扩增编码人B7-2及B7-1胞外区可变区1-225aa和1-208aa片段的cDNA，长度预计分别约为675bp和624bp。

以含B7-2₂₂₅胞外区cDNA的pGEM-T-B7-2₂₂₅(张惠丽等人，中国应用生理学杂志，2001，17(2)：117-120)或B7-1₂₀₈胞外区cDNA的pGEM-T-B7-1₂₀₈重组质粒(张惠丽等人，中国应用生理学杂志，2001，17(2)：117-120)为模板，利用引物PF7-2A与PR7-2A或者PF7-1A与PR7-1A，经常规PCR进行扩增。反应条件是94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1.5分钟，25循环后72℃延伸10分钟。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。参见图1。

将PCR扩增产物纯化后连接入pGEM-T载体(Promega公司)，转化受体菌JM109，挑取阳性重组子，分别称为pGEM-T-B7-2₂₂₅(含B7-2₂₂₅胞外区)及pGEM-T-B7-1₂₀₈重组质粒载体(含B7-1₂₀₈胞外区)，对其中的插入片段进行序列测定。

结果显示B7-2胞外区序列(SEQ ID NO：9)除个别碱基发生改变外绝大部分与GenBank序列相一致，而B7-1胞外区序列(SEQ ID NO：11)与GenBank序列完全一致。其相应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：10和12。

实施例2：新型重组免疫抑制毒素融合蛋白B7-PE40KDEL表达载体的构建

根据B7-2₂₂₅、B7-1₂₀₈和PE40靶基因序列，设计能扩增B7-2₂₂₅、B7-1₂₀₈和PE40的正、反向引物PF7-2B和PR7-2B、PF7-1B和PR7-1B以及PF-PEA和PR-PEA。为了进行融合构建，使B7-2₂₂₅、B7-1₂₀₈与PE40KDEL基因间以柔性接头(Gly₄Ser)₄相连接；在此基础上，又设计了反向引物PR-PEB，PR-PEB与PR-PEA的不同之处是可使其5′的REDLK被置换为KDEL，并且在引物PF7-2B和PF7-1B中引入EcoRI和MunI酶切位点，在引物PF-PEA中包含一段引物PR7-2B和PR7-1B的重复序列，在引物PR-PEA中引入SmaI酶切位点及连接肽[(Gly₄Ser)₄]编码序列。详见表1。

表1.构建含编码B7-PE40KDEL融合基因的引物序列

Table 1 Sequence of oligonucleotides for B7-PE40KDEL amplification

B7-2₂₂₅：

PF7-2B 5’-GCT GCT CCT CTG AAG ATT CAA G-3’(SEQ ID NO：13)

PR7-2B 5’-CGA CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC GCT TCC ACC

GCC TCC AGA TCC GCC GCC ACC AGG AAT GTG GTC TGG 3’(SEQ ID NO：14)

B7-1₂₀₈

PF7-1B 5’-CGCGAATTCATG GTTATCCACGTGACC-3’(SEQ ID NO：15)

PR7-1B 5’-CGA CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC GCT TCC ACC GCC TCC AGA TCC GCC GCC ACC

GTT ATC AGG AAA ATG CTC TTG C-3’(SEQ ID NO：16)

PE40：

PF-PEA 5’-TCG GGC GGT GGT GGG TCG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG A-3’(SEQ ID NO：17)

PR-PEA 5’-TCC CCC GGG GGA TTA CTT CAG GTC CTC GCG CGG CGG TTT G-3’(SEQ ID NO：18)

将PE40REDLK定点突变成→PE40KDEL：

PR-PEB 5’-TCC CCC GGG GGA TTA CAG CTC GTC CTT CGG CGG TTT GCC GGG CTG GCT-3’(SEQ ID NO：19)

分别以含B7-1₂₀₈或B7-2₂₂₅胞外区的pGEM-T-B7-2₂₂₅或pGEM-T-B7-1₂₀₈重组质粒载体为模板，并联合含绿脓杆菌外毒素PE40基因的重组质粒载体pZX-PEA(郑黎燕等人，中华微生物学和免疫学杂志，2001，21(1)：95-98)，利用引物PF7-2B和PR7-2B、PF7-1B和PR7-1B以及PF-PEA和PR-PEA，通过重叠延伸-PCR(SOE-PCR)策略来构建所期望的B7-PE40KDEL融合基因。这需进行四次PCR反应。

第一次PCR反应是以质粒pGEMT-B7-2为模板，以PF7-2B和PR7-2B为正、反向引物，所扩增的B7-2 cDNA为在其N端缺失16aa的完整胞外区，其长度片段为675bp，并使其5’端带有接头。

第二次PCR反应是以质粒pZX-PEA为模板，以PF-PEA和PR-PEA为正、反向引物，使所扩增的PE40 DNA为删除细胞结合功能区Ia但包含完整功能II、III区及Ib区的毒素基因，其长度片段为1083bp，并使其3’端带有接头。须指出的是，由于PE40基因GC含量较高，基因扩增过程中反应体系需加入一定浓度的二甲基亚砜或甘油，方能使扩增产物特异性极高。100ul体积PCR反应体系中包含：100ng DNA模板、10×反应缓冲液、上、下游引物各10pmol、10mmol/l dNTP 10ul、25mmol/l MgSO46ul、二甲基亚砜10ul、Taq DNA聚合酶2U、双蒸水补足体积100ul。PCR反应条件为：98℃3min，循环参数：94℃1min、55℃1min、72℃1.5min、25循环后、72℃延伸10min。

在第三次PCR反应中，以PF7-2B、PR-PEA为上、下游引物，以前两次的PCR产物为模板，扩增构建成B7-2-PE40融合基因。

最后进行第四次PCR反应，其中以PF7-2B、PR-PEB为正、反向引物，以B7-2-PE40融合基因为模板，使PE40功能III区羧基端最后5个氨基酸REDLK被定点置换成内质网蛋白滞留序列KDEL，PCR反应产物回收后进行EcoRI/SmaI双酶切插入pGEM-T载体，最终获得的B7-2-PE40KDEL目的基因片段长度为1.8kb。B7-1-PE40KDEL的构建亦采取上述相同策略，PCR反应产物回收后MunI/SmaI双酶切亦可切下约1.8kb片段长度的基因。

将上述构建好的B7-1-PE40KDEL及B7-2-PE40KDEL系列融合基因PCR扩增产物纯化后连接入pGEM-T载体(Promega公司)，转化受体菌JM109，挑取阳性重组子，分别称为pGEM-T-B7-1-PE40KDEL及pGEM-T-B7-2-PE40KDEL基因载体。对其中的插入片段进行序列测定，结果显示两融合基因除在极少数位点发生某些碱基改变外，绝大部分与文献报道完全一致，B7-2-PE40KDEL和B7-1-PE40KDEL的核苷酸序列参见SEQ ID NO：1和3，其相应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2和4。

重组毒素蛋白融合蛋白B7-2-PE40KDE的一级结构中有4个氨基酸发生了改变，其中有2个可能与二级结构的改变相关，如PE40区的二级结构改变是在PE40-II功能区启始的15个氨基酸由β片层变为α螺旋，PE40-III区的最末3个氨基酸则由β片层变为β转角。

B7-1-PE40KDEL的一级结构有3个氨基酸发生改变，二级结构中PE40-II功能区起始的15个氨基酸由β片层变为α螺旋，PE40-III功能区的最末3个氨基酸由β片层变为β转角。一级结构中的氨基酸改变，只有一个可能与二级结构的改变相关，当然也不排除柔性接头影响了二级结构的可能性。

表2.1.B7-2-PE40KDEL融合蛋白与B7-2及PE40KDEL蛋白一、二级结构比较

Table 2.1 primary and second structure comparison among B7-2-PE40KDEL recombinant fusion

protein，B7-2 and PE40KDEL

B7-2-PE40KDEL

结构一级结构二级结构

B7-2-225 16aa天冬氨酸→谷氨酸未改变

(1-225aa)

Link-20

(226-245aa)

PE40-II-112 246aa甘氨酸→丝氨酸 245-259aa

(246-357aa) 265aa苯丙氨酸→丝氨酸 15β片层→15α螺旋

PE40-Ib-35

(358-392) 284aa苯丙氨酸→丝氨酸无改变

PE40-III-215 605-607aa

(393-607) 3β片层→3β转角

表2.2.B7-1-PE40KDEL融合蛋白与B7-1及PE40KDEL蛋白一、二级结构比较

Table 2.2 primary and second structure comparison among B7-1-PE40KDEL recombinant fusion

protein，B7-1 and PE40KDEL

B7 1-PE40KDEL

结构一级结构二级结构

B7-1-208 181aa蛋氨酸→苏氨酸未改变

(1-208aa)

Link-20

(208-228aa)

PE40-II-112 229aa甘氨酸→丝氨酸 229-243aa

(229-340) 15β片层→15α螺旋

PE40-Ib-35

(341-375) 356aa丙氨酸→丝氨酸无改变

PE40-III-215

(376-590) 3β片层→3β转角

*：aa，amino acid，氨基酸；II，Ib and III are functional domains of PE40 respectively，II，Ib和III分别为PE40功能域。

实施例3：重组毒素蛋白融合基因B7-PE40KDEL的表达

分别以实施例2中构建的质粒pGEM-T-B7-2-PE40KDEL和pGEM-T-B7-1-PE40KDEL为模板，以PF7-2B或PF7-1B与PR-PEB为引物扩增目的片段。100ul体积PCR反应体系为：100ngDNA模板、10×反应缓冲液、上、下游引物各10pmol、10mmol/l dNTP 10ul、25mmol/l MgSO4 6ul、二甲基亚砜10ul、Taq DNA聚合酶2U、双蒸水补足体积100ul。 PCR反应条件为：98℃3min，循环参数：94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，25循环后，72℃延伸10min。PCR反应所扩增的B7-1-PE40KDEL DNA和B7-2-PE40KDEL长度片段分别为1842bp和1791bp。PCR反应产物回收后分别插入pGEM-T载体，BamHI/SmaI双酶切切下约1.8kb片段，将其定向插入于表达载体pRSETA(Invitrogen公司)，并转化菌株BL21(DE3)pLysS(Invitrogen公司)，获得了表达B7-2-PE40KDEL毒素蛋白融合蛋白的pRSETA-B7-2-PE40KDEL-表达载体。其示意图见图2。

将包含pRSETA-B7-2-PE40KDEL重组表达载体的宿主细胞BL21(DE3)pLysS于37℃培养至细菌生长周期对数期中期，OD600nm约为0.2-0.5后，以0.1mM IPTG于22-25℃诱导培养6-8小时。菌体裂解后进行10％SDS-PAGE分析的结果如图3所示。从图中可见，重组质粒表达了分子量约70kD的特异蛋白，与所预计B7-2-PE40KDEL的分子量大小相符。经扫描测得该融合蛋白占菌体总蛋白的20-25％，详见图4。

将诱导培养后离心所得菌体悬浮于新配制的20％蔗糖、30mmol/LTris-HCl(pH7.4)、2mmol/L EDTA的缓冲液中，冰浴10分钟。4℃ 1,000g离心10分钟，收集上清和沉淀，上清即为外周质部分，4℃贮存备用。沉淀重悬于50mmol/L Tris-HCl(pH.4)、2mmol/L EDTA溶液中，超声破碎，4℃ 12,000离心15分钟，上清主要为细胞质内可溶性表达部分。沉淀部分包括细胞膜组分和不溶性包涵体。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对外周质蛋白、细胞质蛋白及膜蛋白进行分析，以确定目的蛋白在细胞内表达的位置。结果发现，本融合蛋白几乎全部为可溶蛋白存在。以1∶500稀释的抗人B7单抗和抗PEA多克隆抗以及1∶1000碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgG作用后，用NBT/BCIP显色。这一Western-blot结果显示，表达产物能与B7-2单克隆抗体和PE40多抗发生特异反应，在70kD处出现强烈的反应带，而对照菌相应位置则没有免疫印迹条带。结果见图5。将纯化后的目的蛋白液分别制样进行10％SDS-PAGE蛋白电泳后，转移到硝酸纤维素膜上。用含10％的小牛血清/PBS/叠氮钠封闭液封闭2小时，然后加入一抗孵育1～2小时；然后用PBS洗涤三次，再用0.1mmol/LTris-HCL、0.05mol/L NaCL洗涤，尽量将磷酸盐洗净；然后用10％小牛血清、Tris-HCL，作为二抗体稀释液二抗，二抗与膜孵育1小时；随后用0.1mol/l Tris-HCL、0.15mol/l NaCL至少洗涤三次，最后用NBT/BCIP试剂盒进行显色，至适当的显色程度用蒸馏水洗去染色液终止反应。

实施例4：重组融合蛋白B7-2-PE40KDEL的纯化

按照实施例3的方法，扩大规模，将包含表达载体pRSETA-B7-2-PE40KDEL的宿主细胞BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Invitrogen公司)大量诱导表达，将培养液于4℃ 4500rpm离心20分钟，分离收集表达上清和菌体，测定上清中融合蛋白表达含量约为25％。

对于可溶性表达上清，在非变性状态下，利用Ni-NTA树脂进行亲和层析纯化。以3倍体积的平衡液平衡金属螯合层析柱，将经0.45um过滤的包涵体上清上样于Ni-NTA树脂层析柱，流速为1ml/min，4℃作用60min，使液体流出并收集，此为穿过峰(flow-through)；再以3倍体积的平衡液冲洗后，以洗涤液(50mmol/l NaH₂PO₄，300mmol/l NaCl，40mmol/l咪唑，pH8.0)冲洗至紫外吸收值不再变动；以洗脱液(50mmol/lNaH₂PO₄，300mmol/l NaCl，250mmol/l咪唑，pH8.0)洗柱并分段收集；将收集的各种成分取样进行10％SDS-PAGE及Western Blot进行分析鉴定，检测纯化的结果。

将含有目的蛋白的样品对透析液充分透析24小时以去除咪唑。MonoQ层析柱用含10％B液(50mmol/L Na2HPO4，2mM EDTA，1mol/L NaCl，pH7.2)的A溶液(50mmol/L Na2HPO4，2mM EDTA，pH7.2)平衡后，将含有目的蛋白的样品以1ml/min流速上样，再以3ml含10％B液的A液平衡层析柱后，进行线性梯度洗脱，即经20分钟B液含量由0至100％，流速是1ml/Min，收集各洗脱成分，分段收集与按峰收集相结合。10％SDS-PAGE及WesternBlot分析鉴定纯化产物。

用YM10超滤膜浓缩已经阴离子交换纯化后的目的蛋白液，上样于平衡好的Superdex 75凝胶柱，以C液(50mmol/l Na2HPO4(pH7.2)，2mmol/lEDTA，0.2mol/l NaCl)进行分离，流速0.3ml/min，收集目的蛋白，分段收集与按峰收集相结合，无峰处每1ml体积收集，峰处起每0.5ml体积收集，10％SDS-PAGE检测蛋白纯化的结果。

重组融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL蛋白含量的测定

考马斯亮蓝G-250法(Bradford法)：称取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml的95％乙醇中，加100ml 85％磷酸，加蒸馏水定容至1000ml，配成0.1mg/L的染液备用。标准蛋白溶液由BSA配制，按比例稀释标准蛋白溶液。5ml染液中加100μl蛋白溶液，摇匀，放置2-5分钟，595nm波长处测定吸收值，作标准曲线。

重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的分子量分析

通过12％SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析，进行相对迁移率计算，得到重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的相对分子量为72.628kD，与理论预测值69.561kD相比，误差在5％之内。

实施例5：重组融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL选择性细胞毒性的初步鉴定

采用MTT法，将高表达CD28的人T淋巴瘤细胞系Jurkat悬浮于含10％小牛血清的1640培养液中，调整细胞浓度为2×105/ml，加入96孔培养板中，再加入按一定比例稀释的B7-2-PE40KDEL融合蛋白纯化样品，于37℃、5％CO2培养条件下孵育48小时后，加入10ul MTT(5mg/ml)，继续培育6小时后，570nm波长测定吸光密度值计算融合蛋白的细胞毒活性。同时并以CD28阴性表达的人B淋巴白血病细胞系Raji作为阴性对照。同时采用台盼蓝染色在光镜下直接观察细胞生存状态。

MTT的结果显示，重组融合蛋白B7-2-PE40KDEL在0.2ug/ml-2ug/ml浓度范围内对Jurkat细胞有显著的杀伤效应，甚至在低至10ng/ml的剂量下对Jurkat细胞就有显著的杀伤效应，剂量达到1000ng/ml其杀伤效率可达90％。结果见图6。计算得出其ID50为0.160ug/ml。

在加入融合蛋白48-72小时后，光学显微镜下可见Jurkat细胞核皱缩，细胞失去折光性，并随浓度的增大死亡细胞明显增加，并成浓度依赖性。台盼蓝拒染结果亦证明，在所设计的浓度范围内融合蛋白能特异性地杀伤Jurkat细胞。而对CD28阴性的Raji细胞，即便是在2ug高剂量范围时均未观察到任何杀伤效应，Raji细胞生长如常。由此初步证实我们所设计构建的全新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL对CD28阳性靶细胞是具有选择性杀伤效应的。

由于95％CD4+及50％CD8+的静止T细胞表达CD28，激活后又诱导了CTLA4分子的表达。因此，本发明的新型重组B7-PE40KDEL毒素蛋白融合蛋白在体内外即能选择性杀伤参与移植排斥的绝大多数CD4+和CD8+T细胞，达到持久防治GVHD和HVGD及诱导特异性免疫耐受的目的，又使机体仍保存一定的免疫力和抗感染能力。由重组B7-PE40KDEL毒素蛋白融合蛋白诱导的免疫耐受是不易逆转的，更不受MHC相合与否的影响，还将使异种器官或组织移植成为可能。

本文所描述和要求保护的发明并不限定在所公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案意在举例说明本发明的几个方面。任何等价的实施方案均包括在本发明的范围内。事实上，除了本文所示和所述，对本发明的修改方案在参照前面的描述后对本领域内技术人员而言是显而易见的。这些修改也包含在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院附属医院

<120>一种新型免疫抑制融合蛋白、其编码核酸及其用途

<130>

<160>19

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1821

<212>DNA

<213>

<400>1

atggctgctc ctctgaagat tcaagcttat ttcaatgaga ctgcaggcct gccgtgccaa 60

tttgcaaact ctcaaaacca aagcctgagt gagctagtag tattttggca ggaccaggaa 120

aacttggttc tgaatgaggt atacttaggc aaagagaaat ttgacagtgt tcattccaag 180

tatatgggcc gcacaagttt tgattcggac agttggaccc tgagacttca caatcttcag 240

atcaaggaca agggcttgta tcaatgtatc atccatcaca aaaagcccac aggaatgatt 300

cgcatccacc agatgaattc tgaactgtca gtgcttgcta acttcagtca acctgaaata 360

gtaccaattt ctaatataac agaaaatgtg tacataaatt tgacctgctc atctatacgc 420

ggttacccag aacctaagaa gatgagtgtt ttgctaagaa ccaagaattc aactatcgag 480

tatgatggta ttatgcagaa atctcaagat aatgtcacag aactgtacga cgtttccatc 540

agcttgtctg tttcattccc tgatgttgcg agcaatatga ccatcttctg tattctggaa 600

actgacaaga cgcggctttt atcttcacct ttctctatag agcttgagga ccctcagcct 660

cccccagacc acattcctgg tggcggcgga tctggaggcg gtggaagcgg tggcggtggc 720

tcgggcggtg gtgggtcggg cggcagcctg gccgcgctga ccgcgcacca ggcttgccac 780

ctgccgctgg agacttccac ccgtcatcgc cagccgcgcg gctgggaaca actggagcag 840

tgcggctatc cggtgcagcg gctggtcgcc ctctacctgg cggcgcggct gtcgtggaac 900

caggtcgacc aggtgatccg caacgccctg gccagccccg gcagcggcgg cgacctgggc 960

gaagcgatcc gcgagcagcc ggagcaggcc cgtcttgccc tgaccctggc cgccgccgag 1020

agcgagcgct tcgtccggca gggcaccggc aacgacgagg ccggcgcggc caacgccgac 1080

gtggtgagcc tgacctgccc ggtcgccgcc ggtgaatgcg cgggcccggc ggacagcggc 1140

tacgccctgc tggagcgcaa ctatcccact ggcgcggagt tcctcggcga cggcggcgac 1200

gtcagcttca gcacccgcgg cacgcagaac tggacggtgg agcggctgct ccaggcgcac 1260

cgccaactgg aggagcgcgg ctatgtgttc gtcggctacc acggcacctt cctcgaagcg 1320

gcgcaaagca tcgtcttcgg cggggtgcgc gcgcgcaacc aggacctcga cgcgatctgg 1380

cgcggtttct atatcgccgg cgatccggcg ctggcctacg gctacgccca ggaccaggaa 1440

cccgacgcac gcggccggat ccgcaacggt gccctgctgc gggtctatgt gccgcgctcg 1500

agcctgccgg gcttctaccg caccagcctg accctggccg cgccggaggc ggcgggcgag 1560

gtcgaacggc tgatcggcca tccgctgccg ctgcgcctgg acgccatcac cggccccgag 1620

gaggaaggcg ggcgcctgga gaccattctc ggctggccgc tggccgagcg caccgtggtg 1680

attccctcgg cgatccccac cgacccgcgc aacgtcggcg gcgacctcga cccgtccagc 1740

atccccgaca aggaacaggc gatcagcgcc ctgccggact acgccagcca gcccggcaaa 1800

ccgccgaagg acgagctgta a 1821

<210>2

<211>606

<212>PRT

<213>

<400>2

Met Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Gly

1 5 10 15

Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu

20 25 30

Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr

35 40 45

Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg

50 55 60

Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln

65 70 75 80

Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro

85 90 95

Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu

100 105 110

Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu

115 120 125

Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile Arg Gly Tyr Pro Glu

130 135 140

Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu

145 150 155 160

Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr

165 170 175

Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Ser Ser Asn

180 185 190

Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His

210 215 220

Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His

245 250 255

Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg Gln Pro

260 265 270

Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu

275 280 285

Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln

290 295 300

Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly

305 310 315 320

Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu

325 330 335

Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp

340 345 350

Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val

355 360 365

Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Tyr Ala Leu Leu

370 375 380

Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp

385 390 395 400

Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu

405 410 415

Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly

420 425 430

Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly

435 440 445

Val Arg Ala Arg Asn Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr

450 455 460

Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu

465 470 475 480

Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr

485 490 495

Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu

500 505 510

Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro

515 520 525

Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly

530 535 540

Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val

545 550 555 560

Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu

565 570 575

Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro

580 585 590

Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

595 600 605

<210>3

<211>1770

<212>DNA

<213>

<400>3

atggttatcc acgtgaccaa ggaagtgaaa gaagtagcaa cgctgtcctg tggtcacaat 60

gtttctgttg aagagccggc acaaactcgc atctactggc aaaaggagaa gaaaatggtg 120

ctgactatga tgtctgggga catgaatata tggcccgagt acaagaaccg gaccatcttt 180

gatattacta ataacctctc cattgtgatc ctggctctgc gcccatctga cgagggcaca 240

tacgagtgtg ttgttctgaa gtatgaaaaa gacgctttca agcgggaaca cctggctgaa 300

gtgacgttat cagtcaaagc tgacttccct acacctagta tatctgactt tgaaattcca 360

acttctaata ttagaaggat aatttgctca acctctggag gttttccaga gcctcacctc 420

tcctggttgg aaaatggaga agaattaagt gccatcaaca caacagtttc ccaagatcct 480

gaaactgagc tctatgctgt tagcagcaaa ctggatttca atatgacaac caaccacagc 540

ttcacgtgtc tcatcaagta tggacattta agagtgaatc agaccttcaa ctggaataca 600

accaagcaag agcattttcc tgataacggt ggcggcggat ctggaggcgg tggaagcggt 660

ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgagc ggcagcctgg ccgcgctgac cgcgcaccag 720

gcttgccacc tgccgctgga gacttccacc cgtcatcgcc agccgcgcgg ctgggaacaa 780

ctggagcagt gcggctatcc ggtgcagcgg ctggtcgccc tctacctggc ggcgcggctg 840

tcgtggaacc aggtcgacca ggtgatccgc aacgccctgg ccagccccgg cagcggcggc 900

gacctgggcg aagcgatccg cgagcagccg gagcaggccc gtcttgccct gaccctggcc 960

gccgccgaga gcgagcgctt cgtccggcag ggcaccggca acgacgaggc cggcgcggcc 1020

aacgccgacg tggtgagcct gacctgcccg gtcgccgccg gtgaatgcgt gggcccggcg 1080

gacagcggcg acgccctgct ggagcgcaac tatcccactg gcgcggagtt cctcggcgac 1140

ggcggcgacg tcagcttcag cacccgcggc acgcagaact ggacggtgga gcggctgctc 1200

caggcgcacc gccaactgga ggagcgcggc tatgtgttcg tcggctacca cggcaccttc 1260

ctcgaagcgt cgcaaagcat cgtcttcggc ggggtgcgcg cgcgcaacca ggacctcgac 1320

gcgatctggc gcggtttcta tatcgccggc gatccggcgc tggcctacgg ctacgcccag 1380

gaccaggaac ccgacgcacg cggccggatc cgcaacggtg ccctgctgcg ggtctatgtg 1440

ccgcgctcga gcctgccggg cttctaccgc accagcctga ccctggccgc gccggaggcg 1500

gcgggcgagg tcgaacggct gatcggccat ccgctgccgc tgcgcctgga cgccatcacc 1560

ggccccgagg aggaaggcgg gcgcctggag accattctcg gctggccgct ggccgagcgc 1620

accgtggtga ttccctcggc gatccccacc gacccgcgca acatcggcgg cgacctcgac 1680

ccgtccagca tccccgacaa ggaacaggcg atcagcgccc tgccggacta cgccagccag 1740

cccggcaaac cgccgaagga cgagctgtaa 1770

<210>4

<211>589

<212>PRT

<213>

<400>4

Met Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser

1 5 10 15

Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Pro Ala Gln Thr Arg Ile Tyr

20 25 30

Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met

35 40 45

Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn

50 55 60

Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr

65 70 75 80

Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu

85 90 95

His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro

100 105 110

Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile

115 120 125

Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu

130 135 140

Asn Gly Glu Glu Leu Ser Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro

145 150 155 160

Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr

165 170 175

Thr Asn His Ser Phe Thr Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val

180 185 190

Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp

195 200 205

Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln

225 230 235 240

Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg Gln Pro Arg

245 250 255

Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val

260 265 270

Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val

275 280 285

Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu

290 295 300

Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala

305 310 315 320

Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu

325 330 335

Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala

340 345 350

Ala Gly Glu Cys Val Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu

355 360 365

Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val

370 375 380

Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu

385 390 395 400

Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr ValPhe Val Gly Tyr

405 410 415

His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ser Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val

420 425 430

Arg Ala Arg Asn Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile

435 440 445

Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro

450 455 460

Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val

465 470 475 480

Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala

485 490 495

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu

500 505 510

Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg

515 520 525

Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile

530 535 540

Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp

545 550 555 560

Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp

565 570 575

Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

580 585

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcggatccgc tgctcctctg 20

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cccgggttaa ggaatgtggt ctgg 24

<210>7

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gcggatcc 8

<210>8

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cccgggtta 9

<210>9

<211>678

<212>DNA

<213>

<400>9

atggctgctc ctctgaagat tcaagcttat ttcaatgaga ctgcaggcct gccgtgccaa 60

tttgcaaact ctcaaaacca aagcctgagt gagctagtag tattttggca ggaccaggaa 120

aacttggttc tgaatgaggt atacttaggc aaagagaaat ttgacagtgt tcattccaag 180

tatatgggcc gcacaagttt tgattcggac agttggaccc tgagacttca caatcttcag 240

atcaaggaca agggcttgta tcaatgtatc atccatcaca aaaagcccac aggaatgatt 300

cgcatccacc agatgaattc tgaactgtca gtgcttgcta acttcagtca acctgaaata 360

gtaccaattt ctaatataac agaaaatgtg tacataaatt tgacctgctc atctatacgc 420

ggttacccag aacctaagaa gatgagtgtt ttgctaagaa ccaagaattc aactatcgag 480

tatgatggta ttatgcagaa atctcaagat aatgtcacag aactgtacga cgtttccatc 540

agcttgtctg tttcattccc tgatgttgcg agcaatatga ccatcttctg tattctggaa 600

actgacaaga cgcggctttt atcttcacct ttctctatag agcttgagga ccctcagcct 660

cccccagacc acattcct 678

<210>10

<211>226

<212>PRT

<213>

<400>10

Met Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Gly

1 5 10 15

Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu

20 25 30

Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr

35 40 45

Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg

50 55 60

Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln

65 70 75 80

Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro

85 90 95

Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu

100 105 110

Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu

115 120 125

Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile Arg Gly Tyr Pro Glu

130 135 140

Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu

145 150 155 160

Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr

165 170 175

Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Ser Ser Asn

180 185 190

Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His

210 215 220

Ile Pro

225

<210>11

<211>624

<212>DNA

<213>

<400>11

gttatccacg tgaccaagga agtgaaagaa gtagcaacgc tgtcctgtgg tcacaatgtt 60

tctgttgaag agccggcaca aactcgcatc tactggcaaa aggagaagaa aatggtgctg 120

actatgatgt ctggggacat gaatatatgg cccgagtaca agaaccggac catctttgat 180

attactaata acctctccat tgtgatcctg gctctgcgcc catctgacga gggcacatac 240

gagtgtgttg ttctgaagta tgaaaaagac gctttcaagc gggaacacct ggctgaagtg 300

acgttatcag tcaaagctga cttccctaca cctagtatat ctgactttga aattccaact 360

tctaatatta gaaggataat ttgctcaacc tctggaggtt ttccagagcc tcacctctcc 420

tggttggaaa atggagaaga attaagtgcc atcaacacaa cagtttccca agatcctgaa 480

actgagctct atgctgttag cagcaaactg gatttcaata tgacaaccaa ccacagcttc 540

acgtgtctca tcaagtatgg acatttaaga gtgaatcaga ccttcaactg gaatacaacc 600

aagcaagagc attttcctga taac 624

<210>12

<211>208

<212>PRT

<213>

<400>12

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Pro Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Ser Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Thr Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gctgctcctc tgaagattca ag 22

<210>14

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cgacccacca ccgcccgagc caccgccacc gcttccaccg cctccagatc cgccgccacc 60

aggaatgtgg tct 73

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

cgcgaattca tggttatcca cgtgacc 27

<210>16

<211>82

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

cgacccacca ccgcccgagc caccgccacc gcttccaccg cctccagatc cgccgccacc 60

gttatcagga aaatgctctt gc 82

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

tcgggcggtg gtgggtcggg cggcagcctg gccgcgctga 40

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

tcccccgggg gattacttca ggtcctcgcg cggcggtttg 40

<210>19

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

tcccccgggg gattacagct cgtccttcgg cggtttgccg ggctggct 48

Claims

1.一种融合蛋白，其中包含免疫配基或者其能够和相应T细胞受体结合的变体、衍生物、类似物或片段与毒素蛋白的融合。

2.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述免疫配基是B7、BB1或CD40L等。

3.根据权利要求2的融合蛋白，其中所述免疫配基是B7-1。

4.根据权利要求2的融合蛋白，其中所述免疫配基是B7-2。

5.根据权利要求1的融合蛋白，其中包含所述免疫配基的胞外部分。

6.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述免疫配基是人的。

7.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述毒素蛋白是植物毒素如蓖麻毒素、植物凝集素等或者是细菌毒素如白喉毒素、志贺氏毒素、假单胞菌外毒素等。

8.根据权利要求7的融合蛋白，其中所述毒素蛋白是绿脓杆菌外毒素。

9.根据权利要求1的融合蛋白，其具有SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列。

10.一种分离的多核苷酸，其中包含编码权利要求1-9中任一项的融合蛋白的核酸序列。

11.一种核酸构建体，其包含权利要求10的多核苷酸及与之可操作连接的控制序列。

12.一种表达载体，其中包含权利要求11的核酸构建体。

13.根据权利要求12的表达载体，它是pRSETA-B7-2-PE40KDEL。

14.包含权利要求11的核酸构建体或者权利要求12或13的表达载体的宿主细胞。

15.根据权利要求14的宿主细胞，它是原核或真核细胞。

16.根据权利要求15的宿主细胞，它是细菌如大肠杆菌。

17.根据权利要求16的宿主细胞，它是包含pRSETA-B7-2-PE40KDEL重组表达载体的BL21-CodonpPlus(DE3)-RIL或者BL21(DE3)pLysS。

18.一种制备权利要求1-9中任一项的融合蛋白的方法，包括(i)在适于所述融合蛋白表达的条件下培养权利要求14-17任一项的宿主细胞；和(ii)从培养物中回收所述融合蛋白。

19.权利要求1-9中任一项的融合蛋白在制备可用于抑制过度的或不必要的免疫反应的药物中的用途。

20.根据权利要求19的用途，其中所述过度的或不必要的免疫反应是移植物抗宿主排斥或宿主抗移植物排斥，或是自身免疫性疾病。

21.根据权利要求20的用途，其中所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、红斑狼疮、牛皮癣、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病等。

22.权利要求10的多核苷酸在制备可用于抑制自身免疫性疾病的药物中的用途。

23.根据权利要求22的用途，其中所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、红斑狼疮、牛皮癣、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病等。

24.一种药物组合物，其中含有免疫抑制有效量的权利要求1-9任一项的融合蛋白或权利要求10的多核苷酸，以及药学可接受的载体。