BRPI1012524A2 - anticorpos anti-tnf-alfa e seus usos - Google Patents

Abstract

anticorpo anti-tnf-alfa monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno anti-tnf-alfa, conjugado de droga de anticorpo, composição farmacêutica e uso do dito anticorpo. a presente invenção refere-se a anticorpos direcionados ao fator alfa de necrose de tumor ("tnf-(alfa)") e usos de tais anticorpos, por exemplo, para tratar doenças associadas com a atividade e/ou sobre-produção de tnf-(alfa).

Description

1U74 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO ANTI-TNF-ALFA MONOCLONAL OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A AN- TÍGENO ANTI-TNF-ALFA, CONJUGADO DE DROGA DE ANTICORPO, . COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO DITO ANTICORPO".

1. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório dos Es- tados Unidos no. 61/170.053, depositado em 16 de abril de 2009, os conteú- dos do qual são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

2. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA A Listagem de Sequência concorrentemente submetida com es- te é incorporada aqui por referência.

3. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere a anticorpos anti-TNF-a, composi- ções farmacêuticas compreendendo anticorpos anti-TNF-a, e usos terapêu- ticosdetais anticorpos.

4. ANTECEDENTES O fator alfa de necrose de tumor (TNF-a) é uma citocina próinfla- matória que é liberada por e interage com células do sistema imune. O TNF- a foi mostrado ser ascendentemente regulado em um número de doenças humanas, incluindo doenças crônicas, tais como artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerativa e esclerose múltipla. Por exemplo, níveis elevados de TNF-a são encontrados no fluido sinovial de pacientes com artrite reumatoi- de e desempenham um papel importante em ambos a inflamação patológica e a destruição de junta que são características da artrite reumatoide. O TNF-a humano é uma proteína de 17 kDa, e a forma ativa existe como um homotrímero (Pennica et al., 1984, Nature 312:724- 729; Davis et al., 1987, Biochemistry 26:1322- 1326; Jones et al., 1989, Nature 338:225-228). O TNF-a exerce seus efeitos biológicos através da interação com dois receptores de superfície de célula estrutural- mente relacionados, mas funcionalmente distintos, p55 e p75, que são coexpressos em muitos tipos de célula (Loetscher et al., 1990, Cell 61:351-9; Smith et a/., 1990, Science 248(4958):1019-23). p55 é também conhecido como p55R; p5s5TNFR; CD120a; TNFR |; TNFR 1 e TN- FRSFIa. pf5 é também conhecido como p75R; p7?5TNFR; CD120b; TNFR |; TNFR 2 e TNFRSFIb. Ambos receptores são também proteoliticamente libe- rados como moléculas solúveis capazes de ligarem TNF-a.

A inibição da atividade de TNF-a como um método de tratamento de doença, em particular, artrite reumatoide, foi alcançada por um número de meios diferentes usando inibidores tais como anticorpos e receptores solúveis. Exemplos incluem etanercept, comercializado por Immunex Corporation como ENBRELO que é uma proteína de fusão recombinante compreendendo dois domínios de TNF-receptor solúveis em p75 ligados à porção Fc de uma imuno- . globulina humana. Infliximab, comercializada por Centocor Corporation como REMICADEG, é um anticorpo quimérico tendo domínios variáveis de murina ' anti-TNF-a e domínios constantes IgG, humana. Outros inibidores incluem mo- léculas de TNF-a projetadas que formam trimeres com TNF-a nativo e impe- - 195 dem ligação de receptor (Steed et al, 2003, Science 301:1895-1898; WO 03/033720; WO 01/64889). Estes métodos atuais de inibição de atividade de TNF-a bloqueiam ligação de TNF-a a ambos os receptores p55 e p75 (Ver, por exemplo, Mease, 2005, Expert Opin. Biol. Therapy 5(11):1491-1504). Adali- mumab, comercializada por Abbott Laboratories como HUMIRAG, é um anti- corpo anti-TNF-alfa totalmente humano recombinante (Tussirot and Wendling, 2004, Expert Opin. Pharmacother. 5:581-594). Adalimumab se liga específica- mente a TNF-a e bloqueia sua interação com os receptores de TNF-a de superfi- cie de célula de p55 e p75. Adalimumab também lisa as células de expressão de TNF-a de superfície in vitro via citotoxicidade dependente de complemento ("CDC") e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo ('(ADCC").

Adalimumab não se liga ou inativa linfotoxina (TNF-B). Adalimumab também modula respostas biológicas que são induzidas ou reguladas por TNF, incluindo mudanças nos níveis de adesão de moléculas responsáveis pela migração de leucócito (ELAM-1, VCAM-1, e ICAM-1 com um ICs9 de 1-2 X 10º M).

Apesar de ser um anticorpo humano, Adalimumab pode induzir uma resposta humana quando administrado a humanos. Tal resposta imune pode resultar em uma folga mediada por complexo imune dos anticorpos ou

- 3/74 fragmentos a partir da circulação e torna a administração repetida inadequa- da para terapia, reduzindo, desse modo, o benefício terapêutico ao paciente e limitando a re-administração do anticorpo. - Consequentemente, existe uma necessidade de proporcionar anticorpos anti-TNF-a aperfeiçoados ou fragmentos que superem um ou ' mais destes problemas, por exemplo, por geração de variantes com afinida- de mais alta do que Adalimumab que pode ser administrado em dosagens reduzidas ou variantes com imunogenicidade reduzida conforme comparado à Adalimumab. .« 10 A citação ou identificação de qualquer referência na Seção 4 ou em qualquer outra seção deste pedido não devem ser construídas como t uma admissão que tal referência é disponível como técnica anterior à pre- sente revelação.

RESUMO A presente revelação se refere a variantes do anticorpo anti- TNF-alfa D2E7 com ligação aperfeiçoada a TNF-a e/ou imunogenicidade ' reduzida conforme comparado à D2E7. D2E7 tem três CDRs de cadeia pe- . sada, referidas aqui (na ordem amino- para carboxi-terminal) como CDR-H1 (SEQ ID NO:5), CDR-H2 (SEQ ID NO:6), e CDR-H3 (SEQ ID NO:7), e três CDRs de cadeia leve, referidas aqui (na ordem amino- para carboxi-terminal) como CDR-L1 (SEQ ID NO:8), CDR-L2 (SEQ ID NO:9), e CDR-L3 (SEQ ID NO:10). Os anticorpos anti-TNF-a e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa da revelação geralmente têm pelo menos uma substituição de amino ácido em pelo menos uma CDR conforme comparada a D2E7. Em certos aspectos, pelo menos uma substituição de amino áci- do ou combinação de substituições é selecionada da Tabela 11, Tabela 12 e/ou Tabela 25. Mutações adicionais (incuindo substituições, anulações ou inserções) podem ser selecionadas de uma ou naus das Tabelas 13-25. Em certos aspectos, a presente revelação se refere a variantes do anticorpo anti-TNF-alfa D2E7 com propriedades de ligação aperfeiçoa- das, por exemplo, afinidade aperfeiçoada, a TNF-a, conforme comparadas a D2E7. Em concretizações específicas, os anticorpos da revelação têm uma |

. ATA afinidade maior do que D2E7 para TNF-a, por exemplo, Kp aperfeiçoado conforme medido por BlAcore e/ou afinidade aperfeiçoada conforme medida por competição ELISA. . Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-a e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa incluem pelo menos uma substituição selecionada ' de S3K em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), S3R em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), S3N em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4H em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4Q em CDR- L2 (SEQ ID NO:9), T4V em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4F em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), TAW em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4Y em CDR-L2 (SEQ ID «+ 10 NOS); L5Rem CDR-2 (SEQ ID NO:9), LSK em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), Q6K em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), Q6R em CDR-L2 (SEQ ID NO:9), DIG em ' CDR-H1 (SEQ ID NO:5), Y2H em CDR-H1 (SEQ ID NO:5); ASGG em CDR-H1 (SEQ ID NO:5), e TSN em CDR-H2 (SEQ ID NO:6). Mutações adicionais que podem ser incorporadas na afinidade aperfeiçoada de anticorpos variantes anti-TNF-a e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa podem ser substitui- ções de de-imunização, tais como aquelas descritas na Tabela 11, bem co- ' mo outras mutações, por exemplo, substituições, que não destroem a capa- - cidade dos anticorpos anti-TNF-a e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa se ligarem a TNF-a, incluindo, mas não limitadas a, mutações conhecidas descritasnas Tabelas 13 a 24, ou as mutações descritas na Tabela 25.

Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa incluem pelo menos uma substituição selecionada de T4F em CDR-L2, TAW em CDR-L2, T4Y em CDR-L2, LSR em CDR-L2, L5K em CDR-L2, Q6R em CDR-L2, Y2H em CDR-H1, A3G em CDR-H1, e T3Nem CDR-H2. Mutações adicionais ou combinações de mutações que podem ser incorporadas em tais anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa podem ser selecionadas de uma OUA mais das Ta- belas 11 e 13a25.

Em certos outros aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e frag- mentos de ligação de anti-TNF-alfa incluem pelo menos uma substituição selecionada de T4F em CDR-L2, TAW em CDR-L2, T4Y em CDR-L2, LSR em CDR-L2, L5K em CDR-L2, O6R em CDR-L2, Y2H em CDR-H1, ASG em |

- 5/74 CDR-H1, e T3N em CDR-H2. Mutações adicionais ou combinações de mu- tações que podem ser incorporadas em tais anticorpos anti-TNF-alfa e frag- mentos de ligação de anti-TNF-alfa podem ser selecionadas de uma ou mais - das Tabelas 11 e 13a18. Em ainda outros aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e frag- mentos de ligação de anti-TNF-alfa incluem as substituições G5S + A11S ou G5S + A11G em CDR-L1. Mutações adicionais ou combinações de muta- ções que podem ser incorporadas em tais anticorpos anti-TNF-alfa e frag- mentos de ligação de anti-TNF-alfa podem ser selecionadas de uma ou mais « 10 dasTabelas 11a25.

Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de t ligação de anti-TNF-alfa incluem as substituições selecionadas de S3N em CDR-L2, T4V em CDR-L2, Q6K em CDR-L2, e DIG em CDR-H1 em combi- nação com pelo menos uma substituição selecionada das Tabelas 11, 12, e

25. Mutações adicionais ou combinações de mutações que podem ser in- corporadas em tais anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti- " TNF-alfa podem ser selecionadas de uma ou mais das Tabelas 11 a 24. BR Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa incluem as substituições selecionadas de S3N em CDR-L2,T4Vem CDR-L2, O6K em CDR-L2, e DIG em CDR-H1 em combi- nação com pelo menos uma substituição selecionada de S3K em CDR-L2, S3R em CDR-L2, T4H em CDR-L2, T4Q em CDR-L2, T4F em CDR-L2, TAW em CDR-L2, T4Y em CDR-L2, LSR em CDR-L2, LSK em CDR-L2, Q6R em CDR-L2, Y2H em CDR-H1, A3G em CDR-H1, e TSN em CDR-H2.

Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa incluem a combinação de substituições seleciona- das de pelo menos um de S3K, T4H, LSR e O6R; S3K, T4Q, L5R e Q6K; S3K, T4Y e L5K; S3K e T4Y; S3N, T4V, LSR e O6K; S3N, T4W, LSR e Q6R; S3R, T4F e LSR; S3R, T4F, LSR e Q6R; S3R, T4H e O6K; S3R, T4W, L5K e OQ6R;T4H,L5Ke Q6K; T4H, LSKe O6R; T4W, LSR e QSR; e T4Y e LSR em CDR-L2, no qual os seis CDRs conjuntamente têm até 17 substituições de amino ácido conforme comparadas às sequências de CDR do anticorpo |

- 6/74 D2E7. Os anticorpos anti-TNF-alfa ou fragmentos de ligação de anti-TNF- alfa opcionalmente incluem uma ou mais mutações ou combinações adicio- nais de mutações que podem ser selecionadas de uma ou mais das Tabelas - 11a24. Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de : ligação de anti-TNF-alfa incluem uma ou mais substituições ou combinações de substituições selecionadas de S3K, S3R, S3N, T4F, T4W, T4Y, T4H, T40Q, T4V, L5R, LSK, O6R, e O6K em CDR-L2. Mutações adicionais ou combinações de mutações que podem ser incorporadas em tais anticorpos 210 anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa podem ser selecio- nadas de uma ou mais das Tabelas 11 a 24.

' Em outros aspectos, a presente revelação se refere a variantes do anticorpo anti-TNF-alta D2E7 com imunogenicidade reduzida conforme comparadas a D2E7. Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa incluem pelo menos uma substitui- ção ou combinação de substituição(õdes) em CDR-L1 (SEQ ID NO:8) sele- ' cionadas de R7Q; A11S; R7Q + A11S; N8T; N8T + A11S; I6T; A11G; I6T + : A11G; O4G; Q4G + A11S; Q4G + A11G; Q4H; Q4H + A11IS; Q4R; Q4R + A11S; G5S; G5S + A11S; N8S + A11S; I6T + A11S; e N8T + A11G. Muta- ções adicionais que podem ser incorporadas nos anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa com antigenicidade reduzida incluem substituições que aperefiçoam propriedades de ligação a TNF-a, tais como aquelas descritas na Tabela 12 e/ou Tabela 25, bem como outras mutações, por exemplo, substituições que não destroem a capacidade dos anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa para se ligar a TNF- a, incluíndo, mas não limitados a, mutações conhecidas descritas nas Tabe- las 13a25.

Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa da revelação têm sequências de VH e VL tendo 80% a99% de identidade de sequência para as sequências de VH e VL de D2E7, e incluem pelo menos uma substituição de amino ácido em pelo me- nos uma CDR conforme comparada a D2E7. Em concretizações específicas, |

- 774 a percentagem de identidade de sequência para a cadeia pesada e a cadeia leve comparada às sequências de VH e VL de D2E7 é cada independente- mete selecionada de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, . ou pelo menos 95% de identidade de sequência.

Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ' ligação de anti-TNF-alfa da revelação têm até 17 substituições de amino áci- do em suas CDRs conforme comparadas às CDRs de D2E7. Anticorpos va- riantes com 17 substituições de amino ácido que mantêm sua capacidade de ligação alvo foram gerados por Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-14. « 10 Os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti-TNF-alfa da re- velação podem também terem até 16, até 15, até 14, até 13, até 12, até 11, t até 10, até 9, até 8, até 7, até 6, até 5, ou até 4 substituições de amino ácido em suas CDRs conforme comparadas às sequências de CDR do anticorpo D2E7. Em concretizações específicas, um anticorpo anti-TNF-alfa ou fragmento de ligação de anti-TNF-alfa da revelação tem, independentemen- ' te: ' e até uma, ou até duas, ou até três CDR-H1 substituições con- forme comparadas à CDR correspondente de D2E7; + até uma, até duas, até três, até quatro, até cinco ou até seis CDR-H2 substituições conforme comparadas à CDR correspondente de D2E7; + até uma, até duas, até três, até quatro, ou até cinco CDR-H3 substituições conforme comparadas à CDR correspondente de D2E7; e até uma, até duas, até três, ou até quatro CDR-L1 substitui ções conforme comparadas à CDR correspondente de D2E7; e até uma, até duas, até três, ou até quatro CDR-L2 substitui ções conforme comparadas à CDR correspondente de D2E7; e e até uma, até duas, até três, ou até quatro CDR-L3 substitui- ções conforme comparadas à CDR correspondente de D2E7. A presente revelação adicionalmente proporciona composições farmacêuticas compreendendo anticorpos anti-TNF-alfa modificados e frag- |

. 8/74 mentos de ligação de anti-TNF-alfa tendo afinidade aumentada a TNF-a e/ou imunogenicidade reduzida conforme comparadas a D2E7.

Em certos aspectos, um anticorpo anti-TNF-alfa ou fragmento de ” ligação de anti-TNF-alfa da revelação pode ser um anticorpo bi-específico ou um fragmento de ligação de TNF-alfa de um anticorpo bi-específico. O anti- ' corpo bi-específico pode ser específico a TNF-a e outra citoquina pró- inflamatória (tais como, por exemplo, linfotoxina, interferon-y, ou interleucina- 1). Ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo - 10 que codificam os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti- TNF-alfa da revelação são aqui providos, como são vetores compreendendo t ácidos nucléicos. Adicionalmente, células hospedeiras procarióticas e célu- las hospedeiras eucarióticas com um vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo anti-TNF-alfa ou fragmento de liga- ção de anti-TNF-alfa são aqui providas, bem como células hospedeiras eu- carióticas (tais como mamífero) projetadas para expressarem as sequências ' de nucleotídeo. Métodos de produção de anticorpos anti-TNF-alfa e frag- . mentos de ligação de anti-TNF-alfa por cultura de células hospedeiras são também providos.

Os anticorpos anti-TNF-alfa e fragmentos de ligação de anti- TNF-alfa da revelação são úteis no tratamento de distúrbios imunes, por e- xemplo, eritematose de lúpus sistêmica, artrite reumatóide, tiroidose, doença de enxerto versus hospedeiro, escleroderma, diabetes mellitus, doença de Grave, sarcoidose, doença de intestino inflamatória crônica, colite ulcerativa, oudoençade Crohn.

Deve ser notado que os artigos indefinidos "um" e "uma" e | arti- go definido "o" são usados no presente pedido, conforme é comum nos pe- didos de patente, para significar um ou mais, a menos que o contexto indi- que claramente de outro modo. Adicionalmente, o termo "ou" é usado no presente pedido, conforme é comum nos pedidos de patente, para significar o disjuntivo "ou" ou o conjuntivo "e".

Todas as publicações mencionadas neste relatório descritivo são |

. 9/74 aqui incorporadas por referência. Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foram incluídos neste relató- rio descritivo é unicamente para a proposta de proporcionar um contexto pa- - ra a presente revelação. Não é para ser tomado como uma admissão que qualquer ou todas destas matérias formam parte da base da técnica anterior ' ou eram conhecimento geral comum no campo relevante a uma presente revelação conforme existiu em qualquer lugar antes da data de prioridade deste pedido.

As características e vantagens da revelação tornar-se-ão adicio- « 10 nalmente aparentes da seguinte descrição detalhada de concretizações des- ta. t BREVE DESCRIÇÃO DAS TABELAS E FIGURAS A Tabela 1 mostra peptídeos D2E7 VH e peptídeos D2E7 VL, respectivamente, que foram testados para imunogenicidade. A Tabela 2 mostram regiões de epítope de célula identificadas CD4+ T cell em D2E7. Regiões CDR são sublinhadas. ' A Tabela 3 mostra associações de classe Il de HLA e risco rela- . tivo de resposta à epitopes de peptídeo de região de D2E7 VL. A Tabela 4 mostra sequências de variantes de epítope de D2E7 VLCDR1.Um total de 99 doadores foram testados. O número de responde- dores, a percentagem de respondedores, e o índice de estimulação médio é indicado para cada peptídeo testadi.

A Tabela 5 mostra mutações candidatas em CDR-L1 para abai- xamento da imunogenicidade de D2E7. A numeração dos amino ácidos na Tabela5 corresponde às posições no contexto da cadeia leve de D2E7.

A Tabela 6 mostra resultados de BlAcore e ELISA para substitu- ições em CDR-L1 que não resultam em ligação significantemente diminuída conforme comparada a D2E7. A numeração dos ácidos na Tabela 6 corres- ponde às posições no contexto da cadeia leve de D2E7. O aperfeiçoamento em kKp (conforme medido por BlAcore) e ICso de ligação (conforme medido por ELISA) são indicados por "WTx". CV% se refere ao desvio padrão como a percentagem da medida de valor total. |

. 10/74 A Tabela 7 mostra resultados de ensaio de célula T para todas as mitações simples e dupla ao epítope de D2E7. O peptídeo 1 é o peptídeo de origem. As modificações para o peptídeo de origem são do tipo de face - em negrito. A Tabela 8 mostra as variantes de peptídeo de epítope preferi- Ú das baseadas somente nos resultados de ensaio de célula T. A numeração dos amino ácidos na Tabela 8 corresponde às posições no contexto da ca- deia leve de D2E7. A Tabela 9 mostra bioatividade de anti-proliferação de anticorpos — 10 construídos para conter os peptídeos de epítope variante preferidos. A ori- gem é anticorpo D2E7 não-modificado. A numeração dos amino ácidos na : Tabela 9 corresponde às posições no contexto da cadeia leve de D2E7. A Tabela 10 mostra cinéticas de ligação de D2E7 e as variantes de D2E7 contra TNF-a conforme analisadas por BlAcore. A numeração dos aminoácidos na Tabela 10 corresponde às posições no contexto da cadeia leve de D2E7.

' A Tabela 11 mostra substituições ou combinações de CDR-L1 . de substituições que podem ser incorporadas nis anticorpos relacionados a D2E7 para reduzir sua imunogenicidade.

Tabela 12 mostra substituições de CDR de amino ácido fora da CDR-L1 resultando em Kp aperfeiçoada (conforme enalisadas por BlAcore), afinidade (conforme medida por ELISA), ou ambos, conforme comparadas a D2E7. A numeração dos amino ácidos na Tabela 12 corresponde às posi- ções no contexto das cadeias leve e pesada de D2E7. O aperfeiçoamento em bkKp (conforme medido por BlAcore) e ICso de ligação (conforme medido por ELISA) são indicados por "WTx". CV% se refere ao desvio padrão como uma percentagem da medida de valor total e "ND" significa "não feito", A Tabela 13 mostra mutações conhecidas em CDR-H1 que po- dem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A Tabela 14 mostra mutações conhecidas em CDR-H2 que po- dem ser incorporadas nos anticorpos da revelação. A inclusão de 2 amino ácidos em uma célula simples indica uma variante de CDR que incorpora |

- 11/74 uma adição a ou inserção na CDR.

O sombreamento de uma célula indica uma variante de CDR que carece dos resíduos de amino ácido sombrados.

A Tabela 15 mostra mutações conhecidas em CDR-H3 que po- : dem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A Tabela 16 mostra mutações conhecidas em CDR-L1 que po- dem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A inclusão de 2 amino ácidos emu ma célula simples indica uma variante de CDR que incorpora uma adição a ou inserção na CDR.

A Tabela 17 mostra mutações conhecidas em CDR-L2 que po- — 10 dem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A inclusão de 2 amino ácidos emu ma célula simples indica uma variante de CDR que incorpora o 1 amino ácido N-terminal adicional indicado no CDR.

A Tabela 18 mostra mutações conhecidas em CDR-L3 que po- dem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A inclusão de 2 amino ácidos emu ma célula simples indica uma variante de CDR que incorpora o amino ácido N-terminal adicional indicado na CDR. ] A Tabela 19 mostra mutações conhecidas adicionais em CDR- ' H1 que podem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A Tabela 20 mostra mutações conhecidas adicionais em CDR- H2que podem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A Tabela 21 mostra mutações conhecidas adicionais em CDR- H3 que podem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A Tabela 22 mostra mutações conhecidas adicionais em CDR- L1 que podem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A Tabela 23 mostra mutações conhecidas adicionais em CDR- L2 que podem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A Tabela 24 mostra mutações conhecidas adicionais em CDR- L3 que podem ser incorporadas nos anticorpos da revelação.

A Tabela 25 mostra combinações de mutações de ponto em CDR-L2 resultando em Kp aperfeiçoada (conforme analisada por BlAcore), afinidade (conforme medida por ELISA), ou ambos conforme comparado a D2E7. As mutações de ponto podem ser incorporadas simplesmente ou em |

: 12/74 combinação nos anticorpos da revelação.

As Figuras 1A-1E.

A Figura 1A mostra as sequências de amino ácido das cadeias pesada e leve de D2E7, com as regiões de CDR em texto -. sublinhado em negrito.

A Figura 1B mostra as sequências de CDR e identifi- cadores de sequência correspondentes de D2E7. A Figura 1C mostra um gráfico de correspondência entre a numeração de CDR de cadeia pesada e a numeração de Kabat de cadeia pesada.

A Figura 1D mostra um gráfico de correspondência entre a numeração de CDR de cadeia leve e a numeração de Kabat de cadeia leve.

A Figura 1E mostra a sequência de nucleotídeos — 10 das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de D2E7 (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3, respectivamente) conforme publicadas em Patente dos Esta- : dos Unidos No. 6.090.382. A Figura 2 mostra percentagem de respostas (fundo) e índices de estimulação médios (topo) para os peptídeos de D2E7 VL.

A Figura 3 mostra índices de estimulação médios (topo) e per- centagem de respostas (fundo) para os peptídeos de D2E7 VH.

O peptídeo ' 27 tem um índice de estimulação anômalo em um doador, e é indicado em ' sobramento mais escuro.

A Figura 4 mostra variantes de peptídeo de epítope de D2E7 VL CDRI1.Os símbolos abertos indicam re-testes múltiplos do peptídeo de ori- gem não-modificado dentro do conjunto de dados.

Os símbolos preenchidos representam variants de varredura de alanina de peptídeo.

As sequências das variantes de indução de resposta mais reduzidas são indicadas.

A Figura 5 mostra variantes de peptídeo de epítope de D2E7 VL CDRI1.Os símbolos abertos indicam re-testes do peptídeo de origem não- modificado dentro do conjunto de dados.

Os símbolos preenchidos represen- tam variants de peptídeo únicas.

As variantes de indução de resposta mais reduzidas são indicadas por um círculo.

Esta figura representa graficamente os dados da Tabela 7. A Figura 6 mostra os resultados de competição ELISA de anti- corpos variantesde D2E7, As placas de ELISA foram revestidas com TNF-a.

D2E7 biotinilatado foi incluído em todas as cavidades a uma concentração |

- 13/74 simples, e o anticorpo de variante foi titulado. Os valores de 1Cso foram cal- culados para cada anticorpo. O experimento foi realizado três vezes. O eixo Y mostra os resultados médios como uma percentagem da ligação de anti- - corpo de origem.

DESCRIÇÃO DETALHADA 11 ANTICORPOS ANTI-TNF-ALFA A presente revelação proporciona anticorpos anti-TNF-alfa. À menos que de outro modo indicado, o termo "anticorpo" (Ab) se refere a uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a, ou é imunologi- — 10 camente reativa com, um antígeno particular, e inclui anticorpos policlonais, monocionais, geneticamente projetados e, de outro modo, formas modifica- : das de anticorpos, incluindo, mas não limitados a, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos heteroconjugados (por exemplo, anti- corpos bi-específicos, diacorpos, triacorpos, e tetracorpos), e fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos, incluindo, por exemplo, fragmentos Fab', F(ab')a, Fab, Fv, rlgG, e scFv. Além disso, a menos que de outro modo indi- ' cado, o termo "anticorpo monoclonal" (mAb) é significativo incluir ambos mo- . léculas intactas, bem como, fragmentos de anticorpo (tais como, por exem- plo, fragmentos Fab e F(ab')-) que são capazes de se ligarem especiífica- mente a uma proteína. Os fragmentos Fab e F(ab'), carecem do fragmento Fc de anticorpo de intacto, aparecem mais rapidamente da circulação do animal ou planta, e podem ter menos ligação de tecido não-específica do que um anticorpo intacto (Wahl et a/., 1983, J. Nucl. Med. 24:316). O termo "scFy" se refere a um anticorpo de Fv de cadeia simples em que os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de uma anticorpo tradicional foram unidos para formarem uma cadeia.

Referências a "VH" se refere a região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo, incluindo a cadeia pesada de um Fv, scFv ou Fab. Referências a "VL" se refere à região variável de uma cadeialeve de imunoglobulina, incluindo a cadeia leve de um Fv, scFv, dsFv ou Fab. Anticorpos (Abs) e imunoglobulinas (lgs) são glicoproteínas tendo as mesmas características estruturais. Enquanto os anticorpos exubem especi- |

- 14/74 ficidade de ligação a um alvo específico, as imunoglobulinas incluem ambos anticorpos e outras moléculas similares à anticorpo que cerecem de especi- ficidade alvo.

Anticorpos natives e imunoglobulinas são usualmente glicopro- - teínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas de duas cadeias leve idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada ca- Ú deia pesada tem no terminal amino um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes.

Cada cadeia leve tem um domínio vari- ável no amino terminal (VL) e um domínio constante no carboxi terminal.

Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação se liga a TNF-a huma- — 10 noeinibe atividade de receptor de TNF-a em uma célula.

Sem estar ligado por qualquer uma teoria, os inventores acreditam que os anticorpos reduzem : a ligação de TNF-a a ambos o receptor de TNF-a de baixa afinidade (p75) e o receptor de TNF-a de alta afinidade (p55). Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação contêm regiões de de- terminação de complementaridade (CDRs) que estão relacionadas em se- quência às CDRs do anticorpo D2E7 (também conhecido como Adalimumab Ú ou HUMIRAG). : CDRs são também conhecidas como regiões hipervariáveis, ambas nos domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.

As por- ções mais altamente conservadas de domínios variáveis são denominadas a estrutura (FR). Conforme é conhecido na técnica, a posição/limite de amino ácido que delineia uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na técnica.

Al- gumas posições dentro de um domínio variável podem ser vistas como posi- ções hipervariáveis híbridas em que estas posições podem ser consideradas estarem dentro de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios, enquanto sendo consideradas estarem fora de uma região hipervariável sob um conjunto diferente de critérios.

Uma ou mais destas posições podem também serem encontradas em região hipervariáveis prolongadas.

A revela- ção proporciona anticorpos compreendendo modificações nestas posições hipervariáveis híbridas.

Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve na- tivas cada compreende quatro regiões de FR, grandemente pela adoção de |

: 15/74 uma configuração de B-folha, ligadas por três CDRs, que formam laços |i- gando (e, em alguns casos formando parte de) a estrutura de B-folha. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade pelas regiões de . FR na ordem FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 e com as CDRs a par- tirda outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação alvo dos ' anticorpos (Ver Kabat et a/., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md, 1987)). Conforme aqui usado, a numeração de resíduos de amino ácido de imunoglobulina é feita de acordo com o sistema de numeração de resíduo de amino ácido de imunoglobulina dekKabatetal, amenos que, de outro modo, indicado. As sequências das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de : D2E7 são representadas por SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:A4, respectivamen- te, e codificadas por SEQ ID NO.:1 e SEQ ID NO.:3, respectivamente. As sequências das regiões variáveis de cadeia pesada e leve são também re- presentadas na Figura 1A. As sequências das CDRs de D2E7, e seus identi- ficadores correspondentes, são apresentadas na Figura 1B. As sequências , das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de D2E7 (conforme publica- . das na Patente dos Estados Unidos No. 6.090.382) são mostradas na Figura 1C. Quaisquer sequências de nucleotídeo que codificam SEQ ID NO:2 ou SEQID NO podem ser usadas nas composições e métodos da presente revelação.

A presente revelação adicionalmente proporciona fragmentos de anticorpo anti-TNF-alfa compreendendo sequências de CDR que são rela- cionadas às sequências de CDR de D2E7. O termo "fragmento de anticorpo" serefere a uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente a ligação alvo ou região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo inclu- em fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Um fragmento "Fy" é o fragment de anticorpo mínimo que contém um reconhecimento alvo completo e sítio de ligação. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de ca- deia pesada e leve em uma associação não-covalente hermética (dímero VH-VL). É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação alvo na superfície do dímeroVH- |

+ 16/74 VL. Frequentemente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação alvo ao anticorpo. Contudo, em alguns exemplos, mesmo um domínio variável simples (ou metade de um Fv compreendendo somente três CDRs especiífi- . cas para um alvo) pode ter a capacidade de reconhecer e logar o alvo. "Ca- deiade Fv simples" ou fragmentos de anticorpo de "scFv" compreendem os ' domínios VH e VL de um anticorpo em uma cadeia de polipeptídeo simples. Geralmente, o polipeptídeo de Fv adicionalmente compreende um articula- dor de polipeptídeo entre o domínio de VH e VL que capacita o scFv a for- mar a estrutura desejada para ligação alvo. "Anticorpos de domínio simples" — 10 sãocompostos de domínios de VH ou VL simples que exibem afinidade sufi- ciente para o TNF-a. Em uma concretização específica, o anticorpo de do- : mínio simples é um anticorpo camelid (ver, por exemplo, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25—38).

O fragmento Fab contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos no carboxil ' terminal do domínio de cadeia pesada CH, incluindo uma ou mais cisteínas a . partir da região de articulação de anticorpo. Os fragmentos F(ab') são produ- zidos por clivagem da ponte de disulfeto nas cisteínas de articulação do pro- duto de digestão de pepsina F(ab')>. Acoplamentos químicos adicionais de fragmentos de anticorpo são conhecidos àqueles técnicos no assunto.

Em certas concretizações, os anticorpos anti-TNF-alfa da reve- lação são anticorpos monoclonais. O termo "anticorpo monoclional", confor- me aqui usado, não é limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo "anticorpo monoclional" se refere a um anticorpo que é derivado de um clone simples, incluindo qualquer clone eucariótico, proca- riótico ou de fago e nçao o método pelo qual ele é produzido. Os anticorpos monoclonais úteis em conjunto com a presente revelação podem ser prepa- rados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica inclu- indoo uso de tecnologias de hibridoma, recombinante, e revelação de fago ou uma combinação destas. Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação inclu- em anticorpos quiméricos, primatizados, humanizados ou humanos.

|

- 17/74 Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação podem ser anticorpos quiméricos. O termo anticorpo "quimérico", aqui usado se refere a um anti- corpo tendo sequências variáveis derivadasa de uma imunoglobulina não- - humana, tal como anticorpo de rato ou camundongo, e regiões constantes de imunoglobulina humana, tipicamente escolhidas de um gabarito de imu- ' noglobulina humana. Métodos para produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentesdos Estados Unidos Nos.

. 10 5.807.715;4.816.567; e 4.816.397, que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

W Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação pode ser humaniza- dos. Fomas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exemplo, mu- rina) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou frag- mentos destas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')) ou outros subdomínios de ligação alvo de anticorpos) que contêm sequências mínimas derivadas de ' imunoglobulina não-humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreen- . derá substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das regiões CDR corres- pondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substanci- almente todas das regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglo- bulina humanizada. O anticorpo humanizado pode também compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma sequência de consenso de imunoglobulina. Mé- todos de humanização de anticorpo são conhecidos na técnica. Ver, por e- xemplo, Riechmann et a/., 1988, Nature 332:323-7; Patentes dos Estados Unidos Nos: 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370 para Queen et a/.; EP239400; publicação PCT WO 91/09967; Patente dos Esta- dos Unidos No. 5.225.539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immu- nol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; e Patente dos Estados Unidos No. 5.565.332, todos dos quais são, desse modo, incorporados por referên- |

- 18/74 cia em suas totalidades. Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação podem ser anticorpos humanos. Anticorpos completamente "humanos" anti-TNF-alfa podem ser * desejáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Conforme aquiusado, "anticorpos humanos" incluem anticorpos tendo uma sequência ' de amino ácido de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isola- dos de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de anumais transgênicos para uma ou mais imunoglobulina humana e que não expressam imunoglo- bulinas endógenas. Os anticorpos humanos podem ser produzidos por uma 2— 10 variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de revela- ção de fago usando-se bibiotecas de anticorpo derivadas de sequências de t imunoglobulina humana. Ver Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.444.887 e

4.716.111; e publicações PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; e WO 91/10741, cada um do qual sendo incorporado aqui por referência em sua totalidade. Os anticorpos humanos podem também serem produzidos usando-se camundongos trans- ' gênicos que são incapazes de expressarem imunoglobulinas endógenas . funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Ver, por exemplo, publicações PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.413.923;

5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318;

5.885.793; 5.916.771; e 5.939.598, que são incorporados aqui por referência em suas totalidades. Em adição, companhias tais como Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL), Amgen (Thousand Oaks, CA) e Rege- neron (Tarrytown, NY), podem ser engajadas para proporcionarem anticor- pos humanos direcionados contra um antígeno selecionado usando-se tec- nologia similar àquela descrita acima. Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítope selecionado podem ser gerados usando uma técnica referida como "seleção guia". Nesta abordagem um anticorpo mono- — clonalnão-humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítope (Jespers et al, 1988, Biotechnology 12:899- |

: 19/74 903). Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação pode ser primatizado. O termo "anticorpo primatizado" se refere a um anticorpo compreendendo - regiões variáveis de macaco e regiões constantes humanas. Métodos para produção de anticorpos primatizados são conhecidos na técnica. Ver, por ] exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.658.570; 5.681.722; e

5.693.780, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades . Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação podem ser anticorpos bi-específicos. Os anticorpos bi-específicos são anticorpos monoclionais, fre- 2 10 quentemente humanos ou humanizados que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Na presente revelação, uma das y especificidades de ligação podem ser direcionadas para TNF-a, a outra pode ser para qualquer outro antígeno, por exemplo, para uma proteína de super- fície de célula, receptor, subunidade de receptor, antígeno específico de te- cido, proteina viralmente derivada, proteína envelope viralmente codificada, proteína bacterialmente derivada, ou proteína de superfície bacterial, efc. ] Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação incluem anticorpos de- : rivatizados. Por exemplo, mas não por modo de limitação, os anticorpos de- rivatizados são tipicamente modificados por glicosilação, acetilação, pegila- ção, fosforilação, amidação, derivatização por grupos conhecidos de prote- ção/bloqueio, clivagem proteolítica, articulação a um ligante celular ou outra proteína (ver Seção Erro! Fonte de referência não encontrada. para uma discussão de conjugados de anticorpo), etc. Quaisquer de numerosas modi- ficações químicas podem ser efetuadas por técnicas conhecidas, including, mas não limitadas a, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, efc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais amino ácidos não-naturais, por exemplo, usando tecnolo- gia ambrx (Ver, por exemplo, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2). Em ainda outra concretização da revelação, os anticorpos anti- TNF-alfaou fragmentos destes podem ser anticorpos ou fragmentos de anti- corpo cuja sequência foi modificada para alterar pelo menos uma função efetuadora biológica mediada por região constante relativa a sequência tipo |

- 20/74 selvagem correspondente. Por exemplo, em algumas concretizações, um anticorpo anti-TNF-a da revelação pode ser modificado para reduzir pelo menos função efetuadora biológica mediada por região constante relativa a : um anticorpo não-modificado, por exemplo, ligação reduzida para o receptor Fc(FoyR). A ligação de FcyR pode ser reduzida por mutação do segmento ' de região constante de imunoglobulina do anticorpo em regiões particulares necessárias para interações de FcyR (Ver, por exemplo, Canfield and Morri- son, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; e Lund et a/., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). A redução na capacidade de ligação de FcyR do anticorpo o pode também reduzir outras funções efetuadoras que ocorrem nas intera- ções de FcyR, tais como opsonização, fagocitose e citotoxicidade celular ' dependente do antígeno ("ADCC").

Em outras concretizações da revelação, um anticorpo anti-TNF- alfa ou fragmento deste pode ser modificado para adquirir ou aperfeiçoar pelomenos uma função efetuadora biológica mediada por região constante relativa a um anticorpo não-modificado, por exemplo, para intensificar intera- ' ções de FcyR (Ver, por exemplo, US 2006/0134709), Por exemplo, um anti- . corpo anti-TNF-alfa da revelação pode te uma região constante que liga FCyRIIA, FeyRIIB e/ou FeyRINA com maior afinidade do que a região cons- tantetipo selvagem correspondente.

Desse modo, os anticorpos da revelação podem ter alterações na atividade biológica que resultam em opsonização aumentada ou diminuí- da, fagociytose, ou ADCC. Tais alterações são conhecidas na técnica. Por exemplo, modificações nos anticorpos que reduzem a atividade de ADCC são descritas na Patente dos Estados Unidos No. 5.834.597. Uma variante de abaixamento de ADCC exemplar corresponde a "mutante 3" (mostrado na Figura 4 da Patente dos Estados Unidos No. 5.834.597) em cujo resíduo 236 é anulado e resíduos 234, 235 e 237 (usando numeração do EU) são substituídos com alaninas.

Em algumas concretizações, os anticorpos anti-TNF-alfa da re- velação têm níveis baixos de ou carecem de fucose. Os anticorpos que ca- recem de fucose foram correlacionados com atividade de ADCC intensifica- |

- 21/74 da, especialmente em doses baixas de anticorpo.

Ver Shields et a/., 2002, J.

Biol.

Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al, 2003, J.

Biol.

Chem. 278:3466-73. Métodos de preparação de anticorpos menos fucose incluem - crescimento nas células YB2/0 de mieloma de rato (ATCC CRL 1662). As células YB2/0 expressam níveis baixos de FUT8 mMRNA, que codificam a- ' 1,6-fucosiltransferase, uma enzima necessária para fucosilação de polipepti- deos.

Em ainda outro aspecto, os anticorpos anti-TNF-alfa ou fragmen- tos destes podem ser anticorpos ou fragmentos de anticorpo que foram mo- 2 1o dificados para aumentar ou reduzir suas afinidades de ligação ao receptor de Fc fetal, FcRn, por exemplo, por mutação do segmento de região contente v de imunoglobulina em regiões particulares envolvidas em unterações de F- cRn (Ver, por exemplo, WO 2005/123780). Em concretizações particulares, um anticorpo anti-TNF-alfa da classe IgG é mutado tal que pelo menos um dos resíduos de amino ácido 250, 314, e 428 da região constante de cadeia pesada é substituído sozinho, ou em quaisquer combinações destes, tal co- : mo nas posições 250 e 428, ou nas posições 250 e 314, ou nas posições : 314 e 428, ou nas posições 250, 314, e 428, com posições 250 e 428 uma combinação específica.

Para posição 250, a substituição do resíduo de ami- no ácido pode ser qualquer resíduo de amino ácido outro do que treonina, incluindo, mas não limitado a, alanina, cisteina, ácido aspártico, ácido glutã- mico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, as- paragina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, troptofan, ou tirosina.

Para posição 314, a substituição do resíduo de amino ácido pode ser qual- —querresíduo de amino ácido outro do que leucina, incluindo, mas não limita- do a, alanina, cisteíina, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, argini- na, serina, treonina, valina, triptofan, ou tirosina, Para posição 428, a substi- tuição dos resíduos de amino ácido pode ser qualquer resíduo de amino áci- do outro do que metionina, incluindo, mas não limitado a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, vali- |

. 22/74 na, triptofan, ou tirosina. Combinações específicas de substituições adequa- das de amino ácido são identificadas na Tabela 1 da Patente dos Estados Unidos No. 7.217.797, cuja tabela é incorporada por referência aqui em sua - totalidade. Tais mutações aumentam a ligação do anticorpo para FcRn, que protegem o anticorpo de degradação e aumentam sua meia-vida.

' Em ainda outros aspectos, um anticorpo anti-TNF-alfa tem um ou mais amino ácidos inseridos em uma ou mais de suas regiões hipervariá- veis, por exemplo, conforme descrito em Jung e Plúckthun, 1997, Protein Engineering 10:9, 959-966; Yazaki et al, 2004, Protein Eng. Des Sel.

: 10 17(5):481-9. Epub 2004 Aug 17; e Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2007/0280931. Y 12 — ÁCIDOS NUCLÉICOS E SISTEMAS DE EXPRESSÃO A presente revelação envolve moléculas de ácido nucléico e cé- lulas hospedeiras que codificam os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação. Um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação pode ser preparado por expressão recombinante de genes de cadeia leve e pesada de imunoglobu- ' lina em uma célula hospedeira. Para expressar um anticorpo recombinante- : mente, uma célula hospedeira é transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinantes que transportam fragmentos de DNA que codifi- cam cadeias leve e pesada de imunoglobulina do anticorpo, tal que as ca- deias leve e pesada são expressas na célula hospedeira e, opcionalmente, secretadas no meio no qual as células hospedeiras são cultivadas, de cujo meio os anticorpos podem ser recuperados. Metodologias de DNA recombi- nante padrões são usadas para obter genes de cadeia pesada e leve de an- ticorpo, incorporam estes genes nos vetores de expressão recombinantes e introduzem os vetores nas células hospedeiras, tais como aqueles descritos em Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Proto- cols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et a/., eds., Greene Publishing As- —sociates, 1989) e na Patente dos Estados Unidos No. 4.816.397. Em uma concretização, os anticorpos anti-TNF-alfa são similares a D2E7, mas para mudanças em uma ou mais CDRs (referidas aqui abaixo |

“ 23/74 como tendo "sequências relacionadas a D2E7)". Em outra concretização, os anticorpos anti-TNF-alfa são similares a D2E7, mas para mudanças em uma ou mais regiões de estrutura.

Em ainda outra concretização, os anticorpos - anti-TNF-alfa são similares a D2E7, mas para mudanças em uma ou mais CDRseemumna ou mais regiões de estrutura.

Para gerar ácidos nucléicos Ú que codificam tais anticorpos anti-TNF-alfa, fragmentos de DNA que codifi- cam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada são primeiro obtidos.

Es- tes DNAs podem ser obtidos por amplificação e modificação de DNA de |i- nha de germe ou cDNA que codifica sequências variáveis de cadeia leve e 2 10 pesada, por exemplo, usando a reação de cadeia polimerase (PCR). Se- quências de DNA de linha de germe para genes de região variável de cadeia 4 pesada e leve humanos são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, a ba- se de dados de sequência de linha de germe humana "VBASE"; ver também Kabat, E.

A. ef al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.

Department of Health and Human Services, NIH Publicati- on No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J.

Mol.

Biol. 22T:116-198; e Cox ef ] al., 1994, Eur.

J.

Immunol. 24:827-836; os conteúdos de cada um dos quais : sendo incorporados aqui por referência). Um fragmento de DNA que codifica a região variável de cadeie leve ou pesada de D2E7, as sequências do qual são mostradas na Figura 1C, pode ser sintetizado e usado como um gabarito para mutagênese para gerar uma variante conforme aqui descrito usando-se técnicas de mutagênese de rotina; alternativamente, um fragmento de DNA que codifica a variante pode ser diretamente sintetizado.

Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam D2E7 ou segmentos de VH e VL relacionados a D2E7 são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser adicionalmente manipulados por técnicas de DNA re- combinante padrões, por exemplo, para converter os genes de região variá- vel em genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, em genes de fragmento Fab ou a um gene de scFv.

Nestas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL ou VH é operantemente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteina, tal como uma região constante de anticorpo ou um articulador flexível.

O termo "operantemente ligado", comforme usado

|

- 24/74 neste contexto, é pretendido significar que os dois fragmentos de DNA são unidos tal que as sequências de amino ácido codificadas pelos dois frag-

mentos de DNA permanecem na estrutura. - O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total por ligação operantemente | do DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões cons- tantes de cadeia pesada (CH, CH2, CH; e, opcionalmente, CH,). As sequên- cias de genes de região constante de cadeia pesada humanos são conheci- das na técnica (Ver, por exemplo, Kabat, E.A. ef al.,, 1991, Sequences of 2 10 Proteinsof Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.

Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA * envolvendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR pa- drão.

A região constante de cadeia pesada pode ser uma IgG1, 19G>, IgGs, IgGa, IgA, IgE, IGM ou região constante de IgD, mas em certas concretiza- ções, é uma região constante de IgG, ou IgG,. Para um gene de cadeia pe- sada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser operantemente Ú ligado a outra molécula de DNA que codifica somente a região constante

' CH, de cadeia pesada.

O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de ca- deia leve Fab) por ligação operantemente do DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL.

As se- quências de genes humanos de região constante de cadeia leve são conhe- cidas na técnica (Ver, por exemplo, Kabat, E.

A. et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (U.S.

Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)) e fragmentos de DNA envolvendo estas regiões podem ser obtidos por amploficação de PCR pa- drão.

A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kap- pa ou lambda, mas em certas concretizações, é uma região constante kap- pa Para criarum gene de scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH e VL são operantemente ligados a outro fragmento que codifica um articular flexível, por exemplo, que codifica a sequência de amino ácido (Glys-Ser)s, |

- 25/74 tal que as sequências de VH e VL podem ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões de VL e VH unidas pelo articu- lador flexível (Ver, por exemplo, Bird et a/., 1988, Science 242:423-426; Hus- . ton ef a/., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554).

Para expressar os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação, os DNAs que codificam cadeias leve e pesada de comprimento parcial ou total, obtidos conforme descrito acima, são inseridos em vetores de expressão tal que os genes são operantemente ligados a sequências de controle transcri- 2 10 cionaletranslacional. Neste contexto, o termo "operantemente ligado" é pre- tendido significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor tal que r sequências de controle transcricional e translacional dentro do vetor servem a sua função pretendida de regular a transcrição e transção do gene de anti- corpo. O vetor de expressão e sequências de controle de expressão são es- colhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão u- sada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de Ú anticorpo podem ser inseridos em vetores separados, ou, maos tipicamente, . ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpos são inseridos no vetor de expressão por métodos padrões (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementa- res no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou grupo de ligação terminal se nenhum sítio de restrição está presente). Antes da inserção das sequên- cias relacionadas de cadeia leve ou pesada de D2E7 ou D2E7, o vetor de expressão já pode transportar sequências de região constante de anticorpo. Por exemplo, uma abordagem para converter as sequências relacionadas a D2E7 ou D2E7 de genes de anticorpos de comprimento total de VH e VL é inserí-las nos vetores de expressão já que codificam região constante de cadeia pesada e região constante de cadeia leve, respectivamente, tal que o segmento de VH é operantemente ligado ao(s) segmento(s) de CH dentro do vetoreo segmento de VL é operantemente ligado ao segmento de CL den- tro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão re- combinant epode codificar um peptídeo dse sinal que facilita secreção da |

- 26/74 cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticor- po pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo de sinal é ligado em estrutu- ra ao amino terminal do gene de cadeia de anticorpo. O petídeo de sinal po- * de ser um petídeo de sinal de imunoglobulina ou um petídeo de sinal heteró- logo(istoé, um petídeo de sinal de uma proteína de não-imunoglobulina).

i Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de ex- pressão recombinantes da revelação transportam sequências regulatórias que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "sequência regulatória" é pretendido incluir promoteres, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação dos ge- nes de cadeia de anticorpo. Tais sequências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymo- logy 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Será apreciado por aque- les técnicos no assunto que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias, pode depender de fatores tais como a ' escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de : proteina desejado, etc. Sequências regulatórias adequadas para expressão de célula hospedeira de mamífeo incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/intensificador de CMV), Vírus 40 Simian (SV40) (tal como o promotor/intensificador de SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor pos- terior maior de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Para descrição adicional de elementos regulatórios virais, e sequências destes, ver, por exemplo, Paten- te dos Estados Unidos No. 5.168.062 por Stinski, Patente dos Estados Uni- dos No. 4.510.245 por Bell et al, e Patente dos Estados Unidos No.

4.968.615 por Schafíner et al.

Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e sequências regu- latórias, os vetores de expressão recombinantes da revelação podem trans- portar sequências adicionais, tais como sequências que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e ge- |

- 271/74 nes marcadores selecionáveis.

O gene marcador selecionável facilita a sele- ção de células hospedeiras em que o vetor foi introduzido (Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas . por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável con- fere resistência a drogas, tais como G418, purominica, blasticidina, higromi- ] cina ou metotrexato, em uma célula hospedeira em que o vetor foi introduzi- do.

Genes marcadores selecionáveis adequados incluem o gene de dihidro- folato reductase (DHFR) (para uso em DHFR células hospedeiras com sele- ção/amplificação de metotrexato) e o neo gene (para seleção de G418). Pa- : 10 ra expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesada e leve é(são) transfectado(s) em uma célula » hospedeira por técnicas padrões.

As várias formas do termo "transfecção" são pretendidas envolverem uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira euca- riótica ou procariótica, por exemplo, eletroporação, lipofecção, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE- dextran e similares.

Ú É possível expressar os anticorpos da revelação em células : hospedeiras eucarióticas ou procarióticas.

Em certas concretizações, a ex- pressão de anticorpos é realizada em células eucarióticas, por exemplo, cé- lulas hospedeiras de mamíferos, para secreção ótima de um anticorpo corre- tamente dobrado e imunologicamente ativo.

Células hospedeiras de mamí- feos exemplares para expressão dos anticorpos recombinantes da revelação incluem células de Ovário de Hamster Chinês (células de CHO) (incluindo DHFR células de CHO, descritas em Urlaub and Chasin, 1980, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, conforme descrito em Kaufman and Sharp, 1982, Mol.

Biol. 159:601-621), células de NSO mieloma, células de COS, células 293 e células SP2/0. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos nas células hospedeiras de mamífeos, os anticorpos são produzidos por cultura das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células

| hospedeiras são crescidas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando-se métodos de purificação de proteína padrões. As células hospedeiras podem também serem usadas para produzir porções de anticorpos intactos, tais como fragmentos de Fab ou moléculas de scFv. É compreendido que variações no procedimento acima estão dentro do escopo ' da presente revelação. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA que codifica ou a cadeia leve ou a cadeia pesa- da (mas não ambas) de um anticorpo anti-TNF-alfa desta revelação.

Tecnologia de DNA recombinante pode também ser usada para 2 10 remover algum ou todo do DNA que codifica qualquer ou ambas da cadeia leve e cadeia pesada que não é necessária para ligação à TNF-a. As molé- - culas expressas de tais moléculas de DNA truncadas são também envolvi- das pelos anticorpos da revelação.

Em adição, anticorpos bi-funcionais podem ser produzidos em que uma cadeia pesada e uma cadeia leve são um anticorpo da revelação e a outra cadeia pesada e cadeia leve são específicas para um antúgeno outro S do que TNF-a por reticulação de um anticorpo da revelação para um segun- ' do anticorpo por métodos de reticulação química padrões. Os anticorpos bi- funcionais podem também serem produzidos por expressão de um ácido —nucléico projetado para codificar um anticorpo bi-funcional.

Em certas concretizações, anticorpos específicos duplos, isto é, anticorpos que ligam TNF-a e um antúgeno não-relacionado usando o mes- mo sítio de ligação, podem ser produzidos por mutação de resíduos de ami- no ácido nas CDRs de cadeia leve e/ou cadeia pesada. Em várias concreti- zações, anticorpos específicos duplos que ligam TNF-a e outro antígeno, por exemplo, outra citoquina pró-inflamatória (tais como, por exemplo, linfotoxi- na, interferon-y, ou interleucina-1) podem ser produzidos por mutação de resíduos de amino ácido na periferia do sítio de ligação do antígeno (Ver, por exemplo, Bostrom ef al., 2009, Science 323:1610-1614). Anticorpos funcio- nais duplos podem ser produzidos por expressão de um ácido nucléico pro- jetado para codificar um anticorpo específico duplo.

Para expressão recombinante de um anticorpo anti-TNF-alfa da |

- 29/74 revelação, a célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão da revelação, o primeiro vetor que codifica um polipeptídeo deri- vado de cadeia pesada e o segundo vetor que codifica um polipeptídeo deri- - vado de cadeia leve.

Tipicamente, os dois vetores cada um contém um mar- cador selecionável separado.

Alternativamente, um vetor simples pode ser ' usado que codifica ambos polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve.

Uma vez que um ácido nucléico que codifica uma ou mais por- ções de D2E7 ou de um anticorpo anti-TNF-alfa com sequências de CDR relavionadas às sequências de CDR de D2E7 é gerado, alterações adicio- naisou mutações podem ser introduzidas na sequência de codificação, por exemplo, para gerar ácidos nucléicos que codificam anticorpos com sequên- - cias de CDR diferentes, anticorpos com afinidade reduzida para o receptor de Fc, ou anticorpos de subclasses diferentes.

Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação podem também serem produzidos por síntese química (por exemplo, pelos métodos descritos em Solid Phase Peptídeo Synthesis, 2"º ed., 1984 The Pierce Chemical Co,., : Rockford, 1lI.). Os anticorpos variantes podem também serem gerados usan- : do-se uma plataforma livre de célula (ver, por exemplo, Chu et al., Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals)). Uma vez que um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação tenha si- do produzido por expressão recombinante, ele pode ser purificado por qual- quer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de i- munoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca de (on, afinidade, particularmente por afinidade para TNF-a após seleção de Proteí- naaAou Proteína G, e dimensionamento de cromatografia de coluna), centri- fugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas.

Adicionalmente, os anticorpos anti-TNF-alfa da presente revelação ou fragmentos destes podem ser fundidos às sequências de polipeptídeo heterólogas descritas aqui ou, de outro modo, conhecidas na técnica para facilitar purificação.

Uma vez isolado, um anticorpo anti-TNF-alfa pode, se desejado, ser adicionalmente purificado, por exemplo, por cromatografia líquida de alto |

- 30/74 desempenho (Ver, por exemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Bioche- mistry AND Molecular Biology (Work e Burdon, eds., Elsevier, 1980)), ou por cromatografia de filtração de gel em uma coluna Superdex"" 75 (Pharmacia - Biotech AB, Uppsala, Sweden). 13 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE ANTICORPOS ANTI-TNF-ALFA

' Em certas concretizações, os anticorpos anti-TNF-alfa da reve- lação têm certas atividades biológicas, tais como competição com D2E7 pa-

ra ligação a TNF-a ou neutralização da atividade de TNF-a.

Consequentemente, em certas concretizações, os anticorpos an- ti-TNF-alfa da revelação competem com D2E7 para ligação a TNF-a.

A ca- pacidade de competor para ligação a TNF-a pode ser testada usando-se um r ensaio de competição.

Em um exemplo de um ensaio de competição, TNF-a é aderido em uma superfície sólida, por exemplo, uma placa de microcavi- dade, por contato da placa com uma solução de TNF-a (por exemplo, a uma concentração de 1 ua/mlL em PBS durante a noite a 4ºC). A placa é lavada (por exemplo, 0,1% de Tween 20 em PBS) e bloqueada (por exemplo, em " Superblock, Thermo Scientific, Rockford, IL). Uma mistura de quantidade de : sub-saturação de D2E7 biotinilatado (80 ng/mL) e D2E7 não-etiquetado (o anticorpo de "referência") ou anticorpo anti-TNF-alfa de competição (o anti- corpode'"teste"”) em diluição em série (por exemplo, a uma concentração de 2,8 uo/mL, 8,3 ug/mL, ou 25 pug/mL) em tampão de ELISA (por exemplo, 1% de BSA e 0,1% de Tween 20 em PBS) é adicionado às cavidades e as pla- cas são incubadas por 1 hora com oscilação branda.

A placa é lavada, 1pg/mL de HRP-conjugado Streptavidin diluído em tampão de ELISA foi adi- cionado à cada cavidade e as placas incubadas por 1 hora.

As places são lavadas e os anticorpos ligados foram detectados por adição de substrato (por exemplo, TMB, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD). A reação é terminada por adição de tampão de parada (por exemplo, Bio FX Stop Rea- gents, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD) e a absorvência foi medida a650nm usando-se leitora de microplaca (por exemplo, VERSAmax, Mole- cular Devices, Sunnyvale, CA). Variações neste ensaio de competição po- dem também serem usadas para testar competição entre um anticorpo anti-

|

- 31/74 TNF-alfa da revelação e D2E7. Por exemplo, em certos aspectos, o anticor- po anti-TNF-alfa é usado como um anticorpo de referência e D2E7 é usado como um anticorpo de teste.

Adicionalmente, ao invés de TNF-a solúvel, - TNF-a ligado à membrana expresso em superfície de célula (por exemplo, célulasde mamífero tal como 293S) na cultura pode ser usado.

Alternativa- ] mente, ao invés de D2E7 solúvel e anticorpos de teste, aqueles expressos em superfície de célula (por exemplo, células de mamífero tal como 293c18) em cultura podem ser usados também.

Geralmente, cerca de 10º a 10º transfectantes, por exemplo, cerca de 10º transfectantes, são usados.

Ou- : 10 tros formatos para ensaios de competição são conhecidos na técnica e po- dem ser empregados. . Em várias concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção reduz a ligação de D2E7 etiquetado por pelo menos 40%, por pelo me- nos 50%, por pelo menos 60%, por pelo menos 70%, por pelo menos 80%, 15 por pelomenos 90%, ou por uma percentagem variando entre qualquer dos valores precedentes (por exemplo, um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação ' reduz a ligação de D2E7 etiquetado por 50% a 70%) quando o anticorpo an- . ti-TNF-alfa é usado a uma concentração de 0,08 ug/mL, 0,4 pg/ml, 2 pg/mL, pg/ml, 50 pa/mL, 100 po/mL, ou a uma concentração variando entre qualquer dos valores precedentes (por exemplo, a uma concentração vari- ando de 2 pyg/mL a 10 pyo/mL). Em outras concretizações, D2E7 reduz a ligação de um anticor- po anti-TNF-alfa etiquetado da revelação por pelo menos 40%, por pelo me- nos 50%, por pelo menos 60%, por pelo menos 70%, por pelo menos 80%, — porpelomenos 90%, ou por uma percentagem variando entre qualquer dos valores precedentes (por exemplo, D2E7 reduz a ligação de um anticorpo anti-TNF-alfa etiquetado da revelação por 50% a 70%) quando D2E7 é usa- do a uma concentração de 0,4 ug/mL, 2 ug/mL, 10 pa/mL, 50 po/mL, 250 Vpg/mL ou a uma concentração variando entre qualquer dos valores prece- dentes (porexemplo, a uma concentração variando de 2 ug/mL a 10 pg/mL). Em outros aspectos, um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação i- nibe atividade de TNF-a em uma faixa de ensaios in vitro, tais como citotoxi- |

- 32/74 cidade de célula, mitogênese, indução de citoquina, e indução de moléculas de adesão.

Alternativamente, a atividade de um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação pode ser medida por ensaios in vitro usando-se TNF-alfa ligado à - membrana naturalmente ou recombinantemente expresso nas células, tais como capacidade para induzir sinalização reversa, indução de citoquina, in- ' dução de moléculas de adesão, CDC e ADCC.

Um ensaio de neutralização de TNF-a exemplar que need a inibição de citotoxicidade de TNF-a solúvel usando-se células sensíveis a TNF-a (por exemplo, L929) é descrito abaixo.

Outros ensaios de citotoxicidade de TNF-a podem também serem usados para avaliara atividade dos anticorpos anti-TNF-alfa da revelação.

Desse modo, em uma concretização exemplar, ensaios de cito- - toxicidade de anti-TNF-a proporcionam colocação de 3 x 10º células de mu- rina L929 em cavidades individuais de uma placa de microtitulação de 96 cavidades de fundo redondo.

As células são incubadas durante a noite a 37ºC em uma incubadora de 5% de CO> umidificada.

No dia seguinte, dilui- ções em série do anticorpo anti-TNF-alfa (por exemplo, 0,712 ug/mL, 0,949 " po/mL, 1,27 ug/mL, 1,69 po/mL, 2,25 pg/ml. ou 3 ug/mL) são preparadas em . 25 ul de meio livre de soro e adicionadas às células (por exemplo, concen- tração final em 150 uL de cultura é 119 ng/ml, 158 na/mL, 211 ng/mL, 282 ng/ml, 375 ng/ml ou 500 ng/mL). Após uma incubação de 2 horas a 37ºC, 5% de CO, TNF-a é adicionado a concentração final de 40 ng/mL (por e- xemplo, 25uL de 240 ng/mL) e as células foram adicionalmente incubadas por 48 horas a 37ºC, 5% de CO». As cavidades são classificadas por citoto- xicidade conforme comparadas às placas de controle (que em certas concre- tizações foram tratadas com TNF-a que não foram incubadas com um anti- corpo anti-TNF-alfa, por exemplo, foram incubadas com um anticorpo de controle de isótopo e, em outras concretizações, foram tratadas com D2E7) usando-se um ensaio de viabilidade (por exemplo, CellTiter-Blue, Promega, Madison, WI). Outros formatos para ensaios de neutralização de TNF-a são conhecidos na técnica, e podem ser empregados.

Em várias concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção neutraliza TNF-a por pelo menos 30%, por pelo menos 40%, por pelo |

: 33/74 menos 50%, por pelo menos 60%, por pelo menos 70%, por pelo menos 80%, por pelo menos 90%, ou por uma percentagem variando entre qual- quer dos valores precedentes (por exemplo, um anticorpo anti-TNF-alfa da - revelação neutraliza atividade de TNF-a por 50% a 70%) quando o anticorpo anti-TNF-alfa é usado a uma concentração de 2 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, ' 20 ng/mL, 0,1 po/mL, 0,2 pua/mL, 1 po/mL, 2 ug/mL, 5 po/mL, 10 pa/mL, 20 UVg/mL, ou a uma concentração variando entre qualquer dos valores prece- dentes (por exemplo, a uma concentração variando de 1 ug/ml a 5 po/mL). Em algumas concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação é pelo menos 80% mais efetivo, pelo menos 90% mais efetivo, pelo menos 100% mais efetivo, pelo menos 110% mais efetivo, pelo menos 125% mais efetivo . ou pelo menos 150% mais efetivo, e até 110% mais efetivo, até 125% mais efetivo, até 150% mais efetivo ou até 200% mais efetivo como D2E7 na neu- tralização de TNF-a, ou qualquer faixa entre qualquer par dos valores prece- dentes (por exemplo, 80% a 125% mais efetivo como D2E7 ou 125% a 200% mais efetivo como D2E7 na neutralização de TNF-a). " Em certas concretizações, os anticorpos anti-TNF-alfa da reve- . lação têm uma alta afinidade de ligação para TNF-a.

Em concretizações específicas, os anticorpos anti-TNF-alfa de uma presente revelação têm constantes de taxa de associação específicas (valores de Ko, Ou k;), cons- tantes de taxa de dissociação(Kor ou kg values), constantes de afinidade (va- lores Ka), constantes de dissociação (valores Kp) e/ou valores ICso.

Em cer- tos aspectos, tais valores são selecionados das seguintes concretizações. 14 PROPRIEDADES CINÉTICAS DE ANTICORPOS ANTI-TNE-ALFA Em uma concretização específica, um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação se liga a TNF-a com uma ko, de pelo menos 10º Ms, pelo me- nos 5 X 10º Ms”, pelo menos 10º Ms, pelo menos 5 X 10º Ms”, pelo menos 107 Ms”, pelo menos 5 X 10º Ms”, pelo menos 10º Ms, ou com uma ko, de qualquer faixa entre qualquer par dos valores precedentes (por —exemplo,5X10ºa5X10º M's* ou 10º to 10º Ms”). Em outra concretização, um anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção se liga a TNF-a com uma taxa de k. de 5X 10º s* ou menos, 10 s ou |

. 34/74 menos, 5 X 10? s” ou menos, 10? s* ou menos, 5 X 10? s* ou menos, 10? s ou menos, 5 X 10º sor menos, 10º s* ou menos, 5 X 10º s ou menos, 10º s ou menos, 5X 10º s ou menos, 10º s ou menos, 5 X 107 s” ou - menos, 107 s* ou menos, 5 X 10º s” ou menos, 10º s ou menos, 5 X 10º sºoumenos, 10º s* ou menos, 5 X 10º s* ou menos, 10º s* ou menos, : ou com uma taxa de k,.x de qualquer faixa entre qualquer par dos valores precedentes (por exemplo, 5X 10º a 10º 5, ou 5X 10º a 5X 10 s7).

Em outra concretização, um anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção se liga a TNF-a com uma Ka (Kon/Kos) de pelo menos 10º* nM”, pelo me- 2 10 nos5X10" NM, pelo menos 10? nM”, pelo menos 5 X 10"? nM”, pelo menos 10º? nM”, pelo menos 5 X 10"? nM”, pelo menos 10"* nM”, pelo - menos 5 X 10"** nM”, pelo menos 10º nM'', pelo menos 5 X 10º nM”, pelo menos 10ºº nM”, pelo menos 5 X 10º nM”, pelo menos 10" nM”, pelo menos 5 X 10" nM”, pelo menos 10º nM”, pelo menos 5 X 10º? nM”, pelo menos 10" nM”, pelo menos 5 X 10º nM”, pelo menos 10º nM”, pelo me- nos 5 X 10ºº nM”, pelo menos 10º nM”, pelo menos 5 X 10º* nM”, pelo 1 menos 10º? nM”, pelo menos 5 X 10º nM”, pelo menos 10º nM”, pelo : menos 5 X 10º nM”, pelo menos 10º* nM”, pelo menos 5 X 10ºº nM”, ou com uma k, de qualquer faixa entre qualquer par dos valores precedentes (porexemplo,5X10"a10ºnM”, ou 10º a 5X10ºnM).

Em outras concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção se liga a TNF-a com uma kp (Kot/Kon) de 5 X 10º nM ou menos, 10º nM ou menos, 5 X 10º nM ou menos, 10º nM ou menos, 5 X 10º nM ou menos, 10º nM ou menos, 5 X 10º nM ou menos, 10º nM ou menos, 5 X 10º nM ou menos, 10º nM ou menos, 5 X 10º nM ou menos, 100 nM ou menos, 90 nM ou menos, 80 nM ou menos, 70 nM ou menos, 60 nM ou menos, 50 nM ou menos, 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou me- nos, 3,8 nM ou menos, 2 nM ou menos, 1,5 nM ou menos, 1 nM ou menos, 5 X 10 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 X 10? nM ou menos, 10? nM ou —menos,5X10ºnM ou menos, 10º nM ou menos, 5 X 10º nM ou menos, 10º * nM ou menos, 5 X 10º nM ou menos, 10º nM ou menos, 5 X 10º nM ou menos, 10º nM ou menos, ou com uma kp de qualquer faixa entre qualquer |

. 35/74 par dos valores precedentes (por exemplo, 5 X 107 a 50 NM, ou 15nMa 5X 10º nM).

Em certas concretizações específicas, um anticorpo TNF-a da - revelação se liga a TNF-a com uma kp (Kort/Kon) entre aproximadamente 0,1 nMe aproximadamente 1 nM, ou aproximadamente 0,1 nM e aproximada- ' mente 2 nM, ou aproximadamente 0,1 nM e aproximadamente 3 nM, ou a- proximadamente 0,1 nM e aproximadamente 4 nM, ou aproximadamente 0,1 NM e aproximadamente 5 nM, ou aproximadamente 0,1 nM e aproximada- mente 6 nM, ou aproximadamente 0,1 nM e aproximadamente 7 nM, ou a- proximadamente 0,1 nM e aproximadamente 8 nM, ou aproximadamente 0,1 nM e aproximadamente 9 nM, ou aproximadamente 0,1 nM e aproximada- - mente 10 nM, ou entre aproximadamente 0,01 nM e aproximadamente 0,1 NM, ou entre aproximadamente 0,01 nM e aproximadamente 1 nM, ou entre aproximadamente 0,01 nM e aproximadamente 2 nM, ou entre aproximada- mente 0,01 nM e aproximadamente 3 nM, ou entre aproximadamente 0,01 nM e aproximadamente 4 nM, ou entre aproximadamente 0,01 nM e aproxi- ' madamente 5 nM, ou entre aproximadamente 0,01 nM e aproximadamente 6 NM, ou entre aproximadamente 0,01 nM e aproximadamente 7 nM, ou entre aproximadamente 0,01 nM e aproximadamente 8 nM, ou entre aproximada- mente0,01nM e aproximadamente 9 nM, ou entre aproximadamente 0,6 nM e aproximadamente 1,1 nM, ou entre aproximadamente 0,7 nM e aproxima- damente 1,2 nM, ou entre aproximadamente 0,5 e aproximadamente 5 nM. Em outras concretizações específicas, um anticorpo anti-TNF-alfa se liga a TNF-a com uma kp (Kos/Kon) de cerca de 5 nM, cerca de 3,5 nM, cerca de 1,5 —nM,cercade1nM, cerca de 0,5 nM, cerca de 0,1 NM, cerca de 0,05 nM, ou cerca de 0,01 nM. Em concretizações específicas, o valor da kp (Kos/Kon) é determinasdo pelos ensaios bem conhecidos na técnica ou descritos aqui, por exemplo, ELISA, calorimetria de titulação isotérmica (ITC), BlAcore, ou ensaio de polarização fluorescente.

Em algumas concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da reve- lação se liga a TNF-a e inibe a ligação de TNF-a a p55, p75 ou ambos a um valor de ICso de menos do que 5 X 10” nM, menos do que 10” nM, menos do |

' 36/74 que 5 X 10º nM, menos do que 10º nM, menos do que 5 X 10º nM, menos do que 10º nM, menos do que 5 X 10º nM, menos do que 10º nM, menos do que 5 X 10º nM, menos do que 10º nM, menos do que 5 X 10º nM, menos do - que 100 nM, menos do que 90 nM, menos do que 80 nM, menos do que 70 nM,65nM,menos do que 60 nM, menos do que 50 nM, menos do que 40 ' NM, menos do que 30 nM, menos do que 25 nM, menos do que 20 nM, me- nos do que 15 nM, menos do que 12 nM, menos do que 10 nM, menos do que 5 nM, menos do que 1 nM, menos do que 5 X 10 nM, menos do que nM, menos do que 5 X 10? nM, menos do que 10? nM, menos do que 5 210 x 10º nM, menos do que 10º nM, menos do que 5 X 10º nM, ou menos do que 10º nM, ou com um ICs,9 de qualquer faixa entre qualquer par dos valo- “ res precedentes (por exemplo, 5 X 10º a 50 nM, ou 15 nMa 5 X 10º nM). ICso pode ser medido de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, ou descritos aqui, por exemplo, ELISA.

Em outras concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção se liga a TNF-a e neutraliza TNF-a à um valor de ICsoy de menos do que ' 5 X 10” nM, menos do que 10” nM, menos do que 5 X 10º nM, menos do que 10º nM, menos do que 5 X 10º nM, menos do que 10º nM, menos do que 5 X 10º nM, menos do que 10º nM, menos do que 5 X 10º nM, menos do que 10º —nM, menos do que 5 X 10? nM, menos do que 100 nM, menos do que 90 nM, menos do que 80 nM, menos do que 70 nM, 65 nM, menos do que 60 nM, menos do que 50 nM, menos do que 40 nM, menos do que 30 nM, menos do que 25 nM, menos do que 20 nM, menos do que 15 nM, menos do que 12 NM, menos do que 10 nM, menos do que 5 nM, menos do que 1 nM, menos doque5X10nM, menos do que 10 nM, menos do que 5 X 10? nM, me- nos do que 10? nM, menos do que 5 X 10º nM, menos do que 10º nM, me- nos do que 5 X 10º nM, ou menos do que 10º nM, ou com um IC, de qual- quer faixa entre qualquer par dos valores precedentes (por exemplo, 5 X 10” a 50 nM, ou 15 nMa5X10ºnM). Um ensaio de neutralização exemplar que pode ser usado para medir o ICso de um anticorpo anti-TNF-alfa é descrito na Seção 1.5 abaixo.

Em certas concretizações específicas, um anticorpo anti-TNF- |

. 371/74 alfa se liga a TNF-a e inibe a ligação de TNF-a a p55, p75 ou ambos, ou ini- be atividade de TNF-a em um ensaio de neutralização de TNF-a, a um valor de ICso de entre aproximadamente 1 nM e aproximadamente 10 nM, entre - aproximadamente 1 nM e aproximadamente 15 nM, entre aproximadamente 1nMe aproximadamente 20 nM, entre aproximadamente 1 nM e aproxima- ' damente 25 nM, entre aproximadamente 1 nM e aproximadamente 30 nM, entre aproximadamente 1 nM e aproximadamente 40 nM, entre aproxima- damente 1 nM e aproximadamente 50 nM, entre aproximadamente 10 nM e aproximadamente 10º nM, entre aproximadamente 10º nM e aproximada- mente 10º nM, entre aproximadamente 10 nM e aproximadamente 10º nM, entre aproximadamente 10* nM e aproximadamente 10º nM, entre aproxi- - madamente 10º nM e aproximadamente 10º nM, ou entre aproximadamente 10º nM e aproximadamente 10” nM.

Em outras concretizações específicas, um anticorpo anti-TNF- alfaseligaa TNF-a e inibe a ligação de TNF-a a p55, p75 ou ambos, ou ini- be atividade de TNF-a em um ensaio de neutralização de TNF-a, a um valor Í de ICs59 de entre aproximadamente 5 nM e aproximadamente 10 nM, entre aproximadamente 5 nM e aproximadamente 15 nM, entre aproximadamente 10 nM e aproximadamente 15 nM, entre aproximadamente 10 nM e aproxi- madamente 20 nM, entre aproximadamente 10 nM e aproximadamente 30 nM, entre aproximadamente 10 nM e aproximadamente 40 nM, entre apro- ximadamente 10 nM e aproximadamente 50 nM, entre aproximadamente 1 nM e aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 10 nM e aproxima- damente 100 nM, entre aproximadamente 20 nM e aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 30 nM e aproximadamente 100 nM, entre apro- ximadamente 40 nM e aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 50 nM e aproximadamente 100 nM, entre aproximadamente 15 nM e apro- ximadamente 25 nM, ou entre aproximadamente 15 nM e aproximadamente 20 nM.

Em certos aspectos das concretozações precedentes, o ICs9 é medido na presença de TNF-a a uma concentração de 0,001 uM, 0,005 uM, 0,01 UM, 0,05 UM, 0,1 uM, 0,5 UM, 1 uM, 10 UM, 20 UM, 30 UM, 40 UM, 50 |

. 38/74 HM, 60 UM, 70 UM, 80 UM, 90 UM, 100 UM, 200 UM, 300 UM, 400 uM, 500 UM, 600 uM, 700 uM, 800 uM, 900 uM, 1000 UM ou a uma concentração de qualquer faixa entre qualquer par dos valores precedentes (por exemplo, “ 0,01 a 50 UM, ou 10 uM a 100 uM). Em certas concretizações, as propriedades cinéticas de um anti- ] corpo da revelação são comparáveis a, ou aperfeiçoadas relativas ao anti- corpo de D2E7 em um ensaio comparável.

Por exemplo, em certas concreti- zações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação se liga a TNF-a com uma taxa de k., variando de 0,2x a 5x da k.n de D2E7, por exemplo, uma kon de . 10 0,2xda ko, deD2E7, uma k,, de 0,3x da k., de D2E7, uma ko, de 0,4x da Kon de D2E7, uma ko, de 0,5x da kon de D2E7, uma kon de 0,6x da kon de D2E7, - uma ko, de 0,7x da kon de D2E7, uma Ko, de 0,8X da Ko, de D2E7, uma k,., de 0,9x da ko, de D2E7, uma ko, de 1x da ko. de D2E7, uma kon de 1,1x da Kon de D2E7, uma kon de 1,2x da ko, de D2E7, uma kon de 1,ôx da ko, de D2E7, uma ko, de 1,4xda k,, de D2E7, uma ko de 1,5x da kn de D2E7, uma ko, de 1,75x da ko de D2E7, uma ko, de 2x da ko.” de D2E7, uma kon de 2,25x da í kKkon de D2E7, uma kon de 2,5x da kon de D2E7, uma ko, de 2,75x da k., de . D2E7, uma k., de 3x da ko. de D2E7, uma Ko, de 3,5x da Kon de D2E7, uma Kon de 4x da ko, de D2E7, uma Ko, de 4,5x da Ko, de D2E7, uma ko, de 5x da kKkonde D2E7, ou uma ko, variando entre qualquer par dos valores preceden- tes, por exemplo, uma kon de 0,7x-1,5x da Ko." de D2E7, uma ko, de 0,9x-1,3x da kon de D2E7, uma ko, de 0,8x-2x da Ko. de D2E7, uma ko,n de 0,9x-3x da Kon de D2E7, etc.

Em concretozações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação se ligaaTNF-0a com uma taxa de k,« variando de 0,2x a 5x da kor de D2E7, por exemplo, uma kor de 0,2x da kog de D2E7, uma kog de 0,3x da kog de D2E7, uma kog de 0,4x da kog de D2E7, uma kog de 0,5x da Kog de D2E7, uma kog de 0,6x da ka de D2E7, uma ko de 0,7x da kog de D2E7, uma korr de 0,8X da kKor de D2E7, uma kog de 0,9x da kos de D2E7, uma kog de 1x da kog de D2E7, uma kogde1,1xdakogdeD2E7, uma ko de 1,2x da Ko. de D2E7, uma kos de 1,3x da kKog de D2E7, uma kos de 1,4x da ko. de D2E7, uma kog de 1,5x da Korg de D2E7, uma kor de 1,75x da K.« de D2E7, uma kog de 2x da kog de D2E7, |

- 39/74 uma kog de 2,25x da k.s de D2E7, uma kog de 2,5x da kog de D2E7, uma Kot de 2,75x da kos de D2E7, uma ko de 3x da kos de D2E7, uma kog de 3,5x da kog de D2E7, uma kog de 4x da kog de D2E7, uma kog de 4,5x da kog de D2E7, - uma kog de 5x da kos de D2E7, ou uma kog variando entre qualquer par dos valores precedentes, por exemplo, uma ko de 0,7x-1,5x da kKog de D2E7, ' uma kog de 0,9x-1,3x da kog de D2E7, uma kKog de 0,8X-2x da kog de D2E7, uma kog de 0,9x-3x da kor de D2E7, etc.

Em outras concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção se liga a TNF-a com uma ka (Kor/Kder) variando de 0,04x a 25x da k, de D2E7, por exemplo, uma k, de 0,04x da k, de D2E7, uma k, de 0,1x da ka de D2E7, uma k, de 0,25x da k, de D2E7, uma ka de 0,5x da k, de D2E7, , uma k, de 0,6x da ka de D2E7, uma k, de 0,7x da k, de D2E7, uma k, de 0,8x da k, de D2E7, uma k, de 0,9x da ka de D2E7, uma ka de 1x da k, de D2E7, uma k, de 1,1x da k, de D2E7, uma k, de 1,25x da ka de D2E7, uma k.de1,5xda k, de D2E7, uma ka de 1,75x da k, de D2E7, uma ka de 2x da ka de D2E7, uma k, de 2,5x da k, de D2E7, uma k, de 3x da k, de D2E7, " uma k, de 4x da k, de D2E7, uma k, de 4x% da k, de D2E7, uma ka de 5x . da ka de D2E7, uma ka de 7,5x da ka de D2E7, uma k, de 10x da k, de D2E7, uma k, de 12,5x da k, de D2E7, uma k, de 15x da k. de D2E7, uma Kk.de20xdak,de D2E7, uma k, de 25x da ka de D2E7, ou uma k, variando entre qualquer par dos valores precedentes, por exemplo, uma ka de 0,7x- 1,25x da k, de D2E7, uma k, de 0,9x-1,5x da k, de D2E7, uma ka de 0,9x-2x da ka de D2E7, uma k, de 0,8Xx-1,75x da ka de D2E7, uma k,a de 0,9x-5x da ka de D2E7, ou qualquer valor ou faixa que pode ser calculada a partir das taxasde ko, e ker aqui reveladas.

Em outras concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção se liga a TNF-a uma kp (Kaet/Kon) variando de 0,04x a 25x da kp de D2E7, por exemplo uma kr de 0,04x da kp de D2E7, uma kp de 0,1x da kW de D2E7, uma kp de 0,25x da kW de D2E7, uma kp de 0,5x da kp de D2E7, uma kpde0,6xdakpdeD2E7, uma kp de 0,7x da ky de D2E7, uma kp de 0,8x da kp de D2E7, uma kp de 0,9x da kpy de D2E7, uma kp de 1x da ko de D2E7, uma kp de 1,1x da kpy de D2E7, uma ko de 1,25x da kp de D2E7, uma kp de |

. 40/74 1,5x da kpy de D2E7, uma kp de 1,75x da kpy de D2E7, uma kp de 2x da kp de D2E7, uma kp de 2,5x da kpy de D2E7, uma kp de 3x da kpy de D2E7, uma kp de 4x da ko de D2E7, uma ko de 4x% da k” de D2E7, uma kp de 5x da kp de * D2E7, uma kp de 7,5x da kpy de D2E7, uma kp de 10x da k, de D2E7, uma ko de12,5xdakpdeD2E7,uma kp de 15x da kp de D2E7, uma kp de 20x da ko ' de D2E7, uma kp de 25x da ky de D2E7, ou uma kp variando entre qualquer par dos valores precedentes, por exemplo, uma kp de 0,7x-1,25x da kp de D2E7, uma kp de 0,9x-1,5x da kpy de D2E7, uma kp de 0,9x-2x da kp de D2E7, uma kp de 0,8x-1,75x da kp de D2E7, uma kp de 0,9x-5x da kW de 2 10 D2E7,ou qualquer valor ou faixa que pode ser calculada das taxas de k,, e Kaet aqui reveladas.

- Em algumas concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da reve- lação se liga a TNF-a e inibe a ligação de TNF-a a p55, p75 ou ambos a um valor de ICs9 variando de 50% a 200% do ICs5º de D2E7, por exemplo, um

15. 1Cso de 50% do ICso de D2E7, um ICgso de 60% do IC5o de D2E7, um ICs5o de 70% do ICso de D2E7, um ICso de 75% do IC5o de D2E7, um ICso de 80% do Í ICso de D2E7, um ICs5o de 90% do ICso de D2E7, um ICso de 95% do IC59o de ' D2E7, um ICso de 100% do ICso de D2E7, um IC5o de 110% do ICso de D2E7, um ICs9o de 120% do IC; de D2E7, um ICso de 125% do ICs5o de D2E7,umiCso de 130% do ICso de D2E7, um ICso de 140% do IC5o de D2E7, um ICs9 de 150% do ICso de D2E7, um ICs9o de 160% do IC59 de D2E7, um IC5o de 170% do ICs9 de D2E7, um ICs9o de 175% do ICs5o de D2E7, um ICso de 180% do ICs5o de D2E7, um ICs59o de 190% do ICso de D2E7, um 1IC59o de 200% do ICs9 de D2E7, ou um ICs55 de qualquer faixa entre qualquer par dos valores precedentes, por exemplo, um ICso de 75%-125% do ICs5o de D2E7, um ICso de 90%-130% do ICso de D2E7, um 1Cso de 95%-125% do 1ICso de D2E7, um ICso de 90%-110% do IC59 de D2E7, um ICs9o de 90%-180% do IC5o de D2E7, ou um ICs, de 80%-175% do IC5o de D2E7. Em outras concre- tizações, uma sibstituição de CDR simples pode resultar nas diferenças pre- cedentes no lCso conforme comparado à D2E7, pelo que um anticorpo anti- TNF-alfa da revelação pode compreender tal substituição e até 16 substitui- ções adicionais conforme comparadas a D2E7.

|

- 41/74 Em outras concretizações, um anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção se liga a TNF-a e neutraliza TNF-a a um valor de ICso variando de 50% a 200% do ICso de D2E7, por exemplo, um ICs5o de 50% do ICsode D2E7, um . ICso de 60% do ICso de D2E7, um ICs9 de 70% do IC5o de D2E7, um IC5o de 75% dolCso de D2E7, um IC5o de 80% do ICso de D2E7, um IC5o de 90% do ] ICso de D2E7, um ICso de 95% do ICso de D2E7, um IC5o de 100% do IC5o de D2E7, um ICso de 110% do ICso de D2E7, um IC5o de 120% do ICso de D2E7, um 1ICs9 de 125% do ICso de D2E7, um ICso de 130% do ICso de D2E7, um IC59 de 140% do ICsode D2E7, um ICso de 150% do ICs5o de D2E7, umliCso de 160% do ICso de D2E7, um ICs5o de 170% do IC5o de D2E7, um ICso de 175% do ICso de D2E7, um IC5o de 180% do ICsode D2E7, um 1Cso r de 190% do ICsode D2E7, um ICs9 de 200% do IC5o de D2E7, ou um IC59 de qualquer faixa entre qualquer par dos valores precedentes, por exemplo, um ICso de 75%-125% do ICso de D2E7, um IC5o de 90%-130% do IC5o de D2E7, um liCso de 95%-125% do ICso de D2E7, um ICso de 90%-110% do ICs5 de D2E7, um ICs,5 de 90%-180% do ICso de D2E7, ou um ICs59 de 80%-175% do ' ICs5o de D2E7. Em outras concretizações, uma substituição de CDR simples pode resultar nas diferenças precedentes em ICs9 conforme comparada a i D2E7, pelo que um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação pode compreender tal substituição e até 16 substituições adicionais conforme comparadas a D2E7. 15 IMUNOGENICIDADE REDUZIDA DE ANTICORPOS ANTI-TNF-ALFA Em certos aspectos, a presente revelação proporciona anticor- pos anti-TNF-alfa tendo imunogenicidade reduzida conforme comparada a D2E7.A presente revelação também proporciona anticorpos anti-TNF-alfa tendo substituições múltiplas de amino ácido em suas CDRs conforme com- paradas às CDRs de D2E7, no qual pelo menos uma substituição reduz a imunogenicidade do anticorpo conforme comparada a D2E7. Em certas con- cretizações, a imunogenicidade reduzida resulta de uma ou mais substitui- ções de amino ácido que resultam na eliminação ou impedimento de um ou mais epítopes de célula T.

Em certos aspectos, os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação |

- 421/74 tendo imunogenicidade reduzida têm atividade biológica comparável ou a- perfeiçoada conforme comparada a D2E7, por exemplo, afinidade para TNF- a ou neutralização de atividade de TNF-a.

Tais propriedades podem ser tes- - tadas, por exemplo, pelos métodos descritos na Seção 7.3 acima.

Em certas concretizações, a imunogenicidade de um anticorpo ' TNF-a da revelação é reduzida relativa ao anticorpo de D2E7. Tais anticor- pos geralmente têm sequências variantes relativas à região variável de ca- deia pesada e/ou cadeia leve em regiões correspondentes a SEQ ID NO:81 e/ou SEQ ID NO:82, e/ou SEQ ID NO:83. Os anticorpos terão geralmente uma, duas ou três substituições de amino ácido em uma, duas ou todas as três sequências correspondentes a SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, e SEQ - ID NO:83, embora até quatro ou cinco substituições uma, duas ou todas as três regiões sejam aqui contempladas.

Substituições de CDR-L1 exemplares que produzem anticorpos com imunogenicidade inferior conforme comparadas a D2E7 são listadas na Tabela 11. Os anticorpos da revelação podem compreender qualquer das ' substituições ou combinações de substituições listadas na Tabela 11, e, op- : cionalmente, uma ou mais substituições adicionais, tais como mutações de CDR em qualquer das Tabelas 12-25, simplesmente ou em combinação.

Conforme usado na presente revelação, o termo "imunogenici- dade reduzida" indica que a sequência variante conforme comparada a SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 ou SEQ ID NO:83 induz uma resposta proliferativa reduzida nas células mononucleares de sangue periféricas conforme compa- rada ao peptídeo de SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, ou SEQ ID NO:83, res- pectivamente.

Um ensaio de proliferação exemplar que pode ser usado para avaliar a resposta proliferativa é colocado na Seção 8 abaixo.

A resposta proliferativa reduzida pode ser refletida em termos da percentagem dos res- pondedores, o índice de estimulação, ou ambos.

Em outras concretizações, conforme comparadas às a peptídeo tendo the sequência of SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, ou SEQ ID NO;83, the variant sequência results in pelo menos 25% fewer responders, in pelo menos 30% fewer responders, in pelo menos 35% fewer responders, in pelo |

- 43/74 menos 40% fewer responders, in pelo menos 45% fewer responders, in pelo menos 50% fewer responders, in pelo menos 60% fewer responders, in pelo menos 65% fewer responders, in pelo menos 70% fewer responders, in pelo - menos 75% fewer responders, in pelo menos 80% fewer responders, in pelo menos 85% fewer responders, in pelo menos 90% fewer responders, in pelo ' menos 95% fewer responders, 100% fewer responders, ou a reduction in responders in a faixa entre qualquer of the valores precedentes, por exem- plo, 25%-75% fewer responders, 50%-90% fewer responders, 60%-100% fewer responders, 70%-90% fewer responders, ou similares. Em outras concretizações, the variant sequência results in a in- dice de estimulaçãothat é pelo menos 5% menos, pelo menos 10% menos, . pelo menos 15% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 25% menos, pelo menos 30% menos, pelo menos 35% menos, ou pelo menos 40% me- nos do que the índice de estimulaçãoelicited by a peptídeo of SEQ ID NO:81, SEQIDNO:82, ou SEQ ID NO;83, respectivamente, ou results in a índice de estimulação reduced by a faixa entre qualquer dos valores precedentes con- ' forme comparadas às a peptídeo of SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, ou SEQ ID NO;83, por exemplo, 5%-20% menos, 10%-30% menos, 25%-35% me- nos, 30%-40% menos, ou similares.

Concretizações exemplares de anticorpos anti-TNF-alfa com i- munogenicidade reduzida conforme comparadas a D2E7 compreendem uma ou mais das substituições de CDR ou combinações de substituições coloca- das na Tabela 11.

16 —CONJUGADOS DE ANTICORPO Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação incluem conjugados de anticorpo que são modificados, por exemplo, pela fixação covalente de qual- quer tipo de molécula ao anticorpo, tal que a fixação covalente não interfere com a ligação a TNF-a.

Em certos aspectos, um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação pode ser conjugado a uma porção efetuadora ou a uma etiqueta. O termo "porção efetuadora", conforme aqui usado, inclui, por exemplo, agentes anti- neoplásticos, fármacos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exem- |

- 44/74 plo, enzimas, outro anticorpo ou fragmentos de anticorpo, polímeros sintéti- cos ou que ocorrem naturalmente, ácidos nucléicos (por exemplo, DNA e RNA), radionuclídeos, particularmente radioiodo, radioisótopos, metais que- “ latados, nanopartículas e grupos repórteres tais como compostos fluorescen- tes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia de NMR ou : ESR.

Em um exemplo, anticorpos anti-TNF-alfa podem ser conjugados a uma porção efetuadora, tal como um agente citotóxico, um radionuclideo ou porção de fármaco para modificar uma dada resposta biológoica.

A por- ção efetuadora pode ser uma proteína ou polipeptídeo, tal como, por exem- i plo e sem limitação, uma toxina (tais como abrin, ricin A, Pseudomonas exo- . toxin, ou Diphtheria toxin), uma molécula de sinalização (tais como a- interferon, B-interferon, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta ou ativador de plasminogênio de tecido), um agente trombótico ou um agente anti-angiogênico (por exemplo, angiostatin ou en- dostatin) ou um modificador de resposta biológicar tal como uma citoquina ] ou fator de crescimento (por exemplo, interleucina-1 (IL-I), interleucina-2 (IL- : 2), interleucina-6 (IL-6), fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito (G- CSF),oufatorde crescimento de nervo (NGF)). Em outro exemplo, as porções efetuadoras podem ser citotoxi- nas ou agentes citotóxicos.

Exemplos de citotoxinas e agentes citotóxicos incluem taxol, citocalasin B, gramicidin D, brometo de etidium, emetina, mi- tomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubi- cin, daunorabicin, dihidroxo antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, acti- nomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes.

Porções efetuadoras também incluem, mas não são limitadas a, antimetabólitos (por exemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilatação (por exemplo, mecloretamina, thioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomusti- na (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mi- |

: 451/74 tomíicina C5 e cis-diclorodiamina platina (11) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicin (anteriormente daunomicina) e doxorubicin), an- tibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomi- - cina, mitramíicina, antramicina (AMC), calicheamicinas ou duocarmicinas), e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). ' Outras porções efetuadoras podem incluem radionuclídeos tais como, mas não limitados a, "In e ºY, Lu", Bismuto??, Califórnio?* Irí- dio”? e Tungstênio Reênio'”* e fármacos tais comno, mas não limitados a, alquilfosfocolinas, inibidores de topoisomerase |, taxóides e suramin.

Técnicas para conjugação de tais porções efetuadoras a anti- corpos são bem conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Hellstrom et al. - Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., at pp. 623-53 (Robinson et al, eds., 1987)); Thorpe et a/., 1982, Immunol.

Rev. 62:119-58 and Dubowchik et al, 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123). Em um exemplo, o anticorpo ou fragmento deste é fundido via uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação de peptídeo), através do " N-terminal ou do C-terminal do anticorpo ou internamente, a uma sequência de amino ácido de outra proteína (ou porção desta; por exemplo, pelo menos uma porção de 10, 20 ou 50 amino ácidos da proteína). O anticorpo, ou fragmento deste, pode se articular a outra protein no N-terminal do domínio constante do anticorpo.

Procedimentos de DNA recombinantes podem ser usados para criar tais fusões, por exemplo, conforme descrito em WO 86/01533 e EP0392745. Em outro exemplo a molécula efetuadora pode aumentar a meia-vida in vivo, e/ou intensificar a distribuição de um anticorpo através de ima barreira pitelial para o sistema imune.

Exemplos de molécula efetuadoras adequadas deste tipo incluem políleros, albumina, proteínas de ligação de albumina ou compostos de ligação de albumina tais como aque- les descritos em WO 2005/117984. Em certos aspectos, um anticorpo anti-TNF-alfa é conjugado a uma toxinade molécula pequena.

Em certas concretizações exemplares, um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação é conjugado a uma dolastatina ou aná- logos pepitídicos de dolostatina ou derivados, por exemplo, uma auristatina |

. 46/74 (Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.635.483 e 5.780.588). A porção de fármaco de dolastatina ou auristatina pode ser fixada ao anticorpo através de seu N (amino) terminal, C (carboxil) terminal, ou internamente (WO “ 02/088172). Concretizações de auristatina exemplars incluem as porções de fármaco monometilauristatina N-terminal ligada DE e DF, conforme revelado ' na Patente dos Estados Unidos No. 7.498.298, que é, desse modo, incorpo- rada por referência em sua totalidade (revelando, por exemplo, articuladores e métodos de preparação de compostos de monometilvalina tais como MMAE e MMAF conjugados a articuladores). Em outras concretizações exemplares, toxinas de molécula pe- : quena incluem, mas não são limitadas a, calicheamicina, maitansina (Paten- . te dos Estados Unidos No. 5.208.020), tricoteno, e CC1065. Em uma concre- tização da revelação, o anticorpo é conjugado a uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 moléculas de maitansina por molécula de anticorpo). A maitansina pode, por exemplo, ser convertida a May-SS-Me que pode ser reduzida a May-SH3 e reagida com um anticor- M po (Chari ef a/., 1992, Cancer Research 52: 127-131) para gerar um anticor- po maitansinóide ou conjugado de fusão de maitansinóide. Análogos estrutu- rais de calicheamicina que podem também seem usados incluem, mas não sãolimitados a, v1', yv3', v3' N-acetila- v/', PSAG, e 84), (Hinman et a/., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al, 1998, Cancer Research 58:2925-2928; Patente dos Estados Unidos No. 5.714.586; Patente dos Es- tados Unidos No. 5.712.374; Patente dos Estados Unidos No. 5.264.586; Patente dos Estados Unidos No. 5.773.001).

Anticorpos da revelação podem também serem conjugados a li- possomos para distribuição alvo (Ver, por exemplo, Park et al., 1997, Adv. Pharmacol. 40:399—435; Marty & Schwendener, 2004, Methods in Molecular Medicine 109:389-401).

Em um exemplo, os anticorpos da presente revelação podes ser fixados a porções de polifetolenoglicol) (PEG). Em um exemplo particular o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as porções PEG podem ser fixadas através de qualquer cadeia lateral de amino ácido disponível ou grupo fun- |

. 471/74 cional de amino acudo terminal localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo, qualquer grupo amino livre, imino, tiol, hidroxila ou carboxila. Tais amino ácidos podem ocorrer naturalmete no fragmento de anticorpo ou po- - dem ser projetados no fragmento usando-se métodos de DNA recombinan- tes. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.219.996. Sítios ' múltiplos podem ser usados para fixar duas ou mais moléculas de PEG. As porções de PEG podem ser covalentemente ligadas através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no fragmento de anticorpo. Onde um gripo tiol é usado como o ponto de fixação, porções efetuadoras apropriadamente ativadas (por exemplo, derivados seletivos de tiol tais como i derivados de maleimidas e cisteína) podem ser usados. ; Em um exemplo específico, um conjugado de anticorpo anti- TNF-alfa é um fragmento Fab' modificado que é PEGylatado, isto é, tem PEG (poli(etilenoglicol)) covalentemente fixado a este, por exemplo, de a- cordo com o método revelado em EPO948544. Ver também Poly (ethylene- glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris ' (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American | Chemical Society, Washington D.C., 1997); and Bioconjugation Protein Cou- pling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds,, Grove Publishers, New York, 1998); and Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. PEG pode ser fixado a uma cisteína na região de articulação. Em um exemplo, um fragmento Fab modificado por PEG tem um grupo maleimida covalentemente ligado a um grupo tiol simples em uma região de articulação modificada. Um resíduo de lisina pode ser covalente- mente ligado ao grupo de maleimida e cada um dos grupos amina no resí- duo de lisina pode ser fixado a um polímero de metoxipoli(etilenoglico!l) tendo um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total do PEG fixado ao fragmento Fab pode, portanto, ser aproximadamente

40.000 Da. A palavra "etiqueta" quando aqui usada se refere a um composto ou composição detectável que pode ser conjugado diretamente ou indireta- |

. 48/74 mente a um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação. A etiqueta pode em si ser detectável (por exemplo, etoquetas de radioisótopo ou etiquetas fluorescen- tes) ou, no caso de uma etiquita enzomática, pode catalisar alteração quíimi- - ca de um composto de substrato ou composição que seja detectável. Por- ções fluorescentes úteis incluem, mas não são limitadas a, fluoresceína, flu- ' oresceína isotiocianato, rodamina, 5- dimetilamina-1-nafhalenosulfonila clo- reto, ficoeritrin e similares. Etiquetas enzimáticas úteis incluem, mas não são limitadas a, fosfatasealcalina, peroxidase de rábano silvestre, glicose oxida- se, e similares. Os conjugados adicionais de anticorpo anti-TNF-alfa que são ú- teis para, inter alia, propostas de diagnóstico, são descritos na Seção 1.7 : abaixo.

1.77 USOS DIAGNÓSTICOS DE ANTICORPOS ANTI-TNF-ALFA Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação, incluíndo aqueles an- ticorpos que foram modificados, por exemplo, por biotinilação, peroxidase de rábano silvestre, ou qualquer outra porção detectável (incluindo aqueles ' descritos na Seção Erro! Fonte de referência não encontrada.), podem ser vantajosamente usados para propostas de diagnóstico. Em particular, os anticorpos anti-TNF-alfa podem ser usados, porexemplo, mas não limitados a, para purificar ou detectar TNF-a, incluindo ambos métodos de diagnóstico in vitro e in vivo. Por exemplo, os anticorpos têm uso em imunoensaios para qualitativamente e quantitativamente medir níveis de TNF-a em amostras biológicas. Ver, por exemplo, Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Labo- ratory Press, 1988), que é incorporado por referência aqui em sua totalidade. Em uma concretização, os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação podem ser usados para detecção e quantificação de níveis de TNF-a no soro. A presente revelação adicionalmente envolve anticorpos ou fragmentos destes conjugados a um agente diagnóstico. Os anticorpos po- dem ser usados diagnosticamente, por exemplo, para detectar expressão de um alvo de interesse em células específicas, tecidos, ou soro; ou para moni- torar o desenvolvimento ou progressão de uma resposta imunolígica como |

- 49/74 parte de um procedimento de teste clínico para, por exemplo, determinar e eficácia de um dado regime de tratamento. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo a uma substância detectável. Exemplos de - substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materi- ais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, ma- : teriais radioativos, metais de emissão de positron usando várias tomografias de emissão de positron, e íons de metal paramagnético não-radioativos. À substância detectável pode ser acoplada ou conjugada ou diretamente ao anticorpo (ou fragmento deste), ou indiretamente, através de um intermediá- rio (tal como, por exemplo, um articulador conhecido na técnica) usamdo-se técnicas conhecidas na técnica. Exemplos de etiquetas enzimáticas incluem s luciferases (por exemplo, luciferase de mosca do fogo e luciferase bacterial; Patente dos Estados Unidos No. 4.737.456), luciferin, 2,3-dihidroftalazina- dionas, malato dehidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano silvestre (HRPO), fosfatase alcalina, B-galactosidase, acetolcolineste- rase, glucoamolase, lisozima, sacarídeo oxidases (por exemplo, glicose oxi- ' dase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato dehidrogenase), oxidases hete- rocíclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, micropero- xídase, e similares. Exemplos de complexos de grupos prostéticos incluem estreptavidin/biotina e avidin/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbelliferona, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrin; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de mate- riais bioluminescentes incluem luciferase, luciferin, e aequorin; e exemplos dematerial radioativo adequado incluem 21, "991, ln ou Tc.

Uma revelação proporciona a detecção de expressão de TNF-a, compreendendo contactar uma amostra biológica (células, tecido, ou fluido corpóreo de um indivíduo) usando um ou mais anticorpos anti-TNF-alfa da revelação (opcionalmente conjugado a porção detectável), e detecção se ou nãoa amostra é positiva para expressão de TNF-a, ou se a amostra tal ex- pressão alterada (por exemplo, reduzida ou aumentada) conforme compara- da a uma amostra de controle.

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" 50/74 Doenças que podem ser diagnosticadas usando-se os presentes métodos incluem, mas não são limitadas a, as doenças aqui descritas. Em certas concretizações, o tecido ou fluido corpóreo é sangue peroférico, leu- - cócitos de sangue periférico, tecidos de biópsia tais como biópsias de pul- mãooupele,e tecido. , 18 MÉTODOS TERAPÊUTICOS USANDO ANTICORPOS ANTI-TNF-

ALFA 181 Benefícios Clínicos Os anticorpos TNF-a da presente revelaçãoare úteis para trata- mento de distúrbios ou sintomas de várias patologias imunes e autoimunes, | bem como doenças inflamatórias. Patologias e doenças relacionadas a TNF- - a que podem ser tratadas com os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação in- cluem, mas não são limitadas a, as seguintes: e Patologias agudas e crônicas imunes e autoimunes, tais como eritematose de lúpus sistêmica, artrite reumatóide, tiroidose, doença de en- xerto versus hospedeiro, escleroderma, diabetes mellitus, doença de Grave, ' e similares; e Infecções, incluindo, mas não limitadas a, síndrome de septi- cemia, caquexia, colapso e choque circulatório resultante de infecção bacte- rial aguda e crônica, doenças infecciosas parasíticas crônicas e agudas e/ou doenças infecciosas bacteriais, virais ou fungais, tais como AIDS (incluindo sequelas tais como caquexia, distúrbios autoimunes, complexo de demência e infecções da AIDS); + Doenças inflamatórias, tais como patologias inflamatórias crô- nicas e patologias inflamatórias vasculares, incluindo patologias inflamató- rias crônicas, tais como sarcoidose, doença de intestino inflamória crônica, colite ulcerativa, e patologia de Crohn e patologias inflamatórias vasculares, tais como, mas não limitadas a, coagulação intravascular disseminada, ate- rosclerose, e patologia de Kawasaki; + Doenças neurodegenerativas, includindo, mas não limitadas a, doenças de demielinação, tais como esclerose múltipla e mielitus transversa aguda; distúrbios extrapiramidal e cerebelar, tais como lesões do sistema |

: 51/74 corticoespinhal; distúrbios do gânglio basal ou distúrbios cerebelares; distúr- bios de movimento hipercinético, tais como Coréia de Huntington e coréia senil, distúrbios do movimento induzidos por droga, tais como aqueles indu- - zidos por drogas que bloqueiam o SNC, receptores de dopamina; distúrbios do movimento hipocinético, tal como doença de Parkinson; Paralisia de su- ' pranúcleo progressiva, Distúrbios Cerebelares e Espinocerebelares, tais co- mo lesões estruturais do cerebelo; degenerações espinocerebelares (ataxia espinhal, ataxia de Friedreich, degenerações corticais cerebelares, degene- rações de sistemas múltiplos (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, e Ma- chado-Joseph); e distúrbios sistêmicos (doença de Refsum, abetalipoprote- mia, ataxia, telangiectasia, e distúrbio de sistema multi-mitocondrial); distúr- . bios de núcleo de demielinação, tais como esclerose múltipla, mielite trans- versa aguda; distúrbios da unidade motora, tais como atrofias musculares neurogênicas (degeneração da vélula de chifre anterior, tais como esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal infantil e atrofia muscular espi- nhal juvenil); doença de Alzheimer; Síndrome de Down na meia idade; Do- ' ença de corpo de Lewy difusa; Demência Senil do tipo de corpo de Lewy, síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoolismo crônico; doença de Creutzfeldt- : Jakob; panencefalite de esclerosação subaguda, doença de Hallerrorden- Spatz-e Demência pugilística, ou qualquer subconjunto destes; + Patologias malignas envolvendo tumors de secreção de TNF-a ou outras malignidades envolvendo TNF-a, tais como, mas não limitadas a, leucemias (aguda, mielocítica crônica, linfovítica crônica e/ou síndrome mie- lodospástica); linfomas (linfomas de Hodgkin e não-Hodgkin, tais como lin- fomas malignos (linfoma de Burkitt ou Micose fungóides), e e Hepatite induzida pelo álcool.

Em certas concretizações específicas, os anticorpos da revela- ção são usados para tratar um ou mais de; + Artrite reumatóide (RA) moderada a severa em adultos. + Artrite idiopática juvenile poliarticular moderada a severa (JIA) em crianças de 4 anos de idade e mais velhas. + Artrite psoriática (PSA) em adultos. |

. 52/74 e Espondilite de anquilosação (AS) em adultos. « Doença de Crohn moderada a severa (CD) em adultos que não responderam bem a tratamentos convencionais. - e Psoríase de plava vdônica moderada a severa (Ps) em adultos. Consequentemente, a presente revelação proporciona métodos ' de tratamento de qualquer das doenças precedentes em um paciente em necessidade deste, compreendendo: administrar ao paciente um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação. Opcionalmente, referida administração é repeto- da, por exemplo, após um dia, dois dias, três dias, cinco dias, uma semana, duas semanas, três semanas, um mês, cinco semanas, seis semanas, sete semanas, oito semanas, dois meses, ou três meses. A administração repeti- . da pode ser na mesma dose ou emu ma dose diferente. A administração pode ser repetida uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco ve- zes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, dez vezes, ou mais.

Por exemplo, de acordo com certos regimes de dosagem um paciente rece- be terapia de anti-TNF-a por um período prolongado de tempo, por exemplo, " 6 meses, 1 ano ou maos. A quantidade de anticorpo anti-TNF-alfa adminis- trada ao paciente é, em certas concretizações, uma quantidade terapeutica- mente efetiva, Conforme aqui usado, uma quantidade "terapeuticamente efe- tiva" de anticorpo TNF-a pode ser administrada como uma dose simples ou sobre o curso de um regime terapêutico, por exemplo, sobre o cirso de uma semana, duas semanas, três semanas, um mês, três meses, seis meses, um ano, ou mais longo. Regimes terapêuticos exemplars são descritos na Seção

1.11 abaixo.

De acordo com a presente revelação, | tratamento de uma doen- ça envolve o tratamento de pacientes já diagnostivados como tendo qual- quer forma da doença em qualquer estágio clínico ou manifestação; o retar- do do começo ou evolução ou agravamento ou deterioração dos sintomas ou sinais da doença; e/ou prevenção e/ou redução da severidade da doença.

Um "indivíduo" ou "paciente" a quem o anticorpo anti-TNF-alfa da revelação é administrado é preferivelmente um mamífero tal como um não-primata (por exemplo, vaca, porco, canalo, gato, cão, rato, etc.), ou um |

; 53/74 primata (por exemplo, macaco ou humano). Em certas concretizações, o in- divíduo ou paciente é um humano. Em certos aspectos, o humano é um pa- ciente pediátrico. Em outros aspectos, o humano é um paciente adulto. . 19 COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ROTAS DE ADMINISTRA-

ÇÃO ' Composições compreendendo um anticorpo anti-TNF-alfa da re- velação e, opcionalmente um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tal como a combinação de agentes terapêuticos descrita na Seção 1,10 abaixo, são providas aqui. As composições usualmente serão fornecidas como parte de uma composição farmacêutica estéril que normalmente incluirá um trans- portador farmaceuticamente aceitável. Esta composição pode estar em . qualquer forma adequada (dependendo do método de administração dese- jado da mesma ao paciente). Os anticorpos anti-TNF-alfa da revelação podem ser administra- dosaum paciente por uma variedade de rotas tais como oralmente, trans- dermalmente, subcutaneamete, intranasalmente, intravenosamente, intra- : muscularmente, intraocularmente, topicamente, intratecalmente e intracere- broventricularmente. A rota mais adequada para administração em qualquer dado caso dependerá do anticorpo particular, do indivíduo, e da natureza e severidade da doença e da condição física do indivíduo. Para tratamento de indicações aqui descritas, a dose efetiva de um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação pode variar de cerca de 0,001 a cerca de 75 mg/kg por administração única (por exemplo, massa), adminis- trações múltiplas ou administração contínua, ou para alcançar uma concen- traçãode soro de 0,01-5000 ug/mL de concentração de soro por administra- ção única (por exemplo, massa), administrações múltiplas ou administração contínua, ou qualquer faixa ou valou efetivo dependendo da condição a ser tratada, a rota de administração e da idade, peso e condição do indivíduo. Em uma certa concretização, cada dose pode variar de cerca de 0,5 ug a cercade 50 ug por kilograma de peso corpóreo, por exemplo, de cerca de 3 pg a cerca de 30 ug por kilograma peso corpóreo. O anticorpo pode ser for- mulado como uma solução aquosa e administtada por injeção subcutânea. |

- 5A4/7A Composições farmacêuticas podem ser convenientemente apre- sentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade predetermi- nada de um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação por dose.

Tal unidade pode : conter, por exemplo, mas sem limitação, 5 mg a 5 9, por exemplo, 10 mg a 1 g ou20a50 mg.

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis para uso Ú na revelação podem tomar uma ampla variedade de formas dependendo, por exemplo, da condição a ser tratada ou da rota de administração.

Formulações terapêuticas dos anticorpos anti-TNF-alfa da reve- lação podem ser preparadas para armazenagem como formulações liofiliza- das ou soluções aquosas pela mistura do anticorpo tendo o grau desejado de pureza com transportadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais, ex- . cipientes ou estabilizadores tipicamente empregados na técnica (todos dos quais são referidos aqui como "transportadores"), isto é, agentes de tampo- namento, agentes de estabilização, conservantes, isotonificadores, deter- gentes não-iônicos, antioxidantes, e iutros aditivos misturados.

Ver, Reming- ton's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Tais aditivos ' devemn ser não-tíxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações em- pregadas.

Agentes de tamponamento ajudam a manter o pH na faixa que se aproxima das condições fisiológicas.

Eles podem estar presentes a uma concentração variando de cerca de 2 mM a cerca de 50 MM.

Agentes de tamponamento adequados para uso com a presente revelação incluem am- bos ácidos orgânicos e inorgânicos e sais destes tais como tampões de ci- trato (por exemplo, mistura de monosódio citrato-disódio citrato, mistura de ácido citrico-trisódio citrato, mistura de ácido citrico-monosódio citrato, etc.), tampões de succinato (por exemplo, mistura de ácido succínico-monosódio succinato, mistura de ácido succínico-hidróxido de sódio, mistura de ácido succínico-disódio succinato, etc.), tampões de tartrato (por exemplo, mistura de ácido tartárico-sódio tartrato, mistura de ácido tartárico-potássio tartrato, mistura de ácido tartárico-hidróxido de sódio, etc.), tampões de fumarato (por exemplo, ácido fumárico-monosódio fumarato, mistura de ácido fumárico- disódio fumarato, mistura de monosódio fumarato-disódio fumarato, etc.), |

. 55/74 tampões de gluconato (por exemplo, mistura de ácido glucônico-sódio glico- nato, mistura de ácido glucônico-hidróxido de sódio, mistura de ácido glucô- nico-potássio gliconato, etc.), tampão de oxalato (por exemplo, mistura de " ácido oxálico-sódio oxalato, mistura de ácido oxálico-hidróxido de sódio, mis- turade ácido oxálico-potássio oxalato, etc.), tampões de lactato (por exem- : plo, mistura de ácido láctico-sódio lactato, mistura de ácido láctico-hidróxido de sódio, mistura de ácido láctico-potássio lactato, etc.) e tampões de aceta- to (por exemplo, mistura de ácido acético-acetato de sódio, mistura de ácido acético-hidróxido de sódio, etc.). Adicionalmente, tampões de fosfato, tam-

põesde histidinae sais de trimetilamina tais como Tris podem ser usados.

Conservantes podem ser adicionados ao retardo de crescimento - microbial, e podem ser adicionados em quantidades variando de 0,2%-1% (p/v). Conservantes adequados para uso com a presente revelação incluem fenol, álcool benzila, meta-cresol, metila parabeno, propila parabeno, octa- decildimetilbenzila cloreto de amônia, haletos de benzalcônio (por exemplo, cloreto, brometo e iodeto), cloreto de hexametônio, e alquila parabenos tais ' como metila ou propila parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, e 3- pentanol.

Isotonicificadores as vezes conhecidos como "estabilizadores" po- dem ser adicionados para assegurar isotonicidade das composições líquidas da presente revelação incluem álccoóis de açúcar polihídricos, por exemplo, alcoóis de açúcar trihídriocos ou mais altos, tais como glicerina, eritritol, ara- bitol, xilitol, sorbitol e mannitol.

Estabilizadores se referem a uma ampla ca- tegoroa de excipientes que podem variar em função de um agente de massa a um aditivo que estabiliza o agente terapêutico ou ajuda a impedir desnatu- ração ou aderência à parede do recipiente.

Estabilizadores típicos podem ser alcoóis de açúcar polihídricos (acima enumerados); amino ácidos tais como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, orniti- na, LHeucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, efc., açúcares orgâni- cos ou alcoóis de açúcar, tais como lactose, trehalose, estachiose, manitol, — sorbitol, xílitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol e similares, incluindo cicli- tóis tais como inositol; polietileno glicol; polímeros de amino ácido; agentes de redução contendo enxofre, tais uréia, glutationa, ácido tiótico, sódio tiogli-

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- 56/74 colato, tioglicerol, a-monotioglicero| e sódio tio sulfato; polipeptídeos de baixo peso molecular (por exemplo, peptídeos de 10 resíduos ou menostr); proteí- nas tais como albumina de soro humana, albumina de soro bovino, gelatina - ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona mo- —nosacarídeos, tais como xilose, manose, frutose, glicose; dissacacarídeos Ú tais como lactose, maltose, sucrose e trissacarídeos tais como rafinose; e polissacarídeos tal como dextran. Os estabilizadores podem estar presents na faixa de 0,1 a 10.000 pesos por parte de proteína de peso ativo.

Surfactantes não-iônicos ou detergentes (também conhecidos comno "agentes de umedecimento") podem ser adicionados para ajudar a solubilizar o agente terapêutico, bem como para proteger a proteína terapêu- . tica contra agregação induzida por agitação, que também permite que a for- mulação seja exposta a superfície estressada de cisalhamento sem causar desnaturação da proteina. Surfactantes não-iônicos adequados incluem poli- sorbatos (20, 80, efc.), polioxâmeros (184, 188 etc.), Pluronic polióis, polioxi- etileno sorbitan monoéteres (TWEENG-20, TWEENQO-80, etc.). Surfactantes ' não-iônicos podem estar presentes em uma faixa de cerca de 0,05 mg/mL a cerca de 1,0 mg/mL, por exemplo, cerca de 0,07 mg/mL a cerca de 0,2 mag/mL.

Excipientes misturados adicionais incluem agentes de espessa- mento (por exemplo, amido), agentes de quelatação (por exemplo, EDTA), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E), e co- solventes. Formulações adicionalmente adequadas para os anticorpos anti- TNF-alfa da revelação são revelados no Pedido de Patente dos Estados U- nidos No. 2004/0033228 A1, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

A formulação aqui pode também conter uma combinação de a- gente terapêutico em adição ao anticorpo anti-TNF-alfa da revelação. Exem- plos de combinação adequada de agentes terapêuticos são providos na Se- ção1.10 abaixo.

A tabela de dosagem para administração subcutâmra pode vari- ar de uma vez de seis em seis meses, cinco meses, quatro meses, três me- |

: 57/74 ses, dois meses, uma vez por mês a bisemanalmente, semanalmente, ou diariamente, dependendo de um número de fatores clínicos, incluindo o tipo de doença, severidade da doença, e a sensibilidade do paciente ao anticor- - po anti-TNF-alfa. A dosagem de um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação a ser ] administrada variará de acordo com o anticorpo particular, o tipo de doença autoimune ou inflamatória, o objetivo, e a natureza e severidade da doença, a condição física do indivíduo, o regime terapêutico (por exemplo, se uma combinação de agente terapêutico é usada), e a rota selecionada de admi- nistração; a dosagem apropriada pode ser prontamente determinada por um técnico no assunto.

% Para o tratamento e/ou profilaxia de doença autoimune ou infla- matória em humanos e animais, as composições farmacêuticas compreen- dendo anticorpos anti-TNF-alfa podem ser administradas a pacientes (por exemplo, indivíduos humanos) a dosagens terapeuticamente ou profilatica- mente efetivas (por exemplo, dosagens que resultam na inibição de uma ' doença autoimune ou inflamatória e/ou alívio de sintomas de doença autoi- mune ou inflamatória) usando-se qualquer rota adequada de administração, tal como injeção e outras rotas de administração conhecidas na técnica para produtos clínicos à base de anticorpo.

Será reconhecido por um técnico no assunto que a quantidade ótima e espaçamento de dosagens individuais de um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação serão determinados pela natureza e extensão da condição sendo tratada, da forma, rota e local de administração, e da idade e condi- ção do indivíduo particular sendo tratado, e que um médico determinará as dosageds apropriadas a serem usadas. Esta dosagem pode ser repetida frequentemente conforme apropriado, Se efeitos colaterais se desenvolve- rem, a quantidade e/ou frequência da dosagem pode ser alterada ou reduzi- da, de acordo com a prática clínica normal.

110 TERAPIADECOMBINAÇÃO Descritos abaixos estão métodos combinatoriais que os anticor- pos anti-TNF-alfa da revelação podem ser utilizados. Os métodos combina- |

: 58/74 toriais da revelação envolvem a administração de pelo menos dois agentes a um paciente, o primeiro do qual é um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação, e o(s) agente(s) adicional(is) é/são uma combinação de agente terapêutico. O - anticorpo anti-TNF-alfa e a combinação de agente terapêutico podem ser administrados simultaneamente, sequencialmente ou separadament.

: Os métodos de terapia combinatorial da presente revelação po- dem resultar em maior efeito aditivo, proporcionando benefícios terapêuticos onde nenhum anticorpo anti-TNF-alfa ou combinação de agente terapêutico administrados em uma quantidade que é sozinha terapeuticamentre efetiva.

Nos presentes métodos, o anticorpo anti-TNF-alfa da revelação e a combinação de agente terapêutico podem ser administrados concorren- - temente, ou simultaneamente ou sucessivamente. Conforme aqui usado, o anticorpo anti-TNF-alfa da revelação e a combinação de agente terapêutico são referidos para serem administrados sucessivamente se eles são admi- nisttados ao paciente no mesmo dia, por exemplo, durante a mesma visita do paciente. Administração sucessiva pode ocorrer 1, 2, 3, 4, 5,6,7 ou 8 ' horas. Em contraste, o anticorpo anti-TNF-alfa da revelação e a combinação de agente terapêutico são referidos para serem administrados separada- mente se eles são administrados ao paciente em dias diferentes, por exem- plo, o anticorpo anti-TNF-alfa da revelação e a combinação de agente tera- pêutico podem ser administradas em intervalos de 1 dia, 2dias ou 3 dias, uma semana, 2 semanas ou mensais. Nos métodos da presente revelação, a administração do anticorpo anti-TNF-alfa da revelação pode preceder ou seguir administração da combinação do agente terapêutico.

Como um exemplo não-limitativo, o anticorpo anti-TNF-alfa da revelação e combinação de agente terapêutico podem ser administrados concorrentemente por um período de tempo, seguido por um segundo perío- do de tempo em que a administração do anticorpo anti-TNF-alfa da revela- ção e da combinação de agente terapêutico é alternada.

Devido aos efeitos potencialmente sinergísticos da administra- ção de um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação e de uma combinação de agente terapêutico, tais agentes podem ser administrados em quantidades |

A 59/74 que, se um ou ambos dos agentes é administrado sozinho, na é/são tera- peuticamente efectivo(s).

Em certos aspectos, a combinação de agente terapêutico é uma - droga anti-reumática, um agente anti-inflamatório, um agente quimioterapêu- tico, uma droga radioterapêutica, um agente imunosupressor, ou um agente ' citotóxico.

Drogas anti-reumáticas incluem, mas não são limitadas a, aura- nofina, azatioprina, cloroquina, D-penicilamina, ouro sódio tiomalato hidroxi- cloroquina, Myocrisin e sulfasalzina metotrexato.

Agentes anti-inflamatórios incluem, mas não são limitados a, de- xametasona, pentasa, mesalazina, asacol, codeína fosfato, benorilato, fen- - bufen, naprosina, diclofenac, etodolac e indomethacin, aspirina e ibuprofen.

Agentes quimioterapêuticos incluem, mas não são limitados a, moléculas radioativas, toxinas, também referidas como citotoxinas ou agen- tes citotóxicos, que incluem qualquer agente que é prejidicial a viabilidade das células, agentes, e lipossomos ou outros compostos quimioterapêuticos " contendo vesículas. Exemplos de agents quimioterapêuticos adequados in- cluem, mas não são limitados a, 1-dehidrotestosterona, 5-fluorouracil decar- bazina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldes- leukin, agentes de alquilatação, allopurinol sódio, altretamina, amifostina, anastrozole, antramicina (AMC)), agentes anti-mitóticos, cisdiclorodiamina platina (11) (DDP) cisplatina), diamino dicloro platina, antraciclinas, antibióti- cos, antimetabólitos, asparaginase, BCG viva (intravesical), betametasona sódio fosfato e betametasona acetato, bicalutamida, bleomicina sulfato, bu- sulfan, cálcio leucouorin, calicheamicin, capecitabina, carboplatina, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), Clorambucil, Cisplatina, Cladribina, Colchicina, estrogênios conjugados, Ciclofosfamida, Ciclotosfamida, Citarabina, Citara- bina, citochalasin B, Cotoxan, Dacarbazina, Dactinomicina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunirubicina HCL, daunorucbicina citrato, de- —nileukin diftitox, Dexrazoxana, Dibromomanittol, dihidroxi antracin diona, Do- cetaxel, dolasetron mesilato, doxorubicina HCL, dronabinol, E. coli L- asparaginase, eolociximab, emetina, epoetin-a, Erwinia L-asparaginase, es- | trogênios esterificados, estradiol, estramustina fosfato de sódio, brometo de etódio, etinila estradiol, etidronato, fator de etoposide citrororum, fosfato de etoposide, filgrastim, floxuridina, fluconazole, fosfato de fludarabina, fluorou- - racila, flutamide, ácido folínico, gemcitabina HCL, glucocorticóides, acetato de goserelin, gramicidina D, granisetron HCL, hidroxiuréia, idarubicin HCL, ' ifosfamida, interferon a-2b, irinotecan HCL, letrozole, leucovorin cálcio, ace- tato de leuprolide, levamisole HCL, lidocaina, lomustina, maitansinóide, me- cloretamina HCL, medroxiprogesterona acetato, megestrol acetato, melfalan HCL, mercaptipurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, octreotide acetato, ondan- setron HCL, paclitaxel, pamidronato disódio, pentostatin, pilocarpina HCL, - plimicina, polifeprosan 20 com implante de carmustina, porfimer sódio, pro- caína, procarbazine HCL, propranolol, rituximab, sargramostim, streptozoto- cin, tamoxifen, taxol, teniposide, tenoposide, testolactona, tetracaína, tioepa —clorambucil, tioguanina, tiotepa, topotecan HCL, toremifeno citrato, trastuzu- mab, tretinoina, valrubicin, vinblastina sulfato, vincristina sulfato, e vinorelbi-

' na tartrato.

Em ainda outros aspectos da revelação, a combinação de agen- te terapêutico é um antagonista de TNF-a diferente do anticorpo anti-TNF- alfada revelação.

Exemplos de tais antagonistas de TNF-a incluem, mas não são limitados a, receptores solúveis de TNF-a; etanercept (ENBREL""; Immunex) ou um fragmento, derivado ou análogo deste; infliximab (REMI- CADEG; Centacor) ou um derivado, análogo ou fragmento de ligação de ant'geno deste; IL-10, que é conhecido pir bloquear a produção de TNF-a, via macrófagos ativados por interferon-y (Oswald, et a/., 1992, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 89:8676-8680), TNFR-IgG (Ashkenazi ef a/., 1991, Proc.

Na- tl.

Acad.

Sci.

USA 88:10535-10539); o produto de murina TBP-1 (Sero- no/Yeda); a vacina CytoTAb (Protherics); molécula de antisentido 104838 (ISIS); o peptídeo RDP-58 (SangStat); talidomida (Celgene); CDC-801 (Cel- gene); DPC-333 (Dupont); VX-745 (Vertex); AGIX-4207 (AtheroGenics); ITF- 2357 (Italfarmaco); NPI-13021-31 (Nereus); SCIO-469 (Scios); TACE targe- ter (Immunix/AHP); CLX-120500 (Calyx); Tiazolopirim (Dynavax); auranofin |

.- 61/74 (Ridaura) (SmithKline Beecham Pharmaceuticals); quinacrina (mepacrina diclorohidrato); tenidap (Enablex); Melanin (Large Scale Biological); e agen- tes anti-p38 MAPK por Uriach. - Additional second agentes terapêuticos useful in combinação coman anticorpo anti-TNF-alfa e particular indications for which combinação ' therapy com such second agentes terapêuticos são useful são disclosed in WO 2004/004633, which é incorporated by reference herein in its entirety. 111 REGIMES TERAPÍUTICOS A presente revelação proporciona regimes terapêuticos envol- vendo a administração dos anticorpos anti-TNF-alfa da revelação. O regime terapêutico variará dependendo idade, peso e condição da doença do paci- - ente. O regime terapêutico pode continuar por 2 semanas a indefinidamente. Em concretizações específicas, o regime terapêutico é continuado por 2 se- manas a 6 meses, de 3 meses a 5 anos, de 6 meses a 1 ou 2 anos, de 8 meses a 18 meses, ou similares. O regime terapêutico pode ser um regime de dose não-variável ou um regime de dose varável múltiplo, por exemplo, ' conforme descrito em WO 2005/110452, que é incorporado por referência em sua totalidade. i Para os regimes exemplares de dosagem descritos abaixo, o an- ticorpo anti-TNF-alfa pode ser administrado como uma solução livre de con- servante estéril para administração subcutânea.

Em certas concretizações, o produto de droga é fornecido como uma caneta pré-preenchida de uso únicodentro da qual é encerrada uma seringa de vidro pré-preenchida de 1 mL, ou como uma seringa de vidro pré- preenchida de dose única de 1 mL. Para pacientes adultos, em certas con- cretizações, a seringa distribui 0,8 mL de uma solução faraceuticamente a- ceitável compreendendo o anticorpo anti-TNF-alfa da revelação. Em uma concretização específica, em adição ao anticorpo, a solução contém 4,93 mg de cloreto de sódio, 0,69 mg de fosfato de sódio monobásico dihidrato, 1,22 mg de fosfato de sódio dibásico dihidrato, 0,24 mg de citrato de sódio, 1,04 mg de ácido cítrico monohidrato, 9,6 mg de manitol, 0,8 mg de polisorbato 80, e água para injeção (USP) com hidróxido de sódio adicionado conforme |

- 62/74 necessário para ajustar o pH. Para pacientes pediátricos, em certas concre- tizações, a seringa distribui 0,4 mL de uma solução farmaceuticamente acei- tável compreendendo o anticorpo anti-TNF-alfa da revelação. Em uma con- - cretização específica, em adição ao anticorpo, a solução contém 2,47 mg de — cloretode sódio, 0,34 mg de fosfato de sódio monobásico dihodrato, 0,61 mg , de fosfato de sódio dibásico dihidrato, 0,12 mg de citrato de sódio, 0,52 mg de ácido cítrico monohidrato, 4,8 mg de manitol, 0,4 mg de polisorbato 80, e água para injeção (USP) com hidróxido de sódio adicionado conforme ne- cessário para ajustar o pH. Para tratamento de artrite reumatóide, artrire psoriática e espon- dilite de anquilisação, um anticorpo anti-TNF-alfa da revelação pode ser ad- - ministrado a uma dose de 10 a 50 mg (por exemplo, 10 ma, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg ou 50 mg) toda semana. Metotrexato, glucocorticóides, salicilatos, drogas inflamatórias não-esteroidais (NSAIDs), analgésicos ou outra droga antireumática de modificação de doença (DMARDs) podem ser continuadas durante tratamento com o anticorpo anti- TNF-alfa da revelação. Em artrite reumatóide, alguns pacientes não tomam metotrexato concomitante e podem deriver benefício adicional de aumento i da frequência de dosagem de bisemanalmente a semanalmente.

Para tratamento de artrite idiopática of juvenil, um anticorpo anti- TNF-alfa da revelação é administrado a uma dose que depende do peso do paciente. Em certas concretizações não-limitativas, a dose para pacientes pediátricos pesando 15 kg (33 lbs) a mais de 30 kg (66 lbs) varia de 5a 25 mg (por exemplo, 5 mg, 7,5 mg, 10 mg, 12,5 mg, 15 mg, 20 mg, ou 25 mg) toda semana. Em certas concretizações não-limitativas, a dose para pacien- tes oediátricos pesando mais do que 30 kg (66 l|bs) varia de 10 a 50 mg (por exemplo, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg ou 50 mg) toda semana. Metotrexato, glucocorticóides, salicilatos, NSAIDs ou a- nalgésicos podem ser continuados durante tratamento com o anticorpo anti- TNF-alfa.

Para tratamento de- Doença de Crohn, um anticorpo anti-TNF- alfa da revelação pode ser administrado em certas concretizações não- |

. 63/74 limitativas a uma dose de 40-280 mg (por exemplo, 40 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 140 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 240 mg, ou 280 mg) dada inici- almente (no Dia 1 ou dividida entre Dia 1 e Dia 2), seguida por uma dose de - aproximadamente 40% a 60% (por exemplo, 50%) da dose inicial duas se- manas mais tarde (Dia 15). Duas semanas mais tarde (Dia 29), uma dose , de manutanção de 20% a 30% (por exemplo, 25%) da dose inicial é adminis- trada toda semana. Aminosalicilatos, corticosteróides, e/ou agentes imuno- modulatórios (por exemplo, 6-mercaptopurina e azatioprina) podem ser con- tinuadas durante tratamento com o anticorpo anti-TNF-alfa.

Para tratamento de psoríase de placa, um anticorpo anti-TNF- alfa da revelação pode ser administrado em certas concretizações não- limitativas a uma dose de 40-160 mg (por exemplo, 40 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 140 mg, ou 160 mg dada inicialmente, seguida por metade da dose inicial dada outra semana começando uma semana após a dose inicial.

112 KITSTERAPÊUTICOS E FARMACÊUTICOS Envolvidos pela presente revelação são kits farmacêuticos con- ' tendo os anticorpos anti-TNF-alfa (incluindo conjugados de anticorpo) da revelação. O kit farmacêutico é um pacote compreendendo o anticorpo anti- | TNF-alfa da revelação (por exemplo, ou na forma liofiizada ou como uma solução aquosa) e um ou mais dos seguintes: * Uma combinação de agente terapêutico, por exemplo, confor- me descrita na Seção 1.10 acima; e Um dispositivo para administrar o anticorpo anti-TNF-alfa, por exemplo, uma caneta, agukha e/ou seringa; e e Tampão ou água de grau farmacêutico para resuspender o an- ticorpo se o anticorpo está na forma liofilizada.

Em certos aspectos, cada dose unitária do anticorpo anti-TNF- alfa é acondicionada separadamente, e um kit pode conter uma ou mais do- ses unitárias (por exemplo, duas doses unitárias, três doses unitárias, quatro doses unitárias, cinco doses unitárias, oito doses unitárias, dez doses unitá- rias, ou mais). Em uma concretização específica, as uma ou mais doses uni- tárias são cada alojadas em uma seringa ou caneta. |

- 64/74 Kits diagnósticos contendo os anticorpos anti-TNF-alfa (incluindo conjugados de anticorpo) da revelação são também aqui envolvidos. O kit diagnóstico é um pacote compreendendo o anticorpo anti-TNF-alfa da reve- - lação (por exemplo, ou na forma liofilizada ou como uma solução aquosa) e umoumaisreagentes úteis para realização de um ensaio diagnóstico. Onde ' o anticorpo anti-TNF-alfa é etiquetado com uma enzima, o kit pode incluir substratos e co-fatores requeridos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que proporciona a cromóforo ou fluoróforo etiquetado). Em adi- ção, outros aditivos podem ser incluídos, tais como estabilizadores, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lisis), e similares. Em certas concretizações, o anticorpo anti-TNF-alfa incluído em um kit disgnós- - tico é imobilizado em uma superfície sólida, ou uma superfície sólida (por exemplo, uma lâmina) na qual o anticorpo pode ser imobilizado é incluída no kit. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser varieadas am- plamente para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que substancialmente otimizam a sensibilidade do ensaio. Em uma concretiza- ' ção específica, o anticorpo e um ou mais reagentes podem ser providos (in- dividualmente ou combinados) como pós secos, usualmente liofilizados, in- i cluindo excipientes que na dissolução proporcionará uma solução de rea- gentetendoa concentração apropriada. EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE VARIANTES DE D2E7 DE-IMUNIZADAS 113 MATERIAIS & MÉTODOS

113.1 Peptídeos Peptídeos foram sintetizados usando-se um formato de multi- pino por Mimotopes (Adelaide, Australia). As sequências das regiões V de cadeia pesada e leve de D2E7 foram sintetizadas como 15-mer peptídeos que sobrepõem por 12 amino ácidos (Figura 1 e Tabela 1) para um total de 69 peptídeos. Os peptídeos foram liofilizados e foram re-suspensos em DM- SO (Sigma-Aldrich) a aproximadamente 1-2 mg/mL. Os peptídeos de esto- que foram mantidos congelados a —20ºC.

113.2. Células Mononucleares de Sangue Periférico Humano Produtos de revestimento "buffy" doador de comunidade foram |

: 65/74 comprados do Stanford Blood Center, Palo Alto, CA. Material de revestimen- to "buffy" foi diluído 1:1 (v:v) com DPBS não contendo cálcio ou magnésio. O material de revestimento "buffy" diluído (25-35 mL) foi assentado em tubos - centrífugos cônicos de 50 mL (Sarsted ou Costar) com 12,5 mL de FicollPa- que-PLUS (GE Healthcare). As amostras foram centrifugadas a 900 g por 30 ' minutos à temperatura ambiente. Células mononucleares de sangue periféri- co (PBMC) foram coletadas da interface. DPBS foi adicionado para trazer o volume final a 50 mLmL e as células foram centrifugadas a 350 g por 5 minu- tos. As células em pelotas foram resuspensas em DPBS e contadas.

113.3 Células dendríticas Para isolamento de células dendríticas, frascos de cultura T75 . (Costar) foram semeados com 10º de PBMC recentemente isolado em um volume total de 30 mL de meio AIM V (Invitrogen). Excesso de PBMC foi congelado a -80ºC em 90% de soro de bezerro fetal (FCS), 10% de DMSO a5x10' céçulas/ml. Fravos T75 foram incubados a 37ºC em 5% de CO, por 2 horas. Células não-aderentes foram removidas, e a monocamada aderente ' foi lavada com DPBS. Para diferenciar células dendríticas de monócitos, 30 mL de meio AIM V contendo 800 unidades/ml. de GM-CSF (R e D Systems) i e 500 unidades/mL de IL-4 (R e D Systems) foram adicionados. Os fracos foram incubados por 5 dias, No dia 5, IL-1a (Endogen) e TNF-a (Endogen) foram adicionados a 50 pg/ml e 0,2 ng/ml. Is frascos foram incubados por dois mais dias. No dia 7, as células dendríticas foram coletadas pela adição de 3 mL de 100 mM de EDTA contendo 0,5 a 1,0 mg de Mitomicina C (Sig- ma-Aldrich) por uma concentração final de 10 mM de EDTA e 16,5 a 33 p- gml de Mitomicina C. Alternativamente, as células dendríticas podem ser irradiaadas com 4.000 rads para fixação. Os frascos foram incubados uma hora adicional a 37ºC e 5% de CO;>. As células dendríticas foram coletadas e lavadas em meio AIM V 2-3 vezes.

1.134 Cultura de célula No dia 7, PBMC autólogo previamente congelado foram rapo- damente descongelados em um banho de água a 37ºC. AS células foram imediatamente diluídas em DPBS ou meio AIM V e centrifugadas a 350 g por |

. 66/74 minutos. CD4+ células foram enriquevidas por seleção negative usando-se gotas magnéticas (Easy-Sep CD4+ kit, Stem Cell Technologies). Células autólogas CD4+ T e células dendríticas foram co-cultivadas a 2 x 10º de cé- - lulas CD4+ T por 2 x 10º de células dendríticas por cavidade em placas de 5 fundo redondo de 96 cavidades (Costar 9077). Os peptídeos foram adicio- : nados a aproximadamente 5 ug/mL. Cavidades de controle contêm o veículo de DMSO (Sigma) sozindo a 0,25% v:v. Cavidades de controle positivo con- têm DMSO a 0,25% e tetanus toxóide (List Biologicals ou CalBioChem) a 1 Hg/mL. Culturas foram incubadas por 5 dias. No dia 5, 0,25 uCi por cavidade de timidina titulada (Amersham ou GE Healthcare) foi adicionado. Culturas foram coletadas no dia 6 em filtros usando um coletador de célula Packard . Filtermate. A contagem de cintilação foi realizada usando-se um contador de cintilação Wallac MicroBeta 1450 (Perkin Elmer).

113.5 Análise de dados Valores de CPM antecedentes médios foram calculados por re- sultados de classificação individual de 6 a 12 réplicas. Os valores de CPM ' das quatro cavidades de controle positivo foram classificados. Cavidades de réplica ou triplicata ára cada peptídeo foram classificadas. Os valores de ín- i dice de estimulação para o controle positivo e as cavidades de peptídeo fo- ram calculados por divisão dos valores de CPM experimentais médios pelos valores de controle médios. De modo a ser incluído no conjunto de dados, um índice de estimulação de mais do que 3,0 nas cavidades de controle po- sotivo de tetanus toxóide foi requerido. Uma resposta foi notada para qual- quer peptídeo resultando em um índice de estimulação de 2,95 ou maior. Os peptídeos foram testados usando amostras de sangue peroférico de um gru- po de 81 doadores. As respostas a todos os peptídeos foram compiladas. Para cada peptídeo testado, a percentagem do conjunto de doador que res- ponde com um índice de estimulação de 2,95 ou maior foi calculada. Em adição, o índice de estimulação médio para todos os doadores foi calculado.

113.6 Análise de Genótipo de HLA Alelos de HLA DRB1 e HLA DQB1 foram determinados para ca- da doador usando os kits de tipagem comercialmente disponíveis Dynal RE- |

- 67/74 LI (Invitrogen, UK). Os resultados de SSO de baica estringência são reporta- dos. Assoniações de HLA foram determinadas para responsividade a qual- quer dado peptídeo usando uma análise de Chi-squared (um grau de liber- - dade. Onde um alelo estava presente em ambos das populações responde- dorasenão-respondedoras, um valor de risco relativo é reportado. ' 113.7” Competição ELISA de Variantes de Anticorpo D2E7 TNF-a foi adhered onto a microwell plate, by contacting the plate com a solution of TNF-a a uma concentração de 1 ug/mL in PBS over night at 4ºC. The plate foi washed in 0.1% Tween 20 in PBS e blocked in Super- block (Thermo Scientific, Rockford, IL). A mixture of sub-saturating amount of biotinylated D2E7 (80 ng/ml) e unlabeled D2E7 (the "reference" anticor- - po) ou competing anticorpo anti-TNF-alfa (the "test" anticorpo) anticorpo in serial dilution (a uma concentração de 2.8 ug/mL, 8.3 pug/mL, ou 25 po/mL) in ELISA buffer (por exemplo, 1% BSA e 0.1% Tween 20 in PBS) foi adicio- nadosto wells e plates foram incubated for 1 hour com gentle shaking. The plate foi washed, 1ug/ml. HRP-conjugated Streptavidin diluted in ELISA buf- ' fer foi adicionados to each well e the plates incubated for 1 hour. Plates fo- ram washed e bound anticorpos foram detected by addition of TMB (Biofx Ú Laboratories Inc., Owings Mills, MD). The reaction foi terminated by addition ofstop buffer (por exemplo, Bio FX Stop Reagents, Biofx Laboratories Inc., Owings Mílis, MD) e the absorbance wconforme medido at 650 nm using mi- croplate reader (por exemplo, VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). The ICso values foram calculated for each anticorpo. The experiment foi performed três vezes, e average results são shown as a percent of the parentanticorpo ligação result.

1.13.8 Bioassay 3 x 10º murine L929 cells foram plated into individual wells of a flat bottomed 96-well microtiter plate. The cells foram incubated overnight at 37ºC in a humidified 5% CO, incubator. The next day, serial dilutions of the anticorpo anti-TNF-alfa (por exemplo, 0.712 ug/mL, 0.949 pg/ml, 1.27 p- g/mL, 1.69 po/mL, 2.25 po/mL ou 3 po/mL) foram prepared in 25 ul of se- rum-free medium e adicionados to cells (such that the final concentration in |

. 68/74 150 uL culture foi 119 ng/mL, 158 ng/ml, 211 ng/ml, 282 ng/mL, 375 ng/ml ou 500 ng/mL). After a 2-hour incubation at 37ºC in 5% CO,, 25uL of a 240ng/mL solution of TNF-a foram adicionados, for a final concentration of : 40 na/mL, e the cells foram adicionalmente incubated for 48 horas at 37ºC in 5%€CO> The wells foram scored for cytotoxícity conforme comparadas às " control plates, which treated com TNF-a but incubated com an isotype con- trol anticorpo ou com the parent anticorpo, D2E7) using a CellTiter-Blue via- bility assay (Promega, Madison, WI). ICsº5 values foram determined e ex- pressed as percent of the parental D2E7 resuit.

113.9 Kinetic Analysis de D2E7 Variants by BlAcore Ligação affinities of anticorpos anti-TNF-alfa foram measured by - using a BlAcore 2000 e 3000 surface plasmon resonance system (BlAcore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Polyclonal goat anti-human Fc anticorpo (Jackson Immunoresearch) foi first immobilized to the biosensor surface u- sing standard BlAcore amine coupling reagents (N-ethyl-N'-dimethylamino- propylcarbodiimide, EDC; N-hydroxysuccinimide, NHS; e ethanolamine HCI, ' pH 8.5), followed by the capture of anticorpos anti-TNF-alfa (D2E7 e D2E7 variants) on parallel surfaces at a low flow rate of 5 ui/min. RL foi kept low to achieve a low Rmax of 25-80 RU. No capture of the anticorpo foi made on the reference surface to serve as a negative control. Subsequently, TNF-a foi injected to all flow cells at a flow rate of 80 ul/min for três minutes to mo- nitor association followed by a 30-minute flow of HBS-P running buffer (10 mM HEPES, 150 mM sódio chloride, 0.005% P-20, pH 7.4) to monitor the dissociation phase. At each cycle, TNF-a (R&D systems, Minneapolis, MN), in6 different concentrations of TNF variando entre O nM e 128 e at quatro- fold increments, foi injected over the surface. The surface foi regenerated com 1.5% H3PO;, at a flow rate of 100 pL/min in duas brief pulses at the end of each cycle. The ligação kinetics of each TNF-a e anticorpo par foram calcu- latedfrom a global analysis of sensorgram data collected from the different concentrations of TNF-a using the BlAevaluate program. Double referencing foi applied in each analysis to eliminate background responses from the refe- |

: 69/74 rence surface e buffer only control (0 nM of TNF-a). The dissociation cons- tants (Kp), the association rate constants (Kk.n) e the constantes de taxa de dissociação(Kkor) Of each ligação par foi obtained by simultaneously fitting the - association e dissociation phases of the sensorgram using the 1:1 Langmuir ligação com mass transfer model. Each set of experiments foi performed 3 " separate vezes.

1.14 RESULTS

114.1 Identification Of CD4+ T Cell Epitopes In The D2E7 VH E VL Regions CD4+ T cell epitope peptídeos foram identified by an analysis of i the percent responses to the peptídeos within the set of 81 doadores. The - average percent response e desvio padrão foram calculated for all peptídeos tested describing the D2E7 cadeia pesada e cadeia leve. A response rate greater than ou equal to the average background response plus três desvio —padrãos foi considered a potential CD4+ T cell epitope. For the Cadeia leve de D2E7 V region, 32 peptídeos foram tested (Figura 2) which resulted in an ' average background percent response of 5.09 + 3.53%. Três desvio pa- drãos above background foi determined to be 15.68%. One peptídeo at posi- tion 8 displayed this level of response in the Cadeia leve de D2E7 peptídeo dataset, com a response rate of 17.28% (Figura 2). Em adição, the peptídeo at position 11 displayed a very high response rate of 12.35%. For the D2E7 cadeia pesada V region, 37 peptídeos foram tested (Figura 3). The average background percent response foi 2.64 + 2.04%. Três desvio padrãos above background foi 8.78%. One peptídeo within the D2E7 cadeia pesada data- set f20, achieved a percent response of 8.64% (Figura 3).

The índice de estimulação médio foi calculated for all peptídeos in the dataset. Cadeia leve peptídeo t8 had a high índice de estimulação médio of 1.97 + 0.08 s.e.m. The peptídeo at position 411 retumed an índice de estimulação médio of 1.63 + 0.32 s.e.m. Peptídeo f27 in the cadeia leve datasethad an average SI of 1.83. This é due to a single donor com an unu- sually high índice de estimulaçãoof 29 to this peptídeo. Cadeia pesada pep- tídeo 420 had an índice de estimulação médio value of 1.34 + 0.05 s.e.m. All |

. 70/74 of these values são significantly higher than the índice de estimulação médio for all peptídeos in the duas datasets (1.02 + 0.02 for all 68 cadeia pesada e cadeia leve peptídeos). - These data indicate that there são duas major CD4+ T cell epito- peregionsin D2E7 (Tabela 2). In the VH region, an epitope é found at pep- " tídeo position 20 that encompasses the junction of framework 2 e CDR2. In Tabela 2, the CDR-derived amino ácidos são underlined. In the cadeia leve, a large region that can contain more than one CD4+ T cell epitope includes peptídeos $8 e Ht11. These peptídeos span a section of framework 1, CDR1 eframework 2 of the cadeia leve.

1.142. HLA Associations Com Responses To The VL Epitope . Peptídeos The HLA class !l genotypes of all 81 doadores in the peptídeo dataset foram determined using a low-stringency SSO PCR-based método. Associations entre the presença of a particular HLA allele e responses to the duas VL peptídeos foram determined by chi squared analysis. Fischer P va- ' lues e relative risks foram determined for all HLA types e both peptídeos (Tabela 3). There foram no significant correlations entre qualquer HLA DR ou DO type e a response to VL peptídeo f8 (T22-Y36). This result suggests that the peptídeo é capable of ligação to HLA class Il moléculas in a broadily pro- miscuous manner. CD4+ T cell proliferative responses to the VL peptídeo H11 (N31-K45) foram tightly associated com the presença of HLA-DQ2 (p =

0.003; relative risk = 7.7). As HLA-DR3 é in linkage disequilibrium com HLA- DO?2, the association entre a response to this peptídeo e HLA-DR3 foi pre- sent butdid not reach statistical significance (p = 0.10; relative risk 3.3). Em adição to HLA-DOQ?2, as association foi found entre HLA-DR12 e a response to N31-K45 (p = 0.03; relative risk 5.2). The HLA responses to the VH peptí- deo H20 foram not tested as there foram too few total responders. Since the responders to the duas VL peptídeos foram discrete it pode ser concluded thatthey represent duas separate peptídeo epitopes. Therefore, the D2E7 VH e VL region contains três prominent peptídeo epitope regions.

1.14.3 Identification of imunogenicidade reduzida variants |

- 7U7A Alanine scan modifications: A twenty-one sequência de amino ácido of the Cadeia leve de D2E7 encompasses the epitopes at T22-Y36 e N31-K45. The twenty one sequência de amino ácido selected foi C23-K45. - Alanine modifications foram incorporated at each amino acid (Tabela 4). À setof99 doadores foi tested com the variant peptídeos (Figura 4). The pa- " rent 21-mer foi created 4 vezes within the peptídeo set.

These quatro replica- tes serve as a control for the reproducibility of the assay.

The average peptí- deo de origem response foi 8.3%, com a CV% of 30%. Therefore, variant peptídeos com an average percent of menos do que 5.8% could be conside- redto have a reduced rate of response.

The most reduced variants foram | C23A (2.02%) e P40A (3.03%, see Figura 4). The cysteine at position 23 é - invariant, e é therefore not a good candidate for modification in the whole protein.

Due to the unique nature of proline residues a modification of this residue é também not likely to yield a functional variant anticorpo.

The third candidate would be Y32A (4.04%). Adicionalmente, there são a number of variants that resulted in an average response rate of 5,05%. These changes ' could também be effective but would need to be tested as whole protein mo- léculas for both imunogenicidade reduzida e functional activity. | A set of alanine-modified peptídeos based on the sequência of the D2E7 VH epitope peptídeo foram também tested (data not shown). The response rate of the parent unmodified peptídeo in the replicate test foi very low.

Therefore this peptídeo foi no longer studied.

Antigen Ligação Study: The CDR-L1 region of the D2E7 anticor- po foi subjected to comprehensive mutational analysis.

Based on antigen- ligação studies performed in conjunction com the mutational analyses, a set of candidate substituições de amino ácido within the CDR-L1 region foi iden- tified that did not significantly reduce the affinity of the anticorpo to TNF-a (Tabela 5). Several anticorpos variantes containing the candidate CDR-L1 substituições foram analyzed using BlAcore e ELISA (Tabela 6). Peptídeos foram generated containing amino acid modifications within the CDR-L1 re- gion that had the property of altering the sequência de amino ácido while re- taining the affinity of the overall anticorpo molécula (Tabela 7). The modified |

. 72/74 epitope peptídeos foram tested as single amino-acid modifications, ou as double modifications. The double modifications contained a glutamine ou a glycine at position 32, ou a serine ou glycine at position 34. A total of 79 - peptídeos foram tested including duas syntheses of the parent 21-mer peptí- deo. A total of 102 doadores foram tested com the variant peptídeos e the ' results são shown in Figura 5. The average percent response of the peptí- deo de origems foi 10.3 + 2.1%. For a percent response rate to be menos do que 3 desvio padrãos from the parent the response rate would be menos do que 4%. The índice de estimulação médio for the peptídeo de origems foi

1.49+015. Fora índice de estimulaçãoto reach três desvio padrãos below the parent response it would be 1.03 ou lower.

- Subsequent affinity measurements of the Y32G e Y32Q muta- ções showed that this amino acid modification had a negative impact on anti- gen ligação. Therefore, all peptídeos carrying this modification foram remo- vedírom the analysis. A total of 10 peptídeos foram selected for adicional- mente study. All selected peptídeos had a response rate menos do que 4%.

' Contudo, none of the peptídeos demonstrated stimulation indexes 3 desvio padrãos below the average parent response (Tabela 8).

i 1144 Affinity E Bioactivity Testing Of Modified D2E7 Anticor- posvariantes Ten variant D2E7 VL region constructs foram cloned along com the unmodified VH region into a human IgG, -containing plasmid, expressed in 293T/17 cell lines by transient transfection, e anticorpos purified by Protein A ou Protein G affinity, The purified anticorpos foram tested for TNF-a liga- çãoina competition ELISA assay. All ten variants competed for TNF-a liga- ção com the unmodified D2E7 anticorpo. Contudo, there foi a faixa of affini- ties displayed, from aproximadamente equivalent affinity of the 027R + ASAS variant, to a 10x reduction in affinity of the N31S+ ASAS variant (Figura 6). A TNF-a toxicity bioassay foi performed. 1292 cells foram see- dedinto96 well plates, e a constant concentration of TNF-a foi adicionados to the culture medium. The anticorpos variantes foram titrated into the medi- um. An ECs, value foi determined for each variant (Tabela 9). Similarly, the |

- 731/74 variant Q27R + AZA4S displayed an ECso value aproximadamente equivalent to the parent D2E7 anticorpo. Finally, affinity of the anticorpos for TNF-a foi determined by BIA- - core analysis (Tabela 10). Of the ten variants tested, the Q27H + ASAS, Q27R+A3ZASeG28S+ ASAS variants all displayed association e dissociati- " on rates similar to D2E7. The final affinity values for the variants foram in the 130 pM faixa conforme comparadas às D2E7 com a measured affinity in the- se experiments of 114 pM. EXEMPLO 2: IDENTIFICATION OF VARIANTS DE D2E7 COM AFINIDADE AUMENTADATO TNF-A The D2E7 anticorpo foi subjected to comprehensive mutational - analysis to identify mutants that had afinidade aumentadato TNF-a conforme comparadas às D2E7. The afinidade aumentadaof candidate mutants to TNF-a foi analyzed by ELISA e BlAcore to confirm their characteristics con- forme comparadas às D2E7.

1.15 MATERIALS & MÉTODOS ' 1.151 COMPETITION ELISA Competition ELISA assays foram done conforme descrito in Sec- tion 8.1.7. ELISA foi repeated twice e average fold improvement in ICs,9 é shownasWT/x.

1.152 BlAcore BlAcore assays foram done conforme descrito in Section 8.1.9.

1.16 RESULTS CDR variants de D2E7 that had improved Ko (conforme medido by BlAcore), improved ability to compete in ELISA, ou both relative to D2E7 são shown in Tabelas 12 e 25. SPECIFIC EMBODIMENTS, CITATION OF REFERENCES All publications, patents, patent applications e other documents cíted in this application são hereby incorporated by reference in their entireti- esfor all purposes to the same extent as if each individual publication, pa- tent, patent application ou other document foram individually indicated to be incorporated by reference for all purposes. |

. 7A/7A While various specific embodiments have been illustrated e des- cribed, it will be appreciated that various changes pode ser made without departing from the spirit e scope of the invention(s).

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monocilonal ou fragmento de ligação do mesmo, caracterizado pelo fato de que: .: (a) liga-se especificamente a TNF-alfa humano; (b) compete para se ligar a TNF-alfa humano com um anti- corpo compreendendo uma sequência VH de SEQ ID NO:2 e uma sequên- cia VL de SEQ ID NO:4; (c) compreende seis CDRs que conjuntamente tem até sete substituições de aminoácidos se comparadas aos CDRs de SEQ ID NO:5 (CDR-H1), SEQ ID NO:6 (CDR-H2), SEQ ID NO:7 (CDR-H3), SEQ ID NO:8 (CDR-L1), SEQ ID NO:9 (CDR-L2) e SEQ ID NO:10 (CDR-L3), em que qual- quer CDR individual tem não mais do que três substituições de aminoácidos se comparado ao CDR correspondente de SEQ ID NO:5 (CDR-H1), SEQ ID NO:6 (CDR-H2), SEQ ID NO:7 (CDR-H3), SEQ ID NO:8 (CDR-L1), SEQ ID NO:9(CDR-L2) e SEQ ID NO:10 (CDR-L3); e (d) tem pelo menos uma substituição de aminoácido ou combinação de substituições de aminoácido selecionadas de: (1) substituições em CDR-Li R7Q; A11IS; R/Q + A11S; N8T; N8T + A11S; I6T; A11G; I6T + A11G; Q4G; Q4G + A11S; Q4G + AIG; Q4H; C4H + ATIS: O4R + AVIS; G5S + ATIS NSS + ATIS;IBT + A11S; NET + A11G; (2) substituições em CDR-L2 S3K ou S3R, T4H, T4Q TA4F, T4W ou T4Y; LSR ou L5K; O6R; (3) — substituição em CDR-H1 A3SG; e (4) — substituição em CDR-H2 T3N.

2. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada de S3K ou S3R em CDR-L2; T4H, T4Q, T4F, T4AW ou T4Y em CDR-L2; L5R ou L5K em CDR-L2; Q6R em —CDR-L2;A3Gem CDR-H1eT3Nem CDR-H2.

3. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende pelo me-

nos uma substituição de aminoácido selecionada de TAF, TAW ou T4Y em CDR-L2; LS5R ou L5K em CDR-L2; Q6R em CDR-L2; A3G em CDR-H1 e | T3N em CDR-H2.

.

4. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende pelo me- nos uma substituição de aminoácido ou combinação de substituições de a- minoácido selecionada de R7Q em CDR-L1; A11S em CDR-L1; R7Q + A11S em CDR-L1; N8T em CDR-L1; N8T + A11S em CDR-L1; I8T em CDR-L1; A11G em CDR-L1; I6T + A11G em CDR-L1; Q4G em CDR-L1; Q4G + A11IS em CDR-L1; Q4G + A11G em CDR-L1; Q4H em CDR-L1; Q4H + A11S em CDR-L1; Q4R + A11S em CDR-L1; G5S + A11S em CDR-L1; N8S + A11IS em CDR-L1; I6T + A11S em CDR-L1; e NET + A1IG em CDR-L1.

5. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as referidas substituições são selecionadas de: (1) substituições em CDR-L1 Q4G, Q4H; G5S; I6T; R7Q; N8S ou N8T; A11S ou A11G; substituições em CDR-L1 presentes em sequências de CDR-L1 de SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO185, SEQ 1D NO186, SEG ID NO187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO 193, SEQ 1D NO:194, SEG 1D NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ 1D NO:201, SEQ ID NO:253, SEQ ID NO254, SEQ ID NO:255, SEG 1D NO:256, SEG ID NO:257, SEQ 1D NO:258, SEQ 1D NO259 SEQ ID NO260 SEQ 1D NO2Z61, SEQG ID NO 262, SEQID NO:263, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:265, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:271, SEQ 1D NO:273, SEQ ID NO:274, SEQ 1D NO:2/5, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO277, SEQ ID NO278, SEQ ID NO-349, SEQ TD S0 NO3S50, SEO ID NOSS51, SEO ID NO:$52, SEQ ID NO353, SEQ ID NO:354, SEQ 1D NO:355, SEQ 1D NO:358, SEQ 1D NO-357, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:361, e SEQ ID

S/9

NO:362; e qualquer combinação das mesmas; (ii) substituições em CDR-L1 S3K ou S3R; T4H, T4Q, T4F, TAN ou T4Y; LS5R ou L5K; O6R; substituições em CDR-L2 presentes em sequên- cias de CDR-L2 de SEQ ID NO:272, SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:280, SEQ ID NO:281, SEQ ID NO:282, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:285, SEQ ID NO:286, SEQ ID NO:287, SEQ ID NO:288, SEQ ID NO:2869, SEQ ID NO:290, SEG ID NO-.2971, SEQ 1D NO:292, SEQ ID NO:293, SEQ ID NO:294, SEG ID NO205, SEG ID NO:363, SEQ ID NO:364, SEQ 1D NO:365, SEG ID NO:365, SEQ ID NOS67, SEQ ID NO:368, SEQ ID NO:369, SEQ ID NO:380, SEQ ID NO:381, SEQ |ID NO:382, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:392; e qualquer combinação das mesmas;

(iii) substituições em CDR-L3 presentes em sequências de CDR- L3 de SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:299, SEQ ID NO:300, SEQ ID NO:301, SEQ ID NO:302, SEQ ID NO:303, SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:305, SEQ ID NO:306, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:308, SEQG D NO:309, SEQ 1D NO:310, SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:312, SEQ ID NO:313, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:315, SEQ ID NO:316, SEQ ID NO:317, SEQ ID NO:318, SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:320, SEQ ID NO:321, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323, SEQ ID NO:324, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:329, SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO33S2 SEO ID NO:339 SEQ ID NO:S34, SEQ ID NO:$835, SEQ ID NO:336, SEQ ID NO:376, SEG 1D NO:S71, SEG ID NO:3/2, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:378, and SEQ ID NO:379; e combinações das mesmas; (iv) substituições em CDR-H1 A3SG; substituições em CDR-H1 presentes em sequências de CDR-H1 de SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:337, SEQ ID NO:338, SEQ ID

NO:339, SEQ ID NO:340, SEQ ID NO:341, e SEQ ID NO:342; e qualquer combinação das mesmas; (v) substituições em CDR-H2 T3N; substituições em CDR-H2 presentes em sequências de CDR-H2 de SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:211, SEQIDNO:343, SEQ ID NO:344, SEQ ID NO:345, SEQ ID NO:346, e SEQ ID NO:347; e qualquer combinação das mesmas; (vi) substituições em CDR-H3 presentes em sequências de C- DR-H3 de SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:252, e SEQ ID NO:348; e qualquer combinação das mesmas; e (vii) combinações de um ou mais de (1) a (vi).

6. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as referidas substituições são selecionadas de: () substituições em CDR-L1 Q46G, Q4H; G5S; I6T; R7Q; N8S ou —N8T;A1ISouA1IG; substituições em CDR-L1 presentes em sequências de CDR-L1 de SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ 1D NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:253, SEQ ID NO:254, SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:256, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:258, SEQ ID

NO:259, SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:265, SEQ ID NO:266, SEQ |D NO:267, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:270, SEQ ID r NO:271, SEQ ID NO:273, SEQ ID NO:274, SEQ ID NO:275, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:277, e SEQ ID NO:278; e qualquer combinação das mesmas; (ii) substituições em CDR-L2 T4F, T4W ou T4Y; LS5R ou L5K; Q6R; substituições em CDR-L2 presentes em sequências de CDR-L2 de SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:280, SEQ ID NO:281, SEQ ID NO:282, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:285, SEQ ID NO:286, SEQ ID NO:287, SEQ ID NO:288, SEQ ID NO:289, SEQ ID NO:290, SEQ ID NO:291, SEQ ID NO:292, SEQ ID NO:293, SEQ ID NO:294, e SEQ ID NO:295; e qualquer combinação das mesmas; (iii) substituições em CDR-L3 presentes em sequências de CDR- L3deSEQ ID NO:296, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:299, SEQ ID NO:300, SEQ ID NO:301, SEQ ID NO:302, SEQ ID NO:303, SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:305, SEQ ID NO:306, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:308, SEQ ID NO:309, SEQ ID NO:310, SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:312, SEQ ID NO:313, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:315, SEQ ID NO:316, SEQ ID NO:317, SEQ ID NO:318, SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:320, SEQ ID NO:321, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323, SEQ ID NO:324, e SEQ ID NO:325; e qualquer combinação das mesmas; (iv) substituições em CDR-H1 A3G; substituições em CDR-H1 presentes em sequências de CDR-H1 de SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, —SEQIDNO:204, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:208, e SEQ ID NO:209; e qualquer combinação das mesmas; (v) substituições em CDR-H2 T3N; substituições em CDR-H2 presentes em sequências de CDR-H2 de SEQ ID NO:211 e SEQ ID NO:211; e qualquer combinação das mesmas; (vi) substituições em CDR-H3 presentes em sequências de C- DR-H3 de SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID

NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID . NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, e SEQ ID NO:252; e qualquer combinação das mesmas; e (vii) combinações de um ou mais de (i) a (vi).

7. Anticorpo monoclona!l ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os CDRs conjuntamente tem até quatro, cinco ou, seis substituições de amino- ácidos se comparados aos seis CDRs de SEQ ID NO:5 (CDR-H1), SEQ ID NO'6(CDR-H2), SEQ ID NO:7 (CDR-H3), SEQ ID NO:8 (CDR-L1), SEQ ID NO:9 (CDR-L2), e SEQ ID NO:11 (CDR-L3).

8. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que qual- quer CDR individual tem não mais do que duas substituições de aminoáci- dos se comparado ao CDR correspondente de SEQ ID NO:5 (CDR-H1), SEQ ID NO:6 (CDR-H2), SEQ ID NO:7 (CDR-H3), SEQ ID NO:8 (CDR-L1), SEQ ID NO:9 (CDR-L2) e SEQ ID NO:11 (CDR-L3).

9. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento de ligação de um anti- corpo humano ou humanizado, respectivamente.

10. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser um IgG, opcionalmente em que, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligaçãoé um IgG;.

11. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que possui as sequências estruturais de cadeia pesada da sequência V, de SEQ ID NO:2 e as sequências estruturais de cadeia leve da sequência V, de SEQ ID NO:4. e

12. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação a TNF-alfa de um an- ticorpo biespecífico, opcionalmente em que, o referido anticorpo biespecífico é específico para TNF-alfa e outra citocina pró-inflamatória.

13. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida citocina pró-inflamatória é linfotoxina, interferon-gama, ou interleucina-1.

14. Anticorpo monocional ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que possui pelo menos uma substituição de aminoácido ou combinação de subs- tituições de aminoácidos selecionadas de: Q4R + A11S em CDR-L1; Q4G + A11G em CDR-L1; Q4H + A11S em CDR-L1; G58 + A11S em CDR-L1; S3K em CDR-L2; S3R em CDR-L2; T4H em CDR-L2; T4Q em CDR-L2; TAF em CDR-L2; TAW em CDR-L2; T4Y em CDR-L2; LSR em CDR-L2; LSK em C- DR-L2; e O6R em CDR-L2.

15. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido CDR-L2 CDR possui pelo menos uma combinação de substitui- ções selecionadas de: () S3K, T4H, LSR e O6R; (1) S3K, T4Q, LS5R e Q6K; (ii) S3K, T4Y e LSK; (y) S3KeT4Y; (v) S3N, T4V, LSR e Q6K; (vi) S3N, T4W, LSR e Q6R; (vii) S3R, T4F e LSR; (vii) — S3R, T4F, LSR e OSR; () S3R, T4H e O6K;

Co) S3R, T4W, L5K e Q6R;

[6] TA4H, L5K e O6K; i (xi) — T4H,L5Ke Q6R; Qi) — T4W,L5ReO6R;e (xiv) T4YeLl5R.

16. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que possui pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada de: A3G em CDR-H1; T3N em CDR-H2; S3N em CDR-L2; T4V em CDR-L2; Q6K em CDR-L2;eD1GemCDR-H1.

17. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que possui um Kp para TNF-alfa humano que é ou: (a) 1,1 a 4 vezes o Kp de um anticorpo que possui uma sequên- ciaV'deSEQIDNO:2 e uma sequência V, de SEQ ID NO:4; ou (b) 1,5 a 3 vezes o Kp de um anticorpo que possui uma sequên- cia Va de SEQ ID NO:2 e uma sequência V, de SEQ ID NO:4; em que a afinidade é analisada por BlAcore.

18. Conjugado de droga de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação como de- finidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-TNF-alfa ou fragmento de ligação anti-TNF- alfa como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e um veículo —farmaceuticamente aceitável.

20. Uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-TNF-alfa ou fragmento de ligação anti-TNF-alfa como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 19 para tratamento deum distúrbio imunológico.

21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o distúrbio imunológico é lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, tiroidose, doença do enxerto versus hospedeiro, escleroderma, diabetes mellitus, doença de Grave, sarcoidose, doença de intestino inflama- tória crônica, colite ulcerativa, ou doença de Crohn. .

22. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, reve- lada ou ilustrada no pedido de patente.