KR20020073178A - 인간 ＩＬ-1β에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

IL-1 매개 질환 또는 장애, 예를 들어, 골관절염, 골다공증 및 기타 염증성 관절염의 치료에 사용하기 위한, IL-1β 결합 분자, 구체적으로 인간 IL-1β에 대한 항체, 특히 인간 IL-1β에 대한 인간 항체를 제공하는 것으로, 여기서, 중쇄 및 경쇄의 CDR의 아미노산 서열은 정의된 바와 같다.

Description

인간 ＩＬ-1β에 대한 항체 {Antibodies to Human IL-1β}
본 발명은 인간 인터루킨 I 베타 (IL-1β)에 대한 항체, 및 IL-1 매개 질환 및 장애의 치료를 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
인터루킨 1 (IL-1)은 급성기 염증 반응의 매개자로서 작용하는 면역 시스템의 세포에 의해 발휘되는 활성이다. IL-1, 특히 IL-1β의 부적절한 또는 과도한 생성은 폐혈증, 폐혈증성 쇼크, 내독소성 쇼크, 알레르기, 천식, 골 손실, 허혈증, 졸중, 류마티스성 관절염 및 기타 염증성 질환과 같은 다양한 질환 및 장애의 발병기전과 관련되어 있다. IL-1β에 대한 항체는 IL-1 매개 질환 및 장애의 치료에 사용하도록 제안된 바 있다 (예를 들어, WO 95/01997 및 그의 도입부의 논의를 참조함).
본 발명자들은 본원에서 IL-1 매개 질환 및 장애의 치료에 사용하기 위한 인간 IL-1β에 대한 개질된 항체를 제조하였다.
따라서, 본 발명은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 순서대로 포함하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는 IL-1β 결합 분자 및 그의 직접적 등가물을 제공하는데, 상기 CDR1은 아미노산 서열 Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly을 갖고, 상기 CDR3는 아미노산 서열 Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile을 갖는다.
제1 측면에서, 본 발명은 위에서 정의한 중쇄 가변 도메인 (VH)를 포함하는 단리된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 단일 도메인 IL-1β 결합 분자를 제공한다.
또한, 제2 측면에서, 본 발명은 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 도메인 둘다를 포함하는 IL-1β 결합 분자 및 그의 직접적 등가물을 제공하는데, 상기 IL-1β 결합 분자는 a) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (상기 CDR1은 아미노산 서열 Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly을 갖고, 상기 CDR3는 아미노산 서열 Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile을 가짐)을 순서대로 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH); 및 b) 아미노산 서열 Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro을 갖는 초가변 영역 CDR3'를 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
제2 측면의 특정 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 도메인 둘다를 포함하는 IL-1β 결합 분자 및 그의 직접적 등가물을 제공하는데, 상기 IL-1β 결합 분자는 a) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (상기 CDR1은 아미노산 서열 Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly을 갖고, CDR3는 아미노산 서열 Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile을 가짐)를 순서대로 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 b) 초가변 영역 CDR1', CDR2' 및 CDR3' (상기 CDR1'는 아미노산 서열 Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu Ala을 갖고, 상기 CDR2'는 Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr을 갖고, 상기 CDR3'는 Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro을 가짐)을 순서대로 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
달리 명시하지 않는 한, 본원의 임의의 폴리펩티드쇄는 N-말단에서 시작하고 C-말단에서 끝나는 아미노산 서열을 갖는 것으로 기재되어 있다. 항원 결합 부위가 VH및 VL도메인 둘다를 포함하는 경우, 이들 도메인은 동일한 폴리펩티드 분자 상에 위치하거나, 또는 바람직하게는 각 도메인은 상이한 쇄 상에 존재할 수 있고, VH도메인은 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 단편의 일부이고 VL도메인은 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 단편의 일부일 수 있다.
"IL-1β 결합 분자"는 단독으로, 또는 다른 분자와 결합된 상태로 IL-1β 항원에 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 결합 반응은 예를 들어, IL-1β의 수용체와 IL-1β의 결합의 억제를 측정하기 위한 생물분석, 또는 임의의 종류의 결합 분석을 비롯한 표준 방법 (정량 분석)에 의해, 관련되지 않은 특이성을 나타내지만 이소타입이 동일한 항체, 예를 들어, 항-CD25 항체가 사용되는 음성 대조구 시험과 관련하여 나타낼 수 있다. 유익하게는, IL-1β와 본 발명의 IL-1β 결합분자의 결합은 경쟁 결합 분석에서 나타날 수 있다.
항원 결합 분자의 예에는 B-세포 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 인간 항체 및 이들의 임의의 단편, 예를 들어, F(ab')2및 Fab 단편뿐 아니라, 단일쇄 또는 단일 도메인 항체가 포함된다.
단일쇄 항체는 통상적으로 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15 내지 25개의 아미노산으로 구성된 펩티드 링커에 의해 공유결합되어 있는 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인으로 구성되어 있다. 그러므로, 이러한 구조는 상기 중쇄 및 경쇄의 불변 부위를 포함하지 않고, 작은 펩티드 스페이서의 항원성이 전체 불변 부위의 항원성보다 더 작어야 하는 것으로 생각된다. "키메라 항체"는 중쇄나 경쇄 또는 이들 둘다의 불변 영역이 인간으로부터 유래되었지만 중쇄 및 경쇄 둘다의 가변 도메인이 비-인간 (예를 들어, 뮤린)으로부터 유래되었거나 인간으로부터 유래되었다 하더라도 다른 인간 항체로부터 유래된 항체를 말한다. "CDR-이식 항체"는 초가변 영역 (CDR)이 공여 항체, 예컨대, 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체 또는 다른 인간 항체로부터 유래되었지만, 이뮤노글로불린의 모든 또는 실질적으로 모든 다른 부위, 예컨대, 불변 영역 및 보존성이 높은 가변 도메인의 일부, 즉 골격 영역이 수용 항체, 예를 들어, 인간 유래의 항체로부터 유래된 항체를 말한다. 그러나, CDR-이식 항체는 골격 영역, 예를 들어, 초가변 영역에 인접한 골격 영역의 공여 서열의 소수 아미노산을 함유할 수 있다. "인간 항체"는 중쇄 및 경쇄 둘다의 불변 및 가변 영역이 모두 인간으로부터 유래되었거나, 반드시 동일한 항체일필요는 없지만 인간 유래의 서열과 실질적으로 동일한 항체를 의미하고, 이 인간 항체에는 뮤린 이뮤노글로불린 가변 및 불변 부위 유전자가 그들의 인간 대응부, 예를 들어, EP 0546073 Bl, USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, USP 5661016, USP 5770429, EP 0 438474 B1 및 EP 0 463151 B1에 일반적인 용어로 기재된 이뮤노글로불린 가변 및 불변 부위 유전자로 대체된 마우스에 의해 생산되는 항체가 포함된다.
본 발명의 특히 바람직한 IL-1β 결합 분자는 인간 항체, 특히 하기 실시예에 기재된 AAL160 항체이다.
따라서, 바람직한 키메라 항체에 있어서, 중쇄 및 경쇄 둘다의 가변 도메인은 인간으로부터 유래되었고, 예를 들어, 서열 1 및 서열 2에 기재된 AAL160 항체의 가변 도메인이다. 불변 영역 도메인에는 바람직하게는 적당한 인간 불변 영역 도메인, 예를 들어, 문헌 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health)에 기재된 것도 포함된다.
초가변 영역은 임의의 종류의 골격 영역, 바람직하게는 인간 유래의 골격 영역과 연결되어 있을 수 있다. 적당한 골격 영역은 문헌 (Kabat E. A. et al, ibid)에 기재되어 있다. 바람직한 중쇄 골격은 인간 중쇄 골격, 예를 들어, 서열 1에 기재된 AAL160 항체의 중쇄 골격이다. 골격 영역은 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역 서열로 구성되어 있다. 유사한 방식으로 서열 2에는 FR1', FR2', FR3' 및 FR4' 영역 서열로 구성되어 있는 바람직한 AAL160 경쇄 골격이 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 위치 1의 아미노산으로 시작하고 위치 118의 아미노산으로 끝나는, 서열 1에 나타낸 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 제1 도메인을 포함하거나, 상기 제1 도메인, 및 위치 1의 아미노산으로 시작하고 위치 107의 아미노산으로 끝나는, 서열 2에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 제2 도메인을 포함하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 IL-1β 결합 분자도 제공한다.
모든 인간에서 천연적으로 발견되는 단백질에 대해 유도된 모노클로날 항체는 전형적으로 비-인간 시스템, 예를 들어, 마우스에서 생성된다. 이것의 직접적인 결과로서, 하이브리도마에 의해 생산되는 이종항체는 인간에게 투여되었을 때, 주로 이종 이뮤노글로불린의 불변 영역에 의해 매개되는 바람직하지 못한 면역반응을 일으킨다. 이는 이러한 항체가 장기간에 걸쳐 투여될 수 없기 때문에 상기 항체의 사용을 명백히 제한한다. 그러므로, 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 또는 특히 인간에게 투여하였을 때 실질적인 동종 반응을 일으키지 않을 인간 항체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
앞의 내용에 비추어, 본 발명의 보다 바람직한 IL-1β 결합 분자는 적어도,
a) (i) 아미노산 서열이 Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly인 초가변 영역 CDR1, 아미노산 서열이 Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly인 초가변 영역 CDR2 및 아미노산 서열이 Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile인 초가변 영역 CDR3를 순서대로 포함하는 가변 도메인 및 (ii) 인간 중쇄의 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 단편 및
(b) (i) 아미노산 서열이 Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro인 CDR3' 초가변 영역을 포함하고 임의로 아미노산 서열이 Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu Ala인 CDR1' 초가변 영역 및 아미노산 서열이 Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr인 CDR2' 초가변 영역도 포함하는 가변 도메인 및 (ii) 인간 중쇄의 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 단편
을 포함하는 인간 항-IL-1β 항체로부터 선택된다.
또는, 본 발명의 IL-1β 결합 분자는
a) 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 순서대로 포함하는 제1 도메인,
b) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR3' 및 임의로 CDR1'와 CDR2'를 포함하는 제2 도메인, 및
c) 상기 제1 도메인의 N-말단 및 상기 제2 도메인의 C-말단에 결합되어 있거나 상기 제1 도메인의 C-말단 및 상기 제2 도메인의 N-말단에 결합되어 있는 펩티드 링커
를 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는 단일쇄 결합 분자 및 그의 직접적인 등가물로부터 선택될 수 있다.
잘 공지되어 있는 바와 같이, 하나, 소수 또는 심지어 수개의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환과 같은 아미노산 서열의 작은 변화는 실질적으로 동일한 성질을 갖는 본래 단백질의 대립유전자 형태를 생성시킬 수 있다.
따라서, 용어 "직접적인 그의 등가물"은 임의의 단일 도메인 IL-1β 결합 분자 (분자 X) 또는 결합 부위 당 두 개 이상의 도메인을 갖는 임의의 IL-1β 결합 분자 (분자 X')를 의미한다.
분자 X에서, (i) 이 분자 X의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3는 일반적으로 서열 1에 기재된 초가변 영역과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 상동하고 (ii) 상기 분자 X는 그의 골격 영역과 동일한 골격 영역을 갖지만 서열 1에 기재된 것과 동일한 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 갖는 기준 분자와 실질적으로 동일한 정도로 IL-1β의 수용체와 IL-1β의 결합을 억제할 수 있다.
분자 X'에서, (i) 이 분자 X'의 초가변 영역 CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' 및 임의로 CDR1'와 CDR2'는 일반적으로 서열 1 및 2에 기재된 초가변 영역과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 상동하고, (ii) 상기 분자 X'는 그와 동일한 골격 영역 및 불변 부위를 갖지만 서열 1 및 2에 기재된 것과 동일한 초가변 영역 CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' 및 임의로 CDR1'와 CDR2'를 갖는 기준 분자와 실질적으로 동일한 정도로 IL-1β의 수용체와 IL-1β의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상세한 설명에서, 아미노산 서열은 이 서열이 최적으로 정렬되어 있을 때 같은 위치에서 80% 이상의 동일한 아미노산 잔기를 갖는 경우 서로 80% 이상 상동한 것인데, 이 아미노산 서열에 있는 갭 (gap) 또는 삽입은 동일하지 않은 잔기로 간주된다.
IL-1β와 그의 수용체의 결합의 억제는 이후 기재되는 분석을 비롯한 다양한분석에서 편리하게 시험할 수 있다. 사용되는 IL-1β 수용체는 바람직하게는 IL-1β 타입 1 수용체이다. 용어 "동일한 정도"는 기준 분자 및 동등한 분자가 통계학적으로 볼 때 위에서 언급된 분석 중 하나에서 본질적으로 동일한 IL-1β 결합 억제 곡선을 나타내는 것을 의미한다.
예를 들어, 사용된 분석은 가용성 IL-1 수용체 및 본 발명의 IL-1β 결합 분자에 의한 IL-1 결합의 경쟁 억제 분석일 수 있다.
가장 바람직하게는, 인간 IL-1β 항체는 적어도
a) 위치 1의 아미노산으로 시작하고 위치 118의 아미노산으로 끝나는, 서열 1에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 한 중쇄 및 인간 중쇄의 불변 부위; 및
b) 위치 1의 아미노산으로 시작하고 위치 107의 아미노산으로 끝나는, 서열 2에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 한 경쇄 및 인간 경쇄의 불변 부위
를 포함한다.
인간 중쇄의 불변 부위는 γ1, γ2, γ3, γ4, μ, α1, α2, δ또는 ε타입, 바람직하게는 γ타입, 보다 바람직하게는 γ1타입일 수 있는데 반하여, 인간 경쇄의 불변 부위는 κ또는 (λ1, λ2또는 λ3서브타입을 포함하는) λ타입일 수 있지만 바람직하게는 κ타입이다. 이들 모든 불변 부위의 아미노산 서열은 문헌 (Kabat et al ibid)에 기재되어 있다.
본 발명의 IL-1β 결합 분자는 재조합 DNA 기술로 생산할 수 있다. 이러한 관점에서, 상기 결합 분자를 코딩하는 1종 이상의 DNA 분자를 적당한 조절 서열 하에 위치하도록 제작하여 발현에 적합한 숙주 유기체 내로 전달해야 한다.
따라서, 매우 일반적인 방식에서, (i) 단일 도메인 IL-1β 결합 분자를 코딩하는 본 발명의 DNA 분자, 본 발명의 단일쇄 IL-1β 결합 분자, 본 발명의 IL-1β 결합 분자의 중쇄, 경쇄 또는 그의 단편, 및 (ii) 재조합 방법에 의해 본 발명의 IL-1β 결합 분자를 생산하기 위한 본 발명의 DNA 분자의 용도를 제공한다.
당분야의 현상태는 본원에 제공된 정보, 즉 초가변 영역의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 DNA 서열이 주어지면 당업자가 본 발명의 DNA 분자를 합성할 수 있는 상태이다. 가변 도메인 유전자를 제작하기 위한 방법은 예를 들어, EPA 제239 400호에 기재되어 있고 다음과 같이 짧게 요약할 수 있다. 어떠한 특이성이든지 특이성을 갖는 MAb의 가변 도메인을 코딩하는 유전자를 클로닝한다. 골격 및 초가변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 확인하고, 초가변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 제거하여 골격 영역을 코딩하는 DNA 단편이 연결부위에서 적당한 제한효소 부위와 연결되어 있도록 한다. 제한효소 부위는 표준 방법으로 DNA 분자의 돌연변이를 유발하여 적당한 위치에서 만들 수 있다. 이중 가닥 합성 CDR 카세트는 서열 1 또는 2에 기재된 서열에 따라 DNA 합성으로 제조한다. 이 카세트에는 이들이 골격의 연결부위에서 결찰될 수 있도록 부착 말단 (sticky end)이 제공되어 있다.
또한, 본 발명의 IL-1β 결합 분자를 코딩하는 DNA 제작물을 얻기 위해 생성된 하이브리도마 세포주로부터 반드시 mRNA를 얻을 필요는 없다. 따라서, PCT 출원 WO 90/07861에는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 서면 정보만 주어지면 재조합 DNA 기술로 항체를 생산하기 위한 완전한 설명이 기재되어 있다. 이 방법은 다수의 올리고뉴클레오티드의 합성, PCR 방법에 의한 유전자의 증폭, 및 원하는 DNA 서열을 얻기 위한 유전자의 스플라이싱을 포함한다.
적당한 프로모터, 또는 중쇄 및 경쇄 불변 부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 공개적으로 이용할 수 있다. 따라서, 일단 본 발명의 DNA 분자가 제조되면, 상기 분자를 적당한 발현 벡터 내로 편리하게 전달할 수 있다. 단일쇄 항체를 코딩하는 DNA 분자는 예컨대, WO 88/1649에 기재된 표준 방법으로 제조할 수도 있다.
앞서 말한 것에 비추어, 어떤 하이브리도마 또는 세포주 기탁도 충분한 설명의 기준에 부합하는 데 필요하지는 않다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 하기한 바와 같은, IL-1β 결합 분자의 생산을 위한 제1 DNA 제작물 및 제2 DNA 제작물을 포함한다:
제1 DNA 제작물은 중쇄 또는 그의 단편을 코딩하고, a) 아미노산 서열이 서열 1에 기재되어 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 초가변 영역과 골격을 교대로 포함하는 가변 도메인을 코딩하며, 이 가변 도메인의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 시작하고 상기 가변 도메인의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나는 제1 부위, 및 b) 중쇄 불변 영역의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 시작하고, 정지 코돈 앞에 있으며 상기 불변 영역 또는 그의 단편의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나는, 중쇄 불변 부위 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부위를 포함한다
바람직하게는, 이 제1 부위는 위치 1의 아미노산으로 시작하고 위치 118의 아미노산으로 끝나는, 서열 1에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 코딩한다. 보다 바람직하게는, 상기 제1 부위는 위치 1의 뉴클레오티드로 시작하고 위치 354의 뉴클레오티드로 끝나는, 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또한, 바람직하게는, 상기 제2 부위는 인간 중쇄의 불변 부위, 보다 바람직하게는 인간 γ1쇄의 불변 부위를 코딩한다. 이 제2 부위는 게놈 유래의 DNA 단편 (인트론을 포함함) 또는 cDNA 단편 (인트론을 포함하지 않음)일 수 있다.
제2 DNA 제작물은 경쇄 또는 그의 단편을 코딩하고, a) 아미노산 서열이 서열 2에 기재되어 있는 CDR3' 및 임의로 CDR1' 및 CDR2' 초가변 영역과 골격을 교대로 포함하는 가변 도메인을 코딩하며, 이 가변 도메인의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 시작하고 상기 가변 도메인의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나는 제1 부위, 및 b) 경쇄의 불변 부위의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 시작하며, 정지 코돈 다음에 있는, 불변 부위 또는 그의 단편의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나는, 경쇄 불변 부위 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부위를 포함한다.
바람직하게는, 이 제1 부위는 위치 1의 아미노산으로 시작하고 위치 107의 아미노산으로 끝나는, 서열 2에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 코딩한다. 보다 바람직하게는, 상기 제1 부위는 위치 1의 뉴클레오티드로 시작하고 위치 321의 뉴클레오티드로 끝나는, 서열 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또한, 바람직하게는 상기 제2 부위는 인간 경쇄, 보다 바람직하게는 인간 κ쇄의 불변 부위를 코딩한다.
본 발명은 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1, CDR2'또는 CDR3'의 잔기 중 하나 이상의 잔기가 예를 들어, 돌연변이, 예컨대, 상응하는 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 서열 1 및 서열 2에 기재된 잔기와는 다르게 바뀐 IL-1β 결합 분자도 포함한다. 본 발명은 이렇게 변한 IL-1β 결합 분자를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 특히, 본 발명은 CDR1' 또는 CDR2'의 잔기 중 하나 이상의 잔기가 서열 2의 잔기와 다르게 바뀐 IL-1β 결합 분자를 포함한다.
제1 및 제2 DNA 제작물에 있어서, 제1 부위 및 제2 부위는 인트론에 의해 분리되어 있을 수 있고, 인핸서 (enhancer)를 제1 부위와 제2 부위 사이에 있는 인트론에 편리하게 위치시킬 수 있다. 전사되지만 번역되지 않는 이러한 인핸서의 존재는 효율적인 전사를 도울 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제 1 및 제2 DNA 제작물은 바람직하게는 인간 유래의 중쇄 유전자의 인핸서를 포함한다.
각 DNA 제작물은 적당한 조절 서열의 조절, 특히 적합한 프로모터의 조절 하에 위치시킨다. 발현을 위해 DNA 제작물이 전달될 숙주 유기체에게 적합한 한, 어떠한 종류의 프로모터도 사용할 수 있다. 그러나, 포유동물 세포에서 발현시키는 경우, 이뮤노글로불린 유전자의 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예를 들어, 인간 CMV 프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
원하는 항체는 세포 배양물 또는 형질전환 동물에서 생산할 수 있다. 적합한 형질전환 동물은 적당한 조절 서열 하에 위치한 제1 및 제2 DNA 제작물을 난자 내로 주입하고, 이렇게 주입된 난자를 적당한 가임심 암컷 내로 전달하고, 원하는 항체를 발현하는 새끼를 선별하는 것을 포함하는 표준 방법에 따라 얻을 수 있다.
항체 사슬이 세포 배양물 중에서 생산될 때, DNA 제작물은 먼저 단일 발현 벡터, 또는 분리되어 있지만 상용가능한 두 개의 발현 벡터 내로 삽입되어야 하는데, 분리되어 있지만 상용가능한 두 개의 발현 벡터 내로 삽입하는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상술한 DNA 제작물 중 적어도 하나를 포함하는 원핵 세포주 또는 진핵 세포주에서 복제할 수 있는 발현 벡터도 제공한다.
이어서, DNA 제작물을 함유하는 각 발현 벡터를 적당한 숙주 유기체 내로 전달한다. DNA 제작물들이 두 개의 발현 벡터 상에 따로 삽입되어 있는 경우, 이들 제작물은 따로 전달될 수 있다. 즉, 세포 당 한 가지 유형의 벡터를 전달하거나 동시에 전달할 수 있는데, 동시에 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 숙주 유기체는 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포주일 수 있는데, 포유동물 세포주가 바람직하다. 보다 바람직하게는, 포유동물 세포주는 림프구 유래의 세포주, 예를 들어, 편리하게는 임의의 내재 항체 중쇄 또는 경쇄를 발현하지 않는 골수종, 하이브리도마 또는 정상 불멸 B-세포이다.
포유동물 세포에서 발현하는 경우, IL-1β 결합 분자 코딩 서열은 IL-1β 결합 분자의 고도 발현을 허용하거나 유리하게 하는 좌위 내의 숙주 세포 DNA 내로 삽입되는 것이 바람직하다. IL-1β 결합 분자 코딩 서열이 이러한 유리한 좌위 내로 삽입되어 있는 세포는 이들이 발현하는 IL-1β 결합 분자의 수준을 기준으로 확인하고 선별할 수 있다. IL-1β 결합 분자 코딩 서열을 함유하는 숙주 세포의 제조를 위해서는 임의의 적당한 선별 마커를 사용할 수 있는데, 예를 들어, dhfr 유전자/메토트렉세이트 또는 이와 동등한 선별 시스템을 사용할 수 있다. 본 발명의 IL-1β 결합 분자의 발현에 바람직한 시스템에는 유럽 특허 제0256055B호, 유럽 특허 제0323997B호 및 유럽 특허 출원 제89303964.4호에 기재된 시스템과 같은 GS-기재의 증폭/선별 시스템이 포함된다. 바람직하게는, 벡터는 원하는 경우, 발현, 발현된 단백질의 프로세싱 및 분비를 용이하게 하기 위한 다른 서열을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 벡터는 전형적으로 코딩 서열과 연결되어 있는 리더 서열을 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, (i) 위에 정의된 발현 벡터로 형질전환된 유기체를 배양하는 단계 및 (ii) 배양물로부터 IL-1β 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, IL-1β 결합 분자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서는, AAL160 항체가 인간 성숙 IL-1β의 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 결합 특이성을 나타낸다는 것을 발견하였다 (인간 성숙 IL-1β의 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25는 각각 인간 IL-1β 전구체의 잔기 138, 139, 140 및 141에 상응함). 이 에피토프는 IL-1 수용체의 인식 부위 밖에 있는 듯 하므로, 이 에피토프에 대한 항체, 예를 들어, AAL160 항체가 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있다는 본 발명의 발견은 가장 놀라운 것이다. 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는 항체, 특히 키메라 및 CDR-이식 항체 및 특히 인간 항체; 및 IL-1 매개 질환 및 장애의 치료를 위한 상기 항체들의 용도는 신규한 것이고 본 발명의 범위 내에 포함된다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 인간 성숙 IL-1β의 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 항체를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은
i) IL-1 매개 질환 및 장애의 치료에 있어서, 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 항체의 용도;
ii) 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 유효량의 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 IL-2 매개 질환 또는 장애의 치료 방법;
iii) 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 항체를 포함하는 제약 조성물; 및
iv) IL-1 매개 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조에 있어서, 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 항체의 용도
를 포함한다.
본원의 상세한 설명의 목적상, 항체는 그가 AAL160 항체와 실질적으로 동일한 정도로 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는 경우 IL-1β의 결합을 억제할 수 있는데, 여기서 "동일한 정도"는 위에 정의된 바와 같은 의미를 갖는다.
본원의 상세한 설명에서, 어구 "IL-1 매개 질환"에는 직접적으로든지 아니면 간접적으로든지 IL-1이 질환 또는 증상의 원인, 발달, 진행, 지속 또는 병의 경과를 비롯하여 질환 또는 의학적 증상에서 역할을 하는 모든 질환 및 의학적 증상이 포함된다.
본원의 상세한 설명에서, 용어 "치료" 또는 "치료한다"는 병을 앓을 위험이 있거나 병을 앓는 것으로 의심되는 환자뿐 아니라 질환 또는 의학적 증상을 앓거나 앓는 것으로 진단된 환자의 치료를 비롯하여 예방 또는 방지 치료 및 치유 또는 질환 완화 치료를 말하고 임상적 재발의 억제를 포함한다.
잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는 항체는 지금부터 본 발명의 항체로 불린다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 IL-1β가 변성된 상태, 예를 들어, SDS와 같은 변성제의 존재 하에 있는 것이 아니라 천연 상태, 예를 들어, 정상적인 생리학적 상태 하에 있는 경우 인간 IL-1β의 상기 에피토프에 대한 결합 특이성을 나타내는 항체이다. 본 발명의 항체는 잔기 22에서 Gly를, 잔기 23에서 Pro를, 잔기 24에서 Tyr를, 그리로 잔기 25에서 Glu를 포함하는 항원성 에피토프를 갖고 상응하는 인간 에피토프와 매우 유사한 비-인간 IL-1β와 교차반응할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 레수스 (rhesus) 원숭이 IL-1, 시아노몰구스 원숭이 IL-1 또는 마모셋트 원숭이 IL-1과 같은 영장류 IL-1β와 교차반응할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 본 발명의 제1 측면 및 제2 측면에 따른 IL-1β 결합 분자이다. 유리하게는, 본 발명의 항체는 인간 항체, 가장 바람직하게는 AAL160 항체 또는 그의 직접적 등가물이다.
본 발명의 항체는 표적 세포에 대한 IL-1β의 효과를 차단하므로, IL-1 매개 질환 및 장애의 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체의 이러한 약리학적 활성 및 다른 약리학적 활성은 예를 들어, 아래에 기재한 표준 시험 방법에서 입증할 수 있다.
1. IL-8 프로모터의 인간 IL-1β-매개 활성화의 중성화
IL-1β-의존성 세포 신호화를 중성화하는 능력은 레포터 유전자 분석에서 측정한다.
인간 흑색종 세포주 G361은 인간 IL-8 프로모터-기재의 루시퍼라제 레포터 유전자 제작물로 안정하게 형질감염시킨다. 레포터 유전자의 발현 및 활성은 이세포주에서 IL-1β 또는 TNF-α에 달려 있다. 세포는 6 내지 18,000 pM 내의 다양한 농도의 본 발명의 항체 또는 IL-1 수용체 길항제의 존재 하에 컨디셔닝 배지에서 300 pg/ml의 재조합 인간 IL-1β 또는 100 pg/ml의 등가물로 자극한다. 키메라 항체 시뮬렉트 (Simulect; 등록상표)를 대등한 이소타입 대조구로 사용한다. 루시퍼라제 활성은 화학발광 분석에서 정량한다. 본 발명의 항체를 이 분석에서 시험할 때 본 발명의 항체의 IC50은 전형적으로 약 1 nM (예를 들어, 약 0.2 내지 약 5 nM)이다.
2. 일차 인간 섬유아세포에 의한 PGE 2 및 인터루킨-6의 IL-1β 의존성 생산의 중화
일차 인간 피하 섬유아세포에서의 PGE2및 인터루킨-6의 생산은 IL-1β에 의존한다. TNF-α는 단독으로 이들 염증 매개자를 효율적으로 유도할 수는 없지만 IL-1을 상승작용시킨다. 일차 피하 섬유아세포는 IL-1에 의해 유도되는 세포 활성화에 대한 대용 모델로 사용한다.
일차 인간 섬유아세포는 6 내지 18,000 pM 내의 다양한 농도의 본 발명의 항체 또는 IL-1RA의 존재 하에 LPS-자극 인간 PBMC로부터 수득되는 재조합 IL-1β 또는 컨디셔닝 배지로 자극한다. 키메라 항-CD25 항체 시뮬렉트 (바실릭시마브; 등록상표)를 대등한 이소타입 대조구로 사용한다. 16시간 동안의 자극 후 상등액을 얻고 ELISA에 의해 IL-6를 분석하거나 RIA에 의해 PGE2를 분석한다. 상술한 바와 같이 시험한 경우, IL-6 생성의 억제에 대한 본 발명의 항체의 IC50은 전형적으로약 1 nM 이하 (예를 들어, 약 0.1 내지 약 1 nM)이고, PGE2생성의 억제에 대한 본 발명의 항체의 IC50은 전형적으로 약 1 nM (예를 들어, 약 0.1 내지 약 1 nM)이다.
상기 분석에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 IL-1β의 효과를 효과적으로 억제한다. 따라서, 본 발명의 항체는 다음과 같은 제약학적 용도를 갖는다.
본 발명의 항체는 IL-1 매개 질환 또는 의학적 증상, 예를 들어, 염증성 증상, 알레르기 및 알레르기성 증상, 과민성 반응, 자가면역 질환, 심각한 감염, 및 기관 또는 조직 이식 거부반응의 예방 및 치료에 유용하다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 심장, 폐, 조합된 심장-폐, 간, 신장, 췌장, 피부 또는 각막 이식의 수용자의 치료, 및 골수 이식 후의 이식-대-숙주 질환과 같은 이식-대-숙주 질환의 예방을 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 항체는 자가면역 질환 및 염증성 증상, 특히 골 손실, 염증성 동통, 과민증 (기도 과민증 및 피부 과민증을 포함함) 및 알레르기를 수반하는 염증성 증상 및 관절 질환을 비롯하여, 관절염 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형성 관절염) 및 류마티스성 질환과 같은 자가면역 성분을 포함하는 병인을 갖는 염증성 증상의 치료, 예방 또는 완화에 특히 유용하다. 본 발명의 항체가 사용될 수 있는 특정한 자가면역 질환에는 혈액학적 자가면역 질환 (예를 들어, 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 순수한 적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판감소증을 포함함), 전신 홍반성 루프스, 다연골염, 경화종증, 웨게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 열대성설사, 자가면역 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병 및 자극성 장 증후군을 포함함), 내분비성 안질, 그레이브스병, 사르코이도시스, 다발성 경화증, 원발성 담즙성간경변, 연소자 당뇨병 (당뇨병 타입 I), 포도막염 (전방 및 후방), 건성 각결막염, 봄에 일어나는 각결막염, 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염 및 사구체신염 (예를 들어, 특발성 신증후군 또는 최소 변화 신병증을 포함하는 신증후군이 있거나 없음)이 포함된다.
본 발명의 항체는 천신, 기관지염, 진폐, 폐기종 및 다른 기도 파괴 또는 염증성 기도 질환의 치료, 예방 또는 완화에도 유용하다.
본 발명의 항체는 IL-1에 의해 매개되거나 IL-1, 특히 IL-1β의 생성 또는 IL-1에 의한 TNF 방출의 촉진을 수반하는 원치않는 급성 및 과급성 염증 반응, 예를 들어, 급성 감염, 예를 들어, 폐혈증성 쇼크 (예를 들어, 내독소성 쇼크 및 성인 호흡 곤란 증후군), 수막염, 폐렴 및 심각한 화상의 치료, 및 감염 후의 질환성 TNF 방출, 암 또는 기관 기능저하와 관련된 악액질 또는 소모성 질환, 특히, 예를 들어, HIV의 감염과 관련되어 있거나 HIV의 감염의 결과로서 일어나는 AIDS-관련 악액질의 치료에 유용하다.
본 발명의 항체는 골관절염, 골다공증 및 기타 염증성 관절염을 비롯한 골 대사 질환, 일반적으로 연령-관련 골손실을 포함하는 골손실 및 특히 치주 질환의 치료에 특히 유용하다.
본 발명의 항체는 암, 특히 IL-1 의존성 종양의 치료에 사용할 수 있다.
이들 증상의 경우, 적당한 투여량은 예를 들어, 사용할 본 발명의 구체적인항체, 숙주, 투여 방식, 및 치료할 증상의 특성과 심각도에 달려 있을 것이다. 그러나, 예방 용도의 경우, 일반적으로 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 5 mg의 일일 투여량을 사용하는 경우 만족스러운 결과가 얻어진다. 본 발명의 항체는 비경구, 정맥내, 전주 또는 다른 말초 정맥내, 근육내 또는 피하로 편리하게 투여한다. 예방 치료는 전형적으로 2 내지 4주 동안 매일 1회 내지 주당 1회씩 본 발명의 분자를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 통상적인 방식으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 동결건조된 형태로 투여한다. 즉석 투여의 경우, 상기 조성물은 적당한 수성 담체, 예를 들어, 주사용 멸균수 또는 멸균 완충 생리식염수에 용해시킨다. 볼루스 주사, 예컨대, 피하 볼루스 주사보다는 관주, 예를 들어, 정맥내 관주에 의한 투여를 위한 보다 많은 부피의 용액을 만드는 것이 바람직하다고 생각되는 경우, 인간 혈청 알부민 또는 환자 자신의 헤파린-처리 혈액을 제형화시 식염수 내로 혼입하는 것이 바람직하다. 이러한 생리학적으로 불활성인 단백질이 과량으로 존재하면 용기의 벽 및 관주 용액과 함께 사용된 튜브 상에의 흡착에 의한 항체의 손상이 일어나지 않는다. 알부민이 사용되는 경우, 적당한 농도는 식염수 용액 중량을 기준으로 0.5 내지 4.5 중량%이다.
본 발명은 수반되는 도면을 언급하는 하기 실시예에서의 설명만으로 더 기재되어 있다.
도 1은 가용성 IL-1 타입 I 및 타입 II 수용체에 의한, IL-1β와 AAL160의 경쟁 억제를 나타내는 그래프이고;
도 2는 AAL160에 의한, 래트 모델에서의 IL-1β-유도 발열의 억제를 보여주는 그래프이고;
도 3은 래트 IL-1β-유도 발열에서 AAL160의 작용 지속을 보여주는 그래프인 도 3.
뮤린 이뮤노글로불린 레파토리 대신에 인간 IgG/κ 레파토리를 발현하도록 조작된 형질전환 마우스 (Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol., 14,845-851)를 사용하여 인간 IL-1β에 대한 항체를 생성시켰다. 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 이들 마우스로부터 얻은 B 세포를 불멸 세포로 만들고, 인간 IgGl/κ항체 AAL160를 분비하는 뮤린 하이브리도마 세포를 얻었다.
실시예 1: 하이브리도마의 생성 및 항체의 정제
면역보강제 중의 재조합 인간 IL-1β(50 ㎍)을 여러 부위에 주사하여, 유전공학적으로 조작된 마우스 66 (Medarex Inc. Annadale, NJ)를 면역화시켰다. 5회 추가 주사하되 융합하기 3일 전 마지막으로 주사하여 마우스를 부스팅하였다. 융합하는 날, 마우스 66을 CO2흡입에 의해 죽이고, PEG 4000을 사용하는 통상적인 방법으로 비장 세포 (4.1 x 107)를 동일한 수의 PAI-O (마우스 골수종 세포주)와 융합시켰다. HAT로 보충된 RPMI 1640 (10% 열 불활성화 소태아 혈청 5 x 10-5M 및 β-메르캅토에탄올 함유함) 중의 융합된 세포를 마우스 복막 세포 (BalbC 마우스) 함유 624 웰 (1 ml/웰)에 플레이팅하였다. 상등액을 모으고 ELISA에서 시험하고 IL-1β 반응성 모노클로날 항체에 대해 스크리닝하였다. IgG/κ서브클래스의 5가지 모노클로날 항체를 확인하였다. 웰 당 0.5 세포가 플레이팅된 4 x 96 웰 마이크로타이터 프레이트를 사용하여 클로닝을 수행하였다. 2주 후, 웰을 역상 현미경으로 관찰하였다. 생장에 대해 양성을 나타내는 웰로부터 상등액을 모으고, 항-IL-1β 모노클로날 항체의 생성을 ELISA로 측정하였다. 처음으로 확인된 #476의 4 가지 서브클론으로부터 1-2 L의 컨디셔닝 상등액을 얻고, 단백질 A 컬럼 상의 친화 크로마토그래피로 항체를 정제하였다.
중쇄 및 경쇄의 순도 및 부분 아미노산 서열
아미노산 시퀀싱
정제된 항체 AAL160의 경쇄 및 중쇄를 SDS-PAGE로 분리하고, 아미노-말단 아미노산을 에드만 분해로 확인하였다. 시퀀싱한 결과, 이 연구에 사용된 항체의 순도는 >90%이었다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 cDNA 서열은 클로닝된 하이브리도마 세포로부터 얻은 mRNA로부터 수득된 cDNA의 PCR 증폭에 의해 얻고 완전히 시퀀싱하였다. CDR이 굵은 활자로 나타나 있는, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의아미노-말단 서열 및 상응하는 DNA 서열은 다음과 같다.
AAL160의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열 및 상응하는 아미노산 서열도 서열 1 내지 4로서 첨부된 서열 목록에 기재되어 있다.
중쇄 및 경쇄용 발현 벡터의 제작
클로닝된 VL및 VH코딩 서열은 PCR로 증폭하고 이뮤노글로불린 프로모터, RFT2 항체의 리더 서열 (Heinrich et al. (1989) J. Immunol. 143,3589-97), J-절편의 일부 및 스플라이싱 공여 부위를 제공하는 카세트 벡터 내로 적당한 제한효소 부위를 통해 삽입하였다. 전체 VL영역, 프로모터 및 분비용 리더 서열을 함유하는 경쇄 카세트는 인간 Cκ유전자, 이뮤노글로불린 중쇄 인핸서, 및 메토트렉세이트 (MTX)에 의한 선별용 변형 뮤린 dhfr cDNA가 함유된 발현 벡터 내로 옮겼다.
중쇄 카세트는 인간 IgG1 유전자, 이뮤노글로불린 중쇄 인핸서 및 선별용 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 발현 벡터 내로 전달하였다.
중쇄 및 경쇄 둘다 고발현도에 중요한 것으로 생각되는 재배열된 이뮤노글로불린 유전자의 게놈 입체구조와 유사한 발현 벡터 내의 입체구조를 갖는다.
항체 생산의 경우, 상기 벡터를 적당한 숙주 세포주, 예를 들어, SP2/0 세포주 내로 동시 형질감염시키고, 벡터 서열을 함유하는 세포를 메토트렉세이트 선별로 선별하고, 선별된 세포주를 배양하여 AAL160 항체를 발현시켰다. 별법으로, 유럽 특허 제0256055B호, 유럽 특허 제0323997B호 또는 유럽 특허 출원 제89303964.4호에 기재된 것과 같은 GS-기재 증폭/선별 시스템을 사용할 수 있는데, 이 경우, dhfr 선별 마커는 GS 코딩 서열로 바꾼다.
실시예 2: 생화학적 데이타 및 생물학적 데이타
모노클로날 항체 AAL160은 시험관내에서 인터루킨-1β의 활성을 중화시키는 것으로 확인되었다. 이 모노클로날 항체의 특징을 더 규명하여 상기 항체가 재조합 인간 IL-1β에 결합하는지를 BIA코어 분석으로 확인하였다. 중화 방식은 가용성 IL-1 수용체를 사용한 경쟁 결합 연구로 조사하였다. IL-1β에 의한 자극에 반응한, 재조합 IL-1β 및 천연 생산 IL-1β에 대한 항체 AAL160의 생물 활성은 일차 인간 세포 (실시예 3)에서 측정하였다.
2.1 해리 평형 상수의 측정
재조합 인간 IL-1β와 AAL160의 결합에 대한 결합률 및 해리율 상수는 BIA코어 분석으로 측정하였다. AAL160를 고정시키고, 0.5 내지 12 nM 농도의 재조합 IL-1β의 결합을 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다. 선택된 포맷은 IL-1β와 AAL160의 결합이 1:1 화학량론에 따라 일어나도록 허용한다. 데이타 분석은 BIA평가 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
결합률 상수 [M-1s-1] (n=15) (3.91 ±0.14) x 105 평균 ±SEM
해리율 상수 [s-1] (n=15) (1.53 ±0.05) x 10-4 평균 ±SEM
해리 평형 상수 KD[M] (n=15) (396.6 ±19.5) x 10-12 평균 ±SEM
AAL160은 고친화도로 재조합 인간 IL-1β에 결합한다.
2.2. 가용성 IL-1 수용체와의 결합의 경쟁 억제
가용성 IL-1 타입 및 II 수용체를 사용한 결합 경쟁 연구
AAL160과 가용성 인간 IL-1 타입 I 및 II 수용체 사이의 경쟁은 BIA코어로 측정하였다. AAL160을 칩 표면에 고정시키고, 증가되는 농도의 재조합 인간 가용성 수용체 I (0-10nM) 또는 수용체 II (0-80 nM)의 부재 또는 존재 하에 AAL160과의 결합하는 재조합 인간 IL-1β (8 nM)을 주사하였다. 얻은 결과는 도 1에 나타내었다. NVP AAL160 NX-1 과 IL-1β의 결합은 IL-1 수용체 타입 I 및 타입 II 둘다와 경쟁한다.
2.3. 설치류 및 원숭이 종으로부터 얻은 인간 IL-1α, 인간 IL-1RA 및 IL-1β에 대한 반응성 프로필
인간 IL-1α, 인간 IL-1RA, 및 뮤린, 래트, 토끼 및 시아노몰구스 원숭이 IL-1β에 대한 AAL160의 반응성 프로필은 BIA코어 분석으로 측정하였다. AAL160을 고정시키고, 조사한 사이토킨을 8 nM (또는 IL-1β의 경우에는 20 nM)의 농도로 가하였다.
총 결합률(%) ±SEM
인간 IL-1β 100
인간 IL-1α 0.7 ±0.7 (n=3)
인간 IL-1Ra 1.2 ±1.2 (n=3)
마우스 IL-1β 2.8 ±1.5 (n=3)
래트 IL-1β 3.0 ±2.5 (n=3)
시아노몰구스 IL-1β 96.4 ±6.8 (n=3)
토끼 IL-1β 12.1 ±2.3 (n=4)
AAL160은 인간 IL-1α, 인간 IL-1Ra, 또는 뮤린, 래트 또는 토끼 IL-1β와 별로 교차반응하지 않았다. 시아노몰구스 원숭이 IL-1β에 대한 반응성은 인간 사이토킨과 실질적으로 동일하였다.
실시예 3: 일차 인간 섬유아세포에 의한 PGE 2 및 인터루킨-6의 IL-1β-의존성 생성의 중화
일차 인간 피부 섬유아세포에서의 PGE2및 인터루킨-6의 생성은 IL-1β에 의존한다. TNF-α만으로는 이들 염증성 매개자를 효율적으로 유도할 수 없지만, IL-1과 상승작용하였다. 일차 피부 섬유아세포는 IL-1에 의해 유도되는 세포 활성화에 대한 대용 모델로 사용하였다.
일차 인간 섬유아세포는 6 내지 18,000 pM의 다양한 농도의 AAL160 또는 IL-1RA의 존재 하에 LPS-자극 인간 PBMC로부터 얻은 재조합 IL-1β 또는 컨디셔닝 배지로 자극하였다. 키메라 항-CD25 항체 시뮬렉트 (바실릭시마브)를 대등한 이소타입 대조구로 사용하였다. 자극한지 16시간 후 상등액을 취하여 ELISA로 IL-6에 대해 분석하고 RIA로 PGE2에 대해 분석하였다.
AAL160IC50±SEM (n≥3) IL-1 RaIC50±SEM (n≥3)
IL-6 분비재조합 0.34 ±0.037 nM n.d.
IL-6 분비농축 배지 0.6 ±0.09 nM 0.03 ±0.001 nM
PGE2생성농축 배지 0.79 ±0.17 nM n.d.
AAL160은 재조합 및 천연 IL-1β 둘다와 유사한 IC50으로 인간 피부 섬유아세포에서 IL-6 및 PGE2의 생성을 효율적으로 차단하였다.
실시예 4: AAL160의 생체내 효능 및 작용 지속
효능:
항-huIL-1β 항체인 AAL160의 생체내 효능은 huIL-1β (100 ng/래트)의 정맥내 주사에 의해 발열이 유도된 래트 모델에서 시험하였다. 상기 항체는 1, 3 및 10 ㎍/kg (n = 6 마리의 래트)의 정맥내 투여량에 걸쳐 투여량 의존적 발열 반응 억제를 일으켰다 (도 2 참조). CHI (시뮬렉트 (등록상표), 바실릭시마브)를 대조구 항체로 사용하였다.
작용 지속:
AAL-160의 작용 지속은 다음과 같은 래트 IL-1β-유도 발열에서 조사하였다. 인간 IL-1β의 정맥내 주사에 의한 발열의 유도 24시간 전 또는 30분 전 (표준 프로토콜)에 항체를 정맥내 주사하고, 2시간 및 4시간 후에 체온을 측정하였다. 상기 2시간 및 4시간 후에서 나타난 발열 반응의 억제도는 유사하였다 (도 3 참조). 예측된 바와 같이, 대조구 항체 CHI 621 (시뮬렉트 (등록상표), 바실릭시마브)는 상기 두 시점에서 비효과적이었다. 이러한 발견은 AAL160 인간 항체가 래트에서 24시간 이상 동안 활성 형태로 존재하고 이 시간 동안 조직에서 대사되거나 분비되거나 결합되지 않음을 시사한다.
실시예 5: AAL-160 Fab 및 그와 IL-1β의 결합체의 X-선 연구
2.0Å 해상도에서의 AAL-160의 구조 결정:
50% PEG 200, 0.1 M CHES (pH 9.5) 중에서 현수 소적 기술로 증기를 분산시켜 성장시킨 Fab 결정으로부터 매우 우수한 질의 2.0Å 해상 데이타 셋트 (Rsym= 0,051, 완성도 = 99.9%, 여분 = 8.2)를 모았다. 결정은 단위 세포 용적 a=62.17Å b=89.83Å c=123.73Å 및 대칭 단위 (매튜 계수: 3.6Å3/Da, 추정 용매 함량: 66%) 당 한 Fab 분자를 갖는 공간군 P212121에 있었다 . 이 구조는 분자 교체의 의해 결정하였고 최종 결정 R-인자 0.209 (자유 R-인자 = 0.261)까지 정제하였다. 최종 모델에는 경쇄의 잔기 1-213, 중쇄의 잔기 1-131 및 138-218, 387개의 수분자 및 1개의 PEG 분자가 포함된다. 최종 전자 밀도는 경쇄의 Trp94 (CDR3)을 제외하고 모든 CDR 잔기에 대해 잘 정의되었다. 이 잔기의 측쇄 위치는 현재까지 조사된 2종의 결정 형태로 잘 정의되지 않으므로, 상기 잔기가 결합된 항원의 부재 하에 높은 유동성을 나타냄을 알 수 있다.
IL-1β와 Fab 결합체의 결정화 및 상기 결합체의 예비 실험적 모델:
항원 IL-1β와 결합되어 있는 소수의 AAL160 Fab 결정을 2.0 M의 황산암모늄, 0.1 M 트리스 (pH 8.5) 중의 1:1 결합체 원액 76 mg/ml로부터 얻었다. 상기 결정은 수주의 기간에 걸쳐 매우 서서히 성장하였다. 이들은 홈 공급원 상에서 약 3.2Å까지 약하게 회절하였다. 예비 데이타 셋트를 모으고, 자유 Fab 및 인간 IL-1β의 고해상 구조를 출발 모델로 사용하여 분자 교체를 시도하였다 (J. P. Priestle et al., EMBO J. 7,339 (1988)). Fab의 Fv 및 Fc 부분이 별개의 모듈로서 사용되었을 때 매우 맑고 명백한 용액이 만들어질 것으로 예측되었다 (8.0과3.5Å 사이의 데이타를 사용하여 AMORE FITTING 단계 후, 상관성 67.1%, R-인자 0.354). 그 후, Fab의 유리 형태 및 결합된 형태를 비교한 결과, 굴곡각이 두 구조에서 매우 다르다는 것을 알 수 있었다. 분자 교체 예측의 결과는 항원 IL-1β와 모노클로날 항체 AAL160 사이의 상호작용의 첫번째 분자 모델을 제공하였다. 이러한 상호작용의 예비 분석은 1) IL-1β가 중쇄의 모든 3개 CDR 및 경쇄의 CDR3와 밀접하게 상호작용한다는 것을 나타내었다. 반대로, 경쇄의 CDR1 및 CDR2를 수반하는 상호작용은 있다해도 거의 없다. 2) 성숙 IL-1β의 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프는 항원-결합 부위의 중심에서 결합하므로 에피토프의 핵심 성분인 것으로 보인다. 매우 흥미롭게도, 이 루프는 마우스 IL-1β와 가장 다른 분자의 영역에 위치하지 않는다. Pro23, Tyr24 및 Glu25는 보존되어 있지만, 인간 IL-1β의 잔기 22는 Gly이고 마우스 IL-1β의 잔기 22는 Asp이었다. 인간 (PDB 엔트리 2ilb) 및 마우스 IL-1β (PDB 엔트리 8ilb)의 결정 구조를 비교한 결과, 이 점 돌연변이가 Pro23 주변 주쇄의 매우 다른 입체구조를 초래한다는 것을 알 수 있었다. 이 국소적 구조 차이는 마우스 사이토킨에 대한 AAL160의 교차 반응이 없다는 관찰 결과와 일치하였다.
<서열 목록>
<110> Novartis AG
<120> ANTIBODIES TO HUMAN IL-1 BETA
<130> 4-31289A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.0
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 1
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc agc tac 96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg atc atc tat cct agt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192
Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga tat acc aac tgg gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca 336
Ala Arg Tyr Thr Asn Trp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
atg gtc acc gtc tct tca 354
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Thr Asn Trp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 3
gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc tac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctt gag cct240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc aac tgg atg ttc 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Phe
85 90 95
cct ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 321
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Phe
85 90 95
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (12)

  1. 아미노산 서열 Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly을 갖는 초가변 영역 CDR1, 아미노산 서열 Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly을 갖는 초가변 영역 CDR2 및 아미노산 서열 Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile을 갖는 초가변 영역 CDR3을 순서대로 포함하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는 IL-1β 결합 분자 및 그의 직접적 등가물.
  2. a) 아미노산 서열 Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly을 갖는 초가변 영역 CDR1, 아미노산 서열 Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly을 갖는 초가변 영역 CDR2 및 아미노산 서열 Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile을 갖는 초가변 영역 CDR3을 순서대로 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH); 및
    b) 아미노산 서열 Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro을 갖는 CDR3' 초가변 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL)
    을 포함하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 IL-1β 결합 분자 및 그의 직접적 등가물.
  3. 제2항에 있어서, 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL)이 아미노산 서열 Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala을 갖는 초가변 영역 CDR1', 아미노산 서열 Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr을 갖는 초가변 영역 CDR2' 및 아미노산 서열 Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro을 갖는 초가변 영역 CDR3'를 순서대로 포함하는 것인 IL-1β 결합 분자 및 그의 직접적 등가물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 IL-1β 결합 분자.
  5. 위치 1의 아미노산에서 시작하고 위치 128의 아미노산에서 끝나는 서열 1에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 제1 도메인을 포함하거나, 또는 상기 제1 도메인, 및 위치 1의 아미노산에서 시작하고 위치 107의 아미노산에서 끝나는 서열 2에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 제2 도메인을 포함하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 IL-1β 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1 매개 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 IL-1β 결합 분자.
  7. a) 골격, 및 아미노산 서열이 서열 1에 기재된 초가변 영역 CDR1, CDR2 및CDR3을 교대로 포함하는 가변 도메인을 코딩하며, 상기 가변 도메인의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 시작하고 상기 가변 도메인의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나는 제1 부위; 및
    b) 중쇄의 불변 부위의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 시작하고 상기 불변 부위 또는 그의 단편의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나고 그 다음에 정지 코돈이 이어지는, 중쇄 불변 부위 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부위
    를 포함하는, 중쇄 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 DNA 제작물.
  8. 골격, 및 아미노산 서열이 서열 2에 기재된 CDR3' 및 임의로 CDR1' 및 CDR2' 초가변 영역을 교대로 포함하는 가변 도메인을 코딩하며, 상기 가변 도메인의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 시작하고 상기 가변 도메인의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나는 제1 부위, 및
    b) 경쇄의 불변 부위의 제1 아미노산을 코딩하는 코돈으로 시작하고 불변 부위 또는 그의 단편의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 끝나며 그 다음에 정지 코돈이 이어지는, 경쇄 불변 부위 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부위
    를 포함하는, 경쇄 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 DNA 제작물.
  9. 제7항 또는 제8항에 따른 하나 이상의 DNA 제작물을 포함하는 원핵세포주 또는 진핵세포주에서 복제할 수 있는 발현 벡터.
  10. (i) 제9항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 유기체를 배양하는 단계; (ii) 배양물로부터 IL-1β 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, IL-1β 결합 분자의 제조 방법.
  11. 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 성숙 인간 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 항체.
  12. i) IL-1 매개 질환 및 장애의 치료에 있어서, 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 항체의 용도;
    ii) 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 유효량의 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 IL-1 매개 질환 및 장애의 치료 방법;
    iii) 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 항체를 포함하는 제약 조성물; 및
    iv) IL-1 매개 질환 및 장애의 치료용 약제의 제조에 있어서, 잔기 Gly22, Pro23, Tyr24 및 Glu25를 포함하는 루프를 포함하는 인간 성숙 IL-1β의 항원성 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 나타내며 IL-1β와 그의 수용체의 결합을 억제할 수 있는, IL-1β에 대한 항체의 용도.
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