SK10352002A3

SK10352002A3 - Rekombinantná protilátka proti humánnemu interleukínu-1beta a farmaceutická kompozícia obsahujúca túto protilátku

Info

Publication number: SK10352002A3
Application number: SK1035-2002A
Authority: SK
Inventors: Hermann Gram; Padova Franco E. Di
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2003-03-04
Also published as: EP1248804B2; TR200201780T2; EP1248804B1; NO329816B1; RU2002121649A; US20030124617A1; NO20023266L; DK1248804T4; SI1248804T1; PL356297A1; NO20023266D0; DK1248804T3; SK288054B6; IL150551A0; PE20011219A1; GB0001448D0; CN1395581A; MXPA02007091A; CZ302738B6; DE60124863D1

Description

Rekombinantná protilátka proti humánnemu interleukinu-1 beta a farmaceutická kompozícia obsahujúca túto protilátku

Oblasť techniky ' , .

Predkladaný vynález sa týka protilátky proti humánnemu interleukínu I beta (IL-Ιβ) a použitia tejto protilátky pri liečení ochorení a porúch sprostredkovaných IL-1.

Doterajší stav techniky

Interieukín 1 (IL-1) je aktivita produkovaná bunkami imunitného systému, ktorá pôsobí ako mediátor akútnej fázy zápalovej reakcie. Nevhodná alebo nadmerná tvorba IL-1, najmä potom IL-Ιβ, je patologický stav, ktorý vedie k rôznym ochoreniam a poruchám ako je napr. septikémia, septický alebo endotoxický šok, alergia, astma, strata kostnej hmoty, ischémia, infarkt, reumatoidná artritída a ďalšie zápalové ochorenia. Protilátky proti IL-Ιβ už boli navrhnuté na použitie pri liečení IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch, pozri napr. WO 95/01997 a diskusia v úvode uvedeného dokumentu.

Pôvodcovia predkladaného vynálezu pripravili zlepšené protilátky proti humánnemu IL-Ιβ na použitie na liečenie IL-I sprostredkovaných ochorení a porúch.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá obsahuje miesto viažuce antigén, ktoré obsahuje aspoň jednu variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu (V_H) , ktorá v sekvencii obsahuje hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, kde

CDR1 má aminokyselinovú sekvenciu Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2 má aminokyselinovú sekvenciu Iie-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-ThrArg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly a CDR3 má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Iie; a jej priame ekvivalenty.

Prvý aspekt vynálezu poskytuje jednodoménovú molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá obsahuje izolovaný ťažký reťazec imunoglobulinu obsahujúci variabilnú doménu ťažkého reťazca (V_H) , ktorá bola definovaná.

Druhý aspekt predkladaného vynálezu ďalej poskytuje molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá obsahuje variabilné domény ako ťažkého reťazca (V_H) tak ľahkého reťazca (V_L) , pričom molekula viažuca IL-1β obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén obsahujúci:

a) variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulinu (V_H) , ktorá v sekvencii obsahuje hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3 a síce CDR1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Tyr-ProSer-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Giy a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-ľrp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, a

b) variabilnú doménu lahkého reťazca imunoglobulinu (V_L) , ktorá obsahuje hypervariabilný úsek CDR3', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro, a jej priame ekvivalenty.

V konkrétnom uskutočnení druhého aspektu vynález poskytuje molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá obsahuje variabilné domény ako ťažkého (V_H) tak lahkého (V_L) reťazca, kde molekula viažuca IL-Ιβ obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén obsahujúci:

a) variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulinu (V_H) , ktorá v sekvencii obsahuje hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, a to CDR1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, a

b) variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulínu (V_L) , ktorá obsahuje v sekvencii hypervariabilné úseky CDRľ, CDR2' a CDR3', a to CDRľ, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, CDR2', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a CDR3', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro, a jej priame ekvivalenty.

Pokiaľ nie je vyslovene uvedené inak, každý polypeptidový reťazec je v tomto texte opísaný ako sekvencia začínajúca N-koncovým úsekom a končiaca C-koncovým úsekom.

Keď väzbové miesto pre antigén obsahuje obe V_H a V_L domény, tieto domény môžu byť lokalizované na rovnakej molekule polypeptidu, alebo výhodne každá doména môže byť na inom reťazci, pričom doména V_H je časťou ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo jeho fragmentu a V_L je časťou ľahkého reťazca imunoglobulínu alebo jeho fragmentu.

Termín „molekula viažuca IL-lpa označuje v predkladanom opise akúkoľvek molekulu schopnú väzby na antigén IL-Ιβ, buď samotnému alebo asociovanému s ďalšími molekulami. Väzbová reakcia môže byť dokázaná pomocou štandardných metód (kvalitatívnych testov), ako je napríklad biologický test (bioassay) na stanovenie inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor alebo akýkoľvek iný test väzby, vždy vzhľadom na test s negatívnou kontrolou, keď sa použije protilátka s nepríbuznou špecificitou, ale rovnakým izotypom, napr. protilátka anti-CD25. Výhodne, môže byť väzba moleRuly viažuca IL-Ιβγ podľa vynálezu na IL-Ιβ demonštrovaná použitím kompetitívneho väzbového testu.

Príklady molekúl viažucich antigén sú protilátky tvorené B lymfocytmi, hybridómami, chimérickými protilátkami s „vštepenými” CDR („CDR-grafted”) alebo humánne protilátky alebo akékoľvek ich fragmenty, napr. fragmenty F(ab')2 a Fab a tiež jednoreťazcové („single chain) protilátky alebo jednodoménové („single domain”) protilátky.

Jednoreťazcová protilátka pozostáva z variabilnej domény ťažkého a ľahkého reťazca protilátky kovalentne spojených pomocou peptidovej spojky („linker”), ktorú tvorí obvykle 10 až 30 aminokyselín, výhodne 15 až 25 aminokyselín. Teda taká štruktúra neobsahuje konštantné úseky ťažkého a lahkého reťazca a verí sa, že malý'spojovací peptidový úsek by mal byť menej antigénny než celý konštantný úsek protilátky.

Termín „chimérická protilátka” v opise označuje protilátku, v ktorej konštantné úseky ťažkého alebo lahkého reťazca alebo oboch sú humánneho pôvodu, zatiaľ čo variabilné domény ako ťažkého tak lahkého reťazca sú iného než humánneho pôvodu (non-humánne), napr. myšieho, alebo sú humánneho pôvodu, ale pochádzajú z odlišnej humánnej protilátky.

Termín „CDR-vštepená protilátka označuje protilátku, v ktorej hypervariabilné úseky (CDR) pochádzajú z donorovej (darcovskej) protilátky ako je napríklad non-humánna (napr. myšia) protilátka alebo odlišná humánna protilátka, zatiaľ čo všetky alebo v podstate všetky ďalšie časti imunoglobuiínu, napr. konštantné úseky a vysoko konzervatívne úseky variabilnej domény, t.j. úseky definujúce rámec protilátky („framework”), pochádzajú z akceptorovej (príjemcovej) protilátky, napr. protilátky humánneho pôvodu. „CDR-vštepená protilátka” môže však obsahovať 'niekoľko aminokyselín donorovej sekvencie v úseku rámca, napríklad v úsekoch rámca susediacich s hypervariabilnými úsekmi.

Termín „humánna protilátka označuje protilátku, v ktorej konštantné a variabilné úseky ťažkého a lahkého reťazca sú všetky humánneho pôvodu alebo majú sekvencie v podstate identické so sekvenciami humánneho pôvodu, nie je podmienkou, aby boli z rovnakej protilátky, a patria sem aj protilátky produkované v myšiach, v ktorých boli gény pre variabilné a konštantné časti imunoglobulínu nahradené ich humánnymi proťajškami, napr. ako je opísané všeobecne v dokumentoch EP 0546073 BI, US Patent 5545806, US Patent 5569825, US Patent 5625126, US .Patent 5633425, US Patent 5661016. US Patent 5770429, EP 0 438474 BI a EP 0 463151 BI.

Zvlášť výhodné molekulu viažuce IL-Ιβ podlá vynálezu sú humánne protilátky, obzvlášť protilátka AAL160, ktorá je ďalej opísaná v príkladoch.

Teda vo výhodných chimérických protilátkach sú variabilné domény ako ťažkého tak aj lahkého reťazca humánneho pôvodu, napríklad také, aké sú v protilátke AAL 160 a sú v zozname sekvencií uvedené ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a sekvencia SEQ ID NO: 2. Domény konštantného úseku výhodne tiež obsahujú vhodné humánne domény konštantného úseku, napríklad ako sú opísané v „Sequences of Proteines of Immunological Interest, Kabat E.A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Inštitúte of Health.

Hypervariabilné úseky môžu byť asociované s akýmikoľvek úsekmi rámca protilátky, avšak výhodne humánneho pôvodu. Vhodné úseky rámca protilátok sú opísané v Kabat E.A. et al., ib. Výhodný rámec ťažkého reťazca je humánny .rámec ťažkého reťazca, napríklad protilátky AAL160, uvedený v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID . NO: 1. Táto sekvencia pozostáva z úsekov ERI, FR2, FR3 a FR4. Podobne sekvencia SEQ ID NO: 2 ukazuje výhodný rámec lahkého reťazca protilátky AAL160, ktorého sekvencia pozostáva z úsekov ERI', FR2', ER3'a FR4'.

Teda vynález tiež poskytuje molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén obsahujúci buď prvú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1 začínajúcu aminokyselinou v polohe 1 ' ä končiacu aminokyselinou v polohe 118, alebo prvú doménu už opísanú a druhú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 2, začínajúcu aminokyselinou v polohe 1 a končiacu aminokyselinou v polohe 107.

Monoklonálne protilátky namierené proti proteínom prirodzene sa vyskytujúcim u všetkých ľudí sú typicky produkované v non-humánnych systémoch, napr. v myši. Priamym dôsledkom týchto skutočností je to, že xenogénna protilátka produkovaná pomocou hybridómu, keď je podávaná človeku, vyvoláva nežiaducu imunitnú reakciu, ktorá je predovšetkým sprostredkovaná konštantnou časťou xenogénneho imunoglobulínu. To jasne obmedzuje použitie takých protilátok, pretože nemôžu byť podávané dlhšie obdobie. Teda je zvlášť výhodné použitie jednoreťazcových, jednodoménových, chimérických, CDR-vštepených alebo najmä humánnych protilátok, ktoré po podaní človeku s veľkou pravdepodobnosťou nevyvolajú významnú alogénnu reakciu.

Vzhľadom na uvedené skutočnosti, výhodnejšia molekula viažuca IL-Ιβ podía predkladaného vynálezu je molekula vybraná zo skupiny humánnych protilátok anti-IL-Ιβ, ktoré obsahujú aspoň

a) ťažký reťazec imunoglobulínu alebo jeho fragment, ktorý obsahuje (i) variabilnú doménu obsahujúcu v sekvencií hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3 a (ii) konštantný úsek alebo jeho fragment z humánneho ťažkého reťazca a to CDR1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Prč-Ser-Phe-Gln-Gly a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, a

b) ľahký reťazec imunoglobulínu alebo jeho fragment, ktorý obsahuje (i) variabilnú doménu, ktorá obsahuje hypervariabilný úsek CDR3'.a voliteľne tiež hypervariabilné úseky CDRÍ', CDR2'a (ii) konštantný úsek alebo jeho fragment z humánneho ľahkého reťazca a to CDRľ, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-VaľSer-Ser-Tyr-Leu-Ala, CDR2', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro, a jej priame ekvivalenty

Alternatívne molekula, ktorá viaže IL-ipa podľa vynálezu je molekula vybraná zo skupiny jednoreťazcovýčh viažucich molekúl, ktoré obsahujú väzbové miesto pre antigén obsahujúci

a) prvú doménu obsahujúcu v sekvencií hypervariabilné úseky CDRÍ, CDR2 a CDR3, pričom tieto hypervariabilné úseky majú aminokyselinové sekvencie uvedené v sekvencií SEQ ID NO: 1,

b) druhú doménu obsahujúcu hypervariabilný úsek CDR3'a voliteľne tiež CDRl'a CDR2', pričom tieto hypervariabilné úseky majú aminokyselinové sekvencie uvedené v sekvencií SEQ ID NO: 2 a

c) peptidový linker, ktorý je naviazaný buď na N-koniec prvej domény a na C-koniec druhej domény alebo na C-koniec prvej domény na N-konci druhej domény, a jej priame ekvivalenty.

Ako je odborníkovi známe, malé zmeny v aminokyselinovej sekvencii, ako je napríklad delécia, adícia alebo substitúcia jednej, niekoľkých alebo dokonca aj viac aminokyselín, môžu poskytnúť alelickú formu pôvodného proteínu, ktorá má v podstate identické vlastnosti.

Teda termín „jej priamy ekvivalent označuje v predkladanom opise buď jednodoménovú molekulu viažucu IL-Ιβ (molekula X) (i) v ktorej hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3 ako celok sú aspoň z 80% homologické, výhodne a.spoň z ,90% homologické, výhodnejšie aspoň z 95% homologické s hypervariabilnými úsekmi v sekvencii SEQ ID NO: 1 a (ii) ktorá je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako referenčná molekula, ktorá má úseky protilátkového rámca identické so zodpovedajúcimi, úsekmi molekuly X, ale má hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3 identické so zodpovedajúcimi úsekmi sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo akúkoľvek molekulu viažucu IL-Ιβ, ktorá má aspoň dve domény na každé väzbové miesto (molekula X') (i) v ktorej hypervariabilné úseky CDR1, CDR2, CDR3, CDR3'a voliteľne tiež CDRl'a CDR2'ako celok, sú aspoň z 80% homologické, výhodne aspoň z 90% homologické, výhodnejšie aspoň z 95% homologické s hypervariabilnými úsekmi sekvencie SEQ ID NO: 1 a sekvencie SEQ ID NO: 2 a (ii) ktorá je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako referenčná molekula, ktorá má úseky protilátkového rámca a konštantné úseky identické so zodpovedajúcimi úsekmi molekuly Xf, ale má hypervariabilné úseky CDR1, CDR2, CDR3 a CDR3', a voliteľne tiež CDRl'a CDR2', identické so zodpovedajúcimi úsekmi sekvencie SEQ ID NO: 1 a sekvencie SEQ ID NO: 2.

V kontexte predkladaného opisu vynálezu je aminokyseiinová sekvencia aspoň z 80% homologické s druhou sekvenciou, ak tieto sekvencie majú aspoň 80% identických aminokyselinových zvyškov v rovnakej polohe, keď sú sekvencie optimálne priradené (porovnané), pričom medzery alebo inzercie v aminokyselinovéj sekvencii sú počítané za neidentické zvyšky.

Inhibícia väzby IL-Ιβ na receptor môže byť lahko testovaná pomocou rôznych testov ako sú napr. testy opísané ďalej v texte. Použitý IL-Ιβreceptor je výhodne receptor IL-ίβ typu 1.

Výraz „v rovnakom rozsahu” alebo „ v rovnakej miere” znamená v kontexte predkladaného opisu, že referenčná a s ňou ekvivalentná molekula vykazujú, štatisticky vzaté, v podstate identickú funkčnú závislosť inhibície IL-Ιβ väzby podía jedného zo zmienených testov.

Napríklad použitý test môže byť test kompetitívnej inhibície väzby IL-Ιβ uskutočňovaný pomocou rozpustných IL-1 receptorov a IL-Ιβ viažucich molekúl podľa vynálezu.

Najvýhodnejšia humánna IL-Ιβ protilátka obsahuje aspoň

a) jeden ťažký reťazec, ktorý obsahuje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou SEQ ID NO: 1, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 118 a konštantný úsek humánneho ťažkého reťazca a

b) jeden lahký reťazec, ktorý obsahuje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou SEQ ID, Č. 2, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 107 a konštantný úsek humánneho lahkého reťazca.

Konštantný úsek humánneho ťažkého reťazca môže byť typu γΐ, γ2, γ3 a γ4, μ, αΐ, α2, δ alebo ε, výhodne typu γ, a výhodnejšie typu γΐ, zatiaľ čo konštantný úsek humánneho lahkého reťazca môže byť typu κ alebo λ (ktorý zahŕňa subtypy λΐ, λ2, λ3, ale výhodne je typu k. Aminokyselinové sekvencie všetkých týchto konštantných úsekov sú uvedené v publikácii Kabát et al., ib.

Molekula viažuca IL-Ιβ podľa vynálezu sa môže pripraviť metódami rekombinantnej DNA. Na tento účel sa musí skonštruovať ¹ I . ' ' jedna alebo viac DNA molekúl kódujúcich viažucu molekulu, umiestniť s vhodnou kontrolnou sekvenciou a preniesť do vhodného hostiteľského organizmu, kde sa potom exprimuje.

Vo všeobecnom zmysle tak vynález poskytuje:

(i) DNA molekuly kódujúce jednodoménovú molekulu viažucu IL-Ιβ podľa vynálezu, jednoreťazcovú molekulu viažucu IL-Ιβ podľa vynálezu, ťažké alebo ľahké reťazce alebo ich fragmenty z molekuly viažuce IL-Ιβ podľa vynálezu a (ii) použitie DNA molekuly podľa vynálezu na produkciu IL-Ιβ viažucich molekúl podlá vynálezu pomocou rekombinantnej technológie

Doterajší stav techniky je taký, že odborník je schopný ľahko syntetizovať DNA molekuly podľa predkladaného vynálezu na základe informácií uvedených v tomto opise, t.j. aminokyselinových sekvencii hypervariabilných úsekov a DNA sekvencii, ktoré ju kódujú. Spôsob konštrukcie génu pre variabilnú doménu bol napríklad opísaný v Európskej patentovej prihláške č. 239 400 a môže byť stručne zhrnutý nasledovne: Klonuje sa gén kódujúci variabilnú doménu MAb (monoklonálnej protilátky) s ľubovoľnou špecificitou. DNA segmenty kódujúce rámec protilátky a hypervariabilné úseky sa určia a DNA segmenty kódujúce hypervariabilné úseky sa odstránia, takže DNA segmenty kódujúce rámcové úseky sú vzájomne spojené pomocou vhodných reštrikčných miest v mieste spojenia. Reštrikčné miesta môžu byť vytvorené vo vhodných polohách mutagenézou DNA molekúl pomocou štandardných postupov odborníkovi známych. Dvojreťazcové syntetické CDR kazety sú pripravené pomocou DNA syntézy podľa sekvencie uvedenej ako sekvencia SEQ

ID NO: 1 alebo sekvencia SEQ ID NO: 2. Tieto kazety sú opatrené „lepivými („sticky) koncami, takže môžu byť ligované do spojov (reštrikčných miest) rámcových úsekov.

Okrem toho nie je potrebné mať prístup k mRNA z produkčnej hybridómovej bunkovej línie, aby bolo možné získať DNA konštrukt kódujúci molekulu viažucu IL-Ιβγ podlá vynálezu. Tak napr. PCT prihláška publikovaná ako WO 90/07861 poskytuje úplné inštrukcie na produkciu protilátky pomocou techniky rekombinantnej DNA, pričom východiskovou informáciou je iba nukleotidová sekvencia génu. Opísaný spôsob zahŕňa syntézu radov oligonukleotidov ich amplifikáciu pomocou PCR (polymerázovej reťazovej reakcie) a nakoniec ich zostrih a spojenie („splicing) , čím vznikne požadovaná DNA sekvencia.

Expresné vektory, ktoré obsahujú vhodný promótor alebo gény kódujúce konštantné úseky ťažkého a ľahkého reťazca sú verejne k dispozícii. Teda hneď ako je DNA molekula podľa vynálezu pripravená, môže byť ľahko prenesená vo vhodnom expresnom vektore. DNA molekuly kódujúce jednoreťazcové protilátky môžu tiež byť pripravené pomocou štandardného postupu, napríklad ako bol opísaný v medzinárodnej patentovej prihláške WO 88/1649.

Vzhladom na uvedené skutočnosti nie je nutné ukladať ani hybridómy ani bunkové línie, aby bola splnená požiadavka dostatočnosti opisu vynálezu.

V konkrétnom uskutočnení vynález obsahuje prvý a druhý DNA konštrukt na produkciu molekuly viažucej IL-Ιβ, ako je opísané ďalej:

Prvý DNA konštrukt kóduje ťažký reťazec alebo jeho fragment a obsahuje

a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo rámec a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú CDR1, CDŔ2 a CDR3 s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a táto prvá časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom, ktorý kóduje aminokyselinu variabilnej domény a

b) druhú' časť kódujúcu konštantný úsek ťäžkého reťazca alebo jeho fragment, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ťažkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.

Výhodne, prvá časť kóduje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je uvedená v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 118. Výhodnejšie prvá časť má nukleotidovú sekvenciu ako sekvencia SEQ ID NO: 1, ktorá začína nukleotidom v polohe 1 a končí nukleotidom v polohe 354. Výhodne druhá časť kóduje konštantnú časť humánneho ťažkého reťazca, výhodnejšie konštantnú časť humánneho reťazca yl. Táto druhá časť môže byť DNA fragment genómového pôvodu, (obsahujúci intróny) alebo cDNA fragment (bez intrónov).

Druhý DNA konštrukt kóduje ľahký reťazec alebo jeho fragment a obsahuje

a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu, ktorá obsahuje striedavo úseky, rámca a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú CDR3' a voliteľné CDRl'a _;CDR2', ktorých aminokyselinové sekvencie sú v zozname sekvencií uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 2, pričom táto časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom , kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény a

b) druhú časť kódujúcu konštantnú časť ľahkého reťazca alebo jej fragment, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ľahkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.

Výhodne táto prvá časť kóduje variabilnú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 2, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 107. Výhodnejšie, prvá časť má nukleotidovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 2, ktorá začína nukleotidom v polohe 1 a končí nukleotidom v polohe 321. Výhodne druhá časť kóduje konštantnú časť humánneho ľahkého reťazca, výhodnejšie konštantnú časť humánneho reťazca k.

Vynález tiež zahŕňa molekulu viažucu IL-Ιβ, v ktorých je jeden· alebo viac zvyškov v CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2'alebo CDR3' zmenených oproti zvyškom v sekvencii SEQ ID NO: 1 a sekvencii SEQ ID NO: 2, napríklad mutáciou, napr. miestne cielenou mutagenézou príslušnej DNA sekvencie. Vynález tiež zahŕňa DNA sekvencie kódujúce takto zmenené molekuly viažuce ΙΣ--1β. Najmä vynález zahŕňa molekuly viažuce IL-Ιβ, v ktorých jeden alebo viac zvyškov v CDRl'alebo CDR2 ' bolo zmenených oproti zvyškom v sekvencii SEQ ID NO: 2.

V prvom a druhom DNA konštrukte môže byť prvá a druhé časť oddelená intrónom a v intróne medzi prvou a druhou časťou môže byť výhodne lokalizovaný enhancer (zosilňovací element). Prítomnosť takého enhanceru, ktorý je transkribovaný, ale nie je translatovaný, môže napomôcť účinnosti transkripcie. Vo zvláštnom uskutočnení prvý a druhý DNA konštrukt obsahujú enhancer génu ťažkého reťazca výhodne humánneho pôvodu.

Každý z DNA konštruktov je vložený pod kontrolu vhodných kontrolných sekvencii, najmä vhodného promótora. Môže byť použitý akýkoľvek typ promótora, za predpokladu, že je adaptovaný na hostiteľský organizmus, do ktorého budú DNA konštrukty prenesené na expresiu. Avšak' pokiai má dôjsť k expresii v cicavčích bunkách, zvlášť výhodné je použitie promótora imunoglobulínového génu alebo promótora cytomegalovírusu (CMV), napr. promótor humánneho CMV.

Požadovaná protilátka môže byť produkovaná v bunkovej kultúre alebo v transgénnom zvierati. Vhodné transgénne zviera môže byť pripravené štandardným spôsobom, ktorý je odborníkom známy a ktorý zahŕňa mikroinjekcie prvého a druhého DNA konštruktu s vhodnými kontrolnými sekvenciami do vajíčka a potom prenesenie takto pripraveného vajíčka do vhodnej pseudopregnantnej samice a nakoniec selekcia potomstva exprimujúceho požadovanú protilátku.

Keď sú reťazce protilátky produkované v bunkovej kultúre, DNA konštrukty musia byť najskôr vložené buď do jedného expresného vektora alebo do dvoch oddelených, ale pritom kompatibilných expresných vektorov, čo je považované za výhodnejšiu možnosť .

Takže predkladaný vynález tiež poskytuje 'expresný vektor, ktorý je schopný replikácie v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunkovej línii, ktorá obsahuje aspoň jeden z DNA už opísaných konštruktov.

Každý z expresných vektorov obsahujúcich DNA konštrukt je potom prenesený do vhodného hostiteľského organizmu. Keď sú DNA konštrukty oddelene vložené do dvoch expresných vektorov, môžu byť prenesené oddelene, t.j. jeden typ vektora do jednej bunky, alebo môžu byť prenesené spoločne (ko-transfer), čo je považované za výhodnejšiu možnosť. Vhodným hostiteľským organizmom sú baktérie, kvasinky alebo cicavčie bunkové línie, pričom výhodná je táto tretia možnosť. Výhodnejšie, cicavčia bunková línia je lymfoidného pôvodu, napr. myelóm, hybridom alebo normálne imor15 talizo'vané B-lymfocyty, ktoré neexprimújú endogénne žiadne ťažké ani ľahké reťazce protilátky.

Na expresiu v cicavčích bunkách je výhodné, keď sekvencia kódujúca molekulu viažucu IL-Ιβ je integrovaná do DNA hostiteľskej bunky do lokusu, ktorý dovoľuje alebo podporuje vysoký stupeň expresie IL-Ιβ viažucich molekúl. Bunky, v ktorých je sekvencia kódujúca molekulu viažucu IL-Ιβ integrovaná do takých výhodných lokusov, môžu byť identifikované a selektované na základe hladín molekuly viažucich IL-Ιβ, ktorú exprimujú. Akýkoľvek vhodný selekčný marker.. môže byť použitý na prípravu hostiteľských buniek obsahujúcich kódujúcu sekvenciu pre molekulu viažucu ILΙβ, napr. gén dhfr/metotrexát alebo ekvivalentný selekčný systém. Výhodné systémy na expresiu molekuly viažuce IL-Ιβ podľa vynálezu sú napr. systémy založené na GS-amplifikácii/selekcii, opísané v EP 0256055 B, EP 0323997 B a európskej patentovej prihláške 89303964.4. Výhodne vektor obsahuje aj ďalšie sekvencie nielen požadované a to na uľahčenie expresie, opracovanie a transport exprimovaného proteínu, napr. vektor typicky obsahuje vedúcu („leader) sekvenciu asociovanú s kódujúcou sekvenciou. , .

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob, produkcie IL-Ιβ viažucich molekúl, tento spôsob zahŕňa kroky (i) kultivácie organizmu, ktorý je transformovaný expresným vektorom už definovaným a (ii) izoláciu molekulu viažucu IL-Ιβ z kultúry.

V súlade s predkladaným vynálezom bolo zistené, že protilátka AAL160 má väzbovú špecificitu na antigénny epitop humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku, ktorá obsahuje zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zo zrelého humánneho IL-Ιβ (tieto zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zo zrelého humánneho IL-Ιβ zodpovedajú zvyškom 138, 139, 140 a 141, v uvedenom poradí, prekurzora humánneho IL-Ιβ. Tento epitop je lokalizovaný vo vnútri rozpoznávajúceho miesta receptora IL-1 a je preto nanajvýš prekvapujúce, že protilátky proti tomuto epitopu, t.j. napr. protilátka AAL160, sú schopné inhibovať väzbu IL-Ιβ na receptor. Protilátky, najmä chimérické protilátky a CDR-vštepené protilátky a najmä humánne protilátky, ktoré majú väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý obsahuje slučku, ktorá obsahuje zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 a ktoré sú schopné inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor a tiež použitie týchto protilátok pri liečení ochorení a porúch sprostredkovaných IL-1, sú preto nové a spadajú tiež do rozsahu predkladaného vynálezu.

Takže ďalším aspektom predkladaného vynálezu je protilátka proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop humánneho IL-Ιβ, ktorý obsahuje slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zrelého humánneho IL-Ιβ a ktorá je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor.

Ďalšie aspekty predkladaného vynálezu sa týkajú:

i) použitia protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, pri liečení IL-1 sprostredkovaných ochorení alebo porúch, ii) liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch u pacientov, ktoré spočíva v tom, že sa pacientovi podáva účinné množ•stvo protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, iii) farmaceutickéj kompozície, ktorá obsahuje protilátku proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky

Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, v kombinácii s farmaceutický prijateľným vehikulom, riedidlom alebo nosičom a iv) použitie protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor, na výrobu lieku, na liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch .

V kontexte predkladaného opisu výraz, že protilátka je „schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ znamená, že protilátka je schopná inhibovať väzbu IL-Ιβ na jeho receptor v podstate v rovnakom rozsahu ako protilátka AAL160, pričom výraz „v rovnakom rozsahu, ktorý už bol definovaný.

V kontexte predkladaného opisu výraz „IL-1 sprostredkované ochorenie zahŕňa všetky ochorenia a zdravotné stavy, v ktorých hrá nejakú úlohu IL-1, či už priamo alebo nepriamo pri ochorení alebo stave, vrátane príčiny ochorení, rozvoji a progresie ochorenia, perzistencie alebo patológie ochorenia alebo stavu.

V kontexte predkladaného opisu sa termíny „liečenie alebo „liečiť týkajú ako profylaktickej starostlivosti tak aj kuratívnej staros.tlivosi alebo starostlivosti, ktorá vedie k modifikácii ochorenia, vrátane starostlivosti o pacientov, ktorí sú v riziku získania ochorenia alebo majú podozrenie, že ochorenie získali a tiež pacientov, ktorí ochorením už trpia alebo boli diagnostikovaní ako trpiaci ochorením a ďalej sa týkajú aj potlačenia klinického relapsu.

Protilátky, ktoré majú väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ zahŕňajúce slučku, ktorá obsahuje zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 a ktoré sú schopné inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor sú ďalej označované ako „protilátky podlá vynálezu.

Výhodné protilátky podľa vynálezu sú protilátky, ktoré majú väzbovú špecificitu na tento epitop humánneho IL-Ιβ, keď humánny IL-Ιβ je v natívnom stave, ako sú napr. normálne fyziologické podmienky a v žiadnom prípade nie v denaturovanom stave, ako je tomu napr. v prítomnosti denaturujúcich činidiel, ako je napríklad SDS. Protilátky podlá vynálezu môžu skrížené reagovať s non-humánnymi IL-Ιβ, ktoré majú antigénne epitopy obsahujúce Gly ako zvyšok v polohe 22, Pro ako zvyšok v polohe 23, Tyr ako zvyšok v polohe 24 a Glu ako zvyšok v polohe 25 a ktoré sú si blízko podobné zodpovedajúcemu humánnemu epitopu. Napríklad protilátky podľa vynálezu môžu skrížené reagovať s IL-Ιβ primátov, ako sú napríklad makak rhesus, mákak cynomolgus IL-1 alebo makak marmoset IL-1. Výhodné protilátky podlá vynálezu sú molekuly viažuce IL-Ιβ podľa prvého a druhého aspektu vynálezu. Výhodne sú protilátky podľa vynálezu humánne protilátky, najvýhodnejšie .je to protilátka AAL160 alebo jej priamy ekvivalent.

Protilátky podía vynálezu blokujú účinky IL-Ιβ na jeho cieľové bunky a sú. teda určené na použitie pri liečení IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch. Tieto a ďalšie farmakologické účinky protilátok podľa vynálezu môžu byť dokázané použitím štandardných testovacích metód, napr. uvedených ďalej:

1. Neutralizácia aktivácie promótora IL-8 sprostredkovaná humánnym IL-Ιβ

Potenciálna neutralizácia bunkovej signalizácie závislej na IL-Ιβ sa môže stanoviť pomocou testu s reportérovým génom

Humánna melanómová bunková línia G361 je stabilne transfekovaná konštruktom založeným na humánnom IL-8 promótore s luciferázovým reportérovým génom. Expresia a aktivita reportérového génu je závislá v tejto bunkovej línii na IL-Ιβ alebo TNEa. Bunky sa stimulujú 300pg/ml rekombinantného humánneho IL-Ιβ alebo ekvivalentom 100 pg/ml v kondiciovanom médiu v prítomnosti rôznych koncentrácií protilátky podľa vynálezu alebo antagonistu IL-1 receptora v rozmedzí 6 až 18000 pM. Chimérická protilátka Stimulect® (basiliximab) sa používa ako kontrola so zhodným izotypom. Luciferázová aktivita sa kvantifikuje použitím chemiluminiscenčného testu. Protilátky podľa vynálezu majú pri testovaní v tomto teste typicky hodnotu IC50 približne 1 nM (napr.. 0,2 až 5 nM).

2. Neutralizácia IL-Ιβ dependentej tvorby PGE₂ a interleukínu-6 v primárnych humánnych fibroblastoch

Tvorba PGF₂ a IL-6 v primárnych humánnych dermálnych fibroblastoch je závislá na IL-Ιβ. Samotný. TNF-α nemôže účinne indukovať zápalové mediátory, ale pôsobí synergický s IL-1. Primárne dermálne fibroblasty sa používajú ako náhradný model na IL-1indukovanú bunkovú aktiváciu.

Primárne humánne fibroblasty sa stimulujú rekombinantným IL-Ιβ alebo kondicionovaným médiom získaným c. LPS-stimulovaných humánnych PBCM v prítomnosti rôznych koncentrácií protilátky podlá vynálezu alebo IL-1RA v rozsahu 6 až 18000 pM. Chimérická protilátka Simulect® (basiliximab) sa používa ako kontrola so zhodným izotypom. Supernatant sa odoberá po 16 hodinách stimulácie a testuje sa na prítomnosť IL-6 testom ELISA alebo na prítomnosť PGE₂ testom RIA. Protilátky podľa vynálezu majú pri testovaní v týchto testoch typicky hodnotu IC50 na inhibíciu produkcie IL-6 približne 1 nM alebo nižšiu (napr. 0,1 až 1 nM) a na inhibíciu produkcie PGE₂ približne lnM (napr. 0,1 až 1 nM)

Ako sa ukázalo, protilátky podľa vynálezu silne blokujú účinok IL-Ιβ. Teda sú protilátky podľa vynálezu farmaceutický využiteľné a to nasledujúcimi spôsobmi:

Protilátky podľa vynálezu sú užitočné na profylaxiu a liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení a stavov, ako je napr. zápal, alergia a alergický stav, hypersenzitívna reakcia, autoimunitná choroba, silná infekcia a rejekcia orgánového alebo tkanivového transplantátu. , . '

Tak napríklad protilátky podľa vynálezu môžu byť použité pri liečení príjemcov transplantátov srdca, pľúc, bloku srdce-plúca, obličiek, pankreasu, kože alebo rohovky a tiež pri prevencii reakcie štepu proti hostiteľovi („graft versus hos't diseases), napr. po transplantácii kostnéj 'drene.

Protilátky podľa vynálezu sú konkrétne použiteľné napr. pri liečení, prevencii alebo zmiernení autoimunitných ochorení a zápalových ochorení, najmä zápalových stavov s etiológiou zahŕňajúcou autoimunitnú zložku, ako je napríklad artritída (napr. reumatoidná artritída, artritída chronica progrediente a artritída deformans) a reumatických ochorení, vrátane zápalových stavov a reumatických ochorení zahŕňajúcich stratu kostnej hmoty, bolestivé zápaly a hypersenzitivity (vrátane hypersenzitivity dýchacích·ciest aj kožnej hypersenzitivity) a alergií. K špecifickým autoimunitným chorobám, na ktoré môžu byť protilátky podľa vynálezu použité, patria autoimunitné hematologické poruchy (vrátane napr. hemolytickej anémie, aplastickej anémie, anémie iba červených krviniek a idiopatickej trombocytopénie), systémový lupus erythematosus, polychondritída, skleroderma, Wegenerova granulomatóza, dermatomyozitída, chronická aktívna hepatitída, myasténia gravis, psoriáza, Steven-Johnsonov syndróm, idiopatická porucha vstrebávania v tenkom čreve (sprue), autoimunitné zápalové ochorenie čriev (vrátane napr. . ulceratívnej kolitídy, Crohnovho· ochorenia a syndrómu dráždivého čreva), endokrinné oftalmopatie, Gevensove ochorenie, sarkoidóza, skleróza multiplex, primárna biliárna cirhóza, juvenilný diabetes (diabetes mellitus typu I), uveitída (anterior a posterior), suchá kerato21 konjunktivitída a vernálna keratokonjunktivitída, fibróza plúcneho interstícia, psoriatická artritída a glomerulonefritída (ako bez, tak aj s nefrotickým syndrómom, napr. vrátane idiopatického nefrotického syndrómu alebo nefropatie s minimálnymi zmenami).

Protilátky podľa vynálezu sú tiež použiteľné pri liečení, prevencii alebo zmiernení ochorení ako je astma, bronchitída, pneumokonióza, emfyzém plúc a ďalšie obštruktívne alebo zápalové ochorenia dýchacích ciest.

t

Protilátky podľa vynálezu sú použiteľné tiež na liečenie nežiadúcich akútnych a hyperakútnych zápalových reakcií, ktoré sú sprostredkované IL-1 alebo zahŕňajú tvorbu IL-1, zvlášť IL-Ιβ alebo podporu uvoľňovania TNF pomocou IL-1, napr. akútne infekcie, napr. septický šok (napr. endotoxický šok a syndróm respiračnej poruchy dospelých), meningitída, pneumónia, ťažké popáleniny a ďalej na liečenie kachexie alebo syndrómu chradnutia (wasting syndróm) spojeného s patologickým uvoľňovaním TNF v dôsledku infekcií, karcinómu alebo orgánových dysfunkcií, obzvlášť kachexie súvisiacej s AIDS, napr. asociovanej alebo nasledujúcej po infekcii HIV.

Protilátky podľa vynálezu sú ďalej najmä použiteľné pri liečení ochorení metabolizmu kostí, ako je napr. osteoartritída, osteoporóza a ďalšie zápalové artritídy a straty kostnej hmoty všeobecne, vrátane straty kostnej hmoty, ktorá súvisí so starnutím a pri špecifických periodontálnych ochoreniach.

Protilátky podľa vynálezu môžu byť tiež použité pri liečení karcinómov, najmä IL-1 dependentných nádorov.

Na uvedené indikácie bude vhodná dávka, samozrejme, rôzna, a to v závislosti napríklad na konkrétnej použitej protilátke podía vynálezu, príjemcovi, spôsobe podávania a povahe a závažnosti ochorenia, ktoré sa má liečiť. Avšak pri profylaktickom použití je všeobecne možné dosiahnuť uspokojivých výsledkov s dennými dávkami približne 0,1 mg až približne 5 mg na 1 kilogram telesnej hmotnosti. Protilátka podľa vynálezu sa obvykle podáva parenterálne, intravenózne, napr. do antekubitálnej alebo inej periférnej žily, >intramuskulárne alebo subkutánne. Profylaktické liečenie typicky spočíva v podávaní molekúl podľa vynálezu jedenkrát denne až jedenkrát týždenne počas 2 až 4 týždňov.

Farmaceutické kompozície podľa predkladaného vynálezu sú vyrábané obvyklými spôsobmi, ktoré sú odborníkom známe.. Kompozíciu podľa vynálezu je výhodné poskytnúť v lyofiiizovanej forme. Na okamžité podanie je rozpustený vo vhodnom vodnom nosiči, ako je napríklad sterilná voda na injekcie alebo sterilný pufrovaný fyziologický roztok. Je vhodné pripraviť väčší objem takého roztoku na podávanie infúzií, napr. i.v. infúzií, namiesto bolusovej injekcie, napr. s.c. bolusovej injekcie. Pri formulácii takejto kompozície je výhodné do fyziologického roztoku pridať ľudský sérový albumín alebo priamo pacientovu vlastnú heparinizovanú krv. Prítomnosť nadbytku fyziologicky inertného proteínu zabraňuje strate protilátky v dôsledku adsorpcie na stenách kontajnera a hadičiek, ktoré sa používajú na infúzny roztok. Pokial sa použije albumín, potom vhodná koncentrácia je 0,5 až 4,5% (hmôt.) vzhladom na fyziologický roztok.

Predkladaný vynález je ďalej opísaný pomocou príkladov, ktorých funkcia je ilustratívna a ktoré sú doplnené nasledujúcimi obrázkami.

Prehľad obrázkov na. výkresoch

Obrázok 1 je graf, ktorý ukazuje kompetitívnu inhibiciu väzby AAL160 k IL-Ιβ pomocou rozpustného receptora IL-1 typu I a typu II.

Obrázok 2 je graf, ktorý ukazuje inhibíciu horúčky vyvolanej IL-Ιβ podaním AAL160 na modeli laboratórneho potkana.

Obrázok 3 je graf, ktorý ukazuje trvanie účinku AAL160 na horúčku vyvolanú IL-Ιβ na modeli laboratórneho, potkana.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Transgénne myši exprimujúce humánny IgG/κ repertoár namiesto vlastného imunoglobulínového repertoáru (Fishwild et al., 1996, Náture Biotechnol., 14, 845-851) sa použili na prípravu protilátky proti humánnemu IL-Ιβ. B lymfocyty z týchto myší sa imortalizovali použitím štandardnej hybridómovej technológie a tak sa získali myšie hybridómové bunky secernujúce humánnu IgGl/κ protilátku označenú AAL160.

Príklad 1

Vytvorenie hybridómu a purifikácia protilátky

Geneticky modifikovaná myš 66 (Medarex Inc. Annadale, NJ) sa imunizovala rekombinantným humánnym IL-Ιβ (50 pg) v adjuvans s.c. v niekoľkých miestach. Imunitná reakcia myši sa ďalej zosilnila piatimi ďalšími injekciami, posledná injekcia tri dni pred fúziou. V deň fúzie sa myš 66 usmrtila inhaláciou CO2 a bunky zo sleziny (4,lxl0⁷) sa fúzovali rutinným spôsobom použitím PEG 4000 s rovnakým počtom buniek PAI-0 myší myelómovej bunkovej línie. Fúzované bunky sa preniesli do 624 jamiek (lml/jamka) obsahujúcich podpornú („feeder”) vrstvu myších peritoneálnych buniek (Balb C myší) , v médiu RPMI 1640 s HAT, 10% tepelne inaktivovaným fetálnym telacím sérom a 5 x 10'⁵ M β-merkaptoetanolom. Supernatanty sa odoberali a testovali pomocou ELISA testu a uskutočnil sa skríning na IL-Ιβ reaktívnu monoklonálnu protilátku. Päť monoklonálnych protilátok podtriedy IgG/κ sa identifikovalo.

Klonovanie sa uskutočnilo v 4 x 96 jamkovej mikrotitračnéj doštičke, do každej jamky sa prenieslo 0,5 buniek. Po dvoch týždňoch sa jamky kontrolovali inverzným mikroskopom. Supernatanty sa odoberali z jamiek s pozitívnym rastom a produkcia monoklonálnej protilátky anti-IL-Ιβ sa vyhodnocovala pomocou ELISA. 1 až 2 litre kondicionovaného supernatantu zo štyroch subklonov pôvodne identifikovaného hybridómu #476 sa pripravili a protilátky sa purifikovali pomocou afinitnej chromatografie na kolóne s proteínom A.

Čistota a čiastočná aminokyselinová sekvencia ťažkého a ľahkého reťazca

Aminokyselinové sekvenovanie

Ľahké a ťažké reťazce purifikovanej protilátky AAL160 sa oddelili pomocou SDS-PAGE a amino-koncové aminokyseliny sa stanovili pomocou Edmanovej degradácie. Čistota protilátky použitej v tejto štúdii pomocou sekvenovania bola >90%. cDNA sekvencie kódujúce variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca sa získali pomocou PCR amplifikácie z cDNA pripravenej z mRNA z klonovaných hybridómových buniek a úplného sekvenovania. Aminokoncové sekvencie variabilných domén ťažkého a ľahkého reťazca a zodpovedajúce DNA sekvencie sú uvedené ďalej, pričom hrubo sú vyznačené úseky CDR.

SEKVENCIA SEQ ID NO: 1

60

GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG AAG ATC Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys íle

20 .

CDR1 120

TCC TGT AAG GGT TCT GGA TAC AGC TTT ACC AGC TAC TGG ATC GGC TGG GTG CGC CAG ATG Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp íle Gly Trp Val Arg Gin Met

40

150

CDR2

180

ccc

GGG

AAA

GGC

CTG

GAG

TGG

ATG

GGG

ATC

ATC TAT

CCT

AGT

GAC

TCT

GAT

ACC

AGA

TAC

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

íle

íle Tyr

Pro

Ser

Asp

Ser

Asp

Thr

Arg

Tyr

60

210

240

AGC

CCG

TCC

TTC

CAA

GGC

CAG

GTC

ACC

ATC

TCA

GCC

GAC

AAG

TCC

ATC

AGC

ACC

GCC

TAC

Ser

Pro

Ser

Phe

Gin

Gly

Gin

Val

Thr

íle

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

íle

Ser

Thr

Ala

Tyr

70

80

CTG Leu

CAG Gin

TGG Trp

AGC Ser

AGC CTG

270

TGT Cys

300 GCG AGA TAT ACC

AAG Lys

GCC Ala

TCG Ser

GAC ACC GCC ATG

TAT TAC

Ser

Leu

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Ala

Arg

Tyr

Thr ICO

CDR3

330

AAC

TGG

GAT

GCT

TTT

GAT

ATC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACA

ATG

GTC

ACC

GTC

TCT

TCA

Asn

Trp Asp

Ala

Phe

Asp

íle

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

SEKVENCIA SEQ ID NO:

2

30

50

GAA

ATT

GTG

TTG

ACA

CAG

TCT

CCA

GCC

ACC

CTG

TCT

TTG

TCT

CCA

GGG

GAA

AGA

GCC

ACC

Glu

íle

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

10

20

CDR1

90

120

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGT

CAG

AGT

GTT

AGC

TAC

TTA

GCC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCT

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

,Lys

Pro

40

150

CDR2

180

GGC

CAG

GCT

CCC

AGG

CTC

ATC

TAT

GAT

GCA TCC

AAC

AGG

GCC

ACT

GGC

ATC

CCA

GCC

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

íle

Tyr

Asp

Ala Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Ala

50

60

210

240

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA'

GAC.

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

CTT

GAG

CCT

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Glu

Pro

70

50

270

CDR3

300

GAA

GAT

TTT

GCA

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CGT

AGC AAC

TGG

ATG

TTC

CCT

TTT

GGC

CAG

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gin

Arg

Ser Asn

Trp

Met

Phe

Pro

Phe

Gly

Gin

90

100

GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA

Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys

DNA sekvencia kódujúca variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia AAL160 sú tiež uvedené v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1 až sekvencia SEQ ID NO: 4.

Konštrukcia expresných vektorov pre ťažký a ľahký reťazec

Klonované sekvencie kódujúce V_L a V_H ša ampiifikovali pomocou PCR a vložili prostredníctvom vhodného reštrikčného miesta do kazety vektorov obsahujúcich imunoglobulínový promótor vedúcej sekvencie z RET2 protilátky (Heinrich et al. (1989) J. Immunol. 143, 3589-97), časť J-segmentov a zostrihové donorové miesto. Kazeta ľahkého reťazca obsahujúca celý V_L úsek, promótor a vedúcu sekvenciu na sekréciu sa preniesla do expresného vektora obsahujúceho humánny gén Ck, enhancer ťažkého reťazca imunoglobulínu a modifikovanú myšiu dhfr cDNA na selekciu pomocou metotrexátu (MTX).

Kazeta ťažkého reťazca sa preniesla do expresného vektora, ktorý kóduje humánny gén IgGl, enhancer ťažkého reťazca imunoglobulínu a gén rezistencie na neomycín na selekciu.

Ako ťažký, tak aj ľahký reťazec sú v expresných vektoroch v konfigurácii, ktorá pripomína genómovú konfiguráciu preskupených („rearranged) imunoglobulínových génov, čo je považované za dôležitý faktor pre vysoký stupeň expresie.

Na produkciu protilátky podlá vynálezu sa opísali vektory kotransfekované do vhodnej hostiteľskej bunkovej línie, napr.

bunkovej línie SP2/0, bunky obsahujúce vektorové sekvencie sa selektovali pomocou metotrexátovej selekcie a vyselektované bunkové línie sa kultivovali, aby exprimovali protilátku AAL160.

Alternatívne sa môže použiť amplifikačný/selekčný systém založený na GS, aký bol napríklad opísaný v EP 0256055 B, EP 0323997 B alebo európskej patentovej prihláške 89303964.4, keď je selekčný marker dhfr nahradený GS kódujúcou sekvenciou.

₍

Príklad 2

Biochemické a biologické dáta

Zistilo sa, že monoklonálna protilátka AAL160 neutralizuje in vitro aktivitu interleukínu-ΐβ. Monoklonálna protilátka bola ďalej charakterizovaná jej väzbou na rekombinantný humánny ILl-β analýzou Biacore. Spôsob neutralizácie sa hodnotil kompetitívnou väzbovou štúdiou s rozpustnými IL-1 receptormi. Biologická aktivita protilátky AAL160 proti rekombinantne pripravenému a prirodzene tvorenému IL-Ιβ sa· stanovila na primárnych humánnych bunkách (pozri príklad 3) , responzívnych na stimuláciu pomocou IL-1β.

2.1 Stanovenie disociačnej rovnovážnej konštanty

Konštanty rýchlosti asociácie a disociácie väzby rekombinantného humánneho IL-Ιβ a AAL160 sa stanovili analýzou BIAcore. AAL160 sa imobilizovala a väzba rekomb’inantnéhg IL-Ιβ v rozmedzí koncentrácií 0,5 až 12 nM sa merala pomocou povrchovéj plazmónovej rezonancie. Vybratý formát analýzy umožnil zaobchádzať s väzbovou udalosťou IL-Ιβ na AAL160 podía 1:1 stechiometrie. Analýza dát sa uskutočnila pomocou softvéru „BIAevaluation.

Asociačná rýchl. konštanta (M^s'¹)	(n=15)	(3, 91 ± 0, 14) x 10⁵	Priemer ± str. chyba priemeru
Disociačná rýchl. konštanta (M’¹s¹)	(n=15)	(1,53 ± 0,05) x 10^-4	Priemer ± str. chyba priemeru
Disociačná rovnovážna Konštanta K_D (M)	(n=15)	(396, 6 ± 19, 5) x 10'¹²	Priemer ± str. chyba priemeru

AAL160 sa viaže na rekombinantný humánny IL-Ιβ s vysokou afinitou. .

2.2 Kompetitívna inhibícia väzby k rozpustným IL-1 receptorom

Štúdium kompetície väzby pomocou rozpustných receptorov IL-1 typu I a II

Kompetícia medzi AAL160 a rozpustným humánnym receptorom IL-1 typu I a typu II sa merala opäť pomocou zariadenia Biacore. AAL160 sa imobilizovala na povrchu čipu a rekombinantný humánny IL-Ιβ (8nM) sa injikoval,. aby sa viazal na AAL160 za absencie alebo prítomnosti zvyšujúcej sa koncentrácie rekombinantného humánneho rozpustného receptora I (0 až 10 nM) alebo receptora II (0 až 80 nM) . Získané výsledky sú ukázané na obrázku 1. Väzba NVP AAL160. NX-1 na IL-Ιβ je kompetitívna ako s receptorom IL-1 typ I tak aj s receptorom typu II.

2.3 Profil reaktivity s humánnym IL-Ια, humánnym IL-1RA a IL-Ιβ z niektorých druhov hlodavcov a primátov

Profily reaktivity AAL160 s humánnym IL-Ια, IL-1RA a IL-Ιβ z myši, laboratórneho potkana, králika a makaka „cynomolgus sa analyzovali opäť pomocou zariadenia Biacore. AAL160 sa imobilizovala a skúmané cytokíny sa použili v koncentrácii 8 nM (alebo 20 nM v prípade IL-Ιβ).

•	Percento celkovo naviazaného ± stredná chyba priemeru
Humánny IL-Ιβ	100
Humánny IL-la	0,7 ± 0,7 (n=3)
Humánny IL-1RA	1,2 ± 1,2 (n=3)
Myší IL-Ιβ	2,8 ± 1,5 (n=3)

IL-Ιβ lab. potkana	3,0 ± 2,5 (n=3)
IL-Ιβ makaka „cynomolgus	96,4 ± 6,8 (n=3)
Králičí IL-Ιβ	12,1 ± 2,3 (n=4).

ÄAL160 skrížené významne nereaguje s humánnym IL-Ιβ, humánnym IL-IRa alebo IL-Ιβ z myši, laboratórneho potkana alebo králika. Reaktivita proti IL-Ιβ z makaka „cynomolgus je v podstate zhodná s humánnym cytokínom.

Príklad 3

Neutralizácia na IL-Ιβ závislej produkcie PGE₂ a interleukínu-6 v primárnych humánnych fibroblastoch

Produkcia PGE₂ a IL-6 v primárnych humánnych dermálnych fibroblastoch je závislá od IL-Ιβ. Samotný TNF-α nemôže účinne indukovať zápalové mediátory, ale pôsobí synergicky s IL-1. Primárne dermálne fibroblasty sa používajú ako náhradný model na IL-ľindukovanú bunkovú aktiváciu.

Primárne humánne fibroblasty sa stimulujú rekombinantným IL-1β alebo kondiciovaným médiom získaným z LPS-stimulovanýth humánnych PBCM v prítomnosti rôznych koncentrácií protilátky podlá vynálezu alebo IL-IRA v rozsahu 6 až 18000 pM. Chimerická antiCD25 protilátka Simulect® (basiliximab) sa používa ako kontrola so zhodným izotypom. Supernatant sa odoberá po 16 hodinách stimulácie a testuje sa na prítomnosť IL-6 testom ELISA alebo na prítomnosť PGE₂ testom RIA.

	AAL160 IC;c ± str. chyba (n>3)	IL-1 Ra IC50 ± str. chyba (n>3)
Sekrécia IL-6 Rekombinantná	0,34 ± 0,037 nM	nestanovené

Sekrécia IL-6 Kond. Médium	0,6 ± 0,09 nM	0,03 ± 0,001 nM
Produkcia PGE₂Kond. Médium	0,79 ± 0,17 nM	nestanovené

Výsledky ukázali, že AAL160 účinne blokuje produkciu IL-6 a PGE₂ v primárnych humánnych dermálnych fibroblastoch s hodnotou IC50 podobnou pre rekombinantný a prírodný IL-Ιβ.

Príklad 4

Účinnosť a trvanie pôsobenia AAL160 in vivo

Účinnosť

In vivo účinnosť anti-huIL-Ιβ protilátky AAL160 sa testovala na modeli laboratórneho potkana, kde sa horúčka indukovala pomocou i.v. injekcie huIL-Ιβ (100 ng/potkan). Protilátka viedla k inhibícii horúčky spôsobom závislým od dávky pri dávkach v rozmedzí 1,3 a 10 μς/kg i.v. (n=6 potkanov) - pozri tiež obrázok 2. CHI 621 (Simulect®, basiliximab) sa použila ako kontrolná protilátka.

Trvanie účinku

Trvanie účinku AAL160 sa skúmalo na laboratórnych potkanoch, u ktorých sa pomocou IL-Ιβ indukovala horúčka, nasledujúcim spôsobom: protilátka sa injikovala i.v. buď 24 hodín alebo 30 minút (štandardný protokol) pred indukciou horúčky pomocou i.v. injekcie humánneho IL-Ιβ a telesná teplota sa merala neskôr za 2 a 4 hodiny. V oboch časoch sa pozorovala približne rovnaká inhibícia horúčky (pozri obrázok 3). Ako sa dalo očakávať, kontrolná protilátka CHI 621 (Simulect®, basiliximab) bola neúčinná v oboch časových bodoch. Toto zistenie ukazuje na to, že humánna protilátka AAL160 je prítomná v potkanovi v aktívnej forme aspoň po hodín a v priebehu tohto času nie je metabolizovaná, vylučovaná ani viazaná na tkanivo.

Príklad 5

Róntgenorafické štúdie AAĹ160 Fab a jeho komplexu s IL-Ιβ

Stanovenie štruktúry AAL160 Fab s rozlíšením 2,0 Á

Súbor dát s rozlíšením 2,0 Á (2,0 x 10’^1θ m) veľmi dobrej kvality (R_SYM = 0,051, úplnosť = 99,9%, redundancia = 8,2) sa získal na kryštáloch Fab pestovaných pomocou difúzie pary v metóde visiacej kvapky, pri pH 9,5 v 50% PEG 200 a 0,lM CHES. Kryštál bol v priestorovej skupine P2i2i2i s rozmermi jednotkovej bunky a = 62,17 Á, b = 89,83 Á a c = 123,73 Á a jednou Fab molekulou na jednu symetrickú jednotku (Matthewsov koeficient: 3,-6 Á³/Da, stanovený obsah rozpúšťadla: 66%). Štruktúra sa určila pomocou molekulárneho nahradenia a bola zjemnená na konečný kryštalografický R-faktor 0,209 (voľný R-faktor = 0,261). Výsledný model zhŕňa aminokyselinové zvyšky 1 až 213 lahkého reťazca, 1 až 131 a 138 až 218 ťažkého reťazca, 387 molekúl vody a 1 molekulu PEG. Výsledná elektrónová denzita je dobre definovaná pre všetky zvyšky CDR s výnimkou Trp94 (CDR3) lahkého reťazca. Poloha postranného reťazca tohto zvyšku je chybne definovaná v dvoch kryštálových formách, ktoré boli doteraz preskúmané, takže je možné predpokladať, že je v neprítomnosti viazaného antigénu vysoko mobilná.

Kryštalizácia Fab komplexu s IL-Ιβ a predbežný experimentálny model komplexu:

Niekolko kryštálov AAL160 Fab v komplexe s antigénom IL-Ιβ sa získalo zo zásobného roztoku 1:1 komplexu o koncentrácii 76 mg/ml v 2,0 M sírane amónnom, 0,lM Tris, pH 8,5. Kryštály rástli veľmi pomaly počas niekoľkých týždňov. Vykazovali slabú difrak32 ciu približne do 3,2 Á na domácom zdroji. Súbor predbežných dát sa zistil pomocou molekulárneho nahradzovania využitím štruktúry voľného Fab a humánneho IL-Ιβ s vysokým rozlíšením (J.P. Priestle et al., EMBO J. Ί, 339 (1988)) ako východiskových modelov. Výpočty poskytli veľmi jasný a nepochybný výsledok, keď sa časti F_v ¹ I ι ' ' « a F_c z Eab použili ako oddelené moduly (korelácia 67,1%, R-faktor 0,354 po ďalšom aproximačnom kroku AMOREFITTING použitím dát medzi 8,0 Á a 3,5 Á) . Následné porovnanie voľnej a viazanej formy Fab ukázalo, že uhol ohybu je pre tieto dve štruktúry veľmi odlišný. Výsledky výpočtov molekulárneho nahradzovania poskytli prvý molekulárny model interakcie medzi antigénom IL-Ιβ a monoklonálnou protilátkou AAL160. Predbežná analýza tejto interakcie ukázala, že 1) IL-Ιβ vstupuje do tesnej interakcie so všetkými tromi CDR ťažkého reťazca a s CDR ľahkého reťazca. Oproti tomu, CDR1 a CDR2 ľahkého reťazca se zúčastňujú len niekoľko málo interakcií, pokial vôbec a 2) kľučka obsahujúca zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zrelého IL-Ιβ sa viaže v strede antigén-kombinujúceho miesta zdá sa teda byť kľúčovou zložkou epitopu. Je preto značne zaujímavé, že táto kľučka nie je lokalizovaná v úseku molekuly, ktorá sa najviac odlišuje od myšieho IL-Ιβ. Pro23, Tyr24 a Glu25 sú zachované, ale zvyšok v polohe 22 je Gly v humánnom IL-Ιβ, zatial čo v myšom IL-Ιβ je to Asp. Porovnanie kryštálovej štruktúry humánneho (PDB č. 2ilb) a myšieho IL-Ιβ (PDB č. 8ilb) ukazuje, že táto bodová mutácia má za následok veľmi odlišnú konformáciu hlavného reťazca v okolí Pro23. Táto lokálna štruktúrna diferencia je v zhode súhlasná s pozorovaným nedostatkom skríženej reaktivity AAL160 s príslušný— myším cytokínom.

ZOZNAM SEKVENCII <110> Novartis AG <120> Protilátky na humánny IL-1 beta

<130>

4-31289A

<160>

4

<170>

Patentln

version

3.0

<210>

1

<211>

354

<212>

DNA

<213> .

Mus musculus

<220>

<221>

CDS

<222>

(1) ..

.(354)

<400>

1

gag gtg

cag

ctg

gtg

cag

tct

gga

gca

gag

gtg

aaa

aag

ccc

ggg

gag

43

Glu Val

Gin

Leu

val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Pro

Gly

Glu

1

5

10

15

tct ctg

aag

atc

tcc

tgt

aag

ggt

tct

gga

tac

agc

ttt

acc

agc

tac

96

Ser Leu

Lys

íle

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

tgg atc

ggc

tgg

gtg

cgc

cag

atg

ccc

ggg

aaa

ggc

ctg

gag

tgg

atg

144

Trp íle

Gly

Trp

Val

Arg

Gin

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

ggg atc

atc

tat

cct

agt

gac

tct

gat

acc

aga

tac

agc

ccg

tcc

ttc

192

Gly íle

íle

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ser

Asp

Thr

Arg

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

caa ggc

cag

gtc

acc

atc

tca

gcc

gac

aag

tcc

atc

agc

acc

gcc

tac

240

Gin Gly

Gin

Val

Thr

íle

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

íle

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

ctg cag

tgg

agc

ctg

aag

gcc

tcg

gac

acc

gcc

atg

tat

tac

tgt

288

Leu Gin

Trp

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Cys

85

90

95

gcg aga

tat

acc

aac

tgg

gat

get

ttt

gat

atc

tgg

ggc

caa

ggg

aca

336

Ala Arg

Tyr

Thr

Asn

Trp

Asp

Ala

Phe

Asp

íle

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

354 atg gtc acc gtc tct tca Met Val Thr Val Ser Ser

115
<210>	2
<211>	118 !
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	2

Glu 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser Gly

Ala

Glu Val 10

Lys

Pro Gly Glu 15

Ser

Leu

Lys

íle

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

Trp

íle

Gly

Trp

Val

Arg

Gin

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

>

35

40 .

45

Gly

íle

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ser

Asp

Thr

Arg

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gin

Gly

Gin

Val

Thr

íle

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

íle

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Trp

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Cys

85

so'

95

Ala

Arg

Tyr

Thr

Asn

Trp

Asp

Ala

Phe

Asp

íle

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

Met

Val

Thr

Val

Ser

115

<210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(321) <400> 3 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg

Glu 1

íle

Val

Leu.

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

gaa

aga

gcc

acc

ctc

tcc

tgc

agg

gcc

agt

cag

agt

gtt

'age

age

tac

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Tyr

20

25

30

tta

gcc

tgg

tac

caa

cag

aaa

cct

ggc

cag

get

ccc

agg

ctc

atc

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

íle

35

40

45

tat

gat

gca

tcc

aac

agg

gcc

act

ggc

atc

cca

gcc

agg

ttc

agt

ggc

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Arg

H í ä

Thr

Gly

íle

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

agt

ggg

tct

ggg

aca

gac

ttc

act

ctc

acc

atc

age

ctt

gag

cct

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

gaa

gat

ttt

gca

gtt

tat

tac

tgt

cag

cgt

age

aac

tgg

atg

ttc

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gin

Arg

Ser

Asn

Trp

Met

Phe

85

90

95

cct

ttt

ggc

cag

ggg

acc

aag

ctg

gag

atc

aaa

Pro

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

100

105

<210>

4

<211>

107

<212>

PRT

<213> ,

Mus musculus

<400>

4

Glu

íle

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

íle

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

íle

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gin

Arg

Ser

Asn

Trp

Met

Phe

85

90

95

Pro

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

144

Claims

1. Molekula viažuca IL-Ιβ, ktorá obsahuje väzbové miesto pre antigén obsahujúce aspoň jednu variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu (V_H) , ktorá obsahuje v sekvencii hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, a to ODRI, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile; a jéj priame ekvivalenty.

2. Molekula viažuca IL-β, ktorá obsahuje variabilné domény tak ťažkého (V_H) ako aj ľahkého reťazca (V_L), v ktorých molekula viažuca IL-Ιβ obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén obsahuj úce:

a) variabilnú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu (V_H) , ktorá obsahuje v sekvencii hypervariabilné úseky CDR1, CDR2 a CDR3, a to CDR1, ktorý má’ aminokyselinovú sekvenciu Ser.-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly a CDR3, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile; a

b) variabilnú doménu ľahkého reťazca imunoglobulínu (V_L) , ktorá obsahuje hypervariabilný úsek CDR3', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro;

a jej priame ekvivalenty.

3. Molekula viažuca IL-Ιβ podľa nároku 2, v ktorej variabilná doména ľahkého reťazca imunoglobulínu (V_L) obsahuje v sekvencii hy37 pervariabilné úseky CDRľ, CDR2'a CDR3'a to CDR1', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, CDR2', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a CDR3', ktorý má aminokyselinovú sekvenciu Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro; a jej priame ekvivalenty.

4. Molekula viažuca IL-Ιβ podľa nároku 1, 2 alebo 3, ktorá je humánnou protilátkou.

5. Molekula viažuca IL-Ιβ, ktorá obsahuje aspoň jedno väzbové miesto pre antigén obsahujúce buď prvú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 1, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 128, alebo prvú doménu, ako bola opísaná, a druhú doménu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou uvedenou v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 2, ktorá začína aminokyselinou v polohe 1 a končí aminokyselinou v polohe 107.

6. Molekula viažuca IL-Ιβ podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 na použitie na liečenie ochorenia alebo poruchy sprostredkovanej IL-1.

7. Prvý DNA konštrukt kódujúci ťažký reťazec alebo jeho fragment, ktorý obsahuje

a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo úseky rámca a hypervariabilné úseky, pričom hypervariabilné úseky sú CDR1, CDR2 a CDR3, ktorých aminokyselinové sekvencie sú uvedené v sekvencií SEQ ID NO: 1; pričom táto prvá časť začína kodónom, ktorý kóduje prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a

b) druhú časť kódujúcu konštantný úsek ťažkého reťazca alebo jeho fragment, ktorý začína kodónom kódujúcim,prvú aminokyselinu konštantnej časti ťažkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop.kodón.

8. Druhý DNA konštrukt kódujúci ľahký reťazec alebo jeho fragment, ktorý obsahuje

a) prvú časť, ktorá kóduje variabilnú doménu obsahujúcu striedavo úseky rámca a hypervariabilné úseky; a hypervariabilné úseky sú CDR3' a voliteľne CDRľ a CDR2', ktorých aminokyselinové sekvencie sú uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 2; pričom táto prvá časť začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu variabilnej domény a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu variabilnej domény, a

b) druhú časť kódujúcu konštantný úsek ľahkého reťazca alebo jeho fragment, ktorý začína kodónom kódujúcim prvú aminokyselinu konštantnej časti ľahkého reťazca a končí kodónom kódujúcim poslednú aminokyselinu konštantnej časti alebo jej fragmentu, po ktorom nasleduje stop kodón.

9. Expresný vektor schopný replikácie v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunkovej línii, ktorý obsahuje aspoň jeden z DNA konštruktov podlá nároku 7 alebo.nároku 8.

10. Spôsob prípravy molekuly viažucej IL-Ιβ vyznačuj úci sa t ý m, že zahŕňa kroky (i) kultivácie organizmu, ktorý je transformovaný expresným vektorom podľa nároku 9 a (ii) izolácie molekuly- viažucej IL-Ιβ z kultúry.

11. Protilátka proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny' epitop zrelého· humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je schopná inhibovať naviazanie IL-Ιβ na jeho receptor.

12. i) Použitie protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je schopná inhibovať naviazanie IL-Ιβ na jeho receptor, na liečenie IL-1 sprostredkovaných ochorení alebo porúch;

ii) spôsob liečenia IL-1 sprostredkovaných ochorení a porúch u pacienta vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi podáva účinné množstvo protilátky proti' IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ zahŕňajúceho slučku, ktorá obsahuje zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je schopná inhibície väzby IL-Ιβ na jeho receptor;

iii) farmaceutická kompozícia vyznačuj.úca .satým, že Obsahuje protilátku proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je schopná inhibovať naviazanie IL-Ιβ na jeho receptor, v kombinácii s farmaceutický prijateľným vehikulom, riedidlom alebo nosičom; a iv) použitie protilátky proti IL-Ιβ, ktorá má antigénnu väzbovú špecificitu na antigénny epitop zrelého humánneho IL-Ιβ, ktorý zahŕňa slučku obsahujúcu zvyšky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a ktorá je schopná inhibovať naviazanie IL-Ιβ nä jeho receptor, na prípravu lieki na liečenie ochorení a porúch sprostredkovaných IL-1.