CZ302738B6 - Protilátka proti IL-1beta tvorená molekulou vázající IL-1beta, tato molekula pro použití jako lécivo, použití této molekuly pro výrobu léciva, odpovídající DNA konstrukty a expresní vektor, zpusob prípravy uvedené molekuly a farmaceutická kompozice o - Google Patents

Abstract

Rešení se týká molekuly vázající IL-1.beta., kterou je v konkrétním provedení protilátka proti humánnímu IL-1.beta., zejména humánní protilátka proti humánnímu IL-1.beta., ve které mají úseky CDR težkého a lehkého retezce definovanou aminokyselinovou sekvenci. Tato molekula je vhodná pro prípravu léciva pro lécení nemocí a poruch zprostredkovaných IL-1, jakými jsou napríklad osteoartritida, osteoporóza a další zánetlivé artritidy. Rešení se rovnež týká odpovídajících DNA konstruktu a expresního vektoru, jakož i zpusobu prípravy uvedené molekuly a farmaceutické kompozice, která uvedenou protilátku obsahuje.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká protilátky proti IL-Ιβ tvořené molekulou vázající IL-Ιβ, této molekuly pro použití jako léčivo, použití této molekuly pro výrobu léčiva pro léčení nemocí a poruch zprostředkovaných IL-1, odpovídajících DNA konstruktů a expresního vektoru, způsobu přípravy uvedené molekuly a farmaceutické kompozice obsahující uvedenou protilátku.

Dosavadní stav techniky

Interleukin 1 (IL-1) je aktivita produkovaná buňkami imunitního systému, která působí jako mediátor akutní fáze zánětlivé reakce. Nevhodná nebo nadměrná tvorba IL-1, zejména pak ILΙβ, je patologický stav vedoucí k různým nemocem a poruchám jako je např. septikémie, septický nebo endotoxický šok, alergie, astma, ztráta kostní hmoty, ischémie, infarkt, revmatoidní artritida a další zánětlivá onemocnění. Protilátky k IL-Ιβ již byly navrženy pro použití pri léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a poruch, viz např. WO 95/01997 a diskuse v úvodu uvedeného dokumentu.

Původci předkládaného vynálezu připravili zlepšené protilátky khumánnímu IL-Ιβ pro použití při léčení IL-1 zprostředkovaných nemocí a poruch.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je protilátka proti IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specifitu pro antigenní epitop zralého humánního EL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytky Gly 22, Pro 23, Tyr 24 a Glu 25, a která je schopna inhibice vazby IL- 1β kjeho receptoru, přičemž molekula vázající IL-Ιβ obsahuje vazebné místo pro antigen obsahující alespoň jednu variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (Vh), která obsahuje v sekvenci hypervariabilní úseky CDR1, CDR2 a CDR3, uvedené v SEKVENCI ID. Č. 1, kde uvedený úsek CDR1 má aminokyselinovou sekvenci Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, uvedený úsek CDR2 má aminokyselinovou sekvenci Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp~Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-GÍy a uvedený úsek CDR3 má aminokyselinovou sekvenci Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, přičemž molekula vázající IL-Ιβ obsahuje vazebné místo pro antigen obsahující alespoň jednu variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (V_L), která v sekvenci obsahuje hypervariabilní úseky CDR1', CDR2' a CDR3', uvedené v SEKVENCI ID. Č. 2, kde uvedený úsek CDR1 má aminokyselinovou sekvenci Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, uvedený úsek CDR2' má aminokyselinovou sekvenci Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a uvedený úsek CDR3' má aminokyselinovou sekvenci Gln-Gln-Arg-Ser Asn-Trp-Met -PhePro.

Uvedenou molekulou vázající IL-Ιβ je výhodně humánní protilátka.

Předmětem vynálezu je rovněž uvedená molekula vázající IL-1 β pro použití jako léčivo.

Předmětem vynálezu je rovněž použití uvedené molekuly vázající IL-Ιβ pro výrobu léčiva určeného pro prevenci nebo léčení nemocí nebo poruch zprostředkovaných IL-1, akutních a hyperakutních zánětových reakcí, akutních infekcí, septického šoku, endotoxického Šoku,

CZ 302738 Β6 úbytového syndromu, rakoviny, orgánové dysfunkce, kachexie související s AIDS; nebo pro léčení zánětových stavů, alergií a alergických stavů, hypersenzitivních reakcí, autoimunitních chorob, vážných infekcí, odmítnutí orgánového nebo tkáňového transplantátu; autoimunitní nemoci, artritidy, revmatoidní artritidy, artritidy chronica progrediente, artritidy de forman s, revmatických chorob, zánětové bolesti, hypersenzitivity, hypersenzitivity dýchacích cest, kožní hypersenzitivity, alergií, autoimunitních hematologických poruch, hemolytické anemie, aplastické anemie, anemie pouze červených krvinek a isiopatické trombocy topen ie, systémového lupus erythematosus, polychondrítidy, sklerodermatu, Wegenerovy granulomatózy, dermatomyositidy, chronické aktivní hepatitidy, myastenie gravis, psoriázy, Steven-Johnsonova syndromu, idiopatické poruchy vstřebávání v tenkém střevě, auto imunitního zánětového onemocnění střev, ulcerativní kolitidy, Crohnovy nemoci, syndromu dráždivého tračníku, endokrinní oftalmopatie, Gravesovy nemoci, sarkoidózy, roztroušené sklerózy, primární biliámí cirhózy, juvenilního diabetů, diabetů meílitus typu 1, uveitídy (anteriorní a posteriomí), keratokonjuktivitídy sicca, vernální keratokonjuktivitídy, fibrózy plícního intersticia, intersticíální plicní fibrózy, psoriatické artritidy a glomerulonefritidy, idiopatického nefrotického syndromu, nefropatie s minimálními změnami, astmatu, bronchitídy, pneumokoniózy, emfyzému plic a dalších obstruktivních nebo zánětových chorob dýchacích cest, nemocí kostního metabolizmu, osteoartrítidy, osteoporózy, dalších zánětových artritid, obecného úbytku kostní hmoty, úbytku kostní hmoty souvisejícího se stáří, periodontální choroby, rakovin a nádorů dependentních na IL-1.

Předmětem vynálezu je rovněž první DNA konstrukt kódující těžký řetězec nebo jeho fragment, který obsahuje (i) první část, která kóduje variabilní doménu obsahující střídavé úseky rámce a hypervariabilní úseky, přičemž uvedenými hypervariabilními úseky jsou v sekvenci CDR1, CDR2 a CDR3, jejíchž aminokyselinové sekvence jsou uvedeny v SEKVENCI ID. Č. 1, přičemž tato první část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a (íi) druhou část kódující konstantní úsek těžkého řetězce, který začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části těžkého řetězce a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části, po kterém následuje stop kodon; a druhý DNA konstrukt kódující lehký řetězec, který obsahuje (í) první část, která kóduje variabilní doménu obsahující střídavě úseky rámce a hypervariabilní úseky, přičemž hypervariabilními úseky jsou CDR3' a případně CDE1' a CDR2', jejichž aminokyselinové sekvence jsou uvedeny v SEKVENCI ID. Č. 2, přičemž tato první část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a (ii) druhou část kódující konstantní úsek lehkého řetězce, který začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části lehkého řetězce a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části, po kterém následuje stop kodon.

Předmětem vynálezu je rovněž expresní vektor schopný replikace v prokaryotické nebo eukaryotické buněčné linii, kteiý obsahuje alespoňjeden z uvedených DNA konstruktů.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy molekuly vázající IL-Ιβ, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje (i) kultivaci organizmu, který je transformován uvedeným expresním vektorem a (ii) izolaci molekuly vázající IL-Ιβ z kultury.

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje uvedenou protilátku proti IL-Ιβ společně s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem.

Pokud není výslovně uvedeno jinak, každý polypeptidový řetězec je v tomto textu popsán jako sekvence začínající N-koncovým úsekem a končící C-koncovým úsekem.

. 7 .

Když vazebné místo pro antigen obsahuje obě V_H a V_L domény, tyto domény mohou být lokalizovány na stejné molekule polypeptidu, nebo výhodně každá doména může být na jiném řetězci, přičemž doména V_H je částí těžkého řetězce imunoglobulinu nebo jeho fragmentu a V_L je částí > lehkého řetězce imunoglobulinu nebo jeho fragmentu.

Termín „molekula vázající IL-lpa“ označuje v předkládaném popisu jakoukoliv molekulu schopnou vazby k antigenu IL-1 β, buďto samotnému, nebo asociovanému s dalšími molekulami. Vazebná reakce může být prokázána pomocí standardních metod (kvalitativních testů), jako je io například biologický test (bioassayro stanovení inhibice vazby IL—1 β na jeho receptor nebo jakýkoliv jiný test vazby, vždy vzhledem k testu s negativní kontrolou, kdy se užije protilátka s nepřibuznou specificitou ale stejným isotypem, např. protilátka anti-CD25. Výhodně, vazba molekuly vázající IL—1 βγ podle vynálezu k IL—1 β může být demonstrována užitím kompetitivního vazebného testu.

Příklady molekul vázajících antigen jsou protilátky tvořené B-lymfocyty, hybridomy, chimérické protilátky s „naroubovaným“ CDR („CDR-grafted“) nebo humánní protilátky nebo jakékoliv jejich fragmenty, např. fragmenty F(ab')2 a Fab, a také jednořetězcové („single chain“) protilátky nebo jednodoménové („single domain“) protilátky.

Jednořetězcová protilátka sestává z variabilní domény těžkého a lehkého řetězce protilátky kovalentně spojených pomocí peptidové spojky („linker“), kterou tvoří obvykle 10 až 30 aminokyselin, výhodně 15 až 25 aminokyselin. Tudíž taková struktura neobsahuje konstantní úseky těžkého a lehkého řetězce a věří se, že malý spojovací peptidový úsek by měl být méně antigenní než celý konstantní úsek protilátky.

Termín „chimérická protilátka“ v popisu označuje protilátku, ve které konstantní úseky těžkého nebo lehkého řetězce nebo obou jsou humánního původu, zatímco variabilní domény jak těžkého, tak lehkého řetězce jsou jiného než humánního původu (non-humánní), např. myšího, nebojsou so humánního původu, ale pocházejí z odlišné humánní protilátky.

Termín „CDR-roubovaná protilátka“ označuje protilátku, ve které hypervariabilní úseky (CDR) pocházejí zdonorové (dárcovské) protilátky, jako je například non-humánní (např. myší) protilátka nebo odlišná humánní protilátka, zatímco všechny nebo v podstatě všechny další části imu35 noglobulinu, např. konstantní úseky a vysoce konzervativní úseky variabilní domény, tj. úseky definující rámec protilátky („framework“), pocházejí zakceptorové (príjemcovské) protilátky, např. protilátky humánního původu. CDR-roubovaná protilátka může však obsahovat několik aminokyselin donorové sekvence v úseku rámce, například v úsecích rámce sousedících s hypervariabilními úseky.

Termín „humánní protilátka“ označuje protilátku, ve které konstantní a variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce jsou všechny humánního původu, nebo mají sekvence v podstatě identické se sekvencemi humánního původu, nikoliv nutně ze stejné protilátky, a patří sem i protilátky produkované v myších, ve kterých byly geny pro variabilní a konstantní části imunoglobulinu byly nahrazeny jejich humánními protějšky, např. jak bylo popsáno obecně v dokumentech EPO 546 073 Bl, patent US 5 545 806, patent US 5 569 825, patent US 5 625 126, patent US 5 633 426, patent US 5 661 016, patent US 5 770 429, EP0438474 B1 aEP0463 151 Bl.

Zvláště výhodné molekula vázající IL—1 βγ podle vynálezu jsou humánní protilátky, obzvláště protilátka AAL 160, kteráje dále popsána v příkladech.

Tedy ve výhodných chimérických protilátkách jsou variabilní domény jak těžkého, tak i lehkého řetězce humánního původu, například takové, jaké jsou v protilátce AAL 160, ajsou v seznamu sekvencí uvedeny jako SEKVENCE ID. Č. 1 a SEKVENCE ID. Č. 2. Domény konstantního úseku výhodně také obsahují vhodné humánní domény konstantního úseku, například jak byly

- CZ 302738 B6 popsány v „Sequences of Proteins of Immunological Interest“, Kabat E. A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health.

lypervariabilní úseky mohou být asociovány sjakýmikoliv úseky rámce protilátky, avšak výhodně humánního původu. Vhodné úseky rámce protilátek byly popsány v Kabat E. A. et al, ibid. Výhodný rámec těžkého řetězec je humánní rámec těžkého řetězce, například protilátky AAL 160, uvedený v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1. Tato sekvence sestává ze úseků FR1, ER2, FR3 a FR4. Podobně SEKVENCE ID. Č. 2 ukazuje výhodný rámec lehkého řetězce protilátky AAL160, jehož sekvence sestává z úseků FR1FR2', FR3' a FR4'.

Tudíž vynález také poskytuje Molekulu vázající IL-Ιβ, která obsahuje alespoň jedno vazebné místo pro antigen obsahující buďto první doménu mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou se sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1 počínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 118, nebo první doménu popsanou výše a druhou doménu mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou se sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2, počínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 107.

Monoklonální protilátky namířené proti proteinům přirozeně se vyskytujícím u všech lidí jsou typicky produkovány v non-humánních systémech, např. v myši. Přímým důsledkem těchto skutečností je to, že xenogenní protilátka produkovaná pomocí hybridomu, když je podávána člověku, vyvolává nežádoucí imunitní reakci, která je především zprostředkovaná konstantní částí xenogenního imunoglobulinu. To jasně omezuje použití takových protilátek, jelikož nemohou být podávány po delší období. Tudíž je zvláště výhodné použití jednořetězcových, jednodoménových, chimérických, CDR-roubovaných nebo zejména humánních protilátek, které po podání člověku s velkou pravděpodobností nevyvolají významnou allogenní reakci.

S ohledem na skutečnosti výše uvedené, výhodnější molekula vázající IL—1 β podle předkládaného vynálezu je molekula vybraná ze skupiny humánních protilátek anti-lL-Ιβ, které obsahují alespoň

a) těžký řetězec imunoglobulinu nebo jeho fragment, který obsahuje (i) variabilní doména obsahující v sekvenci hypervariabilní úseky CDR1, CDR2 a CDR3 a (ii) konstantní úsek nebo jeho fragment z humánního těžkého řetězce, a to CDR1 mající aminokyselinovou sekvenci Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, CDR2 mající aminokyselinovou sekvenci Ile-lle-TyrPro -SerAsp-Ser- /\sp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-<jly a CDR3 mající aminokyselinovou sekvenci Tyr-Thr-AsnTrp-Asp-AlaPhe-Asp-Ile, a

b) lehký řetězec imunoglobulinu nebo jeho fragment, který obsahuje (i) variabilní doménu obsahující hypervariabilní úsek CDR3' a volitelně také hypervariabilní úseky CDRU, CDR2' a (ii) konstantní úsek nebo jeho fragment z humánního lehkého řetězce, a to CDR]' mající aminokyselinovou sekvenci Arg-Ala-Ser-GIn-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, CDR2' mající aminokyselinovou sekvenci Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a CDR3' mající aminokyselinovou sekvenci Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro, a její přímé ekvivalenty.

Alternativně molekula vázající IL-Ιβα podle vynálezu je molekula vybraná ze skupiny jednoretězcových vázajících molekul, která obsahuje vazebné místo pro antigen obsahující

a) první doménu obsahující v sekvenci hypervariabilní úseky CDR1, CDR2 a CDR3, přičemž tyto hypervariabilní úseky mají aminokyselinové sekvence uvedené v SEKVENCI ID. Č. 1,

b) druhou doménu obsahující hypervariabilní úsek CDR3' a volitelně také CDRU a CDR2', přičemž tyto hypervariabilní úseky mají aminokyselinové sekvence uvedené v SEKVENCI ID.Č. 2 a

e) peptidový linker, který je navázán buďto k N-konct první domény a k C-konci druhé domény, nebo k C-konci první domény k N-konci druhé domény,

-4 CZ 302738 B6 a její přímé ekvivalenty.

Jak je odborníkovi známo, malé změny v aminokyselinové sekvenci, jako je například delece (odstranění), adice (přidání) nebo substituce (nahrazení) jedné, několika málo nebo dokonce i více aminokyselin, mohou poskytnout alelickou formu původního proteinu, která má v podstatě identické vlastnosti.

Tudíž termín Její přímý ekvivalent“ označuje v předkládaném popisu buďto jednodoménovou molekulu vázající IL-1 β (molekula X) (i) ve které hypervariabilní úseky CDRI, CDR2 a CDR3 jakožto celek jsou alespoň z 80% homologní, výhodně alespoň z 90 % homologní, výhodněji alespoň z 95 % homologní s hypervariabilními úseky v SEKVENCI ID. Č. 1, a (ii) kteráje schopná ínhibovat vazbu IL-Ιβ kjeho receptoru v podstatě ve stejném rozsahu jako referenční molekula mající úseky protilátkového rámce identické s odpovídajícími úseky is molekuly X, ale mající hypervariabilní úseky CDRI, CDR2 a CDR3 identické s odpovídajícími úseky SEKVENCE ID. Č. 1 nebo jakoukoliv molekulu vázající IL-Ιβ mající alespoň dvě domény na každé vazebné místo (molekula X') (i) ve které hypervariabilní úseky CDRI, CDR2, CDR3, CDR3' a volitelně také CDRI' a

CDR2' jakožto celek, jsou alespoň z 80 % homologní, výhodně alespoň z 90 % homologní, výhodněji alespoň z 95 % homologní s hypervariabilními úseky v SEKVENCI ID. Č. 1 a SEKVENCE ID. Č. 2, a (ii) kteráje schopná ínhibovat vazbu IL-Ιβ kjeho receptoru v podstatě ve stejném rozsahu jako referenční molekula mající úseky protilátkového rámce a konstantní úseky identické s odpovídajícími úseky molekuly X', ale mající hypervariabilní úseky CDRI, CDR2, CDR3 a CDR3', a volitelně také CDRI' a CDR2', identické s odpovídajícími úseky SEKVENCE ID.Č. 1 a SEKVENCE ID. Č. 2.

V kontextu předkládaného popisu vynálezu je aminokyselinová sekvence alespoň z 80 % homo30 logní s druhou sekvencí, jestliže tyto sekvence mají alespoň 80 % identických aminokyselinových zbytků ve stejné poloze, když jsou sekvence optimálně přiřazeny (srovnány), přičemž mezery nebo inzerce v aminokyselinové sekvenci jsou počítány za neidentické zbytky.

Inhibice vazby IL-Ιβ na receptor může být snadno testována pomocí různých testů jako jsou např. testy popsané dále v textu. Použitý IL-1 β receptor je výhodně receptor IL-1 β typu 1.

Výraz „ve stejném rozsahu“ nebo „ve stejné míře“ znamená v kontextu předkládaného popisu, že referenční a s ní ekvivalentní molekula vykazují, statisticky vzato, v podstatě identickou funkční závislost inhibice IL-Ιβ vazby podle jednoho z testů zmíněných výše.

Například použitý test může být test kompetitivní inhibice vazby IL-Ιβ prováděný pomocí rozpustných IL-1 receptoru a IL-Ιβ vázajících molekul podle vynálezu,

Nejvýhodněji humánní IL—l β protilátka obsahuje alespoň

a) jeden těžký řetězec, který obsahuje variabilní doménu mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou se SEKVENCÍ ID. Č. I počínající aminokyselinou v poloze i a končící aminokyselinou v poloze 118, a konstantní úsek humánního těžkého řetězce, a

b) jeden lehký řetězec, který obsahuje variabilní doménu mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou s SEKVENCÍ ID. Č. 2 počínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 107, a konstantní úsek humánního lehkého řetězce.

-5 CZ 302738 B6

Konstantní úsek liu mail ní ho těžkého řetězce muže být typu γ,, γ₂, γ₃ a γ₄, μ, ct,, α₂, Ó nebo ε, výhodně typu γ, a výhodněji typu γ_Η zatímco konstantní úsek humánního lehkého řetězce může být typu κ nebo λ (který zahrnuje subtypy λ|, λ₂, λ₃), ale výhodně je typu k. Aminokyselinové sekvence všech těchto konstantních úseků jsou uvedeny v publikací Kabat et al., citované výše.

Molekula vázající IL-Ιβ podle vynálezu může být připravena metodami rekombinantní DNA. Pro tento účel musí být zkonstruována jedna nebo více DNA molekul kódujících vázající molekulu a umístěna s vhodnou kontrolní sekvencí a přenesena do vhodného hostitelského organismu, kde je pak exprimována.

io

V obecném smyslu tak vynález poskytuje:

(i) DNA molekuly kódující jednodoménovou molekulu vázající IL-Ιβ podle vynálezu, jednořelčzeovou molekulu vázající IL-Ιβ podle vynálezu, těžké nebo lehké řetězce nebo jejich fragmenty z molekuly vázající IL—lβ podle vynálezu, a (ii) použití DNA molekuly podle vynálezu k produkci IL-Ιβ vázajících molekul podle vynález pomocí rekombinantní technologie.

Dosavadní stav techniky je takový, že odborník je schopen snadno syntetizovat DNA molekuly podle předkládaného vynálezu na základě informací uvedených v tomto popisu, tj. amínokyseli2(> nových sekvencí hypervariabilních úseků a DNA sekvencí, která je kódují. Způsob konstrukce genu pro variabilní doménu byl například popsán v Evropské patentové přihlášce ě. 239 400 a může být stručně shrnut následovně: Klonuje se gen kódující variabilní doménu MAb (monoklonální protilátky) s libovolnou specificitou. DNA segmenty kódující rámec protilátky a hypervariabilní úseky se určí a DNA segmenty kódující hypervariabilní úseky se odstraní, takže DNA segmenty kódující rámcové úseky jsou vzájemně spojeny pomocí vhodných rcstrikčních míst v místě spojení. Restrikční místa mohou být vytvořena ve vhodných polohách mutagenezí DNA molekul pomoct standardních postupů odborníkovi známých. Dvouřetězcové syntetické CDR kazety jsou připraveny pomocí DNA syntézy podle sekvence uvedené jako SEKVENCE ID. Č. 1 nebo SEKVENCE ID. C. 2. Tyto kazety jsou opatřeny „lepivými“ („sticky“) konci, takže mohou být ligovány do spojů (restrikčních míst) rámcových úseků.

Navíc není potřeba mít přístup k mRNA z produkujícího hybridomové buněčné linie, aby bylo možné získat DNA konstrukt kódující molekulu vázající IL—1 βγ podle vynálezu. Tak např. PCT přihláška publikované jako WO 90/07861 poskytuje úplné instrukce pro produkci protilátky pomocí techniky rekombinantní DNA, přičemž výchozí informací je pouze nukleotidová sekvence genu. Popsaný způsob zahrnuje syntézu řady oligonukleotidů, jejich amplifikaci pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) a nakonec jejich sestřih a spojení („splicing“), čímž vznikne požadovaná DNA sekvence.

Expresní vektory obsahující vhodný promotor nebo geny kódující konstantní úseky těžkého a lehkého řetězce jsou veřejně k dispozici. Tedy jakmile je jednou DNA molekula podle vynálezu připravena, může být snadno přenesena ve vhodném expresním vektoru. DNA molekuly kódující jed no řetězcové protilátky mohou také být připraveny pomocí standardního postupu, například jak byl popsán v mezinárodní patentové přihlášce WO 88/1649.

Vzhledem k výše uvedenému není nutné ukládat ani hybridomy ani buněčné linie, aby byl splněn požadavek dostatečnosti popisu vynálezu.

V konkrétním provedení vynález obsahuje první a druhý DNA konstrukt pro produkci Molekula vázající IL—I β, jak jsou popsány dále:

První DNA konstrukt kóduje těžký řetězec nebo jeho fragment a obsahuje

-6CZ 302738 Β6

a) první část, která kóduje variabilní doménu obsahující střídavě rámec a hypervariabilní úseky, přičemž hypervariabilní úseky jsou CDR1, CDR2 a CDR3 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1, a tato první část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a

b) druhou část kódující konstantní úsek těžkého řetězce nebo jeho fragment, který začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části těžkého řetězce a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části nebo jejího fragmentu, po kterém následuje stop kodon.

Výhodně tato první část kóduje variabilní doménu mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1 počínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 118. Výhodněji první část má nukleotidovou sekvenci jako SEKVENCE ID. Č. 1 začínající nukleotidem v poloze 1 a končící nukleotidem v poloze 354. Výhodně druhá část kóduje konstantní část humánního těžkého řetězce, výhodněji konstantní část humánního řetězce γΐ. Tato druhá část může být DNA fragment gen o mo vého původu, (obsahující introny) nebo cDNA fragment (bez intronů).

Druhý DNA konstrukt kóduje lehký řetězec nebo jeho fragment a obsahuje

a) první část, která kóduje variabilní doménu obsahující střídavě úseky rámce a hypervariabilní úseky, přičemž hypervariabilní úseky jsou CDR3' a volitelně CDR1' a CDR2', jejichž aminokyselinové sekvence jsou v seznamu sekvencí uvedeny jako SEKVENCE ÍD. C. 2, přičemž tato Část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a

b) druhou část kódující konstantní Část lehkého řetězce nebo její fragment, který začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části lehkého řetězce a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části nebo jejího fragmentu, po kterém následuje stop kodon.

Výhodně tato první část kóduje variabilní doménu mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2 začínající aminokyselinou v poloze 1 a končící aminokyselinou v poloze 107. Výhodněji, první část má nukleotidovou sekvenci uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 2 začínající nukleotidem v poloze 1 a končící nukleotidem v poloze 321. Výhodně druhá část kóduje konstantní Část humánního lehkého řetězce, výhodněji konstantní Část humánního řetězce k.

Vynález také zahrnuje molekulu vázající IL—l β, ve kterých je jeden nebo více zbytků vCDRl, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' nebo CDR3' změněno proti zbytkům v SEKVENCI ID. Č. 1 a SEKVENCI ID. Č. 2, například mutací, např. místně cílenou mutagenezí příslušné DNA sekvence. Vynález také zahrnuje DNA sekvence kódující takto změněné molekuly vázající IL—1 β. Zejména vynález zahrnuje molekuly vázající IL— 1 β, ve kterých jeden nebo více zbytků v CDR1^r nebo CDR2' byly změněny proti zbytkům v SEKVENCI ID. Č. 2.

V prvním a druhém DNA konstruktu může být první a druhý část oddělena intronem, a v intronu mezi první a druhou částí může být výhodně lokalizován enhancer (zesilovací element). Přítomnost takového enhanceru, kterýje transkribován ale není translatován, může napomoci účinnosti transkripce. Ve zvláštním provedení první a druhý DNA konstrukt obsahují enhancer genu těžkého řetězce výhodně humánního původu.

Každý z DNA konstruktů je vložen pod kontrolu vhodných kontrolních sekvencí, zejména vhodného promotoru. Může být použit jakýkoliv typ promotoru, za předpokladu, že je adaptován pro hostitelský organismus, do které budou DNA konstrukty přeneseny pro expresi. Avšak pokud má k expresi dojít v savčích buňkách, zvláště výhodné je použití promotoru imunoglobulinového genu, nebo promotoru cytomegaloviru (CMV), např. promotor humánního CMV.

CZ 302738 Β6

Požadovaná protilátka muže být produkována v buněčné kultuře nebo v transgenním zvířeti. Vhodné transgenní zvíře může být připraveno standardním způsobem, který je odborníkům znám, a který zahrnuje mi kro injekce prvního a druhého DNA konstruktu s vhodnými kontrolními sekvencemi do vajíčka a pak přenesení takto připraveného vajíčka do vhodné pseudopregnantní samice a nakonec selekci potomstva exprimujícího požadovanou protilátku.

Když jsou řetězce protilátky produkovány v buněčné kultuře, DNA konstrukty musí být nejdříve vloženy buďto do jednoho expresního vektoru, nebo do dvou oddělených ale přitom kompatibilních expresních vektorů, což je považováno za výhodnější možnost.

Takže předkládaný vynález také poskytuje expresní vektor schopný replikace v prokaryotické nebo eukaryotické buněčné linii, která obsahuje alespoň jeden z DNA konstruktů výše popsaných.

Každý /.expresních vektorů obsahujících DNA konstrukt je pak přenesen do vhodného hostitelského organizmu. Když jsou DNA konstrukty odděleně vloženy do dvou expresních vektorů, mohou být přeneseny odděleně, tj. jeden typ vektoru do jedné buňky, nebo mohou být přeneseny společně (ko-transťer), což je považováno za výhodnější možnost. Vhodným hostitelským organismem jsou baktérie, kvasinky nebo savčí buněčné linie, přičemž výhodná je tato třetí možnost. Výhodněji, savčí buněčná linie je lymfoidního původu, např. myelom, hybridom nebo normální imortalizované B-lymťocyty, které neexprimují endogenně žádné těžké ani lehké řetězce protilátky.

Pro expresi v savčích buňkách je výhodné, když sekvence kódující molekulu vázající IL—I β je integrována do DNA hostitelské buňky do lokusu, který dovoluje nebo podporuje vysoký stupeň exprese IL-Ιβ vázajících molekul. Buňky, ve kterých je sekvence kódující molekulu vázající ILΙβ integrována do takového výhodného lokusu, mohou být identifikovány a selektovány na základe hladiny molekul vázajících IL-Ιβ, kterou exprimují. Jakýkoliv vhodný selekční markér může být použit pro přípravu hostitelských buněk obsahujících kódující sekvenci pro molekulu vázající IL—1 β, např. gen dhfr/metotrexat nebo ekvivalentní selekční systém. Výhodné systémy pro expresi molekuly vázající IL-Ιβ podle vynálezu jsou např. systémy založené na GS-amplifikaci/selekci, popsané v EP 0 256 055 B, EP 0 323 997 B a evropské patentové přihlášce 89303964.4. Výhodně vektor obsahující i další sekvence než jen požadované, a sice pro usnadnění exprese, opracování a transport exprimovaného proteinu, např. vektor typicky obsahuje vedoucí („leader“) sekvenci asociovanou s kódující sekvencí.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob produkce IL-Ιβ vázajících molekul, přičemž tento způsob zahrnuje kroky (i) kultivace organizmu, který je transformován expresním vektorem definovaným výše, a (ii) izolace molekuly vázající 1L— I β z kultury.

V souladu s předkládaným vynálezem bylo zjištěno, že protilátka AAL160 má vazebnou specifickou pro antigenní epitop humánního IL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 ze zralého humánního IL-Ιβ (tyto zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 ze zralého humánního IL-Ιβ odpovídající zbytkům 138, 139, 140 a 141, v uvedeném pořadí, prekurzoru humánního IL-Ιβ). Tento epitop je lokalizován vně rozpoznávacího místa receptorů 1L1 a je proto nanejvýš překvapující, že protilátky proti tomuto epitopů, tj. např. protilátka AAL160, jsou schopné inhibovat vazbu IL-Ιβ k receptorů. Protilátky, zejména chimérické protilátky a CDR-roubované protilátky, a zejména humánní protilátky, které mají vazebnou specifícitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ, který obsahuje kličku obsahující zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a kteréjsou schopné inhibovat vazbu IL—1 β na jeho receptor, a také použití těchto protilátek při léčení nemocí a poruch zprostředkovaných IL-1, jsou proto nové a spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu.

-8CZ 302738 B6

Takže dalším aspektem předkládaného vynálezu je protilátka proti IL-1 β, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop humánního IL-1 β, který obsahuje kličku obsahující zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zralého humánního IL-Ιβ, a která je schopná inhibovat vazbu IL-1 β na jeho receptor.

Další aspekty předkládaného vynálezu se týkají:

i) použití protilátky proti IL—Ί β, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL—tβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a která je schopná inhibice vazby IL—l β kjeho receptorů, při léčení IL—l zprostředkovaných nemocí nebo poruch, íi) léčení IL—1 zprostředkovaných nemocí a poruch u pacientů, které spočívá v tom, že se pacientovi podává účinné množství protilátky proti IL—1 β, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a která je schopná inhibice vazby IL-Ιβ kjeho receptoru, iii) farmaceutického přípravku, který obsahuje protilátku proti IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a která je schopná inhibice vazby IL-Ιβ kjeho receptorů, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem, a iv) použití protilátky proti IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specificitu pro antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ, který zahrnuje kličku obsahující zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a která je schopná inhibice vazby IL-Ιβ kjeho receptorů, pro výrobu léku k léčení 1L— I zprostředkovaných nemocí a poruch.

V kontextu předkládaného popisu výraz, že protilátka je „schopná inhibovat vazbu IL-Ιβ“ znamená, že protilátka je schopná inhibovat vazbu IL-Ιβ kjeho receptorů v podstatě ve stejném rozsahu jako protilátka AAL160, přičemž výraz „ve stejném rozsahu“již byl definován výše.

V kontextu předkládaného popisu výraz „IL—1 zprostředkovaná nemoc“ zahrnuje všechna onemocnění a zdravotní stavy, ve kterých hraje důležitou roli IL-1, ať již přímo nebo nepřímo při nemoci nebo stavu, včetně příčiny nemoci, rozvoji a progrese nemoci, persistence nebo patologie nemoci nebo stavu.

V kontextu předkládaného popisu se termíny „léčení“ nebo „léčit“ týkají jak profylaktické péče tak i kurativní péče nebo péče vedoucí k modifikaci onemocnění, včetně péče o pacienty, kteří jsou v riziku získání nemoci nebo mají podezření, že nemoc získali, a také pacienty, kteří nemoci již trpí nebo byly diagnostikováni jako trpící nemocí, a dále se týkají i potlačení klinického relapsu.

Protilátky, které mají vazebnou specificitu po antigenní epitop zralého humánního IL-Ιβ zahrnující kličku obsahující zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25, a kteréjsou schopné inhibice vazby IL-Ιβ kjeho receptorů jsou dále označovány jako „protilátky podle vynálezu“.

Výhodné protilátky podle vynálezu jsou protilátky, které mají vazebnou specificitu pro tento epitop humánního IL-Ιβ, když humánní IL-Ιβ je v nativním stavu, jako jsou např. normální fyziologické podmínky, a nikoliv v denaturovaném stavu, jako je tomu např. v přítomnosti denaturujících činidel, jako je například SDS. Protilátky podle vynálezu mohou zkříženě reagovat s non-humánními IL-Ιβ, které mají antigenní epitopy obsahující Gly jako zbytek v poloze 22, Pro jako zbytek v poloze 23, Tyr jako zbytek v poloze 24 a Glu jako zbytek v poloze 25, a které jsou blízce podobné odpovídajícímu humánnímu epitopů. Například protilátky podle vynálezu mohou zkříženě reagovat s IL-Ιβ primátů, jako jsou například makak „rhesus“, makak „cynomolgus“ nebo marmoset.

-9 CZ 302738 B6

Výhodné protilátky podle vynálezu jsou molekuly vázající IL— I β podle prvního a druhého aspektu vynálezu. Výhodně jsou protilátky podle vynálezu humánní protilátky, nej výhod něj i je to protilátka AAL160 nebo její přímý ekvivalent.

s Protilátky podle vynálezu blokují účinky IL— I β na jeho cílové buňky a jsou tedy určeny pro použití pří léčení 1L-I zprostředkovaných nemocí a poruch. Tyto a další farmakologické účinky protilátek podle vynálezu mohou být prokázány užitím standardních testovacích metod, např. uvedených dále:

ιο 1. Neutralizace aktivace promotoru 11-8 zprostředkované humánním 11 -I β

Potenciální neutralizace buněčné signalizace závislé na IL-Ιβ se může stanovit pomocí testu s reportérovým genem.

Humánní melanomová buněčná linie G361 je stabilně transfekována konstruktem založeným na humánním 1L-8 promotoru s luciferázovým reportérovým genem. Exprese a aktivita reportérového genu je závislá v této buněčné linii na IL-Ιβ nebo TNFa. Buňky se stimulují 300pg/ml rekombinantního humánního IL-Ιβ nebo ekvivalentem 100 pg/ml v kondícionovaném médiu v přítomnosti různých koncentrací protilátky podle vynálezu nebo antagonisty IL—1 receptoru

2o v rozmezí 6 až 18000 pM. Chimérická protilátka Sirnulect* (basiliximab) se užívá jako kontrola se shodným isotypem. Luciťěrázová aktivita se kvantifikuje užitím chem i luminiscenčního testu. Protilátky podle vynálezu mají při testování v tomto testu typicky hodnotu IC₅₀ přibližně I nM (např. 0,2 až 5 nM)

2. Neutralizace IL-Ιβ dependentní tvorby PGE2 a interleukinu-6 v primárních humánních fibroblastech

Tvorba PGF? a IL—6 v primárních humánních dermálních fibroblastech je závislá na IL-Ιβ. Samotný TNF-α nemůže účinně indukovat zánětové mediátory, ale působí synergicky s IL—1.

Primární dermální fíbroblasty se užívají jako náhradní model pro IL-l-indukovanou buněčnou aktivaci.

Primární humánní fíbroblasty se stimulují rekombinantním IL-Ιβ nebo kondicíonovaným médiem získaným z LPS-stimulovaných humánních PBMC v přítomnosti různých koncentrací protilátky podle vynálezu nebo 1L-1RA v rozsahu 6 až 1800 pM. Chimérická protilátka Simulecť* (basiliximab) se užívá jako kontrola se shodným isotypem. Supernatant se odebírá po 16 hodinách stimulace a testuje se na přítomnost IL-6 testem ELISA nebo na přítomnost PGE2 testem R1A. Protilátky podle vynálezu mají při testování v těchto testech typicky hodnotu IC50 pro inhibicí produkce IL—6 přibližně 1 nM nebo nižší (např. 0,1 až 1 11M) a pro inhibicí produkce

PGE2 přibližně lnM (např. 0,l až l nM).

Jak bylo ukázáno výše, protilátky podle vynálezu silně blokují účinek IL-Ιβ. Tudíž jsou protilátky podle vynálezu farmaceuticky využitelné, a sice následujícími způsoby:

Protilátky podle vynálezu jsou užitečné k profylaxi a léčení IL— l zprostředkovaných nemocí a stavů, jako je např. zánět, alergie a alergický stav, hypersenzitívní reakce, autoimunitní choroba, silná infekce a rejekce orgánového nebo tkáňového transplantátu.

Tak například protilátky podle vynálezu mohou být užity při léčení příjemců transplantátů srdce, plic, bloku srdce-plíce, ledvin, slinivky, kůže nebo rohovky, a také při prevenci reakce příjemce proti dárcovskému štěpu („graft-versus-host disease“), např. po transplantaci kostní dřeně.

Protilátky podle vynálezu jsou konkrétně použitelné např. při léčení, prevenci nebo zmírnění autoimunitních onemocnění a zánětlivých onemocnění, zejména zánětlivých stavů s etiologií

- IOCZ 302738 B6 zahrnující autoimunitní složku, jako je například artritida (např. revmatoidní artritida, artritida chronica progrediente a artritida deformans), a revmatických onemocnění, včetně zánětlivých stavů a revmatických onemocnění zahrnujících ztrátu kostní hmoty, bolestivé záněty, a hypersenzitivity (včetně hypersenzitivity dýchacích cest i kožní hypersenzitivity) a alergií. Ke speci5 fíckým auto imunitních chorobám, pro které mohou být protilátky podle vynálezu použity, patří autoimunitní hematologické poruchy (včetně např. hemolytické anemie, aplastické anemie, anemie pouze červených krvinek a idiopatické trombocytopenie), systémový lupus erythematosus, polychondritida, skleroderma, Wegenerova granulomatóza, dermatomyositida, chronická aktivní hepatitida, myasthenia gravis, psoriáza, Steven-Johnsonův syndrom, idiopatická porucha vstřeio bávání v tenkém střevu (sprue), autoimunitní zánětlivé onemocnění střev (včetně např. ulcerativní kolitidy, Crohnovy nemoci a syndromu dráždivého tračníku), endokrinní oftalmopatie, Gravesova nemoc, sarkoidóza, sclerosis multiplex, primární biliámí cirhóza, juvenilní diabetes (diabetes mellitus typu I), uveitida (anterior a posterior), keratoconjunctivitis sicca a vernální keratokonjunktivitida, fibróza plicního interstitia, psoriatická artritida a glomerulonefritida (jak bez, tak is i s neťrotickým syndromem, např. včetně idiopatického nefrotického syndromu nebo nefropatie s minimálními změnami).

Protilátky podle vynálezu jsou také použitelné při léčení, prevenci nebo zmírnění nemocí jako je astma, bronchitida, pneumikonióza, emfyzém plic, a další obstruktivní nebo zánětlivá onemocně2o ní dýchacích cest.

Protilátky podle vynálezu jsou použitelné také při léčení nežádoucí akutní a hyperakutní zánětlivé reakce, kteráje zprostředkovaná IL-1 nebo zahrnuje tvorbu IL-1, obzvláště IL-Ιβ, nebo podporou uvolňování TNF pomocí IL-1, např. jako je např. akutní infekce, např. septický šok (např.

endotoxický šok a respirační distres syndrom dospělých), meningitida, pneumonie, těžké popáleniny, a dále pri léčení kachexie nebo úbyťového syndromu spojeného s patologickým uvolňováním TNF v důsledku infekcí, karcinomu nebo orgánových dysfunkcí, obzvláště s AIDS související kachexie, např. asociované nebo následující po infekci HIV.

Protilátky podle vynálezu jsou dále zejména použitelné pri léčení onemocnění metabolismu kostí, jako je např. osteoartritida, osteoporóza a další zánětlivé artritidy a ztráty kostní hmoty obecně, včetně ztráty kostní hmoty související se stárnutím, a pri specifických onemocněních periodontu.

Protilátky podle vynálezu mohou být také použit při léčení karcinomů, zejména IL-1 dependent35 nich nádorů.

Pro uvedené indikace bude vhodná dávka, samozřejmě, různá, a to v závislosti například na konkrétní použité protilátce podle vynálezu, příjemci, způsobu podávání, a povaze a závažnosti onemocnění, které se má léčit. Avšak při profylaktickém použití lze obecně uspokojivých výsledků io dosáhnout s denními dávkami přibližně 0,1 mg až přibližně 5 mg na 1 kilogram tělesné hmotnosti. Protilátka podle vynálezu se obvykle podává parenterálně, intravenózně, např. do antekubitální nebo jiné periferní žíly, intramuskulámě, nebo subkutánně. Profylaktické léčení typicky spočívá v podávání molekul podle vynálezu jedenkrát denně až jedenkrát týdně po dobu 2 až 4 týdnů.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu jsou vyráběny obvyklými způsoby, které jsou odborníkům známy. Přípravek podle vynálezu je výhodně poskytnut v lyofilizované formě. Pro okamžité podání je rozpuštěn ve vhodném vodném nosiči, jako je například sterilní voda pro injekce nebo sterilní pufřovaný fyziologický roztok. Je vhodné připravit větší objem takového roztoku pro podávání infúzí, např. i.v. infúzí, namísto bolusové injekce, např. s.c. bolusové injekce. Pri formulaci takového přípravku je výhodné do fyziologického roztoku přidat humánní sérový albumin nebo přímo pacientovu vlastní heparinizovanou krev. Přítomnost nadbytku fyziologicky inertního proteinu zabraňuje ztrátě protilátky v důsledku adsorpce na stěnách kontejneru a hadiček, které se užívají pro infúzní roztok. Pokud se užije albumin, pak vhodná koncentrace je

0,5 až 4,5 % (hmot.) vzhledem k fyziologickému roztoku.

Předkládaný vynález je dále popsán pomocí příkladů, jejichž funkce je ilustrativní, a které jsou doplněny následujícími obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je graf ukazující kompetitivní inhibici vazby AAL160 k IL-Ιβ pomocí rozpustného receptorů 1L—1 typu I a typu II.

tu Obrázek 2 je graf ukazující inhibici horečky vyvolané 1L—I β podáním AAL160 na modelu laboratorního potkana.

Obrázek 3 je graf ukazující trvání účinku AAL160 na horečku vyvolanou IL-I β na modelu laboratorního potkana.

Příklady provedeni vynálezu

Transgenní myši exprimující humánní lgG/κ repertoár místo vlastního imunoglobulinového zo repertoáru (Fishwild eí aí, 1996, Nátuře Biotechnol., 14, 845 až 851) byly použity pro přípravu protilátky proti humánnímu IL-Ιβ. B lymfocyty z těchto myší byly imortalizovany užitím standardní hybridomové technologie a byly tak získány myší hybridomové buňky secernující humánní lgGl/κ protilátku označenou AAL160.

Přiklad I

Vytvoření hybridomů a purifikace protilátky w Geneticky modifikované myš 66 (Medarex lne. Annadale, NJ) byla imunizována rekombinantním humánním IL-Ιβ (50 pg) v adjuvans s.c. v několika místech. Imunitní reakce myši byla dále zesílena pěti dalšími injekcemi, poslední injekce tři dni před fúzí. V den fúze byla myš 66 utracena inhalací CO> a buňky ze sleziny (4,1 χ 10⁷) byly fúzovány rutinním způsobem užitím PEG 4000 se stejným počtem buněk PAI-O myší myelomové buněčné linie. Fúzované buňky byly přeneseny do 624 jamek (1 ml/jamka) obsahujících podpůrnou („feeder“) vrstvu myších peritoneálních buněk (Balb C myší), v médiu RPMI 1640 s HAT, 10% tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem a 5 x 10 ⁵ M β-merkaptoethanolem. Supematanty byly odebírány a testovány pomocí ELISA testu a byl prováděn sereening na IL-Ιβ reaktivní monoklonální protilátky. Pět monoklonálních protilátek podtřídy lgG/κ bylo identifikováno. Klonování bylo provedeno 4 x

96jamkové mikrotitrační destičky, do každé jamky bylo přeneseno 0,5 buněk. Po dvou týdnech byly jamky kontrolovány inverzním mikroskopem. Supematanty byty odebrány z jamek s pozitivním růstem a produkce monoklonální protilátky antí-IL-1 β byla vyhodnocována pomocí ELISA. 1 až 2 litry kondicionovaného supernatantu ze čtyřech subklonů původně identifikovaného hybridomů #476 bylo připraveno a protilátky byly purifi kovány pomocí afinitní chromatogra45 fie na koloně s proteinem A.

Čistota a Částečná aminokyselinová sekvence těžkého a lehkého řetězce

Aminokyselinové sekvencování

Lehké a těžké řetězce purifikované protilátky AAL160 byly odděleny pomocí SDS-PAGE a amino-koncové aminokyseliny byly stanoveny pomocí Edmanovy degradace. Čistota protilátky použité v této studii pomocí sekvencování byla >90%. cDNA sekvence kódující variabilní domény těžkého a lehkého řetězce byly získány pomocí PCR amplifikace z cDNA připravené z mRNA

- 12 CZ 302738 B6 z klonovaných hybridomových buněk a úplného sekvencování. Aminokoncové sekvence variabilních domén těžkého a lehkého řetězce a odpovídající DNA sekvence jsou uvedeny dále, přičemž tučně jsou vyznačeny úseky CDR.

SEKVENCE ID. Č. 1

60

GAG Glu	GTG CAG CTG	GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG AAG ATC
Val Gin	Leu	Val	Gin Ser Gly Ala	Glu 10	Val Lys	Lys	Pro	Gly Glu Ser	Leu Lys	Xle 20
					90	ChAl				120
TCC	TGT AAG	GGT	TCT	GGA TAC AGC TTT	ACC	AGC TAC	TOO	ATC	GGC TGG GTG	CGC CAG	ATG
Ser	Cys Lys	Gly	Ser	Gly Tyr Ser Phe	Thr	Ser Tyr	Trp	Xle	Gly Trp Val	Arg Gin	Met
					30						40
					150	CDR2					180
CCC	GGG AAA	GGC	CTG	GAG TGG ATG GGG	ATC	ATC TAT	CCT	AGT	GAC TCT GAT	ACC AGA	TAC
Pro	Gly Lys	Gly	Leu	Glu Trp Met Gly	Xle	xle Tyr	Pro	Ser	Asp Ser Asp	Thr Arg	Tyr
					50						60
					210						240
AGC	CCG TCC	TTC	CAA	GGC CAG GTC ACC	ATC	TCA GCC	GAC	AAG	TCC ATC AGC	ACC GCC	TAC
Ser	Pro Ser	Phe	Gin	Gly Gin Val Thr	Ile	Ser Ala	Asp	Lys	Ser Ile Ser	Thr Ala	Tyr
					70						80
					270						300
CTG	CAG TGG	AGC	AGC	CTG AAG GCC TCG	GAC	ACC GCC	ATG	TAT	TAC TGT GCG	AGA TAT	ACC
Leu	Gin Trp	Ser	Ser	Leu Lys Ala Ser	Asp	Thr Ala	Met	Tyr	Tyr Cys Ala	Arg Tyr	Thr
					90						100
	CDR3				330
AAC	TGG GAT	GCT	TTT	GAT ATC TGG GGC	CAA	GGG ACA	ATG	GTC	ACC GTC TCT	TCA
Asn	Trp Asp	Ala	Phe	Asp xle Trp Gly	Gin	Gly Thr	Met	Val	Thr Val Ser	Ser
SEKVENCE ID. Č.	2
					30					60
GAA ATT GTG	TTG	ACA	CAG TCT CCA GCC	ACC	CTG TCT	TTG	TCT	CCA GGG GAA	AGA GCC	ACC
Glu	Ile Val	Leu	Thr	Gin Ser Pro Ala	Thr	Leu Ser	Leu	Ser .Pro Gly Glu	Arg Ala	Thr
					10						20
				CDRl	90						120
CTC	TCC TGC	AGG	GCC	AGT CAG AGT GTT	AGC	AGC TAC	TTA	GCC	TGG TAC CAA	CAG AAA	CCT
Leu	Ser Cys	Arg	Ala	Ser Gin Ser Val	Ser	Ser Tyr	Leu	Ala	Trp Tyr Gin	Gin Lys	Pro
					30						40
					150	CER3					180
GGC	CAG GCT	CCC	AGG	CTC CTC ATC TAT	GAT	GCA TCC	AAC	AGG	GCC ACT GGC	ATC CCA	GCC

- 13 CZ 302738 B6

Gly

Gin

Ala

pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Aep

Ala

Ser A»a

Arg Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

50

60

210

240

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACT CTC

ACC

ATC

AGC

AGC

CTT

GAG

CCT

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

70

80

270

CDR3

300

GAA

GAT

TTT

GCA

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAO

CGT

AGC AAC

TGG

ATG

TTC

CCT

TTT

GGC

CAG

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ola Ola

Arg

Ser Aaa

Trp

Met

Phe

Pro

Phe

Gly

Gin

90

100

GGG	ACC	AAG	CTG	GAG	ATC	AAA
Gly	Thr	Lys	Leu	Glu	Ile	Lya

DNA sekvence kódující variabilní domény těžkého a lehkého řetězce a odpovídající am i noky se5 línové sekvence AAL160 jsou také uvedeny v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID.Č. 1 až SEKVENCE ID.Č. 4.

Konstrukce expresních vektorů pro těžký a lehký řetězec ío Klonované sekvence kódující V_L a V_lt byly amplifi kovány pomocí PCR a vloženy prostřednictvím vhodného restrikční místa na kazety vektorů obsahujících imunoglobulinový promotor, vedoucí sekvenci z RET2 protilátky (Heinrich et al. (1989) J. Immunol, 143, 3589 až 97), část Jsegmentů a sestřihové donorové místo. Kazety lehkého řetězce obsahující celý V_L úsek, promotor a vedoucí sekvenci pro sekreci byla přenesena do expresního vektoru obsahujícího humánní gen i? Ck, enhancer těžkého řetězce imunoglobulinu a modifikovanou myší dhfr cDNA pro selekci pomocí metotrexatu (MTX).

Kazeta těžkého řetězce byl přenesena do expresního vektoru kódujícího humánní gen IgGl, enhancer těžkého řetězce imunoglobulinu a gen rezistence k neomycinu pro selekci.

Jak těžký, tak i lehký řetězec jsou v expresních vektorech v konfiguraci, která připomíná genomovou konfiguraci přeskupených („rearranged“) imunoglobulinových genů, což je považováno za důležitý faktor pro vysoký stupeň exprese.

Pro produkci protilátky podle vynálezu byly výše popsané vektory kotransfekovány do vhodné hostitelské buněčné linie, např. buněčná linie SP2/0, buňky obsahující vektorové sekvence byly selektovány pomocí metotrexatové selekce a vyselektované buněčné linie byly kultivovány, aby exprimovaly protilátku AAL 160. Alternativně muže být použit amplifikační/selekční systém založený na GS, jaký byl například popsán v EP 0 256 055 B, EP 0 323 997 B nebo evropské so patentové přihlášce 89303964.4, kdy je selekční markér dhfr nahrazen GS kódující sekvencí.

Příklad 2

Biochemická a biologická data

Bylo zjištěno, že monoklonální protilátka AAL160 neutralizuje in vitro aktivitu ínterleukinu-1 β.

Monoklonální protilátka byla dále charakterizována její vazbou k rekombinantnímu humánnímu

- 14CZ 302738 B6

ILl-β analýzou Biacore. Způsob neutralizace byl hodnocen kompetitivní vazebnou studií s rozpustnými IL—1 receptory. Biologická aktivita protilátky AAL160 vůči rekombinantně připravenému a přirozeně tvořenému IL—1 β byla stanovena na primárních humánních buňkách (viz příklad 3), responzivních ke stimulaci pomocí IL—1 β.

2.1 Stanovení disociační rovnovážné konstanty

Konstanty rychlosti asociace a disociace vazby rekombinantního humánního IL—1 β a AAL 160 byly stanoveny analýzou BIAcore. AAL160 byla imobilizována a vazba rekombinantního IL—1 β io v rozmezí koncentrací 0,5 až 12 nM byla měřena pomocí povrchově plazmonové rezonance.

Vybraný formát analýzy umožnil zacházet svazebnou událostí IL-Ιβ kAAL160 podle 1:1 stech iometrie. Analýza dat byla provedena pomocí softwaru „BIAevaluation“.

Asociační rychl. konstanta (M'1 s’1)	(n=15)	(3/91 ± 0,14)x 105	Průměr ± stř. chyba průměru
DosociaČní rychl. konstanta (M'1 s1)	(n=15)	(1,53 + 0,Q5)xl0~4	Průměr ± stř. chyba průměru
Disociační rovnovážná konstanta KD (M)	(n=15)	(396,6 ± 19,5) x 10'l2	Průměr ± stř. chyba průměru

AAL 160 se váže k rekombinantnímu humánnímu IL— 1 β s vysokou afinitou.

2.2. Kompetitivní inhibice vazby k rozpustným IL—1 receptorům

2» Studium kompetice vazby pomocí rozpustných receptor IL—I typu I a II

Kompetice mezi AAL 160 a rozpustným humánním receptorem ÍL—1 typu I a typu II byla měřena opět pomocí zařízení Biacore, AAL160 byla imobilizována na povrchu Čipu a rekombinantní humánní IL-Ιβ (8nM) byl injikován, aby se vázal na AAL 160 za absence nebo přítomnosti zvy25 sující se koncentrace rekombinantního humánního rozpustného receptoru I (0 až 10 nM) nebo receptoru II (0 až 80 nM), Získané výsledky jsou ukázány na obrázku I. Vazba NVP AAL 160 NX-1 k IL-Ιβ je kompetitivní jak s receptorem IL-I typ I, tak i s receptorem typu II

2.3. Profil reaktivity s humánním IL-Ία, humánním IL-1RA a IL-Ιβ z některých druhů hlodav30 ců a primátů

Profily reaktivity AAL160 s humánním IL-Ία, 1L-IRA a IL-Ιβ z myši, laboratorního potkana, králíka a makaka „cynomolgus“ byly analyzovány opět pomocí zařízení Biacore. AAL 160 byla imobilizována a zkoumané cytokiny byly užity v koncentraci 8 nM (nebo 20 nM v případ IL—1 β).

- 15CZ 302738 B6

	Procento celkově navázaného 1 str. chyba prumeru
Humánní IL-Ιβ	100
Humánní IL-la	0,7 ± 0,7 (n=3)
Humánní IL-lRa	1,2 ± 1,2 (n-3)
Myší IL-ϊβ	2,8 ± 1,5 (n=3)
IL-Ιβ lab. potkana	3,0 ± 2,5 (n=3)
IL-Ιβ makaka „cynomolgus	96,4 ± 6,8 (n=3)
Králičí IL-Ιβ	12,1 ± 2,3 (n=4)

AALI60 zkřížené významně nereaguje s humánním IL—1(3, humánním IL-IRa, nebo IL-Ιβ z myši, laboratorního potkana nebo králíka. Reaktivita vůči IL-Ιβ z makaka „eynomolgus“ je v podstatě shodná s humánním cytokinem.

Příklad 3

Neutralizace na IL-Ιβ závislé produkce PGE₂ a interleukin-6 v primárních humánních fibroblastech

Produkce PGE₂ a IL-6 v primárních humánních dermálních fibroblastech je závislá na IL-Ιβ. Samotný TNF-α nemůže účinně indukovat zánětové mediátory, ale působí synergicky s IL-1. Primární dermální fibroblasty se užívají jako náhradní model pro IL-1 indukovanou buněčnou aktivaci.

Primární humánní fibroblasty se stimulují rekombinantním IL-Ιβ nebo kondicionovaným médiem získaným z LPS-stimulovaných humánních PBMC v přítomnosti různých koncentrací protilátky podle vynálezu nebo IL-1RA v rozsahu 6 až 18000 pM, Chimérická anti-CD25 protilátka Simulecf (basiliximab) se užívá jako kontrola se shodným isotypem. Supernatant se odebírá po 16 hodinách stimulace a testuje se na přítomnost IL-6 testem ELISA nebo na přítomnost PGE? testem RIA.

	AAL160 ICS0 ± stř. chyba (n > 3)	IL-1 Ra IC50 ± stř. chyba (n > 3)
Sekrece IL-6 rekombinantní	0,34 i 0,037 nM	nestanoveno
Sekrece IL-6 Koná. médium	0,6 ± 0,09 nM	0,03 ± 0,001 nM
Produkce PGE2 Kond. médium	0,79 ± 0,17 nM	nestanoveno

- 16Výsledky ukázaly, že AALI60 účinně blokuje produkci IL-6 a PGE₂ v primárních humánních dermálních fibroblastech s hodnotou IC^ podobnou pro rekombinantní a přírodní IL-Ιβ.

Příklad 4

Účinnost a trvání působení AAL160 in vivo

Účinnost in vivo účinnost anti-huIL-Ιβ protilátky AAL160 byla testována na modelu laboratorního potkana, kde byla horečka indukována pomocí i.v. injekce hu-ΙΕΙβ (100 ng/potkan). Protilátka vedla k inhibicí horečky způsobem závislým na dávce při dávkách v rozmezí 1,3 a 10 pg/kg i.v. (n-6 potkanů) - viz také obrázek 2. CHI 621 (Simulect®, basiliximab) byla použita jako kontrolní protilátka.

Trvání účinku

Trvání účinku AAL-160 bylo zkoumáno na laboratorních potkanech, u kterých byla (L—1 β indukována horečka, následujícím způsobem: protilátka byla i nj i kována i.v. buďto 24 hodin, nebo 30 minut (standardní protokol) před indukcí horečky pomocí i.v. injekce humánního IL—Ιβ a tělesná teplota byla měřena později za 2 a 4 hodiny. V obou časech byla pozorována přibližně stejná inhibice horečky (viz obrázek 3). Jak se dalo očekávat, kontrolní protilátka CHI 621 (SimulectA basiliximab) byla neúčinná v obou časových bodech. Toto zjištění ukazuje na to, že humánní protilátka AAL160 je přítomná v potkanovi v aktivní formě alespoň po 24 hodin a v průběhu této doby není metabolizována, vylučována ani vázána na tkáně.

Příklad 5

Rentgenografické studie AAL160 Fab a jeho komplexu s IL-I β

Stanovení struktury AAL160 Fab s rozlišením 2,0 A

Soubor dat s rozlišením 2,0 A (2,0 x 10“^lom) velmi dobré kvality (Rsym = 0,051, úplnost = 99,9%, redundance - 8,2) byl získán na krystalech Fab pěstovaných pomocí difúze páry v metodě visící kapky, při pH 9,5 v 50% PEG 200 a 0,1 M CHES. Krystal byl v prostorové skupině P2i2|2, s rozměry jednotkové buňky a = 62,17 A, b - 89,83 A a c = 123,73 A a jednou Fab molekulou na jednu symetrickou jednotku (Matthewsův koeficient: 3,6 A³/Da, stanovený obsah rozpouštědla: 66 %). Struktura byla určena pomocí molekulárním nahrazením a byla zjemněna na konečný krystalografický R-faktor 0,209 (volný R-faktor = 0,261). Výsledný model zahrnuje aminokyselinové zbytky 1 až 213 lehkého řetězce, 1 až 131 a 138 až 218 těžkého řetězce, 387 molekul vody a 1 molekulu PEG. Výsledná elektronová denzita je dobře definována pro všechny zbytky CDR s výjimkou Trp94 (CDR3) lehkého řetězce. Poloha postranního řetězce tohoto zbytku je chybně definována ve dvou krystalových formách, které byly dosud prozkoumány, takže je možné předpokládat, zeje v nepřítomnosti vázaného antigenu vysoce mobilní. Krystalizace Fab komplexu s IL— 1 β a předběžný experimentální model komplexu:

Několik krystalů AAL160 Fab v komplex s antigenem IL—1 β bylo získáno ze zásobního roztoku 1:1 komplexu o koncentraci 76 mg/ml v 2,0M síranu amonném, 0,lM Tris, pH 8,5. Krystaly rostly velmi pomalu po dobu několika týdnů. Vykazovaly slabou difrakci přibližně do 3,2 A na domácím zdroji. Soubor předběžných dat byl zjištěn pomocí molekulárního nahrazování s využitím struktury volného Fab a humánního IL-1 β s vysokým rozlišením (J. P. Priestle et aí, EMBO J. 7, 339 (1988)) jakožto výchozích modelů. Výpočty poskytly velmi jasný a nepochybný výsledek, když byly části Fv a Fc z Fab použity jako oddělené moduly (korelace 67,1 %, R-faktor 0,354 po dalším aproximačním kroku AMOREFITTING s použitím dat mezi 8,0 A a 3,5 A). Následné srovnání volné a vázané formy Fab ukázalo, že úhel ohybu je pro tyto dvě struktury

- 17CZ 302738 B6 velmi odlišný. Výsledky výpočtů molekulárního nahrazování poskytly první molekulární model interakce mezi antigenem IL-Ιβ a monoklonální protilátkou AALI60. Předběžná analýza této interakce ukázala, že I) IL-Ιβ vstupuje do těsné interakce se všemi třemi CDR těžkého řetězce a sCDR3 lehkého řetězec. Naproti tomu, CDR1 a CDR2 lehkého řetězce se účastní jen několika málo interakcí, pokud vůbec, a 2) klička obsahující zbytky Gly22, Pro23, Tyr24 a Glu25 zralého IL-Ιβ se váže ve středu antigen-kombinuj ícího místa zdá se tedy být klíčovou složkou epitopů. Je proto značně zajímavé, že tato klička není lokalizována v úseku molekuly, která se nejvíce odlišuje od myšího IL-Ιβ. Pro23, Tyr24 a Glu25 jsou zachovány, ale zbytek v poloze 22 je Gly v humánním IL-Ιβ, zatímco v myším IL-Ιβ je to Asp. Srovnání krystalové struktury humánního iu (PDB č. 2ilb) a myšího IL-Ιβ (PDB č. 8ilb) ukazuje, že tato bodová mutace má za následek velmi odlišnou konformaci hlavního řetězce v okolí Pro23. Tato lokální strukturní diference je ve shodě souhlasný s pozorovaným nedostatkem zkřížené reaktivity AAL160 s příslušným myším cytokinem.

SEZNAM SEKVENCÍ <160> 4 <170> Patentln version 3.0 <2IO> 1 <21 l> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(354) <400> 1

gag gtg

cag ctg gtg

cag tet gga gca gag gtg

aaa aag ccc ggg gag

48

Glu 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser Gly

Ala

Glu Val 10

Lys Lys

Pro Gly Glu 15

tet

ctg

aag

atc

tcc

tgt

aag

ggt

tet

gga

tac

agc

ttt

acc

agc

tac

96

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

tgg

atc

ggc

tgg

gtg

cgc

cag

atg

ccc

ggg

aaa

ggc

ctg

gag

tgg

atg

144

Trp

Ile

Gly

Trp

val

Arg

Gin

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

ggg

atc

atc

tat

cct

agt

gac

tet

gat

acc

aga

tac

agc

ccg

tcc

ttc

192

Gly

Ile

Ile

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ser

Asp

Thr

Arg

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

caa

ggc

cag

gtc

acc

atc

tca

gcc

gac

aag

tcc

atc

agc

acc

gcc

tac

240

Gin

Gly

Gin

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

ctg

cag

tgg

agc

agc

ctg

aag

gcc

tcg

gac

acc

gcc

atg

tat

tac

tgt

288

Leu

Gin

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

gcg

aga

tat

acc

aac

tgg

gat

get

ttt

gat

atc

tgg

ggc

caa

ggg

aca

336

Ala

Arg

Tyr

Thr

Asn

Trp

Asp

Ala

Phe

Asp

Ile

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

atg

gtc

acc

gtc

tet

tca

354

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

- 18 115 <210 2 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400 2

Glu 1

Val

Gin Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu val Lys 10

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys Xle 20

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser 25

Gly Tyr Ser

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Xle

Gly Trp

Val

Arg

Gin

Met

Pro

Gly Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Met

25

40

45

Gly

Ile 50

Ile

Tyr

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Asp

Thr

Arg

Tyr 60

Ser

Pro

Ser

Phe

Gin 65

Gly

Gin

Val

Thr

Ile 70

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser 75

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Leu

Gin

Trp

Ser

Ser 85

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Tyr

Thr 100

Asn

Trp

Asp

Ala

Phe 105

ASp

Ile

Trp

Gly

Gin 110

Gly

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

ío <210	3
<211>	321
<212>	DNA
<213>	Mus musculus
15 <220
<221>	CDS
<222>	(1)..(321)

. 19 .

CZ 302738 R6

400> 3

gaa GlU 1

att Ile

gtg Val

ttg Leu

aca Thr 5

cag Gin

tet Ser

cca Pro

gcc Ala

acc Thr 10

ctg Leu

tet Ser

ttg Leu

tet Ser

cca Pro 15

ggg Gly

gaa

aga

gcc

acc

ctc

tcc

tgc

agg

gcc

agt

cag

agt

gtt

agc

agc

tac

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

tta

gcc

tgg

tac

caa

cag

aaa

cct

ggc

cag

gct

ccc

agg

ctc

ctc

atc

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

35

40

45

tat

gat

gca

tcc

aac

agg

gcc

act

ggc

atc

cca

gcc

agg

ttc

agt

ggc

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

agt

ggg

tet

ggg

aca

gac

ttc

act

ctc

acc

atc

agc

agc

ctt

gag

cct

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

gaa

gat

ttt

gca

gtt

tat

tac

tgt

cag

cag

cgt

agc

aac

tgg

atg

ttc

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Arg

Ser

Asn

Trp

Met

Phe

85

90

95

cct

ttt

ggc

cag

ggg

acc

aag

ctg

gag

atc

aaa

Pro

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100 105

144

192

240

288

321 <210>

<21 1> <212> -213^

107

PRT

Mus musculus o <400> 4

Glu 1 Glu

Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

Arg Ala

Thr 20

5

10

IS Ser

Tyr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Ser 30

Leu

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg 45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Asp 50

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala 55

Thr

Gly

Xle

Pro

Ala 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro 80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val 85

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 90

Arg

Ser

Asn

Trp

Met 95

Phe

Pro

Phe

Gly

Gin 100

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu 105

Ile

Lys

-20CZ 302738 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (8)

1. 5 1, Molekula protilátky vázající IL-Ιβ, která má antigenní vazebnou specifitu pro antigenní epitop zralého humánního IL—l β, který zahrnuje kličku obsahující zbytky Gly 22, Pro 23, Tyr 24 a Glu 25, a která je schopna inhibice vazby IL—I β kjeho receptoru, přičemž molekula vázající IL-Ιβ obsahuje vazebné místo pro antigen obsahující alespoň jednu variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (V_H), která obsahuje v sekvenci hypervariabilní úseky CDRI, CDR2 a io CDR3, uvedené v SEKVENCI ID. Č. I, kde uvedený úsek CDRI má aminokyselinovou sekvenci Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly, uvedený úsek CDR2 má aminokyselinovou sekvenci Ile-Ile-Tyr-ProSer-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-<jln-Gly a uvedený úsek CDR3 má aminokyselinovou sekvenci Tvr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile, přičemž molekula vázající ILΙβ obsahuje vazebné místo pro antigen obsahující alespoň jednu variabilní doménu lehkého is řetězce imunoglobulinu (V_L), která v sekvenci obsahuje hypervariabilní úseky CDRICDR2' a CDR3', uvedené v SEKVENCI ID. Č. 2, kde uvedený úsek CDRI' má aminokyselinovou sekvenci Arg-Ala-Ser-GIn-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala, uvedený úsek CDR2' má aminokyselinovou sekvenci Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr a uvedený úsek CDR3' má aminokyselinovou sekvenci Gln-Gln -Arg-Ser-Asn-ITp-Met-Phe-Pro.
2. 2. Molekula vázající IL-1 β podle nároku 1, která je humánní protilátkou.
3. 3. Molekula vázající IL-1 β podle některého z nároků 1 a 2 pro použití jako léčivo.

   25
4. 4. Použití molekuly vázající IL-Ιβ podle některého z nároků 1 a 2 pro výrobu léčiva určeného pro prevenci nebo léčení nemoci nebo poruch zprostředkovaných IL-1, akutních a hyperakutních zánětových reakcí, akutních infekcí, septického šoku, endotoxického šoku, respiračního tísňového syndromu dospělých, meningitidy, pneumonie; a vážných popálenin; kachexie nebo úbyťového syndromu, rakoviny, orgánové dysfunkce, kachexie související sAIDS; nebo pro léčení

   30 zánětových stavů, alergií a alergických stavů, hypersenzitivních reakcí, autoimunitních chorob, vážných infekcí, odmítnutí orgánového nebo tkáňového transplantátu; autoimunitní nemoci, artritidy, revmatoidní artritidy, artritidy chronica progrediente, artritidy deformans, revmatických chorob, zánětové bolesti, hypersenzitivity, hypersenzitivity dýchacích cest, kožní hypersenzitivity, alergií, autoimunitních hematologických poruch, hemolytické anemie, aplastické anemie,

   35 anemie pouze červených krvinek a isiopatické trombocytopenie, systémového lupus erythematosus, polychondritidy, sklerodermatu, Wegenerovy granulomatózy, dermatomyositidy, chronické aktivní hepatitidy, myastenie gravis, psoriázy, Steven-Johnsonova syndromu, idiopatické poruchy vstřebávání v tenkém střevě, auto imunitní ho zánětového onemocnění střev, ulcerativní kolitidy, C roh novy nemoci, syndromu dráždivého tračníku, endokrinní oftalmopatte, Gravesovy

   40 nemoci, sarkoidózy, roztroušené sklerózy, primární biliámí cirhózy, juvenilního diabetů, diabetů mellitus typu I, uveitídy (anteriomí a posteriomí), keratokonjuktivitídy sicca, vernální keratokonjuktivitídy, fíbrózy plicního intersticia, intersticíální plicní fibrózy, psoriatické artritidy a glomerulonefritidy, idiopatického nefrotíckého syndromu, nefropatie s minimálními změnami, astmatu, bronchitídy, pneumokoniózy, emfyzému plic a dalších obstruktivních nebo zánětových

   45 chorob dýchacích cest, nemocí kostního metabolizmu, osteoartritídy, osteoporózy, dalších zánětových artritid, obecného úbytku kostní hmoty, úbytku kostní hmoty souvisejícího se stářím, periodontální choroby, rakovin a nádorů dependentních na IL-1.
5. 5. První DNA konstrukt kódující těžký řetězec nebo jeho fragment, který obsahuje

   50 (i) první část, která kóduje variabilní doménu obsahující střídavě úseky rámce a hypervariabilní úseky, přičemž uvedenými hypervarlabilními úseky jsou v sekvenci CDRI, CDR2 a CDR3, jejichž aminokyselinové sekvence jsou uvedeny v SEKVENCI ID. C. 1, přičemž tato první Část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a

   -21 CZ 302738 B6 (ii) druhou část kódující konstantní úsek těžkého řetězce, který začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části těžkého řetězce a konci kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části, po kterém následuje stop kodon; a druhý DNA konstrukt kódující lehký řetězec, který obsahuje

   5 (i) první část, která kóduje variabilní doménu obsahující střídavě úseky rámce a hypervariabilní úseky, přičemž hypervariabilními úseky jsou CDR3' a případně CDRI' a CDR2 , jejichž aminokyselinové sekvence jsou uvedeny v SEKVENCI ID. Č. 2, přičemž tato první část začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu variabilní domény a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu variabilní domény, a ío (ii) druhou část kódující konstantní úsek lehkého řetězce, který začíná kodonem kódujícím první aminokyselinu konstantní části lehkého řetězce a končí kodonem kódujícím poslední aminokyselinu konstantní části, po kterém následuje stop kodon.
6. 6. Expresní vektor schopný replikace v prokaryotieké nebo eukaryotické buněčné Unií, který

   15 obsahuje alespoň jeden z DNA konstruktu podle nároku 5.
7. 7. Způsob přípravy molekuly vázající IL-1 β, vyznačený tím, že zahrnuje (i) kultivaci organizmu, kterýje transformován expresním vektorem podle nároku 6 a (ii) izolaci molekuly vázající IL-1 β z kultury.
8. 8. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje protilátku proti IL-Ιβ podle nároku 1 společně s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem.