JPH05504058A - 敗血症性ショック治療用医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 敗血症性ショックの治療方法 発明の分野 本発明は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）に対するアンタゴニストを投与す ることによる敗血症性ショックの治療方法に関する。

背景 重い感染、特にグラム陰性細菌による感染は、発熱、低血圧症、代謝的アシド− シス、広範囲な器官機能不全、そして最後には死を含む、重大な生理的かつ代謝 的変調に至り得る。かかる変調は、しばしば敗血症性ショックと呼ばれる。最近 、宿主由来の蛋白質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）がグラム陰性の敗血症の多く の有害な影響を誘発すること、および、抗血清を用いたＴＮＦへの受動免疫がグ ラム陰性の菌血症または内奏血症の致死的な影響を防ぐことができるというこび トレイン−ら（Ｔｒａｃｙ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｎａｔｕｒｅ、３３Ｑ巻、６６２ ページ（１９８７）。髄膜炎菌性髄膜炎、マラリアおよびリーシュマニア症を含 むいくつかの感染性疾患においてＴＮＦの高血清レベルが観察され、ＴＮＦの高 循環レベルを有する患者では高死亡率を伴った器官機能不全が増えたことが観察 された：例えば、ワッゲら（Ｗａｇｇｅ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｌａｎｃｅｔ、３５ ５ページ（１９８７）：ギラーデンら（Ｇｉｒａｒｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）。

８７巻、１３９ペー７（１９８９）。

ＴＮＦを動物または人間の被検者に投与後２−６時間たつとＩＬ−６の血清レベ ルが検出可能になるということが報告されている。マンキントンユら（ＭｃＩｕ ｎｏｌ、、１４２巻、１５４２ページ（１９８９）；およびプロッカートら２２ ５７ページ（１９８９）。ＩＬ−６は、Ｂ細胞刺激因子−２、インターフェロン −β２、および肝実質細胞（ヘバトサイト）刺激因子としても知られており、Ｂ 細胞成熟を引き起こすＴ細胞−由来糖蛋白質として同定された１例えば、キシモ ト（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ）、Ｂｌｏｏｄ、７４巻、１ページ（１９８９）。より 最近では、ＩＬ−６が、肝実質細胞における急性期蛋白質を誘発、また造血原細 胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）やＴ細胞 への働きを含む多面発現的生物活性をもつということが示された　例えば、ガイ ガーら（Ｇｅｉｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１８ 巻、７１７ページ（１９８８）；マリンジョビックら（Ｍａｒｉｎｊｏｖｉｃ２ ６３巻、１２５５４ページ（１９８８）；およびパールムラターら（Ｐｅｒｌｍ ｕｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、８４巻、１３８ ベーノ（１９８９）。

現在、たとえば菌血症などの敗血症性状態は、抗菌性化合物を用いて治療されて いる。しかしながら、かかる状態がショックと関連する場合、そのショック症候 群を改善するための治療法における有効な付加的処置はない：例えば、ヤング（ Ｙｏｕｎｇ）、４６８−４７０ページ、マンデルら（Ｍａｎｄｅｌｌ　ｅｔａｌ 、）編集、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｎｆｅ ｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第２版（ジョン・ウィリー・アンド・ヤング 、ニューヨーク、１９８５）。この観点から、敗血症に関連するショックを治療 する技術の利用可能性は、臨床的にも重要な効用をもち得るであろう。

発明の要約 本発明は、ヒトＩＬ−６に対するアンタゴニストを有効量疫与することによる敗 血症性ショックの治療方法を提供するものである。ＩＬ−６に対するアンタゴニ ストは、好適には、モノクローナル抗体もしくは標準的な手法によってそこから 誘導される結合組成物である。

図面の簡単な説明 図１は、生大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）を腹腔的注射し、種々のモノクローナル抗体 で治療したオスＢＡＬＢ／ｃマウスの生存データを示す。

発明の詳細な説明 本発明は、ＩＬ−６の増大生産は、敗血症のような大きな菌感染におけるショッ クに先立つ生理学上の変調の偶発的連鎖をつなぐリンク（環）である、という発 見に基づく。本発明の方法は、ヒ１−ＩＬ−６に対するアンタゴニストを患者に 有効量あるいは疾病改善量投与することを含む。

本発明のアンタゴニストは、好適にはヒトＩＬ−６に特異的な抗体から誘導され る。より好適には、本発明のアンタゴニストはＩＬ−６に特異的なフラグメント または結合組成物を含む。抗体は、ジスルフィド橋によって一緒に結合されるポ リペプチド鎖のアセンブリを含む。Ｌ鎖、Ｈ鎖と呼ばれる二つの主要なポリペプ チド鎖は、抗体の全ての主要な構造クラス（イソタイプ）を形づ（る。Ｈ鎖、Ｌ 鎖ともさらに、可変領域、定常領域（不変領域）といわれるサブ領域に分けられ る。Ｈ鎖は一つの可変領域と三つの異なる定常領域を含み、そしてＬ鎖は一つの 可変領域（Ｈ鎖のものとは別の）と一つの定常領域（Ｈ鎖のものとは別の）を含 む。Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域が抗体の結合特異性に関わっている。

本明細書中で用いられるように、用語“Ｈ鎖可変領域“は、（１）１１０から１ ２５アミノ酸の長さであり、（２）そのアミノ酸配列が、Ｈ鎖のＮ−末端アミノ 酸からスタートして本発明のモノクローナル抗体のＨ鎖のそれに対応する、ポリ ペプチドを意味する。同様に、用語“Ｌ鎖可変領域”は、（１）９５から１１５ アミノ酸の長さであり、（２）そのアミノ酸配列が、Ｌ鎖のＮ−末端アミノ酸か らスタートして本発明のモノクローナル抗体のし鎖のそれに対応する、ポリペプ チドを意味する。

本明細書中で用いられるように、用語“モノクローナル抗体”は、ヒトＩＬ−６ に特異的に結合することができる免疫グロブリンの均質集団を意味する。

本明細書中で用いられるように、″結合組成物”は、（１）作用的に結合する場 合、ヒトＩＬ−６に高い結合親和力をもつコンホーメーンヨンを惣定させ、（２ ）ヒトｒＬ−６に特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマに由来 する、二つのポリペプチド鎖を含む組成物を意味する。用語“作用的に結合して ”とは、種々の手段によって、例えばＦａｂやＦｖなどの天然の抗体フラグメン トにおける結合によって、あるいはカルボキシル末端における遺伝子工学的手法 によるシステイン含有ペプチドリンカ−によって、二つのポリペプチド鎖が結合 のために互いに位置することができることを示す。通常、二つのポリペプチド鎖 は、ヒトＩＬ−６に特異的なモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変 領域に対応する。好適には、本発明のアンタゴニストはヒトＩＬ−６に特異的な モノクローナル抗体に由来する。遮断または中和することができるモノクローナ ル抗体、ＩＬ−６は、標準的なＩＬ−６パイオアツセイにおいて、それらのＩＬ −６−由来の効力を阻害する能力によって選択される１例えば、セーガルらヱ、 ８巻、８４−８７ページ（１９８７）：およびウォンら（Ｗｏｎｇ　ｅｔａｌ、 ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ、９巻、１３７−１３９ページ（１９８８）等 に記載されているように。好適には、以下の生物学的活性の阻害が、ＩＬ−６を 中和することができるモノクローナル抗体のスクリーンに使用される：（ｉ）抗 ウィルス活性、（ｆｉ）免疫グロブリン分泌の亢進、および（ｆｆｉ）あるＥＢ Ｖ−形質転換細胞株の成長刺激。抗ウィルス活性の阻害は、例えばアームストロ ング（Ａｒｍｓ　ｔ　ｒｏｎｇ）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、７８巻、３８ １−３８７ページ（１９８１）、およびファミレッティら（Ｆａｍｉｌｌｅｔｔ ｉｅｔ　ａｌ、）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、７８巻、３８７−３９９ペー ジ（１９８１）（両者とも参考文献として組み込まれている）によって記載され ているような、標準的な細胞変性効果阻害アッセイによって測ることができる。

中和抗体は、ＩＬ−６の標準的濃度の細胞変性効果の阻害を妨害あるいは無効に する能力に基づいて選択される。中和抗体はまた、ＭＯＰＣ−３１５のようなあ る形質細胞腫（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ）細胞株のＩＬ−６刺激成長を妨げる 能力によっても選択することができる、例えば、チューら（Ｃｈｉｕ　ｅｔ　ａ ｌ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５巻、７０９９ −７１０３ページ（１９８８）。ＭＯＰＣ−３１５はアメリカン・タイプ・カル チャ−・コレクンコンから受託番号ＴｌＢ２３として入手できる。中和抗体を選 択する他の手段は、ＣＥＳＳおよび５ＫＷ６．４　（それぞれ、ＡＴＣＣ受託番 号ＴｌＢ１９０およびＴｒＢ２１５として入手できる）などのＥＢＶ−形質転換 細胞株のＩＬ−６刺激免疫グロブリン分泌の阻害である、例えばヒラメら（Ｈｉ ｒａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２巻、５ ４９０−５４９４ページ（１９８５）。抗体分泌は、商業的に入手可能なイソタ イブー特異的モノクローナル抗体を用いて、イソタイプ−特異的ＥＬＩＳＡによ って便利に測られる。例えば、（４−６）Ｘ１０３ＣＥＳＳまたは５ＫＷ６．４ 細胞を培養培地（例えばＲＰＭＩ　１６４０）２００μｌ中に約３３−３０ｐの Ｉ　Ｌ−６と一緒に培養する。およそ３日後に、ＩｇＧ１１度（ＣＥ　Ｓ　Ｓ） またはＩｇＭ濃度（ＳＫＷ６．４）を調べるために上清をアッセイする。

本発明のハイブリドーマはよく知られた公知技術によってつくられる。通常その 方法は、不死細胞株を所望の抗体を産生ずるＢ−リンパ球と融合させることを含 む。あるいは、不死抗体−産生細胞株を生成させる非−融合手法を用いることも でき、それは本発明の範囲内である、例えばウィルスによって誘発される形質転 換°カサリら（Ｃａｓａｌｉ　ｅｔ　ａｌ、）、“Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏ ｎａｌｓ　ｆｒｏｍ　Ａｎｔｉｇｅｎ−３ｐｅｃｉｆｉｃ　５ｅｌｅｃｔｉ。

ｎ　ｏｆ　Ｂ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ。

ｎ　ｂｙ　ＥＢＶ”、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４巻、４７６−４７９ページ（１９ ８６）。不死細胞株は通常、哺乳類の細胞、特に薩歯類、クンおよびヒト起源の ミエローマ細胞が形質転換される。便利性および入手しやすさという点から、ラ ットまたはマウスのミエローマ細胞株が最もよく用いられる。標的抗原を注射し た哺乳類から適当なリンパ球を得る手法はよく知られている。一般に、もしヒト 起源の細胞を望むなら末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）が用いられ、非−ヒト哺乳 類起源のものを望むなら牌臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。宿主哺乳類 は精製された抗原を注射で反復投与され、そして、不死細胞株との融合のために それらが収穫される前に、所望の抗体−産生細胞が生成される。当業分野におい ては融合技術もまたよ（知られており、一般に、ポリエチレングリコールのよう な融合剤と一緒に細胞を混合することを含む。ハイブリドーマはＨＡＴ選択のよ うな標準的な手法によって選択される。これらのハイブリドーマのなかから、所 望の抗体を分泌するもの、即ちヒトＩＬ−６に特異的なものが、ウェスタン・プ ロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＬ−６中和可能性等の標準的なイムノア ッセイによって、それらの培養培地をアッセイして選択される。抗体は、標準的 な蛋白質精製技術、例えばティラセン（ＴｉｊＳｅｅｎ）、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　 ａｎｄＴｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（エルセ ピア、アムステルダム、１９８５）を用いて、培地から得られる。多くの参考文 献が、上記のすべての技術の応用の指針として利用できる：例えばコーラ−ら（ ＫｏｈＩｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　 （）−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８０） ；ティラセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　 ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｒｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（エルセピア、アムステルダム 、１９８５）：カンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔ ｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（エルセピア、アムステルダム、１９８４ ）：ハーレル（Ｈｕｒｒｅｌｌ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ 　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎｓ（ＣＲＣブレス、ポカ・レイトン、ＦＬ、１９８２）：等。ヒトＩＬ−６ に特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、その後、上述のＩ Ｌ−６を用いて第二のスクリーンにかけられ、ＩＬ−６の生物学的活性を遮断ま たは中和することができるものが選択される。

抗体のフラグメントの使用および生成もまた、よく知られている：例えばＦａｂ フラグメント：ティッセ：、ｚ（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（エルセピア、 アムステルダム、１９８５）’；およびＦｖフラグメント：ホフマンら（Ｈｏｃ ｈエーリッヒら（Ｅｈｒｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、）、米国特許第４．　４７０． 　９２５号。

本発明のハイブリドーマおよびモノクローナル抗体は、組み換えによってつくら れた成熟ヒトＩＬ−６のグリコジル化または非グリコノル化型のいずれかに対し て産生される。一般的に、ヒトＩＬ−６の非グリコノル化型のものは大腸菌（Ｅ 、ｃｏｌｉ）中に産生され、グリコジル化型のものは、例えばＣＶＩまたはＣＯ Ｓサル細胞、マウスＬ細胞等の補乳頚細胞宿主中に産生される。組み換えによっ てつくられる成熟ヒトＩＬ−６は、標準的なプロトコールを用いて、発現ベクタ ーを宿主細胞中に導入することによって生成される：例えば、マニアナイスら（ Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（：ｌ−ルド・スプリング・／蔦−バ ー・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８２）；オカヤマとバーブ（Ｏｋａｙａ ｍａａｎｄ　Ｂｅｒｇ）、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、２巻、１６１−１７ ０ページ（１９８２）、および３巻、２８０−２８９ページ（１９８３）：タケ ベら（Ｔａｋｅｂｅ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｍｏｌ、Ｃｅｌ　Ｉ、Ｂｉｏｌ、、８巻 、４６６−４７２ページ（１９８８）：米国特許第４．５９９．３０８号、米国 特許第４．６７５．２８５号；カウフマンら（Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、） 、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、２巻、１３０４−１３１９ページ（１９８２ ）：等。所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列が公知、もしくは入手され るなら、細菌または哺乳雇発現ベクターの構築は当業分野においてよ（知られて いる・例えば、デボア（ＤｅＢｏｅｒ）は米国特許第４，５５１．４３３号にお いて細菌発現ベクターで使用するプロモーターを開示している：ゴーデルら（Ｇ ｏｅｄｃｌｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）は米国特許第４．６０１．９８０号において、 またリッグス（Ｒｉｇｇｓ）は米国特許第４，４３１，７３９号において、大腸 菌発現系による哺乳類蛋白質の生産を開示している：そしてリッグス（Ｒｉｇｇ ｓ）（上のための合成遺伝子を構築する方法を開示している。従って、これらの 文献は参考文献として組み込まれる。成熟ヒトＩＬ−６のアミノ酸配列はヒラメ ら（Ｈｉｒａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻、７３−７６ペー ジ（１９８６）およびライルバースタインら（Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ　ｅｔ　 ａｌ、）。

ＥＭＢＯＪ、、５巻、２５２９−２５３７ページ（１９８６）によって開示され ている：ヒトＩＬ−６をコードする合成遺伝子はベックマン・インスツルメンツ （フラートン、ＣＡ）から商業的に入手できる：および精製されたヒトＩＬ−６ はゲンザイム・コーポレーション（ボストン、ＭＡ）から商業的に入手できる。

多（の細菌発現ベクターと宿主が商業的に、およびＡＴＣＣを通じて入手できる 。

本発明のハイブリドーマに特徴的な抗体および抗体フラグメントは、メツセンジ ャーＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの構築、および抗体分子のセグメント をコードするクローンの選択による組み換え手段によっても産生ずることかで１ １１ｙ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８１巻、３２７３−３２７７ページ（１９８４）：ボスら（Ｂｏｓｓ　ｅｔ　ａ ｌ、）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１２巻、３７９１− ３８０６ページ（１９８４）；アムスターら（Ａｍｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８巻、２０５５−２０６５ ページ（１９８０）；ムーアら（Ｍｏｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、）、米国特許第４， ６４２．３３４号；およびスケフラら（Ｓｋｅｒｒａ　ｅｔ　ａｌ、）、５ｃｉ ｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８−１０４１ページ（１９８８）、特に、かかる技 術は、一つの種の結合領域が、免疫原性を減じるために抗体の他の種の非−結合 領域に結合されている内的特異的な（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ）モノクロー ナル抗体を産生ずるのに用いることができる：例えばリューら（Ｌｉｕ　ｅｔ　 ａｌ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８４巻、３２３９−３ ４４３ページ（１９８７）。

本発明のアンタゴニストは医薬組成物として投与される。かかる組成物はそのよ うなアンタゴニスト、例えば本発明のモノクローナル抗体の少なくとも一つ、ま たはそれらのフラグメントを、医薬的担体中に治療量含む。医薬的担体は、本発 明の組成物を患者に送達（ｄｅｌｉｖｅｒ）するのに適した相溶性で非−毒性の あらゆる物質であることができる。殺菌水、アルコール、脂肪、ワックス、およ び不活性固体を担体に含むことができる。医薬的に許容されたアジュバント（バ ッファー剤、分散剤）もまた該医薬組成物に加えることができる。一般的にかか る薬剤の非経口投与に有用な組成物がよく知られている、例えばＲｅｍｉｎｇｔ ｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、１５版（マソク ・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ＰＡ、１９８０）。あるいは、本 発明の組成物を、移植または注射による薬物送達システムによって患者の体に導 入してもよい：例えばアークハートら（Ｕｒｑｕｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、）。

Ａｎｎ、Ｒｅｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、、２４巻、１９９−２ ３６ページ（１９８４）ニルイス（Ｌｅｗｉｓ）ｉｉ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　 Ｒｅ１ｅａｓｅ　ｏｆ　Ｐｅ５ｔｉｃｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ ｉｃａｌｓ（ブレナム・プレス、ニューヨーク、１９８１）；米国特許第３，７ ７３．９１９号：米国特許策３．２７０．９６０号；等。

抗体由来の本発明のアンタゴニストは、通常非経口的に、好ましくは静脈内に投 与される。そのような蛋白質またはペプチドアンタゴニストは免疫原性があるの で、例えばトマンら（Ｔｏｍａｓｉ　ｅｔ　ａｌ、）、米国特許第４，７３２． ８６３号に教示されているように、伝統的な■投与セット、あるいは舌下デポの いずれかによってゆっくりと投与されるのが好ましい。非経口的に投与される場 合、抗体またはフラグメントは、医薬的に許容できる非経口的ビヒクルと組合わ せて、単一投与量注射形態（例えば溶液、懸濁液またはエマルジョン）に調製さ れるだろう。そのようなビヒクルは本来的に非毒性で非冶療的である。そのよう なビヒクルの例は、通常の食塩水、リンゲル液、デキストロース液、およびハン グ液等である。固定オイルやオレイン酸エチル等の非水性ビヒクルもまた使用し てもよい。好適なビヒクルは５％デキストロース／食塩水である。ビヒクルは等 偏性や化学的安定性を高める物質のような添加剤（例えば緩衝剤や保存剤）を少 量含んでもよい。抗体は、実質的に凝集塊や池の蛋白質やエンドトキシン等を含 まない純粋な形で、約５から３０ｍｇ／ｍｌ、好適には１０から２０ｍｇ／ｍｌ の濃度で調製されるのが好ましい。好ましくは、エンドトキシンのレベルは２． ５ＥＵ／ｍ１未満テアル。

アンタゴニストのための投与計画の選択は、アンタゴニストの血清ターンオーバ ー率、敗血症に関連したｒＬ−６の血清レベル、アンタゴニストの免疫原性、標 的ＩＬ−６の利用しやすさく例えば、もし非−血清ＩＬ−６が遮断された場合） 、アンタゴニストへのＩＬ−６の親和力に比べての、レセプターへのＩＬ−６親 和力等、い（つかの要素に依存する。投与計画は、副次的影響の許容し得るレベ ルに合わせて、患者へ送達されるアンタゴニスト量を最大にするようにするのが 好ましい。従って、送達されるアンタゴニスト量は、特定のアンタゴニストおよ び治療される状態の重篤さに一部依存する。適当な投与量を選択するにあたって の指針が抗体の治療的使用についての文献にみられる：例えばバラ／Ｘら（Ｂａ ｃｈ　ｅｔ　ａｌ、）、第２２章、フｚｏ−ネら（Ｆｅｒｒｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ 、）編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ（ノゲス・パブリケーションズ、パーク・リッジ、ＮＪ、１９８５）；および う・ソセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、３０３−３５７ページ、およびスミスら（Ｓｍ ｉｔｈｅｔ　ａｌ、）、３６５−３８９ページ、ハバーら（Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　 ａｌ。

）編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ　（レイブン・プレス、ニューヨーク、１９７７）。アンタゴニ ストがモノクローナル抗体またはそれらのＦａｂ−サイズのフラグメント（結合 組成物を含む）を含むときはいつでも、投与量は１日あたり約１−２０ｍｇ／ｋ ｇの範囲内であるのが好ましい。より好ましくは、投与量は１日あたり約１−Ｉ Ｑｍｇ／ｋｇの範囲内である。

寒應男 以下の実施例は、本発明の側面を示すためのものである。選択されたベクター、 宿主、融合相手、試薬の濃度、温度、および他の変数の値は、本発明を例示する ためのものに過ぎず、本発明を限定するものと考えるものでない。

実施例１．　ＩＬ−６中和モノクローナル抗体の産生オスのＬｅｗｉｓラットを Ｃ０８７−細胞発現マウスＩＬ−６の半一精製化製剤で免疫した（この発現系は り−ら（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、）、ＡｎｎａｌｓＮ、　Ｙ、　、へｃａｄ、Ｓｃ ｉ、、５５７巻、２１５−２２９ページ（１９８９）およびチューイら（Ｃｈｕ ｉ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５巻、７０９９−７１０３ページ（１９８８）によって記載 されている）。ラットをまずフロイントの完全アジュバント中でマウスＩ　Ｌ− ６約５０μｇで免疫し、フロイントの不完全アジュバント中で同量の試料で２回 追加投与（ｂｏｏｓ　ｔ）　した。試験採血を行った。マウスは最終的にリン酸 塩−緩衝食塩水中２３μｇ追加投与され、４日後に、融合のため膵臓が取り出さ れた。

およそ３Ｘ１０’個のラット膵臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を同数のＰ３ Ｘ６３−ＡＣ３，６５３マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ１ ５８０として入手可能）と融合させた。３８４０マイクロタイター・プレート・ ウェルで、ウェルあたり５．７Ｘ１０’個の親ミエローマ細胞が播種された。こ れらのウェルの半数は、初めに約２２ユニツト／ウエルの組み換えヒトＩ　Ｌ− ６で培養された。ユニットは、ヒトＩＬ−６に反応する細胞株ＮＦＳ−６０の成 長に関連づけて定められたが、これはチューら（Ｃｈｉｕ　ｅｔ　ａｌ、）によ って記述されている（上記文献）。他の５７６ウエルでは、ウェルあたり１．９ ×１０’個の親を播種した。融合のための標準的なプロトコールに続いてハイブ リドーマの培養が行われたが、これらはクレチェンら（Ｃｈｒｅｔｉｅｎ　ｅｔ ａｌ、）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、１１７巻、６７−８１ページ（１ ９８９）によって記載されているものと実質的には同じである。融合から１２日 後、上清を取り、（１）ＣＯ５−７産生マウスＩＬ−６でコートされたｐｖｃプ レート上の間接ＥＬＩＳＡによって、および（２）ＩＬ−６従属物であるＮＦＳ −６０細胞の成長を阻害するそれらの能力によって、スクリーニングされた。上 記のスクリーニングプロトコールは、ＩＬ−６に帰するハイブリドーマ成長因子 活性の理由で用いられた。これらのハイブリドーマから初めに産生された中和抗 −ＩＬ−６抗体が培養培地中のｒＬ−６を激減させることによって、それらの成 長を妨げたであろうという理由による。このようにして、いくつかのウェルでマ ウス細胞に活動的なヒトＩ　Ｌ−６（ｈ　ＩＬ−６）が播種された。どの場合に おいても、下記の表に示すように、中和抗体のほぼ同じフラクションが産生され た。

２２Ｕ／ウェルｈＩＬ−６；　８　１９２０　０．４１％５、７ＸｌＯ’細胞／ つ、ル ｈＩＬ−６なし、　６　５７６　１．０％１、９Ｘ１０’細胞／ウエル ＭＰ５−２０Ｆ３と称されるハイブリドーマからのモノクローナル抗体を実施例 ２の実験に用いた。

オスＢＡＬＢ／ｃマウス（１９−２１ｇ）を無作為に５つの異なる治療群Ａ−Ｅ に振り分け、これらの群を含む実験を異なる５日間設定した。Ａ群（３０匹のマ ウス）では、各マウスに、組み換えマウスＩＬ−，６（抗−組み換えマウスＩＬ −６モノクローナル抗体）に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を０．７５か ら１．００ｍｇ腹腔内注射して投与した。Ｂ群（３０匹のマウス）では、各マウ スに、ウサギ抗−組み換えマウスＴ　Ｎ　Ｆ　ａ　Ｉ　ｇ　Ｇを０．１から１． ０ｍｇ腹腔内注射して投与した。０群（３０匹のマウス）では、各マウスに、イ ソタイプコントロールＭａｂ　ＧＬ１１３を０，５から１．０ｍｇ腹腔内注射し て投与した。

Ｄ群（５匹のマウス）では、各マウスに、抗−ＩＬ−６Ｍａｂよりも２倍高レベ ルのエンドトキシンをもつイソタイプコントロールＭａｂを腹腔内注射して投与 した。最後に、Ｅ群（６匹にマウス）では、各マウスに、Ａ群のマウスに投与し たのよりも１００倍低いレベルの量の抗−組み換えマウスＩＬ−６を腹腔内注射 して投与した。各群とも、最初の注射から２時間後、各マウスに食塩水０．　２ から０３ｍｌ中１．２Ｘ１０’個の生大腸菌（ＡＴＣＣから受託番号２５９２２ として入手可能）を腹腔的注射して投与した。大腸菌は５％ヒツジ血液と共にト リプチケース（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）大豆寒天プレート上で培養され、分光光 度測定によって数えられた。マウスの生存に関する種々の実験計画の効果が図１ に示されており、図中、ｙ軸は生存マウスのパーセントを表し、ｙ軸はマウスが 大腸菌を注射されてからの時間（単位１時間ｈｏｕｒ）を表す。高投与量の抗− ＩＬ−６またはウサギ抗−組み換えマウスＴＮＦａＩｇＧを与えられたマウス群 のみが、大腸菌注射後２４時間を超えても生存マウスがいるということを示して いる：これら２つのマウス群は、大腸菌注射後７２時間たっても有意な生存率を 示した。

本発明の上述した態様の記述は、例証および説明を目的としたものである。それ らは網羅的なものではなく、本発明を開示された通りの正確な形に制限するもの でもなく、明らかに、上記教示から鑑みて多くの修正や変形が可能である。実施 態様は、本発明の本質を最も良く説明し、それによって他の当業者が、種々の態 様において本発明を最も良く利用することができる（および意図した特別の利用 に適した種々の変形を伴って）ようにするために選ばれ、記述されたものである 。本発明の範囲は、これに付随する請求の範囲によって定められることを企図し ている。

手続補正書

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＩＬ−６に対するアンタゴニストを有効量投与することから成る、ヒト における敗血症性ショックの治療方法。
2. ２．ヒトＩＬ−６に対するアンタゴニストが、ヒトＩＬ−６の生物学的活性を遮 断することができるモノクローナル抗体、ヒトＩＬ−６の生物学的活性を遮断す ることができるモノクローナル抗体のフラグメント、およびヒトＩＬ−６の生物 学的活性を遮断することができるモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖 可変領域を含む結合組成物から成る群から選択されるものである、請求の範囲第 １項に記載の方法。
3. ３．モノクローナル抗体のフラグメントがＦａｂフラグメントである、請求の範 囲第２項に記載の方法。
4. ４．モノクローナル抗体がヒトーヒトハイブリドーマから産生される、請求の範 囲第２項に記載の方法。
5. ５．モノクローナル抗体のフラグメントＦａｂフラグメントである、請求の範囲 第４項に記載の方法。
6. ６．投与段階がさらに、１日につき約１−２０ｍｇ／個人あたりの体重ｋｇの範 囲の量のアンタゴニストを静脈内伝達することを含む、請求の範囲第２項に記載 の方法。
7. ７．活性成分としてヒトＩＬ−６に対するアンタゴニストを医薬的な担体または 賦形剤と共に含む、医薬組成物。
8. ８．アンタゴニストが、モノクローナル抗体、ヒトＩＬ−６の生物学的活性を遮 断することができるモノクローナル抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメン ト、またはヒトＩＬ−６の生物学的活性を遮断することができるモノクローナル 抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域を含む結合組成物である、請求の範囲第 ７項に記載の医薬組成物。
9. ９．ヒトＩＬ−６に対するモノクローナル抗体。
10. １０．ヒトＩＬ−６に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、特 にここでＭＰ５−２０Ｆ３と称されているハイブリドーマ。
11. １１．敗血症性ショックの治療に有用な医薬組成物の調製のためのヒトＩＬ−６ に対するアンタゴニストの使用。
12. １２．アンタゴニストが、モノクローナル抗体、ヒトＩＬ−６の生物学的活性を 遮断することができるモノクローナル抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメ ント、またはヒトＩＬ−６の生物学的活性を遮断することができるモノクローナ ル抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域を含む結合組成物である、請求の範囲 第１１項に記載の使用。