HUT64481A

HUT64481A - Method for producing pharmaceutical preparative containing human il-6 antagonist

Info

Publication number: HUT64481A
Application number: HU9201859A
Authority: HU
Inventors: H Fletcher Starnes
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1989-12-04
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1994-01-28
Also published as: EP0504307A1; HU9201859D0; FI922551A0; WO1991007986A1; AU7179491A; JPH0747547B2; FI922551A; EP0504307B1; JPH05504058A; DK0504307T3; WO1991007986A8; CA2070424A1; ES2062762T3; DE69006221T2; DE69006221D1; ATE100331T1; AU648777B2

Description

A találmány tárgya szeptikus sokk kezelésére alkalmas, interleukin-6 (IL-6) antagonistát tartalmazó gyógyszetkészitmény előállítására szolgáló eljárás.

A súlyos fertőzések - elsősorban azok, amelyeket Gram-negativ baktériumok okoznak - súlyos fiziológiai és metabolikus változásokat okozhatnak az alábbi tünetek előfordulásával: láz, vérnyomásesés, metabolikus acidozis, számos szerv múködészavara, végül pedig halál. A megbetegedett egyének szervezetéből ( a bacilusgazdákból) kivonható fehérjéről, a tumor nekrózis faktorral (TNF-ről) kiderült, hogy a Gram-negativ szeptikémia számos káros hatásáért felelőssé tehető és a TNF-elleni antiszérummal végzett passzív immunizálás kivédheti a Gram-negativ bakteriémia és endotoxémia letális hatását [például Tracey et al., Science 234, 470 (1986); Beutler et al., Natúré, 320, 584 (1986); Tracey et al., Natúré,330 662 (1987)] . Magas szérum TNF-szintek voltak megfigyelhetők számos fertőző megbetegedésben - például meningococcus-meningitisben, maláriában és leishmaniasisban - és azon betegeknél, akiknek emelkedett volt a szérum TNF-szintjük, gyakoribbak voltak a különböző szervek rendellenességei és magasabb volt a halálozási arány is fwaage et al., Láncét, 355, (1987);

Girardin et al., New Engl.J.Med., 319, 397 (1988); Scuderi et al., Láncét, 1364 (1988); Kern et al., Am.J.Med., 87, 139 (1989)].

Beszámoltak arról is, hogy állatoknak, illetve embereknek történő TNF-adagolás hatására 2-6 órával később mérhető módon emelkedett a szérum IL-6 szintje [Mclntosh et al.,0.Immunoi., 143, 162 (1989); Oablons et al., 0.Immunoi. 142,

- 3 1542 (1989); Brouckaert et al., J.Exp.Med. 169, 2257 (1989)]. Az IL-6 - más néven B-sejt stimuláló 2-es faktor, interferon-β2, illetve hepatocitastimuláló faktor - a vizsgálatok alapján olyan T-sejt eredetű glükoproteinnek bizonyult, mely B-sejt érést okoz [például Kishimoto: Blood, 74 , ¹ (1989)].

Újabban az Il-6-ról kimutatták, hogy sokféle biológiai aktivitása van, például az akut fázis proteinek indukciója hepatocitákbán és a vérképzés őssejtjeire és a T-sejtekre gyakorolt hatások [üeiger et al., Eur.J.Immunoi. , 18, 717 (1988);

Marinjovic et al., J.Immunoi., 142, 808 (1989); Morrone et al., 3 . Bioi, Chem. , 263 , 12554 (1988); Perimutter et al., O-.Clin. Invest., 84, 138 (1989)].

Jelenleg a szeptikus állapotokat - például a bakteriémiát és hasonlókat - mikrobaellenes vegyületekkel kezelik. Abban az esetben azonban, amikor az ilyenfajta állapotok sokkal társulnak, nem állnak rendelkezésre hatékony járulékos terápiás lehetőségek a sokk-szindróma kezelésére [Young: in Mandell és munkatársai, eds., Principles and Practice of Infectious Diseases, 2nd Ed. 468-470 old. Oohn Wiley and Sons, New York, (1985)]. A fentiek miatt tehát a szepszishez társuló sokk kezelésére alkalmas eljárások biztosításának igen nagy a klinikai jelentősége.

A találmány tárgya eljárás sokk kezelésére alkalmas, humán IL-6 antagonista hatékony mennyiségét tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására. Az IL-6 antagonisták előnyösen monoklonális antitestek, vagypedig azokból standard eljárásokkal előállítható, kötődő vegyületek.

-•J* .

- 4 Az 1. ábra olyan, him BALB/c egerek túlélési adatait szemlélteti, melyeket élő E. colival fertőztünk meg intraperitoneálisan, majd különböző monoklonális antitestekkel kezeltük őket.

A találmány alapjául az a felfedezés szolgált, hogy a fokozott IL-6 termelés a sokkhoz vezető kórélettani történések egyik kiváltó láncszemének tekinthető mikrobák okozta masszív fertőzésekben, például szeptikémiában.' A találmány eljárást biztosit olyan gyógyszerkészítmények előállítására, melyek hatékony, a betegséget jótékonyan befolyásolni képes dózisban tartalmaznak egy humán IL-6 antagonista szert.

Előnyösen a találmány szerinti antagonisták a humán

IL-6 specifikus antitestjeinek származékai. Még előnyösebben, a találmány szerinti antagonisták olyan fragmenseket, illetve kötődő vegyületeket tartalmaznak, melyek specifikusak az IL-6-ra. Az antitestek olyan polipeptidláncok együtteséből állnak, melyeket diszulfid-hidak kapcsolnak össze egymással. Az antitest valamennyi fontos szerkezeti osztályát (izotipusát) · két fontos polipeptid lánc - a könnyű-lánc és a nehéz-lánc -hozza létre. Mind a nehéz-, mind pedig a könnyűláncok további szubrégiókból épülnek fel, melyek lehetnek változó vagy állandó régiók. A nehéz-láncok egyetlen változó és három különböző állandó régiót tartalmaznak, a könnyű-láncok pedig egyetlen változó régióból (mely nem azonos a nehéz-lánc ilyen részével) és egyetlen állandó régióból állnak (ez utóbbi sem azonos a nehéz-lánc megfelelő részével). A nehéz-, illetve a könnyű-lűnc változó régiói felelősek az antitest kötési képességéért.

A találmányi leírásban a nehéz-lánc változó régió olyan polipeptidet jelent, mely (1) 110-125 aminosav hosszúságú és (2) amelynek aminosav-szekvenciája megfelel a találmány szerinti monoklonális antitest nehéz-lánca aminosavsorrendjének, a nehéz-lánc N-terminális aminosavtól kiindulva. Hasonló módon, a könnyű-lánc változó régió olyan polipeptidet jelent, mely (1) 95-115 aminosav hosszúságú és (2) amelynek aminosav-szekvenciája megfelel a találmány szerinti monoklonális antitest könnyű-lánca aminosav-sorrendjének, a könnyű-lánc N-terminális aminosavtól kiindulva.

A találmány értelmében a monoklonális antitest kifejezés az immunglobulinok olyan homogén populációját jelenti, melyek képesek a humán IL-6 specifikus megkötésére.

A találmány értelmében a kötő vegyület olyan vegyületet jelent, mely két olyan polipeptid-láncot tartalmaz, melyek (1) amikor funkcionális kapcsolatba kerülnek, olyan alakzatot vesznek fel, melynek na^y a humán IL-6 iránti kötési affinitása, és amelyek (2) humán IL-6-ra specifikus monoklonális antitesteket termelő hibridomából származnak. A funkcionális kapcsolat kifejezés azt jelenti, hogy a két polipeptidlánc oly módon helyezkedhet el'egymáshoz képest, hogy a kötés számos különböző módon létrejöhessen, például egy natív antitestTfragmenssel - például Fab-vel vagy Fv-vel - való összekapcsolódás révén, vagy pedig oly módon, hogy karboxil-végződésekként génsebészeti eljárással módosított, ciszteint tartalmazó pepiid kötőelemet alkalmazunk. Normális esetben a két • « polipeptidlánc megfelel a humán IL-6-specifikus monoklonális antitest könnyű-lánc változó régiójának és nehéz-lánc változó régiójának. Előnyös esetben a találmány szerinti antagonisták humán^rIL-6-ra specifikus monoklonális antitestekből származnak. Az IL-6 blokkolására, illetve semlegesítésére képes monoklonális antitesteket azon képességük alapján vizsgáljuk, illetve szelektáljuk, hogy gátolni tudják az IL-6 által kiváltott hatásokat standard IL-6 bioassay során. Ezt ismertetik például a következő szerzők: Sehgal és munkatársai: Science, 235, 731-732, (1987); Billiau: Immunoi. Today, _8, 84-87 , (1987); Wong és munkatársai: Immunoi.Today, 2> 137-139, (1988). Előnyösen az alábbi biológiai aktivitások gátlása használható fel az IL-6 semlegesítésére képes monoklonális antitestek vizsgálatára: (i) vírusellenes aktivitás; (ii) az immunglobulin-elválasztás fokozása: (iii) bizonyos EBV által transzformált sejtvonalak szaporodásának serkentése. A vírusellenes aktivitás gátlása standard citopatiás hatás gátlásának vizsgálatára szolgáló assay segítségével mérhető: ilyen például az Armstrong által leirt módszer ^Metn.Enzymol. > 78, 381-387, (1989)J valamint a Familletti és munkatársai által leirt módszer [Meth. Enzymol., 789, 387-399, (1989)J, melyek mindegyike megtalálható az irodalmi hivatkozások között. A semlegesítő antitesteket azon képességük alapján szelektáljuk, hogy gátolni képesek bizonyos plazmocitoma-sejtvonalak - például az MOPC-315 - IL-6 által stimulált szaporodását £ lásd például Chiu és munkatársai: Proc . Natl. Acad . Sci . USA , 85 , 7099-7103, (1988)]. Az MOPC-315 a TIB 23 daponálási számon szerezhető • ·

- Ί be az Amerikai Tipustenyészetek Gyűjteményéből (American Type Culture Collection). A semlegesítő antitestek kiválasztásának további módszere az IL-6 által stimulált immunglobulin-szekréció gátlása bizonyos EBV által transzformált sejtvonalak esetében, amilyen például a CESS és az SKW 6,4 (ezek TIB 190, illetve TIB 215 daponálási számok alapján szerezhetők be az ATCC-tól [lásd .Hirano és munkatársai: Proc . Natl.Acad.Sci. USA, 82, 5490-5494, (1985)J. Az antitest-elválasztás mérésére szolgáló előnyös módszer az izotóp-specifikus EL1SA, a kereskedelemben beszerezhető izotóp-specifikus monoklonális antitestek felhasználásával. Például: (4-6) x 10^ CESS- vagy SKW 6.4 sejtet 200 pl tenyészközegben tenyésztettünk, például RPMI 1640-et körülbelül 3-30 pM IL-6-tal. Körülbelül 3 nap múlva meghatároztuk a felöluszók IgG (CESS), illetve IgM koncentrációját (SKW 6.4).

A találmány szerinti hibridomák előállítása jól ismert módszerekkel történik. Az eljárás során általában az immortalizált (végtelen szaporodási képességet szerzett) sejtvonalat egy olyan B-limfocitával egyesítjük ( = fúzió), mely a kívánt antitestet termeli. További lehetőséget jelent nem-fuziós technikák alkalmazása immortalizált antitesttermelő sejtvonalak előállítására - ami ily módon a találmány tárgykörébe sorolható , amilyen például a virusok által indukált transzformáció [lásd például Casali és munkatársai: Humán Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and Transformation by EBV] - B-limfociták antigén-specifikus szelekciójából származó humán monoklonálisok és transzformációjuk

EBV-vel: Science, 234, 476-479, (1986)J. Az immortalizált sejtvonalak transzformációja általában emlós sejtekkel előnyösen rágcsáló-, szarvasmarha- és emberi eredetű myelomá-sejtekkel - történik. Leggyakrabban patkány- vagy egér eredetű myeloma-sejtvonalakat használnak előnyös alkalmazhatóságuk és könnyű hozzáférhetőségük miatt. jól ismertek azok az eljárások, melyek a célantigénnel injekció formájában kezelt emlősöktől megfelelő limfociták nyerésére irányul nak. Általában - amikor emberi eredetű sejtekre van szükség perifériás vérből származó limfocitákat (PBLs _ peripheral blood lymphocytes) használunk, abban az esetben pedig, ha nem-emberi emlős sejteket kívánunk nyerni, lépsejtekkel vagy nyirokcsomósejtekkel dolgozunk. A gazda emlőst a tisztított antigén ismételt injekcióival kezeltük, miáltal lehetővé tettük, hogy az emlős a kívánt antitesttermelő sejteket létrehozza azt megelőzően, hogy azokat - az immortalizált sejtvonallal történő fúzió céljából

- összegyűjtenénk. A fúziós eljárások szintén jól ismertek a szakterületen, és áltáIában abból állnak, hogy a sejteket valamilyen fúziós ágenssel - például polietilén-glikollal - keverjük össze. A hib ridomákat standard eljárásokkal - például HAT-szelekcióval válogatjuk.

Ezen hibridómák közül azokat, amelyek a kívánt antitestet termelik - például azt, amely humán IL-6-ra speci fikus - oly módon választjuk ki, hogy tenyésztőközegüket stan dard immunoassay módszerekkel - például Western blotting

ELISA, RIA, IL-6 neutralizáló képesség és hasonlók segítségével - vizsgáljuk. Az antitestek visszanyerése a tenyésztőközeg• ·

- 9 bői standard fehérjetisztitási eljárások alkalmazásával történhet, például a Tijssen által leirt módszerrel (Practice andTheory of Enzyme Immunoassays - ^z>Az enzim-immunoassay vizsgálatok gyakorlata és elmélete Elsevier, Amsterdam, 1985). Valamennyi fent említett eljárás alkalmazásával kapcsolatban számos irodalmi hivatkozás nyújthat segítséget, például a következők: Kohler és munkatársai: Hybridoma Techniques - Hibridoma eljárások (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980): Tijssen: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays - Az enzim-immunoassay vizsgálatok gyakorlata és elmélete (Elsevier, Amsterdam, 1985): Campbell Monoclonal Antibody Technology - Monoklonális antitestekkel kapcsolatos eljárások (Elsevier, Amsterdam, 1984): Hurell: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications - Monoklonális hibridoma-antitestek: Eljárások és alkalmazási lehetőségek (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982): és hasonló irodalmi hivatkozások. Ezt követően a humán IL-6-ra specifikus monoklonális antitesteket termelő hibridomákat egy olyan, második szűrésnek vetik alá, melyet a fent ismertetett IL-6-assay módszerek segítségével végeznek, annak érdekében, hogy kiválasszák azokat, amelyek képesek az IL-6 biológiai aktivitásának blokkolására, illetve semlegesítésére.

Szintén jól ismert terület az antitestek fragmenseinek

- például a Fab fragmenseknek - alkalmazása és létrehozása; például az alábbi irodalmi hivatkozásból: Tijssen: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays - Az enzimf-immunoassay vizsgálatok gyakorlata és elmélete (Elsevier, Amsterdam, • ·

4* • * · • · · · 4 * • · · · · · , * · ····* * « *··< ·· » « ,

- 10 1985); valamint az Fv fragmensekkel kapcsolatban a következőkből: Hochman és munkatársai: Biochemistry, 12, 1130-1135 (1973); Sharon és munkatársai: Biochemistry, 15, 1591-1594 (1976) és Ehrlich és munkatársai: 4,355,023 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; végül az antitest félmolekulákkal kapcsolatban: Auditore-Hargreaves: 4,470,925 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

A találmány szerinti hibridomák és monoklonális antitesteket rekombináns eljárással létrehozott, érett humán IL-6 glikozilált vagy nem-glikozilált típusaival szemben termeltetjük. A humán IL-6 nem-glikozilált típusait általában E.coliban, a glikozilált változatokat pedig emlős gazdasejtekben - például CV1 vagy COS típusú majomsejtekben, egerek L-sejtjeiben , illetve más, hasonló sejtekben - termeltetjük. A rekombináns eljárással létrehozott, érett humán IL-6-ot oly módon termeltetjük, hogy egy expressziós vektort viszünk be a gazdasejtbe, standard vizsgálati tervnek/módszernek megfelelően: ilyenek például a következők: Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual Molekuláris klonozás: Laboratóriumi kézikönyv (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982): Okayama és Berg: Mól. Leli. Bioi.,2, 161-170, (1982) és 3, 280-289 (1983);

Takebe és munkatársai: Mól. Cell. Bioi., 8_. 466-472, (1988); a 4,599,308 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás: a 4,675,285 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás: Kaufman és munkatársai: Hol. Cell. Bioi.,.2, • 4

- 11 1304-1319, (1982); és hasonló közlemények. A szakterületen jól ismert a bakteriális, illetve emlős eredetű expressziós vektorok szerkezete, amint a kivént fehérjét kódoló nukleotidszekvencia ismert, illetve hozzáférhető: például DeBoer a 4,551,433 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan promoter anyagokat ismertet, melyek a bakteriális expressziós vektorok esetében használhatók: Goeddel és munkatársai a 4,601,980 számú, Riggs pedig a 4,431,739 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban E. őoli expressziós rendszerek emlős fehérje-termelését ismerteti: Riggs (1. a fent idézett közleményt). Ferretti és munkatársai: Proc. Matl.Acad. Sci. USA, 83, 599-603, (1986), Sproat és munkatársai: Mucleic Acid Research, 13, 2959-2977 (1985) és Müllenbach és munkatársai: J . Bioi.Chem., 261, 719-722 (1986) közleményeikben azzal foglalkoznak, hogyan kell létrehozni szintetikus géneket baktériumokban történő expresszió (kifejeződés) céljából. Ennek megfelelően a fent említett irodalmi hivatkozások itt referenciaként szolgálnak.

Az érett humán IL-6 aminosav-szekvenciáját Hirano és munkatársai [Natúré, 324, 73-76 (1986)J és Zilberstein és munkatársai [ EMBO 0., 5_, 2529-2537 (1986)J ismertetik: a humán IL-6-οΐ kódoló szintetikus gének kereskedelmi forgalomban vannak (Beckman Instruments, Fullerton. CA); a tisztított humán IL~6 is kapható a kereskedelemben (Genzyme Corp., Boston, MA). Számos bakteriális expressziós vektor és gazdaszervezet kapható kereskedelmi forgalomban és az ATCC-n keresztül.

.·. . *. 5 ···» ···· ***♦·· » , • · ’ ··*♦ « · • ♦ ·· · * « ,

A találmány szerinti hibridomákra jellemző antitestek és antitest-fragmensek rekombináns .. . eljárással is előállíthatok oly módon, hogy kivonjuk a messenger RNS-t, cDNS-könyvtárat hozunk létre és kiválasztjuk azokat a klonokat, amelyek az antitest-molekula szegmenseit kódolják: például Wall és munkatársai: Mucleic Acids Research, _5, 3113-3128 (1978); Zakut és munkatársai: NucleicAcids Research, _8, 3591-3601 (1980); Cabilly és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 3273-3277 (1984); Boss és munkatársai: Mucleic Acids, research, 12, 37>i-3806 (1984); Amster é-s munkatársai: Mucleis Acids Research, 8., 2055-2065 (1980); Moore és munkatársai: 4,642,334 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; valamint Skerra és munkatársai;. Science, 240, 1038-1041 (1988). Sajátos módon az ilyenfajta eljárások felhasználhatók interspecifikus monoklcnalis antitestek előállítására is, mely esetben az egyik faj kötődési régióját egy másik fajhoz tartozó antitest nem-kötődési régiójával kombináljuk, az immunogenicitás (immunogén-hatás) csökkentése céljából £ lásd például Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3439-3443 (1987)J.

A találmány szerinti antagonisták adagolása gyógyszerkészítmény formájában történik. Az ilyenfajta gyógyszerkészítmények valamely, találmány szerinti antagonista - például legalább egy, találmány szerinti monoklonális antitest vagy annak fragmensei - terápiásán hatékony mennyiségét tartalmazza, valamilyen gyógyszerészeiben használt vivőanyaggal együtt. A gyógyszerészeti vivőanyag lehet bármilyen kompatibilis, nem·*·« «··»

- 13 toxikus anyag, mely előnyösen alkalmazható a betegeknek adagolandó, találmány szerinti gyógyszerkészítményben. Steril víz, alkohol, zsírok, viaszok és semleges szilárd anyagok alkalmazhatók a vivőanyagban. A gyógyszerkészítményben gyógyszerészetileg elfogadható adjuvánsokat (pufferhatást biztositó szereket, diszpergáló szereket) is használhatunk Általában jól ismertek azok a gyógyszerkészítmények, melyek alkalmasak az ilyenfajta hatóanyagok parenterális adagolására (Remington’s Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1930). Más esetben a találmány szerinti gyógyszerkészítmények implantálható, illetve injekciós hatóanyagleadási rendszerek formájában is bejuttathatok a beteg szervezetébe [llrquhart és munkatársai: Ann. Rév. Pharmacol. Toxicol., 24, 199-236 (1984); Lewis. ed.

Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals A rovarirtó szerek és gyógyszerek szabályzott hatóanyagleadása (Plenum Press, New York, 1981): a 3,773,919 számú és a 3,270,960 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és hasonlók^.

Az antitestekből származó, találmány szerinti antagonistákat általában parenterálisan, előnyösen intravénásán adagoljuk. Mivel az ilyenfajta fehérje- vagy peptidtartalmú antagonisták immunogén tulajdonságúak lehetnek, adagolásuk előnyösen lassan történik, vagy hagyományos intravénás (IV) szerelék segítségével vagy pedig szubkután depóból (lásd például a Tomasi és munkatársai által a 4,732,863 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismerte• · ·*·♦ ··♦· ♦ « ·* * · ·· ♦

» ···« tetteket). Parenterális adagoláskor az antitesteket, illetve fragmenseiket egységnyi injekciós adagolási készítmények (például oldat, szuszpenzió vagy emulzió formájában, állíthatjuk elő valamilyen gyógyszerészetileg elfogadható, parenterálisan alkalmazható vivőanyaggal együtt. Az ilyenfajta vivőanyagok jellegükből fakadóan nem-toxikusak és nincs terápiás hatásuk. Példaként említhetjük az ilyenfajta vivőanya gokra a normál sóoldatot, a Ringer-oldatot, a dextrózoloatot és a Hank-féle oldatot. Nem-vizes vivőanyagokat - például állandó/zsiros olajokat és etil-oleátot is alkalmazhatunk. Előnyös vivőanyagnak tekinthető az 5 ^!í-os dextróz/sóoldat. A vivőanyag tartalmazhat kis mennyiségben adalékanyagokat is, azaz olyan anyagokat, melyek fokozzák az· izotonicitást és a kémiai stabilitást: ilyenek lehetnek például a pufferek és a tartósítószerek. Az antitestet előnyösen olyan tisztított formában állítjuk elő, mely lényegében mentes az aggregátumoktól egyéb fehérjéktől, endotoxinoktól és hasonló anyagoktól, koncentrációjuk pedig 5 és 30 mg/ml között, előnyösen 10 és 20 mg/ml között van. Az endotoxin-szintek előnyösen kisebbek 2,5 EU/ml-nél.

Valamely antagonista szer adagolási módjának kiválasztása számos tényező függvénye, beleértve a következőket: az antagonista turnoverének (-szérumban történő átalakulásának) sebessége; a szeptikémiához társuló IL-6-szérumszint értéke; az antagonista immunogenicitása (immunogén tulajdonsága); a cél-IL-6 hozzáférhetősége (például abban az eset- :

**·£ *·♦' • 4 «V • ♦ ♦ < · • ·« · • r « · ···· ♦ ·

- 15 ben, ha a nem-szérum IL-6 blokkolódik)^ az IL-6 receptorához hoz/receptoraihoz, illetve az antagonistához való affinitásának viszonya és hasonlók. Előnyös esetben az adagolásmód rév vén biztosítható maximális mennyiségű antagonista beadása a betegnek, miközben a mellékhatások szintje is elfogadható marad. A fentiek értelmében a bevitt antagonista mennyisége részben az adott antagonista típusának, részben pedig a kezelendő megbetegedésnek a függvénye. A megfelelő dózisok kiválasztásához segítséget nyújt az antitestek terápiás dózisaival kapcsolatos szakirodalom, például a következők: Bach és munkatársai: 22. fejezet, in: Ferrone et al., eds., Handbook of Monoclonal Antioodies¹¹ - A monoklonális antitestek. kézikönyve (Noges Publications, Park Ridge. N3. 1985); és RusselT: 303-357; továbbá Smith et al., 365-3B9 in: Haber et al., eds. Antibodies in Humán Diagnosis and Therapy - Antitestek a humán diagnózisban és terápiában (Raven Press, New York, 1977). Előnyösen, amennyiben az antagonista monoklonális antitesteket vagy azok Fab-méretű fragmenseit tartalmazza (beleértve a kötődő vegyületeket is)_?a dózis a napi körülbelül 1-20 mg/kg-os tartományba esik.

Még előnyösebb esetben a napi körülbelül 1-10 mg/kg-os dózistartomány a jellemző.

A továbbiakban a találmányt példáink segítségével ismertetjük részletesebben. A kiválasztott vektorok, gazdaszervezetek, fúziós partnerek,a reagensek koncentrációja, a hőmérséklet és az egyéb változók értékei csak példaként szolgálnak a találmány kiviteli eljárásaira, és nincs sem-

«« « • · * ·· ·«·- 99 miféle korlátozó jellegük.

1. példa

IL-6-neutralizáló monoklonális antitest előállítása

Egy hím, Lewis törzsből származó patkányt immunizáltunk C0S7Tsejt által indukált expressziós egér IL-6 félig tisztított készítményeivel £ezt az expressziós rendszert az alábbi szerzők ismertetik közleményeikben: Lee et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 552, 215-229 (1989) és Chui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 , 7099-7103 (1988)J. A patkányt először körülbelül 50 yug, Freund-féle komplett adjuvánsban bevitt IL-6-tal immunizáltuk, majk két lökésszerű injekció (boost) formájában a fentivel azonos mennyiségű hatóanyagot vittünk be, Freund-féle inkomplett adjuvánsban. Az állattól vizsgálat céljára vért vettünk. Végül a patkánynak egy végső, lökésszerű injekciót (boost) adtunk be, mely 25 pg hatóal nyagot' tartalmazó, foszfáttal pufferolt sóoldatban. Ezt követő négy nap múlva kivettük az állat lépét, a fúzió végrehajtása céljából.

Q

Körülbelül 3 x 10 patkány szplenocitát azonos számú P3X63-AG8.653 típusú egér mieloma-sejttel (mely az ATCC-től CRL 1580-as deponálási számon szerezhező be) egyesítettünk. 3840 lyukú (tenyésztő) tálca minden egyes vájatába 5.7 x 10⁴számú szülői mieloma-sejtet oltottunk le. Ezen vájatok felét kezdetben körülbelül vájatonként 22 egységnyi rekombináns humán IL-6-tal együtt tenyésztettük. Az egységek meghatározása •••j ·*·· • · • · « ♦ * « » ·9 • · ··*· • ·♦·· az NF5-60 sejtvonal szaporodásához képest történik - reakcióképpen humán IL-6-ra -, Chui és munkatársai leírása szerint (lásd fent). További 576 vájatba vágatonként 1.9 x 10^ szülői sejtet oltottunk le. A fúzió és a hibridek ezt követően létrehozott tenyésztése során követtük a standard vizsgálati tervekben foglaltakat, melyek lényegében azonosak voltak a Chretien és munkatársai által leírtakkal [ü. Immunoi. Meth. 117, 67-81 (1989)], 12 nappal a fúziót követően a felülúszókat összegyűjtöttük és szűrtük, (1) C0S7 által termelt egér IL-6-tal bevont PVC-lemezeken végzett indirekt ELISA módszerrel, és (2) azon képességük révén, hogy gátolják az IL-6-függő NFS-60 sejtek szaporodását. A fentiekben ismertetett vizsgálati tervet az IL-6-nak tulajdonított hibridoma növekedési faktor aktivitás miatt használtuk. Megállapítottuk, hogy a fenti hibridomák által kezdetben termelt anti-IL-6 antitestek semlegesítése gátolhatja növekedésüket azáltal, hogy blokkolja a tenyésztő közegben lévő IL-6-ot. Ily módon, bizonyos vájatokba humán IL-6-ot (hIL-6) oltottunk le, mely egérsejteken aktívnak bizonyult. Valamennyi esetben azt tapasztaltuk, hogy a semlegesítő antitestek azonos frakciója jött létre, amint azt az 1. táblázatból láthatjuk.

«· «

····

1. táblázat

Kezdeti leol-	Semlegesítő	Leoltott	Semlegesítő
tási feltéte-	anti-IL-6-ot	vajatok	Mab-okkal
lek	tartalmazó	száma	leoltott
	vajatok szá-		vajatok
	ma		százaléka

hIL-6 nélkül: 5.7 x 10⁴sejt/vájat	7	1920	0,36 %
22 E hIL-6	8	1920	0,41 %
vájatonként:
5.7 x 10⁴
hIL-6 nélkül:	6	576	1.0 %

1.9 x 10⁵ sejt/vájat

A 2. példában leirt kísérletekben az MP5-20F3-mal jelölt hibridomából származó monoklonális antitesteket használtunk fel.

• ·

2. példa

A semlegesítő anti IL-6 Mab profilaktikus hatása letális dózisú E. colival i njiciált .egerek esetében.

Him BALB/c egereket(testtömegük 19-21 g között volt) random módon öt különböző kezelési csoportba (A-E) soroltunk, és az egyes csoportokkal kapcsolatos kísérleteket öt különböző napon végeztük.el. Az A csoportban (30 állat) valamenynyi egérnek 0,75-1,00 mg monoklonális antitestet (Mab) adtunk be intraperitoneális injekció formájában rekombináns egér IL-6-tal szemben (anti-rekombináns egér IL-6 monoklonális antitest). A B csoportban (30 állat) valamennyi egérnek 0,1-1,0 mg nyúl anti-rekombináns egér TNFccIgG-t adtunk be intraperitoneális injekció formájában. A C csoportban (30 állat) valamennyi egérnek 0,5-1,0 mg izotipusos kontroll Mab GL113-at adtunk be intraperitoneális injekció formájában. A D csoportban (5 állat) valamennyi egérnek olyan izotipusos kontroll Mab-t adtunk be - intraperitoneális injekció formájában - melyben az anti IL-6-éhoz képest kétszeresen magasabb volt az endotoxinszint. Végül az E csoport esetében (6 állat), valamennyi egérnek olyan intraperitoneális injekciót adtunk be, mely 100-szorosan alacsonyabb dózisban tartalmazta az anti-rekombináns egér-IL-6-ot, mint azt az A csoporthoz tartozó egerek esetében alkalmaztuk. Minden egyes csoport esetében a kezdeti injekció után két órával valamenynyi egérnek 0,2-0,3 ml sóoldatban 1,2x10 élő E. colit adtunk he intraperitoneális injekció formájában (az E. colit az ATCC-től szereztük be, 25922-es hozzáférhetőségi szám? alatt). Az E. colit 5 %-nyi mennyiségű juhvért tartalmazó triptikáz szója-agar lyukacsos lemezeken tenyésztettük, majd a számlálást spektrofotometriás eljárással végeztük.

Az 1. ábra a különböző kísérleti elrendezések hatásait szemlélteti egerek túlélési idejére: az y-tengely a túlélő egerek %-os arányát mutatja, az x-tengely pedig azon időszak hosszúságát - órákban kifejezve -, mely azt követően telik el, hogy az egerek megkapták az E. coli injekciót. Csak azon egércsoport mutatott az E. coli injekció után több, mint 24 órás túlélést, melyet nagy dózisú amti-IL-6-antitesttel vagy nyúl anti-rekombináns egér TNF«IgG-vel kezeltünk. Ezen két csoportban még az E. coli injekció után 72 órával is szignifikánsan magasabb volt a túlélő állatok százalékos aránya.

A találmány fentiekben ismertetett kiviteli alakjainak és foganatositási eljárásainak leírásai csak a szemléltetést és az ismertetést szolgálják, nem pedig a részletes leírást, illetve a találmánynak az adott formákra történő korlátozását. Nyilvánvaló módon számos módositás'és változat lehetséges a fentiek értelmében. A kiviteli példákat azért választottuk, illetve ismertettük, hogy ezáltal érthetőbbé tehessük a találmány elvi alapjait és a szakterületen jártas egyének számára lehetővé tegyük, hogy a lehető legjobban hasznosítsák a találmány különböző kiviteli alakjait azon számos módosítással együtt, melyek megfelelnek az adott, sajátos célnak.

- 21 -

Szándékunk szerint a találmány oltalmi körét az alábbiakban közölt szabadalmi igénypontokban határoztuk meg.

Claims

1. Eljárás olyan, szeptikus sokk kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, mely valamilyen humán IL-6 antagonista szert^tartalmaz, terápiásán hatékony menynyiségben.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a humán IL-6 antagonista szert az alábbiak közül választjuk: a humán IL-6 biológiai aktivitásának blokkolására képes monoklonális antitest, a humán IL-6 biológiai aktivitásának blokkolására képes monoklonális antitest egy fragmense, valamint egy olyan kötődő vegyület, mely a humán IL-6 biológiai aktivitásának blokkolására képes monoklonális antitest nehéz-láncának változó régióját és könnyű-láncának változó régióját tartalmazza.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitest említett fragmense egy Fab fragmens.

4. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitestet ;humán-humán hibridoma termeli.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a monoklonális antitest említett fragmense egy Fab fragmens.

6. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az adagolás során az ilyenfajta kezelésre szoruló egyénnek naponta testtömeg-kilogrammonként körülbelül 1-20 mg-os mennyiségben adjuk az antagonista szert.

7. Gyógyszerkészítmény, mely aktív hatóanyagként valamilyen humán IL-6-antagonista szert tartalmaz, valamely gyógyszerészeti vivőanyaggal vagy adalékanyaggal együtt.

8. A 7. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény azzal jellemezve, hogy az antagonista szer egy monoklonális anti test, a humán IL-6 biológiai aktivitásának blokkolására képes monoklonális antitest egyik - előnyösen Fab - fragmense, illetve olyan kötődő vegyület, amely a humán IL-6 biológiai aktivitásának blokkolására képes monoklonális antitest nehéz-láncának változó régiójából és könnyű-láncának változó régiójából áll.

9. Humán JL-6-ellenes monoklonális antitestek.

10. Humán IL-6-ellenes monoklonális antitesteket termelő hibridomák, előnyösen az MP5-20F3 jelű hibridóma.

11. Humán IL-6-ellenes antagonista szer felhasználása olyan gyógyszerkészítmények előállítására, melyek hatékonyan alkalmazhatók szeptikus sokk kezelése során.

12. A 11. igénypont szerinti felhasználás azzal jellemezve, hogy az alkalmazott antagonista valamely monoklonális κ-·

- 24 antitest, a humán IL-6 biológiai aktivitásának blokkolására képes monoklonális antitest valamely - előnyösen Fab - fragmense, vagypedig egy olyan kötőCdési) vegyület, mely a humán IL-6 biológiai aktivitásának blokkolására képes monoklonális antitest nehéz-lánca változó régiójából és könnyű-lánca változó régiójából áll.

ddaL

I 'oJoiooddoJC oldek.