JPS60149600A - インタ−フエロン−γ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、免疫インターフェロン及びそのｍＲＮＡ　
、並びに均質な免疫インターフェロン（ＩＦＮ−γ）に
関する。

さらに詳しくは、この発明の１つの観点は、メゼライン
（ｍｅｚｅｒｅｉｎ　）又は１２．１３−フオルゼール
ジブチレー）　（１２、１３−ｐｈｏｒｂｏｌｄｉｂｕ
ｔｙｒａｔｅ　）によシ調節された誘発されたヒト白血
球からのＩＦＮ−γの高収量製造方法に関する。

好ましくは、白血球をＡ−３２１８７、イオノマイシン
（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ　）　、及び１，１−ジメチル−
６，６，７，７，８，８，８−ヘゾタフルオローー３．
５−オクタンジオンから選ばれたカルシウムイオンフォ
アにより誘発する。

この発明の他の観点は、実質上均質にｆＩ’ｊ　ＩＪさ
れたＩＦＮ−γに関する。

この発明のそのほかの観点はＩＦＮ−γｍ　ＲＮＡ　。

及びＩＦＮ−γの製造のためのクローニング方法に関す
る。

インターフェロンはｌ５ａａｃｓ及びＬｉｎｄｅｎｍａ
ｎｎによＪ１９５７年に発見された。彼らはウィルスに
感染した細胞培養物からの液が、正常な細胞と反応して
該細胞を広範囲の種類のウィルスによる感染に対して耐
性にする蛋白質を含有していることを観察した。有力な
抗ウイルス効果のほかに、インターフェロンは抗細胞活
性、免疫調節活性、及び抗腫瘍活性を有する。動物にお
ける癌及びウィルス感染の治療におけるインターフェロ
ンの使用はある程度成功し、そしてそれ故にヒトにおけ
るその使用に大きな興味がもたれてしる。

インターフェロンは、α又は白血球インターフェロン（
ＩＦＮ−α）、β又は線維芽細胞インターフェロン（Ｉ
ＦＮ−β）、及びγ又は免疫インターフェロン（ＩＦＮ
−γ）と称する３つの主要なスペーシスに分類される。

ＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βに対して向け
られた抗体によシ中和されない能力、及びＩＦＮ−γに
対して向けられた抗体によシ中和される能力によｐ　Ｉ
ＦＮ−α及びＩＦＮ−βから区別される。

ＩＦＮ−γはまた、その生物学的性質が低ＰＨ環境、例
えばＰＨ２に置かれた場合、及びドデシル硫酸ナトリウ
ムと接触した場合に容易に破壊されるという事実により
特徴付けることができよう。

インターフェロンに関する研究は主としてＩＦＮ−α及
びＩＦＮ−βに関連していた。例えばＩＦＮ−αの製造
に関する相当多くの研究がフィンランドのＫａｒｉ　Ｃ
ａｎｔｅｌｌ博士によって行われている。

［Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　ＨｕｍａｎＬｅｕｃｏｃｙｔｅ　Ｉｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎ　Ｊ　ｒ　Ｋ、Ｅ、　Ｍｏｒｇａｎｓｅｎ
及びり、　Ｃａｎｔｅｌｌ　、　Ｉ　Ｐｈａｒｍａｃ、
　Ｔｈｅｒ、　Ｃ，、３６９−３８１，１９７７を参照
のこと。ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βのアミノ酸配列が最
近、蛋白質配列分析、及び対応するクローニングされた
相補的ＤＮＡの配列についての研究によって同定された
。さらに、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βの多数のサブスベ
イシスが存在することが証明されている。

ＩＦＮ−γの構造及びその生物学的性質についてはほと
んど知られていない。しかしながら現在、ＩＦＮ−γは
細胞増殖阻害剤、免疫調節剤及び抗腫瘍剤として一層活
性であり、そしてＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βの抗ウイル
ス効果及び抗細胞効果を増強する能力を有すると信じら
れている。従って、ＩＦＮ−γはＩＦＮ−α及びＩＦＮ
−βに比べて非常に興味深いであろう。

種々のＴ−細胞分裂促進蛋白質が）０ライムされていな
いリンツク球からＩＦＮ−γを誘発するものとして同定
されている。さらに一般に使用されている蛋白質の幾つ
かは、植物レクチン、例えばコンカナバリンＡ１フイト
ヘマグルチニンＡ、又ハ分裂促進性を有することが知ら
れている他の蛋白質、例えばスタフィロコッカス性エン
テロトキシンＡ及ヒフタフィロコ、カス性プロティンＡ
である。

報告ｒＨｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏ
ｎ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅ
１ｌｓ　ｂｙ　ａ　Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｉｏｎｏｐｈｏｒ
ｅＪＦ、Ｄｉａｎｚａｎｉ等＋　２９　Ｉｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ＋５６１−５６３＋１
９８０年８月は、ＩＦＮ−γの誘発剤としてカルシウム
イオノフォーレＡ−２３１８７の使用全記載している。

ＣＡ−２３１８７は、米国特許第３．９３２８．２３号
に記載されている。カルシウムイオノ７オーレＡ−３２
１８７は蛋白質ではない。Ａ−３２１８７は、その親脂
性及びカルシウムに対する高い親和性のために、細胞膜
を通してのカルシウムの急速な流入を可能にし、とれに
よって蛋白質インデューサーのパッチング機構を刺激す
ることが信じられている。しかしながら、Ｄｉａｎｚａ
ｎｉ等の方法を使用する場合、ＩＦＮ−γ活性はわずか
に検知できる程度であり、１０〜１００ユニツト／　ｍ
ｌのＩＦＮ−γ活性が観察されるに過ぎない。ここで、
１ユニツトはウィルスによる細胞変性効果を５０％阻害
する量と同等である。

（ＩＦＮ−γについては容認された国際標準が存在しな
いため、異る研究室間の力価を比較することは容易でな
い。） この発明は、ＩＦＮ−γを高収量で製造する方法、及び
信頼できる効果的で且つ機能的なｍＲＮＡ　ｋ教示する
。この発明はさらに、ＩＦＮ−γを発現することができ
るクローンを生産するための遺伝子工学的技法を開示す
る。

この発明は、ＩＦＮ−γの製造方法であって、少なくと
もＩＦＮ−γの生産に十分な時間にわたって、白血球を
含む生細胞、並びにＩＦＮ−γの生産を刺ン放するのに
十分な量のＩＦＮ−γ生産誘発剤及び該誘発剤のための
メゼライン又は１２．１３−７オルボールブチレートか
ら選ばれた調節剤を含んで成る懸濁液ｔインキーベート
し、この細胞懸濁液から上溝液を分離し、そして （、）　調節された細孔を有するがラスビーズ（Ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｑｌａｇｓ　ｂｅｅｄｓ）
を収容したカラムにＩＦＮ−ｒを吸着せしめ、そして硫
酸アンモニウムで溶出し； （ｂ）　段階（、）のＩ　ＦＮ　−１含有溶出液をコン
カナ・々リンＡ−セファロース、レンズ豆レクチンーセ
ファロース、又はエントウ豆レクチンーアがロースを収
容したカラムに吸着せしめ、そして糖を含有する緩衝液
によ）溶出し； （ｃ）　段階（ｂ）のＩＦ’Ｎ−ｒ含有溶出液をヘパリ
ン−セファロース又ハプロシアンレッドーアガロースを
収容したカラムに吸着せしめ、高塩含量の緩衝液で溶出
し；そして （ｄ）段階（ｃ）のＩＦＮ−γ含有溶出液を高塩濃度に
おいて平衡化したグル涙過カラムに通し、そして精製さ
れたＩＦＮ−γを回収する方法に関し、この方法は、前
記段階（ａ）〜（Ｃ）の後であって段階（ｄ）の前に、
部分的に精製されたＩＦＮ−γを化学的に適合性の緩衝
液に対して透析し、約９．０〜１０．０の−の緩衝液の
存在下でイオン交換体にＩＦＮ−γを平衡的に吸着せし
めるのに十分な時間にわたって、透析された部分精ｇ　
ＩＦＮ−ｒの前記溶液を陽イオン交換体のカラムと接触
せしめ、ＩＦＮ−γを吸着した前記イオン交換樹脂を溶
出液の２８０　ｎｍにおける光学濃度が約Ｏになるまで
緩衝液により洗浄して溶液画分を除去し、そして吸着さ
れたＩＦＮ−γを、５０　ｍＭ　ＮａＣ２を含有する声
約９〜１０．約ｌＯ〜３０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ａ−ＨＣＡ
の溶出緩衝液によ）溶出することにより改良されている
。

白血球は、ヒト、モンキー、羊、牛、豚及び局を含む種
々の分離源から得られるであろう。特に、生細胞懸濁液
は白血球、メゼライン及び１２゜１３−フォルボールジ
ブチレートから成る群から選ばれた調節剤、並びにＩＦ
Ｎ−γ誘発剤を含有する。

好ましくは、ＩＦＮ−γ誘発剤はＡ−２３１８７、イオ
ノマイシン、及び２，２−ジメチル−６，６゜７．７，
８，８，８−ヘプタフルオロ−３，５−オクタンジオン
（ＦＯＤ）から成る群から選ばれたカルシウムイオノフ
ォーレである。

インキュベーション期間の終りに、ＩＦＮ−γ及びＩＦ
Ｎ−７ｍＲＮＡの両者を細胞懸濁液から抽出することが
できる。ＩＦＮ−γは出精液中に見出され、そして粗Ｉ
ＦＮ−γを一連のカラムに吸着せしめそして溶出するこ
とによって均質に精製することができる。

ＩＦＮ−γを精製するだめの技法は米国特許第４．４８
２．０２６に開示されておシ、引用によりこの明細書に
組み入れる。

ＩＦＮ−１ｍＲＮＡは細胞中に含まれる。このｍＲＮＡ
は一般に、溶解した細胞から大形のＤＮＡ鎖及び蛋白質
全除去し、そして次にポリ（ロ）カラ人中でｍＲＮＡを
他のタイプのＲＮＡ及びＤＮＡの不備から分離すること
を含む方法によって、細胞から抽出する。高ＩＦＮ−γ
活性を有するｒｎＲＮＡをサイズ画分によって選択する
。

このｍＲＮＡはクローン中でＩＦＮ−γを発現せしめる
ために有用である。クローニングの原理的な利点は、Ｉ
ＦＮ−γについてコードするＤＮＡを宿主細胞例えが細
菌又は酵母に入れることによって多量のＩＦＮ−γを採
取することができることである。簡単に記載すれば、こ
れは、分離されたｍＲＮＡをウィルス性酵素である逆転
写酵素に添加することによって達成される。この酵素は
ｍＲＮＡコードを読み取シ、そして相補的単鎖ＤＮＡ　
＞逆転写する。ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素の存
在下で二重鎖ＤＮＡを形成せしめ、そして遺伝子工学的
組換技法、例えば米国特許第４，２３７，２２４号に記
載されている方法によって宿主細胞、例えば細菌Ｅ、コ
リ（Ｅ、ｃｏｌｉ）に入れる。例えば、二重鎖ＤＮＡの
宿主細胞への挿入はまず、宿主に適合性であムそして表
現形質、例えばペニシリン耐性を有するクローニングベ
クター、例えばプラスミドを選択することによシ行う。

クローニングベクター上の特定の部位を切断することが
できる酵素により、挿入すベキＩＦＮ−γコードＤＮＡ
のサイズとおよそ等しいベクターの部分を除去する。Ｄ
ＮＡ及びクローニングベクターをＤＮＡ　＋）ガーゼに
よシ連結する。次に、組換クローニングベクターを、形
質転換法により塩化カルシウムの存在下で宿主に導入す
る。次に、組換クローニングベクター分子を取り込んだ
細胞、すなわち形質転換体を、通常は抗生物質を用いて
選択し、そして次にＩＦＮ−γ誘発細胞由来のｍＲＮＡ
とバイブリド形成するその能力により選択的に分離する
。次に、これらの形質転換体をＩＦＮ−γの発現につい
てスクリーニングする。選択された形ｐ転換体からのＩ
ＦＮ−γｄａ−ＤＮＡを最適な発現ベクターに入れ、Ｉ
ＦＮ−γの大量製造に使用する。

カルシウムイオノフォーレ、Ａ−２３１８７及びイオノ
マイシンは微生物によって生産される抗生物質である。

カルシウムイオノフォーレＦＯＤけ合成物質であり、そ
してその生物学的活性がＡ−２３１８７について記載さ
れたそれと類似することが示されている。この発明の目
的に関しＦＯＤとＡ−３２１８７の主な相違は、ＩＦＮ
−γの同様な収量を得るためによシ高いＦＯＤ濃度が必
要らしいことである。しかしながら、ＦＯＤをそのモノ
マー形（非ミセル形）に小形化することができ、そして
細胞毒性を有しないＦＯＤ用溶剤が見出された後はＡ−
３２１８７とＦＯＤの最適濃度に有意表蓋がないことが
証明されるであろう。実際には、ＦＯＤは高価ではなく
、そして大量に容易に入手できるから、よシ高濃度のＦ
ＯＤを使用することは問題にならない。

調節剤であるメゼラインは６５４０分子量を有する多項
式Ｃ３８Ｈ６８０，。炭化水素である。これは植物ダフ
ン１メーゼロイン（Ｄａｐｈｎｅ　ｍｅｚｅｒｅｕｎ）
Ｌからの抽出物である。メゼラインは、効果的な腫瘍促
ｍ　剤である１２−０−テトラデカノイルフォルボール
１３−アセテート（ＴＰＡ）と同等に効果的なリンパ血
分裂促進剤であることが示されている。ＩＦＮ−γ誘発
剤のための効果的なｍ１１１節剤としてのこの物質の発
見は、これを非常に有用なものとしている。

この発明にお−で有用な他の調節剤である１２゜１３−
７オルゴールジブチレートハフオルボールエステルであ
って、メゼラインと同様にＩＦＮ−γ誘発剤のための有
効な調節剤である。

調節剤と誘発剤との組合わせは、これら全個別的に使用
した場合に比べて有意に高いＩＦＮ−γ力価を生じさせ
、そしてこれらの効果を単に加え合わせた場合に予想さ
れる効果よシも大きな効果を生じさせる。

さらに、ＩＦＮ−γ誘発剤、特にカルシウムイオノフォ
ーレの１つは、調節剤と組合わされて、Ｖ’Ａ　ｆｆ？
、’剤を伴わないＩＦＮ−γ誘発剤、す力わちスタフィ
ロコッカスエンテロトキシンＡ１−フィトヘマグルチニ
ンＡ及びコンカナバリンＡよシも高い免疫ＩＦＮ−γ力
価の生産全刺激することが見出されている。

メゼラインとカルシウムイオノフォーレ、特にＡ−３２
１８７との組合せは、確実に且つ一貫して高収量の工Ｆ
Ｎ−ｒ＝生産する。さらに、カルシウムイオンフォーレ
及びメゼラインの比較的低い分子量のため、これらの疎
水性のため、そして八−２３１８７の場合にはある種の
二価陽イオンに対するその高い親和性のために、これら
はＩＦＮ−γ生成物から容易に除去される。そして、メ
ゼライン／カルシウムイオノフォーレ系は、他の公知の
誘発剤（すべて蛋白質であシ、そして細胞懸濁液中に見
出される他の蛋白質から除去することが困離である）に
比べて毒性が少ない。さらに、誘発剤蛋白質はＩＦＮ−
γと同時精製される傾向があり、このために最終生成物
が汚染され、そして臨床的使用に耐えられないものとさ
れる。従って、メゼライン／カルシウムイオノフォーレ
系は臨床的に使用するためのヒトＩＦＮ−γの製造のた
めに特に有利で６Ｄ、セして又クローニングのために、
培養された細胞懸濁液からｍＲＮＡを回収するためにも
有利である。

第１−１図及び第１−２図のフローチャートはＩＦＮ−
γの製造及びその均質な精製のための方法、ＩＦＮ−γ
をクロー二／グするために有用なｍＲＮＡの製造方法、
及びＩＦＮ−γを発現することができるクローンを製造
するだめの方法を示す。

第１−１図に関して、バフィーコートを遠心分離によっ
て全血から分離し、そして次に抗生物儀を含有する培地
にＭｍする。この方法に代えて、バフィーコートから赤
血球を除却し、そして残った白血球を培地に懸濁するこ
とができる。調節剤及び誘発剤を懸濁液に混合し、そし
て短時間免件調節する。栄養源を加え、そして細胞懸濁
液を静置条件下又は撹拌条件下でインキ−ベートする。

次にインキュベートされた細胞懸濁液を遠心分離して細
胞から上清液を分離する。上清液は粗ＩＦＮ−γ−を含
有しておシ、このＩＦＮ−γを均質に精製する。細胞は
ＩＦＮ−１ｍＲＮＡ　ｆ含有し、これはクローニング方
法に使用する。

細胞を溶解し、ＩＦＮ−１ｍＲＮＡを次の方法によシ抽
出する。この方法は、大形のＤＮＡ鎖及び蛋白質を除去
し、残ったＲＮＡをポリ（ロ）カラムに通すことによっ
てｒＲＮＡ及びＤＮＡの不備を除去し、カラムからｍＲ
ＮＡを溶出し、そしてｍＲＮＡをサイズ画分することを
含んで成る。種々のサイズ画分からのサンプルをカエル
の卵母細胞中での試験管内翻訳により、ＩＦＮ−γをコ
ードするその能力について測定する。最も高いＩＦＮ−
γ活性を有する両分をクローニングのために選択する。

クローニングベクターに挿入すべきｄ　５−ＤＮＡは、
抽出されたｍＲＮＡから２段階において調製する。

壕ず、逆転写酵素の存在下で、ｍＲＮＡに相補的な５ｓ
−ＤＮＡを合成する。このａｉｌ−ＤＮＡは、逆転写酵
素又はＤＮＡポリメラーゼの存在下でその相補的なり　
Ｂ−ＤＮＡを合成するための鋳型として機能し、ノ飄イ
ブリド形成によりｄ　５−ＤＮＡが形成される。

ｄ　５−ＤＮＡに平滑末端を加え、そして適切な末端コ
ドンを加える。次に、このｄ　５−ＤＮＡを、ＤＮＡリ
ガーゼの存在下で、適切な末端コドンを有する切断され
たクローニンベクターと連結する。この組換クローニン
グベクターを、形質転換法により宿主細胞に入れる。生
成した形質転換体を、クローニングベクターに担持され
ている表現形質により分離する。さらに、形質転換体音
、ＩＦＮ−γ誘発細胞からのラベルされたｍＲＮＡと強
くノ・イブリド形成するその能力によυ選択し、場合に
よっては次に陽性バイブリド形成選択を行う。候補形質
転換体音、ングする。これらの形質転換体からのＩＦＮ
−γｄｓ−ＤＮＡを取シ出し、そして最適な発現ベクタ
ーに挿入し、これをＩＦＮ−γの大規模製造のために使
用することができる。

この発明の好ましい態様に従えば、ヒト白血球を含有す
るバフィーコートがヒｉ　ＩＦＮ−γを製造するための
生細胞源として与えられる。ノ々フィーコートは種々の
標準的な臨床的方法、例えばロイコポーレシス（Ｌｅｕ
ｃｏｐｏｒｅａｉｓ）によ＃）−又は−、％エティクス
（ｈｅｍｏａｔｉｃ＋ｓ）　Ｉｆｌｅにおいて得られる
。

１つの適当な方法は、全血（通常１００ｒＬｌ）を静脈
穿刺によシ健全な給血者から酸−クエン酸塩−グルコー
ス溶液、又はヘパリンを加えた容器に採取する。酸−ク
エン酸塩−グルコース溶液及びヘパリンは、放置中に血
球が凝集するのを防止するために血液ユニットに加える
通常の添加物である。全血を遠心分離し、そして血漿画
分を除去する。遠心分離物の血清の直下の層がバフィー
コートである。バフィーコートは主として白血球を含有
し、そして幾らかの赤血球を含有する。白血球の１つの
成分はＴ−細胞リンパ球である。このリンパ球がＩＦＮ
−γの生産のために機能していると信じられている。

白血球を分離するだめの他の方法は、Ａ、Ｂｏｙｕｍ＋
ｒＩｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ　
ｆｒｏｍ　ＨｕｍａｎＢｌｏｏｄＪ、２１５ｃａｎｄ、
Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

５ｕｐｐｌｎ、　３１−５０　（１９６８）　に記載さ
れているフィコール−ハイバーク（Ｆｉ　ｃｏｌ　１−
Ｈｙｐａｑｕｅ）グラジェント法である。この方法によ
って得られる細胞の実質的な部分がリンパ球であシ、Ｔ
−細胞由来９７７４球はこの中に存在する。そのほかの
単核白血球細胞はβ−細胞リンパ球、単球及びヌル細胞
である。

米国特許第、ｉ、　３７６，８２１号には、ヒト末梢血
を緩衝化された塩化アンモニウム溶液で処理して材料全
溶解（ｌｙｓｅ）する方法が記載されている。

今ヤ、バフィーコート材料が塩化アンモニウム溶液によ
り前処理されていなければ、好ましい誘発剤を使用した
場合、ヒト１ＦＮ−γの収量が５倍に才で改良されるこ
とが見出された。好ましい態様においては、バフィーコ
ート材料をこの発明の調節−誘発法において直接使用す
る。

バフィーコート材料を、細胞懸濁液１ｍｌに対して約１
．０Ｘ１０’〜約９．０Ｘ１０’の白血球細胞の濃度範
囲で、培地に懸濁する。最適濃度範囲は約４．０×１０
６〜約７．０Ｘ１０６細胞／Ｍである。好ましい濃度は
５．０Ｘ１０’細胞／ｒｎ／Ｖである。特に好ましいこ
とが見出された商業的に入手し得る培地は、ギブコラボ
ラトリーズ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　
ｒグランドアイランド、ニー−ヨークから入手できるＲ
ＰＭＩ　１６４０　であり、そして好ましい誘発剤を使
用する場合はメロイラ？ラドリーズ（ＭＯＩＯｙＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、スプリングフィールド、パー
ジニアから入手できるドウルペコの最少必須培地（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａ
ｌ　Ｍｅｄｉａ＋ＤＭＥＭ）　である。

ある場合には、細菌の増殖による汚染を防止するために
、バフィーコートを懸濁する前に培地に抗生物質を加え
るのが好ましい。広スペクトル抗生物質例えば培地１Ｍ
中１００ユニットのペニシリン、１００μｇのストレプ
トマイシン、又は１００μｙのゼンタマイシンを使用す
ることができる。培地に抗生物質を含有せしめることに
より細菌の増殖が阻止されるが、これらを抽出されたイ
ンターフェロン生成物から除去しなければならないと言
う意味において、抗生物質自体が汚染物である。痕跡量
の抗生物質であっても、それがインターフェロン生成物
から完全に除去されていなければ、感受性の患者に投与
された場合にアレルギー反応を惹起するであろう。

メゼライン及び１２．１３−フォルＰ−ルジブチレート
から成る群から選ばれた調節剤を、懸濁されたバフィー
コート材料を含有する培養液に加える。これらの調節剤
は、ＣＣＲ社、エデンプレーリー、ミネソタから商業的
に入手できる。調節剤は、細胞懸濁液ｍｌ当り約０．７
ｎ９の最小数において加えることができる。調節剤の最
適濃度においてＩＦＮ−γの収量は一定となるから、上
限は臨界的ではない様である。異る製造又はパッチ間で
調節剤の最適濃度にノ々ラツキが存在するが、これは各
パッチにおける調節剤の純度レベルに基くようである。

調節剤の純度が高い程、ＩＦＮ−γの最高収量を得るた
めに必要な調節剤の量は少なくなる。調節剤の特定のパ
ッチについて、調節剤の最適使用針は、好ましくは検量
線図を作成することによって決定する。例えば、例４及
び第３図を参照のこと。

これは、メゼラインの濃度変化に対するドーズレスポン
スをこの誘発剤の濃度の関数としてプロットすることに
よシ実施することができる。細胞懸濁液に含有せしめる
べき調節剤の最ｉｎ量はドーズレスポンス曲線の平坦部
（例えば第３図中破線Ａ−Ｂ部分）の最初の点の領域に
存在する。２つの別々のパッチのメゼラインについて作
成した検量線図に基いて、ＩＦＮ−γの最適量を誘発す
るメゼラインの最小濃度は７ｒＪ／ｍｌ〜３０Ｊ／―の
間で変化する。Ａ−３２１８７の最適調節のために必要
なメゼラインの濃度はバッチごとに変化することが見出
されたが、ＩＦＮ−γの生産速度及びＡ−３２１８７の
ドーズレスポンス曲線は変化しない。

以下余白 米国特許第４，３７６，８２１号は、末梢血白血球を含
有する培地へのカルシウムイオノフオーレＡ−２３１８
７及び調節剤の導入について記載している。

細胞懸濁液−当りＡ−２３１８７の量は０１〜１００μ
ｂ４らそして好ましくは０．１０〜２．０μｐ／ｍｅの
範囲であった。その後、混合物を約１２時間〜約７日間
約３７℃において、培養物（スピン培養物）を約１０　
ｒｐｍの速度で攪拌しながらインキ−ベートした。スピ
ン培養懸濁物を空気／ＣＯ２被覆のもとに保持した。空
気／Ｃ０２被覆は、ミクロン孔サイズのエアーストーン
（ａｉｒ　５ｔｏｎｅ　）を通してＣＯ２を懸濁液中に
供給して気体を攪拌することによって保持することがで
きる。こうして約５喉の均一なＣＯ２混合物が全期間に
わたって保持された。

Ａ−２３１８７ｒｔ、インキュベーション期間中静置培
養条件のもとで細胞懸濁液ｄ当り０．１５〜０８μｙの
好ましい比率範囲において非常に効果的に使用されるこ
とが見出された。好ましくは、０．２５〜０，６μｇΔ
の量のＡ−２３１８７が使用される。この範囲内におい
て、静置培養は、培養物を攪拌した場合に比べて２〜３
倍高いＩＦＮ−γの収量をもたらす場合がある。

インキュベーション温度は、およそ体温、すなわち３７
℃に保持すべきである。この温度は細胞が生存する範囲
で変えることができ、そして生存範囲内において温度と
インキーベーション時間との間に関連があり、温度が高
くなるに従って、必要なインキュベーション時間は短縮
されるようでアル。インキュベーションの約１２時間後
にＩＦＮ−γの誘導が観察され、そしてインキュベーシ
ョンは細胞がもはや生存しなくなるまで、約１２日間ま
で続ける。時間当り最高の収量を得るためには、好まし
いインキーベーション時間は３〜４日である。

約２０〜４０時間の間に最初の生産期間が存在すること
が観察された。これに続いて活性の喪失が生じ、そして
次に第２の生産期間が続く。

静置培養インキュベーション及び一層少ない好ましい比
率のＡ−２３１８７によ５　ＩＦ’Ｎ−γの非常に改良
された収量が得られるのは、細胞懸濁液をインキュベー
ション期間に攪拌する場合に生ずる連続的な不規則な細
胞接触よりむしろ、静置インキュベーション期間を通し
ての隣接する細胞の直接的細胞接触のためであると考え
られる。ともかく、３倍までの収量増加が場合によって
は観察される。

収量の増加に加えて、静置培養インキュベーション法に
おいてはさらに、同じ比率のＩＦＮ−γを得るために、
スピン培養インキュベーション法において使用される大
きなバッチに比べて相当に小さいパッチでよい。従って
、ＩＦＮ−γと共存する汚染物の量が有意に減少する。

さらに、少ないＡ−３２１８７を使用することにより有
意なコストの低下が得られる。従って、全体的な収］″
を減少せしめることなく、従来法の効率が実質上改良さ
れる。

Ａ−２３１８７は単独で、かろうじて検出できる一叶の
ヒ）−ＩＦＮ−γを生産するように細胞を誘発するであ
ろう。十分には理解されていない機構により、調節剤の
添加がＡ−２３１８７ＶＣ応答することができる細胞の
数を増加し、そしてこれによｔ）　ＩＰ’Ｎ−ｒの収量
を増強するようである。例えば、Ｄｉａｎｚａｎｉ等の
報告（カルシウムイオノフォーレＡ−２３１８７が調節
剤無しに使用される）の追試において、１０〜１００ユ
ニット／−の抗ウィルス活性が測定されたに過ぎない。

これに対して、メゼラインと誘発剤との組合わせは一貫
して、増加した量のＩＦＮ−γを生産するように細胞を
誘発した。特に、メゼ２インは、Ａ−２３１８７との組
合わせにおいて、−当Ｈｏｏ、ｏｏｏユニット及びこれ
以上のユニットまでの範囲の■厨−γを生産するであろ
う。特定の実験において、−当りｓｏ、ｏｏｏユニット
及びこれより高いユニットまでの収量が得られている。

実際的且つ効果的な誘発剤である他のカルシウムイオノ
フォーレは２．２−ジメチル−６，６，７，７゜８．８
．８−ヘプタフルオロ−３，５−オクタンジオン（ＦＯ
Ｄ　）である。これはアルドリッチケミカルカンパ＝　
−（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　、Ｃｏｍｐａ
ｎｙ、カタログＡ１７，５１６−１）から商業的に入手
できる。ＦＯＤは生物学的系に対するその効果において
カルシウムイオノフォーレＡ−２３１８７と非常に類似
しているととが証明された。（ＪＡＳｙｎｔｈｅｔｊｃ
　ＩｏｎｏｐｈａｒｅＳｙｓｔｅｍｓ　Ｊ　ＩＧｏｍｐ
ｅｒｔｓ等＋　１１７　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　＋５５９−５６２頁、１９８１゜） イオノマイシンもまた効果的なＩＦＮ−ｒ誘発剤である
。これは、スクイブ（５ｑｕｉｂｂ）社から得られるカ
ルシウムイオノフォーレである。

ＦＯＤをＩＦＮ−γ生産の誘発剤として細胞懸濁液当り
３０〜３００μｇ／−の範囲で使用して実験を行った。

ＦＯＤをＡ−２３１８７よりも１００−１，０００倍高
い濃度で添加したが、ＦＯＤが高濃度に必要なのはそれ
がミセル状態にあるためであると信じられる。ＦＯＤを
そのモノマー状態（非ミセル状態）に小形化することが
でき、そして非細胞毒性であるＦＯＤ用溶剤を使用する
ことによって、これら２種類のカルシウムイオノフォー
レ間の鎧度差が除去されるであろう。このような溶剤の
存在下では、ＦＯＤの最低濃度比率は細胞懸濁液当り１
０μＩと低いであろう。ＦＯＤは冒価ではなく、そして
多量に容易に入手できるから、これを高濃度で使用する
ことは実際上問題ではない。

調節剤及びカルシウムイオノフォーレ誘発剤を細胞懸濁
液に導入する順序は重要ではない。これらは任意の順序
で、又は同時に加えることができる。しかしながら、誘
発剤が蛋白質である場合、調節剤の約２時間後に加える
べきである。

栄養源、例えば蛋白質源、例えば牛胎児血清又は牛血溝
をｉ胞の生存を維持するのに十分な量において細胞懸濁
液に加えた場合、ＩＦＮ−γの収量がさらに増加するこ
とが見出された。この量は最終濃度において約３係〜約
１５％であシ、好ましくは約３％〜１０％（いずれも細
胞懸濁液に対する血清の容針／容量係）である。細胞懸
濁液を上記の体温において２〜６、時間条件調節した後
に上記の栄養源を加えるのが好ましい。

細胞がインキーベーション中生存していることがこの発
明のために必須である。

培養容器に導入すべき細胞懸濁液の適当な量は特定の容
器の容積に応じて、適当容量の空％／ＣＯ２が細胞懸濁
液と接触してインキュペーショｙ期間にわたって生存を
維持するように決定する。ＣＯ２及び細胞懸濁液の他の
揮発性代謝物の動的交換が、懸濁培地と空間との間で達
成され得るよ−）１条件を用いなければならない。適切
には、比較的浅い装置を用いて、ディープトレイにおい
ては液深を約３＃とじ、又はＩＩＪ織培養管においては
５〜１０喘として、インキュベーション中静置培養を行
い、こうすることによって大きな表面積対体積の比率を
得る。

細胞が生存を続ける…においてインキュベージせン期間
を開始するのが好ましい。例えば、培養物を約７．０〜
７．９、好ましくは約７．２〜７．４のＰＨにまず緩衝
化する。

細胞培養懸濁液を、所望量の粗工厨−γが生成するのに
十分な時間インキュベートした後、例えば、培養物の容
量に依存して１０００〜３０００Ｘｇにおいて、必要な
時間、例えば１０〜６０分間、４℃にて遠心分離するこ
とにより、細胞を上滑液から分離する。粗細胞懸濁液か
ら得られる粗ＩＦＮ−γの収量は、細胞懸濁液当ジ４０
０，０００ユニ、ット及びそれよ、！１）−ｉ％いユニ
ットまでである。残ったａ胞は、ＩＦＮ−γの生産を再
誘導するため、もしくはＩＦＮ−γｍＲＮＡを回収する
ため、又はこの両方のために使用することができる。粗
ＩＦＮ−γを含有する上清液ば４℃にて貯蔵することが
できる。

粗■厨−γのための部分的精製方法は、ｒＰａｒｔｉａ
ｌＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ（ｉｍｍｕｎｅ
）　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｊ　、Ｙｉｐ等＋　７８　
Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　Ａ３　、１６０
１−０５　、　（１９８］　）に記載されている。

ＩＦＮ−γを精製する方法は第２９３，７７６号に記載
されている。一般に、粗ＩＦＮ−γを４つのカラムに通
すことから成る。１つのカラムは調節された細孔のガラ
スピースを収容する。粗ＩＦＮ−ｒはこのカラムに吸着
され、そして硫酸アンモニウムにより溶出される。第２
のカラムはコンカナバリンＡ−セファロース、レンズ豆
レクチンーセファロース、又はエントウ豆レクチンーア
ガロースのいずれかを収容する。ＩＦＮ−γはこのカラ
ムに汲置され、そして糖含有緩衝液により溶出される。

第３のカラムはヘノ臂リンーセファロース、又はプロシ
アンレッド−アガロースを含有する。ＩＦ’Ｎ−ｒはこ
のカラムに吸着され、そして塩緩衝液により溶出される
。

最後のカラムは高塩儂度において平衡化されたケ９ルｐ
過カラムである。

さらに詳しくは、粗ＩＦＮ−γをクロマトグラフ用カラ
ム中の調節された細孔を有するガラスピーズに、中性Ｐ
Ｈの緩衝液、例えば約７．２のＰＨの燐酸緩衝化塩溶液
の存在下で粗ＩＦＮ−γがビーズに平衡的に吸着される
のに十分な時間にわたって、接触せしめる。粗工厨−γ
が赤血球を含む細胞懸濁液から生産された場合には、粗
ＩＦＮ−γをＣＰＧビーズに接触せしめる前に、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンを加えて５００ｍＭ
の濃度としそしてｐＨ９，５〜９．７に緩衝化する。次
にガラスピーズを、化学的に適合性の緩衝液、例えばト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを５００７の濃
度で含有し、そして約９５の−に緩衝化された水溶液で
洗浄して非結合汚染物を、溶出液の２８０　ｎｍにおけ
る光学濃度が約Ｏになるまで除去する。次に、１厨−γ
を吸着して担持するガラスピーズを中性…の緩衝液によ
り、２８０　ｎｍにおける光学濃度が約０になるまで洗
浄し、そして次に、吸着されているＩＦＮ−γを、ＰＨ
約９．０の２Ｍ硫酸アンモニウム水溶液によりガラスピ
ーズから溶出する。場合によっては、上記の一調整段階
を、赤血球の存否にかかわらず粗ＩＦＮ−ｒに適用する
。

次ニ、この溶出液を、コンカナバリンＡ−セファロース
、レンズ豆しクチシーセファロース及ヒエンドウ豆レク
チン−アガロースから成る群から選ばれた吸着剤を充填
したカラムに、中性ＰＨの緩衝液、例えば燐酸緩衝化塩
溶液の存在下で■耐−γが吸着剤に平衡的に吸着するの
に十分な時間にわたって通す。ＩＦＮ−γを吸着して担
持する吸着剤を硫酸アンモニウムにより、溶出液の２８
０　ｎｍにおける光学濃度が約Ｏになるまで洗浄する。

次に吸着剤を燐酸緩衝化塩溶液により、溶出液の２８０
ｎｍにおける光学濃度が約０になるまで洗浄する。

次に、吸着された。ＩＦＮ−γの溶出を、０．１〜２．
０Ｍのα−メチルＤ−マンノシド又は１−メチルＤ−グ
ルコシドを含有する燐酸緩衝化塩溶液を用いて行う。

（ｆｉｇ、ＩＦＮ−γ溶出液をヘパリン−セファロース
又はプロシアンレッド−アガロースと接触せしめ、そし
て中性−の緩衝溶液中で洗浄する。ＩＦＮ−γを、ＩＭ
α、−メチルＤ−マンノシド又は１−メチルＤ−グルコ
シドを含有する中性ＰＨの緩衝溶液、例えばＰＢＳを用
いて洗浄し、溶出液の２８０　ｎｍ　ＶＣおける光学濃
度が約０になるまで非結合物質を除去する。再び、吸着
剤を中性ＰＨの緩衝液により、光学濃度が約０になるま
で洗浄して結合物質の幾らかを除去する。吸着されたＩ
ＦＮ−γを、高濃度の塩を含有する第２の中性−の緩衝
液により溶出する。

ＩＦＮ−γをこれら３種類のカラムに任意の順序で吸着
せしめ、そして溶出することができる。

ＩＦＮ−γは、溶出画分を高濃度の塩を含有する中性Ｐ
Ｈの緩衝液により平衡化したケ゛ルによυグルｐ過し、
そして次に同じ平衡緩衝液で溶出することにより、さら
に精製することができる。溶出液中の溶解物はその分子
量に従って分離することができる。

ｒルー過カラムから得られた溶出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析したところ、４バンドが示された。これらは
、約２０，０００ドルトン、２５，０００ドルトン、４
７．０００ドルトン、及び６３，０００ドルトンである
。

分子量の測定は、およそ±３．Ｏ’００ドルトンの精度
である。各バンドのアミノ酸分析によｐ１２５．０００
〜６３，０００ドルトンのバンドは実質上同一のアミノ
酸含量を有し、そして４７，０００バンド及び６３，０
００バンドは倍化物、すなわち２５，０００バンドの二
量体が二量体であることが示唆された。

２５．０００〜６３，０００ドルトンのバンドは均質な
スペーシス■暉Ｊ−７−、である。生物学的活性測定は
、２５．０００ドルトン及び４７，０００ドルトンのバ
ンドはＩＦＮ−γ活性を有することを示した。６３，０
００ドルトンバンドＩＦＮ−γは生物学的活性を有する
であろうが、これはまだ確認されていない。

２０．０００ドルトンバンドのアミノ酸分析によりコレ
力２５，０００〜３６，０００ドルトンのバンドと異る
ことが示唆されたから、２０，０００ドルトンバンドは
均質なスペーシスＩＦＮ−γ２である。

上記の方法に代えて、ＩＦＮ−γは米国特許出願第４３
７．６６０（１９８２年１０月２９日出願）Ｉｃ記載さ
れており、この記載を引用によりこの明細摺に組み入れ
る。この方法は下記の例９において櫃略を記載する。

いずれかの方法によって調製された均質なＩＦＮ−γは
、物理化学的構造研究、抗体生産、及び臨床的用途のた
めに特に有用である。

細胞懸濁液を３日間までインキュベートしたＱ２、細胞
からｍｌ’ｊＮＡを抽出することができる。３日後から
酵素がｍＲＮＡを消化すると信じられる。まず、細胞を
溶解（１ｙｓｅ　）　Ｌ、そして大形の汚染物を除去す
る。例えば、細胞を遠心分メ１ｆにより分離し、そして
次に酢酸ナトリウム及びＳＤＳにより、又ｄグアニジン
チオシアネート溶液中で溶解する。大形のＤＮＡ鎖及び
蛋白質をフェノール抽出によｐｌ又は硝酸セルロースチ
ー−プ中の塩化セシウム中で遠心分離することにより除
去する。残留するｍＲＮＡ　Ａレッドをエタノール中で
沈澱せしめ、そして塩溶液中に再懸濁する。さら［ＤＮ
Ａ及びｒＲＮＡを除去するために、ポリ（財）−セファ
ロースを収容するカラムに結合せしめ、そして緩衝液で
洗浄する。ｍＲＮＡをホルムアミドで溶出し、そしてシ
ュークロースグラジェント上でサイズ画分する。画分か
らのサンプルを、ＩＦＮ−γｍＲＮＡを翻訳することが
できる細胞、例えばキセノシス・レービス（Ｘｅｎｏｐ
ｕｓ　１ａｅｖｉｓ）の卵母細胞に注射する。この卵母
細胞をＩＦＮ−γを生産するのに十分な時装置いた後、
ＩＦＮ−γ活性を測定する。ＲＮＡ当り最も高いＩＦＮ
−γに対応する画分をクローニングのために選択する。

次に、高ＩＦＮ−γ活性を含有する両分を逆転写酵素に
加える。この酵素はｍＲＮＡコードを読み取り、そして
単鎖相補的ＤＮＡを逆転写する。逆転写酵素又はＤＮＡ
ポリメラーゼを加えて二重鎖ＤＮＡを完成する。この方
法に代えて、ＩＦＮ−γｍＲＮＡの分離を例８に記載す
るようにして行うことができる。

この二重鎖ＤＮＡを、一般的遺伝子工学的／組換ＤＮＡ
技法、例えば要約に記載した方法によシ、宿主、例えば
細菌Ｅ、コリに入れることができる。

次に、この発明の好ましい態様を例によって説明する。

例１　粗ＩＦＮ−γの製造：赤血球の除去；スピン培養
バフィーコート中の赤血球を、７容積の０８３重量／容
量チ緩衝化塩化アンモニウムを用いて溶解し、そしてす
ぐに約２５Ｘｇにて２０分間遠心分離して溶解した赤血
球を、白血球含有バフィーコートから分離した。白血球
を、ＤＭＦ：、Ｍ培地（メロイ）中に約５．０Ｘ１０　
細胞／ｍｌに懸濁した。

最終濃度が細胞懸濁液ｄ当り約７ｒ１ｇのメゼライン（
調節剤）、及び最終濃度が細胞懸濁液ｍｌ当ジ約２．０
μｙのカルシウムイオンフォーレＡ−２３１８７を、白
血球及び培地と混合して細胞懸濁液を形成した。この細
胞懸濁液を３７℃にて２時間条件調節した。次に、牛胎
児血清を培養物中の濃度が１０％になるように加えた。

この培養物を、穏和に攪拌された容器中で３７°Ｃにて
７２時間インキュベートシタ。インキュベーション後、
培養物（粗ＩＦＮ−γ）を、２６２０Ｘｇ。

４℃、２０分間の遠心分離によシ採取した。組ＩＦＮ−
γを含有する上清液を細胞及び粒状物から分離した。

７ｎｇ／ｍｌ濃度のメゼラインにより調節された種種の
Ａ−２３１８７濃度の関数として、ヒト白血球からのＩ
ＦＮ−γの生産を、ドーズレスポンスデータとして第１
表に示す。ＣＣＲ社から入手した単一バッチからメゼラ
インを使用した。ＩＦＮ−γは静置インキュベーション
条件のもとで調製した（例４参照のこと）。

第１表 ０．０１　３０ ０．０５　３０ ０．１０　３０ ０．１５　１２００ ０．２０　３６０ ０．２５　７２０ ０．５０　７２０ １．０　１２０ この特定のバッチのメゼラインについては、０．１５〜
１．０μＩ肩のＡ−２３１８７においてＩＦＮ−γの最
適収量が存在した。

第１表中のＩＦＮ−γの力価は、ＷＩＳＩ（細胞を指示
細胞として使用し、そして水庖性ロ内炎つィルス（ＵＳ
Ｖ　）を攻撃ウィルスとして使用するセミ−ミクロｅ、
　ｐ、　ｅ−阻止測定法により測定した。攻撃ウィルス
として脳心筋炎ウィルス（ＥＭｃ　）を使用した場合、
ＩＦＮ−γの有意に高い力価が測定された（例５参照の
こと）。ＥＭＣはＩＦＮ−γの抗ウィルス作用に対して
一層敏感である。

メゼラインで調節されそしてＡ−２３１８７で誘発され
たヒ）　ＩＦＮ−γ生産と、最適濃度のスタフィロコッ
カスエンテロトキシンＡ　（ＳＥＡ　）　、フイトヘマ
グリチニシーｐ　（ＰＨＡ−Ｐ　）　及びコンカナノぐ
リンＡ　（ＣｏｎＡ）によシ誘発され、調節を伴わない
ＩＦＮ−γ生産とを比較した。白血球培養物（５×１０
６細胞／ｒｎｌＤＭＥＭ培地）において、ＳＥＡ、　Ｐ
ＨＡ−Ｐ及びＣｏｎ　Ａに比べて、調節されたＡ−２３
１８７は、それぞれ２〜４．５〜１０、及び１０〜２０
倍多くのＩＩへ−γを誘発した。

例１，２、及び３の検出し得るインターフェロンの実質
上すべてがＩＦＮ−γであった。ＰＨ２におけるｌ理に
より、１時間に９９係の活性が喪失した。

これに対して、対照であるヒ）　ＩＦＮ−αはわずかに
影響を受けたに過ぎない。

ＩＦＮ−αに対する抗体ｕＩＦＮ−γにほとんど作用し
ないが、この抗体はＩＦＮ−αの抗ウィルス作用を元金
に中和した。さらに、工じＪ−γは牛の細胞に対しては
不活性であり、そしてヒ）　ＩＦＮ−αと比較した場合
、異るクロマトグラフプロフィールを示した。

例４　粗工厨−γの創造；バフィーコート；静置培養約
１００７の全血を、静脈穿刺により、健康な給血者（ヒ
ト）から、酸−クエン酸塩−デキストロース溶液に採取
した。全血を遠心分離し、そして血清画分を除去した。

バフィーコート材料を、ＤＭＥＭ培地（メロイ）中に、
約５．０×１０６白血球細胞／ｙｄに懸濁した。

Ａ−２３１８７及びメゼラインのストック溶液を、それ
ぞれ５ｏｍｙ／ｍｌ、及び１ｍν盲の濃度でＤＭＳＯ中
に調製した。次にワーキング溶液をＤＭＳ　Ｏ中に８製
した。最終濃度約７０　ｎｇ／ｉ培養物のメゼライン、
及び最終濃度約０．５μ９／ｍｅ培養物のＡ−２３１８
７を、白血球及び培地に加えて細胞懸濁液を形成した。

この例においては、例１，２、及び３において使用した
のと異るバッチのメゼラインを使用した。１０　ｎｌｌ
／＋艷間隔で１０ｎむ旬〜１００ｎ、Ｆ／ｆｎｌのメゼ
ライン、及び０．０５　ｔｉｌｌ／ｍＡ　〜２μＩＡの
範囲で変化する濃度のＡ−２３１８７を用いて検量線図
を作成した後、このバッチのメゼシインの最適濃度は３
０　ｒＪｙ賃細胞懸濁液であると決定した０３０ｎむ賃
はドーズレスポンス曲線（すなわち第３図中破線部分Ａ
−Ｂ）の平坦部の最初の点に相当する。単に安全のため
７０μ９　／ｍｌを使用した。

７０Ｉ７讐のメゼラインにおけるＡ−２３１８７のドー
ズレスポンス曲線を第２図に示す。０．５μに毎のＡ−
２３１８７におけるメゼラインのドーズレスポンス曲線
を第３図に示す。平坦部は、ＩＦＮ−ｒの最初の有意な
生産に対応する点から出発してドーズレスポンス点の平
均により決定する。

このケースにおいては、この点は約３２ＸＩＯ３ユニツ
トのＩＦＮ−γ活性を示した。

次に、培養物を組織培養チューブに注入し、培養物の深
さを約１０−とし、そして３７°Ｃにて２時間条件調節
した。次に牛胎児血清を、細胞懸濁液中での濃度が１０
％になるまで加えた。次に、細胞懸濁液を３７℃にて３
日間、静置条件下、５１　Ｃｏ２を含有する空気／ＣＯ
２被覆のもとてインキ−ベートした。インキーベーショ
ン期間の終点において、培養物（粗ＩＦＮ−γ）を、１
１０００Ｘ、４０℃にて６０分間遠心分離することによ
υ採取した。

粗ＩＦＮ−γを含有する上清液を細胞及び粒状物力）ら
分離した。

例５　粗ＩＦＮ−γの収量 例４のＩＦＮ−γのサンプルを、指示細胞としてＷＩＳ
Ｈ細胞を用いそして攻撃ウィルスとして月図ノヒ筋炎ウ
ィルス（ＭＭＣ）を用いるセミーミクロｅ、ｐ、ｅ阻止
測定法によシカ価検定した。ＩＦＮ−γは約３０×１０
３〜４０　Ｘ　１−０３ユニット／−であった。

この系において検出し得るインターフェロンの実質上す
べてがＩＦＮ−γであった。ｐＨ２における処理により
１時間に９９％の活性が喪失したが、対照であるヒ）　
ＩＦＮ−αはわずかに影響を受けたのみであった。ＩＦ
Ｎ−αに対する抗体はＩＦＮ−γに対してほとんど作用
なかったが、この抗体はＩＦＮ−αの抗ウイルス効果を
元金に中和した。さらに、ＩＦＮ−７’は牛の細胞に対
して不活性であり、そしてヒトＩＦＮ−αと比較した場
合異るクロマトグラフプロフィールを示した。

例４の方法、及び攻撃ウィルスとしてＥＭＣを用いる場
合、ＩＦＮ−γ力価は約８０００ユニット／−〜約４０
０，０００ユニット／−及びそれより高いと予想され、
そして約ｓ、ｏｏｏユニ、ット／―〜約ｓｏ、ｏｏ。

ユニット／艷及びそれより高かった。

次の溶液を調製した。５００ｒｒＬＭトリス（ヒト９０
キシメチル）アミノメタン（ｐＨ９，６）を１２ＨＣ１
によ５　ｐＨ９，５にしたもの（Ｔｒｉｓと称する）；
２Ｍ硫酸アンモニウム溶液ｐＨ９，０（ＮＨ４ＯＨによ
ジ調製）：中性−の燐酸緩衝化塩溶液（ＰＨ７，２，１
（ＰＢＳ）　。

（ＩＭα−メチルＤ−マンノシドを含有する）；及び燐
酸緩衝化塩溶液（ｐＨ７，２）　（ＰＢｓ）　、（２Ｍ
塩化ナトリウムを含有する）。

次のカラムを調製した。調節された細孔を有する〃ラス
ビーズ（ＣＰＧ　）を収容した２、６６ｎｌＸ３０σの
クロマトグラフカラム（ベッドボリウム約１６０ｍ１Ｖ
）：コンカナバリンＡ−セファロース（Ｃｏｎ　Ａ　）
を収容した１、６ｃ／ＩＬＸ１６ｃｍのクロマトグラフ
カラム（ベッドポリウム約３２ｍＡ）；及びヘパリン−
セファロースを収容した１６ｃｒｒＬ×８ｃｒｒＬのク
ロマトグラフカラム（ベッドボリウム約１６７）。これ
らの３種類のカラムは燐酸緩衝化塩溶液により平衡化し
た。遠心分離した粗ＩＦＮ−γの溶液を粉末状Ｔｒｉｓ
を用いて５　ｍＭとし、１２ＮＨＣｊによシＰＨを９．
５に調整し、そして再度遠心分離した。調整された粗Ｉ
ＦＮ−γを、約５００ｍ１／時の流速（約９４　ｍｅ／
ｃｍ”７時）でＣＰＧカラムに負荷した。

カラムを２．　ＯＡＵにおいてＵＶモニターにより監視
し、そして非結合物質をビーカーに集めた。ＣＰＧカラ
ムを、光学濃度（ＯＤ２８ｏ）がＯになるまで５００ｍ
ＭＴｒｉｓ　（ｐＨ９，５）により洗浄した。カラムを
２０ＡＵにおいて監視し、そして非結合物質を集めた。

カラムを、０Ｄ２８ｏがベースラインに戻るまで洗浄し
た（流速８０−７時にて一夜）。溶出した物質ヲ第２　
ｏ　ビーカーに集めた。ＣＰＧカラム’ｔｒ：　２　Ｍ
　ｆＡｉ酸ナトリウム（ｐＨ９，０）により２４ｒｎｌ
／時の流速により溶出し、そして１０ｄずつの両分を犯
めた。

第２のピークがモニターに現われた時、ＣｏｎＡカラム
の入口をモニターの出口に連結し、そしてＣｏｎＡカラ
ムの出口をフラクションコレクターに連結した。ＣＰＧ
カラムを、２４ｍ１／時（１２ｍｌ、／ｃｉ／時でＣｏ
ｎ　Ａをジｍる）の速度でＣｏｎ　Ａカラムに溶出した
。カラムを、上記のようＶＣＯＤ２８ｏがベースライン
に達するまで監視した。

ＣＰＧカラムをモニターからはずし、そしてこのモニタ
ーをＣｏｎＡカラムに連結した。Ｃｏｎ　ＡカラムをＰ
ＢＳにより０Ｄ２８ｏがベースラインに戻るまで洗浄し
た。流速及び両分を上記のように監視した。

Ｈ／Ｓカラムの入口をモニターの出口に連結し、そして
Ｈ／Ｓの出口をフラクションコレクターに連結した。Ｃ
ｏｎ　ＡカラムをＰＢＳ糖溶液によ勺溶出した。

両分を上記のようにして０Ｄ２８ｏがベースラインに戻
るまで監視した。

Ｃ０ｎＡカラムをモニターから外し、そしてＨ／Ｓをモ
ニターに連結した。Ｈ／ＳカラムをＰＢＳにより０Ｄ２
８ｏがベースラインに戻るまで洗浄した０ル侶カラムを
、ＰＢＳ中２ＭＮａＣｔ（ｐＨ７２）により、０Ｄ２８
ｏがベースラインに戻るまで溶出した。流速を上記のよ
うにして監視し、３−ずつの両分を集めた。Ｈ／Ｓピー
ク画分を０Ｄ２８ｏにより集め、そしてプールした。

プールした材料を、２０ｍ／時の流速において重力によ
ρ（ベッドの高さの約８０係の頭圧）、第１　Ｐ−１０
０カラムの排液状態のベッドに負荷した。

サンプルを負荷した後、カラムの側部をＰＢＳ中２　Ｍ
　ＮａＣ１（ｐＨ７，２）により洗浄した。液流れを停
止し、そしてカラムの頭部にＰＢＳ中２ＭＮａＣｔを加
えた。次に液流を開始し、ＰＢＳ中２　Ｍ　ＮａＣ１（
ｐＨ７，２）を２４７！／時で流した。この系を０．５
　ＡＵにおいて監視し、そして１０ｍ１ずつの両分を集
めたＯ 第２表の結果は、前記の逐次的精製法により精製した場
合のヒ）ＩＦＮ−γの精製及び回収の程度を示す。

第２表 相生放物　３．７　３６００　ＮＡ　Ｉ８，４６　２．
４Ｐ−１００カラム− 画分１２３　６．２　９．５　８４　０．０２０　７．
９ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画法によれば、精製されたＩＦＮ
−γ標品ば４バンドに分かれる。これらのバンドは２０
．０００±３，０００　ドルトン、２５，０００±３０
００ドルトン、４７，０００±３，０００ドルトン、及
び６３．０．００±３０００ドルトンの分子量を有する
。

例６に示すような方法で調製された精製ＩＦＮ−ｒのサ
ンプルをデンチュアー（ｄｅｎｔｕｒｉｎｇ　）グル系
に通してＩＦＮ−ｒを複数のバンドに分離した。次にバ
ンドを切シ取シ、そして均質性について確認した。

これらのバンドをアミノ酸分析にかけた。

アミノ酸分析を、２０．０００ドルトンバンド、２つの
２５，０００ドルトンバンド（１つは２５，０００ドル
トンの分子量を有し、そして他方は２８，０００）１’
／ｌ／）ンの分子量を有する）、４５，０００ドルトン
バンド、及び６６．０００ドルトンバントニついて行っ
た。個々の蛋白質バンドをその個々のアミノ酸に加水分
解した。次に各バンドをダルハムアミノ酸アナライザー
（Ｄｕｒｈａｍ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄＡｎａｌｙｚｅ
ｒ　）に付した。このアナライザーはアミノ酸を分離し
、そして蛋白質描シのアミノ酸残基を定量的に測足する
。２５，０００，２８，０００　。

４５．０００．及び６６．０００バンドについてのアミ
ノ酸間のピークの相対的高さの比率は十分に類似してお
シ、そして、これらのバンドが同一の蛋白質を表わすこ
と、及び４５，０００ドルトンバンドが２．５，０００
ドルトンバンドの二量体であシ、そして６６．０００ド
ルトンバンドがその三量体であると結論された。

２０．０００　トルトンハント及び２５，０００ドルト
ンバンドのアミノ酸の相対的ピーク高さは十分に異って
おり、２０，０００ドルトンバンドはＩＦＮ−ｒの別の
スペーシスを代表することが結論さ扛た。

精製されたＩＦＮ−ｒは２種類の均質なスペーシス１す
なわちｙＮ−ｒｌ（分子ｚ２５．ｏｏｏドルトン、及び
その二量体及び三量体）、及び■ＦＮ−ｒ２（分子量約
２０．０６０ドルトン）から成ることが示される。

次の第３表は、ＩＦＮ−γ蛋白質分子当シのアミノ酸残
基数を示す。この表は各バンドのアミノ酸アナライザー
による分析の結果に基く。

シ、下余白 第３表 アスパラギン酸　２３．５　２９．０　７７　５５スレ
オニン　１７．７　９．７　３２ セリン　３０．７　２９．５　６８ グルタミン酸　３６．０　２９．７　８３　９３プロー
リン　５．４　７．７　−　２１グリシン　３８．３　
４２．４　１２７　１０６アラニン　２４．３　１７．
２　７１　６４バリン　１０．６　８．４　−　２フ インロイシン　２．８　５．２　−　１８０イシン　１
２．９　１９．４　２６　３８フエニルアラニン　５．
３　１６．０　２１　１５ヒスチジン　２．２　５　１
０ リジン　９．６　１５．６　３０　３０アルギニン　７
．６　２３．３　−　１９メチオニン　−５ システイン　− チロシン　− μ」　リΣ１血団譚ｑ分崖 例４の粗ＩＦ’Ｎ−γを含有する上清液を分離した後に
残った細胞をこの例において使用した。

細胞をフイコールヒパク（Ｆｉｃｏｌ　Ｈｙｐａｋｕｅ
）密度勾配中で遠心分離して生存リン・９球を分離した
。

リンパ球をその５〜１０倍容量の溶液（４，２Ｍグアニ
ジンチオシアナー）　、　２５　ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、ＰＨ７，０，０１１Ｍ２−メルカノトエタノール、
０．５係サルコシル及び０．１％消泡剤Ａ）に入れるこ
とによって溶解（１ｙ８ｅ）シた。次に、この溶液を超
音波プレンダーで１分間ホモジナイズしてＤＮＡ鎖を破
壊することによシ粘度を低下せしめた。この溶液１２縮
を、５Ｗ２７硝酸セルロース遠心チー−プ中の５．７Ｍ
塩化セシウム１５成の上に重層し、そして１５℃、２２
．００　Ｏｒｐｍにて７２時間遠心分離した。グアニジ
ニウムチオシアナート溶液を吸引除去した後、塩化セシ
ウム浴液をデカントし、残ったＲＮＡベレットを冷７０
％エタノール５００ＴＬ１３中ですすぎ過剰の塩を除去
した。

ｍＲＮＡを０．０１　Ｍ　Ｔｒｉａ−ＨＣｔ、　ｐＨ７
，４、０，００１ＭＥＤＴＡ溶液に溶解し、そして溶液
を７０係エタノールにすることによシー夜沈澱せしめた
。エタノールをデカント除去し、残ったＲＮＡペレット
を空気乾燥し、そして塩緩衝液に懸濁した。ｍＲＮＡを
ポリ側カラムに、１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　、　ｐＨ７
，４、３ｍＭＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，４、０，５％ＳＤ
Ｓ　、及び３００ｍＭＭａＣｔを含有する溶液中で通す
ことによｐ、ｍＲＮＡをカラムに吸着せしめた。非結合
ＲＮＡをカラムから洗浄除去した後、ｍＲＮＡ含有ポリ
（４）を、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，４、１
，０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　、　ｐＨ７，４。

及び７０％脱イオンホルムアミドを含有する５５℃〜６
５℃に保持された溶液中で、カラムから溶出した。ｍＲ
ＮＡを７０係エタノール中で２回ｆｆ［せしめ、そして
０．　ＯＩ　Ｍ　Ｔｒｉｍ−ＨＣｔ、　ｐ”１７．４　
ｅｏ、００１　Ｍ　ＥＤＴＡの溶液に溶解した。次に、
ｍＲＮＡを、５Ｗ４１０−ター中５〜２９．９チのシー
−クロースグラジェント上で２７．０００　ｒｐｍにて
１７時間遠心分離することによってサイズ画分した。

グラジェントから２９画分を採シ、そして選択さｌの卵
母細胞中でＩＦＮ−ｒを生産する能力について測定した
。

例８において採取した選択された画分のＩＦＮ−７ｍＲ
ＮＡ活性を次の第４表に示す。

第４表 両分１１　２，５６０　３．０ 画分１２　２４０　３．１ 画分１３　＞２．５６０（”）　＞　３．３（ａ）　ｍ
ＲＮＡは、ポリＣ）セファロース４Ｂカラムから溶出す
る物質に関する。

（ｂ）、試験した卵白細胞抽出液のすべての稀釈におい
て、ウィルス複製による細胞変性効果からの保護がもた
らされた。

形質転換体の造成及び分離 上記の◆１１画分から単鎖ｃＤＮＡを、鳥類骨髄芽球腫
症ウィルス逆転写酵素、及びｍＲＮＡに対して４倍重量
過剰のオリゴ（ｄＴ　）プライマーの存在下で転写した
。二重鎖ｃＤＮＡは、ｍ　ｓ　−ｃＤＮＡ鋳型から、逆
転写酵素を用いて転写した。ｄｓ−ｃＤＮＡ　ヲＳ　ｔ
　ヌクレアーゼとインキユベートスることにより平滑末
端を設げた。反応混合物は、最終反応容積１００μを中
１ｎｙのｄ　ｓ　−ｃＤＮＡに対して０．２Ｍ酢酸ナト
リウム、ｐ［（４，ｓ　、　０．４　Ｍ塩化ナトリウム
、２．５ｍＭ硫酸亜鉛及び１〜５ユニツトの８１ヌクレ
アーゼから成る。ｄ　８−　ｅＤＮＡを３７℃にて１時
間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱せしめ、そして８係ポリアクリル
アミドゲル上での電気泳動によるサイズ画分に付した。

３００　ｂｐ又はこれよシ長い反応生成物を溶出し、水
に対して透析し、そして凍結乾燥した。末端トランスフ
ェラーゼを用いて約３０のｄＣＭＰをｄ　ｓ　−ｃＤＮ
Ａの３′末端に付加した。同様の方法にょシ、約１５残
基のｄｃＭＰを、ＰａｔＩ制限酵素にょシあらかじめ切
断した。プラスミドｐＢＲ３２２に付加した・等モル量
のｄＣ−ティルトｄ　ｃ　−ｃＤＮＡ及びｄＧティルト
シラスミドを、１５０　ｍＭ　ＮａＣｔ、ＩＯｍＭＴｒ
ｉｌｌ−ＨＣｔ、　ＰＮ２７．６　、１　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ中で、１０μＥ／ｆｉｌｌの最終ＤＮＡ濃度において
アニーリングした。アニーリング混合物を７５℃に置き
、そして５時間かけて温度を０℃まで低下せしめた。塩
化カルシウムの存在下でＥ、コリＲＲＩの形質転換を行
なった。

テトラサイクリン上での増殖にょシ形質転換体を選択し
た。

鰐下余白。

ＩＦＮ−γｃ　ＤＮＡクローンについての形質転換体の
選択 形質転換体を、９６−ウェルミクロタイタープレートの
各ウェルに接種し、対数中期オで増殖せしめ、８％のジ
メチルスルホキシドに調整し、そして次に凍結ストック
として一７０℃に保持した。

形質転換体を、９６−先端接種装置を用いて二重ニトロ
セルロースフィルター上に増殖せしめることによシスク
リーニングした。

フィルターを、正常な又はＩＦＮ−γを誘発したヒトバ
フィーコート細胞から分離したｍＲＮＡから合成した　
Ｐ−フペル５ｓ−ｃＤＮＡとバイブリド形成せしめた。

次にフィルターを洗浄し、乾燥し、そしてオートラジオ
グラフ処理した。誘導されたｃＤＮＡと強いバイブリド
形成シグナルを示し、そして正常なｃ　ＤＮＡと弱いバ
イブリド形成シグナルを示すクローンをさらに分析する
ために選択した。

シラスミドＤＮＡを分離し、制限酵素ＰａｔＩで切断し
、そして切断断片を水平な１．５％アがロースグル中で
電気泳動することによシ分離した。大形のｄｓ−ｃＤＮ
Ａ　挿入部を含有するプラスミドをさらに分析するため
に選択した。

場合によっては、上記の差スクリーニング（ｄｉｆｆｅ
ｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）及びプラスミド
ＤＮＡ分離段階に続いて、ＩＦＮ−γｍＲＮＡ　′ｆｃ
コードするＤＮＡクローンを、陽性バイブリド形成選択
（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　５
ｅｌｅｃｔｉｏｎ）にょシ同定することができる。強い
差バイブリド形成シグナルを示すクローンからのＤＮＡ
ｔ−次のようにシテニトロセルロースフィルター上に固
定スル。

５〜１０μＪＪのＤＮＡ１、小容量（く１ｏｏμｌ）中
０．２　Ｎ　ＮＨ４ＯＨ及び２Ｍ　ＮａＣｔに調整し、
そして短時間１００℃に加熱しＤＮＡ　全完全に変性す
る。す＜’　Ｋ　ＤＮＡ−ｑニトロセルロースフィルタ
ーの小片にスポットする。このフィルターをまず空気乾
燥し、そして次に８０℃にて２時間加熱することによっ
てＤＮＡ’を共有結合的にフィルターに結合せしめる。

フィルターヲ小容量の７０　（ｖ／ｖ）％ホルムアミド
。

０．３Ｍ　ＮａＣ４１０ｍＭ　Ｈｅｐｅａ　（ｐＨ７，
５）　、　０．２％ＳＤＳ及び５　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で
、４７℃にて５分間インキーベートする。特異的ｃＤＮ
Ａクローノ′と１０〜２０μｙの非ラベルＩＦＮ−γｍ
ＲＮＡとのバイブリド形成ｔ、実質上同じ緩衝液中で４
７℃にて３時間行う。次に未反応ｍＲＮＡを、０．７５
ｍＭ　ＮａＣｔ、　７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（Ｐ
Ｈ７，４）、及び０．５％ｓＤｓノ溶液中で５回洗浄す
ることにょフ除去する。次に、ｃＤＮＡに相補的なｒｎ
ＲＮＡを、９０（φ）％ホルムアミ　ド　、　０，１　
％　ＳＤＳ　、１　０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ＰＨ７，５
）　、１ｍＭＥＤＴＡ　、及び特異的ｍＲＮＡの沈澱を
助けるための３３μｇ／ｍｌの担体ｔ　ＲＮＡ中で、４
７℃にて１ｏ分間ずつ２回続けてインキ−ベートするこ
とにょシ溶出する。ＲＮＡ　ｉ少なくとも２回エタノー
ルにょシ沈澱せしめ、そして試験管内翻訳系又は生体内
翻訳系において翻訳する。ＩＦＮ−ｒｎＲＮＡにょシコ
ードされた蛋白質上、ＩＦＮ−γに対する抗血清との免
疫沈澱により同定することができる。

候補ＩＦＮ−γグラスミドの同一性を確認するために、
ｄｔｚ　−ｃＤＮＡの部分的ヌクレオチド配列を決定す
る。ＤＮＡ挿入部ヲ３′−末端において３２Ｐ−コル゛
デシピンによってラベルし、そしてＤＮＡ配列分析に付
す。

ＩＦＮ−γの発現 細菌細胞中でのＩＦＮ−γの高レベル発現は、ｄｓ−ｃ
　ＤＮＡが、Ｅ、コリｔｒｐプロモーターーオペレータ
ー領域ン含有する一般化さバた発現ベクター中にクロー
ニングされた場合に得られる。他の発現ベクターには、
β−ラクタマーゼ遺遺伝子−合成リポゾーム結合部位が
挿入部れているｐＢＲ３２２ベクターが含まれる。

酵母におけるＩＦＮ−γの高レベル発現は、ｄｓ−ｃＤ
ＮＡが、２μプロモ一ター機能の制御下でＩＦＮ−γが
直接発現されるような、酵母２μサークル中の適当な部
位に挿入された場合に得られる。芒らに、ＩＦＮゴむ−
ｃ　ＤＮＡは、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現が抑制解除され
た酵母酵素、例えば酸ホスフェート遺伝子、ｐｈｏＥの
制御のもとで行われるように酵母）杭中に挿入される。

インターフェロン蛋白質の高レベルの発現は、この完全
な構成？！Ｉンエン複製酵母２μサークルに挿入するこ
とによシ得られる。

哨乳動物中でのＩＦＮ−γの発現は、ｄａ−ｃＤＮＡ挿
入部が、ＳＶ４０前期及び後期プロモーターの制御のも
とに置かれる場合に得られる。哺乳動物細胞に形質転換
（ｔｒａｎ＋５ｆｅｃｔ）　Ｌ／て適切な翻訳後修飾を
得るためには組換ＤＮＡか使用される。

仰」 この例は、本発明者の米国特許出願第４３７，６６０号
に記載されている方法に従りて精製さｆｌｆｃｌＦＮ−
γの分析を示す。簡単に記載すれば、次のようにして精
製を行った。遠心分離した粗免疫インターフェロンの溶
液を粉末状Ｔｒｉｇにょシ５００ｍＭに調整し、そして
１２　Ｎ　ＨＣｌによりｐＨを９．５に調整した。調整
された粗インターフェロンを、調節された細孔を有する
ガラスピーズ（ＣＰＧ）カラムに、５００７ｄ／時（９
４ｄ／副２／時）の流速で負荷した。カラムを２．　Ｏ
Ａ　Ｕにおいて監視し、そして非結合物質をビーカーに
集めた。ＣＰＧカラムを５００ｍＭＴｒｌ＠溶液（ｐＨ
９，５）によシ光学績度（ＯＤ２８０）がＯになるまで
洗浄した。カラムを２．　ＯＡ　Ｕにて監視し、そして
非結合物質ン集めた。カラムを燐酸緩衝化塩溶液（ＰＢ
Ｓ）にょＦ）　、０Ｄ２８０がベースラインに戻るまで
洗浄する（８９ｍ／時の流速にて一夜）。溶出された物
質を第２のビーカーに集める。ＣＰＧカラムを、２Ｍ硫
酸アンモニウム（ｐＨ９，０）を用いて、ＨｍＡ／時の
流速で溶出し、そしてｌ。

ｄづつの画分乞集めた。第２のピークが現れはじめたト
キ、コンカナバリンＡ−セファロース（ＣｏｎＡンカラ
ムの入口をモニターの出口に連結し、そしてＣｏｎ　Ａ
カラムの中口ｔフラクションコレクターに連結した。Ｃ
ＰＧカラムＶ、２４ｍｌ／時（１２ｒｎｌ／ｃｒｎ２／
時でＣｏｎＡを通過）の流速でＣｏｎＡカラムに溶出し
た。力２ムＺ前記のようにして監視し、そして０Ｄ２８
０がベースラインに達するまで、ｌ。

ｄずつの画分な集めた。

ＣＰＱ力２ムをモニターから外し、そしてモニターをＣ
ｏｎ　Ａカラムに連結した。Ｃｏｎ　ＡカラムをＰＢＳ
によＪ、０Ｄ２８０がベースラインに戻るまで洗浄した
。流速及び画分乞上記のように監視した。

２０ｍＭ燐酸緩衝液中で平衡化したヘパリンセファロー
ス（Ｈ／Ｓ）カラムの入口をモニターの出口に連結し、
そしてＨ／Ｓの出口を７ラクシヨンコレクターに連結し
た。ＣｏｎＡカラムをＰＢＳ＠溶液によシ溶出した。流
速及び両分を上記のように、０Ｄ２８０がベースライン
に戻るまで監視した。

ＣｏｎＡカラムをモニターから外し、そしてＨ／Ｓをモ
ニターに連結した。Ｈ／ＳカラムをＰＢＳによシ０Ｄ２
８０がベースラインに戻るまで洗浄した。次に力２ムを
、生理的濃度の塩化ナトリウムを含有する中性ＰＨの緩
衝液（ＰＢＳ）によシ、０Ｄ２８０がベースラインに戻
るまで洗浄した。流速及び両分を上記のように監視した
。ル４カラムをＰＢＳ（Ｐｔ（７，２）中２　Ｍ　Ｎａ
（Ｊによｌ）　０Ｄ２８０がベースラインに戻るまで溶
出した。流速を上記のようにして監視し、そして３ｍｌ
ずつの画分ン集めた。ＨＡピーク画分を０Ｄ２８Ｄによ
シ選択し、そして集め、プールした。

プールした物質Ｙ、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐ
Ｈ９，５）に対して２回、十分に透析した。次にこの物
質を、同じ緩衝液中で平衡化したカルボキシメチルアが
ロース（ＣＭ−Ａ）カラム上に負荷した。物質を負荷し
た後、カラムビ同じ緩衝液により０Ｄ２ａｏがベースラ
インに戻るまで洗浄した。次に、インターフェロンをカ
ラムから、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する２　０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ９，５）　Ｙ用いて上昇
法によシ溶出した。

プールした物質を、ＰＢＳ中２　Ｍ　ＮａＣｔにより平
衡化したＡｃＡ３４（９００ｍｌベッド？リウム）′ｆ
！０：含有する２本のダル沢過カラム（２６ｘ９４Ｃｒ
ｎ）の内諾１の排液状態のカラムに負荷し、そして重力
（ベッドの高さの８０％の頭圧）によｐ２Ｑｒｎｉ／時
の流速で直列に連結して溶出した。サンプルヶ負荷した
後、カラムの側部ｙ　ＰＢＳ中２　Ｍ　ＮａＣ６（ｐＨ
７，２）によシ洗浄した。液流乞停止し、カラムの上部
にＰＢＳを重層した。次に流れを開始し、そしてＰＢＳ
中２　Ｍ　ＮａＣ２（ＰＨ７，２）によ、９２４ｍＡ／
時で溶出した。系乞ｏ、　５　Ａ　Ｕにおいて監視し、
そして１０ＴＬｌの両分を集めた。第５表の結果は、上
記の逐次的精製法によシ精製した場合のヒト免投インタ
ーフェロンの精製及び回収の程度を示す。

以下余白 場合によっては最終溶出の後、工ＦＮ−γをさらに、Ｉ
ＦＮ−ｒ　ｂ：フェニル−セファロースに平衡的に吸着
するのに十分な時間にわたって、フェニル−セファロー
スと接触せしめ、そして吸着したｒｐＮ−＝低塩濃度緩
衝液にょシ溶出してさらに精製したＩＦＮ−７を得る。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離法において、精製ＩＦＮ−γは１
つの大バンドと幾つかの小バンドに分がれた。第４図は
、クマーシープルー染色ダルの５６０　ｎｍにおける走
査の結果を示す。ＩＦＮα、β、及びγに対するモノク
ローナル抗体な用いて次のことが決定でれた。

（１）　２６，０００±３，０００ドルトンに相当する
速度で移動する大バンド、及び２２，０００±３．００
０ドルトンに相当する速度で移動する小バンドはＩＦＮ
−γであり； （２）標品は約９０〜９２チの純度乞有しくすなわち、
実質上均質であシ）；そして （３）標品の比活性は約２．８ＸＩＯユニツト／〜であ
る。

高分子量バンドもＩ　ＦＮ−１のスペーシスを表わすで
あろうが、このことは確認されていない。２２Ｋ及び２
６にスペーシスに相当するパントン切ｐ取シ、そしてダ
ルハムアミノ酸アナライデーにおいてアミノ酸分析にか
けた。分析の結果を第６表に第６表 ＡＩＩＸ　２０　２０．４　２０．３ Ｔｈｒ　５　５．５　６．２ ３ｏｒ　１１　１２．０　１１．９ ＧＩＸ　１９　２０．４　２１．０ Ｐｒｏ　２　３．１　２．２ Ｇｌｙ　５　７．１　７．４ Ａｌａ　８　９．８　９．８ Ｃｙａ　２　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

Ｖａｌ　８　５．４　７．０ Ｍｅｔ　４　２．４　１．４ Ｉ　１　ｅ　７　６．２　５．７ Ｌｅｕ　１０　１３．２　１２．９ Ｔｙｒ　５　２．４　２．８ Ｐｈｅ　１０　７．５　８．９ Ｈ１ｇ　２　３．５　２．７ Ｌｙｓ　２０　１９．０　１８．Ｉ Ａｒｇ　７　４．６　４．８ Ｔｒ　ｐ　Ｉ　Ｎ　、Ｄ、　Ｎ　、Ｄ。

申二組成を知られているヌクレオチド配列から算出し、
セして１４３残基に調整した。

２種類の■厨−ｒスペーシス、すなわち２２，０００ド
ルトン及び２６．０００ドルトンのスペーシスヲ別個に
ＣＮＢ　ｒ分解にかけ、そして生成したポリペプチドを
、自動蛋白質シーケンサ−によシ部分的に配列決定した
。２２．０００ドルトン及び２６，０００ドルトンのス
ペーシスの部分配列を第７表に示し、そして同じ領域の
公表されているヌクレオチド配列からのアミノ酸と比較
する。

以下会印 例９の■厨−γの２２，０００及び２６，０００ドルト
ンのスペーシスは例７の２５，０００及び２８，０００
ドルトンのスペーシスに相当することに注意すべきであ
る。この相違はＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分析の方法に基くも
のであシ、このことは分子量パラメーターを説明する場
合にダル分析の方法を考慮する必要があることを強調し
ている。例７の場合には、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法を円筒ダ
ル中で行い、分子量マーカー蛋白質を同時にではあるが
別の円筒グル中で泳動せしめた。これに対して、例９に
おけるＩＦＮ−γの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析はスラブダル
系によシ行い、分子量マーカーは同一ダル内の平行チャ
ンネル中を激動せしめた。この後者の系がＩＦＮ−γに
ついての一層正確な分子量予測をもたらすことが知られ
る。

例７及び９に開示された組成分析間の相違は、例７にお
いては分析された物質のダル中に残留ＮＨ４＋が存在し
たが、例９のダルは十分に透析され、サンプルをアミノ
酸分析にかける前に過剰のＮＨ４±が除去さ九ていたこ
とに基く。過剰のＮＨ４はダルを形成するために用いる
ＮＨ４過硫酸触媒に由来する。明らかなように、塩基性
アミノ酸の分析は、ダル中の過剰ＮＨ４に基く差異に特
に敏感である。例７（過剰のＮＨ４の存在下）で示され
た結果、及び例９（過剰のＮＨ４＋が除去嘔れている）
で示された結果はいずれも再現性があるが、例９に示さ
れたデーターがよシ正確にＩＦＮ−γの真のアミノ酸結
果に関連しているようである。例７における２０，００
０ドルトンのスペーシスに相当するＩＦＮ−γのスペー
シスが例９に存在しないことは、例７においてγｌ及び
γ２と同定されたスペーシスは、異る組成ではなくむし
ろ実質上同じアミノ酸組成ケ有する２つの形を表し、２
つめスペーシス間で観察された組成の差は、同じ分析中
における過剰のＮＨ４の存在に基くこと乞信じさせる。

この発明の出願時において出願人が知っている最良の態
様を構成する好ましい具体例ン記載したが、この発明の
範囲を逸脱することなく種々の変法を行うことができよ
う。

【図面の簡単な説明】

第１−１図及び第１−２図はこの発明の方法のフローシ
ートであシ、第２図及び第３図は誘発剤及び調節剤のド
ーズレスポンス曲線であシ、第４図は電気泳動パターン
乞示す。 特許出願人 メロイ　ラボラトリーズ、インコーポレイティド特許出
願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士西舘和之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士西山雅也 （’ｌ至’／−１Ａτてρｙ）乙口丁乙−６（ｋ手続補
正書（自発） 昭和５９年１り月／ｆ−日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年　特許願　第１７８５７１号２、発明の名称 インターフェロン−γ及びその製造方法３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 名称　メロイ　ラボラトリーズ、　インコーホレイティ
ド４、代理人 （外、４　名） 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 （１）　明細書第３５頁第１０行目「第２９３，７７６
号」を「米国出願番号第２９３，７７５号」に補正する
。 （２）同第５３頁第２行目［デンチュアー（ｄｅｎｔｕ
ｒｉｎｇ　）　ゲル系」を「変性ゲル系（ドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）」に補
正する。 （３）同第５５頁第３表を次の様に補正する。 以下余白 第３表 アスパラギン酸　２３．５　２９．０　７７　５５グル
タミン酸　３６．０　２９．７　８３　９３プローリン
　５．４　７．７　−　２１グリシン　３８．３　４２
．４　１２７　１０６アラニン　２４．３　１７．２　
７１　６４バリン　１０．６　８．４　−　２フ イソロイシン　２．８　５．２　−　１８０イシン　１
２．９　１９．４　２６　３８フエニルアラニン　５．
３　１６．０　２１　１５ヒスチジン　２．２　−　５
　１０ リジン　９．６　１５．６　３０　３０アルギニン　７
．６　２３．３　−　１９メチオニン　−−−５ システイン　、−一一一 チロジン　−　−ｍ− トリプトファン　−−−− （４）同第６４頁第１４行目「酸ホスフェート」を「酸
性ホスファターゼ」に補正する。 （５）同第７２頁第６表中、最上段の見出しの記（６）
同第７２頁下から２行目「組成を知られ・・・」を「こ
の組成は、知られ・・・」に補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　インターフェロン−γの製造方法であって、少な
   くともインターフェロン−γの生産に十分な時間にわた
   って、白血球を含む生細胞、並びにインターフェロン−
   γの生産を刺激するのに十分な量のインターフェロン−
   γ生産誘発剤及び該誘発剤のためのメゼライン又は１２
   ．１３−フォルぎ一ルブチレートから選ばれた調節剤を
   含んで成る懸濁液をインキ−ベートし、この細胞懸濁液
   から上清液を分離し、そして （、）　調節された細孔を有するガラスピーズを収容す
   るカラムにインターフェロン−γを吸着せしめ、そして
   硫酸アンモニウムで溶出し；（ｂ）　段階（ａ）のイン
   ターフェロン−γ含有溶出液をコンカナバリン八−セフ
   ァロース、レンズ豆レクチンーセファロース又はエント
   ウ豆レクチンーアがロースを収容したカラムに吸着せし
   め、そして糖を含有する緩衝液によシ溶出し： （ｃ）　段階（ｂ）のインターフェロン−γ含有溶出液
   をヘノやリン−セファロース又はプロシアンレッド−ア
   ガロースを収容したカラムに吸着せしめ、そして高塩含
   量の緩衝液で溶出し；そして（ｄ）段階（ｃ）のインタ
   ーフェロン−γ含有液出液を高塩濃度において平衡化し
   たダル瀘過カラムに通し、そして精製されたインターフ
   ェロン−γを回収する方法において、前記段階（ａ）〜
   （ｃ）の後であって段階（ｄ）の前に、部分的に精製さ
   れたインターフェロンを化学的に適合性の緩衝液に対し
   て透析し、約９．０〜１０，０のｐＨの緩衝液の存在下
   でイオン交換体にインターフェロンを平衡的に吸着せし
   めるのに十分な時間にわたって、透析された部分精製イ
   ンターフェロンの前記溶液を陽イオン交換体のカラムと
   接触せしめ、インターフェロンを吸着した前記イオン交
   換樹脂を溶出液の２８０　ｎｍにおける光学濃度が約０
   になるまで緩衝液により洗浄して溶液画分を除去し、そ
   して吸着されたインターフェロンを、５０　ｍＭ　Ｎａ
   Ｃ２を含有するＰＨ約９〜１０、約１０〜３０　ｍＭ　
   Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌの溶出緩衝液によシ溶出することを
   特徴とする方法。 ２、陽イオン交換体がカル？キシメチル基、スルホ基、
   又はスルホプロピル基を有する特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、緩衝液が約１０ｒｎ１辺の濃度及び約９．２〜９．
   ８ＯＰＨを有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
   タン−ＨＣｌである特許請求の範囲第１項又は第２項記
   載の方法。 ４、段階（ｄ）の溶出緩衝液が約２０ｍＭの濃度及び約
   ９．５のＰＨを有しそして約５０　ｍＭ　ＮａＣ１を含
   有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣ
   ｌである特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項
   に記載の方法。 ５、最終溶出インターフェロン−γをさらに、該インタ
   ーフェロン−γをフェニル−セファロースに平衡吸着せ
   しめるのに十分な時間にわたってフェニル−セファロー
   スに接触せしめ、そして吸着されたインターフェロン−
   γを低塩濃度緩衝液で溶出する特許請求の範囲第１項〜
   第４項のいずれか１項に記載の方法。 ６、（ａ）（ｉ）　中性ＰＨの緩衝液中でインターフェ
   ロン−γが調節された細孔を有するガラスピーズに吸着
   するのに十分な時間にわたって該インターフェロン−γ
   を該ガラスピーズに接触せしめ；（１１）該ビーズを化
   学的に適合性の緩衝液によシ溶出液の２８０　ｎｍにお
   ける光学濃度が約０になるまで洗浄し； ０１１）該ビーズを中性ＦＨの緩衝液により溶出液の２
   ８０　ｎｍにおける光学濃度が約Ｏになるまで洗浄し；
   そして （ψ　該ビーズからインターフェ西シーγヲ硫酸アンモ
   ニウム溶液により溶出し： （ｂ）中　段階（ａ）（ｉｖ）の前記溶出液を、コンカ
   ナバリンＡ−セファロース、レンズ豆レクチンーセファ
   ロース及びエントウ豆レクチンーアガロースから成る群
   から選ばれた吸着剤と、中性ＰＨの緩衝液の存在下で該
   吸着剤に前記インターフェロン−γが吸着するのに十分
   な時間にわたって接触せしめ；（１１）該吸着剤を硫酸
   アンモニウムによシ溶出液の２８０　ｎｍにおける光学
   濃度が約０になるまで洗浄し； ０１Ｄ　該吸着剤を中性ｐｌｉの緩衝液にょシ溶出液の
   ２８０　ｎｍにおける光学濃度が約０になるまで洗浄し
   ：そして （φ　該吸着剤からインターフェロン−γを、α−メチ
   ルＤ−マンノシド及び１−メチルローグルコシドから成
   る群から選ばれた糖を含有する緩衝液によシ溶出し； （ｃ）（１）段階（ｂ）ＯＶ）の前記溶出液を、ヘパリ
   ン−セファロース及びプロシアンレッド−アガロースか
   ら成る群から選ばれた吸着剤と、中性ｐＨの緩衝液の存
   在下で該吸着剤に前記インターフェロン−γが吸着する
   のに十分な時間にわたって接触せしめ；（１１）該吸着
   剤をα−メチルＤ−マンノシド及び１−メチルＤ−グリ
   コシドから成る群から選ばれた糖を含有する中性−の緩
   衝液によシ、溶出液の２８０　ｎｍにおける光学濃度が
   約０になるまで洗浄し； ０１Ｄ　該吸着剤を中性−の緩衝液によシ、溶出液の光
   学濃度が約０になるまで洗浄し：そして（ｌｖ）　該吸
   着剤を生理的濃度のＮａＣ４を含有する中性ＰＨの緩衝
   液によシ、溶出液の光学濃度が約０になるまで洗浄し； （■）該吸着剤からインターフェロン−γを高濃度の塩
   を含有する中性ＰＨの緩衝液により溶出し；そして （ａ）（ｉ）　段階（Ｃ）（ψの前記溶出液を、高儂度
   の塩を含有する中性−の緩衝液中で平衡化したダル濾過
   カラムに通し：そして （１１）中性ＰＨの緩衝液を用いて前記カラムからイン
   ターフェロン−γを溶出する特許請求の範囲第１項〜第
   ５項のいずれか１項に記載の方法。 ７４　約２２，０００±３，０００ドルトンのスラブＳ
   ＤＳ　−ＰＡＧＥ分子量バンドに相当する均質なヒトイ
   ンターフェロン−γのスペーシス。 ８、約２６，０００±３，０００ドルトンのスラブＳＤ
   Ｓ　−ＰＡＧＥ分子量バンドに相当する均質なヒトイン
   ターフェロン−γのスペーシス。 ９、次の部分アミノ酸配列 Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａ
   ｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−によ
   り特徴付けられる特許請求の範囲第７項記載のインター
   フェロン−γのスペーシス。 １０、次の部分アミノ酸配列 Ａｌａ−Ｘ−Ｘ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ
   ｙｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓによシ特徴付けられる特
   許請求の範囲第８項記載のインターフェロンーγのスペ
   ーシス。