FI98373C - Uusi diagnostisesti käyttökelpoinen polypeptidi, onkostatiini M - Google Patents

Description

'98373

Uusi diagnostisesti käyttökelpoinen polypeptidi, onkosta-tiini M

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 865156 5

Leukosyytit, sekä lymfosyytit että monosyytit, on liitetty kasvainten kasvun estoon muutamissa eläinkasvain-malleissa. Pahanlaatuisten kasvainten kohonnut esiintymistiheys ihmisissä, joiden immuniteetti on alentunut, tukee 10 sitä väitettä, että valkoiset verisolut osallistuvat kasvainten kasvun säätelyyn. Näiden valkosolujen tuottamiin, jo eristettyihin ja karakterisoituihin proteiinitekijöihin, jotka estävät kasvainten kasvua tai säätelevät immuuni toimintoja, kuuluvat interferonit a- ja -, tuumorin 15 nekroositekijä, lymfotoksiin!, interleukiini 2 ja muut lymfokiinit. Koska kullakin näistä eristetyistä tekijöistä on erilainen vaikutusspektri ja ne voivat olla eri tavalla vuorovaikutuksessa muiden tekijöiden kanssa, tunnetaan edelleen voimakasta kiinnostusta kaikkien tekijöiden, joi-20 ta valkosolut tuottavat säädellessään solujen kasvua ja immuunitoimintoja, eristämiseen ja karakterisointiin.

Luonnossa esiintyvien tekijöiden löytämisessä, eristämisessä, puhdistuksessa tai karakterisoinnissa voi- .. . daan kohdata monia vaikeuksia. Täytyy kehittää menetelmiä • · ; ; 25 kiinnostuksen kohteena olevan tekijän erottamiseksi ja « · · ·**/ puhdistamiseksi epäpuhtaassa lähtöaineessa esiintyvistä « · * *·’.· muista tekijöistä denaturoimatta halutun tekijän aktiivi- ***** suutta; täytyy kehittää biologisia määrityksiä, jotka mah- dollistavat fraktioiden identifioinnin erotusten aikana, :i: 30 joissa konsentroidaan tiettyä tekijää; uusi tekijä täytyy erottaa jo tunnetuista tekijöistä tai muista tuntematto-; mistä tekijöistä, joita voi olla läsnä ja jotka voivat 98373 2 vaikuttaa, joko negatiivisesti tai positiivisesti, halutun tekijän aktiivisuuteen; ja puhdistettua tekijää täytyy konsentroida riittävässä määrin tekijän identifioinnin ja karakterisoinnin mahdollistamiseksi. Siksi eris-5 tettyjen tekijöiden lukumäärän kasvaessa jokainen uusi tekijä käy vaikeammaksi identifioida, sillä sen roolia ja toimintaa voivat peittää läsnä olevat lukuisat muut tekijät.

Bealin et ai.'n [Cancer Biochem. Biophys. 3 (1979) 10 93 - 96] mukaan ihmisen virtsassa esiintyy peptidejä, jot ka estävät kasvua ja DNA-synteesiä voimakkaammin muuttuneissa kuin normaaleissa soluissa. Holley et ai. [Proc.

Natl. Acad. Sei. 77 (1980) 5 989 - 5 992] kuvaavat epiteelisolujen kasvun inhibiittoreiden puhdistusta. Letanskyn 15 [Biosci. Rep. 2 (1982) 39 - 45] mukaan naudan istukasta puhdistetut peptidit estävät kasvainten kasvua ja tymidii-nin sisällyttämistä DNA:hän suuremmassa määrin kasvaimissa kuin normaalisolukossa. Chen [Trends Biochem. Sei 7 (1982) 364 - 365] kuvaa syöpää tukahduttavan peptidin eristämistä 20 vesivatsanesteestä. Redding ja Schally [Proc. Natl. Acad.

Sei. 79 (1982) 7 014 -7 018] kuvaavat yhden tai useamman peptidin, joilla on antimitogeeninen vaikutus useita normaali- ja kasvainsolulinjoja vastaan, eristämistä sikojen hypotalamuksista. Sone et ai. [Gann. 75 (1984) 920 - 928] 25 kuvaavat ihmisen makrofagien tuottamien yhden tai useamman ··· · tekijän valmistamista, jotka estävät tiettyjen kasvainso- • · · *·*.* lujen kasvua in vitro. Ransom et ai. [Cancer Res. 45 *·**: (1985) 851 - 862] kuvaavat leukoreguliiniksi kutsutun te- kijän eristämistä, joka estää tiettyjen kasvainsolulin-::** 30 jojen replikoi tumista ja näyttää olevan eri aine kuin lym- fotoksiini, interferoni ja interleukiini 1 ja 2. Useimpia . .*. näistä tekijöistä ei ole karakterisoitu täydellisesti, eikä niiden primaarirakennetta tunneta.

98373 3

Aggarwal et ai. [J. Biol. Chem. 259 (1984) 686 -691] ovat puhdistaneet ja karakterisoineet lymfoblastoidi-solulinjan tuottaman ihmislymfotoksiinin (LT) ja sekven-soineet sen myöhemmin [Aggarwal et ai., J. Biol. Chem. 260 5 (1985) 2 334]. Gammainterferonia (γ-IF), jota tuottavat lymfoidisolut ja jolla on immuunijärjestelmää säätelevä ja kasvaimia estävä vaikutus, on tuotettu kloonauksen ja ilmentämisen kautta [Gray et ai., Nature 295 (1982) 503 -508], Tuumorin nekroositekijä (TNF), joka estää joidenkin 10 kasvainten kasvua ja jota tuottavat makrofagit ja tietyt leukemiasolulinjat, on karakterisoitu, ja TNF-cDNA on kloonattu ja saatettu ilmentymään E. colissa [Pennica et ai., Nature 312 (1984) 724].

Keksintö koskee uutta, leukosyyteistä saatavissa 15 olevaa peptiditekijää, onkostatiini M -polypeptidiä, jolle on tunnusomaista, että se on oleellisesti vapaa solujät-teistä ja muista leukosyyttiproteiineista, sillä on kyky estää kasvainsolujen proliferaatiota ja stimuloida ihmisen normaalien fibroblastien proliferaatiota, se ei inhiboi 20 ihmisen proliferatiivisia eikä sytotoksisia T-soluvasteita eikä granulosyyttisten/myelosyyttisten luuydinpesäkesolu-jen muodostumista, sen molekyylipaino on 17 - 19 kD määritettynä geeliekskluusiokromatografiällä ja noin 28 kD määritettynä SDS-PAGE:lla, se kestää käsittelyn 1 N etikkaha-25 polla ja 1 N ammoniumhydroksidilla ja 56 eC:n lämpötilaa • · · *IV yhden tunnin ajan ja se voidaan valmistaa menetelmällä, • · · *·’·[ jossa a) eristetään leukosyytit, kuten histiosyyttiset lymfoomasolut tai normaalit ihmisen perifeerisen veren * ' lymfosyytit, imettäväissoluviljelmästä tai imettäväisestä; * 30 b) aktivoidaan leukosyytit indusoivalla aineella, kuten ingenolilla, forbolilla tai mitogeenilla; ja : c) eristetään kromatografisesti aktivoiduista leukosyyteistä onkostatiini M puhtaana muusta solumateri-aalista.

35 Keksintö koskee myös onkostatiini M -polypeptidiä tai sen fragmentteja vastaan muodostettuja vasta-aineita, • 98373 4 diagnostista menetelmää onkostatiini M -polypeptidin läsnäolon toteamiseksi näytteestä sekä dianostista välineistöä, joka sisältää onkostatiini M -polypeptidiä ja edellä määriteltyä vasta-ainetta.

5 Kuvio 1 esittää onkostatiini M:n fragmenttien ami- nohapposekvenssej ä, kuvio 2 on sarja mikroskooppivalokuvia onkostatiini M:llä käsitellyistä soluista, jossa (A-C) ovat A375-mela-noomasoluja, jotka on käsitelty 0, 5 ja vastaavasti 100 10 GIA-yksiköllä, ja (D-F) ovat W138-fibroblasteja, jotka on käsitelty 0, 5 ja vastaavasti 100 GIA-yksiköllä; ja kuvio 3 on valokuva onkostatiini M:n SDS-PAGE-ana-lyysista.

Leukosyyttejä, joista onkostatiini M:ää voidaan 15 saada, ovat esimerkiksi stimuloitujen U937-solut tai stimuloidut normaalit ihmisen ääreisverilymfosyytit (PBL), joiden kasvualustoihin tekijä erittyy.

Polypeptidifragmentit ovat vähintään 8 aminohappoa käsittäviä uusia polypeptidejä, jotka ovat biologisesti 20 aktiivisia ainakin siinä mielessä, että ne reagoivat im-munologisesti ristiin luonnossa esiintyvän onkostatiini M:n kanssa. Immunologisesti ristireagoivalla tarkoitetaan sitä, että tämän keksinnön mukaisen uuden polypeptidin indusoima vasta-aine reagoi ristiin alkuperäisen kokonai-J 25 sen onkostatiini M:n kanssa ainakin onkostatiini M:n oi- 4 4 4 V.‘ lessa denaturoituneessa tilassa. Nämä polypeptidit ovat • · · • 44 * *. siksi käyttökelpoisia vasta-aineiden indusointiin onkosta- 4 4··· ‘ tiini M:lle, jotta vasta-aineita voidaan käyttää onkosta- 4 4·· * " tiini M:n pitoisuuden määrittämiseen elimistön nesteestä, * · · V ' 30 onkostatiini M:n sitomiseen ja siten sen aktiivisuuden säätelyyn ja onkostatiini M:n puhdistamiseen, esimerkiksi : affiniteettikolonnissa käyttämällä. Osassa polypeptidejä voi säilyä myös alkuperäisen kokonaisen onkostatiini M:n solujen kasvua säätelevä vaikutus, tosin tämä aktiivisuus 35 voi olla säädelty, tavallisesti alentunut alkuperäiseen kokonaiseen onkostatiini M:ään verrattuna.

. 98373 5

Kuvio 1 esittää onkostatiini M:n kanssa ristirea-goivien poly(aminohappojen) aminohapposekvenssejä; ensimmäinen sekvenssi edustaa onkostatiini M:n N-päätä.

Poly(aminohapot) sisältävät yleensä vähintään 8 5 peräkkäisestä aminohaposta koostuvan aminohapposekvenssin, joka vastaa kuviossa 1 esitettyä aminohapposekvenssiä ja eroaa siitä korkeintaan 3, tavallisesti korkeintaan 1 aminohapon suhteen. Tämä ero voi olla aminohapon insertio, aminohapon deleetio tai jonkin aminohapon korvautuminen 10 toisella, erityisesti säilyttävä korvautuminen. Poly(aminohapot) sisältävät tavallisesti vähintään 10, tavallisemmin vähintään 12, peräkkäistä aminohappoa, jotka vastaavat kuvassa esitettyjä sekvenssejä ja eroavat siitä korkeintaan yhden aminohapon suhteen.

15 Tämän keksinnön tarkoituksia varten erilaiset ami nohapot jaetaan joukoksi alaryhmiä. Alaryhmät osoitetaan seuraavalla taulukolla: alifaattiset neutraalit

20 polaarittomat G A P V L I

polaariset S T C M N Q

happamat D E

emäksiset K R

aromaattiset F H Y W

25 Säilyttävällä korvauksella tarkoitetaan sitä että • · · * aminohappojen korvaamiseen käytetään saman alaryhmän (ts.

«« ·*· * joko neutraaleja alifaattisia, happamia alifaattisia, %* « emäksisiä tai aromaattisia), tarkemmin ilmaistuna polaari-’ 30 suudeltaan samanlaisia aminohappoja. On toivottavaa, että 2-4 hiiliatomia tai 5-6 hiiliatomia sisältävät amino-::: hapot määräävät monomeerien ryhmityksen kussakin alifaat- tisessa alaryhmässä.

Poly(aminohappojen) pituus on korkeintaan noin 1000 35 aminohappoa. Tavallisesti niissä on vähemmän kuin 100 aminohappoa, tavallisemmin alle 50 aminohappoa. Poly(amino- 98373 6 happoja) on siten helppo syntetisoida. Kun poly(aminohappojen) pituus ylittää 100 aminohappoa, ne voivat olla on-kostatiini M -fragmenttien, joista kukin sisältää alle 100 aminohappoa, polymeerejä tai fuusioproteiineja, joissa 5 fragmentti on fuusioituna antigeeniin, entsyymiin, entsyymi f ragmentteihin jne. Suurehkomolekyyliset poly(aminohapot) voivat erityisesti koostua vähintään yhdestä polypep-tidifragmentista, jossa on alle noin 100 aminohappoa ja joka on liitetty kovalenttisesti suureen immunogeeniseen 10 polypeptidikantajaan, jolloin saadaan aikaan immunogeeni-syys. Esimerkkejä tällaisista proteiinikantajista ovat naudan seerumialbumiini, tulivuorikotilon hemosyaniini (KLH) tms. Nämä konjugoidut polypeptidit ovat käyttökelpoisia vasta-aineiden indusoimiseen sopivassa isäntäor-15 ganismissa.

U937-solut ovat histiosyyttisestä lymfoomasolulin-jasta johdettu solulinja [Sundström ja Nilsson, Int. J. Cancer 17 (1976) 565 - 577], joka voidaan indusoida erilaistumaan soluiksi, joilla on makrofagien ominaispiirtei-20 tä, käsittelemällä erilaisilla aineilla [Harris et ai.,

Cancer Res. 45 (1985) 9 - 13]. Onkostatiini M:n tuottamiseksi U937-soluja voidaan kasvattaa tavanomaisessa, seerumia sisältävässä ravintoalustassa ja käsitellä asianmukai-sella indusoijalla. On kätevää käyttää forboleja tai inge- • ,·, 25 noleja, erityisesti 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-ase- • « « *!V taattia (TPA). Tavallisesti voidaan käyttää noin 5 - • » · » ’ 20 ng/ml indusoijaa. Solujen alkulukumäärä on noin 10 - 9 t · * · ] 106 solua/ml.

r « *t

Kun soluja on käsitelty indusoijalla riittävä aika, «Il % f v V * 30 yleensä 3-6 vrk, supernatantti poistetaan, solut pestään seerumittomalla kasvualustalla, pestään kiinnittyneet so-lut uudelleen seerumittomalla kasvualustalla ja solujen annetaan inkuboitua vähintään 12 tuntia, yleensä korkeintaan noin 48 tuntia, seerumittomassa ravintoalustassa, 35 esimerkiksi RPMI-1640-alustassa. Sitten otetaan talteen supernatantit, ja poistetaan solut sentrifugoimalla. So- . 98373 7 luttomista supernatanteista tutkittiin solujen kasvua estävä aktiivisuus (GIA) kokeellisessa osassa kuvattavalla tavalla. Supernatantti sisältää noin 50 - 500 GIA-yksik-köä/ml (GIA-yksikön määritelmä esitetään kokeellisessa 5 osassa).

Onkostatiini M:ää voidaan saada myös mitogeenilla stimuloiduista normaaleista ihmisen ääreisverilymfosyy-teistä (PBL). PBL:t voidaan eristää leukofraktioista laimentamalla fraktiot ja sentrifugoimalla ne Ficoll-gradien-10 teillä. Gradientin rajapinnalta talteenotetut solut pes tään ja iskuhajoitetaan punaisten verisolujen poistamiseksi. Jäljelle jääneet solut otetaan talteen liuoksesta sentrifugoimalla, suspendoidaan takaisin seerumia ja trombiinpa sisältävään puskuriin, sekoitetaan, ja annetaan veri-15 hiutaleaggregaatin laskeutua vähän aikaa. Suspendoituneet solut siirretään pois, otetaan talteen sentrifugoimalla, suspendoidaan takaisin seerumiin ja siirretään nailonvil-laa sisältävään kolonniin. Kolonnia inkuboidaan monosyyt-tien ja B-lymfosyyttien kiinnittymisten mahdollistamiseksi 20 ja pestään sitten. Useimmat ääreisveren T-lymfosyytit eivät kiinnity ja huuhtoutuvat siten pois. Näitä soluja viljeltiin lämpötilassa 37 °C kasvualustassa, esimerkiksi RPMI-1640-alustassa, ja käsiteltiin asianmukaisella indu-soijalla, esimerkiksi fytohemagglutiinilla (noin 1 -25 5 mg/1) noin 100 tuntia, ja sitten otettiin talteen super- • · . natantit. Supernatantit sentrifugoitiin solujen poistami- seksi ja konsentroitiin esimerkiksi ultrasuodattamalla tai • · · '·’ ' dialysoimalla.

Kun soluvapaa supernatantti on eristetty joko U937- m 30 soluista tai normaaleista PBLristä, käsitelty alusta kon-·/· · sentroidaan, kätevästi ontelokuitujärjestelmää tai ultra- .♦* ; suodatuskalvoa käyttämällä, minkä jälkeen se laimennetaan etikkahapolla (etikkahappopitoisuuteen 0,1 N), konsentroidaan noin 10-kertaiseen pitoisuuteen ja toistetaan laimen-35 nus ja konsentrointi. Konsentraatti voidaan kylmäkuivata 98373 8 ja käyttää suoraan, tai kylmäkuivattu tuote voidaan puhdistaa edelleen.

Keksinnön mukainen onkostatiini M voidaan puhdistaa geelipermeaatiokromatografiamenettelyllä käyttämällä vesi-5 liuosta, joka sisältää 40 % asetonitriiliä ja 0,1 % tri-fluorietikkahappoa, isokraattisena liikkuvana faasina Bio-sil TSK250 -kolonnissa ja seuraamalla kunkin fraktion aktiivisuutta. Puhdistamalla saadaan koostumus, joka sisältää vähintään noin 0,5 - 5 x 104 GIA-yksikköä/ml aktii-10 visissa fraktioissa.

Geelipermeaatiokromatografiästä saatu osittain puhdistettu tuote voidaan puhdistaa edelleen käyttämällä RP-HPLC:tä (käänteisfaasikorkeapainenestekromatografiaa), jossa käytetään lineaarista gradienttia, jossa primaari-15 liuottimena on 0,l-%:inen trifluorietikkahappo vedessä ja sekundaarisena liuottimena asetonitriili, joka sisältää 0,1 % trifluorietikkahappoa. Ohjelma voi olla vaihteleva; yleensä kromatografia vie noin 3-4 tuntia, suurimman osan ajasta, yli 50 % ja korkeintaan noin 80 % ajasta, 20 sekundaarisen liuottimen osuus on 30 - 45 %; aktiiviset fraktiot eluoituvat näissä olosuhteissa asetonitriilipi-toisuuden ollessa noin 41 - 42 %.

Yhdistetyt aktiiviset fraktiot voidaan puhdistaa edelleen toistamalla RP-HPLC muuttaen nopeammin gradient-25 tiolosuhteita ja käyttäen pienempää virtausnopeutta. Näis- • · · · · . sä olosuhteissa aktiivisuus eluoituu asetonitriilipitoi- • · · « · ]suuden ollessa noin 40,5 - 41,5 %.

• · · *·* * RP-HPLC voidaan sitten toistaa muuttamalla liuotin- systeemi sellaiseksi, että sekundaarisena liuottimena on *.·,* 30 0,1 % trifluorietikkahappoa sisältävä n-propanoli. Käyte- :*:'i tään lineaarista gradienttia, jossa n-propanolin pitoisuus .* . muuttuu hitaasti 23 %:sta 35 %:iin. Pääosa aktiivisuudesta • · · eluoituu propanolipitoisuudessa 25,5 - 27,5 %, jolloin saadaan suurin piirtein homogeeninen tuote, jonka ominais-35 aktiivisuus on yli 10 GIA-yksikköä/ng proteiinia. Tuote 98373 9 puhdistetaan tavallisesti sillä tavalla, että ominaisak-tiivisuudeksi saadaan vähintään noin 100 GIA-yksikköä/ng proteiinia, tavallisemmin 150 GIA-yksikköä/ng.

Puhdistetun onkostatiini M:n fragmenttien aminohap-5 posekvenssit analysoitiin. Onkostatiinin aminohapposekvenssit ovat suurin piirtein kuviossa 1 esitetyn kaltaiset. Kuviossa 1 ensimmäinen sekvenssi esittää onkostatiini M:n N-päätä, kun taas muut sekvenssit esittävät polypepti-din sisäisiä fragmentteja. Myöhemmin suoritetussa tarkem-10 massa analyysissä cDNA-klooneja sekvenssoimalla saadut aminohapposekvenssit, jotka tulivat Suomessa julkisiksi 15. huhtikuuta 1993, eroavat jonkin verran kuvion 1 sekvensseistä, mikä ei ole mitenkään hämmästyttävää, sillä eri menetelmillä saadut sekvenssit usein eroavat toisis-15 taan jonkin verran. cDNA-klooneja sekvenssoimalla saadut aminohapposekvenssit esitetään seuraavassa, jolloin aminohapoista käytetään kolmikirjaimisia lyhenteitä. Kuten kuviossa 1, ensimmäinen sekvenssi valaisee onkostatiini M:n N-päätä, kun taas muut sekvenssit valaisevat polypeptidin 20 sisäisiä fragmentteja.

15 10

Ala-Ala-Ile-Gly-Ser-Cys-Ser-Lys-Glu-Tyr-Arg-Val-Leu-Leu-15 20 25 25 Gly-Gln-Leu-Gln-Lys-Gln-Thr-Asp-Leu-Met-Gln-Asp-Thr-Ser- * ! 30 35 ...* Arg-Leu-Leu-Asp-Pro-Tyr-Ile, : 1 5 10

Gln-Arg-Leu-Pro-Lys-Ala-Gln-Asp-Leu-Glu-Arg-Ser-Gly-Leu-30 15 20 ; Asn-Ile-Glu-Asp-Leu-Glu-Lys ja .·* : 1 5 10 * tr

Leu-Arg-Glu-His-Cys-Arg-Glu-Arg-Pro-Gly-Ala-Phe-Pro-Ser-15 20 35 Glu Glu-Thr-Leu-Arg-Gly i < 98373 10 joissa Ala on alaniini, Cys on kysteiini, Asp on aspara-gilnihappo, Glu on glutamiinihappo, Gly on glysilni, His lOon histidiini, Ile on isoleusiini, Lys on lysiini, Leu on leusiini, Met on metioniini, Asn on asparagiini, Pro on 5 proliini, Gin on glutamiini, Arg on arginiini, Ser on se-rlini, Thr on treoniini, Vai on vallini ja Tyr on tyrosii-ni.

Eristettyä onkostatiini M:ää sisältävät aktiiviset valmisteet sisälsivät seosta, jossa oli runsasmannoosista 10 ja monimutkaista N-sidottua oligosakkaridia. Glykosyloitu-mattomat onkostatiini M-valmisteet olivat kuitenkin myös solujen kasvua säätelevästi vaikuttavia.

Onkostatiini M:lie on, kuten aikaisemmin on mainittu, lisäksi luonteenomaista aktiivisuus tiettyjä solukan-15 toja vastaan. Keksinnön kohteena olevalta polypeptidiltä puuttuu sytotoksinen vaikutus WI26- ja Wl38-ihmisfibro-blasteja, tuumorin nektroositekijälle herkkiä hiiren L929-soluja ja γ-interferonille herkkää ihmisen kasvainsolu-linjaa vastaan. On myös havaittu, ettei se estä normaalien 20 ihmisen T-lymfosyyttien proliferaatiota eikä granulosyyt-ti/myelosyyttipesäkkeiden muodostumista luuydinsoluista pitoisuuksiin 100 GIA-yksikköä/ml asti. Onkostatiini M stimuloi lisäksi normaalien ihmisen fibroblastien, joista esimerkkeinä ovat WI38- ja Wl26-solut, proliferaatiota ja 25 estää kasvainsolujen, kuten A375-, HBT10-, A549- ja SK- • · MEL28-solujen, proliferaatiota ja saattaa edistää pesäk- • · ... keitä muodostavien solujen kasvua normaalista luuytimestä.

• · · *· ’ Onkostatiini M ei vaimentanut ihmisen proliferatiivisten tai sytotoksisten T-solujen reaktioita leukosyyttiseosvil- « 30 jelmäreaktioissa (MLC) pitoisuuksina 500 GIA-yksikköä/ml.

• · · : Keksinnön mukaisen polypeptidin aminohapposekvenssi .*. : voidaan määrittää kokonaan käyttämällä myynnissä olevia sekvensoijia. Polypeptidi voidaan sitten syntetisoida tunnetuin menetelmin, käyttämällä samoin myynnissä olevia 35 automaattisia syntetisointilaitteita.

98373 11

Keksinnön mukainen polypeptidi voitaisiin vaihtoehtoisesti valmistaa yhdistelmä-DNA-menetelmin. Osittaisesta aminohapposekvenssistä voidaan päätellä koettimia, joita voidaan sitten käyttää ihmisgenomikirjaston seulomiseen.

5 Kirjasto voi olla cDNA- tai kromosomikirjasto. Kun koettimen kanssa pariutuvat yksi tai useampi klooni on identifioitu, voidaan kiinnostuksen kohteena olevan geenin sisältävät fragmentit identifioida erilaisin tavoin ja niitä voidaan käsitellä lukuisin tavoin. Fragmentin kokoa voi-10 daan pienentää endonukleaasipilkonnalla ja kloonata tuloksena olevat fragmentit ja tutkia niistä halutun geenin läsnäolo. Soluja, jotka tuottavat haluttua peptidiä tai tuottavat sitä kohonneina määrinä, voidaan käyttää mRNA:n tuotantoon. mRNA:sta voidaan valmistaa yksisäikeinen cDNA.

15 Tämä cDNA voidaan sitten pariuttaa kokonais-mRNA:n kanssa, joka on peräisin solusta, joka tuottaa vähän, mikäli ollenkaan, polypeptidiä. Pariutumaton cDNA voidaan sitten eristää ja käyttää kaksisäikeisen cDNA:n valmistukseen, joka voidaan tutkia koettimien avulla.

20 DNA-fragmentit voidaan vaihtoehtoisesti insertoida

Xgtllreen, niin että koodaavat fragmentit voivat olla B-galaktosidaasigeenin perässä ja samassa kehyksessä sen kanssa. Onkostatiini M-polypeptidille voidaan valmistaa vasta-aineita ja käyttää niitä tuloksena olevien fuusioi-25 tujen proteiinien ristireaktiivisuuden tutkimiseen. Tällä m m . tavalla voidaan keksinnön mukaista polypeptidiä tai sen fragmenttia koodaavia fragmentteja tunnistaa ja käyttää • · · halutun geenin identifisointiin.

Kun koko geeni on identifioitu, joko cDNA:na tai :J.r 30 kromosomi-DNA:na, sitä voidaan käsitellä eri tavoin ilmen- ««« ·,· · tyrni sen aikaansaamiseksi. Kun geeni on määrä saattaa il- X : mentyinään isännässä, joka on tunnistanut villiä tyyppiä olevat onkostatiini M:n kopiointia ja luentaa säätelevät alueet, voidaan koko geeni villin tyypin 5'- ja 3'-sääte-35 lyalueineen viedä sopivaan ilmentymisvektoriin. On ole- 98373 12 massa erilaisia ilmentymisvektoreita, jotka käyttävät nisäkkäiden virusten, kuten Simianvirus 40:n, adenoviruk-sen, naudan papilloomaviruksen, vaksiniaviruksen, hyönteisten bakuloviruksen jne., replikoitumisjärjestelmiä.

5 Näitä replikoitumisjärjestelmiä on kehitetty, jotta saataisiin markkereita, jotka mahdollistavat transfektant-tien valikoinnin samoin kuin kätevien restriktiokohtien, joihin geeni voidaan lisätä, aikaansaannin.

Kun geeni on määrä saattaa ilmentymään isännässä, 10 joka ei tunnista luonnossa esiintyviä villin tyypin kopioita ja luentaa sääteleviä alueita, tarvitaan lisäkäsit-telyä. Tunnetaan erilaisia käteviä 3'-pään kopioinnin säätelyalueita, joita voidaan sijoittaa lopetuskodonien jälkeen. Koodaamaton 5'-pään alue voidaan poistaa rakennegee-15 nin edeltä endonukleaasirestriktiolla, Bal31-resekoinnilla tms. Kun rakennegeenin 5'-pään lähellä on kätevä restrik-tiokohta, voidaan vaihtoehtoisesti irrottaa rakennegeeni ja käyttää adaptoria rakennegeenin kytkemiseksi promoottorialueeseen, jolloin adaptor! tuo mukanaan rakennegeenin 20 menetetyt nukleotidit. Voidaan käyttää erilaisia strategioita ilmentymisvektorin aikaansaamiseksi, jossa on ko-piointisuunnassa 5':stä 3':een kopioinnin ja luennan aloi-tusalue, johon voi sisältyä myös säätelysekvenssejä, jotka mahdollistavat säätelyn induktion, rakennegeeni, jonka 25 luenta ja kopiointi on initiaatioalueen ohjauksessa, ja • · . kopioinnin ja luennan lopetusalue.

Tyypillisiin kopioinnin aloitusalueisiin tai pro- • · · V * moottoreihin kuuluvat β-gal-promoottori, TAC-promoottori, lambdafaagin vasen ja oikea promoottori jne. bakteereja « :.:.J 30 varten; glykolyyttisten entsyymien promoottorit, kuten ADM-! ja -II-promoottorit, GPK-promoottori, PGI-promoot- Λ·\ . tori, TRP-promoottori jne. hiivoja varten; SV40:n varhai- • »* nen ja myöhäinen promoottori, adenoviruksen myöhäinen pääpromoottori jne. nisäkässoluja varten. Kuten jo mainit-35 tiin, ilmentymisyksikkö voidaan sisällyttää replikoitumis- 98373 13 järjestelmään episomin ylläpitämiseksi sopivassa soluisän-nässä, tai se voi olla ilman replikoitumisjärjestelmää, jolloin se voi integroitua isännän genomiin. DNA voidaan tuoda isäntään tunnetuin menetelmin, kuten transformaa-5 tiolla, jossa käytetään kalsiumfosfaatilla saostettua DNA:ta, transfektiolla, jossa solut saatetaan kosketukseen viruksen kanssa, mikroinjektoimalla DNA soluihin tms. tavalla.

Kun rakennegeeni on viety sopivaan isäntään, isän-10 tää voidaan viljellä, ja saada aikaan rakennegeenin ilmentyminen. Joissakin tapauksissa voi olla toivottavaa sijoittaa signaalisekvenssi (erittymisesijakso) rakennegeenin edelle ja samaan lukukehykseen sen kanssa, joka sekvenssi saa aikaan rakennegeenin erittymisen ja erittymis-15 esijakson irtoamisen, niin että saadaan aikaan valmiin polypeptidin erittyminen supernatanttiin. Ellei aiheuteta erittymistä, isäntäsolut voidaan kerätä talteen, hajottaa tavanomaisella tavalla ja puhdistaa tavanomaisin menetelmin, kuten kromatografisesti, elektroforeettisesti, liuo-20 tinuutolla tms. tavalla.

Keksinnön mukaista polypeptidiä voidaan käyttää hyvin monella tavalla in vitro. Keksinnön mukaista polypeptidiä voidaan käyttää vasta-aineidensa valmistukseen, jotka myös ovat esillä olevan keksinnön kohteena. Vasta-ai-25 neita voidaan valmistaa tavanomaisin menetelmin, esimer- • · kiksi käyttämällä keksinnön mukaista polypeptidiä immuno-geeninä ja injektoimalla sitä nisäkäsisäntään, esimerkiksi • « * ’·* * hiireen, lehmään, vuoheen, lampaaseen, kaniin jne., eri tyisesti apuaineen, esimerkiksi täydellisen Freundin apu- * 5.:.: 30 aineen, alumiinihydroksidigeelin tms., kanssa. Isännästä ··· i voidaan sitten ottaa verta ja käyttää se polyklonaalisten .·* ; vasta-aineiden eristämiseen tai hiiren ollessa kyseessä, • · · ' fuusioida ääreisveren lymfosyytit tai pernan lymfosyytit (B-solut) sopivan myeloomasolun kanssa kromosomien tekemi-35 seksi kuolemattomiksi keksinnön mukaiselle polypeptidille . 98373 14 spesifisten monokloonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi.

Voidaan valmistaa joko polyklonaalisia tai mono-klonaalisia vasta-aineita, joita voidaan sitten käyttää 5 diagnosointiin in vitro tai kyseessä olevan polypeptidin detektointiin näytteestä, kuten soluista tai fysiologisesta nesteestä, kuten verestä. Vasta-aineita voidaan käyttää myös affiniteettikromatografiassa esillä olevan polypeptidin puhdistamiseksi ja sen eristämiseksi luonnon tai syn-10 teettisestä lähteestä. Vasta-aineita voidaan käyttää myös säätämään soluihin liittyvän kyseessä olevan polypeptidin määrää viljelmässä.

Keksinnön mukaista polypeptidiä voidaan käyttää li-gandina tämän yhdisteen reseptorien läsnäolon havaitsemi-15 seen. Tällä tavalla reseptorit voidaan erottaa toisistaan polypeptidin reseptorien läsnäolon ja niiden tiheyden suhteen seuraamalla erilaisten yhdisteiden vaikutusta tällaisten reseptorien läsnäoloon.

Keksinnön mukaista polypeptidiä voidaan käyttää in 20 vitro -viljelmissä estämään tällä polypeptidille herkkien solujen tai solulinjojen, jotka reagoivat eri tavalla kuin epäherkät solut, kasvua. Heterogeenisista soluseoksista tai solulinjöistä voidaan tällä tavalla poistaa epätoivottavat solut, kun epätoivottavat solut ovat herkkiä keksin-25 nön mukaiselle polypeptidille.

Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön valaisemi- • · ... seksi eikä niillä ole tarkoitus rajoittaa sitä.

• · » * Kokeellinen osa

Materiaalit ja menetelmät 30 U937-soluista eristetty onkostatiini M: kasvainsolujen • · · J.:· kasvun inhibiittorin tuottaminen histiolyyttisestä lymfoo- .*. : masolulinjasta

V

U937-soluja, histiolyyttistä lymfoomasolulinjaa [Sundström ja Nilsson, Int. J. Cancer 17 (1976) 565 - 577) 35 viljeltiin 850 cm2:n pyörityspulloissa (Corning C2540) pi- - 98373 15 toisuuteena 4 x 105 solua/ml kaikkiaan 300 ml:ssa RPMI 1640 -alustaa, joka oli täydennetty 10 %:lla naudan sikiösee-rumia (FCS), penisilliini/streptomysiinillä (PS), L-gluta-miinilla ja 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-asetaatilla 5 (TPA, 10 ng/ml). Neljän vuorokauden kuluttua FCSrää ja TPA:ta sisältävät supernatantit poistettiin, pyörityspul-lot pestiin viidesti seerumittomalla RPMI 1640:llä, ja irronneet solut (1 x 105 solua/ml) pestiin kolmesti seerumittomalla alustalla ja lisättiin takaisin pulloihin, jol-10 loin lopputilavuudeksi tuli 125 ml seerumitonta RPMI 1640 -alustaa pyörityspulloa kohden. Vuorokauden kuluttua otettiin talteen supernatantit, sentrifugoitiin ne solujen poistamiseksi, suodatettiin 0,45 pm:n Nalgene-suodattimen läpi ja konsentroitiin käyttämällä ontelokuitujärjestelmää 15 (Amicon-patruuna HIP10-20), jolloin lopputilavuudeksi tuli 150 ml (alkutilavuus 1500 ml). Onkostatiini M:ää eristettiin myös 150 cm2:n kudosviljelypulloissa olevien, seerumittomalla TPA:11a käsiteltyjen U937-solujen supernatan-teista. Supernatantti konsentroitiin Amicon Diaflo -kal-20 volla PM-10 (läpäisyraja 10 kD) ja dialysoitiin. Dialyysin jälkeen konsentraatti laimennettiin etikkahapolla siten, että tuloksena oli etikkahappopitoisuus 0,1 N 500 ml:n tilavuudessa, ja konsentroitiin Amicon PM 10 -suodatinta käyttämällä 50 ml:ksi. Tämä konsentraatti (50 ml) laimen-25 nettiin 400 ml:ksi 0,1 N etikkahapolla ja konsentroitiin . 40 ml:ksi samalla suodattimena. Konsentraatti laimennet- ...* tiin 1 N etikkahapolla, ja syntyvä sakka poistettiin sent- rifugoimalla. Saatu konsentraatti pakastettiin ja kylmä-kuivattiin. Kylmäkuivattua materiaalia käytettiin puhdisti, 30 tusvaiheisiin.

• « · i.·' '· Geelipermeaatiokromatografia .·[ ; Bio-sil TSK-250 -kolonnin (600 x 21,5 mm) (BioRad) liitettiin suurpainenestekromatografiajärjestelmään. Raa-kafraktio (10 mg/ml) liuotettiin vesiliuokseen, joka si-35 sälsi 40 % asetonitriiliä ja 0,1 % trifluoritetikkahappoa 98373 16 (0,l-%:inen TFA). Injektoitiin 2 ml:n annos seosta, ja eluoitiin isokraattisesti käyttäen liikkuvana faasina liuosta, joka sisälsi 40 % asetonitriiliä ja 0,1 % TFA:ta vedessä. Virtausnopeus oli 2,5 ml/min ja piirturipaperin 5 liikkumisnopeus 0,25 cm/min. Kerättiin 5 ml:n fraktioita. Kromatografia tehtiin huoneen lämpötilassa. Kustakin fraktiosta otettu näyte haihdutettiin ja siitä tutkittiin kolmena rinnakkaismäärityksenä A375-solujen kasvua estävä aktiivisuus (GIA, growth inhibitory activity).

10 Kuudesta ajosta saadut aktiiviset fraktiot (21 ja 22) yhdistettiin. Yhdistetty materiaali sisälsi kaikkiaan noin 4,8 x 105 GIA-yksikköä. Tekijän näennäisen molekyyli-painon havaittiin olevan 18 kD määritettynä koon mukaan erottelevalla kromatografiällä (Bio-sil TSK-250 -kolonni).

15 TSK-250-fraktioiden RP-HPLC (käänteisfaasisuurpai- nekromatografia)

Edellä kuvatut yhdistetyt TSK-250-fraktiot 21 ja 22 laimennettiin kaksinkertaiseen tilavuuteen 0,l-%:isella TFA:11a. Tämä seos injektoitiin isokraattisesti μ-Bonda-20 pak-C18-kolonnille (7,8 x 300 mm) (josta käytetään nimitystä C18l) huoneen lämpötilassa. Virtausnopeus säädettiin arvoon 2,0 ml/min ja piirturin nopeus oli 0,25 cm/min. Käytettiin lineaarista gradienttia primaariliuottimesta (0,1 % TFA:ta) sekundaariseen liuottimeen (asetonitriili, ,, 25 0,1 % TFA:ta). Gradienttiolosuhteet olivat 0 -> 30 %

I I

10 min:ssa, sitten 30 -» 45 % 150 min:ssa; 45 -» 55 % • · ... 20 min:ssa, ja 55 -> 100 % 10 min:ssa. Kaikki liuottimet

• · « * +J

* · · * olivat HPLC-laatua. Kerättiin 4 ml:n fraktioita, ja kusta kin fraktiosta otetusta näytteestä tutkittiin kasvua estä- *·!·* 30 vä aktiivisuus. Fraktioiden 72 - 75 havaittiin sisältävän V * pääosan aktiivisuudesta. Aktiiviset fraktiot eluoituivat •*.J asetonitriilipitoisuuden ollessa 41 - 52 %.

Fraktiot 72 - 75 yhdistettiin. Yhdistettyihin fraktioihin lisättiin 16 ml 0,l-%:ista TFA:ta. Seos injektoi-35 tiin p-Bondapak-C18-kolonniin (3,9 x 300 mm) (josta käyte- 98373 17 tään nimitystä C182) huoneen lämpötilassa. Virtausnopeus säädettiin arvoon 1 ml/min, ja piirturin nopeus oli 0,25 cm/min. Gradienttiolosuhteet olivat 0 -* 35 % 10 min:ssa; 35 -♦ 45 % 100 min:ssa? ja 45 -* 100 % 5 10 minrssa. Kerättiin fraktiot, otettiin niistä näytteet, ja tutkittiin näytteistä GIA. Suurin osa aktiivisuudesta eluoitui kolonnista asetonitriilipitoisuuden ollessa 40,7 - 41,3 % (retentioaika 83 - 86 min).

Aktiiviset fraktiot yhdistettiin, laimennettiin 10 kaksinkertaiseen tilavuuteen 0,l-%:isella TFA:11a ja injektoitiin isokraattisesti p-Bondapak-C18-kolonnille (3,9 x 300 mm) (josta käytetään nimitystä C183) huoneen lämpötilassa. Virtausnopeus oli 1 ml/min ja piirturipape-rin nopeus 0,25 cm/min. Käytettiin lineaarista gradienttia 15 primaariliuottimessa (0,l-%:inen TFA) sekundaariseen liuottimeen (n-propanoli, 0,1 % TFA:ta). Gradienttiolosuhteet olivat 0 -* 23 % 20 minrssa ja 23 -» 120 min:ssa. Kerättiin fraktiot ja tutkittiin kustakin fraktiosta otetusta näytteestä GIA. Suurin osa aktiivisuudesta eluoitui 20 propanolipitoisuuden ollessa 25 - 26,5 % (retentioaika 59 min). Tämä ilmeisesti homogeeninen fraktio sisälsi noin 300 ng proteiinia ja noin 40 000 GIA-yksikköä.

Määritys, jossa tutkitaan solujen kasvun säätelyä ; käyttämällä 3H-tymidiinln sisällyttämistä DNAthan (GIA) 25 Kokeet tehtiin levyillä, joissa oli 96 tasapohjais- ta kuoppaa (Costar 3596). Herkkänä indikaattorisolulinjana • · ...# käytettiin ihmisen melanoomasoluja (A375). Kuhunkin kuop- * * * .

‘ paan laitettiin soluja (3 x 10 ) 1,1 ml:ssa Dulbeccon muun nettua Eagles-alustaa (DMEM), joka oli täydennetty *-··* 30 10 %:lla FCSrää ja PS:llä. Kolmen tunnin kuluttua lisät- V * tiin kuhunkin kuoppaan 0,1 ml tutkittavaa näytettä. Levyjä t inkuboitiin 37 °C:ssa 3 vrk. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 0,025 ml (0,5 pCi) 3H-tymidiiniliuosta (ominaisak-tiivisuus 27 pCi/ug) ja inkuboitiin vielä 6 tuntia. Solut 35 siirrettiin sitten lasisuodatinliuskoille käyttämällä mo-nikuoppakerääjää (PHD Cell Harvester, Cambridge Techology, 98373 18

Inc). Suodattimet siirrettiin tuikelaskentapulloihin, joihin lisättiin 2 ml tuikelaskentaliuosta (ScientiVerse II, Fisher Scientific Co.), ja tehtiin sitten tuikelaskenta 3H-tymidiinin sisällytyksen määrittämiseksi kvantitatiivises-5 ti.

Pehmytagarilla tehtävä pesäkkeiden eston määritys- (TGI) 0,5 ml:n pohjakerros, joka sisälsi 0,5 % agaria (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) 10 DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia (FCS), lisättiin 24-kuoppaisille Costar-kudosviljelylevyille. Agarpohjakerroksen päälle levitettiin 0,5 ml samaa alus-ta-FCS-seosta, joka sisälsi 0,3 % agaria, 1 - 2,5 x 103 A375solua ja tutkittavaa tekijää erilaisina pitoisuuksina.

15 Levyjä inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa kostutetussa at mosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02 ilmassa, ja lisättiin 7 vrk;n kuluttua vielä 0,5 ml samaan alustaan tehtyä 0,3-%:ista agaria, jossa tekijän pitoisuus oli sama. Pesäkkeet laskettiin kiinnittämättöminä ja värjäämättöminä 20 ja laskennassa otettiin huomioon pesäkkeet, jotka päivien 7 ja 14 välissä sisälsivät yli 6 solua.

: Tulokset i ·'; U937-soluista eristetyn onkostatiini M;n sekvenssit ,* Onkostatiini M:n N-terminaalinen sekvenssi ja si- 25 säiset fragmentit määritettiin tekemällä mikrosekvenssi- ....· analyysi pelkistetystä ja S-pyridiinietyloidusta polypep- ♦ · ...e tistä ja peptideistä, jotka saatiin pilkkomalla pelkistet ty» ty ja S-pyridiinietyloitu onkostatiini M entsymaattisesti endoproteinaasilla Lys-C ja Staphylococcus aureus V8 -pro- *·?.* 30 teinaasilla. Peptidi fragmentti puhdistettiin RP-HPLC:llä ♦ ·♦ ‘ käyttäen haihtuvia liuottimia. Peptideille tehtiin auto- * ·*·.· maattinen toistuva Edman-hajotus Model 470A -proteiinisek- vensaattorissa (Applied Biosystems, Inc.). Fenyylitiohyd-antoiiniaminohapot anlysoitiin RP-HPLC:llä (Applied Bio-35 systems, Inc.) käyttämällä PTH-C18 -kolonnia (2,1 x 98373 19 220 mm, ABI) ja eluoitiin käyttäen natriumasetaattipusku-ri-tetrahydrofuraani-asetonitriillgradienttia.

Tuloksena olevat aminohapposekvenssit ovat suurin piirtein kuviossa 1 esitetyn kaltaiset.

5 Verrattaessa näitä sekvenssejä ajan tasalla olevaan proteiinitietokantaan (PIR Release 9,0, toukokuu 1986) talletettuihin sekvensselhln el havaittu merkittävää sek-vensslhomologiaa minkään tunnetun sekvenssin kanssa. Homo-logiaa ei ole myöskään tuumorin nekroosi teki jän, lymfotok-10 siinin, pesäkkeitä stimuloivan tekijän, interleukiini l:n eikä 2:n eikä B-transformoivan kasvutekijän kanssa.

Kasvainsolujen proliferaation esto ja ihmisen nor-maalifibroblastien proliferation stimulointi Käyttämällä edellä kuvattua pehmytagarpesäkeinhibi-15 tiokoetta saatiin seuraavia tuloksia:

Taulukko 1 U937-soluista eristetyn, puhdistetun onkostatiini M:n aikaansaama A375-melanoomasolujen pesäkkeenmuodostuksen esto* 20 GIA-yksikköä/ Pesäkkeiden Pesäkkeen muodostuk- kuoppa_lukumäärä_sen esto (%)_ 250 4 96 83 6 94 27 11 89 25 45 32 69 .1.: 0 106 • ·· • · · *A375-solut siirrostettiin edellä kuvatulla tavalla pehmytagariin tekijän kera tai sitä ilman lopputilavuuden 30 ollessa 2 ml. Käytetty faktori oli C18-propanolikolonnista • « · · saatu fraktio, jossa kasvainten kasvua estävä aktiivisuus : (GIA) oli korkeimmillaan. Pesäkkeiden lukumäärä laskettiin • ·· ' ' 11 vrk:n kuluttua. Pesäkkeeksi määriteltiin vähintään 6 solua sisältävä rykelmä. Yksi GIA-yksikkö määriteltiin 35 siksi määräksi, joka aiheuttaa 3H-tymidiinin sisällytyk- 98373 20 sen mikrokuopassa oleviin A375-soluihin 50-%:isen eston edellä kuvatussa kokeessa.

Seuraavassa kokeessa määriteltiin erilaisten, joko kemiallisten tai fysikaalisten, käsittelyjen vaikutus ky-5 seessä olevaan polypeptidiin. Tulokset annetaan seuraavassa taulukossa.

Taulukko 2 TPA-indusoitujen U937-solujen supernatanttien erilaisten käsittelyjen vaikutus kasvainten kasvua estävään aktiivi-10 suuteen*

Supernatantin lopullinen laimennussuhde 1:4 1:8 1:16

Alusta, vertailunäyte - - 39,780 Käsittelemätön supern. 7,206** 13,896 16,000 15 IN etikkahappo 6,670 17,073 18,783 1 N NH40H 6,956 15,016 13,923 *U937-soluja käsiteltiin TPA:11a (10 ng/ml) 3 vrk, sitten solut pestiin alustalla, inkuboitiin 24 tuntia see-20 rumittomassa alustassa ja supernatantit otettiin talteen. Supernatantit käsiteltiin 1 N etikkahapolla tai 1 N ammo-niumhydroksidilla (NH40H). Ne dialysoitiin alustaa vastaan : ja tutkittiin niiden kyky estää 3H-tymidiinin sisällytys A375-soluihin. A375-soluja leimattiin 3H-tymidiinillä 25 (3H-TdR) viimeiset 6 tuntia 3 vrk:n inkubointiajasta.

. ** Tulokset esittävät 3H-TdR:n sisällytystä pulssei na minuutissa.

• · · *·' * Edellä esitetyt tulokset osoittavat, ettei dialy- soidussa supernatantissa oleva onkostatiini M juurikaan 30 inaktivoidu 1 N etikkahapon eikä 1 N ammoniumhydroksidin : vaikutuksesta. Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat siten .·* . suhteellisen epäherkkiä sekä kohtalaisen vahvalle hapolle * » » että kohtalaisen vahvalle emäkselle. Keksinnön mukainen , yhdiste kestää 1 tunnin lämpökäsittelyn 56 °C:ssa, muttei 35 30 min:n käsittelyä 90 °C:ssa.

98373 21

Tutkittiin myös keksinnön mukaisen yhdisteen lämpö-stabiilisuus ja havaittiin, että yhdisteen aktiivisuus säilyi pidettäessä sitä 1 tunti 56 °C:ssa, mutta hävisi suurin piirtein kokonaan pidettäessä sitä 30 min 5 90 °C:ssa.

Seuraavassa kokeessa tutkittiin keksinnön mukaisten polypeptidien kykyä estää erilaisten kasvainsolulinjoja replikoitumista. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

10 Taulukko 3

Kasvainsolujen replikoitumisen estyminen U937-soluista saadun, puhdistetun onkostatiini M:n vaiktuksesta 30-%:isen inhibition aiheuttava GIA-yksikkömäärä Kasvainsolut 1H-TdR:n otto soluihin 15 A549 (keuhkosyöpä) 21 HTB10 (neuroblastooma) 81 A375 (melanooma) 0,3

Kasvainsolut siirrostettiin mikrokuoppiin 3 tuntia 20 ennen RP-HPLC:llä edellä kuvatulla tavalla puhdistetun onkostatiini M:n lisäämistä erilaisissa suhteissa laimennettuna. Viimeisten 6 tunnin ajan 3 vrk:n inkuboinnista soluja, jotka olivat 0,2 ml:ssa alustaa, leimattiin 1H-tymidiinillä (1H-TdR) (0,5 pCi/kuoppa). Yksi yksikkö kas-25 vainten kasvua estävää aktiivisuutta (GIA) määriteltiin taulukon 1 selityksessä määräksi, joka vähentää 50 %:lla • · * « H-TdR:n sisällytystä A375-melanoomasoluihin. Yhden yksi- • · · kön määritettiin olevan noin 10 pg puhdistettua proteiinia; siten pitoisuus (ng/ml), joka aiheuttaa 30-%risen 30 inhibition 1H-TdR:n sisällytyksessä A549-, HTB10-ja A375- • · t V * soluihin oli noin 1,4, 4,0 ja vastaavasti 0,015 ng/ml.

;*·.♦ U937-tekijä ei vähentänyt 1H-TdR:n sisällytystä ihmisen normaaleihin WI16-fibroblasteihin missään kokeessa.

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että onkosta-35 tiini M:n kyky estää replikoitumista on selektiivinen; 98373 22 vaikutus vaihtelee suuresti solun luonteen mukaan. Keksinnön mukainen yhdiste on tehokas melanoomasoluja, kuten A375-melanoomasoluja, suomukeuhkosyöpäsoluja, kuten A549-soluja, ja neuroblastoomasoluja, kuten HTBIO-soluja, vas-5 taan.

Kasvainsoluja siirrostettiin tiheydeksi 3 x 103 so-lua/kuoppa ja normaaleja fibroblasteja tiheydeksi 1,5 x 103 solua/kuoppa 96-kuoppaisille levyille 3 tunnin ajaksi. Lisättiin puhdistettua onkostatiini M:ää, joka saatiin 10 C183-kolonnin siitä fraktiosta, jossa oli suurin antiproli- feratiivinen aktiivisuus A375-soluja vastaan, erilaisina pitoisuuksina, ja mitattiin kolmesta rinnakkaisesta kuopasta 3H-tymidiinin sisällytys kussakin pitoisuudessa. Tulokset esitetään taulukossa 4.

15 Taulukko 4

Kasvainsolujen proliferaation estyminen ja normaalien fib-roblastien proliferaation edistyminen onkostatiini M:n vaikutuksesta GIA- 20 yksikköä/ inhibitio (%) stimulaatio (%) kuoppa A375 WI38

Koe 1 16 83 25 4 62 30 25 1 46 46 '.V A375 HTB10 WI26

Koe 2 27 NT 28 46 9 87 22 36 3 76 11 52 ·:··· 30 A375 A549

Koe 3 75 89 30 :.·· : 25 85 22 8 71 16 A375 SK-MEL28 : 35 Koe 4 20 87 44 ::: 5 75 25 : 1 59 11 • · • · « • · · 40 Tulokset osoittavat 3H-tymidiinin sisällytyksen kasvainsoluihin (A375, HTB10, A549 ja SK-MEL28) ja normaaleihin fibroblasteihin (W126 ja W138) inhibition (%) ja 98373 23 vastaavasti stimulaation (%). Yksi GIA-yksikkö määritellään taulukon 1 selityksessä siksi määräksi onkostatiini M:ää, joka aiheuttaa 3H-tymidiinin sisällytyksen A375-so-luihin estymisen 50 %:lla.

5 Sen lisäksi, että vaikutus 3H-tymidiinin sisällytyk- seen kasvainsoluihin on erilainen kuin ihmisen normaaleihin fibroblasteihin, havaitaan myös erilainen vaikutus morfologiaan ja solulukumäärään, kun näitä kahta solutyyppiä on käsitelty 3 vrk onkostatiini M:llä, kuten kuviosta 10 2 ilmenee.

Käytetty onkostatiini M saatiin HPLC-C183-kolonnin siitä fraktiosta, jossa A375-solujen proliferaatiota estävä aktiivisuus oli suurimmillaan. Kuvio 2 on sarja mik-roskooppivalokuvia A375-melanoomasoluista, jotka olivat 15 käsittelemättömiä (A), joita oli käsitelty 5 GIA-yksi-köllä (kasvua estävä aktiivisuus -yksiköllä) onkostatiini M:ää (B) ja joita oli käsitelty 100 yksiköllä (C), sekä mikrokooppivalokuvia Wl38-fibroblasteista, jotka olivat käsittelemättömiä (D), käsiteltyjä 5 GIA-yksiköllä (E) tai 20 100 yksiköllä (F). Solut värjättiin 0,5-%:isella kristal- livioletin metanoliliuoksella. Suurennus on 63-kertainen.

Onkostatiini M;n NaDodS0A/PAGE

Puhdistetun onkostatiini M:n, jolle tehtiin NaDodS04 pelkistävissä olosuhteissa, näennäisen molekyylipainon 25 havaittiin olevan noin 28 kD, kuten kuviosta 3 ilmenee.

Standardeina (kaista A) käytettiin seeuraavia proteiineja: • · #... ovalbumiini, Mp = 43 kD; kymotrypsinogeeni a, Mp » 25,7 kD; laktoglubuliini β, Mp = 18,4 kD; lysotsyymi, Mp = 14,2 kD, naudan trypsiinin inhibiittori Mp = 6,2 kD; insu- • · m * 30 liinin A- ja B-ketju, Mp = 2,3 kD ja vastaavasti 3,4 kD.

*·* * onkostatiini M laitettiin kaistalle B.

Onkostatiini M:n, jolle tehtiin PAGE pelkistämättö-missä olosuhteissa, näennäinen molekyylipaino oli myös 28 kD, ja proteiinin, joka elektroeluoitui vyöhykkeestä, 35 havaittiin estävän A375-solujen proliferaatiota.

98373 24

Synteettisen onkostatiini M-peptidin vasta-aine reagoi 128I-leimatun onkostatiini M:n kanssa radioimmuuni-saostuksissa a) Peptidisynteesi: Peptidi vastaa onkostatiini M-5 proteiinin ryhmiä 6 - 19, ja se syntetisoitiin kiinteäfaa- simenetelmällä automaattisella Beckman-laitteella kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Gentry et ai., J. Biol.

Chem. 258 (1983) 11219]. Peptidi irrotettiin hartsista käyttämällä "matala-korkea"-HF-menettelyä [Tam et ai., J.

10 Amer. Chem. Soc. 105 (1983) 6442-6445].

b) Vasta-aineiden tuotanto: Peptidi liitettiin naudan gammaglobuliiniin kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Gentry ja Lawton, Virology 152 (1985) 421 - 431]. Valkeille New Zealand-kaniineille annettiin peptidiä perusan- 15 noksena ja viitenä tehosteannoksena 4 kohtaan ihonalaisesti kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Gentry ja Lawton, Virology 152 (1986) 421 - 431]. Antiseerumit otettiin 2 viikon kuluttua viidennestä tehoste-annoksesta.

c) Onkostatiini M:n jodaus: Näyte osittain puhdis- 20 tettua onkostatiini M:ää radioleimattiin jodi-125:llä käyttämällä julkaistuja menettelyjä [Linsley et ai., PNAS 82 (1985) 356 - 360]. Annos leimattua preparaattia, joka sisälsi 100 000 pulssia/min, sekoitettiin kaniinin anti-seerumiin, joka oli muodostunut onkostatiini M:n 17 N-ter-25 minaalista aminohappoa vastaan (lopullinen laimennussuhde 1:20), N-terminaalisen peptidin (onkostatiini M:n 17 N-.·;· terminaalista aminohappoa, 2 pg) läsnä tai poissa ollessa, « i · ja tehtiin immuunisaostusanalyysi kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Linsley et ai., Biochemistry 25 (1986) 30 2978 - 2986].

• « · *·* ‘ Tarkemmin ilmaistuna yhtä putkea, joka sisältää :*·.· 5 μΐ näytettä, esi-inkuboitiin 2 pg:n kanssa N-terminaali- sia peptidiä 10 ml:ssa TNEN-liuosta (20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05 % Nonidet P-40:ä), joka si-35 sälsi 0,1 % BSA, 30 min 4 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 98373 25 125I-onkostatiini M 85 ylrssa TNEN-liuosta, joka sisälsi 0,1 % BSA ja 40 mmol/1 ditiotreitolia (DTT). Seitsemää putkea, jotka sisälsivät 5 μΐ antiseerumia, inkuboitiin 125I-onkostatiini M:n kanssa, joka oli 85 pl:ssa TNEN-liuos-5 ta, joka sisälsi 0,1 % BSA ja 40 mmol/1 DDT, 30 min 4 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 50 μΐ 10-%:isella formaliinilla kiinnitettyä Staphylococcus aureusta (Pansorbin, Calbio-chem).

Kun oli inkuboitu vielä 30 min 4 eC:ssa, putket 10 sentrifugoitiin mikrosentrifugissa, ja pelletit pestiin neljästi 1 ml:11a TNEN-liuosta, minkä jälkeen tehtiin PAGE-analyysi. Havaittiin diffuusivyöhyke, joka vastasi Mp 32 kD, immuunisakkojen SDS/PAGE-analyysin jälkeen. Tämän vyöhykkeen saostumista esti ylimäärä leimaamatonta pepti-15 diä, joka vastasi onkostatiini M:n 17 N-terminaalista aminohappoa, mikä osoittaa, että saostuminen oli spesifinen tämän peptidin suhteen.

Onkostatiini M:n hiilihydraattikoostumusta tutkittiin testaamalla glykosidaasiherkkyys. Edellä kohdassa c) 20 kuvatulla tavalla valmistetut immuunisakat käsiteltiin puskurilla, endoglykosidaasi H:11a tai neutramidaasilla Linsleyn et ai. (1986) kuvaamalla tavalla. Käsittely endoglykosidaasi H:11a, N-kytkeytyneille, paljon mannoosia sisältäville oligosakkarideille spesifisellä entsyymillä, 25 johti pienimolekyylisemmän vyöhykkeen (Mp = 24 kD) ilmaan-tumiseen. Vain osa radioleimatusta materiaalista oli herk- • · kää tälle entsyymille, mikä osoittaa, etteivät kaikki mo- • » · lekyylit sisältäneet runsasmannoosisia oligosakkarideja. Käsittely neuramidaasilla johti yhden vyöhykkeen (Mp = « · 30 27 kD) ilmaantumiseen, mikä osoittaa, että käsittelemättö- • * « **! 1 män 125I-leimatun onkostatiini M:n koon heterogeenisyys ai- heutui heterogeenisyydestä glykoproteiiniytimen sialyloi-tumisessa. Tulokset osoittivat, että aktiiviset onkostatiini M-valmisteet sisälsivät runsasmannoosisten ja moni-35 mutkaisten N-sidottujen oligosakkaridisivuketjujen seoksen.

98373 26

Ihmisen normaaleista ääreisverilymfosyyteistä (PBL) eristetty onkostatiini M

Kasvainsolujen kasvun estäjän tuottaminen PBLiistä

Veripankista saadut PBL:iä sisältävät leukofraktiot 5 laimennettiin suhteessa 1:1 fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, 10 ml liuosta, joka sisälsi 9 % Ficollia ja 20 til-% 50-%:ista natriumdiatritsoaattia (lopullinen ominaispaino 1,080). Gradientteja sentrifugoitiin huoneen lämpötilassa 20 min kiihtyvyydellä 850 x g. Solut 10 kerättiin gradientin rajapinnalta ja pestiin PBS:llä. Punaiset verisolut hajoitettiin käsittelemällä 3-4 min 10 - 20 ml:11a liuosta, joka sisälsi 0,8 % ammoniumklori-dia ja 0,1 % Na4-EDTA.

Solut otettiin talteen punasolujen hajoitusliuok-15 sesta sentrifugoimalla tätä kiihtyvyydellä 600 x g 10 min ja suspendoitiin takaisin 10 ml:aan RPMI 1640 -alustaa (GIBCO), joka sisälsi 5 % naudan sikiöseerumia. Lisättiin trombiinia loppupitoisuudeksi 0,5 yksikköä/ml. Solususpen-siota sekoitettiin 5 min 37 °C:ssa ja verihiutaleaggregaa-20 tin annettiin laskeutua 5 min. Suspendoituneet solut siirrettiin uusiin putkiin, otettiin talteen sentrifugoimalla, suspendoitiin takaisin 1 ml:aan naudan sikiöseerumia ja siirrettiin kolonniin, joka sisälsi 0,5 g harjattua, esi-kostutettua nailonvillaa (tyyppi 200, Fenwal).

25 Nailonvillakolonnia inkuboitiin 37 °C:ssa 60 min, jotta monosyytit ja B-lymfosyytit pääsivät kiinnittymään.

• · ... Sitten kolonni huuhdottiin kolminkertaisella tilavuudella •I * * RPMI 1640-alustaa (37 eC), joka sisälsi 5 % naudan sikiö- seerumia, ja otettiin talteen eluoituneet tarttumattomat **.:.* 30 solut (PBL: t).

•.

r.: ? PBL:iä (2 x 106 solua/ml) viljeltiin 37 eC:ssa at- ;*.J mosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02 ja 95 % ilmaa, 96 tuntia RPMI 1640 -alustassa (10,4 g/1), joka sisälsi FeS04*7H20 (1 mg/1), ZnS04·7H20 (2 mg/1), Na2Se03*5H20 (0,017 mg/1), 35 1-aminoetanolia (1 mg/1), ihmisen transferriinia (5 mg/1), naudan seerumialbumiinia-linoleiinihappokonjugaattia 98373 27 (Sigma) (200 mg/1), L-glutamiinia (300 mg/1), penisilliini /streptomysiiniä (100 000 yksikköä/1) ja fytohemagglu-tinii-P:tä (Wellcome) (2 mg/1). Kerättiin supernatantit, sentrifugoitiin solujen poistamiseksi, konsentroitiin ult-5 rasuodattamalla (Amicon Diaflo-kalvo YM-10, läpäisyraja 10 kD) ja dialysoitiin 0,1 M etikkahappoa vastaan (Spectrapore 3-dialyysiletku). Selkeytetty retentaatti kylmäkuivattiin.

Geelipermeaatiokromatografia 10 Raakafraktio sekoitettiin 20 ml:aan 1 M etikkahap poa (50 mg/ml) ja laitettiin BioGel P-100-kolonniin (2,6 x 88 cm), joka oli tasapainotettu 1 M etikkahapolla, virtausnopeudella 0,5 ml/min. Kerättiin 20 ml:n fraktioita. Kustakin fraktiosta otettu näyte haihdutettiin ja siitä 15 tutkittiin kolmena rinnakkaismäärityksenä A375-solujen kasvua estävä aktiivisuus (GIA). Aktiiviset fraktiot yhdistettiin, kylmäkuivattiin ja käsiteltiin uudelleen kro-matografisesti Bio-sil TSK-250 -kolonnilla (600 x 21,5 mm) edellä kuvatulla tavalla.

20 TSK-250-fraktioiden RP-HPLC

Yhdistettyjen TSK-250-fraktioiden lopullinen puhdistus tehtiin RP-HPLC:llä suurin piirtein edellä kuvatulla tavalla. PBLzistä peräisin oleva kasvainsoluinhibiitto-ri eluoitui Bonda-pak C18 -kolonnista asetonitriilipitoi-25 suudessa 40 - 41 % ja n-propanolipitoisuudessa 26,5 %.

Solujen kasvun säätelyn tutkiminen käyttämällä 125I- *;·t jodideoksiuridiinin sisällyttämistä DNA:hän (GIA) • · « Nämä kokeet tehtiin tasapohjaisilla 96-kuoppaisilla . kudosviljelylevyillä (Costar 3596). Kuhunkin kuoppaan li- * 30 sättiin ihmisen melanoomasoluja (A37 5 , 4 x 103 ) 50 pl:ssa V ‘ tutkittavaa näytettä ja inkuboitiin 3 vrk 37 °C:ssa. Solu- ja leimattiin 24 tuntia 125I-IdU:lla (0,05 pCi/kuoppa), ja inkuboitiin vielä 24 tuntia. Solut pestiin kolmesti, kerättiin moninäytekerjäällä, ja määritettiin radioaktiivi-35 suus gammalaskurissa.

98373 28

Tulokset:

Yhdelle PBL-peräiselle kasvainsoluinhibiittorival-misteelle tehtiin automaattinen toistuva Edman-hajotus.

Aminoterminaalinen aminohapposekvenssi on seuraava: 5 1 5 10 15

A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K

X edustaa identifioimatonta aminohappoa.

Tämän sekvenssin vertaaminen U937-tekijän sekvenssiin osoittaa selvästi identtisyyden PBL-peräisen tekijän 10 N-pään kanssa.

PBL-tekijä A-A-I-G-X-X-X-K-E-Y-X-V-L-X-X-Q-L-Q-K U937-tekijä A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K

15 Seuraavassa tutkimuksessa tutkittiin PBL-peräisen onkostatiini M:n kykyä vaikuttaa erilaisten solujen repli-koitumiseen. Havaittiin, että hiiren L929-solut eivät olleet herkkiä PBL-peräiselle onkostatiini M:lie, kun tätä käytettiin korkeintaan pitoisuutena 1000 GIA-yksikköä/ml.

20 Ihmisen WI26-fibroblastien kasvua stimuloi käsittely 1000 GIA-yksiköllä/ml. Korkeintaan 500 GIA-yksikköä/ml ei vai kuttanut ihmisen normaalien T-lymfosyyttinen proliferaa-: Λ tioon 72 tunnin kuluttua mitogeneesistä.

Edellä esitettyjen tulosten perusteella on ilmeis- 25 tä, että on saatu aikaan uusi polypeptidi, jolla on kyky säädellä solujen kasvua. Yhdisteellä on kyseessä olevan *··, solulinjan luonteen mukaan vaihteleva aktiivisuus, niin että sitä voidaan käyttää yksinään tai yhdistettynä muihin yhdisteisiin solujen kasvun säätelyyn in vitro. Keksinnön *«♦·* 30 mukaiset polypeptidit merkitsevät siten uutta polypepti- • ♦ * diä, jota voidaan käyttää soluseoksissa in vitro vähentä-j*·.; mään tai edistämään selektiivisesti tietyn solutyypin pro- liferaatiota. Kokonaista polypeptidiä tai sen fragmentteja voidaan käyttää lisäksi immunogeeneinä vasta-ainetuotannon 35 indusointiin. Indusoituja vasta-aineita voidaan käyttää 98373 29 määritettäessä elimistön nesteessä esiintyvä onkostatiini M tai säätelemään tekijän aktiivisuutta sitoutumisen kautta in vitro. Lisäksi tämä vasta-aine yhdessä puhdistetun onkostatiini M:n tai sen fragmenttien kanssa toimivat kom-5 ponentteina diagnostisissa välineistöissä yhdessä muiden reagenssien, erityisesti onkostatiini M:n detektointiin ja kvantitatiiviseen määrittämiseen tarkoitettujen vasta-aineiden kanssa.

Vaikka keksintöä on kuvattu melko yksityiskohtai-10 sesti valaisevassa ja esimerkinomaisessa mielessä sen ymmärtämisen helpottamiseksi, lienee ilmeistä, että siihen voidaan tehdä tiettyjä muutoksia ja muunnoksia poikkeamatta liitteenä olevien patenttivaatimusten piiristä.

• · • · · • · · • · • · « < I • « • 1 2 3< 1·

V

• 1 · • · • « · m · · 2 • # · 3

Claims (7)

98373 30

1. Onkostatiini M -polypeptidi, tunnettu siitä, että se on oleellisesti vapaa solujätteistä ja 5 muista leukosyyttiproteiineista, sillä on kyky estää kas-vainsolujen proliferaatiota ja stimuloida ihmisen normaalien fibroblastien proliferaatiota, se ei inhiboi ihmisen proliferatiivisia eikä sytotoksisia T-soluvasteita eikä granulosyyttisten/myelosyyttisten luuydinpesäkesolujen 10 muodostumista, sen molekyylipaino on 17 - 19 kD määritettynä geeliekskluusiokromatografiällä ja noin 28 kD määritettynä SDS-PAGE:11a, se kestää käsittelyn 1 N etikkaha-polla ja 1 N ammoniumhydroksidilla ja 56 °C:n lämpötilaa yhden tunnin ajan ja se voidaan valmistaa menetelmällä, 15 jossa a) eristetään leukosyytit, kuten histiosyyttiset lymfoomasolut tai normaalit ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit, imettäväissoluviljelmästä tai imettäväisestä; b) aktivoidaan leukosyytit indusoivalla aineella, kuten ingenolilla, forbolilla tai mitogeenilla; ja 20 c) eristetään kromatografisesti aktivoiduista leukosyyteistä onkostatiini M puhtaana muusta solumateri-aalista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että polypeptidin puhtausaste on : 25 sellainen, että ominaisaktiivisuus on vähintään 100 GIA- ·:··1 yksikköä/ng proteiinia.

..... 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että leukosyytit ovat forbolidies- • > · terillä indusoituja ihmisen histiolyyttisiä lymfoomasolu-30 ja. .1?·’

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että leukosyytit ovat mitogeeniak-tivoituja ihmisen normaaleja perifeerisen veren lymfosyyttejä. 98373 31

5. Vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne ovat spesifisiä patenttivaatimuksen 1 mukaiselle polypep-tidille tai poly(aminohappo)fragmentille.

6. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen poly-5 peptidin läsnäolon detektoimiseksi, tunnettu siitä, että yhdistetään näyte, jonka epäillään sisältävän mainittua polypeptidiä, patenttivaatimuksen 5 mukaisen vasta-aineen kanssa ja määritetään kvantitatiivisesti kompleksin muodostuminen vasta-aineen kanssa.

7. Diagnostinen välineistö, tunnettu sii tä, että se sisältää patenttivaatimuksen 5 mukaista vasta-ainetta ja patenttivaatimuksen 1 mukaista polypeptidiä. • ♦ • « « • · · ♦ « f • · ·» -• ♦ • ··· φ « • · 1 2 3 · « 2 • · « 3 32 98373