CN1157407C - 人白细胞介素-6抑制剂 - Google Patents
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Abstract
一种先前从未介绍过的白细胞介素-6抑制活性物已经成功地从人体前髓细胞白血病细胞系HL-60中分离出来了。用戊二酰亚胺环己酮处理HL-60细胞防止在细胞上清液中出现抑制活性物。用胰蛋白酶孵化HL-60上清液可以摧毁活性物。上述观察指出抑制剂是一种蛋白质。膜和凝胶过滤分析指出蛋白质的分子量在10000到30000道尔顿之间。抑制剂可以利用染色配位体和逆向层析法从其它蛋白质中部分地分离出来。
Description
技术领域
本文涉及一种新的细胞活素拮抗剂的制品,特别是涉及一种可以从组织培养液中离析出的,并已发现具有体外白细胞介素-6拮抗剂活性的白细胞介素-6抑制剂的制品、检定和应用。
背景技术
广泛调查了白细胞介素-6(IL-6)与人体健康和疾病之间的关系。已发现在细菌和病毒感染、创伤、自身免疫疾病和瘤形成的个体的血流和/或体液中IL-6含量升高。IL-6含量和各种症状的严重程度之间的相互关系以及动物模型中抗IL-6抗体的有利作用使人想到细胞活素可能在有些疾病的征兆上起了病理生理作用。所以IL-6拮抗物可能对治疗有用。
我们也必须对特定的、天然的IL-6拮抗物作一介绍。Portier等人(Blood 81(11):3076-82(1993))发现γ-干扰素(γ-IFN)能抑制与骨髓瘤细胞增长有关的IL-6,但γ-IFN在体外其它类型的试验中不能抑制IL-6活性。
Brakenhoff等人(J.Biol.chem.269(1):86-93(1994))设计了能与80 KD IL-6R结合而不与gp130结合的生物失活的IL-6突变体,这就防止了信号的转导作用。这些突变蛋白质通过避免自然IL-6结合到IL-6受体亚基上面起到IL-6拮抗物的作用。然而,突变蛋白质潜在的致免疫性难以用于治疗。
Klein等人(Blood 78:1198-1204(1991))发现给得白血病的病人用鼠抗IL-6抗体阻断骨髓里的骨髓瘤细胞增生。而虽然因为鼠抗体是异种蛋白质,可仍有潜在的致免疫性。
已经假定可溶性80KD受体的生物工程衍生物通过与循环的IL-6结合,而不是与gp1 30结合就能起到IL-6拮抗物的作用,这样来予防信号转导作用(J.Bauer Biotechnology Therapeutics,2(3和4):285-298(1991))。然而,如果用这些蛋白质治疗的话,那它们就应具有一个被认为是异种蛋白的抗原决定基,同时也是致免疫的抗原决定基。Bauer也介绍了已经开始利用人的抗人体IL-6抗体治疗多发性骨髓瘤的临床试验,临床试验的结果还未知。
已经证明单核细胞/巨噬细胞都能产生细胞活素和细胞活素抑制物,例如,Roberts等人在受呼吸性多核病毒(RSV)感染的单核细胞(J.Exp,Med.163:511-519(1986))中发现了IL-1抑制剂,也发现了IL-1受体拮抗物蛋白质(Janson等人;J.Immunol.147(12):4218-4223(1991)。本发明中,我们调查研究了这种细胞也分泌IL-6抑制剂的可能性。因为难以供给人体外周血液单核细胞,所以我们采用人体前髓细胞白血病细胞系HL-60。用佛波醇二酯处理HL-60诱导分化成显示几种巨噬细胞性能的细胞(Hall等人Cell.Immunol.76:58-68(1983)),而用二甲亚砜(DMSO)或视黄酸(RA)处理的结果是沿着粒细胞途径分化(Leftwich等人,Canc,Res,46:3789-3792)。我们发现HL-60细胞暴露在佛波醇二酯中特别能诱导HL-6抑制剂的分泌。好像这种HL-6抑制剂显然就是一种新的人体蛋白质。因为HL-60细胞系是人体的,所以IL-6抑制剂就应当含有人体氨基酸序列,并因此在体内是不致免疫的。这应当改进了先前IL-6拮抗物实例。
发明内容
本发明揭示的抑制剂制品包括一种抑制剂,其特征是它能从HL-6细胞系中得到,并通过凝胶过滤层析法测定具有大约10000和30000道尔顿的分子量。抑制剂也能与Blue琼脂糖凝胶(Sepharose)、阴离子交换树脂、逆向层析树脂粘合并能从中洗脱。抑制剂阻止依赖IL-6的B9细胞系的增殖。在刺激作用完全消除了上述清液的抑制活性期间,通过胰蛋白酶消化并用放线菌酮处理使抑制的活性减少了50多倍。这种活性能抗酸和热的处理。
抑制剂可以通过Blue琼脂糖凝胶层析法、阴离子交换树脂层析法和逆向层析法从激化了的HL-60上清液中部分地离析出来。
抑制剂已被用于在体外研究IL-6对细胞功能的影响,并及时断定对治疗以IL-6含量升高为特征的病症是有用的。
附图说明
图1:在HL-60细胞中诱导IL-6抑制剂
用10ng/ml PMA、130ng/ml PDBu、50ng/m1 A23187、1.2%v/v DMSO、PMA和A23187或含1%v/v乙醇的乙醇处理HL-60培养物24小时。在有或没有130ng/ml PDBu的24小时诱导期前5天,要加10nM的RA。将细胞洗涤并以1×106细胞/ml重新悬浮在RPMI-2中。保温培养3天后,在室温下,以200xg离心分离10分钟而得到无细胞的培养液,并在B9细胞实验中分析抑制IL-6活性。
图2:IL-抑制剂对U373细胞增殖的影响。
用10ng/ml PMA处理1×106细胞/ml的HL-60细胞24小时,将细胞洗涤并重新悬浮在RPMI-2中,然后孵化3天。用离心分离来制得培养液,再在有或没有IL-1α的U373试验中进行分析。用抗IL-1(1μg/孔)做比较。
图3:细胞密度和PMA浓度的最佳化
在指定的细胞密度下建立HL-60培养物并用RPMI-2里的PMA的指定浓度孵化24小时。收集细胞,洗涤并按原始细胞密度重新悬浮。24小时以后,在IL-6存在下,以B9试验分析无细胞组织培养液。显示了细胞密度(A)和PMA浓度(B)对抑制剂表达的影响。
图4:HL-60上清液的Superose 12HR10/30层析
用YM 3膜使TCF浓缩约17倍并透析滤入pH7.0的50mM磷酸钠(起始缓冲液)中。把0.5ml的浓缩液加到柱子里。该柱的缓冲液是10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、150mM pH7.8的氯化钠。柱流速为0.5ml/min并以1ml馏分收集。直接在B9试验中测试馏分的抑制剂活性。
图5:HL-60上清液的Mono Q层析
用YM 3膜使TCF浓缩约17倍,并透析滤入起始缓冲液中。用20mM pH7.5的Tris液使层析柱平衡。用Tris缓冲液以1∶2稀释浓缩过的TCF,再把0.5ml装进柱内。用含20mM三羟甲基氨基甲烷1M pH7.5的NaCl的最终缓冲液以线性梯度洗脱蛋白质。以0.5ml为馏分收集进含BSA的管内。为了测试抑制剂活性,将0.4ml馏分浓缩4-8倍并用RPMI 1640透析过滤。
图6:HL-60上清液的Blue Sepharose层析
用YM 10膜使TCF浓缩约87倍,并通过透析滤入起始缓冲液中。把浓缩过的TCF装到一个50ml的柱内,并用起始缓冲液冲洗该柱。然后,使用0-1M线性梯度NaCl的起始缓冲液,再用在50mM磷酸钠、4M pH7.0 NaCl中的50%乙二醇溶液洗脱。以10ml馏分收集。为了用于B9试验,将所收集馏分样品浓缩4-8倍,并透析滤入RPMI-1640中。
图7:从Blue Sepharose层析洗脱的HL-60抑制活性的逆相层析
把从Blue Sepharose层析出来的含有抑制活性的馏分合并进二个池中,一个以约900mM、NaCl的线性梯度液洗脱(A),另一个用50%乙二醇4M NaCl洗脱(B)。二个都要浓缩约100倍,并分别加到用0.1%(v/v)三氟乙酸的水溶液平衡的2ml ProRpc逆向柱上。用起始缓冲液洗涤柱子,再用20%v/v至80%v/v线性梯度的HPLC级乙腈的0.1%(v/v)TFA溶液来洗脱。收集馏分(0.3ml),蒸发干燥,并为了进行B9试验分析而重新悬浮在0.1ml水中。
图8:逆向层析分离出来的HL-60抑制活性物的逆向层析
将从Blue Sepharose池A和B逆向层析出来的有效馏分合并在一起,并重新用20-80%(v/v)乙腈的0.1%TFA线性梯度液在2mlProRpc柱上进行层析。按图7所述方法分析馏分的IL-6抑制活性。
图9:HL-60抑制剂的热处理
将下面的样品在100℃下加热15分钟,然后在B9试验中测定抑制活性。(1)Blue琼脂糖凝胶峰2:不稀释的,(2)Blue琼脂糖凝胶峰2∶1∶10,(3)Blue琼脂糖凝胶峰2∶1∶100,(4)Blue琼脂糖凝胶峰2∶1∶1000,(5)抗IL-6 5.0μg/ml,(6)抗IL-6 0.5μg/ml,(7)抗IL-650ng/ml(8)抗IL-6 5ng/mL,(9)RPMI-2:未稀释的,(10)RPMI-2∶1∶10、(11)RPMI-2∶1∶100、(12)RPMI-2∶1∶1000。
图10:HL-60抑制剂的胰蛋白酶消化
用一个10KD分子量阻塞的过滤器,使500μl含有IL-6抑制活性物的Blue琼脂糖凝胶池透析滤入0.1M pH8.0的碳酸氢铵(消化缓冲剂)中。把(250μL/样品)样品加到予先用消化缓冲液洗过的固定化的胰蛋白酶的不相连粒子上,并在37℃下孵化3.5小时。利用离心沉淀无菌过滤回收胰蛋白酶消化液,并在B9试验中与未处理的样品进行比较。
图11:HL-60抑制剂的酸处理
将含有IL-6抑制剂的Blue琼脂糖凝胶池用0.1%三氟乙酸/100%乙腈,PH≤2或无菌水以1∶2稀释。蒸发干燥后,使样品在100μlRPMI中重组,无菌过滤,再用B9试验进行分析。
图12:戊二酰亚胺环己酮对合成HL-60抑制剂的影响
用10ng/ml PMA处理106/ml的HL-60细胞。24小时后,粘性细胞洗涤在RPMI-2中并除去非粘性的细胞。然后在RPMI-2或含有100μg/ml戊二酰亚胺已酮的RPMI-2中孵化复制的培养物。又过24小时后,除去TCF并将细胞洗涤以除去戊二酰亚胺环己酮。细胞在RPMI-2中孵化2天多,这时,收集TCF,以B9分析法来分析抑制活性。在进行试验前所有TCF样品都要进行透析以保证除去戊二酰亚胺环己酮。
具体实施方式
试剂
乙酸肉豆寇酸佛波醇酯(PMA)、二丁酸佛波醇酯(PDBu)、A23187、全反式视黄酸(RA)、和二甲亚砜(DMSo)都购于Sigma化学公司。PMA、PDBu、A23187和RA贮备液要贮存在-20℃乙醇中。所有试剂都要避光并在使用前才稀释到适当的介质中。重组人体IL-6购自Genzyme。抗IL-6、抗IL-1α、抗IL-1β和重组人体IL-1α购自R&D Systems。
细胞培养物
用两种HL-60细胞系(ATCC # CCL-240)来产生抑制活性物。第一种细胞系分泌高含量的IL-6,而第二种细胞系分泌20pg/ml以下的IL-6。细胞系保存在由10%热减活的FBS(Hyclone)(RPMI-10)补充的RPMI-1640(Gibco)中。在无Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS-CMF Gibco)中洗涤细胞并重新在含有适当诱导剂的RPMI-1640中悬浮,收集组织培养液(TCF),再用B9试验测定IL-6抑制剂活性。最初实验是用分泌IL-6的细胞系确定最佳诱导剂和细胞浓度的实验。后来的实验说明了佛波醇二酯(例如PMA、PDBu等)刺激之后,不分泌HL-60的细胞系能产生IL-6抑制剂。经凝胶过滤,由IL-6非分泌者合成的抑制剂和由IL-6分泌者合成的抑制剂具有相同的分子量。为了避免由于IL-6的存在,产生异常结果,使用购自ATCC的非分泌细胞系来进行特征性和提纯研究。
与IL-6相关的B9试验
将B9鼠的杂交瘤细胞系(P.Scuderi,Miles Research Center;West Haven,CN赠品)保存在用至少1unit/ml IL-6补充的RPMI-10中。为了用于试验,要在96孔板(Corning)上按5×104细胞/ml浓度接种细胞,该96孔板中以100μl/孔存在有含5%FBS(RPMI-5)的RPMI。加入20μl(原始TCF)或10μl(柱馏分)的待测样品。一半孔得接受按2单位/ml IL-6的RPMI-5 100μl,而另一半将接受100μl的RPMI-5。将抗IL-6以0.5-1μg/孔的浓度加到对照孔中以保证IL-6的特殊效应正是要测的。3-4天的孵化期后,用3H-胸苷(3-Tdr,Dupont-NEN)掺合物或用MTS四唑鎓(promega)转化成的水溶性甲来测量细胞的增殖。对于3H-Tdr掺和物,细胞要用0.5μci/孔3H-Tdr标记5小时,用Tomtec Autotrap收集在滤器上并用一块1205BSβ板(LKB-Wallac)测定了3H掺和物。为了非放射性的测定细胞增殖,使用细胞标度96AQ的非放射性细胞增生试验法(promega)。样品测试一式三份,并按下式用平均值计算抑制百分率:
为了确定非放射性试验中的抑制百分率,要用O.D.值代替上式中的CMP。
与IL-1相关的U373试验
已由其它人(Lachman等人J.Immunol,138(9):2913-29-6(1987))报道了IL-1在U373(人体星形细胞瘤/恶性胶质瘤)细胞系上的生长刺激作用。为了用于试验,让U373-MG(ATCC# HTB 17)细胞渐渐汇集进RPMI-10中。测试的前一天,用胰蛋白酶处理细胞并按1×104细胞/孔,在含1%FBS(RPMI-1)的RPMI的96-孔板上进行接种。然后在有或没有5单位/ml IL-1α的每孔200μl的总体积中加进20μl组织培养液(TCF)的测试样品。加进适量体积的RPMI-2作为阴性对照。细胞培育2天并在最后5小时要加进0.5μci/孔的H3-Tdr。收获细胞并测定3H掺和物。
柱层分析
使PMA诱导HL-6的培养物上清液透析滤入指定的缓冲液中,再用YM 10或YM3膜(Amicon)超滤进行浓缩。把浓缩过的上清液放到层析树脂上,并按附图所述方法洗脱。为了分析IL-6抑制剂活性,将馏分滤过0.22μm滤器,而且,如果洗脱的缓冲液与B9试验不相容,就用RPMI-1640透析。除非另有说明所有树脂都购自Pharmacia。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
用非还原性SDS-PAGE缓冲液以1∶2稀释要电泳移动的样品,并在100℃下煮沸5-10分钟。把20μl稀释过的样品加到10-20%梯度的SDS-PAGE凝胶(BioRad)上,并在200V下电泳移动约45分钟。用Coomassie Blue R-250或银使凝胶着色。
实施例1
图1概括了几种已知体外调制HL-60细胞分化的化合物的作用。用10ng/ml PMA或130ng/ml PDBu处理每毫升RPMI-1640含0.5-2×106HL-60细胞,知道这两种化合物都能诱导单核细胞分化。24小时后.细胞变粘、起泡并中止生长,把这些细胞转移进RPMI-2中,三天后,正如用B9试验测定的,在用PMA或PDBu处理的细胞的培养液中发现IL-6抑制剂,而在用能诱导粒细胞分化的DMSO或RA处理细胞的培养液中没发现。在有些细胞系中,钙离子载体和佛波醇酯可以协同引起细胞活化。然而我们发现用PMA和钙离子载体(A23187)共同刺激不能把抑制剂的含量提高到超过只用PMA诱导的抑制剂的含量。只用A23187不产生可测得的抑制剂。
在添加PMA的24小时内就可以测得培养液中的IL-6抑制剂并在除去诱导剂后48小时中分泌继续进行。尽管单用PMA就能刺激B9细胞生长且HL-60培养液的首次收集物大概就含有10ng/ml的PMA残余物,也还是能在这个收集的粗品上清液中观察到抑制剂活性物。
实施例2
除抑制IL-6刺激B9细胞增殖外,HL-60衍生的抑制剂能抑制B9细胞的内源性(与IL-6无关)生长。抗IL-6只对IL-6刺激的增殖有作用,为了排除HL-60衍生的活性物是一种胸苷掺合物的抑制剂或一种非特异性细胞增殖的抑制剂的可能性,也要分析对U373细胞的作用。用IL-1而不是用IL-6刺激U373细胞增殖。见图2,1×106HL-60细胞/ml用10ng/ml PMA处理24小时。把细胞移进RPMI-2中,并进一步孵化3天。收集上清液并在U373试验中测定。在诱导HL-60细胞的PMA培养液中,按U373试验测定没有检出刺激细胞增殖的IL-1抑制剂或细胞生长的特异抑制剂。事实上,可以发现HL-60培养液刺激U373细胞增殖,估计可能是由于上清液中有IL-1存在。利用抗IL-1作对照实验得到了期望的结果。另外,HL-60抑制剂不抑制CTLL细胞的IL-2依赖的或非特异的增殖。
结果
将最初的研究扩展到确定诱导抑制剂的最佳条件上。使用密度在0.5到2.0×106细胞/ml的HL-60细胞和浓度为1-10ng/ml的PMA(见图3)可以看到能最佳产生抑制剂。
抑制剂的检定
柱层析法:用不分泌IL-6的HL-60细胞系来进一步检定抑制剂并从含杂质的蛋白质中分级分离抑制剂活性物。使用大小排阻、阴离子变换、Blue琼脂糖凝胶和逆向层析法。为了简化大规模的提纯,可将细胞在无血清的RPMI-1640中诱导。为了大概地测定抑制剂的分子量,使TCF通过一个30KD膜进行超滤用10KD膜浓缩之后,就在过滤物中发现活性物,表明抑制剂分子量低于30KD但高于10KD。
为了进一步检定抑制剂,在琼脂糖12凝胶过滤柱上层析分离浓缩并透析后的TCF。见图4。与大约20KD相对应的位置上洗下活性物。利用ELISA(R&D System)测定IL-6。
浓缩HL-60 TCF并放到MonoQ阴离子变换柱里。见图5。测定由MonoQ柱出来的馏分的抑制活性,并在175mM的NaCl处发现洗脱的活性物。在DEAE-Sephacel中,发现洗脱抑制剂活性物在150mM NaCl处
因为先前已经使用Blue琼脂糖凝胶来分离细胞活素,所以在这种树脂上层析分离含有IL-6抑制剂的TCF。见图6。在使用的条件下,TCF中的大部分蛋白质不会结合到柱子上。在大约900mM NaCl(池A)或在其后50%乙二醇/4M NaCl(池B)上的宽峰里有洗脱的抑制剂活性物。通过SDS-PAGE分析来自Blue琼脂糖凝胶的抑制剂峰的馏分,还含有多种蛋白质。
使用C1/C8逆向层析分离法(ProRpc)进一步使抑制剂纯化。见图7。发现来自Blue琼脂糖凝胶池(A)(图7A)或池B(图7B)的IL-6抑制活性物都在约40%乙腈中洗下。合并来自这些试验中的活性馏分,并使用改进分解率的浅梯度的ProRpc上再次色层分离(图8)。在约32%乙腈处洗下抑制剂活性物。SDS-PAGE分析(10-20%梯度凝胶)显示有多条蛋白质带存在。这样一来,虽然来自TCF的抑制剂已经进行了有效的净化,但仍未能使抑制剂纯化到均匀一致。
检定:
将从Blue琼脂糖凝胶洗脱的抑制剂的部分净化池液100℃下加热15分钟,与抗IL-6相比抑制剂活性没有任何明显损失(见图9)。用固态胰蛋白酶处理Blue琼脂糖凝胶池,抑制活性减少64倍(见图10)。用0.1%三氟乙酸乙腈液PH≤2处理TCF,活性损失3倍(见图11)。用戊二酰亚胺环己酮(一种已知的蛋白质合成抑制剂)培养PMA刺激后的HL-60细胞,结果在B9试验中完全抑制了抑制的活性(见图12)。以上实验结果强有力地说明了所看到的抑制作用正是在HL-60 TCF中存在蛋白质的结果。
讨论
在诱导巨噬细胞谱系分化的HL-60细胞培养液中检测刺激B9杂种瘤细胞增生的IL-6抑制剂。乙酸肉豆寇佛波醇(PMA)和非亲水的二丁酸佛波醇二酯(PDBu)用作抑制剂活性物的诱导剂是有效的。我们发现诱导剂浓度和细胞密度是抑制剂表达最佳的关键参数,例如1-10ng/ml PMA,和0.5-2.0×106细胞/ml。用视黄酸(RA)和二甲亚砜(DMSO)使HL-60细胞沿粒细胞途径分化不诱导产生可检出的抑制剂。细胞暴露在有或没有PMA或RA和PMA组合物的钙离子载体A23187中(已报道提高单核细胞系的活化的条件)都对抑制剂的表达没有明显作用。
HL-60衍生的活性物对与U373细胞的依赖IL-1的或自然的增生速度都没有抑制作用。这些数据提示了这种活性不是一种胸苷摄入的或IL-1的抑制剂,或一种细胞增殖的非特异抑制剂。尽管如此,HL-60抑制剂除了抑制B9细胞在PMA上的暴露所导致的刺激率外还在不加IL-6中观测到抑制B9细胞自然增殖速度,虽然抗IL-6在B9细胞的自然增生上没起作用,但细胞活素的内源性合成可能产生一种自激(autocrine)生长效应,而这样的自激效应难以用抗体抑制。PMA刺激B9细胞增生的机理是未知的,但是,因为B9细胞没有对应的其它已知细胞活素,所以也可能依赖于IL-6的内源性合成。我们的实验性结论是HL-60衍生的活性物可能是一种外加的和内源性的IL-6的特异抑制剂。值得注意的是可以在含有稍高浓度IL-6的HL-60上清液中发现抑制剂活性物。这个观察提出了一项与受体拮抗作用不同的机理,这个机理与抗IL-6和HL-60抑制剂对自生的和PMA诱导的B9细胞增殖上的不同作用相一致。
就我们所知,到现在为止还没有介绍过天然产生的IL-6抑制剂。本文中天然产生人抑制剂的意思是从人体细胞衍生的一种抑制IL-6作用的非基因工程的化合物。可溶性IL-6的受体已有报道,但是,已发现它刺激却不抑制IL-6活性。 因为知道其它可溶性细胞活素受体是拮抗物,所以这是一个独特的观察结果。激动剂活性最可能是由于IL-6受体的构型;以低亲和性与IL-6结合的一个重要的胞外80KD亚基和与IL-6/80KD复合物结合后的gp130提高了80KD受体对IL-6的亲合力同时产生信号转导作用。一种可溶的受体IL-6复合物可能被识别并被gp130结合而转导IL-6信号。
已经证明在自身免疫疾病,例如,系统性红斑狼疮、类风湿关节炎中,IL-6表达过量,并知道细胞活素是肿瘤浆细胞的生长因子。虽然还未报道过IL-6拮抗物对自身免疫疾病的作用,但根据有价值的数据已提出了细胞活素在发病机理上所起的作用。注意到将鼠单克隆抗体用于患浆细胞白血病病人身上会有短期临床反应,提议有效地阻断IL-6功能会对目前的治疗有所帮助。
以上的实施例用来说明本发明,并认为本领域技术人员会进行各种改变。因此应当只用下列权利要求来限定本发明的范围。
Claims (11)
1.一种纯化的白细胞介素6抑制剂,其特征在于:
A)从HL-60细胞系中获得的,
B)按凝胶过滤层析法测定具有10000道尔顿到30000道尔顿的分子量,
C)能抑制白细胞介素6依赖细胞系的白细胞介素6依赖的增殖,
D)可结合并可从Cibrachrome Blue连接的树脂中洗脱下来,
E)可结合并可从阴离子交换树脂中洗脱下来,和
F)可结合并可从逆相树脂中洗脱下来。
2.按照权利要求1的白细胞介素6抑制剂,其中用戊二酰亚胺环己酮孵化所说的HL-60细胞消除了所述抑制。
3.按照权利要求1的白细胞介素6抑制剂,其中HL-60细胞是用佛波醇酯处理的。
4.按照权利要求1的白细胞介素6抑制剂,其中通过用胰蛋白酶进行处理,使所述增殖的抑制减少了50多倍。
5.按照权利要求1的白细胞介素6抑制剂,其中抑制剂是从Cibrachrome Blue树脂中,NaCl浓度约高于800mM、pH约6.5-7.5之间时洗脱下来的。
6.按照权利要求1的白细胞介素6抑制剂,其中抑制剂是从阴离子交换树脂中,NaCl浓度高于约140mM、pH约为7.0-8.0时洗脱下来的。
7.按照权利要求1的白细胞介素6抑制剂,其中抑制剂是从C1/C8逆相树脂中,乙腈浓度约30-50%时洗脱下来的。
8.按照权利要求1的白细胞介素6抑制剂,其中在100℃下加热15分钟时,增殖的抑制不受影响。
9.按照权利要求1的白细胞介素6抑制剂,其中通过用酸进行处理,将增殖的抑制减少大于或等于2倍。
10.按照权利要求1的白细胞介素6抑制剂,其中所述白细胞介素6依赖细胞系是B9。
11.一种制备权利要求1抑制剂的方法,其中包括在足以诱导白细胞介素6抑制剂产生的条件下,使HL-60细胞与佛波醇酯接触的步骤。
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