KR100424553B1

KR100424553B1 - 사람인터루킨-6억제제

Info

Publication number: KR100424553B1
Application number: KR1019950024486A
Authority: KR
Inventors: 델리아이.펜자; 수잔케이.페리스; 케네스제이.램바흐
Original assignee: 바이엘 코포레이션
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 2004-07-01
Also published as: CA2155629A1; DE69528325D1; CN1136043A; ES2183846T3; TW438808B; ATE224914T1; DE69528325T2; EP0696594B1; CN1157407C; JPH08169840A; ZA956636B; US5527546A; IL114876A; EP0696594A1; AU684968B2; IL114876A0; KR960006937A; AU2838995A

Abstract

본 발명은 아직까지 보고된 바 없는 사람 전골수세포 백혈병 세포주 HL-60의 상등액으로 부터 성공적으로 분리시킨 인터루킨-6 억제제 활성에 관한 것이다. HL-60 세포주를 사이클로헥시마이드로 처리하면 세포 상등액중의 억제 활성 발생을 방지하게 된다. HL-60 상등액과 트립신의 배양은 활성을 파괴시킨다. 이 같은 관찰은 이 억제제가 단백질임을 나타낸다. 막 및 겔 여과 연구는 이 단백질이 10,000 내지 30,000달톤의 분자량을 가짐을 보인다. 억제제는 염료-리간드 및 역상 크로마토그래피에 의해 다른 단백질로 부터 부분적으로 분리된다.

Description

사람 인터루킨-6 억제제

본 발명은 일반적으로 신규한 사이토킨 길항제 제제 및 특히 조직 배양액으로부터 분리시킬 수 있고 시험관내 인터루킨-6 길항제 활성을 갖는 것으로 밝혀진 인터루킨-6 억제제의 제조, 특징화 및 용도에 관한 것이다.

사람의 건강과 질환에서 인터루킨-6(IL-6)의 관련성은 철저하게 연구되고 있다. 박테리아 및 바이러스 감염, 외상, 자가면역 질환 및 종양을 가진 개체의 혈류 및/또는 체액 중 IL-6의 수준이 증가함이 발견된바 있다. 동물모델에서 IL-6 수준과 증상의 중증도의 상관관계 및 항-IL-6 항체의 유익한 효과는 사이토킨이 몇가지 질환 상태에서 병리-생리학적 역할을 나타내는 것을 암시한다. 따라서 IL-6의 길항제는 치료적으로 유용하다.

특이한, 천연 IL-6 길항제는 아직 더 조사할 영역이 남아있다. 폴티어등[참조: Portier et al., Blood, 81 (11); 3076-82 (1993)]은 γ-인터페론(γ-IFN)이 IL-6 의존성 골수종 세포 증식은 억제하나 γ-IFN이 다른 타입의 시험관내 분석에서는 IL-6 활성을 억제하지 않는다는 것을 발견하였다.

브라켄호프등[참조: Brakenhoff et al., J. Biol. Chem., 269 (1): 86-93 (1994)]은 80 kD IL-6R에는 결합하나 gp 130에는 결합하지 않음으로써 시그날 전달을 억제시키는 생물학적으로 불활성인 IL-6 돌연변이체를 유전자 공학으로 제조한 바 있다. 이러한 돌연변이체 단백질은 천연의 IL-6가 IL-6 수용체 소단위에 결합하는 것을 억제함으로써 IL-6 길항제로서 작용한다. 그러나, 돌연변이체 단백질의 잠재적 면역원성은 치료적 용도로서의 난제일 수 있다.

클라인등[참조: Klein et al., Blood, 78:1198-1204(1991)]은 백혈병을 가진 환자에게 쥐과 항-IL-6 항체의 투여가 골수내에서 골수종 세포의 증식을 차단함을 발견해내었다. 그렇긴해도, 쥐과의 항체가 외래 단백질이기 때문에 면역원성에 대한 가능성은 남아있게 된다.

가용성 80 kD 수용체의 생물공학 처리된 유도체가 gp 130과는 결합하지 않고 순환하는 IL-6와 결합하여 시그날 전달을 방해함으로써 IL-6 길항제로서 작용할것으로 가정된바 있다[참조: J. Bauer, Biotechnology Therapeutics, 2(3 & 4): 285-298 (1991)]. 그러나, 이들 단백질은 외래 단백질로서 인지되어질 수 있는 에피토프를 가질 수 있으며 치료제로서 사용될 경우 여전히 면역원성일 수 있다. 바우어는 또한 다발성 골수종의 치료를 사람 항-사람 IL-6 항체를 사용한 임상적 시도가 시작되었다고 언급한바 있다(상기 참조). 현재까지, 이 임상적 시도의 결과는 알려져 있지않다.

단핵구/대식세포는 사이토킨 및, IL-1 억제제와 같은 사이토킨 억제제를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 로버트 등은 호흡기 합포체성 바이러스(RSV: Respiratory Syncytial Virus) 감염된 단핵구[참조: Robert et al., J. Exp, Med., 163:511-519(1986)] 및 IL-1 수용체 길항제 단백질[참조: Janson et al., J. Immunol., 147(12): 4218-4223 (1991)]을 발견하였다. 본 발명에서, 발명자들은 이러한 세포들 또한 IL-6 억제제를 분비할 수 있을지의 가능성을 조사하였다. 사람 말초혈액 단핵구를 지속적으로 공급하도록 하는것이 어렵기 때문에 사람 전골수 세포 백혈병 세포주 HL-60을 이용하였다. HL-60을 포르볼 디에스테르로 처리하면 대식세포의 여러가지 특성을 나타내는 세포로의 분화를 유도하지만[참조: Hall et al., cell, Immunol., 76: 58-68 (1983)], 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 레틴산(RA) 처리는 과립구 세포 경로를 따른 분화로 나타난다[참조: Leftwich et al., Canc. Res., 46: 3789-3792]. 본 발명자들은 HL-60 세포를 포르볼 디에스테르에 노출시키면 특이적으로 IL-6 억제제의 분비를 유도함을 발견하였다. 이 같은 IL-6 억제제가 분명히 신규한 사람 단백질인것으로 나타났다. HL-60 세포주가 사람이기 때문에, IL-6 억제제는 사람 아미노산 서열을 함유해야만 하며 따라서 생체내에서 면역원이 되지는 않는다. 이 같은 사실은 IL-6 길항제의 선행 예증에 비해 진보된 점이다.

본 발명의 억제제 제제는 HL-60 세포주로부터 수득가능하며 겔 여과 크로마토그래피에 따라 측정한 바와 같이 약 10,000 내지 30,000 달톤의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 억제제를 포함한다. 이 억제제는 또한 블루 세파로스(Blue sepharose)와 결합 및 용출가능하며 음이온 교환 수지와 결합 및 용출가능하고 역상 크로마토그래피와 결합 및 용출가능하다. 이 억제제는 B9 세포주의 IL-6 의존성 증식을 억제시킨다. 억제 활성은 트립신 분해에 의해 50배 이상 감소되며 자극 동안에 HL-60 세포주를 사이클로헥시마이드로 처리하면 세포 상등액의 억제 활성은 완전히 소멸된다. 이 활성은 산과 열처리에 내성을 갖는다.

억제제는 블루 세파로스, 음이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피에 의한 크로마토그래피에 의해 자극시킨 HL-60 상등액으로 부터 부분적으로 분리시킬 수 있다.

이 억제제는 시험관내에서 세포의 기능에 대한 IL-6의 효과를 연구하는데 유용하며 조만간에 증가된 IL-6 수준을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 치료적으로 유용한 것으로 보인다.

제1도는 HL-60 세포에서의 IL-6 억제제의 유도를 나타낸다. HL-60 배양물을 PMA (10ng/ml), PDBu(130ng/ml), A23187(50ng/ml), DMSO(1.2% v/v), PMA 및 A23187, 또는 에탄올(EtOH, 1% v/v)로 24시간 처리한다. RA(10nM)를 PDBu(130ng/ml)의 존재 또는 부재하에 24시간 유도시키기 5일 전에 가한다. 세포를 세척하고 RPMI-2중에 1x10⁶세포/ml로 재현탁시킨다. 배양 3일후, 실온에서 10분간 200xg로 원심분리시켜 세포-없는 배양액을 제조하고 B9 세포 분석에서 IL-6 활성의 억제에 대해 분석한다.

제2도는 U373 세포의 증식에 대한 IL-6 억제제의 영향을 나타낸다. HL-60 세포(1x10⁶세포/ml)를 PMA(10ng/ml)로 24시간 처리한다. 세포를 세척하고 RPMI-2 중에 재현탁시키며 3일간 배양한다. 배양액을 원심분리시켜 제조하고 IL-1α의 존재 또는 부재하에 U373에서 분석한다. 대조용으로서 항-IL-1(1μg/웰)을 사용한다.

제3도는 세포 밀도 및 PMA 농도의 최적화를 나타낸다. HL-60 배양물을 지시된 세포 밀도까지 확립시키고 RPMI-2 중에서 지시된 농도의 PMA와 24시간 배양한다. 세포를 수거하고, 세척하며 최초 세포 밀도로 재현탁시킨다. 24시간 후, IL-6의 존재하에 세포-없는 조직 배양액을 B9 분석에서 분석한다. 억제제 발현에 대한 세포밀도(A) 및 PMA 농도(B)의 영향을 나타내고 있다.

제4도는 HL-60 상등액의 슈퍼로스 12(Superose 12) HR 10/30 크로마토그래피를 나타낸다. YM3 막을 써서 TCF를 대략 17배 농축하고 50mM 인산나트륨(pH 7.0; 출발 완충액)중에 투석 여과시킨다. 컬럼에 0.5ml의 농축물을 적용시킨다. 컬럼 완충액은 10mM 트리스, 150mM NaCl(pH 7.8)이었다. 컬럼 유속은 0.5ml/분이고 1ml 분획을 수거한다. 분획을 B9 분석을 써서 억제제 활성에 대해 직접 시험한다.

제5도는 HL-60 상등액의 모노 Q(Mono Q) 크로마토그래피를 나타낸다. YM3 막을 써서 TCF를 대략 17배 농축하고 출발 완충액중에 투석 여과시킨다. 컬럼을 20mM 트리스(pH 7.5)로 평형화시킨다. 농축된 TCF를 트리스 완충액으로 1:2로 희석시키고 0.5ml를 컬럼상에 부하시킨다. 20mM 트리스, 1M NaCl(pH 7.5)를 함유하는 최종 완충액으로 단백질을 선형 구배중에서 용출시킨다. 0.5ml 분획을 BSA-함유 튜브중에 수거한다. 억제제 활성을 분석하기 위해 0.4ml의 분획을 4∼8배 농축시키고 RPMI-1640으로 투석 여과시킨다.

제6도는 HL-60 상등액의 블루 세파로스크로마토그래피를 나타낸다. YM10막을 써서 TCF를 대략 87배 농축시키고 출발 완충액내로 투석 여과시킨다. 농축시킨 TCF를 50ml의 컬럼에 부하하고 컬럼을 출발 완충액으로 세척한다. 그후 출발 완충액 중의 0 내지 1M NaCl의 선형 구배를 적용하고 50mM 인산나트륨, 4M NaCl(pH7.0)중에서 50% 에틸렌 글리콜로 용출시킨다. 10ml 분획을 수거한다. B9 분석에 사용하기 위해 수거한 분획의 샘플을 4 내지 8배 농축시키고 PRMI-1640내로 투석여과시킨다.

제7도는 블루 세파로스크로마토그래피로 부터 용출시킨 HL-60 억제활성의 역상 크로마토그래피를 나타낸다. 억제 활성을 함유하는 블루 세파로스 크로마토그래피로부터의 분획을, 선형 구배중에서 대략 900mM NaCl에서 용출시킨 제1(A) 풀 및 50% 에틸렌글리콜, 4M NaCl로 용출시킨 제2(B)풀의 두 풀내에 혼합시켜 넣는다. 풀을 대략 100배 농축시키고 독립적으로 수중 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA)으로 평형시킨 2ml ProRPC역상 컬럼에 적용시킨다. 컬럼을 출발 완충액으로 세척하고 0.1%(v/v) TFA중 HPLC 등급 아세토니트릴의 20%(v/v) 내지 80%(v/v) 선형 구배로 용출시킨다. 분획(0.3ml)을 수거하고, 무수조건까지 증발시키며 B9 분석에서 분석하기 위해 0.1ml H₂O중에 재현탁시킨다.

제8도는 역상 크로마토그래피로 분리시킨 HL-60 억제 활성의 역상 크로마토그래피이다. 블루 세파로스풀(A) 및 (B)의 역상 크로마토그래피로 부터의 활성 분획을 혼합하고 0.1% TFA 중에서 20 내지 80%(v/v) 아세토니트릴 구배를 써서 2ml ProRPC컬럼상에서 재크로마토그래피시킨다. 제7도에서 기술한 바와 같이 분획을 IL-6 억제제 활성에 대해 분석한다.

제9도는 HL-60 억제제의 열처리를 나타낸 도면이다. 다음의 샘플을 100℃에서 15분간 가열시키고 B9 분석에서 억제 활성에 대해 시험한다. (1) 블루세파로스피크 2; 미희석, (2) 블루 세파로스피크 2:1:10, (3) 블루 세파로스피크 2:1:100, (4) 블루 세파로스피크 2:1:1000, (5) 항 IL-6, 5.0μg/ml, (6) 항-IL-6, 0.5μg/ml, (7) 항-IL-6, 50ng/ml, (8) 항-IL-6, 5ng/ml, (9) RPMI-2: 미희석, (10) RPMI-2:1:10, (11) RPMI-2:1:100, (12) RPMI-2:1:1000.

제10도는 HL-60 억제제의 트립신 분해를 나타낸 도면이다. 10 kD 분자량 컷-오프 필터를 써서, IL-6 억제제 활성을 함유하는 500㎕의 블루 세파로스풀을 0.1M 중탄산암모늄(pH 8.0; 분해 완충액)중에 투석 여과시킨다. 분해 완충액 중에서 앞서 세척시킨 고정시킨 트립신의 별도 펠렛에 샘플(250㎕/샘플)을 가하고 37℃에서 3.5시간 배양한다. 트립신 분해물을 원심분리로 회수하고 무균 여과시키며, B9 분석에서 미처리된 샘플에 대해 비교한다.

제11도는 HL-60 억제제의 산 처리를 나타낸 도면이다. IL-6 억제제를 함유하는 블루 세파로스풀을 0.1% TFA/100% 아세토니트릴(pH≤2) 또는 무균수 중에서 1:2로 희석시킨다. 무수조건까지 증발시키고, 샘플을 100㎕ RPMI중에 재조성시켜 무균여과시키며 B9 분석으로 분석한다.

제12도는 HL-60 억제제의 합성에 대한 사이클로헥시마이드의 영향을 나타낸다. HL-60 세포(10⁶/ml)를 PMA(10ng/ml)로 처리한다. 24시간 후, 부착된 세포를 RPMI-2중에서 세척하고 비-부착 세포를 제거한다. 그후 2조의 배양을 RPMI-2 또는 100μg/ml의 사이클로헥시마이드를 함유하는 RPMI-2중에서 배양한다. 추가로 24시간 후에, TCF를 제거하고 세포를 세척시켜 사이클로헥시마이드를 제거한다. 세포를RPMI-2중에 2일이상 배양시키고 이때 TCF를 B9 분석에서의 억제 활성 분석을 위해 수거한다. 모든 TCF 샘플을 분석전에 투석여과하여 사이클로헥시마이드를 완전히 제거한다.

시약류

포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA), 포르볼 디부티레이트(PDBu), A23187, 모든-트랜스-레틴산(RA), 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 시그마 케미칼 캄파니로부터 구입한다. PMA, PDBu, A23187 및 RA의 스톡용액을 에탄올중 -20℃에서 보관한다. 모든 시약을 빛으로부터 차단시키고 사용 직전에 적절한 매질중에 희석시켜 넣는다. 재조합 사람 IL-6를 겐자임으로부터 구입한다. 항-IL-6, 항-IL-1α, 항-IL-1β 및 재조합 사람 IL-1α 는 R & D 시스템즈로부터 구입한다.

세포 배양

억제 활성을 발생시키기 위해 2가지 HL-60 세포주(ATCC # CCL-240)를 사용한다. 첫번째 세포주는 고수준의 IL-6를 분비하며 두번째 세포주는 20pg/ml 이하의 IL-6를 분비한다. 세포주는 10% 열 불활성화시킨 FBS(하이클론 제조)(RPMI-10)를 보충한 RPMI-1640(지브코 제조)중에 보존시킨다. 세포를 Ca²⁺및 Mg²⁺없는 둘베코의 인산염 완충시킨 염수(DPBS-CMF, 지브코 제조)중에서 세척하고 적절한 유도제(들)를 함유하는 RPMI-1640내에 재현탁시킨다. 조직 배양물(TCF)을 수거하고 B9 분석을 써서 IL-6 억제제 활성을 측정한다.

최적 유도물질 및 세포 농도를 측정하기 위한 최초 실험을 IL-6 분비성 세포주를 써서 수행한다. 후속 실험은 포르볼 디에스테르(즉, PMA, PDBu 등) 자극후에 비-분비성 HL-60 세포주가 IL-6 억제제를 생성함을 입증하였다. 겔 여과에 의하면, IL-6 비-분비체에 의해 합성된 억제제가 IL-6 분비체에 의해 합성된 억제제와 동일한 분자량을 갖는다. IL-6의 존재로 인한 비정상적인 결과를 피하기 위해, ATCC로부터 입수가능한 비-분비성 세포주를 사용하여 특징화 및 정제 연구를 실시한다.

IL-6 의존성 B9 분석

B9 쥐과 하이드리도마 세포주[CN, 웨스트 헤이븐 소재의 밀즈 리써치 센터의 피.스큐데리(P.Scuderi)로부터 입수]를 1단위/ml 이상의 IL-6로 보충시킨 RPMI-10 중에 보존시킨다. 분석에 사용하기 위해, 세포를 5% FBS(RPMI-5)를 써서 96-웰 플레이트(코닝 제조)중 100㎕/웰에서 5x10⁴세포/ml로 시딩시킨다. 시험할 샘플 20㎕(조 TCF) 또는 10㎕(컬럼 분획)의 용적을 가한다. 웰의 1/2에 RPMI-5중 2단위/ml의 IL-6 100㎕를 가하고 나머지 1/2에는 100㎕의 RPMI-5를 가한다. 대조군 웰에 항-IL-6를 0.5 -1μg/웰로 가하여 IL-6 특이적 효과가 측정될 수 있도록 한다. 3∼4일간의 배양 기간후,³H-티미딘(³H-Tdr, DuPont-NEN) 혼입에 의해 또는 MTS 테트라졸륨(프로메가 제조)의 수용성 포르마잔으로의 전환에 의해 세포 증식을 측정한다.³H-Tdr 혼입을 위해 세포를 0.5μ Ci/웰³H-Tdr로 5시간 표지하고 톰테크 오토트랩(Tomtec Autotrap)을 써서 필터상에 수거하고³H 혼입은 1205 BS 베타플레이트(LKB-Wallac 제조)를 써서 측정한다. 세포 증식의 비-방사능적 검출을 위해,세포 적정기 96 AQ 비-방사능 세포증식 분석법(Cell Titer 96 AQ Non-radioactive Cell Proliferation Assay; 프로메가 제조)을 사용한다. 샘플을 3회 분석하고 %억제를 다음의 방법에 따라 평균값으로 부터 계산해낸다:

비-방사성 분석에서의 % 억제를 측정하기 위해 상기식에서 CPM 대신에 O.D.값을 대신 사용한다.

IL-1 의존성 U373 분석

U373(사람 성상세포종/신경교아종) 세포주에 대한 IL-1의 성장 촉진 효과가 보고된 바 있다[참조: Lachman et al., J. Immunol., 138 (9): 2913-29-6 (1987)]. 이 분석에서 사용하기 위해 U373-MG 세포(ATCC # HTB 17)를 RPMI-10 중에서 합치까지 성장시킨다. 시험 하루전에, 세포를 트립신으로 처리하고, 1x10⁴세포/웰을 1% FBS(RPMI-1)를 함유하는 96-웰 플레이트에 시딩시킨다. 그후 시험 샘플, 20㎕의 조직 배양액(TCF)을 5단위/ml의 IL-1α 의 존재 또는 부재하에 200㎕/웰의 총 용적으로 가한다. 네가티브 대조군으로서 사용하기 위해 적절한 용적의 RPMI-2를 가한다. 세포를 2일간 배양하고 최종 5시간 동안 0.5μ Ci/웰의 3H-Tdr을 가한다. 세포를 수거하고³H 혼입을 측정한다.

컬럼 크로마토그래피

PMA-유도된 HL-60 배양 상등액을 지시된 완충액내로 투석 여과시키고 YM10또는 YM3 막(아미콘 제조)을 써서 한외여과에 의해 농축시킨다. 농축 상등액을 크로마토그래피 수지에 적용시키고 도면에 기술한 바와 같이 용출시킨다. IL-6 억제 활성을 분석하기 위해 분획을 0.22μm 필터를 통해 여과하고, 용출 완충액이 B9 분석과 비혼화성일 경우 RPMI-1640으로 투석 여과시킨다. 모든 수지는 달리 언급하지 않는한 파마시아로 부터 구입한다.

SDS-PAGE

전기 영동시킬 샘플을 비-환원성 SDS-PAGE 완충액을 써서 1:2로 희석시키고 100℃에서 5∼10분간 비등시킨다. 20㎕의 희석시킨 샘플을 10∼20% 구배의 SDS-PAGE 겔(바이오라드 제조)에 부하하고 200V에서 대략 45분간 전기 영동시킨다. 겔을 쿠마시 블루 R-250으로 또는 은으로 염색시킨다.

실시예 1

시험관내에서 HL-60의 분화를 조절하는 것으로 공지된 여러가지 화합물의 효과가 제1도에 요약되어 있다. RPMI-1640 1ml당 0.5-2x10⁶HL-60 세포를 10ng/ml PMA 또는 130ng/ml PDBu로 처리하며, 둘다는 단핵구의 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 24시간 후, 세포가 점차 붙게되고 포를 가지면서 성장을 멈춘다. 세포를 RPMI-2로 옮기고 3일 후 B9 분석으로 측정된 것과 같은 IL-6 억제제가 PMA 또는 PDBu로 처리한 세포의 배양액에서는 발견되나 과립구 세포의 분화를 유도하는 DMSO 또는 RA로 처리한 세포의 배양액에서는 나타나지 않는다. 일부의 세포주에서 칼슘 이온 운반체와 포르볼 에스테르가 상승작용적으로 세포 활성화를 유발시킨다. 그러나, 본 발명자들은 PMA와 칼슘 이온운반체(A23187)를 사용한 동시 자극이 PMA 단독에 의해 유도된 경우보다 높은 수준의 억제제를 증가시키지 않는다는 것을 알아냈다. A23187 단독은 검출가능한 억제제를 생성시키지 않는다.

IL-6 억제제는 PMA 첨가 24시간 이내에 배양액내에서 검출되며 유도제의 제거후 추가로 48시간 분비가 지속된다. PMA 단독이 B9 세포 성장을 촉진할 수 있으며 HL-60 배양액의 첫번째 수거분이 잠재적으로 10ng/ml의 잔류 PMA를 함유함에도 불구하고, 이들 수거물의 조 상등액에서는 여전히 억제 활성이 관찰된다.

실시예 2

B9 세포의 IL-6 촉진된 증식을 억제시키는 것 외에, HL-60-유래된 억제제는 B9 세포의 내재성(IL-6 독립성) 성장을 억제시킨다. 항-IL-6는 단지 IL-6 촉진된 증식에만 영향을 미친다. HL-60-유래된 활성이 티미딘 혼입 또는 세포 증식의 비 특이적 억제제일 수 있는 가능성을 배제하기 위해 U373 세포에 대한 효과를 분석한다. U373 세포의 증식은 IL-6가 아닌 IL-1에 의해 촉진된다. 제2도를 참조하라. 1x10⁶HL-60 세포/ml를 10ng/ml PMA로 24시간 처리한다. 세포를 RPMI-2로 옮기고 3일간 더 배양한다. 상등액을 수거하고 U373 분석으로 분석한다. U373 분석에 의해 측정된 바와 같이 IL-1 촉진된 증식의 억제제 또는 세포증식의 비-특이적 억제제 어느 것도 PMA 유도된 HL-60 세포의 배양액 중에서 검출할 수 없었다. 실제로, HL-60 배양액은 아마도 상등액중에 IL-1의 존재로 인해 U373 세포의 증식을 촉진하는 것으로 나타났다. 항-IL-1을 사용한 대조 실험은 예상한 결과를 나타내었다. 또한HL-60 억제제는 CTLL 세포의 IL-2 의존성 또는 비특이적 증식을 억제하지 않는다.

결과

억제제 유도에 대한 최적 조건을 결정하기 위해 최초 연구를 확장하였다. 최적 억제제 생성은 0.5 내지 2.0x10⁶세포/ml 범위의 HL-60 세포 밀도 및 1 내지 10ng/ml 범위의 PMA 농도를 사용하여 관찰한다(제3도 참조).

억제제의 특징화

컬럼 크로마토그래피: 오염된 단백질로 부터의 억제제 활성을 분획화할뿐 아니라 억제제를 더 특징화하기 위해 IL-6 비-분비성 HL-60 세포주를 사용한다. 크기 배제, 음이온 교환, 블루 세파로스및 역상 크로마토그래피를 활용한다. 대규모 정제를 단순화시키기 위해, 세포를 혈청-없는 RPMI-1640 중에서 유도시킨다.

억제제의 대략적인 분자량을 측정하기 위해 30kD 막을 통해 TCF를 한외여과 시킨다. 10kD 막으로 농축시킨후 여과물에서 발견되는 활성은 억제제의 분자량이 10kD 보다는 크나 30kD 미만임을 나타낸다.

억제제를 더 특징화시키기 위해, 농축 및 투석 여과시킨 TCF를 슈퍼로스 12겔 여과 컬럼상에서 크로마토그래피시킨다(제4도 참조). 대략 20kD에 상응하는 위치에서 활성이 용출된다. IL-6를 ELISA(R & D 시스템즈)로 측정한다.

HL-60 TCF를 농축시키고 모노 Q음이온 교환 컬럼에 적용시킨다(제5도 참조). 모노 Q컬럼으로부터의 분획을 억제제 활성에 대해 분석하고 활성은 175mM NaCl에서 용출되는 것으로 나타났다. DEAE-세파셀(Sephacel)로 부터 억제제 활성은 150mM NaCl에서 용출되는 것으로 밝혀졌다.

앞서 블루 세파로즈가 사이토킨을 분리하는데 사용된 바 있기 때문에 IL-6 억제제를 함유하는 TCF를 이 수지상에서 크로마토그래피시킨다(제6도 참조). 사용된 조건하에서, TCF내의 단백질의 대부분은 컬럼에 결합하지 않는다. 억제제 활성은 약 900mM NaCl(풀 A) 또는 이후의 50% 에틸렌 글리콜/4M NaCl(풀 B)의 넓은 피크에서 용출된다. SDS-PAGE에 의해, 블루 세파로스로부터의 억제 피크 분획은 다수의 단백질을 함유한다.

억제제를 더 정제하기 위해 C1/C8 역상 크로마토그래피(ProRPC)를 사용한다(제7도 참조). 블루 세파로스풀 A(제7A도) 또는 풀 B(제7B도)로 부터의 IL-6 억제 활성은 대략 40% 아세토니트릴에서 용출되는 것으로 밝혀졌다. 이들 전개로부터의 활성 분획을 혼합하고 해상도를 개선시키기 위해 낮은 구배를 써서 ProRPC상에서 재크로마토그래피시킨다(제8도 참조). 억제 활성은 대략 32% 아세토니트릴에서 용출된다. SDS-PAGE 분석(10 내지 20% 구배 겔)은 다수의 단백질 밴드의 존재를 나타낸다. 따라서, TCF로 부터 상당량의 억제제의 정제가 성취된 바 있으나, 아직까지 억제제가 균질하게 정제된 바는 없다.

특징화:

블루 세파로스로 부터 용출시킨 부분적으로 정제한 억제제의 풀을 항-IL-6에서 관찰된 바와 달리 어떠한 억제 활성의 상실도 없이 100℃에서 15분간 가열시킨다(제9도 참조). 블루 세파로스풀을 고정시킨 트립신으로 처리하면 억제 활성을 64배 감소시킨다(참조: 제10도). pH≤ 2에서 아세토니트릴중 0.1% 트리플루오로 아세트산으로 TCF를 처리하면 활성이 3배 소실된다(제11도 참조). PMA 자극후 HL-60 세포를 사이클로헥시마이드(공지된 단백질 합성 억제제)와 배양하면 B9 분석에서 완전한 억제제 활성 억제를 초래한다(제12도 참조). 상기 실험의 결과는 나타난 억제가 HL-60 TCF 중에 존재하는 단백질의 결과로 인한 것임을 강하게 뒷받침해준다.

토의

B9 하이브리도마 세포의 IL-6 촉진된 증식의 억제제는 대식 세포 계열로 분화되도록 유도시킨 HL-60 세포의 배양액 중에서 검출된다. 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 및 비-친유성 디에스테르 포르볼 디부티레이트(PDBu)가 억제 활성의 유도제로서 효과적이다. 유도제 농도 및 세포 밀도가 억제제 발현의 최적화에 중요한 파라메타임이 입증되었다(즉, 1∼10ng/ml PMA 및 0.5-2.0x10⁶세포/ml). 레틴산(RA)과 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용한 과립구적 경로를 따른 HL-60 세포의 분화는 검출가능한 수준의 억제제를 유도하지 않는다. PMA 존재 또는 부재하에 세포를 칼슘 이온담체 A23187 또는 RA 및 PMA의 배합물에 노출시키는 것(이같은 조건은 단핵구 세포주의 활성화를 증가시킨다고 보고된 바 있다)은 억제제의 발현에 아무런 유의성 있는 효과도 없다.

HL-60 유래된 활성은 U373 세포의 IL-1 의존성 또는 자발적 증식율에 아무런 억제 효과를 갖지 않는다. 이같은 데이터는 활성이 티미딘 흡수 또는 IL-1 작용의억제제 또는 세포 증식의 비-특이적 억제제가 아님을 뒷받침하고 있다. 그럼에도 불구하고, HL-60 억제제는 첨가된 IL-6의 부재하에 관찰된 자발적인 B9 세포 증식 속도를 억제하며 또한 PMA에 노출된 B9 세포에 의한 촉진된 속도도 억제한다. 비록 항-IL-6가 B9 세포의 자발적 증식에 아무런 효과도 없으나, 사이토킨의 내인성 합성은 자가분비 성장 효과를 제공하며 이러한 자가분비 효과는 항체에 의한 억제를 반증하는 것이다. PMA가 B9 세포 증식을 억제한다는 기작은 공지되어 있지 않지만, B9 세포가 공지된 다른 사이토킨과는 반응을 나타내지 않기 때문에 IL-6의 내인성 합성에 의존할 수도 있다. 본 발명자들은 HL-60 유래된 활성이 첨가 및 내인성 IL-6의 특이적 억제제일 것이라는 가정적 결론을 내렸다. 오히려 고농도의 IL-6를 함유하는 HL-60 상등액에서 억제 활성이 발견된다는 점이 흥미롭다. 이 같은 관찰은 수용체 길항작용과는 상이한 기작을 암시하고 있으며, 이는 자발적 및 PMA-유도된 B9 세포 증식에 대한 항-IL-6 및 HL-60 억제제의 차등적 영향과 일치한다.

발명자들의 최근 지식으로는, 지금까지 어떠한 자연적으로 나타나는 IL-6 억제제도 기술된 바가 없다. 본원에서 사용된 바와 같이, 자연적으로 생성되는 사람 억제제란, IL-6의 작용을 억제하는, 사람 세포로 부터 유래된 전혀-유전자적으로 처리시키지 않은 화합물을 의미한다. 가용성 IL-6 수용체가 보고된바 있지만, IL-6 활성을 억제시키기 보다는 이를 촉진시킨다고 밝혀졌다. 다른 가용성 사이토킨 수용체가 길항제인 것으로 공지되어 있기 때문에, 이 점은 독특한 관찰이다. 작동제 활성은 주로 IL-6 수용체의 배위에 의한 것으로 보인다; 일차적으로는 낮은 친화도로 IL-6에 결합하는 80kD의 세포외 소단위 및 IL-6/80kD 복합체에 결합한 후 IL-6에 대한 80kD 수용체의 친화도를 증가시킴으로써 시그날 전달을 유발시키는 gp130. 아마도 가용성 수용체-IL-6-복합체가 gp130에 의해 인지 및 결합될 것이며 IL-6 시그날이 전달될 것이다.

IL-6의 과잉 발현은 예를 들어 전신성 홍반성 낭창 및 류마티스성 관절염등의 자가면역성 질환에서 입증된바 있으며, 사이토킨은 종양 혈장 세포에 대한 성장 인자인 것으로 알려져 있다. IL-6 길항제의 효과가 자가면역성 질환에 대해서는 보고된 바 없으나, 병인발생에서의 사이토킨의 역할은 유용한 데이터를 기초로 하여 제안된 바 있다. 형질 세포성 백혈병을 가진 환자에서 쥐과 모노클로날 항체를 사용한 단기의 임상적 반응이 보고된 바 있으며 IL-6 작용의 효과적인 차단은 현대 치료요법에 유익한 보조요법이 되고 있다.

상기한 예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며 당해 분야의 전문가에게는 변화가 가해질 수 있으리라 본다. 따라서, 본 발명의 범주는 다음의 특허청구의 범위에 의해서만 한정시키고자 한다.

제1도는 HL-60 세포에서의 인터루킨-6(IL-6)억제제의 유도를 나타낸다.

제2도는 U373 세포의 증식에 대한 IL-6 억제제의 영향을 나타낸다.

제3(A)도는 억제제의 발현에 대한 세포밀도의 영향을 나타낸다.

제3(B)도는 억제제의 발현에 대한 PMA 농도의 영향을 나타낸다.

제4도는 HL-60 상등액의 슈퍼로스 12HR 10/30 크로마토그래피를 나타낸다.

제5도는 HL-60 상등액의 모노 Q(Mono Q)크로마토그래피를 나타낸다.

제6도는 HL-60 상등액의 블루 세파로스(Blue Sepharose) 크로마토그래피를 나타낸다.

제7도는 블루 세파로스 크로마토그래피로부터 용출시킨 HL-60 억제 활성의 역상 크로마토그래피를 나타낸다.

제8도는 역상 크로마토그래피로 분리시킨 HL-60 억제 활성의 역상 크로마토그래피이다.

제9도는 HL-60 억제제의 열처리를 나타낸 도면이다.

제10도는 HL-60 억제제의 트립신 분해를 나타낸 도면이다.

제11도는 HL-60 억제제의 산처리를 나타낸 도면이다.

제12도는 HL-60 억제제의 합성에 대한 사이클로헥시마이드의 영향을 나타낸다.

Claims

(A) HL-60 세포주로부터 수득가능하고,

(B) 겔 여과 크로마토그래피로 측정한 분자량이 10,000 달톤 내지 30,000달톤이고,

(C) 인터루킨-6 의존성 세포주의 인터루킨-6 의존성 증식을 억제할 수 있고,

(D) 시바크론 블루(Cibacron Blue) 결합 수지와 결합 및 이로부터 용출될 수 있으며,

(E) 음이온 교환 수지와 결합 및 이로부터 용출될 수 있고,

(F) 역상 수지와 결합 및 이로부터 용출될 수 있음을 특징으로 하는 정제된 인터루킨-6 억제제.
제1항에 있어서, 억제제가, 800mM 내지 1M의 NaCl 농도 및 6.5 내지 7.5의 pH에서 시바크론 블루 수지로부터 용출되는 정제된 인터루킨-6 억제제.
제1항에 있어서, 억제제가, 140mM 내지 265mM의 NaCl 농도 및 7.0 내지 8.0의 pH에서 음이온 교환 수지로부터 용출되는 정제된 인터루킨-6 억제제.
제1항에 있어서, 억제제가, 30 내지 50%의 아세토니트릴 농도에서 C1/C8 역상 수지로부터 용출되는 정제된 인터루킨-6 억제제.
제1항에 있어서, 증식의 억제가, 트립신 분해에 의해 50배 감소 내지 억제 활성이 소멸되는 수준까지 감소되는 정제된 인터루킨-6 억제제.
제1항에 있어서, 증식의 억제가, HL-60 세포를 사이클로헥시마이드와 함께 배양시킴으로써 소멸된 정제된 인터루킨-6 억제제.
제1항에 있어서, 증식의 억제가, 100℃에서 15분간 가열하여도 영향을 받지 않는 정제된 인터루킨-6 억제제.
제1항에 있어서, 증식의 억제가, 산으로 처리함으로써 2배 내지 3배 감소된 정제된 인터루킨-6 억제제.
제1항에 있어서, 인터루킨-6 의존성 세포주가 B9인 정제된 인터루킨-6 억제제.
제1항에 있어서, HL-60 세포를 포르볼 디에스테르로 처리한 정제된 인터루킨-6 억제제.
인터루킨-6 억제제 생성을 유도시키기에 충분한 조건하에서 HL-60 세포를 포르볼 에스테르와 접촉시키는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 정제된 인터루킨-6 억제제의 제조방법.