五、發明説明（1 ) 經濟部中央榡準局員工消費合作杜印製 發明背景 此揭示概括地關於一種新穎的細胞激動素拮抗劑製劑且 特别闞於一種可由組織培養液單離且已被發現具有生體外 間白血球溶菌素-6拮抗劑活性之間白血球溶菌素-6抑制劑 的製劑，特性，及用途。 間白血球溶菌素-6( IL-6)於人類健康和疾病中的影響已 進行深入研究。於個體具體細菌及病毒感染，外傷，自體 免疫疾病及贅瘤形成之血流和/或體液中乃觀察到IL-6升 高濃度。IL-6濃度與症狀嚴重性的關連及抗1L-6抗體於動 物模型中的有益功效建議細胞激動素可能於部分疾病的徵 兆上扮演一個病理生理上的角色。因此拮抗劑可具有 治療用途。 一種專一的、天然的IL-6括抗劑已被描述。p〇rtier等 人（Blood，81(ll) :3076-82(1993)發現7 -間白血球溶菌素 (7 - IFN)於生體外分析中抑制IL-6依賴骨髓瘤細胞的生長 但7 - IFN不抑制其他類型中的IL-6活性。
Brakenhoff等人（J.Biol.Chem‘，269(1) : 86-93(1994)) 設計生物上失活的IL-6突變物，其結合至80kD IL_6R但不 結合gpl30’因而阻礙訊號的轉導作用。此些突變的蛋白 質經由阻礙天然IL-6結合至丨L-6細胞受體次單元而作爲il -6拮抗劑。然而，此突變蛋白質之潛在的致免疫性爲用於 治療用途的障礙。 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210X 297公釐） ϋ - - II ! - .—Γ - [-.- t— - - - ,1T (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^-4388 08 ab77 五、發明说明（2 ) 〜'''''
Klein等人（Blood，78: 1198-1204( 1991))發現鼠科的抗 -IL-6抗體投予至具有白血病封阻骨髓瘤細胞於骨髓中増 生之患者。然而再度因爲鼠科抗體爲一種外來蛋白質，故 有潛在的致免疫性。 已被主張可溶性80kD細胞受體的生物工程衍生物可經由 結合至循環的IL-6但不結合至gp 130因而阻礙訊號轉 導，作爲 IL-6拮抗劑（J.Bauer, Biotechnology Therapeutics，2(364) : 285-298(1991))。然而，此些蛋 白質可能具有一個可被辨認爲外來物之抗原決定基且若作 爲治療劑仍爲致免疫性的。Bauer亦陳述使用人類抗-人類 IL-6抗體用於多數骨髓瘤治療的臨床試驗已開始（Id.)。 此時，臨床試驗的結果未知。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 單核球/巨喔甸胞類示出產生細胞激動素類和細胞激動 素抑制劑兩者，如Roberts等人於呼吸性融合Μ胞病毒 (RSV)感染的單核球中發現IL-1抑制劑（J.Exp.Med.，163: 511-519(1986)〕及IL-1知胞受體拮抗劑蛋白質（Janson等 人，J.Imnrnnol· ,147(12): 4218-4223(1991))。於此發明 中，吾人調查此類細胞亦可分泌IL-6抑制劑的可能性。由 於難建立人類周圍血液單核球之持績供應，因而吾等利用 前骨親細胞白血病細胞株，HL-60〇 HL-60以phorbol二S旨 類處理誘導分化成表現出數種巨噬細胞特性之細胞（Hal 1 等人，Ce 11 Immuno 1.，76 :58-68( 1983))，而以二甲基亞 ί風（MS0)或視黄酸（RA)處理造成沿著粒性細胞路徑分化（ Leftwich等人，Canc.Res.，46: 3789-3792))。吾等發現 -4 -本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（2!0X297公釐） A7 A7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 五、發明説明（3 ) . HL-60細胞暴露至Phorb〇1二酯類乃專一地誘導il-6抑制劑 的分泌。顯示此1 L-6抑制劑爲一種顯然新穎的人類蛋白質 。因爲此HL-60知胞株爲人類的，故丨L_6抑制劑應内含人 類胺基酸序列且因此於生體内無致免疫性的。此爲一個超 越前述IL-6拮抗劑實例的改善。 發明概述 此揭示之抑制劑製劑包括一種抑制劑其特徵爲由HL-60 細胞株取得且具有以膠過濾層析測定之約1〇)〇⑻至3〇, 〇〇〇 道耳呑之間的分子量。此抑制劑亦爲可結合及可洗提自 Blue Sephafose®，可結合及可洗提自陰離子交換樹脂類 並可結合及可洗提自逆相層析樹脂類。此抑制劑抑制B9細 胞株的IL-6依賴增殖。於刺激作用完全廢止細胞上清液之 抑制活性期間，以胰蛋白消化，及將HL_6〇細胞株以放線 菌酮處理其抑制活性降低高於5〇倍。此活性爲耐受酸和熱 處理。 此抑制劑可由刺激的HL-60上清液經於Biue Sepharose®上層析’陰離子交換樹脂，和逆相層析被部 分地單離。 此抑制劑已被發現可用於生體外研究IL_6於細胞官能上 的功效且將來被發現於處理IL-6濃度增加爲其特徵之疾病 中，爲治療有用的。 圖面描述 圖1 : IL-抑制劑於HL-60細胞中的誘導作用 HL-60培養物爲以PMA(l〇ng/社），PDBU(13〇ng/mL)， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公缝） . ------ *11 ..... 1 I m n- - ί I —、一5, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A 7 __B7__ 五、發明説明（4 ) A23187(50ng/niL)，DMS0(1.2% v/v) ’ PMA及A23187，或 乙醇（EtOH，1% v/v)處理24小時。Μ(10ηΜ)爲在以PDBU (130ng/mL)誘導與否前24小時加入5天。細胞以RPMI-2清 洗並再懸浮於IX 1〇6細胞/mL。培養3夭後，無細胞之 培養液爲經在室溫下200X g離心1〇分鐘而製備並分析IL-6 活性於B9細胞試驗中的抑制作用。 圖2 : IL-6抑制劑於U373細胞增殖上的功率 HL-60細胞（IX 10 6 細胞/mL)以PMA(10ng/mL)處理24小 時。將細胞清洗，再懸浮於RPMI-2中並培養3天。培養液 爲經離心製備並於具有IL-lct與否之U373試驗中分析。抗 -IL-1( 1 u g/孔穴）爲用於比較。 圉3 :細胞密度和PMA濃度的最適化作用 HL-60培養物爲在指定的細胞密度並與指定濃度的PMA/ RPMI-2培養24小時而製成。收集細胞，清洗並再懸浮至最 初的細胞密度。24小時後，無細胞組織培養液爲在IL-6存 在中B9試驗中分析。示出細胞密度（A)和PMA濃度（B)於抑 制劑表現上的功效。 圖4 :HL-60 上清液的 Superose 12®HR 10/30 層析 TCF爲κχΥΜ3膜濃縮約17倍並透過過濾至5〇mM磷酸鈉pH 7.0(起始缓衝液）中。將〇.5mL濃縮物加至圓柱。圓柱緩衝 液爲 10mM Tris，150mM NaCl，pH 7.8〇 圓柱流速爲〇_5mL/ 分鐘並收集lmL餾分。餾分爲直接以B9試驗測試抑制劑活 性。 圖5 :HL-60上清液之MonoQ®層析 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（210X297公釐） I m ί ^^^^1 ^^^^1 m^i 一"^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本f ) 暇4388 〇8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) TCF爲以YM3膜濃縮約17倍並透過過濾至起始缓衝液中。 圓柱以20mM Tris pH7.5平衡。濃縮的TCF爲以Tris缓衝液 稀釋1 : 2並將0.5niL加至圓柱上。蛋白質爲以内含20mM Tris,lMNaCl ρΗ7·5之最終缓衝液以一直線梯度洗提。將 0.5mL餾分收集至内含BSA之試管中。爲了分析抑制劑活性 ，將0.4mL之餾分濃縮4-8倍並以RPMI-1640透過過濾。 圖6 :HL-60上清液之Blue Sepharose⑧層析 TCF爲以YM10膜濃縮約87倍並透過過濾至起始缓衝液中 。濃縮的TCF加至50mL之圓柱上並以起始缓衝液清洗圓柱 。其後加入0至1M NaCl於起始緩衝液中之直線梯度後以 50%乙二醇/50mM磷酸鈉，4M NaCl pH7,0洗提。收集 10mL餾分。爲用於B9試驗，所收禁餾分的樣品為祓濃縮 4-8倍並透過過濾至RPMI-1640中。 圖7 :由Blue Sepharose⑧層析洗提之HL-60抑制活性的 逆相層析 由Blue Sepharose®層析内含抑制劑活性之館分爲合併 成兩個小池（pools) ’第一個（M於約NaCl之直線梯 度洗提且第二個（B)以50%乙二醇，4M NaCl洗提。將小池 濃縮約100倍並分别地加至以0.1% (v/v)三氟醋酸（TFA)/ 水平衡之2mL ProRPC®逆相圓拄。圓柱以起始缓衝液清洗 並以20% (v/v)至80% (v/v)直線梯度的HPLC級乙胩/ 0.1% (v/v)TFA洗提。收集餾分（〇.3ibL)’蒸發至乾’並再 懸浮於O.lmL Η〗〇中以用於肋試驗中的分析。 圈8 :以逆梱層析單離之HL-60抑制活性的逆栢層析 本紙伖尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4说格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝' 訂 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 B7 —--- ' —~-«««___—_____ 五、發明説明（6) 將來自Blue Sepharose⑧小池A和8逆相層析之活性餾 分合併並使用20至80% (v/v)乙胩梯度/〇 1%TFAK2iftL ProRPC⑧圓柱上再層析。餾分爲如圖7所述分析il-6抑 制活性。 圖9 : HL-60抑制劑之熱處理 下列樣品於1〇〇*C下加熱15分鐘且其後於B9試驗中測試 抑制活性。（l)Blue Sepharose®尖峰2 ;未稀釋，（2) Blue Sepharose® 尖蜂2 : 1 : 1〇，（3)Biue Sepharose® 尖峰2 : 1 : 100，（4)Blue Sepharose⑩尖峰2:1:1000， (5)抗IL-6, 5‘〇u g/mL，（6)抗IL-6，〇.5w g/mL，（7) 抗-IL-6 ， 50ng/mL ， （8)抗-IL-6 ， 5ng/mL ， （9)RPMI-2:未 稀釋 ’（10)RPMI-2 : 1 : 10，⑴）rpm卜2 : 1 : 100，（12) RPMI-2 : 1 : 1000。 圉10 ·· HL~60抑制劑之胰蛋白質g每消化 使用10kD分子量切斷（cut-off)濾器，將5〇〇UL内含 IL-6抑制劑活性之Biue Sepharose®小池透過過遽至0.1M 重碳酸銨pH8.0(消化緩衝液）中。將樣品加至預先以消化 缓衝液清洗之固定化胰蛋白S每的分開丸狀物並於37eC下培 養3.5小時。胰蛋白|每消化物以離心回收，無菌過濾，並 與未處理樣品於B9試驗中比較。 圖11 : HL-60抑制劑之酸處理 内含丨L-6抑制劑之Blue Sepharose⑧小池以0.1%三氟 醋酸/100%乙骑，pHS2或無菌水任一者以1 : 2稀釋。蒸 發至乾後，將樣品於100aL RPMI中再懸浮，無菌過濾， -8 - 本紙張尺度適财11财縣（CNS丨八4祕（公疫） ----------•裝 訂 ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •" ... · · · A7 B7 經濟部中央橾隼局員工消費合作社印製 五、發明説明（7) 並以B9試驗分析。 、圖12 :放線菌酮於HL-60抑制劑合成上的功效 HL-60細胞（1〇6 /mL)以PMA(10ng/mL)處理。24小時後 將吸附的細胞清洗至RPMI-2中並移除非吸附細胞。其後將 二重覆的培養物於RPMI- 2或内含100紅g/uiL放線菌嗣之 RPMI-2中培養。再過24小時後，移除TCF並清洗細胞以移 除放線菌酿1。，細胞於RPMI-2中培養2天以上，此時收集 TCF以於Β9試驗中分析抑制活性。所有的TCF樣品於試驗前 先透過過濾，以確保放線菌酮的移除。 發明之詳細描述 試劑 Phorbol十四垸酸酯醋酸醏（ΡΜΑ)，Phorbol二丁酸酯 (PDBU)，A23187，全反式視黄酸（RA),和二甲基亞ί風（ DMS0)爲購自 Sigma化學公司。ΡΜΑ，PDBU，Α23187，和RA 之儲備溶液爲在乙醇中-20°C下貯存。所有試劑爲防光且 於使用前立即稀釋至適當的培養基中。重組人類IL-6爲賭 自 Genzyme。抗-IL-6，抗-IL-l〇(，抗-IL->5，和重组人 類 IL-lot 爲購自R & D Systems。 細胞培養 使用兩個HL-60細胞株（ATCC#CCL-240)以產生抑制活 性。第一個細胞株分泌高濃度的IL-6且第二個分泌20pq/ roL或更少的丨L-6。細胞株爲保持於補充以丨〇%熱失活FBS (Hyclone)(RPMI-10)之RPMI-1640(Gibco)中。細胞以無 Ca2+和Mg2+之Du 1becco ’ s磷酸鹽缓衝食鹽水（dpbs-cmf， I - -------"私-------訂---H - I 冰 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙张尺度適用中國闺家標隼（CNS〉A4規格（210乂297公釐 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 駝4388 〇8 A7 B7五、發明説明（8) Gibco)清洗並再懸浮於内含適當誘導劑之RPMI-1640中。 收集組織培養液（TCF)並使用B9試驗測定il-6抑制劑活性 。測定最適誘導劑和細胞濃度之最初實驗爲以IL-6分泌細 胞株進行。後績實驗證明非分泌HL-60株於phorbol二醋（ 如PMA，PDBU等）刺激後產生IL-6抑制劑。經由膠過濾，由 IL-6非分泌物所合成之抑制劑具有同於R-6分泌物所合成 之抑制劑之分子量。爲了避免因IL-6存在所造成的異常， 乃使用取自ATCC之非分泌細胞株進行特性及純化研究。 IL-6依賴B9試驗 B9鼠科融瘤細胞株（贈自P.Scuderi，Miles Research Center; West Haven, (N)爲保存於補充至少1單位/mL IL-6之RPMI -10中。爲用於試驗，將細胞以5χ1〇4細胞/ mL接種至具有5%FBS(RPMI-5)之RPMI中，於96孔穴平板（ Corning)中以100 uL/孔穴。將欲測試之樣品20 UL(粗製 TCF)或10 aL(圓柱餾分）加入。一半孔穴接受以1〇〇 α L之 單位/mL的IL-6/RPMI-5而另外一半接受以1〇〇以L之RPMI -5。將抗-IL-6以0.5-1 iz g/孔穴加至對照孔穴，以確保 IL-6的專一功效可被測定。於3-4天之培養時段後，細胞 增殖爲以3 H-胸腺核菩（3 H-Tdr,Dup〇nt-NEN)偶合作用或 以MTS四咬條（Pro mega)轉換成含水可溶之甲惜（forma zan) 予以測定。於3 H-胸腺核荅偶合作用，細胞爲以〇.5uCi/ 孔穴3 H_Tdr標織5小時，使用Toiatec Autotrap收集至 濾紙上並使用1205 85召-平板（1〇13113〇測定3 11偶合 作用。於細胞增殖之非放射活性偵測，乃使用細胞標度96 -10- n I n I I"衣 Ί. I Ϊ1 訂 1. Ϊ 冰 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（21 〇 X 297公釐） 丨,1 3 A7 B7 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明（9 ) AQ非放射細胞增殖分析（Cell Titer 96AQ Nonradioactive Cell Proliferation Assay (Promega)。樣品爲以三重覆 分析且抑制百分比爲由下列方式之平均値算出： t {CPM(RPMl+lL^ - CPMtHpM,.,^,} - {CPM(leW+lL^ - CPM^pm,.^,) ] X l〇〇 [(CPM(RpMI+K! - CPM{tlPMHLri>)] 爲了測試非放射活性試驗中之抑制百分比，乃於上式中|中^丨 使用O.D.値代替CPM。 IL-1依賴U 373試驗 k八! IL-1於U373(人類星形細胞瘤/惡性膠質瘤）細胞株上之 促進生長功效已由他導（Lachman等人，J. Immunol. ,138 (9) : 2913-29-6( 1987))。爲用於試驗中，乃將U373-MG細 胞（ATCC#HTB17)於RPM卜 10 中生長至匯集（confluence) 〇 於試驗前一天，將細胞以胰蛋白酹處理並將IX 10 4細胞 /孔穴接種至内含1%FBS(RPMI-1)之RPMI的96孔穴平板中 。試驗樣品，2〇u 1之組織培養液（TCF)其後以具有5單位 /1111>11^1〇(與否加入成總體積20()££1^/孔穴。加入適量之 RPMI-2以作爲陰性對照。細胞培養2天並於最終5小時知 入0.5uCi/孔穴之3 H-Tdr。收集細胞並測定3 H偶合作 用。 踵柱層析 PMA-謗導之HL-60培養上清液爲被透過過濾至指定的緩 衝液中並以裼10或YM3膜（Amicon)超過濾濃縮。濃縮的上 清液加至層析樹脂並如圖面描述洗提。爲試驗IL_6抑制 活性，將餾分過濾通過〇.22uib濾紙，且若洗提緩衝液爲 -11- 本紙張尺度遴用中國國家標牟（CNS ) Λ4規格（210 X297公缓） .ii , t k1T線 Γ靖先閱讀背面史"意事噶再填蹲本頁> 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（10) 不相容於B9試驗，則以βρΜΙ-1640透過過濾。所有樹脂爲 購自Pharmacia除非特别註明。
SDS-PAGE 欲電泳之揉品以#還原SDS-PAGE缓衝液1 : 2稀釋且在 100-C下煮沸5-10分鐘。將2〇uL之稀釋樣品加至10-20% 梯度的SDS-PAGE膠（BioRad)並於200V下電泳約45分鐘。將 膠以克馬希藍（Coomassie Blue)R-250或銀染色。 賁施例1 各種已知於生體外調節HL-60細胞分化作用之化合物的 功效概迷於圖1。0.5-2X 10 6細胞/mL RPMI-1640爲以 10ng/mL PMA或130ng/mL PDBU(此兩者均爲已知誘導單核 球分化作用）處理。24小時後，細胞變成黏附，空泡狀並 停止生長。將細胞移轉至RPMI-2中並於3天後以B9試驗 測得之IL-6抑制劑爲在以PMA或PDBU處理之細胞的培養液 中發現，但未在以DMS0或RA(其謗導粒性細胞之分化作用）處 理之細胞的培養液中發現。於部分細胞株中鈣離子載體和 phorbols旨類協合地誘起細胞活化作用。然而，吾等發現 以PMA和鈣離子載體（A23187)共同刺激並不增加抑制劑濃 度超越僅以PMA誘導者。單獨的A23187並不產生可偵測的 抑制劑。 IL-6抑制劑於PMA加入的24小時期間在培養液中被偵測 且於移除謗導劑後分泌持續以额外的48小時。儘管單獨的 PMA可刺激B9細胞生長且HL-60培養液之首先收集物潛在含 有lOng/inL，殘留的pma之事實，於此收集物的粗製上清液 ---------威------.訂------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度邮 ( CNS } A4iJL#. ( 210 x 297/^7 把 4388 0 8 A7 B7 五、發明説明（11) 仍觀察到抑制活性。 實施例2 除了抑制B9細胞之IL-6所刺激的增殖作用，此hl-60衍生抑 制劑抑制B9細胞之内生性（IL-6非依賴）生長。抗僅 影響IL-6所刺激的增殖作用。爲了排除HL-60所衍生活性 爲一種胸腺核荅偶合作用之抑制劑或細胞增殖之非專—抑 制劑的可能性，乃試驗於U373細胞上之功效。U373細胞的 增殖作用爲受IL-1所刺激但不受IL-6所刺激。參見圖2。 1X 10 6 HL-60細胞/lnL爲以10ng/mL PMA處理24小時。將 細胞轉移至RPMI-2中並再培養3夭。收集上清液並於u 373 試驗中分析。如以U373試驗所測定，於PMA誘導之HL-60細 胞的培養液中未偵測到IL -1所刺激增殖作用之抑制劑或細 胞生長的非專一抑制劑。事實上，發現HL-60培養液刺激 U373知胞增殖作用乃被假定由於上清液中丨卜】的存在。使 用抗-IL-1的對照實驗得到所預期的結果。此外，hl-⑼抑 制劑並不抑制CTLL細胞的IL-2依賴或非專一增殖作用。 結果 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 ^^1- ^^^1 1^— ί I- is ID. f ml n^i--SJ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 最勒的研究爲擴展至測定抑制劑誘導作用的最佳條件。 於使用0.5至2‘Ox 10 6細胞/mL範圍之HL10細胞密度和 1 -1 Ong/mL之PMA濃度觀察到最適的抑制劑生長（參見圖3 )° 抑制劑之特 使用IL-6非分泌肛-60細胞株以進一步描述抑 制及由污染蛋白質分餾抑制劑活性。使用尺寸排阻作用（ -13- ^法尺度適用中國國----
經濟部中央標準局負工消费合作社印裝 A7 _______B7 五、發明説明（12) '
Size exclusion)，陰離子交換，Blue Sepharose®，和 逆相層析。爲簡化大規模純化作用，乃將細胞於無血清 RPMI-1640 中誘導。 爲了大約測定抑制劑的分子量，將TCF超過濾通過30kD 膜。於以10kD膜濃縮後在過濾物中發現活性’顯示抑制劑 的分子量爲低於30kD但大於10kD。 爲進一步描述抑制劑，將經濃縮及造過過濾之TCF於
Superose 12®膠過濾圓柱上層析。參見圖4。其活性在相 對於約20kD位置被洗提。IL-6以ELISA(R & D Systms)測 定。 將HL-60 TCF濃縮並加至Mono 陰離子交換圓柱上。 參見圖5。將來自Mono Q⑧圓柱之餾分試驗以抑制劑活性 且在175iM NaC丨洗提發現活性。由DEAE-Sephacel®，在 150τηΜ NaCl洗提發現抑制劑活性。 由於Blue Sepharos e®於先前被使用以單離細胞激動素 ，故將内含IL-6抑制劑之TCF於此樹脂上層析。參見圖6 φ 於所使用之條件下，TCF中大量的蛋白質並不結合至圓柱 。抑制劑活性於約900mM NaCl下之寬峰中洗提（小池a)或 於後續的50%乙二醇/4M NaCl中洗提（小池B)。經由SDS-PAGE，來自Blue Sepharose❿之抑制的波锋館合内含複數 的蛋白質。 C1/C8进相層析（ProRPC®)用以進一步純化抑制劑。參見 圖7。來自Blue Sepharose®小池Α(圖7Α)或小池Β(圖7Β) 之IL-6抑制活性於約40%乙胩洗提下發現。將此些活性餾 -14- 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I i— II [ -种衣 . 訂 ί 知 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Α7 Β7 五、發明説明（13) 分合併並於ProRPC®上再層析，使用較淺短的梯度以提高 解離作用（參見圖8)。在約32%乙骑下洗提出抑制活性。 SDS-PAGE分析（10至20%梯度膠）顯示出複數蛋白質帶的存 在。因此，雖然抑制劑由TCF的顯著純化已被達成，但此 抑制劑並未純化至均句。 特性： 由Blue Sepharose®洗提之部分純化的抑制劑小池於 l〇〇*C下加熱15分鐘，未有任何顯著的抑制活性的流失， 與抗-IL-6所觀察者成對比（參見圖9)。將Blue Sepharose⑧小池以固定化胰蛋白|每處理，降低抑制活性 64倍（參見圖10)。TCF以0.1%三氟醋酸/乙胂於ρΗ$2下 處理，造成活性流失3倍（參見圖11)。HL-60細胞於PMA刺 激作用後與放線菌酮（已知之蛋白質合成抑制劑）培養，於 B9試驗中造成抑制劑活性的完全抑制（參見圖12)。上述實 驗結果強烈建議所見的抑制作用乃爲蛋白質存在於肌-60 TCF中的結果。 討論 經濟部中央標箏扃員工消費合作社印繁 __________ I .___ _____ _ _ ^—* 1^—' ^—1* ^in 1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) B9融合瘤細胞之經IL-6刺激增殖作用的抑制劑爲在被謗 導分化至巨噬細胞系統之HL-60培養液中被偵測到。 Phorbol十四烷酸酯醋酸酯（PMA)和非親脂性二酯phorbol 二丁酸酯（PDBU)爲有效作爲抑制活性的誘導劑。發現誇導 劑濃度和細胞密度對抑制劑表現的最適化作用爲嚴格的參 數，如 WOng/mL PMA 和 0.5-2 .OxlO6 麵胞/mL°HL-60 細胞與視黄酸（RA)和二甲基亞ί風（DMS0)沿著粒性細胞途徑 -15-本紙張尺度通用中園國家標芈（CNS ) A4現格（2!〇X297公釐} "38s〇8 五、發明説明（14) 之分化作用並不謗導出可偵測濃度的抑制劑。將細胞暴露 於具有PMA與否之鈣離子載體A23187或組合以RA和PMA(此 條件已被報導增強單核球細胞株之活化作用_對於抑制劑 的表現上並無顯著功效。 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 ---------- 裝------訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) HL-60衍生活性對於U373細胞之iL-Ι依賴或增殖作用自 發率並無抑制功效。此些數據建議此活性並非攝取胸腺核 荅或IL-1作用之抑制劑，或細胞增殖作用的非專一抑制劑 。不過，HL-60抑制劑乃抑制未加入R-6所觀察到的B9細 胞增殖作用自發率，除了 B9細胞暴露至PMA所謗發之刺激 率以外。雖然抗-IL-1對於B9細胞之自發性增殖作用並無 功效，但細胞激動素之内源性合成可提供一種自泌性生長 功效且此類自泌功效難以處理抗體之抑制作用。PMA刺激 B9細胞增殖作用的機制爲未知，但由於B9細胞不對其他已 知的細胞激動素反應，故亦可依賴於IL-6的内源性合成。 吾等暫時歸納HL-60所衍生之活性爲類似於一種加入及内 源性IL-6兩者的專一抑制劑。令人感興趣地注意到於HL_ 60上清液中可發現活性，其内含頗高濃度之iL_6。此觀察 建議一種有别於細胞受體拮抗作用之機制，其與抗 和HL-60抑制劑於自發性和PMA-誘導之C9細胞增殖作用上 的差别功效一致。 就吾等所知，到目前爲止並未描述有天然產生地^^抑 制劑。如此處所使用，天然產生地人類抑制劑意指一種由 人類細胞衍生的非基因工程化合物，其抑制^_6之作用。 可溶性IL-6細胞受體已被報導，但其被發現刺激而非抑制 -16- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4U^!〇x 297公釐) —-- 經濟部中央標隼局員工消費合作社印衆 A7 B7五、發明説明（15) IL-6活性。此爲獨特的觀察，因爲其他可溶性細胞激動素 細胞受體已知乃爲拮抗劑。此拮抗活性最可能由於11^6細 胞受體之構型；以低親和力結合至IL-6之初級細胞外的80 kD次單元及gpl30(在結合至IL-6/80kD複合體後）增強80kD 細胞受體對於IL-6的親和力並致使訊號轉導作用。也許可 溶性細胞受體-IL-6複合體爲被gpl30所辨認和結合且轉導 IL-6訊號。 IL-6的過度表現已在自體免疫疾病和全身性紅斑性狼瘡 和風濕性關節炎中被引證且細胞激動素已知爲贅瘤性漿細 胞的生長因素。雖然IL-6拮抗劑之功效未被報導用於自體 免疫疾病，但是細胞激動素於發病原理中的角色在可取得 資料的基礎上乃被提議。已注意到於具有漿細胞白血病患 者中使用鼠科單株抗體之短期臨床反應，此建議IL-6官能 的有效封鎖對於目前治療爲一種有利的附屬物。 上述實例乃欲説明本發明且此藝人士可得知其變異。依 此，本發明之範疇意欲應僅由下列申請專利範圍所限。 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公t )