KR101888779B1

KR101888779B1 - Ａｍｐｋ 활성을 증진시킬 수 있는 약물을 제조하기 위한 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도

Info

Publication number: KR101888779B1
Application number: KR1020167032252A
Authority: KR
Inventors: 쇼에이-셍 리; 밍-자이 수; 치-환 예; 셍-파 차이; 청-옌 차이; 치-툰 루안; 차오-민 수
Original assignee: 지 위안 탕 바이오테크놀로지 코., 엘티디.
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2018-08-14
Also published as: JP2017529315A; CN105078992B; JP6386590B2; EP3146967B1; CN105078992A; EP3146967A1; EP3146967A4; WO2015176539A1; KR20160143847A

Abstract

AMP-의존성 단백질 키나아제(AMPK)를 활성화시키는 효능을 갖는 약물을 제조하기 위한 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도가 기술된다. 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체는 살솔리놀 또는 레티쿨린일 수 있다. 약물은 AMPK를 활성화시킬 수 있고, 이에 따라, 세포의 성장 및 대사의 조절하고 AMPK 관련 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

ＡＭＰＫ 활성을 증진시킬 수 있는 약물을 제조하기 위한 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도{USE OF ISOQUINOLINE ALKALOID DERIVATIVE FOR PREPARING DRUG CAPABLE OF PROMOTING AMPK ACTIVITY}

본 발명은 AMP-의존성 단백질 키나아제(AMPK)를 활성화시키기 위한 약제를 제조하기 위한 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도를 제공한다.

이소퀴놀린 알칼로이드 유도체(isoquinoline alkaloid derivative)는 자연에서 식물 및 동물에 존재하는 질소-함유 유기 화합물의 그룹이다. 이러한 것들 중 대부분은 고리에 이의 질소 원자가 도입된 복잡한 고리 구조를 갖는다. 살솔리놀(salsolinol) 및 레티쿨린(reticuline)을 포함하는, 이러한 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체는 상당한 생물학적 활성을 지닌다. 살솔리놀은 주로 혈압의 조절을 위해 사용되는 것으로 알려져 있으며, 레티쿨린은 주로 말라리아를 치료하기 위한 활성 성분으로서, 및 또한 통증 완화제 중의 하나의 성분으로서 사용된다.

AMP-의존성 단백질 키나아제(AMPK)는 AMP와 결합할 수 있고 AMP를 통한 ATP의 생성과 ATP 소비 간의 균형을 유지시키고, 이에 따라, 에너지 대사의 균형을 유지시킬 수 있다는 것을 특징으로 하는, 세포의 대사 또는 에너지 센서이다. 한편, AMPK는 또한, 세포 성장 및 증식을 조절하고, 세포 극성을 확립시키고 안정화시킬 수 있고, 동물 수명을 조정할 수 있고, 생리학적 리듬을 조절할 수 있다. 최근에, AMPK 활성화를 타겟화하는 것은 약제 개발에서 중요한 포인트들 중 하나가 되었다. 이에 따라, 약제 산업은 신규한 AMPK 활성제의 개발을 적극적으로 추진하고 있다.

본 발명에서는 특정의 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체, 예를 들어, 살솔리놀 및 레티쿨린이 AMPK의 활성화에 있어서 새로운 용도를 갖는다는 것이 예상치 못하게 발견되었다.

일 양태에서, 본 발명은 AMP-의존성 단백질 키나아제(AMPK)를 활성화시키기 위한 약제를 제조하기 위한 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도로서, 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체가 화학식 I을 갖는 용도를 제공한다:

화학식 I

상기 식에서, R, R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로, H, 알킬 또는 아실 (R_aCO) 기이며; R₃은 알킬 또는 치환된 벤질기이며; 여기서, R_a는 H 또는 알킬기이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 치환된 벤질기는 하기 화학식 II를 갖는다:

화학식 II

상기 식에서, X 및 Y는 각각 독립적으로, H, OH, 메톡시 (OMe) 또는 아실옥시 (R_aCO-O-) 기이며; 여기서, R_a는 H 또는 알킬기이다.

본 발명의 일 예에서, 상기 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체는 살솔리놀이다.

본 발명의 다른 예에서, 상기 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체는 레티쿨린이다.

다른 양태에서, 본 발명은 혈당을 감소시키기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 당뇨병을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 AMPK-관련 질환을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도를 제공하는데, 여기서, 치료는 약제에 의한 AMPK의 활성화를 통해 달성되며, 상기 AMPK-관련 질환은 암, 심혈관 질환 및 대사 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 화학식 I을 갖는 화합물은 또한, 항염증에서 또는 상처 치유를 증진시키는데 효과를 갖는다.

본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태들은 하기 바람직한 구현예들의 설명 및 도면에 의해 더욱 명확하게 될 수 있다. 여기에서 변형예 또는 개질예가 존재할 수 있지만, 이러한 것들은 본 발명에서 기술된 신규한 발상(idea)의 사상 및 범위를 벗어나지 않을 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예들을 제시하는 도면들은 본 발명을 설명하는 것을 목표로 한다. 본 발명이 기술된 바람직한 구현예들로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 도면 및 실시예에서의 데이타는 짝비교 t-시험(paired t-test)에 의해 결정되는, 평균±표준편차(SD)로서 나타낸다. 유의적 차(significant difference)는 하기와 같이 나타난다: *: P < 0.05; **: P <0.01; #: P = 0.067.
도 1은 AMPK 포스포릴화에 대한 살솔리놀의 영향을 도시한 것으로서, 여기서, AMPK 활성 시험은 C₂C₁₂ 세포에서 다양한 농도(1, 3, 및 10 μM)의 살솔리놀과 함께 수행되었다.
도 2는 AMPK 포스포릴화에 대한 레티쿨린의 영향을 도시한 것으로서, 여기서, AMPK 활성 시험은 C₂C₁₂ 세포에서 다양한 농도(1, 3, 및 10 μM)의 레티쿨린과 함께 수행되었다.
도 3은 혈당의 빠른 감소에 대한 살솔리놀의 영향을 도시한 것이다. ICR 마우스에 2주 동안 고-지질 식품 및 고 프룩토오스 시럽을 각각 공급하였다. 이후에, 살솔리놀(10 mg/Kg/day) 및 글리벤클라미드(10 mg/Kg)를 1일째에 투여하였다. 30분 후에, 글루코오스(1 g/Kg)를 경구 투여하고, 혈액을 그 직후에 마우스로부터 채취하였다(이러한 시점은 0분으로서 지정됨). 혈액을 또한, 이후 30분, 60분, 90분, 120분 및 150분에 채취하고, 혈청 중 혈당 수준을 결정하였다.
도 4는 혈당의 장기 감소에 대한 살솔리놀의 영향을 도시한 것이다. ICR 마우스에 2주 동안 고-지질 식품 및 고 프룩토오스 시럽을 각각 공급하고, 이후에, 살솔리놀(10 mg/Kg/day) 및 글리벤클라미드(10 mg/Kg)를 연속 14일 동안 투여하였다. 그 후에, 살솔리놀(10 mg/Kg/day) 및 글리벤클라미드(10 mg/Kg)를 다시 투여하고, 30분 후에, 글루코오스(1 g/Kg)를 경구 투여하고, 혈액을 그 직후에 마우스로부터 채취하였다(이러한 시점은 0분으로서 지정됨). 혈액을 또한, 이후 30분, 60분, 90분, 120분 및 150분에 채취하고, 혈청 중 혈당 수준을 결정하였다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에서 명확하게 기술하지 않는 한, 단수 명사 및 "상기(said)"의 의미는 모두 "하나 초과"의 복수 형태를 포함한다. 이에 따라, 예를 들어, 용어 "성분(a component)"이 사용될 때, 이는 다수의 상기 성분들 및 상기 분야의 당업자에게 알려진 균등물들을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "활성화하는(activating)" 또는 "활성화(activation)"는 분자를 활성화하게 만들거나 분자가 기능하게 하거나 작용하게 하는 조치(action)를 지칭한다. 본 발명에서, 활성화는 화합물이 피검체에서 AMPK를 기능하게 하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "치환된" 또는 "치환"은 화학적 화합물에서의 작용기가 다른 기에 의해 대체되는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "피검체"는 인간 또는 포유동물, 예를 들어, 환자, 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이, 등), 농경용 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말, 등), 또는 실험용 동물(예를 들어, 랫트, 마우스, 토끼, 등)을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "AMPK"는 AMP-의존성 단백질 키아나제의 약어로서, 이는 다수의 생물학적 과정들에서 주요 조절 인자인, 세포에서 에너지 대사를 조절하는 단백질 키나아제의 타입을 지칭한다. AMPK의 신호전달 경로는 글루코오스 및 지질의 대사를 포함하고, 관련 유전자 및 단백질의 발현에 영향을 미친다. AMPK가 포스포릴화될 때, 이의 활성은 증가할 것이며, AMPK 신호전달 경로에서의 다운스트림 단백질은 추가로 조절될 것이며, 이에 의해, 간, 골격근, 심장, 지질 조직 및 췌장에서의 대사가 조절될 것이다. 이에 따라, AMPK 활성화에서 효과적인 약제는 다수의 질환, 예를 들어, 대사 질환(예를 들어, 당뇨병), 암, 및 심혈관 질환(예를 들어, 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis) 및 허혈성 심장 질환(ischemic heart disease))을 치료하는데 잠재적으로 효과적일 수 있다. 이러한 것들은 또한, 항염증 또는 상처 치유를 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 혈관 내피 세포에서 항염증 활성을 포함하는 AMPK 활성제의 작용 모드는 일부 임상전 및 임상적 발견에서 확인되었다. 이에 따라, AMPK는 또한, 심혈관 질환 및 대사 질환을 치료하는데 있어서 약물 타겟으로서 여겨진다.

본원에서 사용되는 용어 "알킬기"는 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유한 선형 또는 분지형 일가 탄화수소, 예를 들어, 1 내지 10개의 탄소를 갖는 알킬기, 바람직하게, 1 내지 6개의 탄소를 갖는 알킬기, 더욱 바람직하게, 1 내지 3개의 탄소를 갖는 알킬기를 지칭한다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 및 t-부틸을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 AMP-의존성 단백질 키나아제(AMPK)를 활성화시키기 위한 약제를 제조하기 위한 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도로서, 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체가 화학식 I을 갖는 용도를 제공한다:

화학식 I

본 발명의 특정 예에서, 상기 치환된 벤질기는 하기 화학식 II를 갖는다:

화학식 II

본 발명의 일 구현예에서, 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체는 화학식 I (여기서, R = R₁ = R₂ = H 및 R₃ = Me (메틸))을 갖는 살솔리놀이다. 살솔리놀은 하기 화학식을 갖는다:

본 발명의 다른 구현예에서, 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체는 화학식 I(여기서, R = R₂ = Me (메틸), R₁ = H, 및 R₃은 X = OH 및 Y = OMe인 화학식 II의 치환된 벤질기임)을 갖는 화합물인 레티쿨린이다. 레티쿨린은 하기 화학식을 갖는다:

본 발명의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체, 예를 들어, 살솔리놀 및 레티쿨린은 AMPK를 활성화시키는 효과를 가지고, 혈당을 감소시키는 효과를 갖는 것으로 추가로 입증되었고, 이에 따라, 당뇨병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 또한, 혈당을 감소시키기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체는 살솔리놀 또는 레티쿨린이다.

또한, 본 발명의 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체는 치료의 효과를 달성하기 위해 AMPK 활성화에서 효과적이고, 이에 따라, 예를 들어, 암, 심혈관 질환, 및 대사 질환을 포함하는, AMPK-관련 질환을 치료하는데 유용하다. 또한, 항염증에서 또는 상처 치유를 증진시키는데 효과를 갖는다는 것이 또한 고려된다.

본 발명에 따르면, 상기 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체는 약제 분야에서 널리 알려져 있거나 통상적으로 사용되는 임의 형태의 약제로 제형화될 수 있고, 약제 분야에서 널리 알려진 임의 기술에 따라, 통상적으로 사용되는 담체 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 치료학적 유효량의 상기 화합물을 포함하는 조성물로 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제 분야에서 당업자에게 널리 알려진 것들을 포함하는, 약제학적으로 허용되는 부형제, 충전제, 희석제, 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 본 발명의 상기 설명 및 하기 실시예에서 설명되는데, 이는 본 발명의 범위를 한정하기 위해 사용되지 않을 것이다.

실시예 1: 본 발명의 화학식 I을 갖는 이소퀴놀린 알칼로이드 유도체의 제조

도파민(1.6 g), 10 mL 메탄올, 1 mL 1N 염산, 및 2 mL 99% 아세트알데하이드를 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 순차적으로 첨가하고, 실온 하에서 6시간 동안 교반하였다. 감압 농축에 의해 얻어진 농축물을 Lobar RP-18 컬럼(크기 B, Merck)에 로딩하고, 0.05% 포름산 수용액에 의해 용리시켜, ¹H NMR에서 본질적으로 순수한 살솔리놀(1.0 g)을 수득하였다.

분광학적 분석을 기초로 하여, 살솔리놀의 ¹H 및 ¹³C NMR 분광학적 데이타 및 ESIMS 데이타는 하기와 같다:

¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 6.63 (1H, s), 6.57 (1H, s), 4.30 (1H, q, J = 6.8 Hz, H-1), 3.40 (1H, dt, J = 12.6, 5.6 Hz, H_a-3), 3.20 (1H, ddd, J = 12.6, 8.2, 5.6 Hz, H_b-3), 2.92 (1H, ddd, J = 16.8, 8.2, 5.8 Hz, H_a-4), 2.80 (1H, dt, J = 16.8, 5.6 Hz, H_b-4), 1.55 (3H, d, J =6.8 Hz, Me-1); ESIMS: m/z 180 ([M+H]⁺).

레티쿨린은 공지된 방법[J. Chin. Chem . Soc . Taip . 1992, 39, 189-194]에 따라, 라우라세아에(Lauraceae) 과의 식물인, Konishi's Newlitse (Neolitsea konishii (H.) K. & S.)의 목재 부분으로부터 단리될 수 있다.

실시예 2: AMPK 활성화에서 살솔리놀 및 레티쿨린의 효과의 평가

C₂C₁₂ 골격 근아세포 세포주를 식품산업연구개발원(Food Industry Research and Development Institute)(Hsinchu, Taiwan)으로부터 구매하였다. C₂C₁₂ 세포주는 95% O₂, 5% CO₂, 및 37℃ 하의 세포 인큐베이터(cell incubator)에서 성인 C3H 마우스의 다리 골격근을 배양함으로써 얻어진 세포주이다. 세포를 4.5 mg/mL 글루코오스, 10% 우태아혈청(FBS; Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA), 및 항생제 용액(페니실린의 최종 농도 =100 IU/mL 및 스트렙토마이신의 최종 농도 = 100 ㎍/mL를 가짐)을 함유한 DMEM 배지(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양하였다. C₂C₁₂ 근아세포가 페트리 디시(petri dish)에서 면적의 7/10을 덮도록 증식하였을 때, C₂C₁₂ 근아세포를 다핵 근세포(multi-nuclei myocyte)가 되도록 유도하기 위해 우태아혈청을 2% 말 혈청(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 대체하였다. C₂C₁₂ 근아세포는 4일에 근세포로 분화하였고, 세포의 대사를 감소시키기 위해 실험하기 24시간 전에 세포의 배양 배지를 무혈청 DMEM으로 대체하였다.

C₂C₁₂ 근세포를 5분 및 15분 동안 각각 1 μM, 3 μM 및 10 μM 살솔리놀 및 레티쿨린으로 각각 처리하였다. 이후에, C₂C₁₂ 근세포를 PBS 완충 용액으로 세정하고, 프로테아제 억제제를 함유한 RIPA 완충 용액(20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% SDS, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 1% NP-40, 및 100X 프로테아제 억제제 칵테일)을 세포에 첨가하였다. 세포를 얼음 상에 모으고 원심분리하였다. 이후에, 상청액 샘플의 농도를 동일하게 되도록 조정하였다.

상청액 샘플을 8% SDS-PAGE와 함께 수직 전기영동 단리(vertical electrophoresis isolation)를 통해 처리하고, 단리된 단백질을 PVDF 블롯팅 막 상으로 옮겼다. 블롯팅을 완료한 후에, PVDF 블롯팅 막을 제거하고, 실온 하, 1시간 동안 5% 무-지방 우유를 함유한 TBST(트윈-20을 함유한 트리스-완충화된 염수)의 차단 완충제로 차단하였다. 이후에, PVDF 블롯팅 막을 각각 1차 모노클로날 항체 포스포-AMPKα(Thr172)(Cell Signaling) (1:1000) 및 AMPKα(Thr172)(Cell Signaling)(1:1000)를 함유한 5% BSA 및 TBST 용액에 배치시키고, 1차 면역블롯팅 반응(immunoblotting reaction)을 4℃ 하에서 수행하였다. 이후에, PVDF 블롯팅 막을 TBST로 3회 세정하고, 2차 항체 염소 항-토끼 IgG를 함유한 TBST 용액(Perkin Elmer)(1:10000)을 첨가하여 실온 하에 1시간 동안 2차 반응을 수행하였다. 마지막으로, 막을 TBST로 3회 세정하고, 이후에, ECL(향상된 화학발광(enhanced chemiluminescence))을 칼라를 나타내기 위해 첨가하였다.

결과

도 1에 도시된 바와 같이, C₂C₁₂ 세포를 5분 동안 10 μM 살솔리놀로 처리한 후에, 이러한 세포에서 AMPK 포스포릴화는 대조군 세포에서의 AMPK 포스포릴화의 1.66배까지 증가하였다. 이는, 살솔리놀이 AMPK 활성화에서 우수한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

또한, 도 2에 도시된 바와 같이, C₂C₁₂ 세포를 3 μM 및 10 μM 레티쿨린으로 5분 동안 처리한 후에, 이러한 세포에서 AMPK 포스포릴화는 각각 대조군 세포에서의 AMPK 포스포릴화의 1.52배 및 2.05배까지 증가하였다. C₂C₁₂ 세포를 15분 동안 처리한 후에, 이러한 세포에서 AMPK 포스포릴화는 각각 대조군 세포에서의 AMPK 포스포릴화의 1.04배 및 2.07배까지 증가하였다. 이는, 레티쿨린이 AMPK 활성화에서 우수한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 혈당 감소에서 살솔리놀의 효과의 평가

혈당 감소의 효과를 경구 글루코오스 부하 검사(oral glucose tolerance test; OGTT)로 평가하였다. ICR 마우스에 각각 고-지질 식품 및 고 프룩토오스 시럽을 2일 동안 공급하고, 이후에, 살솔리놀(10 mg/Kg/day) 및 글리벤클라미드(10 mg/Kg)를 연속 14일 동안 투여하였다. 마우스를 동물 실험을 위해 8개의 그룹으로 나누었다. 1일째, 및 이후 연속 14일 동안 투여한 후에, 마우스를 개별적으로 마취시키고, 제공된 살솔리놀(10 mg/Kg/day) 및 글리벤클라미드(10 mg/Kg)를 각각 투여하였다. 30분 후에, 글루코오스(1 g/Kg)를 경구 투여하고, 혈액을 직후에 마우스로부터 채취하였다(이러한 시점은 0분으로서 지정되었다). 혈액을 또한, 이후에 30분, 60분, 90분, 120분 및 150분에 채취하고, 혈청 중 혈당 수준을 원심분리 후 결정하였다.

결과

도 3에 도시된 바와 같이, 고-당 고-지질 식품을 공급함으로써 유도된 제II형 당뇨병에 걸린 마우스에서, 살솔리놀은 혈당의 빠른 감소의 측면에서 글리벤클라미드의 혈당-감소 효과와 유사한 혈당-감소 효과를 갖는다. 도 4에 도시된 바와 같이, 살솔리놀이 또한, 혈당의 장기 감소의 측면에서 글리벤클라미드의 혈당-감소 효과와 유사한 혈당-감소 효과를 갖다는 것이 추가로 확인되었다.

실시예의 결과를 기초로 하여, 살솔리놀이 AMPK 활성화에 있어서 우수한 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다. 또한, 살솔리놀은 글리벤클라미드의 혈당-감소 효과와 유사한 혈당-감소 효과를 갖는다. 그러나, 글리벤클라미드는 또한, 인슐린의 분비에 영향을 미치며, 글리벤클라미드와는 대조적으로, 살솔리놀은 인슐린 분비에 대한 보다 낮은 효과를 갖는다. 레티쿨린은 또한, AMPK 활성화에 있어서 우수한 효과를 갖는다. 심지어, 10 μM 레티쿨린은 매우 양호한 효과를 제공할 수 있다.

Claims

살솔리놀(salsolinol) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈당(blood glucose)을 감소시키기 위한 약제학적 조성물.
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