ES2261412T3

ES2261412T3 - Polipeptidos pellino humanos.

Info

Publication number: ES2261412T3
Application number: ES01932711T
Authority: ES
Inventors: Timothy A. Bird; David J. Cosman
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2021-04-27
Also published as: US20020168683A1; WO2001083739A3; PT1290160E; DE60118359T2; DE60118359D1; AU2001259217A1; CY1105555T1; US20070264711A1; US20040034199A1; US6703487B2; US7169891B2; EP1290160A2; EP1290160B1; ATE321853T1; WO2001083739A2; DK1290160T3

Abstract

Polipéptido aislado que puede inhibir la transcripción dependiente de NF-kB o dependiente de p38, comprendiendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, y SEQ ID NO: 12, en la que los aminoácidos del 1 al x1 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquiera de los aminoácidos del 50 al 98 de dicha secuencia; (b) SEQ ID NO: 4, en la que los aminoácidos x1 a x2 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 99 hasta el 178 y x2 es cualquier aminoácido desde el 100 hasta el 179; (c) SEQ ID NO: 8, en la que los aminoácidos x1 a x2 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 1 hasta el 180 y x2 es cualquier aminoácido desde el 2 hasta el 181; (d) SEQ ID NO: 12, en la que los aminoácidos x1 a x2 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 1 hasta el 206 y x2 es cualquier aminoácido desde el 2 hasta el 207; (e) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, y SEQ ID NO: 12, en la que uno o más residuos de cisteína del dominio de tipo RING-finger se han delecionado o sustituido por residuos distintos a cisteína; (f) una variante alélica de (a)-(e); (g) fragmentos de secuencias de aminoácidos de cualquiera de (a)-(d) y (f) que comprenden secuencias de aminoácidos del dominio de tipo RING-finger; y (h) un fragmento de las secuencias de aminoácidos de cualquiera de (a)-(g), en el que un polipéptido que consiste en dicho fragmento puede inhibir la transcripción dependiente de NF-kB.

Description

Polipéptidos Pellino humanos.

Esta aplicación reivindica el beneficio bajo el Título 35 del Código de los Estados Unidos, (U.S.C.), 119 (e), de la solicitud provisional de los EE.UU. de número de serie 60/200,198, presentada el 28 de abril de 2000.

Campo de la invención

La invención se refiere a moléculas que son miembros de una familia de polipéptidos denominados Pellino (también llamados Diana de la Señal Inflamatoria Conservada (Conserved Inflammatory Signal Target)), (CIST). Más particularmente, la presente invención incluye polipéptidos Pellino y fragmentos de los mismos, los ácidos nucleicos que codifican para tales polipéptidos, y fragmentos de los mismos, los procedimientos para la producción de formas recombinantes de tales polipéptidos, los anticuerpos generados contra estos polipéptidos, células y animales transgénicos y knockout (deficientes), y usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

La ruta de la interleucina-1 (IL-1) es una ruta de señalización celular que desempeña un papel crítico en la repuesta inflamatoria de mamíferos. Varios receptores y ligandos diferentes están implicados en esta ruta, incluyendo los ligandos IL-1 alfa, IL-1 beta y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1ra), y dos receptores de IL-1 denominados receptor de IL-1 Tipo I (IL-1RI) y receptor de IL-1 Tipo II (IL-1RII); también existe una forma soluble de éste último. De éstos, parece ser que IL-1RI es el receptor de señalización mientras que IL-1RII no transduce señales a una célula sino que, en su lugar, puede estar implicado en la regulación de una respuesta mediada por IL-1 (Colotta et al., Immunol. Today 15:562; 1994). La señalización mediante la ruta de IL-1 es compleja, requiriendo un número de moléculas accesorias además de IL-1RI, incluyendo una cinasa asociada a receptor (IRAK). Una serina/treonina cinasa con homología a IRAK, denominada Pelle, se encuentra en Drosophila (para revisión, véase Belvin y Armstrong, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:393; 1996). Se ha informado de que otra proteína de Drosophila, Pellino, interacciona con Pelle (Grosshans et al., Mech. Dev. 81:127; 1999).

La polarización dorsal-ventral en embriones de Drosophila depende del establecimiento de un gradiente de localización nuclear del factor de transcripción Dorsal tipo Rel. El programa de transcripción mediada por el Dorsal resulta de una cascada de señalización provocada por la unión de un ligando extracelular Spaetzle a su receptor peaje (receptor Toll). Los intermedios de esta cascada de señalización incluyen a la proteína adaptadora Tube, la serina/treonina cinasa Pelle, y Cactus, una pareja de unión citosólica de Dorsal. Las señales transmitidas por Toll dan como resultado la degradación de Cactus y por ello, permiten la importación nuclear de Dorsal. La similitud entre los dominios citosólicos de Toll y el receptor IL-1-R1 de la interleucina-1 de mamíferos se observó primero por Gay y Keith (Gay. N., y Keith, F., 1991, Nature 351: 355-356), y el número de proteínas que contienen las regiones homólogas, denominadas dominio Toll/IL-1R (TIR), se ha extendido posteriormente para incluir una familia más grande de receptores y moléculas de señalización intracelulares de una variedad de organismos. Aquellos con repeticiones ricas en leucina en sus dominios extracelulares están ampliamente implicados en las respuestas inmunitarias innatas e incluyen por lo menos diez receptores tipo peaje (toll-like receptors (TLR) de mamífero que inician las respuestas inflamatorias frente a patógenos microbianos tales como peptidoglicano, lipopéptidos bacterianos, lipopolisacáridos bacterianos, zimosan, ADN CpG, flagelina, ácidos lipoteicoicos y proteínas de virus sincitial respiratorio; y proteínas vegetales tales como el producto del gen N de resistencia que media en la resistencia a la enfermedad. Además, ahora resulta claro que una función importante de la señalización Toll en Drosophila adulta es controlar las respuestas a infecciones fúngicas.

También se han conservado evolutivamente los componentes corriente abajo de la ruta de señalización Toll en las rutas de señalización del receptor de interleucina-1 y TLR de mamíferos que culminan en la translocación nuclear del factor de transcripción Factor Nuclear kappa B (NF-kB). Las proteínas cinasas IRAK-1 e IRAK2, homólogos cercanos de Pelle, se reclutan en los complejos activados del receptor IL-1R o TLR a través de la proteína adaptadora MyD88 y experimentan de autofosforilación. Aunque la MyD88 no es un análogo estricto de Tube, ambas proteínas contienen un denominado dominio de la muerte, y la Tube probablemente sirve para mediar la transmisión de señales entre Toll y Pelle, al que se une. Posteriormente, IRAK interacciona con otra molécula adaptadora TRAF-6, que es homóloga a la D-TRAF recientemente descrita. Las señales corriente debajo de TRAF parecen ser divergentes y no todas se entienden completamente pero una consecuencia, en células de mamíferos, es la activación del complejo de la IkB cinasa (IKK) que fosforila directamente al homólogo inhibitorio de Cactus IkB en dos residuos de serina N-terminales lo que provoca su ubiquitinación y degradación. Liberado de una asociación citoplasmática con IkB, el NF-kB migra dentro del núcleo. Recientemente, se encontró un candidato para un intermedio adicional en interacciones Tube-Pelle mediante la selección de dos híbridos de levaduras con Pelle como secuencia de cebo. Se demostró que esta proteína, denominada Pellino, interacciona con Pelle catalíticamente competente pero no con una forma mutante de Pelle que carecía de actividad cinasa. Aunque no se trató una función para Pellino en este estudio, se sugirió que podía o bien estabilizar la forma activada de Pelle o mediar en una interacción con sustratos corriente abajo de Pelle.

Se informó de que homólogos Pellino supuestos de Drosophila existen en C. elegans (Rich et al., Trends in Genetics (2000) 16(7):292-294) y en seres humanos (Rich et al., Immunogenetics (2000) 52: 145-149). Se encontró un segundo gen homólogo, Pellino-2, en seres humanos y en ratones (Resch et al., Cytogenetics and Cell Genetics (2001) 92(1-2):172-174). En la misma publicación, se añadió una nota como prueba, apuntando a indicios de la existencia de un tercer gen Pellino humano (denominado Pellino-3). Kennedy et al. (FASEB J. (2001) 15(7):A209) informó de que Pellino-1 (denominado PRISM) estimula la activación de NF-\kappaB y de que un mutante Pellino-1 negativo dominante bloquea la estimulación por Toll y por IL-1 de NF-\kappaB.

Se han implicado la IL-1 y otras citocinas pro-inflamatorias en una diversidad de enfermedades y estados, incluyendo la artritis reumatoide, el mieloma múltiple, la osteoporosis, la endotoxemia y la sepsis, la osteoartritis, enfermad inflamatoria del intestino y la alergia. Se ha demostrado que la inhibición de la señalización de IL-1 utilizando formas solubles de IL-1R, y el IL-1ra es útil en el tratamiento o la mejora de enfermedades caracterizadas por niveles excesivos de IL-1 (Rosenwasser, J. Allergy Clin. Immunol. 102:344; 1998).Otras partes de la ruta de señalización de IL-1 y otras rutas pro-inflamatorias activadas por MAP cinasa también han sido diana de intentos para identificar moléculas adicionales que pueden utilizarse terapéuticamente para intervenir en estados relacionados generalmente con IL-1 y citocinas pro-inflamatorias en general. Así, hay una necesidad en la técnica de identificar moléculas novedosas implicadas en las rutas de señalización pro-inflamatorias activadas por MAP cinasa e IL-1, tanto como herramientas con las que investigar la señalización celular como para el uso en identificar inhibidores de señalización pro-inflamatoria. Son de particular interés los polipéptidos novedosos que están implicados en la estimulación de múltiples rutas de señalización pro-inflamatoria debido a que la inhibición de tales polipéptidos inhibirían más eficazmente los efectos inflamatorios que la inhibición de un polipéptido específico de ruta.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de nuevos polipéptidos Pellino murinos y humanos, Pellino-1 y -2 murinos y Pellino-1,-2, y -3 humanos.

En particular, la invención proporciona un polipéptido aislado que puede inhibir la transcripción dependiente de NF-kB o dependiente de p38, el polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:12, en la que se han eliminado los aminoácidos 1 hasta x1 de dicha secuencia y en la que x1 es cualquiera de los aminoácidos 50 hasta 98 de dicha secuencia;

(b): SEQ ID NO: 4, en la que se han eliminado los aminoácidos x1 hasta de x2 de dicha secuencia y en la que x1 es cualquiera de los aminoácidos 99 hasta 178 y x2 es cualquiera de los aminoácidos 100 hasta 179;

(c): SEQ ID NO: 8, en la que se han eliminado los aminoácidos x1 hasta x2 de dicha secuencia y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 1 hasta el 180 y x2 es cualquier aminoácido desde el 2 hasta el 181;

(d): SEQ ID NO: 12, en la que se han eliminado los aminoácidos x1 hasta x2 de dicha secuencia y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 1 hasta el 206 y x2 es cualquier aminoácido desde el 2 hasta el 207;

(e): una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:12, en la que se han eliminado o sustituido uno o más residuos de cisteína del dominio tipo RING-finger (dedo de anillo) por residuos no de cisteína;

(f): una variante alélica de (a) a (c);

(g): fragmentos de las secuencias de aminoácidos de cualquiera de (a)-(d) y (f) que comprenden secuencias de aminoácidos del dominio tipo dedo-RING; y

(h): un fragmento de las secuencias de aminoácidos de cualquiera de (a)-(g) en la que un polipéptido que consiste en tal fragmento puede inhibir la transcripción dependiente de NF-kB.

La invención también proporciona un ácido nucleico genómico aislado que corresponde a los ácidos nucleicos de la invención.

Otros aspectos de la invención son ácidos nucleicos aislados que codifican para polipéptidos de la invención y variantes alélicas de esos ácidos nucleicos.

La invención proporciona además vectores de expresión y células huésped recombinantes que comprenden por lo menos un ácido nucleico de la invención y células huésped recombinantes preferidas en las que dicho ácido nucleico está integrado en el genoma de la célula huésped.

También se proporciona un procedimiento para la producción de un polipéptido codificado por los ácidos nucleicos de la invención que comprende cultivar una célula huésped recombinante en estados que potencien la expresión de dicho polipéptido, en el que la célula huésped recombinante comprende por lo menos un ácido nucleico de la invención. Un procedimiento preferido proporcionado por la invención comprende además purificar dicho polipéptido. En otro aspecto de la invención, se proporciona el polipéptido producido por dicho procedimiento.

En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan métodos para identificar compuestos que alteran la actividad del polipéptido Pellino (o actividad dominante negativo de Pellino) que comprenden

(a): mezclar un compuesto de prueba con un polipéptido de la invención; y

(b): determinar si el compuesto de prueba altera la actividad del polipéptido Pellino (o actividad dominante negativo de Pellino) de dicho polipéptido.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar compuestos que inhiben la actividad de unión de polipéptidos Pellino que comprende

(a): mezclar un compuesto de prueba con un polipéptido de la invención y una pareja de unión de dicho polipéptido; y

(b): determinar si el compuesto de prueba inhibe la actividad de unión de dicho polipéptido.

En realizaciones preferidas, la pareja de unión es una molécula de ruta de señalización intracelular; más preferiblemente, la pareja de unión se selecciona del grupo que consiste en TRAF2, TRAF6, IRAK, TRAF1, Y TRAF 3, 4 y 5.

La invención proporciona además un método in vitro para inhibir la transcripción dependiente de NF-kB que comprende proporcionar por lo menos un polipéptido de la invención. Se proporciona además un método in vitro para inhibir la señalización de p38 cinasa mediada por IL-1, comprendiendo el método proporcionar por lo menos un antagonista de un polipéptido de la invención, en el que el antagonista es un anticuerpo que inhibe la actividad de dicho polipéptido.

Otro aspecto de la invención es el uso de los polipéptidos de la invención como un medicamento.

Una realización adicional de la invención proporciona un uso para los polipéptidos Pellino "dominante-negativo" de la invención en la preparación de un medicamento para tratar un estado inflamatorio; con una realización preferida en la que el estado inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en asma, la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria del intestino, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la aterosclerosis y la enfermedad de Alzheimer.

También están comprendidas dentro del alcance de la presente invención las proteínas de fusión que comprenden cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente y un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un dominio Fc de inmunoglobulina, un péptido FLAG, un péptido que comprende por lo menos aproximadamente 6 residuos His, una cremallera ("zipper") de leucina, un péptido GFP, un péptido PkA, un péptido birA y un péptido GST. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para tales proteínas de fusión también están incluidas dentro de la presente invención, como también lo están los vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ADN mencionados anteriormente, las células huésped transformadas o transfectadas con los vectores de expresión y los procedimientos para preparar polipéptidos que comprenden cultivar tales células huésped en estados que potencian la expresión y recuperar los polipéptidos. La invención proporciona además animales transgénicos o knockout generados utilizando los ADN inventivos. La invención proporciona además anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos inventivos, incluyendo anticuerpos monoclonales y anticuerpos humanos. También se proporcionan ensayos para la identificación de moléculas pequeñas que regulan la señalización de IL-1, utilizando un péptido inventivo.

Descripción detallada de la invención

Se han identificado Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano, polipéptidos Pellino nuevos que tienen características estructurales propias de la familia de polipéptidos Pellino. Mediante la expresión de una de estas isoformas de Pellino de mamíferos en células COS, Pellino-1 murino, se ha demostrado que varios inductores de NF-kB provocan específicamente que Pellino-1 se procese proteolíticamente en una forma insoluble. Además, se ha demostrado que la expresión de polipéptidos de Pellino tales como Pellino-1 y Pellino-2 activa fuertemente a los genes indicadores dependientes de NF-kB y aumenta la cinasa N-terminal de Jun, la p38 cinasa, y la señalización de ERK mediada por IL-1, y que las formas mutantes de Pellino, que carecen de motivos conservados, suprimen la activación de NF-kB basal e inducida por citocinas y también la transcripción dependiente de p38. Las moléculas de esta invención tienen utilidad como, o conducen a, terapias anti-inflamatorias. El descubrimiento de los polinucleótidos de la invención permite la construcción de vectores de expresión que comprenden ADN que codifica para polipéptidos; células huésped transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; el desarrollo de células y animales transgénicos y knockout; polipéptidos aislados y purificados y fragmentos de los mismos; el uso de los polinucleótidos de los mismos como sondas o cebadores para identificar el ADN que codifica para proteínas que presentan actividad Pellino, el uso de oligonucleótidos de una hebra sentido o antisentido de los ácidos nucleicos para inhibir la expresión y/o función de polinucleótidos codificados por genes Pellino; el uso de tales polinucleótidos o polipéptidos para identificar inhibidores de moléculas pequeñas de la asociación de proteínas o de la función de Pellino; el uso de tales polinucleótidos o polipéptidos para identificar otras moléculas implicadas en la señalización de IL-1; el uso de tales polipéptidos y fragmentos de los mismos para generar anticuerpos; y el uso de tales anticuerpos para purificar el polipéptido Pellino.

Las secuencias de aminoácidos de Pellino-1 murino y humano, Pellino-2 murino y humano y polipéptido Pellino-3 humano se proporcionan en las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 y 12 respectivamente, y una alineación que muestra las similitudes de secuencia entre Pellino-1 y -2 murino y humano, Pellino-3 humano y otros polipéptidos Pellino se presentan en la tabla 1 en el ejemplo 1 a continuación. La familia de polipéptidos Pellino se conserva sorprendentemente bien, siendo los miembros de la familia humana sumamente similares entre sí, y extremadamente similares a los miembros homólogos de la familia Pellino de otras especies tales como Mus musculus.

Los elementos estructurales típicos comunes a miembros de la familia de polipéptidos Pellino incluyen un dominio central particularmente bien conservado, que se extiende desde el aminoácido 132 hasta el aminoácido 193 en Pellino-1 (SEQ ID NO 2 y 4; que corresponde a los aminoácidos 134 hasta 195 en SEQ ID NO: 8 y aminoácidos 158 hasta 219 en SEQ ID NO: 12); un motivo absolutamente conservado desde el residuo 245 hasta el residuo 254 de las SEQ ID NO 2 y 4 (que corresponde a los aminoácidos 247 hasta 256 en la SEQ ID NO: 8 y los aminoácidos 271 hasta 280 en la SEQ ID NO: 12); y un dominio ("el dominio de tipo RING-finger"), similar a la subfamilia de dedos RING C3CH4 de dominios de dedos de Zinc, desde el aminoácido 333 hasta el aminoácido 398 de SEQ ID NO 2 y 4 (que corresponde a los aminoácidos 335 hasta 400 en SEQ ID NO: 8 y los aminoácidos 360 hasta 425 en SEQ ID NO: 12). Hay ciertos residuos de cisteína claves dentro del dominio tipo RING-finger, de tal modo que es probable que las sustituciones de esos residuos estén asociadas con una función alterada o carecimiento de esa función para polipéptidos Pellino. Los residuos de cisteína conservados dentro de los polipéptidos Pellino están localizados en las posiciones 333, 336, 367, 371, 395 y 398 de las SEQ ID NO 2 y 4 (y en las posiciones 335, 338, 369, 373, 397 y 400 de la SEQ ID NO 8 y las posiciones correspondientes en la SEQ ID NO: 6 y en las posiciones 360, 363, 394, 398, 422 y 425 de la SEQ ID NO: 12). El experto en la técnica reconocerán que los límites de las regiones de los polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano, y Pellino-3 humano descritos anteriormente son aproximados y que los límites precisos de tales dominios también pueden diferir de un miembro a otro dentro de la familia de polipéptidos Pellino. Si embargo, está claro por lo anterior y por la tabla 1 que los polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano presentan cada uno una estructura global coherente entre ellos y con otros polipéptidos Pellino.

Las actividades o funciones biológicas asociadas con los polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano, y Pellino-3 humano incluyen la estimulación de rutas de señalización activadas por MAP cinasa tales como rutas de señalización pro-inflamatorias, y en particular, la estimulación de la transcripción de promotores corriente abajo tales como promotores dependientes de NF-kB y p38. La capacidad de los polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano, y Pellino-3 humano para estimular las rutas de señalización activadas por MAP cinasa está asociada con muchos dominios de los polipéptidos Pellino (tales como el dominio conservado central, N-terminal, el dominio tipo RING-finger y el dominio C-terminal) o con los polipéptidos enteros debido a que se demostrado que las deleciones de dominios N- o C-terminales y ciertas modificaciones de residuos clave dentro del Pellino-1 murino o bien que abolían esta actividad estimulante o que generaban mutantes Pellino-1 "dominante negativos" que inhiben las rutas de señalización activadas por MAP cinasa. La capacidad de los polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano para estimular las rutas de señalización activadas por MAP cinasa puede determinarse, por ejemplo, en un ensayo que mide la transcripción de genes indicadores tales como la secuencia codificante de luciferasa o la secuencia codificante de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), de promotores corriente abajo, tales como el promotor IL-8 dependiente de NF-kB o el promotor CHOP dependiente de p38. Los polipéptidos Pellino que estimulan las rutas de señalización activadas por MAP cinasa tienen preferiblemente el 10% (más preferiblemente por lo menos el 25% y lo más preferiblemente por lo menos el 50%) de esta actividad estimulante comparada con la de Pellino-1 murino medida en los ensayos del gen indicador de luciferasa del promotor IL-8 dependiente de NF-kB del ejemplo 2.

Los polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano también son sustratos para proteasas tales como serina proteasas tipo quimotripsina y muestran un cambio de solubilidad en respuesta a la estimulación celular por parte de moléculas estimulantes tales como TNF-alfa y PMA. La actividad proteasa-sustrato está asociada al dominio central de los polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano, y Pellino-3 humano, este dominio central que comprende los residuos 154 y 165 de la SEQ ID NO: 2 (o los residuos correspondientes de otros polipéptidos Pellino), las sustituciones al cual han mostrado que reducen la escisión de Pellino-1. Así, para los usos que requieren actividad Pellino proteasa-sustrato, los polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano preferidos incluyen aquellos que comprenden los residuos 154 y 165 de SEQ ID NO: 2 (o los residuos correspondientes de otros polipéptidos Pellino) o que tienen el dominio central conservado y que muestran escisión proteolítica en respuesta a los estímulos celulares apropiados, tales como el tratamiento con TNF-alfa o PMA. Los polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano preferidos incluyen además oligómeros o polipéptidos de fusión que comprenden por lo menos un dominio central conservado de uno o más polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano, y fragmentos de cualquiera de estos polipéptidos, que muestran escisión proteolítica en respuesta a los estímulos celulares apropiados, tales como el tratamiento con TNF-alfa o PMA. La actividad proteasa-sustrato de polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano puede determinarse, por ejemplo, en un ensayo que mide la extensión de la escisión de polipéptido Pellino tal como se describe en los ejemplos 3 y 4 a continuación. Los polipéptidos que tienen actividad proteasa-sustrato tienen preferiblemente el 10% (más preferiblemente por lo menos el 25% y lo más preferiblemente por lo menos el 50%) de la actividad proteasa-sustrato de Pellino-1-FLAG murino tal como se mide en los ensayos de los ejemplos 3 y 4.

Las actividades o funciones biológicas asociadas con ciertas formas alteradas o mutantes de polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano incluyen la inhibición de rutas de señalización activadas por MAP cinasa, tales como rutas de señalización pro-inflamatorias, y en particular, la inhibición de la transcripción de promotores corriente abajo tales como promotores dependientes de NF-kB y p38. La capacidad de estos polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano mutantes para inhibir las rutas de señalización activadas por MAP cinasa está asociada con alteraciones de ciertos dominios de los polipéptidos Pellino tales como la región N-terminal, el dominio central conservado y el domino tipo RING-finger ya que se ha demostrado que las eliminaciones de 50 o 99 aminoácidos N-terminales y ciertas modificaciones al dominio central conservado y el domino tipo RING-finger dentro del Pellino-1 murino generan mutantes de Pellino-1 "dominante-negativo" que inhiben las rutas de señalización activadas por MAP cinasa (véase el ejemplo 2, a continuación). La capacidad de polipéptidos alterados Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano alterados para inhibir las rutas de señalización activadas por MAP cinasa puede determinarse, por ejemplo, en un ensayo que mide la transcripción de genes indicadores tales como la secuencia codificante de luciferasa o la secuencia codificante de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), de promotores corriente abajo, tales como el promotor IL-8 dependiente de NF-kB o el promotor CHOP dependiente de p38. Los polipéptidos Pellino que inhiben las rutas de señalización activadas por MAP cinasa tienen preferiblemente por lo menos el 10% (más preferiblemente por lo menos el 25% y lo más preferiblemente por lo menos el 50%) de esta actividad inhibidora comparada con la del mutante "d133-156-FLAG" de Pellino-1-FLAG murino tal como se mide en los ensayos del gen indicador de luciferasa del promotor IL-8 dependiente de NF-kB del ejemplo 2.

El término "actividad del polipéptido Pellino", tal como se utiliza en el presente documento, incluye uno cualquiera o más de los siguientes: estimulación de rutas de señalización activadas por MAP cinasa, actividad proteasa-sustrato, actividad defensiva del huésped contra patógenos, así como las actividades ex vivo e in vivo de polipéptidos Pellino tipo silvestre. El término "actividad dominante-negativo del polipéptido Pellino", tal como se utiliza en el presente documento, incluye la inhibición de rutas de señalización activadas por MAP cinasa, actividad anti-inflamatoria, y la capacidad de secuestrar parejas de unión en la fracción celular insoluble, así como las actividades ex vivo e in vivo de polipéptidos Pellino mutantes que muestran tales actividades inhibitorias en ensayos de genes indicadores. El grado en que miembros individuales de la familia de polipéptidos Pellino y fragmentos y otros derivados de estos polipéptidos muestran estas actividades puede determinarse mediante procedimientos de ensayo convencionales, particularmente ensayos tales como los descritos en los ejemplos 2, 3 y 4 a continuación. Se describen ensayos a modo de ejemplo en el presente documento; los expertos en la técnica apreciarán que pueden utilizarse otro tipo de ensayos similares para medir las actividades biológicas de polipéptidos Pellino.

Otro aspecto de la actividad biológica de los polipéptidos Pellino es su capacidad para interaccionar con moléculas de rutas de señalización intracelular particulares tales como TRAF2, TRAF6, IRAK, TRAF1 y TRAF 3, 4 y 5, estando el dominio tipo RING-finger de los polipéptidos Pellino probablemente implicado en la unión a tales parejas de unión. El dominio central conservado de los polipéptidos Pellino interacciona con una proteasa de serina tipo quimotripsina que escinde los polipéptidos Pellino, y se cree que la porción N-terminal de los polipéptidos Pellino se une a un factor implicado en la localización de péptidos Pellino en, o en su transporte a, la parte del entorno celular que se convierte en la fracción soluble tras la lisis celular. Así, cuando se deleciona la porción N-terminal de Pellino-1, este polipéptido Pellino se localiza constitutivamente en la fracción insoluble pero todavía puede inhibir las rutas de señalización activadas por MAP cinasa, probablemente mediante la unión de polipéptidos de rutas de señalización mediante su dominio tipo RING-finger. El término "pareja de unión", tal como se utiliza en el presente documento, incluye ligandos, receptores, sustratos, anticuerpos, otros polipéptidos Pellino, el mismo polipéptido Pellino (en el caso de interacciones homotípicas) y cualquier otra molécula que interacciona con un polipéptido Pellino a través del contacto o la proximidad entre porciones particulares de la pareja de unión y el polipéptido de Pellino. Como se cree que el dominio tipo RING-finger de los polipéptidos Pellino se une a una pareja de unión de ruta de señalización, cuando el dominio tipo RING-finger se expresa como un fragmento separado del resto de un polipéptido Pellino pero con lo suficiente del dominio N-terminal como para permitir que el polipéptido Pellino se localice en la fracción insoluble, se espera que perturbe la unión de polipéptidos Pellino de tipo natural a sus parejas de unión. Los ensayos particularmente adecuados para detectar o medir la unión entre polipéptidos Pellino y sus parejas de unión incluyen la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), que utiliza una luciferasa bioluminiscente que está fusionada genéticamente a una proteína candidata, tal como un polipéptido Pellino y un mutante de proteína fluorescente verde fusionada a otra proteína de interés, tal como TRAF2, IRAK, TRAF6 y otras parejas de unión potenciales. Las interacciones entre dos proteínas de fusión pueden acercar la luciferasa y la proteína fluorescente verde lo suficiente como para que ocurra la transferencia de energía por resonancia, cambiando así el color de la emisión bioluminiscente. Lo más preferiblemente, pueden determinarse las actividades de unión de parejas de los polipéptidos Pellino utilizando ensayos de complementación de fragmentos de proteínas, tal como se describe por Remy y Michnick, 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96: 5394-5399 y en el documento WO 01/00866.

Se cree que los polipéptidos Pellino tales como polipéptidos Pellino-1 y -2 murino y humano y Pellino-3 humano con la capacidad para estimular las rutas activadas por MAP cinasa desempeñan un papel en la protección del huésped frente a patógenos virales, bacterianos, fúngicos y de otros tipos (respuestas inmunitarias innatas). Adicionalmente, los polipéptidos Pellino están implicados en enfermedades o estados inmunitarios y/o inflamatorios que comparten como rasgo común la estimulación de rutas activadas por MAP cinasa y la transcripción dependiente de NF-kB y/o p38 en su etiología. El efecto terapéutico de la estimulación de rutas activadas por MAP cinasa, por ejemplo mediante la administración de un polipéptido Pellino con actividad de tipo natural, o fragmentos o polipéptidos de fusión con actividad de tipo natural, o agonistas de los mismos, se muestra mediante los ejemplos siguientes de estados en los que la estimulación de la transcripción dependiente de NF-kB es beneficiosa (Yamamoto y Gaynor, 2001, J Clin Invest 107: 135-142). La ruta de NF-kB modula la supervivencia de linfocitos B, proliferación celular dependiente de mitógeno y cambio de isotipo, que conducen a la diferenciación de linfocitos B en células plasmáticas. Adicionalmente, el NF-kB regula la producción de IL-2, lo que aumenta la proliferación y diferenciación de linfocitos T y aumenta el desarrollo de células T colaboradoras de tipo Th1, potenciando la inmunidad mediada por células. Así, la activación de NF-kB conduce a la inducción de múltiples genes que regulan la respuesta inmunitaria. La ruta de NF-kB también es un mediador clave de genes implicados en el control de la proliferación celular y la apoptosis. Los genes antiapoptóticos que están directamente activados por NF-kB incluyen los inhibidores celulares de la apoptosis (c-IAP1, c-IAP2 e IXAP), los factores asociados a receptores de TNF (TRAF1 y TRAF2), el homólogo de Bcl-2 A1/Bfl-1, e IEX-IL. Estas proteínas antiapoptóticas bloquean la activación de caspasa-8, una proteasa iniciadora implicada en una etapa temprana en la estimulación de la ruta apoptótica, y la inducción de la expresión de A1/Bfl-1 mediante NF-kB impide la liberación de citocromo c de la mitocondria y la activación de caspasa-3. Mediante el aumento de la expresión de proteínas celulares antiapoptóticas, la activación de NF-kB puede reducir así la apoptosis en respuesta al tratamiento con diferentes agentes quimioterapéuticos. Adicionalmente, el NF-kB está implicado en la protección de células para que no sufran apoptosis en respuesta a daños de ADN o tratamiento con citocinas.

El efecto terapéutico de la inhibición de rutas activadas por MAP cinasa, por ejemplo, mediante la administración de un polipéptido Pellino con actividad inhibitoria "dominante-negativa", o fragmentos o polipéptidos de fusión de los mismos que tienen actividad inhibitoria "dominante-negativa", u otros antagonistas de polipéptidos Pellino que tienen actividad de tipo natural, se demuestra mediante los siguientes ejemplos de estados en los que la inhibición de la transcripción dependiente de NF-kB es beneficiosa (Yamamoto y Gaynor, 2001, J Clin Invest 107: 135-142). El NF-kB regula las respuestas inflamatorias del huésped aumentando la expresión de genes celulares específicos, incluyendo genes que codifican por lo menos 27 citocinas y quimiocinas distintas. Las citocinas que están estimuladas por NF-kB, tal como IL-1 beta y TNF-alfa, también pueden activar directamente la ruta de NF-kB, estableciendo así un bucle autorregulador positivo que puede amplificar la respuesta inflamatoria y aumentar la duración de la inflamación crónica. El NF-kB también estimula la expresión de enzimas cuyos productos contribuyen a la patogénesis del proceso inflamatorio, incluyendo la forma inducible de la óxido nítrico sintasa (iNOS), que genera óxido nítrico (NO), y la ciclooxigenasa inducible (COX-2), que genera prostanoides. La activación de la ruta de NF-kB está implicada en la patogénesis de enfermedades inflamatorias crónicas tales como el asma, la artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria del intestino y otras enfermedades en las que la inflamación desempeña un papel tal como la ateroesclerosis y la enfermedad de Alzheimer. Varias líneas de evidencia sugieren que la activación de NF-kB de genes de citocinas es un contribuyente importante a la patogénesis del asma que se caracteriza por la infiltración de células inflamatorias y la desregulación de muchas citocinas y quimiocinas en el pulmón. Las citocinas, tal como la TNF-alfa, que activan el NF-kB están elevadas en el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide y contribuyen a los cambios inflamatorios crónicos y la hiperplasia sinovial observada en las articulaciones de estos pacientes. Los aumentos en la producción de citocinas proinflamatorias tanto por linfocitos como por macrófagos también se han implicado en la patogénesis de enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La activación de NF-kB se observa en espécimenes de biopsia de mucosas de pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa activas. El tratamiento de pacientes con enfermedades inflamatorias del intestino con esteroides disminuye la actividad de NF-kB en espécimenes de biopsia y reduce los síntomas clínicos. Estos resultados sugieren que la estimulación de la ruta de NF-kB puede estar implicada en la respuesta inflamatoria potenciada asociada con estas enfermedades. La ateroesclerosis está provocada por numerosos ataques al endotelio y músculo liso de la pared vascular dañada. Un gran número de factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas liberadas de células endoteliales, músculo liso, macrófagos y linfocitos están implicados en este proceso inflamatorio y fibroproliferativo crónico. La regulación de los genes implicados en la respuesta inflamatoria y en el control de la proliferación celular por NF-kB probablemente desempeña un papel importante en la iniciación y progresión de la ateroesclerosis. Las anomalías en la regulación de la ruta de NF-kB pueden estar implicadas en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, la inmunorreactividad de NF-kB se encuentra predominantemente en, y alrededor de, tipos de placas neuríticas tempranas en la enfermedad de Alzheimer, mientras que los tipos de placas maduras muestran actividad de NF-kB inmensamente reducida. Así, la activación de NF-kB puede estar implicada en la iniciación de placas neuríticas y apoptosis neuronal durante las fases tempranas de la enfermedad de Alzheimer. Otras condiciones en las que la inflamación desempeña un papel y las que se espera que mejoren mediante las disminuciones en las rutas de señalización proinflamatorias activadas por MAP cinasa incluyen la osteoporosis, accidente cerebrovascular, la esclerosis múltiple y el mieloma múltiple. Se describen ejemplos adicionales de enfermedades que implican inflamación y/o respuestas celulares inflamatorias en la patente de los EE.UU. número 6.204.261 desde la columna 206, línea 25 hasta la columna 207, línea 44. Además de un papel en la patogénesis de enfermedades caracterizadas por los aumentos en la respuesta inflamatoria del huésped, la activación constitutiva de la ruta de NF-kB también se ha implicado en la patogénesis de algunos cánceres humanos. Las anomalías en la regulación de la ruta de NF-kB se observan frecuentemente en una variedad de cánceres humanos incluyendo leucemia, linfomas y tumores sólidos. Estas anomalías dan como resultado niveles constitutivamente altos de NF-kB en el núcleo de una variedad de tumores incluyendo cánceres de mama, de ovario, de próstata y de colon. La mayoría de estos cambios se deben probablemente a alteraciones en proteínas reguladoras que activan rutas de señalización que conducen a la activación de la ruta de NF-kB. Un aspecto de la invención es evitar, bloquear y/o inhibir las interacciones entre polipéptidos Pellino y sus parejas de unión y proporciona métodos para tratar o mejorar estas enfermedades y estados a través del uso de inhibidores de actividades de Pellino de tipo natural tal como la estimulación de la transcripción dependiente de NF-kB.

Moléculas de polinucleótidos

En una realización particular, la invención se refiere a ciertas moléculas de polinucleótidos aisladas que están libres de material endógeno contaminante. "Molécula de polinucleótido" se refiere a moléculas de polinucleótidos en forma de fragmentos separados o como un componente de constructos de polinucleótidos más grandes. Las moléculas de polinucleótidos se han derivado preferiblemente de ADN o ARN aislado por lo menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentración que permita la identificación, manipulación y recuperación de sus secuencias de nucleótidos componentes mediante métodos bioquímicos convencionales (tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. NY (1989)). Preferiblemente, tales secuencias se proporcionan y/o construyen en forma de un marco de lectura abierto ininterrumpido por secuencias internas no traducidas, o intrones, que están típicamente presentes en genes eucarióticos. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en sentido 5' o 3' desde un marco de lectura abierto, cuando los mismos no interfieren en la manipulación y/o expresión de la región codificante.

Las moléculas de polinucleótidos de la invención incluyen ADN en forma de tanto de hebra sencilla como de hebra doble, así como las secuencias complementarias correspondientes. El ADN incluye por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR y combinaciones de los mismos. Puede aislarse el ADN genómico por técnicas convencionales, por ejemplo, utilizando el ADNc de las SEQ ID NOs 1, 3, 5 o 7, o un fragmento adecuado de los mismos, como una sonda. Las moléculas de ADN de la invención incluyen ADN que codifican para polipéptidos Pellino de longitud completa así como polinucleótidos y fragmentos de los mismos. Los polinucleótidos de la invención se derivan preferiblemente de fuentes humanas, pero la invención también incluye a aquellos derivados de especies humanas.

La presente solicitud describe ADN de Pellino-1 murino que tiene la secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 1 y el polipéptido codificado por el ADN de SEQ ID NO:1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. El polipéptido que tiene los aminoácidos 132 hasta 189 de la SEQ ID NO:2 es un sitio diana para la acción proteasa para un miembro de la familia de quimotripsina de proteasas. La presente solicitud describe además ADN de Pellino-1 humano que tiene la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:3 y el polipéptido codificado por el ADN de SEQ ID NO:3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. También se encuentra en este polipéptido un sitio diana específico de proteasa correspondiente a los aminoácidos 132 hasta 189 de SEQ ID NO:4. Además, se describe el ADN de Pellino-2 murino y que tiene la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:5 y el polipéptido codificado por la SEQ ID NO:5 que se muestra en SEQ ID NO:6. El sitio diana de proteasa se localiza entre los aminoácidos 133 y 190 de Pellino-2 murino. De manera similar, es probable que el sitio diana de proteasa de Pellino-2 humano esté entre los aminoácidos 134 y 191 de SEQ ID N:8. Las secuencias diana de proteasa de SED ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 anteriormente descritas pueden variar en uno o más aminoácidos. Así, el extremo terminal amino de la región diana de proteasa para SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 puede producirse desde el aminoácido 130 hasta el 134 y el extremo terminal carboxilo de la región diana desde el aminoácido 187 hasta el 191. De manera similar, para la SEQ ID NO:6, el extremo terminal amino de la región diana de proteasa se produce desde el aminoácido 131 hasta el aminoácido 135 (aminoácidos 132 hasta 136 de SEQ ID NO: 8) y el extremo terminal carboxilo desde el aminoácido 188 hasta el 192 (aminoácidos 189 hasta 193 de SEQ ID NO:8).

Debido a la degeneración conocida del código genético, en la que más de un codón puede codificar para el mismo aminoácido, un ADN puede variar del que se muestra en SEQ ID NO:1, y todavía codificar para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Tales ADN variantes pueden resultar de mutaciones silenciosas que se producen de manera natural, o durante amplificación por PCR, o pueden ser producto de mutagénesis deliberada de una secuencia naturales. Lo mismo es cierto para los ADN que se muestran en SEQ ID NO: 3, 5 y 7.

La solicitud describe ADN aislados que codifican para polipéptidos de la invención, seleccionados de: (a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1; (b) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3; (c) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5; (d) un ADN que codifica para los polipéptidos codificados por el ADN de (a), (b) o (c); (e) un ADN que puede hibridarse con el ADN de (a), (b) o (c) en condiciones de rigor moderado y que codifica para un polipéptido de la invención; (f) un ADN que puede hibridarse con el ADN de (a), (b) o (c) en condiciones de rigor alto y que codifica para un polipéptido de la invención, y (g) un ADN que está degenerado como resultado del código genético a un ADN definido en (a), (b), (c), (d), (e) o (f) y que codifica para un polipéptido de la invención.

Los parámetros básicos que afectan a la elección de condiciones de hibridación y la orientación para idear condiciones adecuadas se describen en Sambrook et al., 1989. Tal como de utiliza en el presente documento, las condiciones de rigor moderado pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica basándose en, por ejemplo, la longitud y/o composición de base del ADN. Para hibridar sondas que son más largas que aproximadamente 100 nucleótidos con ADN o ARN diana unido a filtro, una manera de conseguir condiciones de rigor moderado implica el uso de una solución de prelavado que contiene 5XSSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de formamida a aproximadamente el 50%, 6XSSC, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 42ºC (u otras soluciones de hibridación similares, como una que contenga formamidama a aproximadamente el 50%, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42ºC), y condiciones de lavado de aproximadamente 60ºC, en 0,5XSSC, SDS al 0,1%. Las condiciones de rigor alto también pueden determinarse por expertos en la técnica basándose, por ejemplo, en la longitud y/o composición de base del ADN. Generalmente, tales condiciones se definen como condiciones de hibridación tal como anteriormente, pero con lavado a aproximadamente 68ºC, 0,2XSSC, SDS al 0,1%. Debe entenderse que la temperatura de lavado y la concentración de sales de lavado puede ajustarse según sea necesario para conseguir un grado de rigor deseado mediante la aplicación de los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y la estabilidad del dúplex, tal como saben los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Debe entenderse además que pueden diseñarse las condiciones de hibridación para sondas de oligonucleótidos de longitud y secuencia definidas mediante la aplicación de fórmulas conocidas en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al., 1989 en 11.4511.47).

También se describen en la solicitud fragmentos de polipéptidos que codifican para ADN que tienen por lo menos una actividad de polipéptidos Pellino, y polipéptidos que codifican para ADN de por lo menos aproximadamente 16 aminoácidos, o de por lo menos aproximadamente 32 aminoácidos, polipéptidos que son útiles como inmunógenos. También se incluyen, tal como se describe a continuación, los ADN que codifican para polipéptidos que comprenden sitio(s) inactivado(s) de N-glucosilación, sitio(s) inactivado(s) de procesamiento de proteasas o sustitución(ones) conservadora(s) de aminoácidos. Por ejemplo, el dominio del homólogo de IL-1R puede ser útil como un regulador dominante negativo de la señalización de IL-1R o en un ensayo para identificar moléculas pequeñas que pueden inhibir o regular de otro modo la señalización de IL-1.

Las moléculas de ADN descritas en la solicitud también comprenden polinucleótidos que son idénticos en por lo menos un 80% a la secuencia nativa, y moléculas de polinucleótidos que son idénticas en por lo menos un 85% a una molécula naturales. También se contemplan realizaciones en las que una molécula de ADN es idéntica en por lo menos un 90%, en por lo menos un 95%, en por lo menos un 98%, en por lo menos un 99% o en por lo menos un 99,9% a una secuencia naturales. El porcentaje de identidad se describe como el número de símbolos alineados, es decir, nucleótidos o aminoácidos, que son idénticos dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Pueden determinarse el grado de homología (porcentaje de identidad) entre dos secuencias utilizando el método de alineación de Neddleman y Wunsch (J. Mol Diol. 48:443, 1970) tal como se revisa por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981), con una matriz unaria de comparación (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess (Nucl. Acids. Res. 14:6745, 1986) tal como se describe por Schwartz y Dayhoff (Atlas of Protein Sequence and Structure. National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979) para aminoácidos. Preferiblemente, la comparación se realiza utilizando un programa informático. Un programa informático preferido a modo de ejemplo es el "GAP", programa del paquete Wisconsin versión 10.0 de Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI). Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) la puesta en práctica de GCG de las matrices de comparación anteriormente citadas para nucleótidos y aminoácidos; (2) una penalización de 30 por cada hueco y una penalización adicional de 1 por cada símbolo en cada hueco para las secuencias de aminoácidos, o una penalización de 50 por cada hueco y una penalización adicional de 3 por cada símbolo en cada hueco para las secuencias de nucleótidos; (3) ninguna penalización por huecos de extremos; y (4) ninguna penalización máxima para huecos largos. También pueden utilizarse otros programas utilizados por un experto en la técnica de comparación de secuencias.

De manera similar, los ADN de la invención incluyen variantes que difieren de una secuencia de ADN naturales debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones, pero que codifican para un polipéptido biológicamente activo. Adicionalmente, los ADN que codifican para diversas adiciones o sustituciones de residuos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de residuos o secuencias terminales o internas están englobadas dentro de la invención.

Ejemplos de tales ADN incluyen a aquellos que se han modificado para facilitar la expresión de un polipéptido con un sitio alterado de glucosilación unido a N o un sitio de proteasa KEX-2, así como aquellos en los que codones que codifican para residuos Cys que no son necesarios para la actividad biológica se eliminan o alteran para codificar para otro aminoácido. Se describen estos y otros péptidos variantes en el presente documento; los ADN que los codifican también están englobadas dentro de la invención.

La invención también proporciona ADN aislados útiles para la producción de polipéptidos. Tales polipéptidos pueden prepararse mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido Pellino, o un fragmento deseado del mismo, puede subclonarse en un vector de expresión para la producción del polipéptido o fragmento. La secuencia de ADN se fusiona ventajosamente con una secuencia que codifica para un péptido líder o de señal adecuado.

El fragmento de ADN deseado puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas conocidas. También pueden producirse fragmentos de ADN mediante la digestión con endonucleasas de restricción de una secuencia clonada de ADN de longitud completa, y aislarlos mediante electroforesis sobre geles de agarosa. Si es necesario, los oligonucleótidos que reconstruyen el extremo terminal 5' o 3' a un punto deseado pueden ligarse a un fragmento de ADN generado por digestión con enzimas de restricción. Tales oligonucleótidos pueden contener adicionalmente un sitio de escisión de endonucleasa de restricción en el sentido 5' de la secuencia codificante deseada y posicionar un codón de iniciación (ATG) en el extremo N-terminal de la secuencia codificante.

También puede emplearse el procedimiento bien conocido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar y amplificar un ADN que codifica para una proteína deseada o un fragmento de la misma. Los oligonucleótidos que definen los extremos terminales deseados del fragmento de ADN se emplean como cebadores de 5' y 3'. Los oligonucleótidos pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento amplificado de ADN en un vector de expresión. Las técnicas de PCR se describen en Saiki et al., Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), págs. 189-196; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990).

La presente invención también proporciona genes correspondientes a secuencias de ácidos nucleicos que se describen en el presente documento. Los "genes correspondientes" o "ácidos nucleicos genómicos correspondientes" son regiones del genoma que se transcriben para producir los ARNm de los que se derivan secuencias de ácidos nucleicos de ADNc y pueden incluir regiones contiguas del genoma necesarias para la expresión regulada de tales genes. Por lo tanto, los genes correspondientes pueden incluir pero no se limitan a secuencias codificantes, regiones 5' y 3' no traducidas, exones, intrones, promotores, potenciadores y elementos silenciadores o supresores empalmados alternativamente. Los ácidos nucleicos genómicos correspondientes pueden incluir 10.000 pares de bases (más preferiblemente, 5.000 pares de bases, todavía más preferiblemente, 2.500 pares de bases, y lo más preferiblemente, 1.000 pares de bases) de secuencias de ácidos nucleicos genómicos en el sentido 5' del primer nucleótido de la secuencia genómica que corresponde al codón de iniciación de la secuencia codificante del polipéptido Pellino, y 10.000 pares de bases (más preferiblemente, 5.000 pares de bases, todavía más preferiblemente, 2.500 pares de bases, y lo más preferiblemente, 1.000 pares de bases) de secuencias de ácidos nucleicos genómicos en el sentido 3' del último nucleótido de la secuencia genómica que corresponde al codón de terminación de la secuencia codificante del polipéptido Pellino. Los genes o ácidos nucleicos genómicos correspondientes pueden aislarse según métodos conocidos utilizando la información de secuencias descrita en el presente documento. Tales métodos incluyen la preparación de sondas o cebadores de la información de secuencias descrita para la identificación y/o amplificación de genes en bibliotecas genómicas apropiadas u otras fuentes de materiales genómicos. Un "gen aislado" o "un ácido nucleico genómico aislado" es un ácido nucleico genómico que se ha separado de secuencias genómicas adyacentes presentes en el genoma del organismo del que se aisló el ácido nucleico genómico.

Polipéptidos y fragmentos de los mismos

La invención engloba polipéptidos y fragmentos de los mismos en diversas formas, incluyendo aquellos que se producen de forma natural o que se producen a través de diversas técnicas tales como los procedimientos que implican tecnología de ADN recombinante. Tales formas incluyen pero no se limitan a derivados, variantes y oligómeros así como a proteínas de fusión o fragmentos de las mismas.

Los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen proteínas de longitud completa codificados por las secuencias de ácidos nucleicos descritas anteriormente. Los polipéptidos de longitud completa comprenden una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, 4 y 6, con fragmentos útiles que comprenden los aminoácidos 132 hasta 289 de SEQ ID NO: 2 y 4, y los aminoácidos 133 hasta 190 de SEQ ID NO: 6. Tal como se mencionó anteriormente, los aminoácidos N-terminal y C-terminal de estos y otros fragmentos puede variar en aproximadamente dos aminoácidos de aquellos dados (es decir, el extremo N-terminal puede variar desde los aminoácidos 130 hasta 134 de SEQ ID NO: 2 y 4 y 131 hasta 135 de SEQ ID NO:6; y el extremo C-terminal puede variar desde los aminoácidos 187 hasta 191 de SEQ ID NO: 2 y 4 y 188 hasta 192 de SEQ ID NO:6).

Los péptidos inventivos y fragmentos de los mismos pueden expresarse de manera recombinante como un polipéptido intracelular, preferiblemente en células que no sean de mamíferos. Tales péptidos pueden obtenerse mediante el aislamiento de células que expresan el polipéptido del medio de cultivo (por ejemplo, mediante centrifugación o filtración), la solubilización de las células y el aislamiento del péptido de las células solubilizadas. La elección de las técnicas de solubilización dependerá de las células utilizadas para la expresión. La purificación del polipéptido de células huésped recombinantes se facilita mediante la expresión del polipéptido como una proteína de fusión con una proteína marcadora tal como se ha tratado en el presente documento.

Los péptidos inventivos y fragmentos de los mismos también pueden expresarse de manera recombinante como un polipéptido soluble que puede secretarse de las células en las que se fabricó. Pueden obtenerse tales péptidos solubles separando células intactas que expresen el polipéptido soluble del medio de cultivo (por ejemplo, mediante centrifugación o filtración) y aislando el péptido soluble del medio (sobrenadante). La purificación de los polipéptidos de células huésped recombinantes se facilita mediante la expresión del polipéptido como una proteína secretada, que puede ser útil en la obtención de grandes cantidades del polipéptido soluble como un agente terapéutico o de diagnóstico o para el uso en ensayos. Debido a que los extremos N-terminal y C-terminal de polipéptidos expresados de manera recombinante pueden variar en varios aminoácidos, incluyendo desde aproximadamente 1 aminoácido hasta aproximadamente 10 aminoácidos, los polipéptidos de esta invención pueden variar en consecuencia.

La invención también proporciona polipéptidos Pellino y fragmentos de los mismos que retienen una actividad deseada. Las realizaciones particulares se refieren a fragmentos de polipéptidos que retienen la capacidad de unirse a un miembro de la familia de quimotripsina de proteasas. Un fragmento de este tipo puede ser un polipéptido soluble, tal como se ha descrito anteriormente. En otra realización, los polipéptidos y fragmentos incluyen ventajosamente regiones que están conservadas en la familia Pellino tal como se has descrito anteriormente.

También se proporcionan en el presente documento, fragmentos de polipéptidos que comprenden por lo menos 8, 12, 16 o por lo menos 32 aminoácidos contiguos de la secuencia SEQ ID NO:2. Tales fragmentos de polipéptidos pueden emplearse como inmunógenos en la generación de anticuerpos, como agonistas o antagonistas de moléculas pequeñas de actividad Pellino, y en diversos ensayos para determinar la actividad Pellino.

En el presente documento se proporcionan variantes que se producen en la naturaleza, así como variantes derivadas de polipéptidos y fragmentos. Las variantes pueden mostrar secuencias de aminoácidos que son idénticas en al menos un 80%, o idénticas en al menos aproximadamente un 85%, al polipéptido natural descrito en el presente documento. También se contemplan realizaciones en las que un polipéptido o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90%, idéntica en al menos un 95%, idéntica en al menos un 98%, idéntica en al menos un 99%, o idéntica en al menos un 99,9% al polipéptido o fragmento preferido del mismo. El porcentaje de identidad puede determinarse tal como se describió anteriormente en el presente documento.

Las variantes de la invención incluyen, por ejemplo, las que resultan de acontecimientos corte y empalme alternante del ARNm o de escisión proteolítica. El corte y empalme alternante del ARNm puede dar, por ejemplo, una proteína truncada pero biológicamente activa, tal como una forma acortada de la proteína que se produce en la naturaleza. Tal como se mencionó anteriormente, las variaciones atribuibles a la proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N o C-terminal con la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína (generalmente desde aproximadamente uno hasta aproximadamente cinco aminoácidos terminales) u otras diferencias en la expresión de la proteína. Las proteínas en las que las diferencias en la secuencia de aminoácidos son atribuibles al polimorfismo genético (variación alélica entre los individuos que producen la proteína) también se contemplan en el presente documento.

Otras variantes incluyen proteínas de fusión, tales como las preparadas mediante la expresión en cultivo recombinante como fusiones en el extremo N-terminal o C-terminal. Ejemplos de proteínas de fusión incluyen proteínas de fusión que formarán oligómeros, tales como una proteína de fusión Pellino/Fc (por ejemplo, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.962.406, concedida el 5 de octubre de 1999), o una proteína de fusión de cremallera (patente de los EE.UU. número 5.716.805, concedida el 10 de febrero de 1998). Además, las proteínas de fusión pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación y la identificación (denominadas a menudo proteínas marcadoras). Tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénica descritos en la patente de los EE.UU. número 5.011.912 y en Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988. Proteínas marcadoras útiles adicionales incluyen la proteína fluorescente verde (GFP; Chalfie et al., Science 263: 802, 1994), un péptido N-terminal que contiene sitios de reconocimiento para un anticuerpo monoclonal, una endopeptidasa específica y una proteína cinasa específica de sitio (PKA; Blanar y Rutter, Science 256: 1014, 1992), proteína birA (Altman et al., Science 274: 94, 1996) y glutatión S transferasa (GST: Smith y Johnson, Gene 67: 31, 1988).

Uno de tales péptidos marcadoras es el péptido FLAG, que es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente mediante un anticuerpo monoclonal específico, lo que permite un ensayo rápido y una fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Un hibridoma murino designado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido FLAG en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.011.912. La línea celular de hibridoma 4E11 se ha depositado con el número de registro HB 9259 en la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo). Anticuerpos monoclonales que se unen al péptido FLAG están disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut.

Otro péptido marcador útil es el péptido GST, que se une a glutatión, lo que facilita también la purificación de la proteína recombinante expresada. La proteína recombinante puede purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz de cromatografía adecuada a la que se ha unido glutatión, tal como se describe en Smith y Johnson, citado anteriormente. Matrices de cromatografía adecuadas incluyen perlas de Glutatión-Agarosa (Pharmacia). La proteína recombinante puede eluirse con un exceso de glutatión. Alternativamente, puede incluirse un sitio de escisión enzimática específico tal como un sitio de escisión de trombina) en la proteína de fusión recombinante, y el polipéptido deseado puede extraerse de la matriz de afinidad mediante el tratamiento con la enzima que escinde la proteína de fusión en el sitio de escisión.

Entre los polipéptidos variantes proporcionados en el presente documento están las variantes de los polipéptidos naturales que conservan la actividad biológica natural o la equivalente sustancial de la misma. Un ejemplo es una variante que se une a una pareja de unión esencialmente con la misma afinidad de unión que la de la forma natural. La afinidad de unión puede medirse mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.512.457 y explicada más adelante. Las variantes incluyen polipéptidos que son sustancialmente homólogos a la forma natural, pero que tienen una secuencia de aminoácidos diferente de la de la forma natural debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones. Las realizaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos que comprenden desde una hasta diez deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos, cuando se comparan con una secuencia natural. Un aminoácido dado puede sustituirse, por ejemplo, por un residuo que tiene características fisioquímicas similares. Ejemplos de tales sustituciones conservativas fisioquímicas incluyen la sustitución de residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala entre sí; sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp, o Gln y Asn; o sustituciones de un residuo aromático por otro, tales como Phe, Trp o Tyr entre sí. Otras sustituciones, por ejemplo, que suponen sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas.

La invención incluye además polipéptidos de la invención con o sin glucosilación de patrón natural asociada. Los polipéptidos expresados en sistemas de expresión de levaduras o mamíferos (por ejemplo, las células CHO o COS-7) pueden ser similares a o significativamente diferentes de un polipéptido natural en un patrón de glucosilación y peso molecular, dependiendo de la elección del sistema de expresión. Además, una preparación dada puede incluir múltiples especies glucosiladas de manera diferencial de la proteína. La expresión de polipéptidos de la invención en los sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glucosiladas. Los grupos glucosilo también pueden eliminarse mediante métodos químicos o enzimáticos convencionales, en particular los que utilizan glucopeptidasa. En general, los polipéptidos glucosilados de la invención pueden incubarse con un exceso molar de glucopeptidasa (Boehringer Mannheim). La tecnología recombinante también puede aplicarse para reducir la glucosilación que se produce en los sistemas de expresión eucariotas, por ejemplo, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.071.972 y en el documento EP 276.846. Otras variantes se preparan mediante la modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes, para mejorar la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad KEX2 proteasa, tal como se describe en el documento EP 212.914. En otro ejemplo de variantes, pueden modificarse secuencias que codifican para residuos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica para hacer que se delecionen o sustituyan residuos de Cys por otros aminoácidos, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.962.406, concedida el 5 de Octubre de 1999.

Variantes adicionales dentro del alcance de la invención incluyen polipéptidos que pueden modificarse para crear derivados de los mismos formando conjugados agregativos o covalentes con otros restos químicos, tales como grupos glucosilo, lípidos, grupos fosfato, acetilo y similares. Los derivados covalentes pueden prepararse mediante la unión de restos químicos a grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos o en el extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido. Los conjugados que comprenden agentes diagnósticos (detectables) o terapéuticos unidos a ellos se contemplan en el presente documento, tal como se trata en más detalle más adelante.

Producción de polipéptidos y fragmentos de los mismos

La presente invención también proporciona vectores de expresión y clonación recombinantes que contienen ADN, así como las células huésped que contienen los vectores recombinantes. Los vectores de expresión que comprenden ADN pueden utilizarse para preparar los polipéptidos o fragmentos de la invención codificados por el ADN. Un método para producir polipéptidos comprende obtener cultivos de células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que codifica para el polipéptido, en condiciones que potencien la expresión del polipéptido, recuperando después los polipéptidos expresados del cultivo. El experto en la técnica reconocerá que los procedimientos para producir y purificar los polipéptidos expresados variarán según factores tales como el tipo de células huésped empleadas, y si el polipéptido está unido a la membrana o es un polipéptido soluble que se secreta de la célula huésped.

Puede emplearse cualquier sistema de expresión adecuado. Los vectores incluyen un ADN que codifica para un polipéptido o fragmento de la invención, unido operativamente a secuencias de nucleótidos reguladoras de la transcripción o la traducción, tales como las derivadas de genes de mamífero, microbianos, virales o de insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores o enhancers (potenciadores) de la transcripción, un sitio de unión ribosómico al ARNm y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y la terminación de la transcripción y la traducción. En el vector de expresión se incorpora generalmente un origen de replicación que confiere la capacidad para replicarse en las células huésped deseadas y un gen de selección mediante el cual se identifican los transformantes. Las secuencias de nucleótidos se unen operativamente cuando la secuencia reguladora está relacionada funcionalmente con la secuencia de ADN. Por tanto, una secuencia de nucleótidos promotora está unida operativamente
a una secuencia de ADN si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de ADN.

Además, puede incorporarse una secuencia que codifica para un péptido señal apropiado (natural o heterólogo) en los vectores de expresión. Una secuencia de ADN para un péptido señal (líder de secreción) puede fusionarse en marco a la secuencia de ácidos nucleicos de la invención, de modo que el ADN se transcribe inicialmente y el ARNm se traduce, en una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células huésped deseadas potencia la secreción extracelular del polipéptido. El péptido señal se escinde del polipéptido con la secreción de un polipéptido de la célula.

El experto en la técnica también reconocerá que la(s) posición(ones) en la(s) que se escinde el péptido señal pue-
de(n) diferir de la(s) pronosticada(s) por un programa informático, y puede(n) variar según factores tales como el tipo de células huésped empleadas en la expresión de un polipéptido recombinante. En consecuencia, una preparación de proteínas puede incluir una mezcla de moléculas de proteínas que tienen diferentes aminoácidos en el extremo N-terminal, que resultan de la escisión del péptido señal en más de un sitio.

Células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos incluyen células procariotas, de levaduras o eucariotas superiores. Vectores de expresión y clonación apropiados para su uso con huéspedes celulares de bacterias, hongos, levaduras y mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir polipéptidos utilizando ARN derivado de constructos de ADN descritos en el presente documento.

También pueden emplearse sistemas de cultivo de células huésped de mamífero o insecto para expresar polipéptidos recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se han revisado por Luckow y Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). También pueden emplearse líneas celulares establecidas de origen mamífero. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario del hámster chino (CHO), células HeLa y líneas de células BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea de células de riñón CV1 del mono verde africano (ATCC CCL 70), tal como describe en McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991).

Una línea celular comúnmente utilizada es la de las células CHO-DFHR (dihidrofolato reductasa) que son auxotróficas para glicina, timidina e hipoxantina, y que pueden transformarse en el fenotipo DHFR+ utilizando ADNc de DHFR como un marcador dominante amplificable. Una de tales líneas celulares CHO-DHFR, DXB11, la describieron Urlaub y Chasin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, 1980). Otro ejemplo de la línea celular CHO-DHFR es DG44 (véase, por ejemplo, Kaufman, R. J., Meth. Enzymology 185: 537 (1988). Otras líneas celulares desarrolladas para esquemas específicos de selección o amplificación también serán útiles con la invención.

En la técnica se conocen varios protocolos de transfección, y se revisan en Kaufman, R. J., citado anteriormente. El protocolo de transfección escogido dependerá del tipo de célula huésped y de la naturaleza del gen de interés, y puede escogerse basándose en la experimentación convencional. Los requisitos básicos de cualquier protocolo de este tipo son introducir primero un ADN que codifica para la proteína de interés en una células huésped adecuada, y después identificar y aislar las células huésped que han incorporado el ADN heterólogo de una manera estable y con expresión. Otros protocolos de transfección útiles se tratan en la patente de los EE.UU. número 6.027.915, concedida el 22 de febrero de 2000. La transfección de las células con ADN heterólogo y la selección de las células que han captado el ADN heterólogo y que expresan el marcador seleccionable da como resultado un conjunto de células transfectadas. Las células individuales en estos conjuntos variarán en la cantidad de ADN incorporado y en la localización cromosómica del ADN transfectado. Para generar líneas celulares estables, las células individuales pueden aislarse de los conjuntos y ponerse en cultivo (un procedimiento denominado clonación).

También es deseable un método para amplificar los genes de interés para la expresión de la proteína recombinante, y normalmente supone el uso de un marcador de selección (revisado en Kaufman, R. J., citado anteriormente). La resistencia a fármacos citotóxicos es la característica utilizada más frecuentemente como un marcador de selección, y puede ser el resultado de un rasgo dominante (es decir, puede utilizare independientemente del tipo de célula huésped) o un rasgo recesivo (es decir, es útil en tipos particulares de células huésped que son deficientes en cualquier actividad para la que se esté seleccionando). Varios marcadores amplificables son adecuados para su uso en los vectores de expresión inventivos (por ejemplo, tal como se describe en Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989; págs. 16.9-16. 14).

En la tabla 1 de Kaufman, R. J., citado anteriormente (1988), se muestran marcadores seleccionables útiles para la amplificación génica en células de mamíferos resistentes a fármacos e incluyen resistencia a MTX-DHFR, resistencia a P-glucoproteína y resistencia a múltiples fármacos (MDR)-diversos agentes citotóxicos lipófilos (es decir, adriamicina, colchicina, vincristina), y adenosina desaminasa (ADA)-Xyl-A o adenosina y 2'-desoxicoformicina. Otros marcadores seleccionables dominantes se tratan en la patente de los EE.UU. número 6.027.915, concedida el 22 de febrero de 2000).

Los elementos reguladores útiles, descritos anteriormente, también pueden incluirse en plásmidos o vectores de expresión utilizados para transfectar células de mamífero. El protocolo de transfección escogido, y los elementos seleccionados para su uso en el mismo, dependerán del tipo de célula huésped utilizado. Los expertos en la técnica conocen numerosos protocolos y células huésped diferentes y pueden seleccionar un sistema apropiado para la expresión de una proteína deseada, basándose en las necesidades de su(s) sistema(s) de cultivo celular seleccionado(s).

Un vector de alta expresión útil, pCAVNOT, se ha descrito por Mosley et al., Cell 59: 335-348, 1989. Otros vectores de expresión para su uso en células huésped de mamífero pueden construirse tal como describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983). Un sistema útil para la expresión estable de alto nivel de ADNc de mamífero en las células epiteliales mamarias murinas C127 puede construirse sustancialmente tal como describen Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Un vector de alta expresión útil, PMLSVN1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312:768, 1984, se ha depositado como ATCC 39890. Vectores de expresión de mamífero útiles adicionales se describen en el documento EP-A-0367566 y en el documento WO 91/18982. Aún en otra alternativa, los vectores pueden derivarse de retrovirus.

También pueden utilizarse vectores de expresión útiles adicionales, pFLAG y pDC311. La tecnología FLAG está centrada en la fusión de un péptido marcador FLAG de bajo peso molecular (lkD), hidrófilo, al extremo N-terminal de una proteína recombinante expresada por los vectores de expresión pFLAG. pDC311 es otro vector especializado utilizado para expresar proteínas en células CHO. pDC311 se caracteriza por una secuencia bicistrónica que contiene el gen de interés y un gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) con un sitio de unión a ribosomas interno para la traducción de DHFR, un elemento de secuencia de aumento de la expresión (EASE - expression augmenting sequence element), el promotor de CMV (citomegalovirus) humano, una secuencia líder tripartita y un sitio de
poliadenilación.

Puede emplearse un péptido señal para facilitar la secreción de la proteína, si se desea. La elección del péptido señal o del líder puede depender de factores tales como el tipo de células huésped en las que va a producirse el polipéptido recombinante. A modo de ilustración, ejemplos de péptidos señal heterólogos que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen la secuencia señal para la interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente de los Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de la interleucina-2 descrito en Cosman et al., Nature 312: 768 (1984); el péptido señal del receptor de la interleucina-4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido señal del receptor de la interleucina-1 de tipo 1 descrito en la patente de los EE.UU. número 4.968.607; y el péptido señal del receptor de la interleucina-1 de tipo II descrito en el documento EP 460.846.

Purificación

Los péptidos o fragmentos de los mismos "aislados" englobados por esta invención son polipéptidos o fragmentos que no están en un entorno idéntico a un entorno en el que pueden encontrarse en la naturaleza. Los polipéptidos o fragmentos de los mismos "purificados" englobados por esta invención están esencialmente libres de asociación con otros componentes celulares, tales como proteínas o polipéptidos no relacionados, lípidos y ADN o ARN, por ejemplo, como un producto de purificación de sistemas de expresión recombinantes, tales como los descritos anteriormente o como un producto purificado a partir de una fuente no recombinante, tal como células y/o tejidos que se producen en la naturaleza.

En una realización, la purificación de los polipéptidos o fragmentos recombinantes puede llevarse a cabo mediante la expresión del(de los) polipétido(s) inventivo(s) como una proteína de fusión con un péptido (a menudo denominado péptido marcador) para el que se conoce en la técnica un esquema de purificación por afinidad. Tales parejas de fusión pueden incluir poli-His u otros péptidos marcadores descritos anteriormente, así como un resto Fc o un resto de cremallera.

Con respecto a la purificación, tal como conoce el experto en la técnica, los procedimientos para purificar un polipéptido o fragmento recombinante variarán según factores tales como el tipo de células huésped empleadas y si el polipéptido o fragmento recombinante se secreta o no en el medio de cultivo. En general, el polipéptido o fragmento recombinante puede aislarse de las células huésped si no se secreta, o del medio o sobrenadante si es soluble y se secreta, seguido por una o más etapas de concentración, extracción por salado, intercambio iónico, interacción hidrófoba, purificación por afinidad o cromatografía por exclusión de tamaño.

En cuanto a las formas específicas para llevar a cabo estas etapas, el medio de cultivo puede concentrarse primero utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación, tal como un medio de filtración en gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio iónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos colgantes de dietilaminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas.

Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Además, puede emplearse una etapa de enfoque cromatográfico. Alternativamente, puede emplearse una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba. Las matrices adecuadas pueden ser restos de fenilo u octilo unidos a las resinas. Además, puede emplearse cromatografía de afinidad con una matriz que une selectivamente la proteína recombinante. Ejemplos de tales resinas empleadas son columnas de lectina, columnas de colorante y columnas de quelantes metálicos.

Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) empleando medios de RP-HPLC hidrófobos, (por ejemplo, gel de sílice o resina polimérica que tiene grupos colgantes de metilo, octilo, octildecilo y otros grupos alifáticos) para purificar adicionalmente los polipéptidos. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, se conocen bien y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada y purificada.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende una proteína de unión a los polipéptidos de la invención, tal como un anticuerpo monoclonal generado frente a los polipéptidos de la invención, para purificar por afinidad los polipéptidos expresados. En este aspecto de la invención, proteínas de unión, tales como anticuerpos frente a Pellino u otras moléculas que se unen a Pellino, pueden unirse a un soporte en fase sólida, tal como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato similar adecuado para identificar, separar o purificar Pellino. La adherencia de Pellino a una superficie de contacto en fase sólida puede lograrse mediante cualquier medio, por ejemplo, pueden recubrirse microesferas magnéticas con proteínas de unión a Pellino (u otras moléculas de unión a Pellino) y mantenerse en el recipiente de incubación a través de un campo magnético.

Las soluciones que contienen polipéptidos Pellino contactan con la fase sólida en condiciones que potencian la unión de polipéptidos Pellino a la pareja de unión; entonces el material no unido se separa mediante lavados. Se conocen en la técnica los métodos para liberar péptidos seleccionados positivamente de la fase sólida y engloban por ejemplo, el uso de un tampón de elución con alto contenido en sales seguido de diálisis un tampón con un contenido en sales más bajo, o cambiando el pH (u otras características dependiendo de la matriz de afinidad utilizada), o eliminación competitiva utilizando un sustrato que se produce en la naturaleza del resto de afinidad. Preferiblemente, los métodos no dañan a los polipéptidos Pellino.

En un método a modo de ejemplo, las soluciones que contienen los polipéptidos Pellino de la invención pueden incubarse primero con una pareja de unión biotinilada de Pellino. Los periodos de incubación son normalmente de por lo menos una hora de duración para garantizar la unión suficiente a los polipéptidos de la invención. La mezcla resultante se hace pasar entonces a través de una columna empaquetada con perlas recubiertas de avidina, por la cual la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de los polipéptidos Pellino a las perlas. Se conoce el uso de perlas recubiertas de avidina en la técnica. Véase Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). El lavado del material no unido y la liberación de células unidas se realiza utilizando métodos convencionales.

El grado de pureza deseado depende del uso intencionado de la proteína. Se desea un grado de pureza relativamente alto cuando el polipéptido se va a administrar in vivo, por ejemplo. En tal caso, se purifican los polipéptidos de tal manera que no puede detectarse ninguna banda de proteínas correspondiente a otras proteínas en el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). Un experto en el campo pertinente reconocerá que pueden visualizarse mediante SDS-PAGE las bandas múltiples correspondientes al polipéptido, debido a glucosilación diferencial, procesamiento de postraducción diferencial y similares. Lo más preferiblemente, se purifica el polipéptido de la invención hasta obtener una homogeneidad sustancial, tal como se indica por una única banda de proteína en el análisis mediante SDS-PAGE. La banda de la proteína puede visualizarse mediante tinción con plata, tinción con Azul de Coomassie o (si la proteína está radiomarcada) mediante autorradiografía.

Usos de ácidos nucleicos o oligonucleótidos de Pellino

Entre los usos de los ácidos nucleicos de la invención está el uso de fragmentos como sondas o cebadores. Generalmente, tales fragmentos comprenden por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras realizaciones, un fragmento de ADN comprende al menos 30, o al menos 60 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN.

Debido a que se contemplan en el presente documento los homólogos de proteínas de Pellino de otras especies de mamíferos, pueden utilizarse las sondas basadas en la secuencia de ADN de las SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 ó 11 para seleccionar bibliotecas de ADNc derivadas de otras especies de mamíferos utilizando técnicas convencionales de hibridación cruzada entre especies.

Utilizando el conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, pueden prepararse conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Tales oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), en las que se aislan y amplifican fragmentos de ADN.

Los expertos en la materia pueden utilizar todas o una parte de los ácidos nucleicos de las SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 ó 11, incluyendo oligonucleótidos, utilizando técnicas bien conocidas para identificar el cromosoma humano, y el locus específico del mismo, que contiene el ADN de un miembro de la familia Pellino. Las técnicas útiles incluyen pero no se limitan al uso de secuencias o partes, incluyendo oligonucleótidos, como una sonda en varias técnicas bien conocidas tales como el mapeo de híbridos por radiación (alta resolución), la hibridación in situ para dispersiones cromosómicas (resolución moderada) y la hibridación de inmunotransferencia Southern para líneas celulares híbridas que contienen cromosomas humanas individuales (resolución baja).

Por ejemplo, se pueden mapear cromosomas mediante hibridación por radiación utilizando cebadores que están dentro un supuesto exón del gen de interés y que amplifica un producto de ADN genómico humano pero que no amplifica el ADN genómico de otras especies. Los resultados de la PCR se convierten en un vector de datos que se marca y se determinan la asignación y ubicación cromosómicas relativas a marcadores de sitios de marcado de secuencia (Sequence Tag Site, STS) en el mapa de hibridación por radiación. Pellino-1 humano se mapea en el cromosoma 2, se sitúa a 7,15 cR de WI-6130.

Un experto en la materia puede utilizar el ácido nucleico de las SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 ó 11 o un fragmento del mismo utilizando técnicas bien conocidas para analizar anomalías asociadas con el mapeo de genes para un cromosoma que comprende un gen que codifica para Pellino. Esto permite que se puedan distinguir condiciones en las que este marcador se reordena o se deleciona. Adicionalmente, pueden utilizarse los nucleótidos de las SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 ó 11, o un fragmento de los mismos como un marcador de posición para mapear otros genes de localización desconocida.

Se puede utilizar el ADN en el desarrollo de tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o indirectamente) por cantidades deficientes o insuficientes de los genes correspondientes a los ácidos nucleicos de la invención. La descripción en el presente documento de secuencias de nucleótidos naturales permite la detección de genes defectuosos y la sustitución o complementación de los mismos por genes normales mediante varias técnicas de terapia génica conocidas en la técnica. Se pueden detectar los genes defectuosos en ensayos diagnósticos in vitro y mediante la comparación de una secuencia de nucleótido natural descrita en el presente documento con la de un gen derivado de una persona que se sospecha que pueda tener un defecto en este gen.

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos incluyen oligonucleótidos sentido o antisentido que comprenden un secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (o bien ARN o bien ADN) capaz de unirse a secuencias diana de ARNm (sentido) o ADN (antisentido). Según la presente invención, los oligonucleótidos sentido o antisentido comprenden un fragmento de ADN se la SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 ó 11. Generalmente, tal fragmento incluye por lo menos 17 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o uno sentido, basado en una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988). La unión de oligonucleótidos sentido o antisentido a secuencias diana de ácidos nucleicos da como resultado la formación de complejos que bloquean o inhiben la expresión de proteínas por uno de varios medios, tal como se trata en la patente de los EE.UU. número 5.783.665, concedida el 21 de julio de 1.998. Se pueden unir restos orgánicos y otras restos que aumentan la afinidad del nucleótido por una secuencia diana de ácido nucleico, o agentes de intercalación, pueden unirse a los oligonucleótidos antisentido o sentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido sentido o antisentido para la secuencia de nucleótidos diana. Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia del ácido nucleico diana por cualquier método de transferencia de genes, incluyendo por ejemplo, lipofección, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación o utilizando vectores de transferencia de genes tal como el virus de Epstein-Barr. Los oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, tal como se describe en el documento WO 91/04753. Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un complejo de oligonucleótido-lípido tal como se describe en el documento WO 90/10448.

Loa ADN inventivos también serán útiles en el desarrollo de células y animales transgénicos y/o knockout. Aquellos expertos ordinarios en la técnica conocen varios métodos mediante los cuales pueden prepararse tales células o animales; se describe un método a modo de ejemplo en la patente de los EE.UU. número 5.565.321, concedida el 15 de octubre de 1.996. Se pueden utilizar las técnicas que se describen en ese documento con secuencias inventivas mediante la aplicación de experimentación rutinaria.

Usos de polipéptidos Pellino

Como las proteínas Pellino son homólogas a las proteínas Pellino de Drosophila, una molécula importante en las cascada de señalización para la familia IL-1R/Toll de receptores, pueden ser útiles inhibidores de molécula pequeña de su función o asociaciones proteicas (o antisentido u otros inhibidores de su síntesis) en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios. En consecuencia, pueden utilizarse los polipéptidos Pellino de la presente invención en un ensayo de selección para identificar compuestos y moléculas pequeñas que inhiben (antagonizan) o potencian (agonizan) la activación de los polipéptidos de la presente invención.

Así, por ejemplo, pueden utilizarse los polipéptidos de la invención para identificar antagonistas y agonistas de células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Los antagonistas y agonistas pueden ser sustratos, ligandos, enzimas, receptores etc. naturales o modificados de los polipéptidos de la presente invención, o pueden ser miméticos estructurales o funcionales de los polipéptidos. Los antagonistas potenciales de la presente invención pueden incluir moléculas pequeñas, péptidos y anticuerpos que se unen a y ocupan un sitio de unión de los polipéptidos inventivos o una pareja de unión de los mismos, haciendo que no estén disponibles para unirse a sus parejas de unión naturales y por lo tanto, impidiendo su actividad biológica normal. Los agonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas, péptidos y anticuerpos que se unen a los presentes polipéptidos o las parejas de unión de los mismos y provocan los mismos efectos biológicos o potenciados que los producidos por la unión de los polipéptidos de la presente invención.

Normalmente, los agonistas o antagonistas de molécula pequeña tienen un peso inferior a 10K y pueden tener numerosas propiedades físicoquímicas y farmacológicas que potencian la penetración celular, resisten la degradación y prolongan sus semividas fisiológicas (Gibbs, J., Pharmaceutical Research in Molecular Oncology, Cell, Vol. 79 (1994)). Pueden utilizarse anticuerpos que incluyen moléculas intactas así como fragmentos tales como fragmentos Fab y F(ab')2, así como moléculas recombinantes derivadas de los mismos, para unirse a e inhibir los polipéptidos de la presente invención bloqueando la propagación de una cascada de señalización. Es preferible que los anticuerpos estén humanizados y más preferible que los anticuerpos sean humanos. Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse mediante una variedad de métodos bien conocidos.

En la técnica, se conocen métodos de selección específicos y junto con sistemas robóticos integrados y colecciones de compuestos químicos/productos naturales están extensamente incorporados en la selección de alto rendimiento para que puedan probarse grandes números de compuestos de prueba para determinar la actividad antagonista o agonista dentro de una cantidad corta de tiempo. Estos métodos incluyen formatos de ensayo homogéneos tales como transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, polarización por fluorescencia, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia con resolución temporal, ensayos de proximidad por centelleo, ensayos de genes indicadores, sustrato de enzima extinguido en fluorescencia, sustrato de enzima cromogénico y electroquimioluminiscencia, así como formatos de ensayo heterogéneo más tradicionales tales como ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayos.

Los ensayos homogéneos son ensayos de "mezcla y lectura" que son muy adecuados para la aplicación robótica, mientras que los ensayos heterogéneos requieren la separación del analito unido del libre mediante operaciones unitarias más complejas tales como la filtración, la centrifugación o el lavado. Estos ensayos se utilizan para detectar una amplia variedad de interacciones biomoleculares específicas y la inhibición de las mismas por moléculas orgánicas pequeñas incluyendo proteína-proteína, receptor-ligando, enzima-sustrato etc. Estos métodos y técnicas de ensayo se conocen bien en la técnica y se describen más en detalle en: High Throughput Screening: The Discovery of Bioactive Substances, John P. Devlin (ed.), Marcel Dekker, Nueva York, 1997, ISBN: 0-8247-0067-8; y los sitios de internet de lab-robotics.org y sbsonline.org. Los ensayos de selección de la presente invención son adecuados para la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas y son adecuados para la identificación de candidatos a fármaco de molécula pequeña, anticuerpos, péptidos y otros antagonistas y/o agonistas.

Una realización de un método para identificar las moléculas que inhiben o antagonizan los polipéptidos implica añadir una molécula candidato a un medio que contiene células que expresan los polipéptidos de la presente invención; cambiar las condiciones de dicho medio para que, quitando la presencia de la molécula candidato, los polipéptidos se unirían a sus ligandos, sustratos o moléculas efectoras naturales, y observar la unión y la estimulación o inhibición de una respuesta funcional. Las actividad de las células que se pusieron en contacto con la molécula candidato puede comparase entonces con células idénticas que no se pusieron en contacto y pueden identificarse antagonistas y agonistas de los polipéptidos de la presente invención. La medición de la actividad biológica puede realizarse mediante varios métodos bien conocidos tales como la medición de la cantidad de proteína presente (por ejemplo, un ELISA) o de la actividad de las proteínas. Una disminución en la estimulación o activación biológica indicaría un antagonista. Un aumento indicaría un agonista.

Los ensayos de selección pueden diseñarse además para encontrar moléculas que imitan la actividad biológica de los polipéptidos de la presente invención. Las moléculas que imitan la actividad biológica de un polipéptido pueden ser útiles para potenciar la actividad biológica del péptido. Para identificar los compuestos para agentes terapéuticamente activos que imitan la actividad biológica de un polipéptido, debe determinarse en primer lugar si una molécula candidato se une al polipéptido. Entonces, se añade una molécula candidato de unión a un ensayo biológico para determinar sus efectos biológicos. Entonces, se comparan los efectos biológicos de la molécula candidato con aquellos del (de los) polipéptido(s).

Otra realización de la invención se refiere a los usos de los polipéptidos Pellino para estudiar la transducción de señales celulares. La señalización celular a menudo implica una cascada de activación celular durante la cual un receptor propaga una señal mediada por el receptor del ligando mediante la activación específica de cinasas intracelulares que fosforilan a sustratos diana. Estos sustratos pueden ser ellos mismos cinasas que se activan después de la fosforilación. Alternativamente, pueden ser moléculas adaptadoras que facilitan la señalización en el sentido de 3' a través de la interacción proteína-proteína después de la fosforilación. En consecuencia, pueden utilizarse estos polipéptidos Pellino novedosos como reactivos para identificar moléculas novedosas implicadas en las rutas de transducción de señales.

Los polipéptidos inventivos están implicados en la señalización de IL-1 y como tal, pueden usarse como inhibidores de la ruta de señalización de IL-1. En consecuencia, tienen utilidad en ensayos in vitro y terapéutica in vivo. Como medicamentos que son permeables a la membrana celular, los polipéptidos Pellino y los fragmentos de los mismos pueden administrarse para agonizar o antagonizar las rutas de señalización mediadas por IL-1R, proporcionando así inmunorreguladores útiles. En el presente documento, se prevén varias composiciones basadas en liposomas de los polipéptidos inventivos.

Las composiciones de la presente invención pueden contener un polipéptido en cualquier forma descrita en el presente documento, tal como proteínas nativas, variantes, derivados, oligómeros y fragmentos biológicamente activos. En realizaciones particulares, la composición comprende un polipéptido soluble o un oligómero que comprende polipéptidos Pellino solubles.

En el presente documento, se proporcionan composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un polipéptido de la presente invención en combinación con otros componentes tales como un diluyente, vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. Pueden formularse los polipéptidos según métodos conocidos utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Pueden combinarse en mezcla, o bien como el único material activo o con otros materiales activos conocidos adecuados para una indicación dada, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina, disoluciones de Tris-HCL, acetato y tamponadas con fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o vehículos. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmacéuticas incluyen las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Además, tales composiciones pueden complejarse con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporarse en compuestos poliméricos tales como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), hidrogeles, dextrano, etc., o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, eritrocitos acrómicos o esferoblastos. Tales composiciones tendrán influencia sobre el estado físico, la solubilidad, estabilidad, tasa de liberación in vivo, y tasa de aclaramiento in vivo, y por tanto se eligen según la aplicación prevista.

Las composiciones de la invención pueden administrarse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, por vía tópica, por vía parenteral o mediante inhalación. El término "parenteral" incluye inyección, por ejemplo, por vía subcutánea, intravenosa o intramuscular, incluyendo también la administración localizada, por ejemplo, en el sitio de la enfermedad o lesión (por ejemplo, administración intracoronaria o intratumoral o inyección en una articulación que experimenta una reacción inflamatoria). También se contemplan implantes de forma de liberación sostenida. Un experto en la técnica pertinente reconocerá que las dosis adecuadas variarán, dependiendo de factores tales como la naturaleza del trastorno que va a tratarse, el peso corporal, edad, y estado general del paciente, y la vía de administración. Pueden determinarse dosis preliminares según pruebas en animales, y la ampliación a escala de las dosis para la administración en seres humanos se realiza según prácticas aceptadas en la técnica.

El polipéptido de la presente invención también puede administrarse mediante el método de la transducción de proteínas. En este método, el polipéptido Pellino está covalentemente unido a un dominio de transducción de proteínas (PTD) tal como, pero sin limitarse a, TAT, Antp, o VP22 (Schwarze et al., 2000, Cell Biology 10: 290-295). Entonces pueden transducirse los polipéptidos Pellino unidos a PTD en células añadiéndolos a medios de cultivo tisular que contienen las células (Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569; Lindgren et al., 2000, TiPS 21: 99; Derossi et al., 1998, Cell Biology 8: 84; documento WO 00/34308; documento WO 99/29721; y documento WO 99/10376). Además, se ha encontrado que puede administrarse a un mamífero el ADN que codifica para un polipéptido de tal manera que las células lo captan, y lo expresan. Entonces, la proteína resultante estará disponible para ejercer un efecto terapéutico. En consecuencia, también se contemplan composiciones que comprenden ácidos nucleicos en formulaciones fisiológicamente aceptables. El ADN puede formularse para inyección, por ejemplo.

Anticuerpos

En el presente documento se proporcionan anticuerpos que son inmunorreactivos con los polipéptidos de la invención. Tales anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos a través de los sitios de unión a antígeno del anticuerpo (al contrario que la unión no específica). Por tanto, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc., tal como se expuso anteriormente pueden emplearse como "inmunógenos" para producir anticuerpos inmunorreactivos con los mismos. Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc., contienen epítopos o determinantes antigénicos que provocan la formación de anticuerpos.

Estos epítopos o determinantes antigénicos pueden ser o bien lineales o bien conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales están compuestos por una única sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos están compuestos por secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena polipeptídica que se ponen en cercana proximidad con el plegamiento de la proteína (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 3: 9 (Garland Publishing Inc., 2ª ed. 1996)). Debido a que las proteínas plegadas tienen superficies complejas, el número de epítopos disponibles es bastante numeroso; sin embargo, debido a la conformación de la proteína y al impedimento estérico, el número de anticuerpos que realmente se unen a los epítopos es inferior al número de epítopos disponibles (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 2: 14 (Garland Publishing Inc., 2ª ed. 1996)). Pueden identificarse los epítopos mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a los epítopos antigénicos de los polipéptidos de la invención. Tales epítopos son útiles para producir anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonaes, tal como se describe en más detalle a continuación. Adicionalmente, los epítopos de los polipéptidos de la invención pueden usarse como reactivos de investigación, en ensayos, y para purificar anticuerpos de unión específica a partir de sustancias tales como sueros policlonales o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Tales epítopos o variantes de los mismos pueden producirse usando técnicas bien conocidas en la técnica tales como síntesis en fase sólida, escisión química o enzimática de un polipéptido, o usando tecnología del ADN recombinante.

En cuanto a los anticuerpos que pueden obtenerse mediante los epítopos de los polipéptidos de la invención, tanto si se han aislado los epítopos como si siguen siendo parte de los polipéptidos, pueden prepararse anticuerpos tanto policlonales como monoclonaes mediante técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual. Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

También se contemplan en el presente documento las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de la invención. Tales hibridomas pueden producirse e identificarse mediante técnicas convencionales. Un método para producir una línea celular de hibridoma de este tipo comprende inmunizar a un animal con un polipéptido o ADN que codifica para un polipéptido; recoger células de bazo del animal inmunizado; fusionar dichas células de bazo con una línea celular de mieloma, generando así células de hibridoma; e identificar una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une al polipéptido. Los anticuerpos monoclonales pueden recuperarse mediante técnicas convencionales.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando se administran los anticuerpos a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o sólo el sitio de unión a antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de una región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y modificados adicionalmente mediante ingeniería incluyen los descritos por Riechmann et al. (Nature 332: 323, 1988), Liu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7: 934, 1989), y Winter y Harris (TIPS 14: 139, mayo de 1993). Los procedimientos para generar los anticuerpos transgénicamente pueden encontrarse en el documento GB 2.272.440, las patentes de los EE.UU. números 5.569.825 y 5.545.806 y patentes relacionadas que reivindican prioridad de las mismas.

La presente invención también abarca los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, que pueden producirse mediante técnicas convencionales. Ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab y
F(ab')2. También se proporcionan fragmentos y derivados de anticuerpos producidos mediante técnicas de ingeniería genética.

En una realización, los anticuerpos son específicos para los polipéptidos de la presente invención y no reaccionan de manera cruzada con otras proteínas. Los procedimientos de selección mediante los cuales pueden identificarse tales anticuerpos se conocen bien, y pueden implicar cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos de la invención, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos también pueden emplearse para purificar polipéptidos o fragmentos la invención mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente las realizaciones particulares de la invención, y no deben interpretarse como que limitan el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Identificación de secuencias de polipéptido y ácido nucleico Pellino

Las secuencias de polinucleótidos de EST (etiquetas de secuencia expresada) aisladas a partir de células dendríticas murinas identificaron dos clones que contenían marcos de lectura abiertos con un alto grado de similitud con la proteína Pellino de Drosophila (Grosshans et al., citado anteriormente). Se diseñaron cebadores de PCR flanqueantes apropiados, y se amplificó un ácido nucleico novedoso a partir de una biblioteca de ADNc murino y se clonó; la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificados de este clon, que se denomina Pellino-1 (denominado previamente como diana de la señal inflamatoria conservada 1), se muestran en las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. Se compararon las secuencias humanas de las divisiones genómica de alto rendimiento (HTG) y EST de la base de datos pública GenBank con Pellino-1 murino, y se montó un marco de lectura abierto para el homólogo de Pellino-1 humano. Se diseñaron cebadores de PCR basándose en esta secuencia humana, y se aisló un clon de ADNc mediante amplificación por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de fibroblastos dérmicos humanos. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta proteína se muestran en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Posteriormente, Rich et al. publicaron las secuencias codificante y de aminoácidos de "Pellino humano" (números de registro de GenBank AJ278859 y CAC04320. 23 de agosto de 2000); la secuencia de aminoácidos del polipéptido "Pellino humano" es idéntica a la de Pellino-1 humano (SEQ ID NO: 4) excepto por una sustitución de Ser a Phe en la posición 11. La diferencia entre las secuencias de aminoácidos de Pellino humano y SEQ ID NO: 4 puede representar una variación de alelos que se produce de manera natural entre ácidos nucleicos que codifican para estas secuencias de aminoácidos dentro de la población humana. También se han publicado las secuencias de aminoácidos de Pellino-1 parciales en los documentos WO 2000/58350; EP 1 074 617; y WO 2001/09318.

Consultando las bases de datos de EST públicas, se identificó una parte de un segundo gen relacionado, denominado Pellino-2, en el ratón y el ser humano. Las secuencias de aminoácidos de Pellino-2 son idénticas en un 80% a sus homólogos respectivos de Pellino-1. Se diseñaron cebadores apropiados, y se clonó el ADN de Pellino-2 murino sustancialmente tal como se describe para Pellino-1; la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de Pellino-2 murino se muestra en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos previstas de Pellino-2 humano se muestran en SEQ ID NOs: 7 y 8.

Se recibió un conjunto de datos de Celera Genomics (Rockville, Maryland) que contenía una lista de secuencias de aminoácidos que se preveía que estaban codificadas por el genoma humano. Se buscó en este conjunto de datos con un algoritmo BLAST para identificar secuencias de polipéptido Pellino y se encontraron diversas secuencias de aminoácidos parciales que parecían estar relacionadas con un nuevo polipéptido Pellino humano, Pellino-3. La comparación de estas secuencias de aminoácidos de Pellino-3 parciales con secuencias de ADNc y genómico permitió montar las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de Pellino-3 humano previstas, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente. Se han detectado dos posibles variaciones alélicas en la secuencia de aminoácidos de Pellino-3 humano (SEQ ID NO: 12): una deleción del residuo Leu en la posición 96, y una sustitución de Arg a Ala en el residuo 353.

Se compararon las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de Pellino-1 y Pellino-2 murino ("Mm") y humano ("Hs"), y polipéptido de Pellino-3 humano (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 12) con las secuencias de aminoácidos de polipéptidos Pellino relacionados con Pellino de otras especies (Drosophila melanogaster, "Dm", SEQ ID NO: 13; Ciona intestinalis, "Ci", SEQ ID NO: 14; y Caenorhabditis elegans, "Ce", SEQ ID NO: 15) usando el programa de alineación de secuencias múltiples "pretty" de GCG, con matriz de puntuación de similitud de aminoácidos = blosum62, penalización por creación de hueco = 8, y penalización por extensión de hueco = 2. La alineación de estas secuencias se muestra en la tabla 1, e indica los residuos de aminoácidos consenso que son idénticos entre al menos tres de las secuencias de aminoácidos en la alineación. Los residuos en mayúsculas en la alineación son aquellos que coinciden con los residuos consenso. Pellino-1 y 2 comparten el 82% de identidad a nivel de aminoácidos, y el grado de conservación entre el ser humano y el ratón es extremadamente alto; sólo un aminoácido es diferente entre el Pellino-1 humano y de ratón, y el Pellino-2 se conserva al 95% entre estas especies. La secuencia de aminoácidos de Pellino-3 prevista es idéntica al 70% y 71% a Pellino-1 y 2 humano, respectivamente. Hay un grado de similitud sorprendente entre Pellino-1 humano, por ejemplo, y la proteína homóloga de C. elegans (SEQ ID NO: 15), que comparten el 44% de identidad de aminoácidos y el 53% de similitud de aminoácidos. Es evidente a partir de una inspección superficial de la alineación que la conservación de la secuencia no se concentra en ninguna parte en particular de la proteína Pellino, sino que se extiende por toda ella. Esto, y el hecho de que todos los polipéptidos Pellino (excepto por Pellino de Drosophila y Pellino-3 humano, que contienen extensiones N-terminales pequeñas) sean de tamaño muy similar, sugiere que (1) todas las partes de la proteína están implicadas en esta función de tipo natural y (2) existen pocos o ningún aminoácido externo a los de la función de tipo natural en los polipéptidos. Hay un dominio central particularmente bien conservado, que se extiende desde el aminoácido 132 hasta el aminoácido 193 en Pellino-1 (SEQ ID NOs 2 y 4; que corresponde a los aminoácidos desde 134 hasta 195 en SEQ ID NO: 8 y aminoácidos desde 158 hasta 219 en SEQ ID NO: 12), y un motivo absolutamente conservado desde el residuo 245 hasta el residuo 254 de SEQ ID NOs 2 y 4 (que corresponde a los aminoácidos desde 247 hasta 256 en SEQ ID NO: 8 y aminoácidos desde 271 hasta 280 en SEQ ID NO: 12). Las partes C-terminal de los polipéptidos Pellino están intercaladas por una serie de motivos cortos, invariantes, en los que son prevalentes los residuos de cisteína, prolina, histidina e hidrófobos grandes. La disposición de algunas de las secuencias conservadas, incluyendo un triplete de Cys-Gly-His y dos motivos de Cys-Pro-X-Cys, recuerda a la estructura de la subfamilia de RING-finger de tipo C3HC4 de los dominios de dedo de zinc, que median en interacciones proteína-proteína y proteína-ADN en un grupo diverso de proteínas, incluyendo supresores tumorales, protooncogenes, y moléculas de señalización que incluyen las TRAF, incluyendo los ejemplos específicos de polipéptidos que contienen dominios de RING-finger similares la proteína 1 de RING-finger humana (hRING1, GenBank NP_002922); proteína de RING-finger de pollo (C-RZF, GenBank 1589724); protooncogen humano CBL (hC-CBL, GenBank P22681); proteína de complejo de señalización TNFR2-TRAF murina (mc-IAP1, GenBank AAC42078); proteína de interacción con TRAF humana (hTRIP, GenBank NP_005870); factor 3 asociado al receptor de TNF humano (hTRAF3, GenBank NP_003291); factor 2 asociado al receptor de TNF humano (hTRAF2, GenBank NP_066961); y proteína neuralizada de Drosophila (neu, GenBank S35371). Los dominios similares a RING-finger de Pellino comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos: desde el aminoácido 333 hasta el aminoácido 398 de SEQ ID NOs 2 y 4; aminoácidos desde 335 hasta 400 en SEQ ID NO: 8 y la región correspondiente de SEQ ID NO: 6; y aminoácidos desde 360 hasta 425 en SEQ ID NO: 12. Hay residuos de cisteína conservados dentro de los dominios similares a RING-finger del polipéptido Pellino, localizados en las posiciones 333, 336, 367, 371, 395, y 398 de SEQ ID NOs 2 y 4 (y en las posiciones 335, 338, 369, 373, 397, y 400 de SEQ ID NO: 8 y las posiciones correspondientes en SEQ ID NO: 6, y en las posiciones 360, 363, 394, 398, 422, y 425 de SEQ ID NO: 12). En los polipéptidos Pellino los residuos de cisteína e histidina conservados están más ampliamente separados de lo que sería normal para un dominio de RING-finger clásico en el que las secuencias intermedias forman los bucles similares a dedo. La primera cisteína tras la histidina conservada del dominio de RING-finger canónico no está en Pellino, pero se observa que hay una histidina casi invariante en la posición 362 de SEQ ID NOs 2 y 4 (y en la posición 364 de SEQ ID NO: 8 y la posición correspondiente en SEQ ID NO: 6, y en las posiciones 389 de SEQ ID NO: 12) que podrían estar disponibles para la coordinación a un ión metálico. Un segundo triplete de Cys-Gly-His invariante en los residuos 311-313 de SEQ ID NOs 2 y 4 (y en los aminoácidos desde 313 hasta 315 de SEQ ID NO: 8 y los residuos correspondientes en SEQ ID NO: 6, y en los aminoácidos desde 338 hasta 340 de SEQ ID NO: 12) extiende la semejanza del dedo de zinc más hacia el extremo N-terminal. Por lo tanto, la región C-terminal de los polipéptidos Pellino parece contener un tipo novedoso del dominio de tipo dedo de zinc.

También se ha identificado similitud de regiones de aminoácidos entre los polipéptidos Pellino y un gen del virus de la viruela de insecto, entomopoxvirus de Melanoplus sanguinipes (MsEPV) ORF244, que se cree que desempeña un papel en sortear las defensas inmunitarias del huésped bloqueando las interacciones proteicas defensivas del huésped (Rich et al., 2000, Immunogenetics 52: 145-149).

Se prevé que es más probable que las sustituciones de aminoácidos y otras alteraciones (deleciones, inserciones, etc.) a las secuencias de aminoácidos de Pellino (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, y SEQ ID NO: 12) alteren o perturben las actividades de los polipéptidos Pellino si dan como resultado cambios en los residuos en mayúsculas de las secuencias de aminoácidos tal como se muestra en la tabla 1, y particularmente si esos cambios no sustituyen a un residuo presente en otros polipéptidos Pellino en esa posición de la alineación mostrada en la tabla 1. A la inversa, si se hace un cambio en la secuencia de aminoácidos Pellino que da como resultado la sustitución de uno o más residuo(s) de la secuencia consenso de la tabla 1 por el(los) residuo(s) Pellino en esas posiciones, es menos probable que una alteración de este tipo afecte a la función del polipéptido Pellino. Las realizaciones de la invención incluyen a los polipéptidos Pellino y los fragmentos de polipéptidos Pellino que comprenden secuencias de aminoácidos alteradas. Las secuencias alteradas de polipéptidos Pellino comparten al menos el 30%, o más preferiblemente al menos el 40%, o más preferiblemente al menos el 50%, o más preferiblemente al menos el 55%, o más preferiblemente al menos el 60%, o más preferiblemente al menos el 65%, o más preferiblemente al menos el 70%, o más preferiblemente al menos el 75%, o más preferiblemente al menos el 80%, o más preferiblemente al menos el 85%, o más preferiblemente al menos el 90%, o más preferiblemente al menos el 95%, o más preferiblemente al menos el 97,5%, o más preferiblemente al menos el 99%, o más preferiblemente al menos el 99,5% de identidad de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos Pellino de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 12.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Comparación de secuencias de aminoácidos entre polipéptidos Pellino de especies diferentes

1

2

Se comparan las secuencias codificantes de Pellino-1, 2 y 3 con secuencias preliminares de ADN genómico humano que están disponibles públicamente y se identificaron los siguientes cóntigos de cromosomas 2, 14 y 11 como las que contienen las secuencias codificantes de Pellino-1, 2 y 3, respectivamente: AC013466.3 (Pellino-1), AL138995.4 y AL355073.4 (Pellino-2), y AC027270.3 (Pellino-3). En la tabla de a continuación, se muestran las posiciones aproximadas de los exones que contienen las secuencias codificantes de Pellino-1, 2, y 3 en los cóntigos anteriores, junto con sus localizaciones con respecto a SEQ ID NOs 3, 7, y 11; obsérvese que las regiones no traducidas en 5' y 3' pueden extenderse adicionalmente a lo largo de la secuencia de cóntigo más allá de aquellas porciones que corresponden a SEQ ID NOs 3, 7, y 11, tal como se indica por los paréntesis alrededor de los puntos finales de los cóntigos en la tabla. Obsérvese también que las posiciones de los límites de exón están muy altamente conservados en las secuencias codificantes de Pellino-1, 2, y 3 humanos, con las diferencias en el tamaño del exón que se producen principalmente en el exón 1, teniendo Pellino-2 dos codones adicionales en el exón 1 con respecto a Pellino-1, y teniendo Pellino-2 27 codones adicionales en el exón 1 con respecto a Pellino-1. Debido a la secuencia preliminar y el ensamblaje de la secuencia de cóntigo, los exones en el cóntigo no siempre están en el orden u orientación correctos entre sí y pueden contener variaciones de secuencias debido a datos de secuencias inexactas o polimorfismo alélico. Por ejemplo, la el cóntigo genómico AC013466.3 tiene dos copias de la secuencia de exón 2 de Pellino-1 presente en orientaciones opuestas entre sí, tal como se indica en la tabla a continuación.

Posiciones correspondientes de exones de genes de Pellino-1, 2, y 3 en cóntigos humanos y en secuencias de ADNc:

	Posición de los exones de Pellino-1 en AC013466.3	Posición en SEQ ID NO: 3
Exón 1	(32275)-32205	1-71
Exón 2	28794-28666; 74461-74589	72-201
Exón 3	78789-78890	202-303
Exón 4	82682-82879	304-501
Exón 5	82979-83167	502-690
Exón 6	84024-(84590)	691-1257

	Posición de los exones de Pellino-2 en AL138995.4	Posición en SEQ ID NO: 7
Exón 1	(81889)-81965	1-77
Exón 2	141562-141691	78-207
	Posición de los exones de Pellino-2 en AL355073.4	Posición en SEQ ID NO: 7
Exón 3	81379-81480	208-309
Exón 4	90140-90337	310-507
Exón 5	91971-92159	508-696
Exón 6	98303-(98869)	697-1263

	Posición de los exones de Pellino-2 en AC027270.3	Posición en SEQ ID NO: 11
Exón 1	(16496)-16646	1-152
Exón 2	19608-19737	153-282

Las secuencias genómicas que comprenden exones de Pellino-1 humano se mapean en la región 2pl3.3 del cromosoma humano 2. Los ácidos nucleicos de Pellino humano tales como SEQ ID NO: 3 y fragmentos de los mismos son útiles para la identificación citológica de esta región cromosómica y para el mapeo genómico de trastornos genéticos humanos tales como los siguientes trastornos que se han mapeado en esta región: gen 1 de la preeclampsia/eclampsia, síndrome de Alstrom, gen 3 de la enfermedad de Parkinson, gen 2 de la hendidura orofacial y miopatía distal de Welander. Las secuencias genómicas que comprenden exones de Pellino-2 humano se mapean en la región 14q24.3 del cromosoma humano 14. Los ácidos nucleicos de Pellino humano tales como SEQ ID NO: 7 y fragmentos de los mismos son útiles para la identificación citológica de esta región cromosómica y para el mapeo genómico de trastornos genéticos humanos tales como los siguientes trastornos que se han mapeado en esta región: gen 1 de la acromatopsia, corea benigna hereditaria, bocio multinodular, miopatía (distal), tirosinemia Tipo 1By gen 3 de la enfermedad de Alzheimer. Las secuencias genómicas que comprenden exones de Pellino-3 humano se mapean en una región del cromosoma humano 11 entre 11p11.1 y 11q13, y se cree que se mapean de manera más próxima a la región 11q12.1. Los ácidos nucleicos de Pellino humano tales como SEQ ID NO: 3 y fragmentos de los mismos son útiles para la identificación citológica de esta región cromosómica y para el mapeo genómico de trastornos genéticos humanos tales como los siguientes trastornos que se han mapeado en esta región: síndrome de osteoporosis-pseudoglioma y gen 5 de la ataxia espinocerebelosa. Dado que un informe reciente (Schmitt-John et al., 2000,"Mouse Homologue of the Drosophila pellino Gene, Plil on Chr 11 is Affected in the Wobbler Mutant", Abstract B12 colgado en atimgs.org/abstracts/2000abstracts/toc_b.html) sugiere que Pellino-1 murino puede ser la proteína afectada en el mutante Wobbler, y que muestra degeneración de motoneuronas espinales, es interesante que los tres genes de Pellino humano se mapean en loci genéticos humanos que implican defectos neuromusculares: miopatía distal de Welander; miopatía (distal) y gen 5 de la ataxia espinocerebelosa (que implica el fallo de la coordinación muscular y/o irregularidad de la acción muscular), lo que sugiere que estos defectos genéticos humanos pueden implicar defectos en la actividad del polipéptido Pellino humano.

Ejemplo 2 Ensayos de genes indicadores de actividad de polipéptido Pellino

Se fusionó el ADN de la secuencia codificante de Pellino-1 murino, en el marco en el extremo 3' al ADN que codifica para el epítopo FLAG, seguido por un codón de terminación en el marco. Esta construcción se clonó en el vector de la expresión de mamíferos pDC304 (idéntico a pDC302, descrito en la patente de los EE.UU número 5.599.905, concedida el 4 de febrero de 1997, excepto porque se ha eliminado la región temprana de corte y empalme que consiste en los sitios del donante y aceptor de corte y empalme del elemento viral SV40; y se ha transfectado en una línea sensible a IL-1 de células COS-7 mediante el método DEAE-dextrano.

Para someter a ensayo el efecto del polipéptido Pellino-1-FLAG y otras formas de polipéptidos Pellino sobre la actividad de genes indicadores, puede utilizarse un método esencialmente descrito en Born et al.,1998, J. Biol. Chem. 273:29445-29450. Como un ejemplo de este método se transfectaron transitoriamente células Cos7 mediante el método DEAE-dextrano tal como se ha descrito (Cosman et al., 1984, Nature 312: 768-771), utilizando 150 ng del constructo de expresión del polipéptido Pellino y 700 ng del plásmido indicador por cada 45.000 células. A los dos días tras la transfección, se estimularon las células con IL-1 10 ng/ml o IL-18 40 ng/ml, (PeproTech, Inc.) durante 4 horas. Se lisaron las células y se evaluó la actividad luciferasa utilizando tampón de lisis de indicador y reactivo de ensayo de luciferasa (Promega Corp.). Se pueden utilizar los constructos del indicador del promotor de IL-8 y del indicador dependiente de NF-kB como plásmidos indicadores. Alternativamente, puede someterse a ensayo el efecto de la expresión de polipéptidos Pellino en células COS-1. En un método preferido alternativo, se hicieron crecer células COS7 en placas de 12 pocillos tal como se has descrito anteriormente. Se transfectaron transitoriamente las células con plásmido de prueba de Pellino, 50 ng de ADN de plásmido indicador y un vector vacío, según se requiera, a un total de 1 microgramo de ADN total por pocillo. Tras 24 horas, se añadieron agentes estimulantes en una cantidad pequeña (inferior al 0,5% del volumen final) de medio o dimetilsulfóxido, y se volvieron a incubar las células durante 5 horas. Se lisaron las células en tampón de lisis de indicador de luciferasa (Promega, Madison WI., 0,25 ml por pocillo) y se midió la actividad luciferasa en un luminómetro EG&G/Berthold después de la adición de reactivo de ensayo de luciferasa (Promega) según las instrucciones del proveedor. Todos los resultados se normalizaron al contenido total de proteínas de los lisados tal como se midieron utilizando el ensayo micro-BCA (Pierce, Rockford, IL).

En un experimento preliminar, se encontró que la expresión de Pellino-1-FLAG murino de esta manera inhibe parcialmente la actividad del gen indicador dependiente de NFkB inducido por IL-1. Este efecto inhibidor de Pellino-l-FLAG puede haberse debido a la sobreexpresión del polipéptido Pellino, ya que se ha demostrado que la transfección de células COS con altas concentraciones de un constructo que expresa Pellino-1 o Pellino-2 tiene un efecto inhibidor sobre la actividad del gen indicador dependiente de NFkB, posiblemente mediante la formación de homodímeros o multímeros superiores de polipéptidos Pellino que podrían tener efectos inhibidores, a diferencia de los efectos estimuladores de las concentraciones moderadas de monómeros de polipéptidos Pellino. Otras posibilidades para el efecto inhibidor de una preparación de Pellino-1-FLAG sobre la actividad del gen indicador dependiente de NFkB son la presencia de formas mutadas del polipéptido tal como se describió anteriormente, o la presencia o ausencia relativas de un factor que todavía debe caracterizarse en una línea celular particular.

Sin embargo, en experimentos posteriores con un constructo murino de Pellino-1-FLAG que se confirmó que comprendía una secuencia de aminoácidos de Pellino-1 de tipo natural, el polipéptido Pellino-1-FLAG de tipo natural tuvo un efecto estimulador sobre la actividad del gen indicador dependiente de NFkB inducida por IL-1 (véase la tabla 2, más adelante); Pellino-1-FLAG de tipo natural también aumentó moderadamente la cinasa N-terminal de Jun, la cinasa p38 y la señalización de ERK mediada por IL-1. Cuando se expresa en células COS-1, el polipéptido Pellino-1 de tipo natural estimula la actividad del gen promotor-indicador de la IL-8 y la actividad del gen indicador dependiente de NFkB tanto en presencia como en ausencia de tratamiento con TNF-alfa, en comparación con un control con el vector únicamente. En experimentos similares, la transfección de células COS con cantidades moderadas de constructo que
expresa el polipéptido Pellino-2 de tipo natural también estimula la actividad del gen indicador dependiente de NFkB.

Para definir las regiones de Pellino que determinan su respuesta a mediadores proinflamatorios, se construyeron varios vectores de expresión de Pellino mutantes. El Mr aparente de FLAG-Pellino-1 en geles de SDS-PAGE está próximo al valor de 47.224 dalton calculados a partir de la secuencia primaria, lo que indica una falta de amplia modificación postraduccional. Por tanto, es posible predecir el punto aproximado en la secuencia primaria de Pellino-1 en la que debe producirse la escisión con el fin de generar un producto N-terminal de 30 kDa. El residuo más próximo a este punto teórico es Phe-158; la escisión del enlace peptídico que precede a este residuo daría como resultado un polipéptido con una masa de 30.044 dalton. Por tanto, esta región del polipéptido Pellino-1 se escogió para mutación, puesto que podría esperarse que algunos de los mutantes resultantes fueran resistentes a la escisión, o en cualquier caso que se alteraran en su respuesta a los estímulos proinflamatorios. La escisión de Pellino es sensible al inhibidor de quimiotripsina, TPCK, y la quimiotripsina necesita un residuo aromático grande en un lado de su sitio de escisión. Con el razonamiento de que la enzima que escinde Pellino podría compartir los mismos determinantes de especificidad, se escogieron para mutar cuatro de los aminoácidos aromáticos que se encuentran invariablemente en esta región en los polipéptidos Pellino de mamífero. Se escogieron los dos mutantes de deleción interna para flanquear el sitio de escisión previsto, y también para incluir residuos altamente conservados. Además, se construyeron una serie de mutantes de truncado, residuos de deleción de los extremos amino y carboxilo-terminal, y mutantes que carecen de los residuos de cisteína conservados en el dominio de tipo RING-finger, tal como sigue. Para obtener una serie de deleciones en el extremo N-terminal, se sintetizaron cebadores de oligonucleótido cortos de la hebra sentido, en los que una secuencia que contenía un sitio de restricción KpnI y un codón de metionina se fusionó con las secuencias Pellino-1 murinas, comenzando con los codones para Gly-51, Phe-100, Asp-181 y Val-231. Éstos se utilizaron con un cebador antisentido adaptado para FLAG-BglII para amplificar fragmentos de PCR del ADN molde de Pellino-1-FLAG murino. Estos fragmentos se volvieron a clonar en el vector pDC304 para generar, respectivamente, los constructos que codifican para los mutantes dN50-FLAG, dN99-FLAG, dN180-FLAG y dN230-FLAG. Se utilizó una estrategia similar para construir una serie de mutantes truncados progresivamente en el extremo C-terminal; se sintetizaron oligonucleótidos antisentido que terminan con los codones para Thr-150, Thr-250 y Glu-350 en tándem con una secuencia que contenía un codón de terminación y un sitio de restricción BgIII. Se utilizaron estos cebadores para generar fragmentos de PCR que posteriormente se clonaron en pDC304 y se refirieron como que codifican para los mutantes 1-150, 1-250, y 1-350, respectivamente. Los constructos que codifican para las sustituciones de aminoácido único F137L-FLAG, Y154A-FLAG, F158A-FLAG y F165L-FLAG se construyeron utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, LaJolla, CA). Para construir los mutantes de deleción interna, d133-156-FLAG y dl55-158-FLAG, se obtuvieron, en cada caso, un par de fragmentos de PCR que contenían un sitio de restricción introducido para flanquear la secuencia que va a delecionarse. Tras la digestión de restricción y la purificación de pares de fragmentos de PCR, se ligaron en tres vías en el vector pDC304. También se construyó un vector en el que se situaron cuatro aminoácidos del dominio de tipo RING-finger desde Cys-333 hasta Cys-336, mediante la secuencia de dos aminoácidos Gly-Ser; este mutante se denomina C333-C336GS-FLAG.

A diferencia del efecto de Pellino-1 de tipo natural, las formas mutantes de los polipéptidos Pellino-1 con los aminoácidos 133-156 o los aminoácidos 155-158 de la SEQ ID NO: 2 delecionados, o con 50 o 99 aminoácidos de la región N-terminal del polipéptido delecionados, o con sustituciones en el dominio de tipo RING-finger que eliminan los residuos de cisteína, inhibieron la actividad del gen promotor - indicador de la IL-8 tanto en presencia como en ausencia de tratamiento con TNF-alfa, y la forma mutante de Pellino-1 con los aminoácidos 155-158 delecionados inhibieron la actividad del indicador dependiente de NF-kB tanto en presencia como en ausencia de tratamiento con PMA, en comparación con un control con el vector únicamente. La estimulación de la actividad de esos genes indicadores es coherente con un efecto estimulador sobre una cascada reguladora proinflamatoria, mientras que la inhibición de la actividad de esos genes indicadores es coherente con un efecto inhibidor sobre una cascada reguladora proinflamatoria. Un resumen de estos efectos de las formas de tipo natural y mutante de Pellino-1 murino sobre la actividad del gen indicador dependiente de NFkB se resume en la tabla 2; todas las posiciones de los aminoácidos son en referencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Los resultados "Soluble o Insoluble" y "¿Escindido?" se describen en los ejemplos 3 y 4 más adelante.

A partir de la tabla siguiente puede observarse que al delecionar parte de la región N-terminal del polipéptido Pellino-1 (es decir, al delecionar 50 o 99 aminoácidos del extremo N-terminal) se generan mutantes que tienen actividad inhibidora sobre las rutas de señalización activadas por MAP cinasa (tal como se demuestra, por ejemplo, mediante la inhibición de la transcripción dependiente de NF-kB), pero la deleción de partes más sustanciales (es decir, 180 o 230 aminoácidos del extremo N-terminal) anula la capacidad de Pellino-1 para estimular o inhibir la actividad del gen indicador. Por tanto, debe ser posible obtener mutantes de deleción en el extremo N-terminal adicionales de polipéptidos Pellino que tengan actividad inhibidora sobre la transcripción dependiente de NF-kB, por ejemplo, un mutante en el que estén delecionados los aminoácidos del extremo N-terminal que corresponden a los 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 o 175 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 2, pero que todavía conserve su actividad inhibidora. Alternativamente, pueden delecionarse otros residuos dentro de los aminoácidos del extremo N-terminal de los polipéptidos Pellino correspondientes a los 180 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 2 con el fin de generar formas mutantes de polipéptidos Pellino que tienen actividad inhibidora sobre la transcripción dependiente de NF-kB. De manera similar, los mutantes en los que las deleciones (de uno a 50 aminoácidos y, más preferiblemente, de uno a 30 aminoácidos) se realizan dentro del dominio conservado central y el dominio de tipo RING-finger también puede mostrar una actividad inhibidora sobre la transcripción dependiente de NF-kB. Todos estos mutantes pueden someterse a prueba fácilmente para determinar su actividad utilizando los ensayos del gen indicador descritos en el presente documento.

TABLA 2

Forma de Pellino-1	Descripción	Soluble o	¿Escindido?	Efecto sobre el
		insoluble		gen indicador
FLAG de tipo natural	Pellino-1 inalterado	Soluble	+	Estimulador
d133-156-FLAG	Aminoácidos 133-156 delecionados	Insoluble	+	Inhibidor
d155-158-FLAG	Aminoácidos 155-158 delecionados	Insoluble	+	Inhibidor
dN50-FLAG	50 aminoácidos del extremo N-terminal	Insoluble	+	Inhibidor
	delecionados
dN99-FLAG	99 aminoácidos del extremo N-terminal	Insoluble	+	Inhibidor
	delecionados
dN180-FLAG	180 aminoácidos del extremo N-terminal	Insoluble	n/a	Inactivo
	delecionados
dN230-FLAG	230 aminoácidos del extremo N-terminal	Insoluble	n/a	Inactivo
	delecionados
1-250	Sólo presentes los aminoácidos 1-250	Insoluble	+	Inactivo
1-350	Sólo presentes los aminoácidos 1-350	Soluble	+	Inactivo
F137L-FLAG	Sustitución de Phe por Leu en el residuo	Soluble	+	No probado
	137
Y154A-FLAG	Sustitución de Tyr por Ala en el residuo	Soluble	+/-	Estimulador
	154
F158A-FLAG	Sustitución de Phe por Ala en el residuo	Soluble	+	Ligeramente
	158			estimulador
F165L-FLAG	Sustitución de Phe por Leu en el residuo	Soluble	-	Estimulador
	165
C333-C336GS-FLAG	Reemplazo de Cys-333 a Cys 336 por	No probado	No probado	Inhibidor
	Gly-Ser

En experimentos similares utilizando células COS transfectadas con un constructo indicador que incluye CHOP, un promotor dependiente de p38, la forma mutante d155-158-FLAG de Pellino-1 inhibió la estimulación de TNF-alfa de la actividad del gen indicador de CHOP. Este resultado es significativo porque demuestra que la formas mutantes de los polipéptidos Pellino pueden inhibir múltiples rutas de señalización proinflamatorias activadas por MAP cinasa, tal como se indica por su inhibición tanto de la transcripción dependiente de NF-kB como de la transcripción dependiente de p38. Dado que las formas de tipo natural de los polipéptidos Pellino tienen efectos estimuladores sobre los componentes clave de las cuatro rutas de señalización principales activadas por MAP cinasa (la estimulación de la cinasa N-terminal de Jun, la cinasa p38 y la señalización de ERK, y la estimulación de la transcripción dependiente de NF-kB), se espera que las formas mutantes "dominantes negativas" de los polipéptidos Pellino inhiban las rutas de señalización activadas por la MAP cinasa ERK y la cinasa de Jun de una forma similar a la inhibición de las rutas de señalización activadas por la MAP cinasa NF-kB y p38.

Ejemplo 3 Localización intracelular de polipéptidos Pellino

Este ejemplo describe un método para monitorizar la regulación por IL-1 (u otra citocina o molécula) de la localización intracelular de Pellino-1 en las células. Las células COS-7 (que expresan un receptor de IL-1 endógeno) se transfectan con un vector de expresión que comprende FLAG-Pellino-1 tal como se describe en el ejemplo 2. Las células también pueden transfectarse al mismo tiempo con otros ADNc que codifican para proteínas que median la señalización inflamatoria, tal como la cinasa asociada al receptor de IL-1 (IRAK; GenBank NP001560). Las células transfectadas se cultivan durante aproximadamente 48 horas. Se añade IL-1 (20 ng/ml), u otra citocina o molécula a una concentración apropiada, al medio de cultivo durante los últimos 15 minutos (estimulación a corto plazo) o 24 horas (estimulación prolongada) de este periodo de cultivo.

Los cultivos celulares se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y se prepararon los lisados celulares raspando las células hacia un tampón de lisis (un tampón que contiene Tris-cloruro 50 mM, pH 8,0 complementado con Nonidet al 1% (NP-40), desoxicolato de sodio al 5%, ortovanadato de sodio 0,1 mM, fosfato de para-nitrofenol 30 mM, beta-glicerofosfato 30 mM, NaCl 140 mM, ditiotreitol 5 mM, EDTA 2 mM, leupeptina 10 mM, pepstatina A 10 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM; productos químicos adquiridos de Sigma, St. Louis, MO). La solubilización de las proteínas celulares puede facilitarse mediante el pase de los lisados varias veces a través de agujas hipodérmicas de calibre 25. El lisado se centrifuga a 13.000 x G a 4ºC. El sobrenadante en esta fase se denomina "fracción soluble". El sedimento restante se solubiliza en tampón de muestra 1X SDS-PAGE (Laemmli et al., Nature 227: 680; 1970); este material se denomina la "fracción insoluble".

En un procedimiento alternativo preferido para obtener las fracciones soluble e insoluble que comprenden los polipéptidos Pellino, se mantuvieron células COS7 (de riñón de mono) en medio Eagle modificado por Dulbecco que contenía un 5% de suero bovino fetal y estaba complementado con 100 unidades/ml de penicilina y 100 microgramos/ml de estreptomicina a 35ºC en CO_{2} al 5%. Los plásmidos que codifican para Pellino-FLAG, u otro plásmido de expresión, se transfectaron transitoriamente en células COS7 confluentes en placas de cultivo tisular de 6 pocillos (Costar) utilizando DEAE-dextrano. En varios momentos tras la transfección, las células se rasparon hacia 0,4 ml de tampón de lisis/extracción que consistía en Tris-HCl 50 mM, pH 7, NP-40 al 1%, NaCl 0,15 M, EGTA 2 mM, NaF 5 microM, \beta-glicerofosfato 30 mM, ortovanato de sodio 1 mM, ditiotreitol 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM, leupeptina 10 microgramos/ml y pepstatina A 10 microgramos/ml. Se permitió que las suspensiones celulares lisaran en hielo durante 15 minutos y se centrifugaron (13000 rpm durante 10 minutos a 4 grados C) en una microcentrífuga. Los sobrenadantes se llevaron cuidadosamente a tubos frescos y se diluyeron con un volumen de una tercera parte de tampón de muestra SDS-PAGE concentrado 4x que contenía 2-mercaptoetanol. Las muestras de sobrenadante (fracción "soluble en detergente") se llevaron a ebullición durante 5 minutos. Los sedimentos se volvieron a extraer resuspendiéndolos en la mitad del volumen original del tampón de muestra SDS-PAGE concentrado 1x, se agitaron en vórtex y después se llevaron a ebullición.

Pueden analizarse entonces alícuotas correspondientes de la fracción soluble y la fracción insoluble mediante electroforesis en gel sobre geles de SDS-poliacrilamida con gradiente del 4-20% (Novex, Invitrogen Corp., Carlsbad CA), y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sometieron a ensayo mediante inmunotransferencia Western utilizando anticuerpos anti-FLAG (es decir, FLAG M2) para unirse a los productos proteicos de los ADNc transfectados. Las proteínas se visualizan por incubación de los Western blots con IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (BioRad, San Diego, CA) seguido por detección utilizando el sistema ECL (Amersham; Arlington Heights,IL).

Ejemplo 4 Efecto de la estimulación celular sobre la localización y la escisión del polipéptido Pellino

Este ejemplo describe el efecto de la estimulación de células COS-7 transfectadas con un vector de expresión que codifica con FLAG-Pellino-1 con IL-1 u otras moléculas. Las células transfectadas se preparan sustancialmente tal como se describió anteriormente. En algunos casos, las células se cotransfectan con un vector pDC304 que contiene un inserto de ADNc que codifica para IRAK humano con 3'FLAG en tándem y una "cola" de poli-His. En otros casos, las células se cotransfectan con un vector de expresión FLAG-poli His-IRAK humano catalíticamente inactivo en el que el residuo de lisina 293 en el bolsillo de unión a ATP de IRAK se sustituye por una alanina. Dado que Pellino de Drosophila se identificó por su capacidad para asociarse con Pelle, se han llevado a cabo experimentos en los que Pellino se coexpresa con IRAK para determinar si Pellino de mamífero interacciona con IRAK, el supuesto homólogo en mamíferos de Pelle.

Los análisis indicaron que en ausencia de IRAK activa sobreexpresada, FLAG-Pellino-1 está en gran parte presente en la fracción soluble como un polipéptido próximo al tamaño previsto de 46 kDa. Cuando IRAK se sobreexpresa, FLAG-Pellino-1 se encuentra en gran parte en la fracción insoluble, y una parte significativa de Pellino en la fracción insoluble apareció en los Western blots como una especie de 30 kDa. Puesto que fueron reactivas con el anticuerpo anti-Flag, las especies de 30 kDa consisten presumiblemente en un fragmento del extremo amino-terminal. En algunos experimentos, en los que se utilizaron cantidades mayores de ADNc en el plásmido de expresión, se detectó un producto de escisión adicional en el extremo N-terminal de Pellino de 17 kDa. La forma insoluble de 30 kDa de Pellino-1 presente en las células transfectadas con IRAK de tipo natural migraron de manera ligeramente más lenta que la de las células cotransfectadas con IRAK activa por cinasa, lo que podría indicar que el fragmento de Pellino-1 de 30-kDa estaba fosforilado de manera diferente, o quizá modificado de alguna otra forma. De manera similar, hubo un cambio general en la movilidad de IRAK de tipo natural evidente en las células que se cotransfectaron con Pellino-1, coherente con un modelo en el que tanto Pellino como IRAK activa por cinasa participaron en la regulación del estado de otras modificaciones postraduccionales (modificaciones tales como fosforilación, ubiquitinilación, miristoilación, farnesilación y geranilgeranilación), aunque IRAK inactiva por cinasa nunca puede efectuar modificaciones en Pellino-1 ni resultar afectada de esta forma por Pellino-1. Por el contrario, la escisión de Pellino-1 y la reubicación en la fracción insoluble no requieren la actividad cinasa de IRAK.

Para determinar si la redistribución observada y el procesamiento proteolítico de Pellino-1 requerían específicamente a IRAK, se estimularon células transfectadas con Pellino-1 con agentes que activan NF-kB mediante rutas independientes de IRAK, tales como miristato-acetato de folbol (PMA, 100 ng/ml), que se sabe que estimula muchas de las mismas señales intracelulares que IL-1, y TNF-alfa (20 ng/ml). TNF-alfa activa NF-kB mediante un mecanismo que incluye la proteína adaptadora TRADD, la cinasa RIP y TRAF2, mientras que PMA estimula la actividad de la proteína cinasa C que se sabe interfiere con la ruta de NF-kB. Ambos agentes produjeron un aumento dependiente del tiempo en la redistribución de Pellino-1 en la fracción insoluble, en la que la mayor parte estaba presente como el producto de escisión de 30 kDa. En ambos casos, se requirieron de 2 a 3 horas de exposición al estímulo antes de que se observara una escisión significativa de Pellino. La cantidad total de polipéptido Pellino-1 detectable (la suma de las fracciones soluble e insoluble) estaba aumentada en presencia de PMA o TNF-alfa, lo que presumiblemente refleja un cambio en las tasas netas de síntesis y/o degradación de Pellino-1. Sin embargo, la incubación con diversos factores de crecimiento (factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento transformante beta, o factor de crecimiento derivado de plaquetas) tuvo poco o ningún efecto sobre Pellino-1; sólo el factor de crecimiento epidérmico fue muy débilmente activo. Se ha notificado que EGF en algunas células activa NF-kB mediante la inducción de la degradación de IkB-alfa. Estos resultados concuerdan con que la escisión y la redistribución de Pellino-1 se produzcan específicamente en respuesta a estímulos que activan NF-kB, incluyendo los que se producen con los mecanismos de señalización que no incluyen IRAK. Experimentos de transcurso de tiempo demostraron que la escisión y la reubicación de Pellino-1 comenzó aproximadamente dos horas tras la inducción con PMA, y aproximadamente tres horas tras la inducción con TNF-alfa, mientras que la activación de NF-kB mediada por TNF-alfa es máxima en las células COS7 tras 15 minutos, lo que sugiere que es más probable que la escisión y los cambios en la solubilidad de Pellino-1 formen parte de los efectos celulares de la activación de NF-kB que están causalmente implicados en el proceso de activación, y lo que indica que la escisión y la reubicación de Pellino-1 podrían depender de la síntesis de proteínas de novo. Esta observación estuvo apoyada por experimentos en los que el pretratamiento de células transfectadas por FLAG-Pellino-1 con el inhibidor de la síntesis de proteínas, ciclohexi-
mida, inhibió en gran parte la capacidad de PMA para inducir posteriormente la escisión y reubicación de Pellino-1.

En un esfuerzo para determinar qué proteasa podría estar implicada en la regulación de la escisión de Pellino-1, se trataron células COS7 transfectadas con un constructo que expresa Pellino-1 con PMA junto con inhibidores de diferentes clases de proteinasas, tal como se muestra en la tabla 3 a continuación.

TABLA 3 Efectos de varios inhibidores de proteasa sobre la escisión y reubicación de Pellino-1

Inhibidor	Enzima inhibida	Efecto
Lactacistina (20 microM)	proteasoma 20S	Ninguno
MG132 (10 microM)	proteasoma 26S	Ninguno
Z-VAD-FMK (20 microM)	Caspasas 1, 3, 4, 7	Ninguno
Z-DEVD-FMK (20 microM)	Caspasas 3, 6, 7, 8, 10	Ninguno
ALLN (20 microM)	Calpaínas 1 y 2, catepsinas B y L,	Ninguno
	cisteína proteasas neutras
Cicloheximida (40 microM)	Síntesis de proteínas	Inhibición
TPCK (20 microM)	Serina proteasas (quimiotripsinas)	Inhibición

Estos resultados indican que un miembro de la familia de la serina proteasa similar a quimiotripsina estaba implicado en la escisión y reubicación de Pellino-1. Esto está en contraste con otras rutas conocidas de señalización de IL-1 y/o TNF-alfa, que se demostró que participaban en la activación de la caspasa (por ejemplo, apoptosis inducida por TNF; Rath et al., J. Clin. Immunol. 19: 350, 1990), o la proteasoma (por ejemplo, degradación de IkB inducida por IL-1; Karin et al., Semin. Immunol. 2000. 12: 85, 2000). La lenta cinética del procesamiento de Pellino-1 concordaría con una necesidad de síntesis de proteínas de novo; en concordancia con esto, el tratamiento de células COS7 con el inhibidor de la síntesis de proteínas, cicloheximida, evitó completamente su escisión inducida por PMA. Por tanto, es posible que PMA induzca la síntesis de una proteinasa que escinde Pellino, o la síntesis de algún factor accesorio para una proteinasa que se expresa constitutivamente. Estos resultados tienen importantes implicaciones adicionales para el mecanismo implicado en el procesamiento del polipéptido Pellino. MG-132 (26) y ALLN (27, 28), mediante su capacidad para evitar la degradación mediada por proteasoma de IkB, son ambos potentes inhibidores de la activación de NF-kB. De esto se deduce que el procesamiento de Pellino, que es insensible a MG132 y ALLN, no puede depender de los acontecimientos celulares posteriores a la degradación de IkB. Aunque también está bien establecido que TPCK es un inhibidor de la degradación de IkB, el hecho de que otros inhibidores de proteasoma no bloqueen la escisión de Pellino-1, tal como se trató anteriormente, excluye a éste como el mecanismo subyacente para la eficacia de TPCK.

Para que se genere un fragmento de Pellino-1 de 30 kDa, podría preverse que la escisión proteolítica se produciría dentro de la región de aminoácidos del 132 al 189 de SEQ ID NO: 2. El examen de la secuencia de aminoácidos de Pellino-1 muestra que está extremadamente bien conservada en aquellas especies para las que se disponen los datos de la secuencia EST (Pellino-1 y Pellino-2 murinos y humanos, descritos anteriormente en el presente documento; Pellino de Drosophila, número de registro de GenBank AF091624; y el producto génico F25B4.2 de Caenorhabditis elegans, número de registro de GenBank U64842). Varios residuos conservados de fenilalanina y tirosina están presentes en esta región, cualquiera de los cuales podría servir como sitio de reconocimiento para una serina proteasa similar a quimiotripsina.

Ejemplo 5 Polipéptidos de fusión GST-Pellino

Este ejemplo describe la construcción y la expresión de una proteína de fusión recombinante glutatión S-transferasa (GST)-Pellino-1. Se sintetizaron cebadores de PCR que tenían las secuencias ATATTCACTGAATTCTGATGTTTTC
TCCTGATCAA (Cebador 1; SEQ ID NO: 9) y AGTGAATATGAATTCCTACTTATCATCGTCATCTTTG (Cebador 2; SEQ ID NO: 10), para los cebadores sentido y antisentido, respectivamente. Estos se diseñaron para su uso con un molde de Pellino-1-FLAG y se añadió un sitio de EcoRI a cada extremo del producto amplificado. Este producto de PCR se ligó en el sitio de clonación único de EcoRI del vector pGEX2T (descrito en el documento EP 0293249-A) de modo que las secuencias codificantes del gen de la glutatión S-transferasa y FLAG-Pellino-1 estaban en el mismo marco. Se transformó la cepa DH10B de E coli con el vector resultante y se hizo crecer un cultivo de un litro. La transcripción del gen de GST-Pellino-1-FLAG se indujo mediante la adición de IPTG (0,1 mM) al cultivo bacteriano durante tres horas. Las células bacterianas se cultivaron y se lisaron según métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Smith D. B., Johnson K. S.; Gene 67: 31-40 (1988)). El lisado que contenía GST-Pellino-1-FLAG solubilizado se purificó en 1 ml de perlas de Glutatión-Agarosa (Pharmacia), según las indicaciones suministradas por el fabricante.

Ejemplo 6 Anticuerpos monoclonales anti-Pellino

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales frente a polipéptidos Pellino. Se emplean preparaciones de Polipéptidos Pellino recombinantes purificados, por ejemplo, o células transfectadas que expresan altos niveles de polipéptidos Pellino, para generar anticuerpos monoclonales frente a polipéptidos Pellino utilizando técnicas convencionales, tales como las descritas en la patente de los EE.UU. número 4.411.993. También puede utilizarse ADN que codifica para polipéptidos Pellino como un inmunógeno, por ejemplo, tal como revisaron Pardoll y Beckerleg en Immunity 3: 165, 1995. Es probable que tales anticuerpos sean útiles como componentes de ensayos diagnósticos o de investigación para determinar Pellino o actividad Pellino, o en la purificación por afinidad de los polipéptidos Pellino.

Para inmunizar roedores, el inmunógeno Pellino (por ejemplo, un péptido Pellino-1 que comprende los aminoácidos del 2 al 20, los aminoácidos del 118 al 131, o los aminoácidos del 318 al 340 de las secuencias SEQ ID NO: 2 y 4), preferiblemente acoplado a una molécula inmunogénica tal como la hemocianina de lapa californiana, se emulsiona en un adyuvante (tal como el adyuvante completo o incompleto de Freund, alumbre, u otro adyuvante, tal como el adyuvante de Ribi R700 (Ribi, Hamilton, MT), y se inyectó en cantidades que oscilaron desde 10-100 microgramos por vía subcutánea en un roedor seleccionado, por ejemplo, ratones BALB/c o ratas Lewis. El ADN puede administrarse por vía intradérmica (Raz et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA: 91: 9519, 1994) o por vía intramuscular (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4156, 1993); se encontró que la solución salina era un diluyente adecuado para los antígenos basados en ADN. De diez días a tres semanas después, se administra una dosis de refuerzo a los animales inmunizados con inmunógeno adicional y después se administra una dosis de refuerzo periódicamente con un programa de inmunización de una vez a la semana, cada dos semanas o cada tres semanas.

Periódicamente se toman muestras de suero mediante sangrado retroorbital o escisión en la punta de la cola para realizar pruebas mediante un ensayo dot-blot (intercalación de anticuerpos), ELISA (ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas), inmunoprecipitación u otros ensayos adecuados, incluyendo análisis de FACS. Tras la detección de un título de anticuerpos apropiado, a los animales positivos se les administra una inyección intravenosa de antígeno en solución salina. De tres a cuatro días después, los animales se sacrificaron, los esplenocitos se recogieron y se unieron a una línea celular de mieloma murino (por ejemplo, NS1 o preferiblemente Ag 8.653 [ATCC CRL1580]). Las líneas celulares de hibridoma generadas por este procedimiento se siembran en placa en múltiples placas de microtítulo en un medio selectivo (por ejemplo, uno que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina, o HAT) para inhibir la proliferación de las células no unidas, híbridos mieloma-mieloma, e híbridos esplenocito-esplenocito.

Los clones de hibridoma así generados pueden seleccionarse por ELISA para determinar su reactividad con los polipéptidos Pellino, por ejemplo, mediante adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall et al., Immunochem. 8: 871 (1971) y en la patente de los EE.UU. número 4.703.004. Una técnica de selección preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckman et al., J. Immunol. 144: 4212 (1990). Entonces se inyectan los clones positivos en las cavidades peritoneales de roedores singénicos para producir ascitis que contienen altas concentraciones (> 1 mg/ml) de anticuerpo monoclonal anti-Pellino. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse mediante precipitación por sulfato de amonio seguido por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también puede utilizarse cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o a la proteína G, al igual que la cromatografía de afinidad basada en la unión a polipéptido Pellino.

Ejemplo 7 Análisis de Northern Blot de la expresión de Pellino-1

Se generó un fragmento de PCR de 234 pb correspondiente al extremo 3' previsto del ARNm de Pellino-1 humano mediante métodos de amplificación convencionales. El fragmento de PCR se purificó (kit de purificación de PCR Qiagen) y se marcó mediante el kit Random Prime Oligonucleotide DNA Labeling de Gibco. La ribosonda de ADNc se desnaturalizó a 100 grados C durante 5 minutos y se colocó en hielo. La sonda de ADNc se desnaturalizó a 100 grados C durante 5 minutos antes de añadirse a la solución de hibridación. Un Northern blot de múltiples tejidos que contenía ARN de tejidos humanos (cerebro, corazón, músculo esquelético, colon (no mucosa), timo, bazo, riñón, hígado, intestino delgado, placenta, pulmón y leucocitos de sangre periférica) se adquirió de Clonetech (Palo Alto, CA). La inmunotransferencia se bloqueó en 5 ml de solución ExpressHyb durante 30 minutos a 68 grados C. Se añadió solución ExpressHyb reciente que contenía la sonda de ADNc radiomarcada desnaturalizada a la membrana y se incubó a 68 grados C durante 1 hora con agitación continua. La inmunotransferencia se enjuagó en 2X SSC, SDS al 0,05% con cuatro cambios a temperatura ambiente durante 40 minutos, seguido por un lavado en 0,1 X SSC, SDS al 0,1% con dos cambios durante 40 minutos a 50 grados C. La ribosonda para Pellino-1 hibridó con el Northern blot con una banda principal en 4,4 kilobases en todos los tejidos representados, con un aumento en el nivel de expresión evidente en los leucocitos en sangre periférica, pulmón, placenta, hígado, riñón, músculo esquelético y cerebro. El mensaje parece estar más altamente expresado en los leucocitos en sangre periférica, y en este tejido parece haber dos bandas adicionales a 7,5 y 9,5 kb que no aparecen en los carriles para otros tejidos. Se prevé que el ADNc para Pellino-1 humano incluya 1251 pares de bases en la región codificante y 1931 pares de bases en la región no traducida en 3' y todavía no se ha identificado evidencia para corte y empalme alternativo.

La memoria descriptiva se entiende más completamente a la luz de las enseñanzas de la bibliografía citada dentro de la memoria descriptiva. Las realizaciones dentro de la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de las realizaciones de la invención y no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención. El experto en la técnica reconoce fácilmente que la invención engloba muchas otras realizaciones.

Secuencias presentadas en la lista de secuencias

SEQ ID NO	Tipo de secuencia	Descripción
SEQ ID NO: 1	Nucleótidos	Secuencia codificante de Pellino-1 murino (Mus musculus)
SEQ ID NO: 2	Aminoácidos	Secuencia de aminoácidos de Pellino-1 murino (Mus musculus)
SEQ ID NO: 3	Nucleótidos	Secuencia codificante de Pellino-1 humano (Homo sapiens)
SEQ ID NO: 4	Aminoácidos	Secuencia de aminoácidos de Pellino-1 humano (Homo sapiens)
SEQ ID NO: 5	Nucleótidos	Secuencia codificante de Pellino-2 murino (Mus musculus)
SEQ ID NO: 6	Aminoácidos	Secuencia de aminoácidos de Pellino-2 murino (Mus musculus)
SEQ ID NO: 7	Nucleótidos	Secuencia codificante de Pellino-2 humano (Homo sapiens)
SEQ ID NO: 8	Aminoácidos	Secuencia de aminoácidos de Pellino-2 humano (Homo sapiens)
SEQ ID NO: 9	Nucleótidos	Cebador de PCR
SEQ ID NO: 10	Nucleótidos	Cebador de PCR
SEQ ID NO: 11	Nucleótidos	Secuencia codificante de Pellino-3 humano (Homo sapiens)
SEQ ID NO: 12	Aminoácidos	Secuencia de aminoácidos de Pellino-3 humano (Homo sapiens)
SEQ ID NO: 13	Aminoácidos	Pellino (GenBank AAC96298) de la mosca de la fruta (Drosophila
		melanogaster)
SEQ ID NO: 14	Aminoácidos	Pellino (GenBank BAB00628) de ascidia (Ciona intestinales)
SEQ ID NO: 15	Aminoácidos	Pellino (GenBank CAB97346) de nematodo (Caenorhabditis elegans)

<110> Immunex Corporation

\hskip1cm

Bird, Timothy A.

\hskip1cm

Cosman, David J.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Polipéptidos Pellino humanos

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 2990-A

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 418

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 418

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1263

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atattcactg aattctgatg ttttctcctg atcaa

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgaatatg aattcctact tatcatcgtc atctttg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1338

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> No seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (513)...(513)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> No seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 424

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 455

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ciona intestinalis

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 458

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Caenorhabditis elegans

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

Claims

1. Polipéptido aislado que puede inhibir la transcripción dependiente de NF-kB o dependiente de p38, comprendiendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, y SEQ ID NO: 12, en la que los aminoácidos del 1 al x1 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquiera de los aminoácidos del 50 al 98 de dicha secuencia;

(b) SEQ ID NO: 4, en la que los aminoácidos x1 a x2 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 99 hasta el 178 y x2 es cualquier aminoácido desde el 100 hasta el 179;

(c) SEQ ID NO: 8, en la que los aminoácidos x1 a x2 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 1 hasta el 180 y x2 es cualquier aminoácido desde el 2 hasta el 181;

(d) SEQ ID NO: 12, en la que los aminoácidos x1 a x2 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 1 hasta el 206 y x2 es cualquier aminoácido desde el 2 hasta el 207;

(e) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, y SEQ ID NO: 12, en la que uno o más residuos de cisteína del dominio de tipo RING-finger se han delecionado o sustituido por residuos distintos a cisteína;

(f) una variante alélica de (a)-(e);

(g) fragmentos de secuencias de aminoácidos de cualquiera de (a)-(d) y (f) que comprenden secuencias de aminoácidos del dominio de tipo RING-finger; y

(h) un fragmento de las secuencias de aminoácidos de cualquiera de (a)-(g), en el que un polipéptido que consiste en dicho fragmento puede inhibir la transcripción dependiente de NF-kB.

2. Polipéptido aislado según la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) SEQ ID NO: 4, en la que los aminoácidos x1 a x2 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 99 hasta el 157 y x2 es cualquier aminoácido desde el 100 hasta el 158;

(b) SEQ ID NO: 8, en la que los aminoácidos x1 a x2 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 1 hasta el 159 y x2 es cualquier aminoácido desde el 2 hasta el 160;

(c) SEQ ID NO: 12, en la que los aminoácidos x1 a x2 se han delecionado de dicha secuencia, y en la que x1 es cualquier aminoácido desde el 1 hasta el 184 y x2 es cualquier aminoácido desde el 2 hasta el 185.

3. Ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido según las reivindicaciones 1 o 2.

4. Ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de una variante alélica del ácido nucleico según la reivindicación 3.

5. Vector de expresión que comprende al menos un ácido nucleico según la reivindicación 3.

6. Célula huésped recombinante que comprende al menos un ácido nucleico recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 3.

7. Célula huésped recombinante según la reivindicación 6, en la que el ácido nucleico recombinante está integrado en el genoma de la célula huésped.

8. Procedimiento para producir un polipéptido codificado por el ácido nucleico según la reivindicación 3, que comprende poner en cultivo una célula huésped recombinante en condiciones que estimulan la expresión de dicho polipéptido, en el que la célula huésped recombinante comprende al menos un ácido nucleico recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 3.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, que comprende además purificar dicho polipéptido.

10. Polipéptido producido mediante el procedimiento según la reivindicación 8.

11. Método in vitro para inhibir la transcripción dependiente de NF-kB que comprende proporcionar al menos un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 10.

12. Método in vitro para inhibir la señalización de la p38 cinasa mediada por IL-1, comprendiendo el método proporcionar al menos un antagonista de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 8; y

(b) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: los aminoácidos x1 a x2 de la SEQ ID NO:4, en la que x1 es cualquiera de los aminoácidos del 1 al 10 de la SEQ ID NO:4, y x2 es cualquiera de los aminoácidos del 409 al 418 de la SEQ ID NO:4; y los aminoácidos x1 a x2 de la SEQ ID NO: 8, en la que x1 es cualquiera de los aminoácidos del 1 al 10 de la SEQ ID NO: 8, y x2 es cualquiera de los aminoácidos del 410 al 419 de la SEQ ID NO: 8,

en el que el antagonista es el anticuerpo que inhibe la actividad de dicho polipéptido.

13. Método para identificar los compuestos que inhiben o antagonizan la estimulación de la señalización de p38 cinasa mediada por IL-1 por los polipéptidos Pellino, comprendiendo el método mezclar un compuesto de prueba con una célula que expresa un polipéptido; y determinar si el compuesto de prueba altera la estimulación de la señalización de p38 cinasa mediada por IL-1 mediante dicho polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO: 8; y

(b) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: los aminoácidos x1 a x2 de la SEQ ID NO:4, en la que x1 es cualquiera de los aminoácidos del 1 al 10 de la SEQ ID NO:4, y x2 es cualquiera de los aminoácidos del 409 al 418 de la SEQ ID NO:4; y los aminoácidos x1 a x2 de la SEQ ID NO: 8, en la que x1 es cualquiera de los aminoácidos del 1 al 10 de la SEQ ID NO: 8, y x2 es cualquiera de los aminoácidos del 410 al 419 de la SEQ ID NO: 8.

14. Método para identificar compuestos que alteran la capacidad de los polipéptidos Pellino mutantes para inhibir la transcripción dependiente de NF-kB o la transcripción dependiente de p38, comprendiendo el método

(a) mezclar un compuesto de prueba con una célula que expresa el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 10; y

(b) determinar si el compuesto de prueba altera la capacidad de dicho polipéptido para inhibir la transcripción dependiente de NF-kB o la transcripción dependiente de p38.

15. Método según la reivindicación 14, que comprende además tratar a la célula con una molécula seleccionada del grupo que consiste en interleucina-1 (IL-1); TNF-alfa, IL-18 y 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA), peptidoglucano, lipopéptidos bacterianos, lipopolisacáridos bacterianos, zimosan, ADN CpG, flagelina, ácidos lipoteicoicos y proteínas del virus sincitial respiratorio.

16. Método según la reivindicación 14, en el que determinar si el compuesto de prueba altera dicha capacidad de dicho polipéptido comprende determinar el nivel de translocación de NF-kB al núcleo de la célula.

17. Método según la reivindicación 14, en el que determinar si el compuesto de prueba altera dicha capacidad de dicho polipéptido comprende determinar el nivel de transcripción dependiente de NF-kB.

18. Método según la reivindicación 14, en el que determinar si el compuesto de prueba altera dicha capacidad de dicho polipéptido comprende determinar el nivel de transcripción dependiente de p38.

19. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 10 para su uso como un medicamento.

20. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 10 en la preparación de un medicamento para tratar un estado inflamatorio.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que el estado inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, aterosclerosis y enfermedad de Alzheimer.