ES2301167T3 - Genes que codifican polipeptidos de la clase de los factores de reguladores de interferones especificos de linfocitos (lsirf). - Google Patents

Abstract

SE DESCUBREN SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN UN NUEVO POLIPEPTIDO DENOMINADO LSIRF. SE DESCUBREN ASIMISMO METODOS PARA PREPARAR EL POLIPEPTIDO Y USOS DEL MISMO.

Description

Genes que codifican polipéptidos de la clase de los factores de reguladores de interferones específicos de linfocitos (LSIRF).

Esta solicitud es una continuación en parte del documento U.S.S.N. 08/422.733, presentado el 14 de Abril de 1995.

Antecedentes Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevos polipéptidos que tienen actividad de fijación de DNA, y a moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos. Los polipéptidos, a los que se ha hecho referencia anteriormente como polipéptidos "IRF-3", se designan actualmente como polipéptidos "LSIRF" (factor regulador de interferón específico de linfocitos), y son miembros nuevos de la clase de polipéptidos conocidos como factores reguladores de interferones.

Descripción de la técnica afín

La regulación de la expresión génica puede ocurrir a varios niveles diferentes, pero la activación de los factores de transcripción específicos de genes se considera como la más fundamental para este proceso. Una familia de factores de transcripción, los factores reguladores de interferones (IRFs), está constituida por cuatro miembros: IRF-1, IRF-2, ISGF3\gamma e ICSBP. Los cuatro IRFs se caracterizan por un dominio de fijación de ADN N-terminal y firmemente conservado que contiene un motivo triptófano repetido (Veals et al., (Vol. Cell Biol., 12: 3315-3324
[1992]).

Los factores reguladores de interferones-1 (IRF-1) y -2 (IRF-2) fueron identificados originalmente por estudios de la regulación de la transcripción del gen de interferón beta humano (IFN-\beta) (Miyamoto et al., Cell, 54: 903-913 [1988]) y (Harada et al., Cell, 58: 729-739 [1989]). Los estudios de expresión de cADN han demostrado que IRF-1 funciona como un activador de la transcripción de IFN y genes inducibles por IFN, mientras que IRF-2 reprime el efecto de IRF-1 (Fujita et al., Nature, 337: 270-272 [1989]) y (Harada et al., Cell, 63: 303-312 [1990]). Análisis recientes han demostrado que IRF-1 puede actuar también como gen supresor de tumores e IRF-2 como un posible oncogén (Harada et al, Science, 259: 971-974 [1993]). La expresión de IRF-1 es inducida por los IFNs tipo-I (\alpha/\beta) y tipo-II (\gamma) (Miyamoto et al., Cell, 54: 903-913 [1988]; Kanno et al., Mol. Cell Biol., 13: 3951-3963 [1993]), mientras que IRF-2 es a la vez expresado constitutivamente e inducido por los IFNs tipo-I (Harada et al, Cell, 58: 729-739 [1989]).

El factor-3 gamma del gen estimulado por interferón (ISGF3\gamma) es una proteína inducible por IFN-\gamma que está asociada con subunidades ISGF3\alpha activadas a partir de una forma citosólica latente por los IFNs tipo-I (Levy et al, EMBO J., 9: 1105-1111 [1990]; Levy et al., New Biologist, 2: 383-392 [1990]). Después de la asociación, se ha demostrado que este complejo sufre translocación al núcleo y fija una secuencia específica de ADN encontrada en la región promotora de los genes inducibles por IFN, conocida como el ISRE (elemento de respuesta estimulado por IFN; Veals et al., Mol. Cell Biol., 12: 3315-3324 [1992]). Recientemente, han sido clonadas subunidades ISGF3\alpha de 91/84 kDa y 113 kDa (Schindler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7836-7839 [1992]; Fu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7840-7843 [1992]) y designadas como transductor de señales y activador de transcripción-1 (Stat-1) y -2 (Stat-2), respectivamente, que son dianas de la fosforilación de la quinasa JAK después del acoplamiento IFN tipo-I/receptor de IFN (Shuai et al, Science, 261: 1744-1746 [1993]; Darnell et al., Science, 261: 1415-1421
[1994]).

La proteína de fijación de la secuencia de consenso de interferón (ICSBP) es también una proteína inducible por IFN-\gamma, aislada originalmente como una proteína que reconoce el motivo ISRE (denominado también ICS) del promotor del gen H-2L^{D} del MHC clase I murino (Driggers et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3743-3747 [1990]). Sin embargo, al contrario que IRF-1, IRF-2 e ISGF3\gamma, ICSBP exhibe un patrón de expresión en tejidos restringido, dado que es inducido exclusivamente en células de linajes macrófagos y linfoides (Driggers et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3743-3747 [1990]). Estudios recientes han sugerido que ICSBP tiene un papel similar a IRF-2 en la antagonización del efecto de IRF-1 sobre la inducción de IFN y genes inducibles por IFN (Weisz et al., J. Biol. Chem., 267: 25589-2596 [1992]; Nelson et al., Mol. Cell Biol., 13: 588-599 [1993]). Los ISREs de los genes inducibles por interferón se superponen a IRF-E, las secuencias de ADN reconocidas por IRF-1 y -2 (Tanaka et al., Mol. Cell Biol., 13: 4531-4538 [1993]). En fecha muy reciente, se ha demostrado que ISGF3\gamma se fija al IRF-Es del gen IFN-\beta (Kawakami et al., FEBS Letters, 358: 225-229 [1995]).

Teniendo en cuenta la importancia de los IRFs en la regulación de la expresión de los genes de interferón y otros genes, existe necesidad en la técnica de identificar otros IRFs, especialmente IRFs específicos de tejidos.

De acuerdo con ello, es objeto de esta invención identificar nuevos miembros de la familia de genes IRF.

Otros objetos serán fácilmente evidentes para una persona con experiencia ordinaria en la técnica.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona nuevas moléculas de ácido nucleico que codifican un factor regulador de los interferones específico de linfocitos. Las moléculas, a las que se hacía referencia anteriormente como moléculas "IRF-3" se designan actualmente como moléculas "LSIRF", aunque este término puede utilizarse intercambiablemente con el término moléculas "LSIRF".

En un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido LSIRF o fragmento del mismo, seleccionado del grupo constituido por:

a) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ. ID. NO: 1;

b) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ. ID. NO: 4;

c) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 2;

o un fragmento de las mismas.

La invención proporciona adicionalmente un polipéptido que es el producto de la expresión de estas moléculas de ácido nucleico en una célula hospedadora.

Todavía adicionalmente, la invención proporciona un anticuerpo que se fija específicamente al polipéptido LSIRF. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o fragmento del mismo que tiene la actividad de fijación de ADN específica de un polipéptido LSIRF.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una molécula de ADN que codifica un polipéptido LSIRF.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona una célula hospedadora transformada o transfectada establemente con un vector que comprende una molécula de ADN que codifica un polipéptido LSIRF.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido LSIRF aislado o fragmento del mismo; pudiendo tener el polipéptido la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 2.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido LSIRF que es el producto de la expresión de una célula hospedadora procariota o eucariota de una secuencia de ácido nucleico LSIRF exógena.

La invención proporciona adicionalmente un método de producción de un polipéptido LSIRF que comprende cultivar una célula hospedadora procariota o eucariota en condiciones que permiten la expresión de LSIRF.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa una secuencia de ácido nucleico cADN de LSIRF de longitud total de ratón.

La Figura 2 representa una secuencia de aminoácidos del polipéptido LSIRF de longitud total de ratón.

La Figura 3 representa una secuencia flanqueante 5' del gen de LSIRF de ratón.

La Figura 4 representa una secuencia de ADN genómico de LSIRF de ratón.

La Figura 5 representa una transferencia Northern de RNA de diversos tejidos de un ratón. La transferencia se sondó con una sonda de LSIRF radiomarcada para identificar transcritos de LSIRF. Los marcadores de pares de bases de RNA indicativos del tamaño de los transcritos se indican a la izquierda. Se muestra también una foto de un RNA ribosómico indicativo en gel de agarosa.

La Figura 6 representa una transferencia Northern de RNA a partir de linfocitos de ratón tratados sin estimuladores (-), o con los estimuladores que se indican. La transferencia se sondó con una sonda de LSIRF radiomarcada para identificar aquellos estimuladores que inducen la transcripción de LSIRF. Se muestra también la misma transferencia, sondada con una sonda de beta-actina radiomarcada.

La Figura 7 representa una transferencia Northern de esplenocitos de ratón tratados sin estimulador alguno (-) o con uno o más estimuladores que se indican, y sondada luego con una sonda de LSIRF radiomarcada. Se muestra también la misma transferencia Northern sondada con una sonda de beta-actina radiomarcada.

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La Figura 8 representa una transferencia Northern de esplenocitos de ratón tratados sin estimulador alguno (-) o con un estimulador que se indica, y sondada luego con una sonda de LSIRF radiomarcada. Se demuestra también la misma transferencia Northern sondada con una sonda de beta-actina radiomarcada.

La Figura 9 representa un ensayo de fijación con desplazamiento de gel de la fijación de LSIRF del MHC ISRE. Extractos nucleares de células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus de control (pista 2) o de células Sf9 infectadas con baculovirus que contenían el gen de LSIRF (pistas 3-12) se incubaron a la vez con una sonda MHC ISRE de ratón radiomarcada y un fragmento de ADN competidor indicado (la secuencia de los fragmentos competidores se indica en la Tabla 1). Las pistas 1 y 13 contienen la sonda MHC ISRE radiomarcada sola.

La Figura 10 representa la secuencia de nucleótidos de longitud total de la región codificante de LSIRF humana en la forma "Simple Q". (SEQ. ID. NO: 24). La forma "Doble Q" tiene un codón adicional que codifica el aminoácido Q (Glu) insertado entre los codones para el aminoácido 163 y el aminoácido 164.

La Figura 11 representa la forma supuesta "Simple Q" de la secuencia de aminoácidos de LSIRF humana (SEQ. ID. NO: 25), tal como es traducida por la secuencia de nucleótidos de la Figura 10. La forma "Doble Q" tiene un amino-ácido adicional Q (Glu) insertado entre el aminoácido 163 y el aminoácido 164).

Descripción detallada de la invención

Los términos "IRF-3" y "LSIRF" se utilizan intercambiablemente en esta memoria y hacen referencia a las mismas secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos; tanto las formas "Simple Q" como "Doble Q" de LSIRF se incluyen en esta definición (véase el Ejemplo 5).

Como se utiliza en esta memoria, el término "biológicamente activo" se refiere a un polipéptido de longitud total o fragmento del mismo derivado de cualquier fuente, que fija fragmentos de ADN de tipo ISRE (elemento de respuesta estimulado por interferón) tales como NHCI ISRE murino, ISG54 humano, y/o mutantes de ISRE tales como ISREm1 o ISREm4 (cuyas secuencias se exponen en la Tabla 1). Polipéptidos biológicamente activos o fragmentos de los mismos incluyen también aquellos polipéptidos o fragmentos que tienen reactividad inmunológica cruzada con un anticuerpo (policlonal o monoclonal) que es generado contra, y reacciona con, un polipéptido LSIRF de longitud total tal como los polipéptidos LSIRF que se muestran en las Figuras 2 y 25 [sic].

Como se utiliza en esta memoria, el término "transformado o transfectado de manera estable" hace referencia a una molécula de ácido nucleico que ha sido insertada en una célula hospedadora y que existe en la célula hospedadora, sea como parte del ADN genómico de la célula hospedadora o como una molécula independiente (v.g., extra-cromosómicamente), y que se mantiene y replica en la célula hospedadora progenitora de tal modo que se hace pasar a través de generaciones sucesivas de la célula hospedadora.

El término "DNA sintético" hace referencia a una molécula de ácido nucleico producida totalmente o en parte por métodos de síntesis química.

El término "vector" hace referencia a un vehículo de amplificación, replicación, y/o expresión de la molécula de ácido nucleico en la forma de un plásmido o sistema de ADN viral en donde el plásmido o ADN viral puede ser funcional con células hospedadoras bacterianas, de levaduras, de invertebrados, y/o de mamífero. El vector puede mantenerse independiente del ADN genómico de la célula hospedadora o puede integrarse totalmente o en parte con el ADN genómico. El vector contendrá todos los elementos necesarios a fin de ser funcional en cualquier célula hospedadora con la que sea compatible. Tales elementos se indican más adelante.

Un aspecto de la presente invención proporciona métodos de preparación de un polipéptido LSIRF. Típicamente, el polipéptido se preparará por obtención de una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, e inserción de esta molécula de ácido nucleico en un vector de expresión adecuado, inserción del vector en una célula hospedadora compatible, expresión del polipéptido LSIRF en la célula hospedadora y purificación del polipéptido LSIRF.

1. Preparación de ADN codificante de polipéptidos LSIRF

Una molécula de ácido nucleico codificante de LSIRF puede obtenerse fácilmente de una diversidad de maneras, que incluyen, sin limitación, síntesis química, cribado de genotecas de cADN o genómicas, cribado de genotecas de expresión, y/o amplificación de cADN por PCR. Estos métodos y otros útiles para aislamiento de dicho ADN han sido expuestos, por ejemplo, por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY [1989]), por Ausubel et al., compiladores (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994]), y por Berger y Kimmel (Methods in Enzymology, Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA [1987]). Secuencias de ácido nucleico preferidas que codifican LSIRF son secuencias de mamífero. Secuencias de ácido nucleico muy preferidas que codifican LSIRF son humanas, de rata, y de ratón.

La síntesis química de una molécula de ácido nucleico LSIRF puede realizarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tales como los expuestos por Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734 [1989]). Estos métodos incluyen, inter alia, los métodos de síntesis de ácido nucleico de fosfotriéster, fosforamidito y H-fosfonato. Típicamente, la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido LSIRF de longitud total tendrá una longitud de varios centenares de pares de bases (pb) o nucleótidos. Los ácidos nucleicos de longitud mayor que aproximadamente 100 nucleótidos pueden sintetizarse como varios fragmentos, teniendo cada fragmento aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Los fragmentos pueden ligarse luego unos a otros, como se describe más adelante, para formar un ácido nucleico de longitud total que codifica el polipéptido LSIRF. Un método preferido es la síntesis soportada por polímeros utilizando química estándar de fosforamidito.

Alternativamente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido LSIRF puede obtenerse por cribado de una genoteca de cADN apropiada (es decir, una genoteca preparada a partir de una o más fuentes de tejidos que se cree expresan el polipéptido) o una genoteca genómica (una genoteca preparada a partir de ADN genómico total). La fuente de la genoteca cADN es típicamente un tejido de cualquier especie que se cree expresa el LSIRF en cantidades razonables (tal como tejido linfoide). La fuente de la genoteca genómica puede ser cualquier tejido o tejidos de cualquier mamífero u otra especie que se cree aloja un gen codificante de LSIRF o un homólogo de LSIRF. La genoteca puede cribar se respecto a la presencia del cADN/gen de LSIRF utilizando una o más sondas de ácido nucleico (oligonucléotidos, cADN o fragmentos de ADN genómico que poseen un nivel aceptable de homología con el cADN o gen de LSIRF u homólogo de LSIRF a clonar), que se hibridarán selectivamente con el o los cADNs o genes que está(n) presente(s) en la genoteca. Las sondas utilizadas típicamente para dicho cribado de genotecas codifican usualmente una pequeña región de la secuencia de ADN de LSIRF de la misma especie o de una especie similar a la especie a partir de la que se preparó la genoteca. Alternativamente, las sondas pueden estar degeneradas, como se expone más adelante.

El cribado de genotecas se realiza típicamente por reasociación de la sonda de oligonucléotidos o cADN a los clones en la genoteca en condiciones de severidad que impiden la fijación inespecífica pero permiten la fijación de aquellos clones que tienen un nivel importante de homología con la sonda o el cebador. Las condiciones típicas de hibridación y severidad de lavado dependen en parte del tamaño (es decir, el número de nucleótidos de longitud) del cADN o la sonda oligonucleotídica, y de si la sonda está degenerada. La probabilidad de obtención de uno o más clones se considera también en el diseño de la solución de hibridación (es decir, si se está cribando una genoteca de cADN o genómica; si se trata de una genoteca de cADN, la probabilidad de que el cADN de interés esté presente a un nivel elevado).

En los casos en que se utilizan como sondas fragmentos de ADN (tales como cADN), condiciones típicas de hibridación son por ejemplo las indicadas en Ausubel et al., compiladores, supra. Después de la hibridación, la transferencia que contiene la genoteca se lava a una severidad adecuada, dependiendo de varios factores tales como el tamaño de la sonda, la homología esperada de la sonda al clon, el tipo de genoteca que se esté cribando, el número de clones a cribar, y análogos. Ejemplos de soluciones de lavado severo (que tienen usualmente una baja fuerza iónica y se utilizan a temperaturas relativamente altas) son como sigue. Un lavado severo de este tipo es NaCl 0,015 M, citrato de sodio 0,005 M y SDS al 0,1% a 55-65ºC. Otro tampón severo de este tipo es Na_{2}EDTA 1 mM, NaHPO_{4} 40 mM, pH 7,2, y SDS al 1% a aproximadamente 40-50ºC. Otro lavado severo adicional es 0,2 X SSC y SDS al 0,1% a aproximadamente 50-65ºC.

En los casos en que se utilizan sondas oligonucleotídicas para cribar genotecas de cADN o genómicas, pueden utilizarse dos protocolos para condiciones de lavado severas como sigue, por ejemplo. El primer protocolo utiliza 6 X SSC con 0,05% de pirofosfato de sodio a una temperatura comprendida entre aproximadamente 35 y 62ºC, dependiendo de la longitud de la sonda. Por ejemplo, las sondas de 14 bases se lavan a 35-40ºC, las sondas de 17 bases a 45-50ºC, las sondas de 20 bases a 52-57ºC, y las sondas de 23 bases a 57-63ºC. La temperatura puede aumentarse 2-3ºC en los casos en que la fijación inespecífica de fondo resulta alta. Un segundo protocolo utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para lavado. Una solución de lavado severa de este tipo es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, y SDS al 0,2%. La temperatura de lavado utilizando esta solución es función de la longitud de la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 bases se lava a aproximadamente 45-50ºC.

Otro método adecuado para obtener un ácido nucleico codificante de un polipéptido LSIRF es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este método, se extrae ARN poli(A)+ o ARN total a partir de un tejido que expresa LSIRF (tal como tejido linfoide). Se prepara luego cADN a partir del ARN utilizando la enzima transcriptasa inversa. Se añaden luego dos cebadores típicamente complementarios a dos regiones separadas del cADN de LSIRF (oligonucleótidos) al cADN junto con una polimerasa tal como la polimerasa Taq, y la polimerasa amplifica la región de cADN entre los dos cebadores.

En los casos en que el método de elección para preparar el ácido nucleico que codifica el polipéptido LSIRF requiere el uso de cebadores o sondas de oligonucleótidos (v.g., PCR, cADN o cribado de genotecas genómicas), las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas o cebadores deberían tener una longitud adecuada y ser suficientemente inequívocas a fin de minimizar la cantidad de fijación inespecífica que se producirá durante el cribado de la genoteca o la amplificación por PCR. La secuencia real de las sondas o cebadores está basada usualmente en secuencias conservadas o sumamente homólogas o regiones del mismo gen o un gen similar procedente de otro organismo. Opcionalmente, las sondas o cebadores pueden estar total o parcialmente degeneradas, es decir, contener una mezcla de sondas/cebadores, todos los cuales codifican la misma secuencia de aminoácidos, pero que utilizan codones diferentes para hacerlo así. Una alternativa a la preparación de sondas degeneradas consiste en situar una inosina en algunas o la totalidad de aquellas posiciones de codón que varían por especies. Las sondas oligonucleotídicas o cebadores pueden prepararse por métodos de síntesis química para ADN como se ha descrito arriba.

Las secuencias mutantes o variantes de LSIRF se contemplan como comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Una secuencia mutante o variante tal como se utiliza en esta memoria es una secuencia que contiene una o más sustituciones, deleciones, y/o inserciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de tipo salvaje que dan como resultado variaciones en la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En algunos casos, pueden existir mutantes o variantes de aminoácidos LSIRF que aparecen naturalmente, debido a la existencia de variación alélica natural. Tales variantes existentes naturalmente están también comprendidas dentro del alcance de la presente invención. La preparación de secuencias mutantes sintéticas es bien conocida en la técnica, y se describe por ejemplo en Wells et al. (Gene, 34: 315 [1985]), y en Sambrook et al., supra.

2. Preparación de una secuencia flanqueante 5' de polipéptido LSIRF

Dentro del alcance de la presente descripción se incluyen secuencias flanqueantes LSIRF 5' (a las que se hace referencia también en esta memoria como "promotores") procedentes de cualquier especie. Por promotor, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende la secuencia flanqueante 5' de un gen de LSIRF. La secuencia flanqueante 5' puede tener diversos sitios de fijación de factores de transcripción, y puede poseer también una secuencia TATA aproximadamente en la posición -30, y una secuencia CCAAT aguas arriba de la secuencia TATA. Tales secuencias flanqueantes 5' se caracterizan como reguladores naturales de la transcripción de un gen de LSIRF in vivo, sea solas o en combinación con otros factores tales como elementos intensificadores, represores, y análogos (cualquiera o la totalidad de los cuales pueden estar localizados a gran distancia). Secuencias flanqueantes 5' preferidas son secuencias flanqueantes LSIRF 5' de mamífero. Son muy preferidas las secuencias flanqueantes LSIRF 5' humanas.

Las secuencias flanqueantes 5' pueden obtenerse a partir de genotecas genómicas por cribado de la genoteca con cADNs o fragmentos genómicos de LSIRF que se hibridan preferiblemente a la posición 5' del gen de LSIRF. Tales fragmentos pueden hibridarse a un clon en la genoteca que contiene algo o la totalidad de la secuencia flanqueante 5' de LSIRF, que está localizada por regla general exactamente en la posición 5' al comienzo de la secuencia codificante para LSIRF. En los casos en que el clon identificado contiene solamente una porción del promotor, el clon propiamente dicho, o un fragmento del mismo, puede utilizarse para tandas subsiguientes del cribado de genotecas genómicas a fin de obtener una secuencia flanqueante 5' adicional. El cribado con los fragmentos (con inclusión de hibridación y lavado) puede realizarse como se ha descrito arriba para clonación de un gen de LSIRF y/o cADN.

3. Preparación de un vector para expresión de LSIRF

Después de la clonación, el cADN o gen que codifica un polipéptido LSIRF o fragmento del mismo que ha sido aislado, se inserta típicamente en un vector de amplificación y/o de expresión a fin de aumentar el número de copias del gen y/o expresar el polipéptido en una célula hospedadora adecuada. El vector es a menudo un vector disponible comercialmente, aunque pueden utilizarse también vectores "fabricados por encargo". El vector se selecciona de modo que sea funcional en la célula hospedadora particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedadora de tal manera que pueda producirse amplificación del gen de LSIRF y/o expresión del gen). El polipéptido LSIRF o fragmento del mismo puede amplificarse/expresarse en células hospedadoras procariotas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/u hospedadores eucariotas. La selección de la célula hospedadora dependerá al menos en parte de si el polipéptido LSIRF o fragmento del mismo va a ser glicosilado. En caso afirmativo, son preferibles células hospedadoras de levadura, insecto o mamífero; las células de levadura glicosilarán el polipéptido, y las células de insecto y de mamífero pueden glicosilar y/o fosforilar el polipéptido como existe el mismo naturalmente en el polipéptido LSIRF (es decir, glicosilación y/o fosforilación "naturales").

Típicamente, los vectores utilizados en cualquiera de las células hospedadoras contendrán secuencias flanqueantes 5' y otros elementos reguladores tales como uno o más intensificadores, un elemento origen de replicación, un elemento de terminación de la transcripción, una secuencia de intrones completa que contiene un sitio de remodelación donante y aceptor, una secuencia de péptido señal, un elemento de sitio de fijación de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresar, y un elemento marcador seleccionable.

Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia "marcadora", es decir una secuencia oligonucleotídica localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia codificante de LSIRF que codifica poliHis (tal como hexaHis) u otra secuencia inmunógena pequeña. Este marcador se expresará junto con la proteína, y puede servir como un marcador de afinidad para purificación del polipéptido LSIRF respecto de la célula hospedadora. De manera opcional, el marcador puede retirarse subsiguientemente del polipéptido LISRF purificado por diversos medios tales como utilización de una peptidasa seleccionada, por ejemplo.

A. Elemento de la secuencia flanqueante 5'

La secuencia flanqueante 5' puede ser homóloga (es decir de la misma especie y/o cepa que la célula hospedadora), heteróloga (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula hospedadora), híbrida (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes p5' de más de una fuente), sintética, o puede ser la secuencia flanqueante 5' de LSIRF nativa. Como tal, la fuente de la secuencia flanqueante 5' puede ser cualquier organismo procariota o eucariota unicelular, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con tal que la secuencia flanqueante 5' sea funcional en, y pueda activarse por, la maquinaria de la célula hospedadora.

Las secuencias flanqueantes 5' útiles en los vectores de esta invención pueden obtenerse por cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes 5' útiles en esta invención distintas de la secuencia flanqueante LSIRF 5' se habrán identificado previamente por mapeado y/o por digestión con endonucleasas de restricción y pueden aislarse por tanto de la fuente de tejido apropiada utilizando las endonucleasas de restricción adecuadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos completa de la secuencia flanqueante 5' puede ser conocida. En este caso, la secuencia flanqueante 5' puede sintetizarse utilizando los métodos descritos anteriormente para síntesis o clonación de ácido nucleico.

En los casos en que se conocen la totalidad o solamente porciones de la secuencia flanqueante 5', la misma puede obtenerse utilizando PCR y/o por cribado de una genoteca genómica con fragmentos de secuencia oligonucleotídica y/o secuencias flanqueantes 5' de la misma u otra especie.

En los casos en que no se conoce la secuencia flanqueante 5', un fragmento de ADN que contiene la misma secuencia flanqueante 5' puede aislarse a partir de un fragmento mayor de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede realizarse por digestión con endonucleasas de restricción utilizando una o más enzimas seleccionadas cuidadosamente para aislar el fragmento de ADN apropiado. Después de la digestión, el fragmento deseado puede aislarse por purificación en gel de agarosa, columna Qiagen® u otros métodos conocidos por el técnico experto. La selección de enzimas adecuadas para realizar este propósito será fácilmente evidente para una persona con experiencia ordinaria en la técnica.

B. Origen del elemento de replicación

Este componente es típicamente parte de los vectores de expresión procariotas adquiridos comercialmente, y contribuye a la amplificación del vector en una célula hospedadora. La amplificación del vector hasta un cierto número de copias puede ser importante en algunos casos para la expresión óptima del polipéptido LSIRF. Si el vector de elección no contiene un sitio origen de replicación, el mismo puede sintetizarse químicamente basándose en una secuencia conocida, y ligarse al vector.

C. Elemento de terminación de la transcripción

Este elemento está localizado típicamente en posición 3' respecto al extremo de la secuencia codificante del polipéptido LSIRF y sirve para terminar la transcripción del polipéptido LSIRF. Usualmente, el elemento de terminación de la transcripción en las células procariotas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli-T. Si bien el elemento se clona fácilmente a partir de una genoteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, el mismo puede sintetizarse también fácilmente utilizando métodos para síntesis de ácido nucleico tales como los arriba descritos.

D. Elemento(s) marcador(es) seleccionable(s)

Los genes marcadores seleccionables codifican proteínas necesarias para la supervivencia y el crecimiento de una célula hospedadora cultivada en un medio de cultivo selectivo. Genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, v.g. ampicilina, tetraciclina, o kanamicina para células hospedadoras procariotas, (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos. Marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la tetraciclina.

E. Elemento de sitio de fijación de ribosoma

Este elemento, denominado comúnmente la secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o la secuencia Kozak (eucariotas), es necesario para la iniciación de la traducción del mARN. El elemento está localizado típicamente en posición 3' respecto al promotor y en posición 5' respecto a la secuencia codificante del polipéptido a sintetizar. La secuencia Shine-Dalgarno es variable, pero típicamente se trata de una polipurina (es decir, que tiene un contenido elevado de A-G). Han sido identificadas muchas secuencias Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede sintetizarse fácilmente utilizando los métodos expuestos con anterioridad.

La totalidad de los elementos arriba indicados, así como otros útiles en esta invención, son bien conocidos por el técnico experto y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]), y Berger et al., compiladores (Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA [1987]).

F. Elemento de secuencia de señal

Para aquellas realizaciones de la invención en las cuales el transgén debe secretarse, está presente frecuentemente una secuencia señal para dirigir el polipéptido codificado por el transgén fuera de la célula en la que se sintetiza el mismo. Típicamente, la secuencia señal está posicionada en la región codificante del transgén hacia o en el extremo 5' de la región codificante. Han sido identificadas muchas secuencias señal, y cualesquiera de ellas que sean funcionales en el tejido transgénico pueden ser utilizadas en asociación con el transgén. Por tanto, la secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga al transgén, y puede ser homóloga o heteróloga al mamífero transgénico. Además, la secuencia señal puede sintetizarse químicamente utilizando métodos expuestos anteriormente. Sin embargo, para los propósitos de esta invención, secuencias señal preferidas son aquéllas que existen naturalmente con el transgén (es decir, son homólogas al transgén).

G. Elemento intrón

En muchos casos, la transcripción del transgén se incrementa por la presencia de una o más intrones en el vector. El intrón puede existir naturalmente dentro de la secuencia del transgén, especialmente en los casos en que el transgén es una secuencia de longitud total o un fragmento de una secuencia de ADN genómico. Cuando el intrón no existe naturalmente en la secuencia de ADN (como sucede para la mayor parte de los cADNs), el o los intrones puede(n) obtenerse a partir de otra fuente. El intrón puede ser homólogo o heterólogo respecto al transgén y/o al mamífero transgénico. La posición del intrón con respecto al promotor y el transgén es importante, dado que el intrón tiene que transcribirse para ser eficaz. Como tal, cuando el transgén es una secuencia de cADN, la posición preferida para el intrón es 3' respecto al sitio de comienzo de la transcripción, y 5' con respecto a la secuencia de terminación de la transcripción poliA. Preferiblemente, en el caso de los transgenes de cADN, el intrón estará localizado en un lado o en el otro (es decir, 5' o 3') respecto a la secuencia del transgén de tal manera que el mismo no interrumpa la secuencia del transgén. Cualquier intrón procedente de cualquier fuente, con inclusión de cualesquiera organismos virales, procariotas y eucariotas (vegetales o animales), puede utilizarse para practicar esta invención, con tal que el mismo sea compatible con la o las células hospedadoras en la(s) que se inserta. Se incluyen también en esta memoria intrones sintéticos. Opcionalmente, puede utilizarse en el vector más de un
intrón.

H. Construcción de vectores

En los casos en que uno o más de los elementos expuestos anteriormente no están presentes ya en el vector a utilizar, los mismos pueden obtenerse individualmente y ligarse al vector. Métodos utilizados para obtención de cada uno de los elementos son bien conocidos por los técnicos expertos y son comparables a los métodos expuestos anteriormente (es decir, síntesis del ADN, cribado de la genoteca, etcétera).

Los vectores finales utilizados para la práctica de esta invención se construyen típicamente a partir de vectores iniciales tales como un vector disponible comercialmente. Este vector puede contener o no algunos de los elementos a incluir en el vector completado. Si ninguno de los elementos deseados está presente en el vector de partida, cada elemento puede ligarse individualmente al vector por corte del vector con corte del vector con la o las endonucleasas de restricción apropiada(s) de tal modo que los extremos del elemento a ligar en y los extremos del vector sean compatibles para ligación. En algunos casos, puede ser necesario hacer romos los extremos a ligar uno con otro a fin de obtener una ligación satisfactoria. Los extremos se hacen romos rellenando primeramente los "extremos cohesivos" con utilización de ADN-polimerasa Klenow o ADN-polimerasa T4 en presencia de los cuatro nucleótidos. Este procedimiento es bien conocido en la técnica y se describe por ejemplo en Sambrook et al., supra.

Alternativamente, dos o más de los elementos a insertar en el vector pueden ligarse primeramente uno a otro (si deben estar posicionados mutuamente adyacentes) y ligarse luego al vector.

Otro método adicional para construir el vector a fin de conducir todas las ligaciones de los diversos elementos simultáneamente en una sola mezcla de reacción [sic]. En este caso, se generarán muchos vectores sin sentido o no funcionales debido a ligación o inserción inadecuada de los elementos, no obstante lo cual el vector funcional puede identificarse y seleccionarse por digestión con endonucleasas de restricción.

Vectores preferidos para la práctica de esta invención son aquéllos que son compatibles con células hospedadoras bacterianas, de insecto, y de mamífero. Tales vectores incluyen, inter alia pCRII (Invitrogen Company, San diego, CA), pBSII (Stratagene Company, LaJolla, CA), y pETL (BlueBacII; Invitrogen).

Después que se ha construido el vector y se ha insertado un ácido nucleico de LSIRF en el sitio apropiado del vector, el vector completo puede insertarse en una célula hospedadora adecuada para amplificación y/o expresión del polipéptido LSIRF. Células hospedadoras utilizadas típicamente incluyen, sin limitación: células procariotas tales como células Gram-negativas o Gram-positivas, es decir, cualquier cepa de E. coli, Bacillus, Streptomyces, Sacharomyces, Salmonella, y análogas; células eucariotas tales como células CHO (de ovario de hámster chino), células 293 de riñón humano, células COS-7; células de insecto tales como Sf4, Sf5, Sf9, y Sf21 e High 5 (todas ellas de Invitrogen Company, San Diego, CA); y diversas células de levadura tales como Saccharomyces y Pichia.

La inserción (a la que se hace referencia también como "transformación" o "transfección") del vector en la célula hospedadora seleccionada puede realizarse utilizando métodos tales como cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o el método DEAE-dextrano. El método seleccionado será en parte función del tipo de célula hospedadora a utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por los técnicos expertos, y se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., supra.

Las células hospedadoras que contienen el vector (a saber, transformado o transfectado) pueden cultivarse utilizando medios estándar bien conocidos por el técnico experto. El medio contendrá usualmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células. Medios adecuados para cultivar células de E. coli son, por ejemplo, Caldo Luria (LB) y/o Caldo "Terrific" (TB). Medios adecuados para cultivo de células eucariotas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden estar complementados con suero y/o factores de crecimiento según sea requerido por la línea de células particular que se esté cultivando. Un medio adecuado para cultivos de insecto es medio de Grace complementado con Yeastolate, hidrolizado de lactoalbúmina, y/o suero de ternero fetal en caso necesario.

Típicamente, se añade como suplemento al medio únicamente un antibiótico u otro compuesto útil para cultivo selectivo de las células transformadas. El compuesto a utilizar vendrá dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual se transformó la célula hospedadora. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es la resistencia a la kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina.

4. Evaluación de la expresión

La cantidad de polipéptido LSIRF producida en la célula hospedadora puede evaluarse obteniendo métodos estándar conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, sin limitación, análisis por transferencia Western, electroforesis en gel SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC, inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad tales como ensayos de desplazamiento en gel con fijación de ADN.

5. Purificación del polipéptido LSIRF

Si el polipéptido LSIRF se ha diseñado para ser secretado por las células hospedadoras, la mayor parte del polipéptido se encontrará probablemente en el medio de cultivo de las células. Por el contrario, si el polipéptido LSIRF no es secretado por las células hospedadoras, el mismo estará presente en el citoplasma (para eucariotas, bacterias Gram-positivas y células hospedadoras de insecto) o en el periplasma (para células hospedadoras de bacterias Gram-negativas).

Para LSIRF intracelular, las células hospedadoras se disgregan en primer lugar por medios mecánicos u osmóticos a fin de liberar el contenido del citoplasma en una solución tamponada. El polipéptido LSIRF se aísla luego a partir de esta solución.

La purificación del polipéptido LSIRF a partir de la solución puede realizarse utilizando una diversidad de técnicas. Si el polipéptido se ha sintetizado de tal manera que el mismo contiene un marcador tal como Hexahistidina (LSIRF/hexaHis) u otro pequeño péptido en cualquiera de sus términos carboxilo o amino, el mismo puede purificarse esencialmente en un proceso de un solo paso haciendo pasar la solución a través de una columna de afinidad en la cual la matriz de la columna tiene una afinidad alta para el marcador o para el polipéptido directamente (es decir, un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente LSIRF). Por ejemplo, la polihistidina se fija con gran afinidad y especificidad al níquel, por lo que puede utilizarse una columna de afinidad de níquel (tal como las columnas de níquel Qiagen) para purificación de LSIRF/poliHis. (Véase, por ejemplo, Ausubel et al., compiladores., Current Protocols in Molecular Biology, sección 10.11.8, John Wiley & Sons, Nueva York [1993]).

Cuando el polipéptido LSIRF no tiene marcador alguno y no están disponibles anticuerpos, pueden utilizarse para la purificación otros procedimientos bien conocidos. Tales procedimientos incluyen, sin limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía con tamices moleculares, HPLC, electroforesis en gel nativo en combinación con elución del gel, y enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific). En algunos casos, pueden combinarse dos o más de estas técnicas para conseguir una pureza incrementada. Métodos preferidos para purificación incluyen marcación con polihistidina y cromatografía de intercambio iónico en combinación con enfoque isoeléctrico preparativo.

Si se prevé que el polipéptido LSIRF se encontrará fundamentalmente en el espacio periplásmico de la bacteria o el citoplasma de las células eucariotas, el contenido del periplasma o citoplasma, incluyendo los cuerpos de inclusión (bacterias) si el polipéptido procesado ha formado tales complejos, puede extraerse de la célula hospedadora utilizando cualquier método estándar conocido por el técnico experto. Por ejemplo, las células hospedadoras pueden lisarse para liberar el contenido del periplasma mediante prensa francesa, homogeneización, y/o tratamiento por ultrasonidos. El homogeneizado puede centrifugarse después.

Si el polipéptido LSIRF ha formado cuerpos de inclusión en el periplasma, los cuerpos de inclusión pueden fijarse a menudo a las membranas celulares interna y/o externa y por tanto se encontrarán fundamentalmente en el material del sedimento después de la centrifugación. El material del sedimento puede tratarse luego con un agente caotrópico tal como guanidina o urea para liberar, disgregar, y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido LSIRF en su forma, ahora soluble, puede analizarse luego utilizando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o medios análogos. Si se desea aislar el polipéptido LSIRF, el aislamiento puede realizarse utilizando métodos estándar tales como los expuestos más adelante y en Marston et al. (Meth. Enz., 182:264-275 [1990]).

Si no se forman cuerpos de inclusión del polipéptido LSIRF en un grado significativo en el periplasma de la célula hospedadora, el polipéptido LSIRF se encontrará fundamentalmente en el sobrenadante después de centrifugación del homogeneizado de células, y el polipéptido LSIRF puede aislarse del sobrenadante utilizando métodos tales como los expuestos más adelante.

En aquellas situaciones en las que es preferible aislar parcial o completamente el polipéptido LSIRF, la purificación puede realizarse utilizando métodos estándar bien conocidos por el profesional experto. Tales métodos incluyen, sin limitación, separación por electroforesis seguida por electroelución, diversos tipos de cromatografía (de inmunoafinidad, con tamices moleculares, y/o de cambio iónico), y/o cromatografía líquida a alta presión. En algunos casos, puede ser preferible utilizar más de uno de estos métodos para purificación completa.

El término "sustancia", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a compuestos múltiples en la inhibición de la transcripción del gen de LSIRF, la traducción del mRNA de LSIRF, o la actividad del polipéptido LSIRF.

El término "terapéuticamente eficaz" hace referencia a la cantidad de la sustancia que se requiere con objeto de obtener la respuesta fisiológica deseada, es decir, suprimir la activación de los linfocitos en respuesta a un estímulo antigénico o respuesta autoinmune, o aumentar el número de linfocitos para estimular la respuesta inmunitaria a un estímulo antigénico.

El término "estímulo antigénico" hace referencia a un compuesto que se encuentra naturalmente en un mamífero (endógeno) y provoca algún aspecto de la respuesta inmunitaria, o procede de una fuente exógena e invade el sistema del mamífero provocando algún o algunos aspectos de la respuesta inmunitaria.

Las composiciones útiles para la práctica de los métodos de la presente invención pueden prepararse de acuerdo con métodos estándar bien conocidos por quienes poseen una experiencia ordinaria en la técnica.

Anticuerpos terapéuticos Anti-LSIRF

Anticuerpos terapéuticos anti-LSIRF policlonales o monoclonales útiles en la práctica de esta invención pueden prepararse en animales de laboratorio o por técnicas de ADN recombinante utilizando los métodos que siguen. Anticuerpos policlonales para la molécula LSIRF o un fragmento de la misma que contiene la secuencia de aminoácidos diana se generan por regla general en animales por inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de la molécula LSIRF en combinación con un adyuvante tal como adyuvante de Freund (completo o incompleto). Para aumentar la inmunogenicidad, puede ser útil conjugar primeramente la molécula LSIRF o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana de [sic] a una proteína que es inmunógena en la especie a inmunizar, v.g. hemocianina de lapa bocallave, seroalbúmina, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación a través de restos cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), aldehído glutárico, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son grupos alquilo diferentes. Alternativamente, pueden producirse conjugados LSIRF-inmunógeno por medios recombinantes como proteínas de fusión.

Los animales se inmunizan contra los conjugados o derivados inmunógenos de LSIRF (tales como un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana) por combinación de aproximadamente 1 mg o aproximadamente 1 \mug del conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con aproximadamente 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund, e inyección intradérmica de la solución en sitios múltiples. Aproximadamente 7 a 14 días después, se sangran los animales y se ensaya el suero respecto a título anti-LSIRF. Los animales se refuerzan con antígeno repetidamente varias veces, hasta que el título alcanza una meseta. Preferiblemente, el animal se refuerza con la misma molécula de LSIRF o fragmento de ella que se utilizó para la inmunización inicial, pero se conjuga con una proteína diferente y/o con ayuda de un agente de centrifugación diferente. Adicionalmente, agentes de agregación tales como alumbre se utilizan en las inyecciones para mejorar la respuesta inmunitaria.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales por recuperación de células del bazo a partir de animales inmunizados e inmortalización de las células de manera convencional, v.g. por fusión con células de mieloma. Los clones se criban luego respecto a aquéllos que expresan el anticuerpo deseado. El anticuerpo monoclonal preferiblemente no reacciona de manera cruzada con otros polipéptidos LSIRF o isoformas del polipéptido LSIRF.

La preparación de anticuerpos utilizando métodos de ADN recombinante tales como el método de presentación de fagémido, puede realizarse utilizando kits disponibles comercialmente, como por ejemplo el Sistema Recombinante de Anticuerpos de Fagémido disponible de Pharmacia (Uppsala, Suecia), o el sistema de presentación de fago SurfZAP^{TM} (Stratagene y Inc. LaJolla, CA).

Preferiblemente, los anticuerpos para administración a humanos, aunque se preparan en un animal de laboratorio tal como un ratón, serán "humanizados", o quiméricos, es decir se harán compatibles con el sistema inmunitario humano de tal manera que un paciente humano no desarrolle una respuesta inmunitaria respecto al anticuerpo. Aún más preferiblemente, los anticuerpos humanos que pueden prepararse ahora utilizando métodos tales como los descritos por ejemplo en Lonberg et al. (Nature Genetics, 7: 13-21 [1994]) se prefieren para administración terapéutica a pacientes.

Los anticuerpos producidos utilizando cualquiera de los métodos arriba descritos pueden conjugarse a compuestos que son capaces de atravesar la membrana celular y la membrana nuclear para importación del anticuerpo al núcleo, utilizando, por ejemplo, una señal de direccionamiento nuclear tal como la encontrada en la forma fosforilada de LSIRF.

Composiciones terapéuticas y administración

Las formulaciones terapéuticas de las composiciones útiles para la práctica de la presente invención tales como anticuerpos LSIRF pueden prepararse para almacenamiento por mezcla de la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes, o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 18ª, A.R. Gennaro, compilador, Mack Publishing Company [1990]) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores y son preferiblemente inertes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, nitrato, u otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular bajo; proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos con inclusión de glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes-azúcar tales como manitol o sorbitol; iones de carga opuesta formadores de sal tales como sodio; y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

La composición a utilizar para administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral se guardará ordinariamente en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas se introducen generalmente en un recipiente que tiene una abertura de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración de la composición está de acuerdo con métodos conocidos, v.g. oral, inyección o infusión por rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, o intralesional, o por sistemas de liberación sostenida o dispositivos de implante. En caso deseado, las composiciones pueden administrarse continuamente por infusión, inyección de tipo bolus o mediante un dispositivo de implantación.

Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en la forma de artículos conformados, v.g. películas, o microcápsulas. Matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (documentos U.S. 3773919, EP 58481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982]), etileno-acetato de vinilo (Langer et al, supra) o ácido poli-D (-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida pueden incluir también liposomas, los cuales pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica (v.g. documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985]; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 [1980]; documentos EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP
143959).

La cantidad eficaz de las composiciones a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la ruta de administración, y del estado del paciente. De acuerdo con ello, será necesario que el terapeuta titule la dosificación y modifique la ruta de administración en caso requerido para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede estar comprendida entre aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores arriba mencionados. Típicamente, un clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que consiga el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente por ensayos convencionales diseñados para evaluar las moléculas de ácido nucleico de LSIRF, secuencias flanqueantes 5', polipéptidos, y anticuerpos de la presente invención tendrán una diversidad de usos que son apreciados fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica.

Los polipéptidos LSIRF tendrán utilidad como diana para compuestos terapéuticos utilizados para regular la activación de los linfocitos. Por bloqueo de la expresión del gen de LSIRF (por disminución de la transcripción o traducción de LSIRF) o la actividad del polipéptido LSIRF, es posible suprimir la activación de los linfocitos en respuesta a ciertos estímulos ambientales. Por aumento del nivel de presión del gen de LSIRF (por regulación ascendente de la secuencia flanqueante de LSIRF 5'), es posible estimular la activación y proliferación de los linfocitos, aumentando con ello la respuesta inmunitaria a antígenos particulares.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser policlonales o monoclonales, y pueden generarse contra LSIRF de cualquier mamífero. Estos anticuerpos pueden utilizarse para evaluar la presencia y/o cantidad de polipéptido LSIRF en un tejido o muestra biológica dado(a). Adicionalmente, aquéllos pueden utilizarse para bloquear la actividad de LSIRF por fijación al sitio activo de este polipéptido. Así, los anticuerpos propiamente dichos pueden encontrar uso como compuestos terapéuticos a fin de reducir el nivel del polipéptido LSIRF.

La invención puede comprenderse más fácilmente haciendo referencia a los Ejemplos que siguen. Estos Ejemplos no deben interpretarse en modo alguno como limitantes del alcance de la invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Clonación de cADN de LSIRF de ratón

Se utilizaron dos cebadores de PCR (reacción en cadena de polimerasa) parcialmente degenerados para amplificación por PCR de cADN preparado a partir de ARN total obtenido de tejido del bazo de un ratón C57B1/6. Los cebadores eran:

ATCCTGGAACACGC	(SEQ ID NO: 5)
GCACACGAACTGCCTTCCA	(SEQ ID NO: 6)

El cebador Nº 5 contenía tres bases inosina que estaban localizadas entre los nucleótidos 2 y 3 (T y C), los nucleótidos 4 y 5 (C y T), y los nucleótidos 9 y 10 (A y C). El cebador Nº 6 contenía cuatro bases inosina en la secuencia que estaban localizadas entre los nucleótidos 5 y 6 (A y C), los nucleótidos 7 y 8 (G y A), los nucleótidos 9 y 10 (A y C), y los nucleótidos 11 y 12 (T y G).

Se llevó a cabo la PCR en un ciclador térmico programable (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) en 50 \mul de tampón PCR (Tris-HCl 10 mM de pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, y KCl 50 mM) que contenía dNTPs 200 \muM, 2 U de polimerasa Taq, y 100 pM de cada cebador. Se realizaron 30 ciclos de PCR de acuerdo con el régimen de temperatura siguiente: 94ºC durante 60 segundos; 37ºC durante 30 segundos; y 72ºC durante 60 segundos. Los productos PCR se insertaron luego directamente en el plásmido pCRII utilizando el sistema TA-Cloning (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Los plásmidos que contenían las inserciones del producto PCR se transformaron en la cepa competente de E. coli INV-alfa F' (Invitrogen Corp.) para amplificación. El ADN plasmídico de estas células hospedadoras se preparó utilizando el método estándar de lisis alcalina (Sambrook et al., supra), y el ADN plasmídico se sometió luego a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% aproximadamente. Una porción del ADN se transfirió a un papel de membrana Hybond-N (Amersham, Oakville, Ontario, Canadá) y se hibridó con fragmentos de ADN marcados con ^{32}P y cebados aleatoriamente de IRF-1 e IRF-2 murinos utilizando el protocolo del fabricante (Amersham). El ADN plasmídico de los clones que no se hibridaban con los fragmentos IRF-1 o IRF-2 se secuenció utilizando el kit Sequenase de US Bioscience (US Bioscience, Cleveland, Ohio). Un clon, "Spl 5"), contenía una nueva secuencia nucleotídica tal como se determinó a partir de una búsqueda en GenBank. Este clon se marcó con ^{32}P por cebado aleatorio (procedimiento Amersham) y se utilizó para cribar una genoteca de cADN de bazo inducida por IL-4 de ratón (Clonetech, Palo Alto, CA). Después de hibridación, los filtros que contenían los clones de la genoteca de cADN se lavaron primeramente con 1 X SSC y SDS al 0,1% durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 65ºC y luego con 0,2 X SSC y SDS al 0,1% durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 65ºC. Se obtuvieron dos clones de cADN de LSIRF que carecían del codón de iniciación ATG. Uno de estos clones, "C13", se utilizó para cribar nuevamente la misma genoteca, produciendo un clon de aproximadamente 35 kb, que carecía también de la secuencia 5'. Se utilizó luego el clon C16 para cribar una genoteca de cADN de bazo de ratón \gammaZAPII (Stratagene, LaJolla, CA) y se obtuvieron varios clones parciales que tenían un codón de partida ATG supuesto. Una secuencia de cADN completa que contenía la región LSIRF codificante entera se obtuvo por creación de un clon artificial utilizando PCR con un iniciador 5' extendido. Este clon se insertó en el vector pBSII para generar el plásmido PV-1, y se verificó la secuencia de LSIRF.

Se obtuvo la secuencia de aminoácidos predicha para cada uno de los clones parciales de cDNA, y algunos de los clones tenían una glutamina extra en la posición del aminoácido 164. La secuencia de cADN de longitud total de PV-1, que tiene una longitud aproximada de 1,4 kb, se expone en la Figura 1. El cADN de PV-1 contiene la glutamina extra en la posición del aminoácido 164. Una secuencia de aminoácidos de longitud total predicha para LSIRF basada en la secuencia de cADN de LSIRF se expone en la Figura 2.

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Ejemplo 2

Clonación genómica de LSIRF de ratón

Una porción de aproximadamente 630 pb de clon C16 del cADN de LSIRF se amplificó por PCR utilizando los cebadores siguientes:

CAGCCCGGGGTACTTGCCGCTGTC	(SEQ ID NO: 7)
AGACCTTATGCTTGGCTCAATGGG	(SEQ ID NO: 8)

Las condiciones de la PCR fueron 94ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 30 segundos.

El fragmento PCR obtenido se purificó por electroforesis en gel de agarosa al 1%, seguido por paso a través de una columna Spin-X (CoStar Corp., Cambridge, MA). Este fragmento se marcó luego con ^{32}P utilizando la técnica de iniciadores aleatorios (Amersham), y se utilizó subsiguientemente para cribar una genoteca genómica preparada a partir de tejido de riñón de un ratón 129/J. Se obtuvieron varios clones por lavado a 65ºC en 0,1 x SSC y SDS al 0,1%. Dos de estos clones (tamaños 12 y 15 kb) se subclonaron en el vector pBSII (Stratagene, LaJolla, CA) para secuenciación. Los clones contenían secuencias solapantes, permitiendo la identificación de aproximadamente 2 kb de secuencia flanqueante 5'. La secuencia flanqueante 5' se expone en la Figura 3. Una secuencia genómica que contiene los exones e intrones de un gen de LSIRF murino se expone en la Figura 4, y las inconsistencias en la secuencia debidas a la incertidumbre de secuencia se indican como "R" para A o G, "S" para G o C, "M" para A o C, y "K" para T o G. Las ambigüedades son:

M en los nucleótidos 748, 4159, 7403 y 10357;

R en los nucleótidos 5277, 5310, 10564 y 11713;

K en los nucleótidos 4513, 5885, y 9812;

S en el nucleótido 6425.

Todas las ambigüedades se encuentran en los intrones, por lo que no afectan a la secuencia de nucleótidos real de los exones que comprenden la región codificante de LSIRF.

Las secuencias de nucleótidos (cDNA y genómica) y la secuencia de aminoácidos deducida de LSIRF se compararon con todas las secuencias incluidas en las bases de datos GenBank y SwissProt, y no se encontró secuencia idéntica alguna. Sin embargo, la secuencia del término amino de LSIRF tenía homología con otros miembros de la familia IRF. La homología máxima se encontró con el polipéptido ICSBP (proteína de fijación de secuencia de consenso de interferón), que comparte 83% de homología (permitiendo una laguna de un solo aminoácido) con LSIRF en el término amino.

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Ejemplo 3

Expresión de LSIRF de ratón

La secuencia de cADN de longitud total de LSIRF se escindió del plásmido PV-1 por digestión de restricción con EcoRI. El gen de LSIRF se aisló a partir de un gel de agarosa al 0,7% después de electroforesis, se hizo romo en los extremos utilizando DNA-polimerasa Klenow, y se ligó al sitio NheI del plásmido pETL (BlueBacII, Invitrogen Company) para generar el plásmido pETL-LSIRF. El plásmido se amplificó en células de E. coli de la cepa DH5-alfa (cultivadas en presencia de ampicilina) utilizando métodos y condiciones de cultivo estándar. El plásmido purificado que contenía el gen de LSIRF en la orientación apropiada (tal como se determinó por mapeado con endonucleasas de restricción utilizando digestión con EcoRI, HindIII, o PvuII) se sometió a co-transfección en células de insecto Sf9 (disponibles de la American Type Culture Collection, 2301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU.) junto con ADN genómico linealizado de baculovirus (Invitrogen Corp., San Diego, CA, EE.UU.), y las células se incubaron durante aproximadamente 48 horas a aproximadamente 28ºC en medio de Grace complementado con Yeastolate, hidrolizado de lactoalbúmina, y suero de ternero fetal al 10%.

Después de la incubación, se cosecharon las células y se realizaron ensayos de calvas (Richardson, compilador, Meth. Mol. Biol., vol. 39: Baculovirus Expression Protocols, Humana Press, Totowa, NJ [1995]) en presencia de Bluo-gal (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) con objeto de aislar el virus recombinante. Se seleccionaron las calvas recombinantes azules después de 5-7 días de cultivo y las calvas se amplificaron en placas de microtitulación de 24 pocillos que contenían células Sf9. La amplificación ulterior del virus recombinante se realizó por cultivo de células en gran escala en matraces de cultivo de tejidos hasta que se alcanzó un título de aproximadamente 10^{8} pfu (unidades formadoras de calvas)/ml. La expresión de LSIRF se verificó por infección de células Sf9 a una multiplicidad de infección de aproximadamente 1 pfu/célula y recogiendo las células al cabo de 0, 24, 48, 72, y 96 horas después de la infección. Se prepararon luego lisados de células por solubilización en tampón de muestra SDS-PAGE (DTT 100 mM, Tris-HCl 80 mM, pH 6,8, glicerol al 10%, azul de bromofenol al 0,0012%) y se analizaron por análisis mediante transferencia Western.

Se analizaron extractos de proteínas procedentes tanto de las células Sf9 como de linfocitos periféricos de ratón, en cuanto a la presencia del polipéptido LSIRF. Se prepararon linfocitos a partir de ganglios linfáticos escindidos de ratones por paso del tejido de ganglio linfático a través de un tamiz de malla fina. Los linfocitos se mantuvieron en medio Iscove complementado con 10% de suero de ternero fetal. Los extractos proteínicos de las células Sf9 y los linfocitos se prepararon utilizando el protocolo del fabricante para las células Sf9 (Pharmingen, San Diego, CA) o los métodos expuestos en Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY [1989], para células linfocíticas). Las proteínas se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 8%/SDS al 0,1% y el gel se transfirió a una membrana Immobilon-P (Millipore Company) utilizando procedimientos estándar. La transferencia se incubó primeramente con tampón de bloqueo (leche desnatada al 4% y Tween-20 al 0,05% en 1 x PBS) durante una hora a la temperatura ambiente. Se añadieron luego a la transferencia antisueros policlonales de conejo de LSIRF generados contra un péptido del término carboxi de LSIRF con una dilución de aproximadamente 1:2000 (en una solución de 1 parte de tampón de bloqueo para 1 parte de PBS). El péptido LSIRF inyectado en el conejo para generar el anticuerpo era:

GYELPHEVTTPDYHR

(SEQ ID NO: 9)

Después de incubación con anticuerpo LSIRF durante aproximadamente 1 hora, se lavó la transferencia y el anticuerpo LSIRF se detectó con anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-conejo de cabra, a una dilución de aproximadamente 1:5000.

Los resultados indican que una banda de aproximadamente 51 kD (el peso molecular predicho de LSIRF) era reconocida por el anticuerpo anti-LSIRF tanto para las células T periféricas estimuladas con anticuerpos anti-CD3 como para las células Sf9 recombinantes.

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Ejemplo 4

Análisis de la expresión de LSIRF de ratón A. Transferencias de tejido

Para evaluar la especificidad de tejido de los transcritos de LSIRF, se preparó ARN total a partir de cerebro, pulmón, timo, médula ósea, bazo, hígado, intestino, páncreas, glándula salivar, testículo, corazón y musculatura lisa de ratón, utilizando los métodos descritos por Wangm et al. (EMBO J; 10:2437-2450 [1991]). Los ARNs se sometieron a electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%/formaldehído utilizando procedimientos estándar y se transfirieron luego a papel de nitrocelulosa como se describe en Sambrook et al., supra. Las transferencias se hibridaron luego con un cADN de 1,4 Kb cebado aleatoriamente y marcado con ^{32}P que contenía la región codificante entera de LSIRF (la inserción de PV-1) y se lavaron subsiguientemente como ha sido descrito por Stewart et al. (Met. Mol. Cell Biol. 1: 73-76 [1989]) a aproximadamente 50ºC en 0,2 X SSC y SDS al 0,1%.

Los resultados que se muestran en la Figura 5 indican que un transcrito de LSIRF de aproximadamente 5,5 kb está presente en gran medida en el tejido del bazo y de la médula ósea con transcritos más débiles del mismo tamaño en los tejidos de timo y pulmón. Sorprendentemente, no se observó banda adicional alguna. Además, la Figura 6 indica que el tejido de ganglio linfático contiene también transcritos de LSIRF.

Diversas líneas de células T que incluían CTLL-2, D10.G4.1, HT-2, EL-4, y BW5147 (estando disponibles todas las células de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn-Drive, Rockville, MD, EE.UU.) se evaluaron respecto a expresión de LSIRF utilizando análisis por transferencia Northern. Se extrajo de estas líneas de células el ARN utilizando el método de Chomczynski et al. (Anal. Biochem., 162: 157-159 [1987]). Las líneas de células se mantuvieron a 37ºC y 5% de CO_{2} en medio Iscove complementado con 10% de suero de ternero fetal y L-glutamina 2 mM. Se cree que las tres primeras líneas de células son linajes de células T periféricas, creyéndose en cambio que las dos últimas son linajes de células T inmaduras. Los cultivos de células HT-2 y CTLL-2 se complementaron con 50 U/ml de IL-2 (Genzyme Inc., Cambridge, MA) y 2-mercaptoetanol 50 \muM; los cultivos de D10.G4.1 se complementaron con 50 U/ml de IL-1 (Genzyme Inc., Cambridge, MA), 50 U/ml de IL-2, y 2-mercaptoetanol
50 mM.

Se prepararon transferencias Northern a partir de RNA total, se transfirieron a papel Hybond N y se sondaron con el cADN cebado aleatoriamente de 1,4 kb como se ha descrito arriba utilizando los métodos de Stewart et al., supra.

Los resultados indican que son visibles únicamente transcritos de LSIRF en las líneas de células T periféricas, lo que sugiere que LSIRF se expresa preferentemente en células T maduras. Análisis similares de transcritos de mARN en la línea de células pre-B CB17.51, la línea de células B WEHI231 (American Type Culture Collection), y la línea de células de plasmacitoma J558 (American Type Culture Collection) demuestran la presencia del transcrito en todas las líneas de células, teniendo J558 la señal más fuerte.

La inducción de LSIRF en los linfocitos primarios obtenidos a partir de bazo o de ganglios linfáticos se evaluó por adición de diversos estimuladores a las células cultivadas y estimación de los niveles de mRNA de LSIRF. Los estimuladores utilizados para las células de ganglios linfáticos fueron 1000 U/ml de interferón-beta murino (IF-beta; Lee Biomolecular Research, San Diego, CA), 100 U/ml de interferón-gamma (IFN-\gamma; Genzyme Inc., Cambridge, MA) murino, o 10 ng/ml de factor de necrosis tumoral (TNF, Genzyme Inc.) murino. Los esplenocitos se trataron con 20 \mug/ml de anticuerpo anti-IgM, 10 \mug/ml de lipopolisacárido (LPS); una endotoxina bacteriana), 10 ng/ml de PMA (miristato-acetato de forbol; Sigma Chemical Co; St. Louis, MO), 1 mg/ml de ciclosporina A (CsA; Sandoz Company, Basilea, Suiza), 10 \mug/ml de Concanavalina A (ConA; Sigma), o 1 ó 10 \mug/ml de cicloheximida (CHX; Sigma). Todas las células se trataron durante 6 horas a 37ºC.

Los resultados se muestran en las Figuras 6, 7, y 8. En todas las figuras, se presenta actina beta como indicador de la cantidad de ARN total analizada.

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La Figura 6 muestra que los anticuerpos anti-CD3 inducían de hecho la transcripción de LSIRF. Muy sorprendentemente, sin embargo, los interferones no inducían transcritos de LSIRF. Esto está en contraste acusado con otros IRFs conocidos, dado que los transcritos de otros IRF conocidos son inducidos por interferones.

La Figura 7 muestra que la cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteínas, induce la transcripción de LSIRF. Este resultado fue inesperado, dado que la cicloheximida no induce transcripción de los genes IRF-1 o IRF-2.

La Figura 8 muestra que anti-IgM y PMA inducen transcritos de LSIRF. Dicha inducción por anti-IgM era sorprendente, dado que indica que LSIRF se expresa tanto en las células B como en las células T.

B. Ensayo de desplazamiento de gel

Se condujo un ensayo de desplazamiento por movilidad electroforética para valorar si el polipéptido LSIRF es una proteína de fijación de ADN. Se prepararon extractos nucleares de células Sf9 de control (transfectadas con baculovirus de tipo salvaje únicamente) y se prepararon células Sf9 que expresaban LSIRF (transfectadas con baculovirus que contenía el cADN de LSIRF) como sigue. Las células Sf9 se redujeron a un sedimento y se lavaron luego dos veces en PBS. Después del lavado final, las células se resuspendieron en 0,5 ml de "tampón H" (tampón hipotónico) por 10^{7} células (el tampón H está constituido por: Hepes-NaOH 25 mM, pH 8,0, KCl 10 mM, MgCl_{2} 5 mM, EDTA 0,5 mM, y DTT 0,5 mM) y se incubaron en hielo durante aproximadamente 30 min, durante cuyo tiempo las células se hincharon debido al tampón hipotónico. Las células se disgregaron luego con 15 golpes de una mano de mortero tipo B en un homogeneizador Dounce. Los núcleos se aislaron a partir de los residuos celulares por reducción a un sedimento a aproximadamente 4ºC en una microcentrífuga a 10K rpm durante aproximadamente 10 min. Los sedimentos, que contenían la mayor parte de los núcleos, se extrajeron luego por resuspensión en 0,5 ml de tampón N por 10^{7} células (el tampón N está constituido por Hepes-NaOH 25 mM de pH 8,0, KCl 400 mM, MgCl_{2} 5 mM, EDTA 0,5 mM, glicerol al 10%, y DTT 0,5 mM) e incubación en hielo durante aproximadamente 20 minutos. La suspensión se centrifugó luego a 4ºC en una microcentrífuga a 15K rpm durante aproximadamente 15 minutos. El sobrenadante, que contenía la mayor parte del polipéptido LSIRF, se cambió de tampón para eliminar el exceso de sal utilizando un microconcentrador Centricon 10 (Amicon Corporation). El tampón de dilución para la concentración era tampón E (Hepes-NaOH 25 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, EDTA 0,5 mM, glicerol al 15%, y DTT 0,5 mM). El tampón H, el tampón N, y el tampón E contenían todos ellos los inhibidores de proteasas siguientes: PMSF 0,5 mM, 0,5 \mug/ml de leupeptina, y 0,5 \mug/ml de aprotinina).

Para evaluar la movilidad electroforética de un fragmento de ADN particular debida a la fijación por LSIRF del fragmento, se incubaron los extractos con una sonda de ADN bicatenaria marcada con ^{32}P. La secuencia de la cadena de sentido de esta sonda, una secuencia de fijación de MHC IRSE murina de tipo salvaje, se indica a continuación:

dTGCAGAAGTGAAACTGAGG

(SEQ ID NO: 10)

Para la reacción de fijación, se prepararon aproximadamente 25 x 10^{3} cpm (correspondientes a aproximadamente 1 x 10^{-11} moles de la sonda) en tampón de reacción de fijación (Hepes-KOH 12 mM, de pH 7,9, KCl 30 mM, EGTA 60 \muM, DTT 0,3 mM, Ficoll al 2,5%, 0,6 \mug de poli(dI-dC) [obtenido de Pharmacia], y NP-40 al 0,05%). Los extractos nucleares se prepararon por dilución a un volumen aproximadamente 8 veces mayor en tampón E que contenía aproximadamente 0,1 mg/ml de BSA (seroalbúmina bovina) hasta una concentración final de aproximadamente 14 \mug de proteína total/ml para las reacciones que contenían LSIRF, y aproximadamente 22 \mug/ml para las reacciones de control. La reacción de fijación se inició por adición de aproximadamente 1 \mul del extracto nuclear a aproximadamente 6,24 \mul de la solución de sonda, la cual, en algunos casos, contenía también fragmentos de ADN "competidores" sin marcar. La secuencia de cada uno de estos fragmentos se indica más adelante en la Tabla 1. Los fragmentos competidores se añadieron a un exceso molar de aproximadamente 750 veces (en comparación con el fragmento marcado). La solución extracto nuclear/sonda se incubó a aproximadamente 23ºC durante aproximadamente 20 minutos y se cargó luego en un gel de poliacril-amida al 9% (preparado con 0,25 x TBE) que se había pasado con anterioridad a aproximadamente 250 voltios durante aproximadamente 2 horas antes de la aplicación de la muestra. El gel se ejecutó durante aproximadamente dos horas a aproximadamente 300 voltios para separar los complejos proteína-ADN de la sonda de ADN sin fijar. El gel se secó luego y se expuso a película para evaluar el desplazamiento por migración de la sonda de ADN debido a la fijación de la proteína.

TABLA 1

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1

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En la Tabla 1, "m" indica secuencia de ratón y "h" indica secuencia humana.

Los resultados se muestran en la Figura 9. Como puede verse, la secuencia MHC ISRE de tipo salvaje fija la proteína LSIRF. Adicionalmente, dos mutantes de fragmentos de ADN ISRE, m1 y m4, compiten claramente para fijación, como lo hacen otros dos fragmentos de ADN, Ig lambda B e ISG54.

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Ejemplo 5

Clonación de LSIRF humano

Para identificar el LSIRF codificante de cADN humano, se cribó una genoteca de cADN de linfocitos humanos (Clontech, Palo Alto, CA; número de catálogo HL 1031a) utilizando el clon PV-1 de ratón. Las condiciones de cribado fueron una noche a 65ºC en tampón Church (Church y Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81: 1991-1995 [1984]). Los filtros se lavaron dos veces durante aproximadamente 30 minutos cada vez en 2 X SSC y 0,1% de SDS. De aproximadamente un millón de calvas cribadas, se identificaron dos clones positivos, se aislaron, y se purificó el ADN utilizando técnicas estándar. Los clones se subclonaron en el sitio EcoRI de pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA). El mayor de estos clones, designado H14, que tenía una longitud mayor que aproximadamente 2 kb, se secuenció. La secuencia indicó que este clon era un híbrido del receptor p55 de TNF (factor de necrosis tumoral) (aproximadamente 400 pares de bases) y aproximadamente 1 kb de secuencia que era claramente homóloga a los exones 3-9 de la secuencia LSIRF de ratón. Adicionalmente, este clon tenía un codón de parada conservado, una secuencia donante de remodelación, y aproximadamente 600 pares de bases del intrón 9. Se dedujo por tanto que esta secuencia de 1019 pares de bases representaba una porción de la secuencia de LSIRF humana. Esta secuencia de 1019 pares de bases se amplificó por PCR utilizando los cebadores siguientes:

CTGGACATCTCAGACCCGTACAAAGTG	(SEQ ID NO: 19)
CTTGACATTTTTCATTCTTGAATAGAG	(SEQ ID NO: 20)

Las condiciones de amplificación eran 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante aproximadamente 90 segundos. Se utilizaron aproximadamente 500 ng del molde H14 en presencia de polimerasa Taq, y se realizaron aproximadamente 15 ciclos de PCR. El producto de la PCR resultante se ligó directamente al vector PCRII del kit de clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA) y se secuenció para verificar que se había amplificado el fragmento apropiado. Este fragmento de cADN de 1019 pares de bases, denominado "FISH", se utilizó luego para cribar una genoteca de cADN del tramo 5' de leucocitos humanos (Clontech; número de catálogo HL1169x). Las condiciones de cribado fueron: aproximadamente 65ºC durante una noche en tampón Church, seguido por lavado dos veces durante aproximadamente 30 minutos en 2 X SSC y SDS al 0,1%, seguido por dos veces en 0,2 X SSC y SDS a 0,1% durante aproximadamente 30 minutos. Se identificó una calva de aproximadamente 500.000, y el ADN se purificó y secuenció. Este clon, designado HIRF4\lambdaDR2, que contenía el intrón 2 y el exón de longitud total 3 (solamente se encontró una porción del exón 3 en el clon H14), así como los exones 5, 7, 8 y el intrón 8. Los exones 4 y 6 estaban supuestamente remodelados o ausentes.

Para obtener el resto de la secuencia codificante de LSIRF, se emplearon dos enfoques. En primer lugar, se cribó una genoteca genómica de placenta humana en el vector lambda fix2 (Stratagene, LaJolla, CA) utilizando el cADN de FISH como sonda. Las condiciones de cribado fueron aproximadamente 65ºC durante una noche en tampón Church, seguido por dos lavados durante aproximadamente 30 minutos en 2 X SSC y SDS al 0,1%, y a continuación dos veces en 0,2 X SSC y SDS al 0,1% durante aproximadamente 30 minutos. Se aislaron 10 clones de fago, y se purificó el ADN de un clon, designado HG-1. Este ADN se digirió con las endonucleasas de restricción BamHI, SacI, y XBA I y los fragmentos se subclonaron en el vector de clonación pMOB (Strathmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1247-1250 [1991]). Se obtuvo la secuencia de cada fragmento y se comparó con la secuencia LSIRF de ratón. El promotor, el exón I, y el exón II de LSIRF humana se identificaron en este clon sobre la base de homología con la secuencia de ratón.

El segundo enfoque utilizado fue una reacción RACE utilizando el kit Clontech Marathon® y siguiendo el protocolo del fabricante. Se utilizó una línea de linfoma de células B designada OCILY8 (véase Blood, 69: 1307-1314 [1987]) que se había demostrado por análisis previos mediante transferencia Northern que tenía una expresión elevada de LSIRF. El producto RACE resultante se secuenció y se encontró que coincidía con la secuencia genómica de los exones uno y dos (obtenida como se ha descrito arriba).

Para producir un marco de lectura abierto, el cADN de FISH se escindió del sitio EcoRI del vector PCRII y se ligó al sitio EcoRI de PGEX4T3 (Promega, Madison, WI) para formar el vector pGEX4T3-FISH. A fin de obtener el extremo 5' del marco de lectura abierto en una forma que permitiera la fusión del mismo al clon FISH, se utilizó cADN listo Marathon® de bazo humano (Clontech, No. de catálogo 7412-1) con los dos cebadores siguientes para amplificación:

TGCCCTCAGCTCCGAGTCCAG	(SEQ. ID. NO: 21)
AACCATTTTCACAAGCTG	(SEQ. ID. NO: 22)

La amplificación se realizó utilizando PCR en las condiciones siguientes: 94ºC durante 30 segundos, 64ºC durante 30 segundos, y 68ºC durante 1 minuto. Se realizaron 30 ciclos utilizando Polimerasa Expand de Alta Fidelidad (Boehringer Mannheim). Utilizando este procedimiento, se amplificó la secuencia del término N del LSIRF, obteniéndose un tamaño de fragmento de ADN esperado de aproximadamente 600 pares de bases.

El fragmento de aproximadamente 600 pares de bases se reamplificó por PCR utilizando SEQ ID NO: 22 (indicada anteriormente) y SEQ ID NO: 23 como se indica a continuación:

GGATCCGGATCCATGAACTGGAGGGCGGCGGCCGAGGC

(SEQ. ID. NO: 23)

Se realizaron quince ciclos de PCR como sigue: 94ºC durante 30 segundos, 64ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 90 segundos, utilizando polimerasa PFU nativa (Stratagene, LaJolla, CA).

El vector PGEX4T3 que contenía la inserción FISH (pGEX4T3-FISH) se digirió a la vez con BamHI y Sac II, separando con ello la porción 5' de la inserción FISH. El producto PCR de aproximadamente 600 pares de bases obtenido anteriormente se digirió con las mismas enzimas y se ligó al vector pGEX4T3-FISH para formar la construcción del marco de lectura abierto de longitud total pGEX4T3 LSIRF BamHI/EcoRI, cuya región codificante se indica en la Figura 10. La secuencia de aminoácidos predicha se presenta en la Figura 11. Este clon se evaluó por producción de una proteína de fusión GST (Pharmacia) siguiendo el protocolo del fabricante. El tamaño predicho de la proteína de fusión era aproximadamente 79 kD, de los cuales aproximadamente 27 kD corresponden a la proteína GST, y aproximadamente 52 kD corresponden a la proteína LSIRF. La proteína de fusión migraba en SDS-PAGE al 8% al tamaño esperado de aproximadamente 79 kD tal como se determinó por tinción con azul Coomassie.

El análisis por transferencia Northern de la LSIRF humana indicó que este gen se expresa primariamente en tejido del bazo y tejido de sangre periférica, observándose un nivel inferior en colon y tejido intestinal. Adicionalmente, utilizando una transferencia Northern de la línea de células de cáncer múltiple obtenida de Clontech (Nº de catálogo 7757-1), se observó una expresión débil del gen en la línea de linfoma de Burkitt de las células B humanas Raji, y se observó una expresión fuerte en la línea de cáncer G361 de la línea de melanoma humano.

Basándose en la secuenciación del ADN de varios clones que contenían la secuencia hLSIRF parcial se cree que existen dos formas de la secuencia hLSIRF. Una forma, la forma "Simple Q", contiene el codón "CAG" en las bases 490-492, que codifica el aminoácido Q (Gln) en la posición del aminoácido 164. Una segunda forma de ADN de LSIRF, la forma "Doble Q", contiene un codón "CAG" adicional entre las bases 492 y 493 de la forma "Simple Q", dando como resultado un aminoácido Q adicional (Gln) entre los aminoácidos 163 y 164 de la forma "Simple Q". Aparte de esta diferencia singular, las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de las dos formas son idénticas.

La secuencia de ADN de longitud total "Simple Q" que codifica LSIRF humana (hLSIRF) en el vector pGEX4T3 fue depositada en la ATCC como número de acceso 98016 el 27 de Marzo de 1996. Adicionalmente, la secuencia LSIRF humana de longitud total que codifica la forma "Doble Q" de la proteína hLSIRF fue depositada con la ATCC el 27 de Marzo de 1996, como número de acceso 98017.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS GENES CODIFICANTES DE POLIPÉPTIDOS LSIRF

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 25

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(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Amgen Canada Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 6733 Mississauga Road, Suite 303

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(C)

CIUDAD: Mississauga

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(D)

ESTADO: Ontario

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(E)

PAÍS: Canadá

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): L5N 6JB

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

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(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE

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(A)

NOMBRE: Oleski, Nancy A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34.688

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE:

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1353 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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2

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 450 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 2139 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

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7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 12537 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CATENARIEDAD: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

12

13

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1353 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 450 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

Claims (15)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido factor regulador de interferón específico de los linfocitos ("LSIRF") o fragmento del mismo, que tiene la actividad de fijación específica de ADN de LSIRF, seleccionada del grupo constituido por:

a) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma;

b) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ. ID. NO: 4 o un fragmento de la misma y

c) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 2 o un fragmento de la misma.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que es cADN, ADN genómico o ADN sintético.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que es SEQ. ID. NO: 1.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada que es SEQ. ID. NO: 4.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada que es SEQ. ID. NO: 3.

6. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

7. Una célula hospedadora procariota o eucariota transformada o transfectada de manera estable con un vector de la reivindicación 6.

8. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 2 o un fragmento del mismo que tiene la actividad de fijación de ADN específica del polipéptido factor regulador de interferón específico de los linfocitos ("LSIRF").

9. Un polipéptido de la reivindicación 8 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 2.

10. Un polipéptido de la reivindicación 8 que es el producto de una expresión en célula hospedadora procariota o eucariota de una secuencia exógena de molécula de ácido nucleico.

11. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1.

12. Un método de producción de un polipéptido factor regulador de interferón específico de los linfocitos ("LSIRF") que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 7 en condiciones que permiten la expresión de LSIRF.

13. Un anticuerpo que fija específicamente un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1.

14. Un anticuerpo de la reivindicación 13 que es un anticuerpo monoclonal.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende

insertar un vector de acuerdo con la reivindicación 6 en una célula hospedadora para formar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7.