CZ318997A3 - Geny kódující polypeptidy regulačního faktoru lymfocytárního interferonu - Google Patents

Description

Vynález se týká nových polypeptidů majících vazebnou aktivitu na DNA a k molekulám nukleových kyselin kódujících polypeptidy. Tyto polypeptidy dříve označované jako „ IRF-3“ polypeptidy jsou nyní označovány jako „LSIRF“ polypeptidy (regulační faktor lymfoojtámího specifického interferonu) a jsou novými členy skupiny polypeptidů, které jsou známy jako interferonové regulační faktory.

Oblast techniky

Regulace genové exprese může nastat na několika rozdílných úrovních, ale aktivace genu specifických transkripčních faktorů je pro tento proces považována za nejzákladnější. Jedna skupina transkripčních faktorů, interferonové regulační faktory (IRFs), se skládá ze čtyř členů: IRF-1, IRF-2, ISGF3y a ICSBP. Všechny čtyři IRF jsou charakterizovány silně konzervativní N-koncovou DNA vazebnou doménou obsahující opakovaný tryptofanový motiv (Veals a kol., Mol. Cell. Biol., 12: 3315-3324 [ 1992]).

Interferonové regulační faktory-1(IRF-1) a -2(IRF-2) byly původně identifikovány pomocí studií transkripční regulace lidského interferon-β genu (IFN- β) (Miyamoto a kol., Cell, 54: 903-913 [1988] ) a (Harada a kol., Cell, 58: 729-739 [1989]). Studie cDNA exprese vysvětlily působení IRF-1 jako transkripčního aktivátoru IFN a IFN-indukujících genů, zatímco IRF-2 potlačuje účinek IRF-1 (Fujita a kol., Nátuře 337: 270-272 [1989]) a (Harada a kol., Cell,63: 303-312 [1990]). Poslední analýzy prokázaly, že IRF-1 může také působit jako protinádorový gen a IRF-2 jako možný onkogen (Harada a kol., Science, 259: 971-974 [1993]). Exprese IRF-1 je indukována typem -I (α/β) a typem -II (γ) IFNs (Miyamoto a kol., Cell,54: 903-913 [1988] ; Kanno a kol. Mol. Cell. Biol., 13: 3951-3963 [1993]), zatímco IRF-2 je jak současně exprimován, tak současně indukován typem-l IFNs (Harada a kol., Cell, 58: 729-739 [1989]).

.· φ • ·· φφ 9999 • 9 · · · Φ · Φ ··

Φ Φ Φ φ · Φ ·Φ Φ Φ

ΦΦΦΦΦ· Φ Φ Φ ΦΦΦΦ · Φ φ Φ Φφ Φ Φ

9909 9 99 9999 9999

Interferonem stimulovaný genový faktor-3 gamma (ISGF3y) je IFN- y- inducibilní protein, který se spojuje s ISGF3 a podjednotkami aktivovanými z latentní cytosolické formy typu-l IFNs (Levý a kol., EMBO J., 9 :1105-1111 [1990]; Levý a kol. New Biologist, 2: 383-392 [1990]). Po konzultaci bylo prokázáno, že tento komplex se translokuje do jádra a váže specifickou sekvenci DNA nalezenou v promotorové oblasti IFN-indukujících genů, známou jako ISRE(IFN-stimulovaný odezvový element; Veals a kol., Mol. Cell. Biol., 12: 3315-3324 [1992]). Nedávno byly klonovány ISGF3a subjednotky 91/84 kDa a 113 kDa (Schindler et al., Proč. Nati. Acad. sel. USA, 89: 7836-7839 [1992]; Fu et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 7840-7843 [1992] a označeny jako signální převodníky a aktivátory transkripce-1 (Stat-1) a -2 (Stat-2) v uvedeném pořadí, což jsou cíle JAK kinázové fosforylace, po níž následuje typ-l IFN/IFN-receptorové navázání (Shuai a kol., Science, 261: 1744-1746 [1993]; Damell et al., Science, 261: 1415-1421 [1994]).

Sekvenční vazebný protein shodný s interferonem (ICSBP) je také IFN-γ inducibilním proteinem původně izolovaný jako protein, který rozpozná ISRE motiv (také nazývaný ICS) promotoru myšího MHO třídy I, H-2L^D genu (Driggers a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:3743-3747 [19901]). Avšak na rozdíl od IRF-1, IRF-2 a ISGF3y, ICSBP vykazuje na tkáň vymezený vzor exprese, protože je indukován výlučně v buňkách makrofágu a lymfoidních rodech (Driggers a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:3743-3747 [1990]). Podle posledních studií hraje ICSBP podobnou roli jako IRF-2 při antagonizování účinku IRF-1 na indukci IFN a IFNindukujících genů (Weisz a kol.., J. Biol. Chem., 267:25589-25596 [1992]; Nelson a kol., Mol. Cell. Biol., 13:588-599 [1993]). ISREs interferon-inducibilních genů překrývají IRF-E, sekvenci DNA rozpoznanou pomocí IRF-1 a -2 (Tanaka a kol., Mol. Cell. Biol. 13:4531-4538 [1993]). Zcela nedávno se prokázalo, že ISGF3y váže IRF-Es IFN-β genu (Kawakami a kol., FEBS Letters, 358:225-229 [1995]).

Z hlediska důležitosti IRFs při regulaci exprese interferonových genů a dalších genů je nutné identifikovat další IRFs, zvláště tkáňově specifické IRFs.

Tudíž, předmětem vynálezu je identikovat nové členy skupiny IRF genů.

Další předměty budou odborníkovi v dané oblasti zcela zřejmé.

• 4 · • · 4 · 4 4·· ··· · · ♦ · · 4 ·Λ • · 4 4 · · · 444 ···· 4 4 · 44 ··· «4 • · ··· 4 4· «·4· 4 ·· 4444 4·4 4

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje molekuly nových nukleových kyselin kódujících regulační faktor lymfodtámího specifického interferonu. Tyto molekuly, které byly dříve označovány jako „IRF-3“ molekuly, jsou nyní označovány jako „LSIRF“ molekuly, avšak toto označení může být užíváno zaměnitelně s označením „LSIRF“ molekul.

Vynález poskytuje molekulu izolované nukleové kyseliny kódující LSIRF polypeptid nebo jeho fragment, vybraný ze skupiny skládající se z:

a) molekuly nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO:1;

b) molekuly nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO:4;

c) molekuly nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO:24 _ř nebo její „Double Q“ variantu;

d) molekuly nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. NO:2;

e) molekuly nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. NO:25 nebo její „Double Q“ variantu; a

f) molekuly nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci která se hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny bodů a), b), c), d), e), nebo s jejich fragmenty.

Vynález dále poskytuje polypeptid, který je produktem exprese těchto molekul nukleové kyseliny v hostitelské buňce.

Dále vynález poskytuje protilátku specificky vázající LSIRF polypeptid. Volitelně je tato protilátka monoklonální protilátkou.

Vynález poskytuje izolovaný polypeptid nebo jeho fragment mající specifickou, DNA vazebnou aktivitu LSIRF polypeptidu.

Vynález poskytuje vektor zahrnující molekulu DNA kódující LSIRF polypeptid.

Vynález poskytuje hostitelskou buňku stabilně transformovanou nebo trans_ _ro, fektovanou s vektorem obsahujícím molekulu DNA LSIRF polypeptidu. .

Vynález poskytuje izolovaný LSIRF polypeptid nebo jeho fragment; polypeptid í může mít aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.

‘ Vynález poskytuje LSIRF polypeptid, který je produktem exprese prokaryotní nebo eukaryotní hostitelské buňky podle sekvence exogenní LSIRF nukleové kyseliny.

• ·

Vynález dále poskytuje způsob výroby LSIRF polypeptidu zahrnující kultivování prokaryotní nebo eukaryotní hostitelské buňky za podmínek, které umožňují

LSIRF expresi.

Přehled a stručný popis obrázků

Obrázek 1 znázorňuje celou délku sekvence u myšího LSIRF cDNA nukleové kyseliny.

Obrázek 2 znázorňuje celou délku sekvence aminokyseliny u myšího LSIRF polypeptidu.

Obrázek 3 znázorňuje sekvenci 5' konce myšího LSIRF genu.

Obrázek 4 znázorňuje genomovou sekvenci DNA u myšího LSIRF.

Obrázek 5 znázorňuje Nothem blot RNA z různých myších tkání. Tento blot byl zkoumán radioaktivně značeným LSIRF za účelem identifikace LSIRF transkriptů. Párové značky RNA báze indikující velikost transkripce jsou znázorněny vlevo. Znázorněna je rovněž fotografie agarosového gelu indikující ribozomální RNA.

Obrázek 6 znázorňuje Nothem blot RNA z myších lymfocytů léčených bez stimulátorů (-) nebo se stimulátory, jak je označeno. Skvrna byla zkoumána radioaktivně značenou LSIRF za účelem identifikace těch stimulátorů, které indukují LSIRF transkripci. Je znázorněn rovněž tentýž blot zkoumaný značeným beta aktinem.

Obrázek 7 znázorňuje Nothem blot myších splenocytů ošetřený bez stimulátoru (-) nebo s jedním či více stimulátory, jak je označeno, a pak zkoumána radioaktivně značeným LSIRF. Tentýž Nothem blot zkoumaný značeným beta aktinem, je rovněž znázorněn.

Obrázek 8 znázorňuje Nothem blot myších splenocytů ošetřený bez stimulátoru (-) nebo se stimulátorem, jak je označeno, a pak zkoumána značeným LSIRF zkouškou. Rovněž, je znázorněn Nothem blot zkoumán značeným beta aktinem.

Obrázek 9 znázorňuje vazebnou zkoušku LSIRF myšího MHC ISRF na gelu. Jaderné extrakty z kontrolních tyčinkových virů infikovaných SF9 hmyzích buněk (pruh 2) nebo z SF9 buněk infikovaných tyčinkovými viry obsahujícími LSIRF gen (pruhy 3-12) byly inkubovány s jak značenou myší MHC ISRE sondou, tak s fragmentem označeného kompetitoru DNA (sekvence kompetitorových fragmentů je sestavena dále v tabulce 1). Pruhy 1 a 13 obsahují samotnou značenou MHC ISRE sondu.

·· · • v • ·

Obrázek 10 znázorňuje celou délku nukleotidové sekvence kódující oblasti lidského LSIRF v „Single Q“ formě. (SEQ. ID. NO.: 24). „Double Q“ forma má přídavný kodon, kódující aminokyselinu Q (Glu), vloženou mezi kodony aminokyselin 163 a 164.

Obrázek 11 znázorňuje předpokládanou „Single Q“ formu aminokyselinové sekvence lidského LSIRF (SEQ. ID. NO.: 25), jak je přepsána z nukleotidové sekvence obrázku 10. „Double Q“ forma má přídavnou aminokyselinu Q (Glu) vloženou mezi aminokyselinu 163 a 164.

Příklady provedení vynálezu

Označení „IRF-3“ a „LSIRF“ jsou zde použity zaměnitelné a vztahují se k téže nukleové kyselině a téže aminokyselinové sekvenci; jak „Single Q“, tak „Double Q“ formy LSIRF jsou zahrnuty v této definici (viz Příklad 5).

Zde použitý termín „biologicky aktivní“, označuje celou délku polypeptidu nebo jeho fragmentu, pocházejícího z jakéhokoliv zdroje, který váže fragmenty ISRE (interferonový stimulovaný odezvový element) typové DNA, například myší MHCI ISRE, lidský ISG54, a/nebo mutanty ISRE, například ISREml nebo ISREm4 (jejichž sekvence jsou sestaveny dále v tabulce 1). Biologicky aktivní polypeptidy nebo jejich fragmenty také zahrnují ty polypeptidy nebo fragmenty, které mají imunologickou zkříženou reaktivitu s protilátkou (polyklonální nebo monoklonální), která je imunizována a reaguje s celou délkou LSIRF polypeptidu, například LSIRF polypeptidy, sestavené dále na obrázcích 2 a 25.

Zde použitý termín „stabilně transformovaná nebo transfektovaná“ označuje molekulu nukleové kyseliny, která byla vložena do hostitelské buňky a existuje v této hostitelské buňce, bud jako část genomové DNA hostitelské buňky nebo jako nezávislá molekula (například extrachromozomálně), a která je udržována a replikována v mateřské hostitelské buňce tak, že je předávána následujícím generacím této hostitelské buňky.

Termín „syntetická DNA“ označuje molekulu nukleové kyseliny vyrobenou zcela nebo zčásti chemickými syntetickými metodami.

Termín „vektor“ se týká amplifikace molekuly nukleové kyseliny, replikace, a/nebo exprese vektoru v podobě plazmidového nebo virového DNA systému, kde plazmidová nebo virová DNA může být funkční s hostitelskými buňkami bakterií, • · ··· · 9 9 9 · . · · • ···· 9 9 9 9 9 999 99 * 9 9 9 9 99

9999 9 ·· 9 99999 99 kvasinek, bezobratlých, a/nebo savců. Vektor může zůstat nezávislý na genomovou DNA hostitelské buňky nebo se může integrovat zcela nebo zčásti s genomovou DNA . Vektor bude obsahovat všechny nezbytné elementy tak, aby byl funkční v jakékoliv hostitelské buňce, s kterou je kompatibilní. Tyto elementy jsou sestaveny níže.

Vynález poskytuje způsob přípravy LSIRF polypeptidu. Charakteristicky bude tento peptid připravován získáním molekuly nukleové kyseliny kódující tento polypeptid, vložením molekuly této nukleové kyseliny do vhodného vektoru exprese, vložením tohoto vektoru do kompatibilní hostitelské buňky, expresí LSIRF polypeptidu v této hostitelské buňce a čištěním tohoto LSIRF polypeptidu.

1. Příprava DNA kódující LSIRF polypeptidy

Molekula nukleové kyseliny kódující LSIRF může být snadno získána několika postupy, zahrnujícími bez omezení, chemickou syntézu, screening cDNA nebo genomové knihovny, screening knihovny exprese a/nebo PCR amplifikace cDNA. Tyto metody a další vhodné pro izolaci této DNA jsou uvedeny dále, např. Sambrook a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]), Ausubel A kol., eds. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994]), a Berger a Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, vol. 152, Academie Press, lne., San Diego, CA [1987]). Výhodné sekvence nukleových kyselin kódujících LSIRF jsou sekvence savců. Nejvýhodnější sekvence nukleových kyselin kódující LSIRF jsou lidské, krysí a myší.

Chemická syntéza LSIRF molekuly nukleové kyseliny může být uskutečněna použitím dobře známých metod, sestavených dále - Engels a kol. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 [1989]). Tyto metody mezi jiným zahrnují metody fosfotriesterové, fosforamiditové a H-fosfonátové syntézy nukleové kyseliny. Typická molekula nukleové kyseliny kódující celou délku LSIRF polypeptidu bude obsahovat několik stovek párů baží (bp) nebo nukleotidů. Nukleové kyseliny obsahující více než asi 100 nukleotidů mohou být syntetizovány jako několik fragmentů, každý fragment skládající se až ze 100 nukleotidů. Fragmenty pak mohou být spojeny dohromady, jak je níže uvedeno, za vzniku úplné nukleové kyseliny kódující LSIRF polypeptid.

·· ·♦ ·· 99 · · · · ·· ♦ » · · · · · · • » · · · · · · · • · · · · · •« «··· 9 9 9 9

Výhodnou metodou je syntéza na polymemím nosiči, využívající standardní fosforamiditovou chemii.

Jinak může být nukleová kyselina kódující LSIRF polypeptid získána screeningem vhodné cDNA knihovny (tzn. knihovny připravené z jednoho nebo více tkáňových zdrojů, u nichž se předpokládá exprese polypeptidu) nebo genomové knihovny (knihovny připravené z úplné genomové DNA). Typickým zdrojem cDNA knihovny je tkáň z nějakého druhu, u které se předpokládá exprese LSIRF v dostatečném množství (například lymfoidní tkáň). Zdrojem genomové knihovny může být jakákoliv tkáň nebo tkáně z jakéhokoliv savce nebo jiných druhů, u nichž se předpokládá, že v sobě skrývají gen kódující LSIRF nebo jeho homolog. Tato knihovna může být zkoumána na přítomnost LSIRF cDNA genu, použitím jedné nebo více sond nukleové kyseliny (oligonukleotidy, fragmenty cDNA nebo genomové DNA, které mají přijatelnou úroveň homologie mezi LSIRF nebo LSIRF homologem cDNA nebo genem, který má být klonován), který bude selektivně hybridizován LSIRF nebo LSIRF homolog(y)em cDNA nebo gen(y)em, který(é) je(jsou) přítomen(mny) v této knihovně. Typické sondy používané pro takový screening knihovny obvykle kódují malou oblast sekvence LSIRF DNA ze stejných nebo podobných druhů jako jsou druhy, z kterých byla tato knihovna připravena. Jinak mohou být tyto sondy degenerovány, jak je uvedeno níže.

Typický screening knihovny se provádí připojováním oligonukleotidové sekvence nebo cDNA na klony v knihovně, za přesných podmínek, aby se zabránilo nespecifické vazbě, ale umožňují vazbu těch klonů, které jsou vysoce homologní se sondou nebo primerem. Typická hybridizace a přesné vymývací podmínky závisí zčásti na velikosti cDNA (tzn. počtu nukleotidů v řetězci) nebo na oligonukleotidové sondě, a na tom, zdali tato sonda je degenerována. Při navrhování hybridizačního roztoku je rovněž brána v úvahu pravděpodobnost získání klonu(ů) (tzn. zdali je zkoumána cDNA nebo genomová knihovna; v případě, že se jedná o cDNA knihovnu, pravděpodobnost, že cDNA, která nás zajímá, je přítomna ve velkém množství).

Tam, kde jsou použity jako sondy fragmenty DNA (například cDNA), jsou podmínky typické hybridizace uvedeny dále např. v Ausubel a kol., eds., supra. Po hybridizaci je blot obsahující knihovnu promyt za vhodných podmínek závisejících na několika faktorech, například velikost sondy, očekávaná homologie sondy ke klonu, typ knihovny, která je zkoumána, počet zkoumaných klonů a podobně. Příklady ·· • · přesných promývacích roztoků (které mají obvykle nízkou iontovou sílu a jsou používány při relativně vysokých teplotách) jsou uvedeny dále. Jeden takový přesný promývací roztok se skládá z 0,015 M NaCl, 0,005 M citrátu sodného a 0,1 procent SDS při 55°C -65°C. Dalším takovým vymývacím pufrem je 1 mM Na₂EDTA, 40 mM Na₂HPO4, pH 7,2, a 1 procento SDS při asi 40°C -50°C. Jiným promývacím pufrem je 0,2 x SSC a 0,1 procento SDS při asi 50°C -65°C.

Tam, kde jsou použity oligonukleotidové sondy ke screeningu cDNA nebo genomových knihoven, mohou být použity dva protokoly pro přesné promývací podmínky, jak je například dále uvedeno. První protokol používá 6 χ SSC s 0,05 procenty difosforečnanu sodného při teplotě mezi asi 35 °C a 62°C, v závislosti na délce sondy. Například, sondy o velikosti 14 baží jsou promývány při 35°C -40°C, sondy o 17 bazích při 45°C -50°C, sondy o 20 bazích při 52°C -57°C a sondy o 23 bazích při 57°C -63°C. Teplota může být zvýšena o 2°C -3°C tam, kde se objeví vysoké pozadí nespecifické vazby. Druhý protokol používá na promývání tetramethylammonium chlorid (TMAC). Jedním takovým přesným promývacím roztokem je 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0 a 0,2 procenta SDS. Promývací teplota pro použití tohoto roztoku je funkcí délky sondy. Například, sondy o velikosti 17 baží se promývá při 45°C -50°C.

Další vhodnou metodou pro získání nukleové kyseliny kódující LSIRF polypeptid je polymerazová řetězová reakce (PCR). Při této metodě je extrahována poly(A)+RNA nebo celková RNA z tkáně, která exprimuje LSIRF (například lymfoidní tkáň). cDNA je pak připravena z této RNA použitím enzymové reverzní transkriptásy. Pak jsou přidány k cDNA dva primery (oligonukleotidy) komplementární ke dvěma odděleným oblastem LSIRF cDNA spolu $ polymerázou, například Taq polymeráza, a tato polymeráza naamplifikuje cDNA oblast mezi těmito dvěma primery.

Tam, kde metoda výběru pro přípravu nukleové-kyseliny, kódující LSIRF polypeptid, vyžaduje použití oligonukleotidových primerů nebo sond (např. PCR, cDNA nebo sceening genomové knihovny), oligonukleotidové sekvence vybrané jako sondy nebo primery o odpovídající délce a dostatečně definované tak, aby se minimalizovalo množství nespecifické vazby, která se může objevit během screeningu knihovny nebo PCR amplifikace. Skutečná sekvence sond nebo primerů je obvykle založena na konzervativních nebo vysoce homologních sekvencích nebo oblastech z téhož nebo podobného genu jiného organismu. Volitelné mohou být tyto sondy • φ ···· · · ·· • · · · · · · ··· • ····«· · ♦ · e·· ·· • · · · · ·· ·· ·. ·· ···· ·· ·· nebo primery zcela nebo částečně degenerovány, tzn., že mohou obsahovat směs sond/primerů, které všechny kódují tutéž sekvenci aminokyselin, ale dochází k tomu použitím rozdílných kodonů. Alternativou k přípravě degenerovaných sond je nahradit inosin v některé nebo ve všech pozicích těch kodonů, které se liší druhem. Oligonukleotidové sondy nebo primery mohou být připraveny metodami chemické syntézy DNA, jak je výše popsáno.

V rozsahu vynálezu se předpokládají LSIRF mutantní nebo alternativní sekvence. Zde použitá mutantní nebo alternativní sekvence je sekvence, která obsahuje jednu nebo více nukleotidových substitucí, delecí, a/nebo inzercí ve srovnání s původní sekvencí, což má za následek změny v sekvenci aminokyselin ve srovnání s původní sekvencí aminokyselin. V některých případech mohou existovat přirozeně se vyskytující LSIRF aminokyselinové mutanty nebo alternativy v důsledku existence přirozených alelických změn. Takové přirozeně se vyskytující alternativy jsou rovněž v rozsahu vynálezu. Příprava syntetických mutantních sekvencí je dobře známa a je popsána například v Wells a kol. (Gene, 34:315 [1985]), a v Sambrook a kol.., supra.

2. Příprava 5' koncové sekvence LSIRF polypeptidu

Součástí rozsahu vynálezu jsou LSIRF 5' koncové sekvence (také zde označované jako „promotory“) z jakéhokoliv druhu. Promotorem, jak je zde použito, se myslí 5' koncové sekvence LSIRF genu. 5' koncová sekvence může mít různé, transkripční faktor vázající místa a může také obsahovat TATA schránku v poloze asi -30 a CCAAT schránku výše od TATA schránky. Takové 5' koncové sekvence jsou charakterizovány jako přirozené regulující transkripci LSIRF genu in vivo, bud samotné nebo v kombinaci s dalšími faktory jako zesilujícími činidly, represory a podobně (kterýkoliv z nich nebo všechny mohou být velmi distálně umístěny). Výhodné 5' koncové sekvence jsou savčí LSIRF 5' koncové sekvence. Nejvýhodnější jsou lidské LSIRF 5' koncové sekvence.

5' koncové sekvence podle vynálezu mohou být získány z genomových knihoven sceeningem těchto knihoven pomocí cDNA kyselin nebo genomových LSIRF fragmentů, které výhodně hybridizují k 5' části LSIRF genu. Tyto fragmenty mohou hybridizovat ke klonu knihovny, která obsahuje část nebo celou LSIRF 5' koncovou sekvenci, která je obecně umístěna na 5' konci k počátku sekvence kódující LSIRF. Tam, kde identifikovaný klon obsahuje pouze část tohoto promotoru, může být klon *· · ·· ·· ·· ·· · · · · · · · « • 9 · · · · · ··· • ···«· · · · ·'·· · · • · 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 9999 99 99 samotný nebo jeho fragment použit pro následující běhy screeningu genomové knihovny za účelem získání další 5' koncové sekvence. Screening pomocí fragmentů (zahrnující hybridizaci a promývání) může být uskutečněn tak, jak je výše popsáno pro klonování LSIRF genu a/nebo cDNA.

3. Příprava vektoru pro LSIRF expresi

Po klonování byla izolována cDNA nebo gen kódující LSIRF polypeptid nebo jeho fragment. To bylo vloženo do amplifikujícího a/nebo expresního vektoru za účelem zvýšení počtu kopií genu a/nebo exprese polypeptidu ve vhodné hostitelské buňce. Vektorem je často komerčně dostupný vektor, ačkoliv vektory vyrobené na zakázku mohou být také použity. Vektor je vybrán tak, aby byl funkční v určité hostitelské buňce (tzn., že vektor je kompatibilní s aparátem hostitelské buňky, takže může dojít k amplifikaci LSIRF genu a/nebo expresi genu). LSIRF polypeptid nebo jeho fragment může být amplifikován nebo exprimován v prokaryotních, kvasinkových, hmyzích (systémech tyčinkových virů) a/nebo eukaryotních hostitelských buňkách. Výběr hostitelské buňky bude alesoň zčásti záviset na tom, zdali LSIRF polypeptid nebo jeho fragment má být glykosylován. V tom případě jsou výhodné kvasinkové, hmyzí nebo savčí hostitelské buňky; kvasinkové buňky budou glykosylovat polypeptid a hmyzí a savčí buňky mohou glykosylovat a/nebo fosforylovat polypeptid tak, jak se to přirozeně děje u LSIRF polypeptidu (tzn., „přirozená“ glykosylace a/nebo fosfory láce).

Typicky, vektory použité v jakýchkoliv hostitelských buňkách budou obsahovat 5' koncovou sekvenci a další regulační elementy, stejně tak jako zvyšovač(e), počátek replikačního elementu, transkripční terminační element, úplnou intronovou sekvenci obsahující donorové a akceptorové vazebné místo, signální peptidovou sekvenci, ribozom vázající element, polyadenylační sekvenci, polyvazebnou oblast pro inzerci nukleové kyseliny kódující polypeptid, aby se exprimoval, a selektivní značkovací element. Volitelně může vektor obsahovat „tag“ sekvenci, tzn., oligonukleotidovou sekvenci umístěnou na 5' nebo 3' konci sekvence kódující LSIRF, která kóduje polyHis (například hexaHis) nebo další malou imunogenní sekvenci. Tato tag bude exprimována spolu s proteinem a může sloužit jako afinitní tag pro čištění LSIRF polypeptidu z hostitelské buňky. Volitelně může být tato tag následné odstraněna z • · · · · ·· · * · · · · · · ···· · · · · přečištěného LSIRF polypeptidu různými prostředky, například použitím vybrané peptidázy.

A. 5' koncový sekvenční element

5' koncová sekvence může být homologní (tzn., ze stejných druhů a/nebo kmenu jako je hostitelská buňka), heterologní (tzn., z jiných druhů než jsou druhy nebo kmen hostitelské buňky), hybridní (tzn., kombinace p5' koncových sekvencí z více než jednoho zdroje), syntetická nebo to může být nativní LSIRF 5' koncová sekvence. Jako takový může být zdrojem 5' koncové sekvence jakýkoliv jednobuněčný prokaryotní nebo eukaryotní organismus, jakýkoliv organismus obratlých nebo bezobratlých nebo jakákoliv rostlina za předpokladu, že 5' koncová sekvence je funkční a může být aktivována aparátem hostitelské buňky.

5' koncové sekvence použitelné ve vektorech podle vynálezu mohou být získány kteroukoliv z několika dobře známých metod ve stavu techniky. Typicky zde užitečné 5' koncové sekvence jiné než LSIRF 5' koncové sekvence budou identifikovány drive mapováním a/nebo štěpením restrikčními endonukleázami a mohou být proto izolovány z vhodného tkáňového zdroje použitím vhodných restrikčních endonukleáz. V některých případech může být celá nukleotidová sekvence 5' koncové sekvence známa. 5' sekvence zde může být syntetizována použitím výše popsaných metod pro syntézu nukleové kyseliny nebo klonování.

Tam, kde je známa celá 5' koncová sekvence nebo pouze její části může být získána použitím PCR a/nebo screeningem genomové knihovny s vhodným oligonukleotidem a/nebo s fragment 5' koncové sekvence z téhož nebo jiného druhu.

Tam, kde 5' koncová sekvence není známa, může být fragment DNA obsahující nějakou 5' koncovou sekvenci izolován z delší části DNA, která může například obsahovat kódující sekvenci nebo dokonce další gen nebo geny. Izolace může být uskutečněna štěpením restrikčními endonukleázami za použití jednoho nebo více pečlivě vybraných enzymů, aby se vyiizoloval správný fragmentu DNA. Po štěpení může být požadovaný fragment izolován čištěním na agarosovém gelu, Qiagen® koloně nebo jinými metodami, které jsou známé odborníkům v dané oblasti. Výběr vhodných enzymů k uskutečnění tohoto úkolu bude odborníkům v dané oblasti zcela zřejmý.

B. Ppčátek reRlj^čního fllpfpentu

Tato komponenta je typickou součástí prokaryotních vektorů exprese komerčně prodávaných a pomůckou při amplifikaci vektoru v hostitelské buňce. Amplifikace vektoru na určitý počet kppií může být v některých případech důležitá pro optimální expresi LSIRF polypeptidu. Jestliže vybraný vektor neobsahuje počátek replikačního místa, může být chemicky syntetizován na základě známé sekvence a vložen do vektoru.

C. Transkripční t^rminační element

Tento element je typicky umístěn 3' koncem k sekvenci kódující LSIRF polypeptid a slouží k ukončení transkripce LSIRF polypeptidu. Transkripční terminační element se obvyklo nachází v prokaryotních buňkách jako fragment bohatý na G-C, následovaný sekvencí polyT. Zatímco je element snadno klonován z knihovny nebo se dokonce komerčně prodáván jako část vektoru, může být také snadno syntetizován použitím metod pr° syntézu nukleových kyselin, například těch, které jsou popsány výše.

D. Element selektivních markeruíů)

Geny selektivního markéru kódují proteiny nezbytné pro přežití a růst hostitelské buňky v selektjním mediu kultury. Typické geny selektivních markérů kódují proteiny, které (a) vykazují odolnost vůči antibiotikům nebo jiným toxinům, například ampicilinu, tetrpcyfdinu nebo kanamycinu pro prokaryotní hostitelské buňky, (b) doplňují auxotrofní nedostatky buňky; nebo (c) zásobují kritickými živinami nedostupnými z komplexního média. Výhodnými selektivními markéry jsou kanamycinový rezistentní gen, ampicilinový rezistentní gen a tetrecyklinový rezistentní gen.

* E. Ribozom vázající element

Tento element běžné nazývaný sekvence Shine-Dalgamo (u prokaryot) nebo ^w Kozák sekvence (u eukaryot), je nezbytný pro iniciaci translace m-RNA. Tento element je typicky umístěn 3' koncem k promotoru a 5' koncem ke kódující sekvenci polypeptidu, který má být syntetizován. Shine-Dalgamo sekvence se liší, ale jedná se o typický polypurin (tzn., že má vysoký obsah A-G). Bylo identifikováno mnoho ·· 99

9

99

9 9 9· · • · · 9 9 9 ··

9 9 9 9 99

9999 9 9 9 9 9 999 99 ' 9 9 9 9 9 9'·

9999 9 99 9999 9999

Shine-Dalgamo sekvencí, každá z nich může být snadno syntetizována použitím metod vyložených výše.

Všechny elementy vyložené výše, stejné jako jiné užitečné v tomto vynálezu, jsou odborníkům v dané oblasti dobře známy a jsou popsány např. v (Sambrook a kol (Molecular Cloniňg: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY [1989] and Bergera kol.., eds. (Guide to Molecular Cloning techniques, Academie press, lne., San Diego, CA [1987]).

F, Signální sekvenční element

Pro ta provedení podle vynálezu, kde má být vyměšován transgen, je často přítomna signální sekvence, aby řídila polypeptid kódovaný transgenem mimo buňku, kde je syntetizován. Typicky se signální sekvence nachází v kódující oblasti transgenu blízko nebo na 5'konci kódující oblasti. Bylo identifikováno mnoho signálních sekvencí a jakákoliv z nich, která je v.transgenní tkáni funkční, může být použita ve spojení s tímto transgenem. Proto signální sekvence mohou být homologní nebo heterologní k transgenu a mohou být homologní nebo heterologní k transgennímu savci. Dále signální sekvence může být chemicky syntetizována použitím metod vyložených výše. Avšak, pro účely zde uvedené, jsou výhodnými signálními sekvencemi ty, které se s transgenem vyskytují přirozeně (tzn., jsou homologní k tomuto transgenu).

G. Intronovv element

V mnoha případech je transkripce transgenu zvyšována přítomností jednoho nebo více intronů na vektoru. Intron se může v sekvenci transgenu přirozeně vyskytovat zvláště tam, kde transgen je v celé délce nebo kde je fragmentem genomové DNA sekvence. Tam, kde se intron v DNA sekvenci přirozeně nevyskytuje (jako u většiny cDNA), intron (y) může být získán z jiného zdroje. Intron může být homologní nebo heterologní k transgenu a/nebo k transgennímu savci. Pozice intronu, s ohledem na promotor a transgen, je důležitá, protože aby byl účinný, musí být intron transkribován. Kde je transgen cDNA sekvencí, výhodnou pozicí pro intron je pozice 3' konce na transkripčním startovacím místě a 5' konce na polyA transkripční terminační sekvenci. Výhodně pro cDNA transgeny bude intron umístěn na jedné nebo druhé straně transgenní sekvence (tzn., 5'-konci nebo 3'-konci) , tj. takové, která ·· *· ·« ···· ·· • · · · * · · ♦ »♦ • · · · · · ·· ·· • ··««·· · · · ····· • ”· · · ♦ · ·>

···· · ·· ······ 4· nepřeruší transgenovou sekvenci. K provedení vynálezu může být použit jakýkoliv intron z jakéhokoliv zdroje, včetně jakýchkoliv virových, prokaryontních a eukaryontních (rostlina nebo zvíře) organismů za předpokladu, že je kompatibilní s hostitelskou buňkou (-ami), do které je vložen. Jsou zde rovněž zahrnuty syntetické introny. Volitelně může být ve vektoru použit více než jeden intron.

H. Konstrukce vektorů

Tam, kde ve vektoru není dosud přítomen jeden nebo více elementů, vyložených výše, který má být použit, může být jednotlivě získán a na vektor navázán. Metody použité pro získání každého z těchto elementů jsou odborníkům v dané oblasti dobře známy a jsou srovnatelné s metodami vyloženými výše (tzn. syntézy DNA, screening knihoven a pod.).

Konečné vektory použité k uskutečnění vynálezu jsou typicky sestaveny z počátečních vektorů, například komerčně dostupný vektor. Tento vektor může nebo nemusí obsahovat některé z elementů. Jestliže žádný z požadovaných elementů není přítomen v počátečním vektoru, každý z elementů může být individuálně navázán na tento vektor rozštěpením vektoru vhodnou restrikční endonukleázou (ami), takže konce elementu, které mají být navázány a konce vektoru jsou kompatibilní. V některých případech může být nezbytné „otupit“ konce, které mají být svázány, aby se dosáhlo uspokojivého navázání. Otupení je uskutečněno prvním vyplněním „spojovacích konců“ užitím Klenow DNA polymerázy nebo T4 DNA polymerázy v přítomnosti všech čtyř nukleotidů. Tento postup je ve stavu techniky dobře znám a je popsán například Sambrookem a kol. supra.

Případně, mají-li být dva nebo více elementů vloženy do vektoru, mohou se nejdříve svázat dohromady (pokud mají být umístěny vedle sebe) a pak navázány na vektor. .

Další metodou pro konstrukci vektoru je provést všechna navázání různých elementů současně v jedné reakční směsi. Při této metodě se v důsledku nevhodných navázání nebo inzerce těchto elementů vytvoří mnoho nesmyslných a nefunkčních vektorů, avšak funkční vektor může být identifikován a vybrán pomocí štěpení restrikčními endonukleázami.

Výhodnými vektory pro uskutečnění vynálezu jsou ty, které jsou kompatibilní s bakteriálními, hmyzími a savčími hostitelskými buňkami. Takové vektory mezi ji99 9 nými zahrnují pCRII (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSH (Stratagene Company, LaJolla, CA) a pETL (BlueBacll; Invitrogen).

Poté, co' byl vektor sestaven a na vhodné místo vektoru byla vložena LSIRF nukleová kyselina, může být tento úplný vektor vložen do vhodné hostitelské buňky pro amplifikaci a/nebo expresi LSIRF polypeptidu. Typicky používané hostitelské buňky zahrnují bez omezení prokaryotní buňky, například gramnegativní nebo grampozitivní buňky, to je jakýkoliv kmen E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Salmonella, a podobně; eukaryotní buňky, například CHO buňky ( z vaječníku čínského křečka), 293 buňky lidské ledviny, COS-7 buňky; hmyzí buňky, například Sf4, Sf5, Sf9 a Sf21 a High 5 (všechny od Invitrogen Company, San Diego, CA); a různé kvasinkové buňky, například Saccharomyces a Pichia.

Inzerce (také označovaná jako „transformace“ nebo „transfekce“) vektoru do vybrané hostitelské buňky může být uskutečněna použitím takových metod, například chloridem vápenatým, elektroporací, mikroinjekcí, lipofekcí nebo DEAEdextranovou metodou. Vybraná metoda bude z části záviset na typu hostitelské buňky, která má být použita. Tyto metody a další vhodné metody jsou dobře známy ve stavu techniky a jsou vyloženy výše, např. v Sambrook a kol.., supra.

Hostitelské buňky obsahující vektor (to je transformovaný nebo transfektovaný) mohou být kultivovány za použití standardního média dobře známého odborníkovi v dané oblasti. Médium bude obvykle obsahovat všechny živiny nutné pro růst a přežití buněk. Vhodnými médii pro kultivování buněk E. coli jsou například Luria bu¹ jón (LB) a/nebo Terrific bujón (TB). Vhodnými médii pro kultivování eukaryotních buněk jsou RPMI 1640, MEM, DMEM, všechny tyto mohou být doplněny sérem a/nebo nůstovými faktory podle požadavku kultivování jednotlivých buněčných linií. Vhodným médiem pro hmyzí kultury je Graceho médium doplněné v případě potřeby kvasinkami, hydrolyzátemjaktalbuminu a/nebo zárodečným telecím sérem.

Jako doplněk k tomuto médiu je typicky přidáno antibiotikum nebo jiná sloučenina užitečná pro selektivní růst transformovaných buněk. Sloučenina, která má být užita, se určí elementem selektivního markéru přítomným v plazmidu, se kterým byla hostitelská buňka transformována. Například tam, kde selektivním markerový elementem je rezistence vůči kanamycinu. Sloučenina, která se přidá do kultivačního média bude kanamycin.

*· · ·· ·· ·· ·· • ♦ « · · · · · · ♦ • · · · · · ···· • ···♦♦· · · · >··· » · • · ··· ·· · ··· · ·· ···· .·· ··

4. Vyhodnocení exprese

Množství LSIRF polypeptidu produkovaného v hostitelské buňce může být vyhodnoceno použitím známých standardních metod. Tyto metody zahrnují bez omezení, analýzu Western blotu, elektroforézu na SDS-polyakrylamidovém gelu, nedenaturující gelovóu elektroforézu, HPLC dělení, imunoprecipitace a/nebo zkoušky aktivity, například jako jsou DNA vazebné detekce na gelu.

5. Čištění LSIRF polypeptidu

Jestliže záměrem byla sekrece LSIRF polypeptidu z hostitelských buněk, pak bude pravděpodobné, že většina polypeptidu se bude nacházet v kultivační půdě buněk. Avšak v případě, kdy LSIRF polypeptid nebude vyměšován z hostitelských buněk, pak bude přítomen v cytoplasmě (pro eukaryontní, grampositivní bakteriální a hmyzí hostitelské buňky) nebo v periplasmě (pro gramnegativní bakteriální hostitelské buňky).

V případě vnitrobuněčného LSIRF jsou hostitelské buňky nejdříve mechanicky nebo osmoticky rozrušeny, aby se obsah cytoplasmy uvolnil do pufru. LSIRF polypeptid je pak izolován z tohoto roztoku.

Čištění LSIRF polypeptidu z roztoku může být uskutečněno použitím různých technik. Jestliže byl polypeptid syntetizován tak, že obsahuje tag, například Hexahistidin (LSIRF/hexaHis) nebo jiný malý peptid na jeho karboxylovém nebo aminovém konci, může být v podstatě čištěn jednostupňovým procesem tak, že se roztok nechá projít afinitní kolonou, kde matrice v koloně má vysokou afinitu k tag nebo přímo k polypeptidu (tzn., monoklonální protilátka specificky rozpoznávající LSIRF). Například, polyhistidin se váže s velkou afinitou a specifitou na nikl, tudíž afinitní niklová kolona (například Qiagen niklové kolony) může být použita pro čištění LSIRF/polyHis. (Viz.-například, Ausubel a kol., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10. 11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).

Tam, kde LSIRF polypeptid nemá dostupnou žádnou tag a nejsou dostupné žádné protilátky, mohou být pro čištění použity jiné dobře známé postupy. Tyto postupy zahrnují bez omezení, iontoměničovou chromatografii, molekulární síťovou chromatografii, HPLC, nativní gelovou elektroforézu v kombinaci s gelovou elucí a preparativní izoelektrickou fokusaci („Isoprime“ machine/technique, Hoefer Scientific). V některých případech mohou být kombinovány dvě nebo více těchto technik k ·· • · · · * · · ···· ··· ·· · · · ·· • ···· · · · · '· ··· · · • · · · · · · ♦ ···· · ♦ · ···· ·· ·· dosažení zvýšené čistoty. Výhodné čistící metody zahrnují polyhistidinové značení a iontoměničovou chromatografi i v kombinaci s preparativní izoelektrickou fokusací.

Jestliže se předpokládá, že LSIRF polypeptid bude nalezen hlavně v periplasmickém prostoru bakterie nebo v cytoplasmě eukaryontních buněk, pak obsahy periplasmy nebo cytoplasmy včetně inkluzních tělísek (bakterií), pokud zpracovávané polypeptidy utvořily takové komplexy, mohou být extrahovány z hostitelské buňky použitím jakékoliv známé standardní techniky. Například, hostitelské buňky mohou být rozštěpeny za účelem uvolnění obsahu periplasmy francouzským lisováním, homogenizací a/nebo sonikací. Homogenát pak může být odstředěn.

Jestliže LSIRF polypeptid vytvořil inkluzní tělíska v periplasmě, mohou se tato inkluzní tělíska často vázat na vnitřní a/nebo vnější buněčné membrány a tudíž mohou být nalezeny hlavně v hrudkovitém materiálu po odstředění. Na tento hrudkovitý materiál se pak může působit chaotropním činidlem, například guanidinem nebo močovinou s cílem uvolnit, oddělit a solubilizovat inkluzní tělíska. LSIRF polypeptid, nyní ve své rozpustné formě, pak může být analyzován gelovou elektroforezou, imunosrážením a podobné. Jestliže je požadována izolace LSIRF polypeptidu, pak tato izolace může být provedena použitím standardních metod jako jsou ty uvedené níže a v Marston etal. (Meth. Enz., 182:264-275 [1990]).

Jestliže LSIRF polypeptidová inkluzní tělíska nejsou vytvořena v podstatné míře v periplasmě hostitelské buňky, pak se po odstředění buněčného homogenátu bude LSIRF polypeptid zejména nacházet v supematantu a LSIRF polypeptid může být ze supematantu izolován metodami, které jsou uvedeny níže.

V těch případech, kdy je upřednostňována částečná nebo úplná izolace LSIRF polypeptidu, může být čištění uskutečněno použitím standardních metod známých odborníkům v dané oblasti. Tyto metody zahrnují bez omezení separace elektroforezou, následované elektroelucí, různé typy chromatografie (imunoafinitní, molekulární síťová a/nebo iontoměničová), a/nebo vysoko účinná kapalinová chromatografie. V některých případech může být výhodné použití více než jedné z těchto metod pro úplné přečištění.

Termín „substance“ zde použitý označuje látky užitečné při inhibici buď transkripce LSIRF genu, translace LSIRF m-RNA nebo aktivity LSIRF polypeptidu.

Termín „terapeuticky účinný“ označuje množství substance, které je potřebné k dosažení požadované fyziologické odpovědi, tj. k potlačení aktivace lymfocytů jako ·· · ·* ···· ·· • · · · · · · · ·· · • · · · · · · ··· • ···· · · · · · ···· · • · · · ···· ···· · ·· ♦ ····· ·· odezvy k antigennímu stimulu nebo autoimunní odpovědi, nebo ke zvýšení počtu lymfocytů ke stimulaci imunní odpovědi k antigenním stimulům.

Termín „antigenní stimul“ označuje látku, která se buď přirozeně nalézá u savců (endogenní) a vyvolává některé aspekty imunní odezvy, nebo je z exogenního zdroje a napadá savčí systém a vyvolává některé aspekty imunní odpovědi.

Kompozice užitečné pro aplikaci metod tohoto vynálezu mohou být připraveny podle standardních metod dobře známých odborníkům z dané oblasti.

Terapeutické Anti-LSIRF protilátky

Polyklonální nebo monoklonální terapeutické anti-LSIRF protilátky užitečné při aplikaci vynálezu mohou být připraveny v laboratorních zvířatech nebo rekombinantními DNA technikami užívající následující metody. Polyklonální protilátky k LSIRF molekule nebo jejímu fragmentu, obsahující cílenou aminokyselinovou sekvenci, jsou obecné vyvolávány u zvířat mnohonásobnými podkožními (sc) nebo intraperitoneálními (ip) injekcemi LSIRF molekuly v kombinaci s adjuvans, například Freundovo adjuvans (úplné nebo neúplné). Ke zvýšení imunogenicity může být užitečné nejdříve konjugovat LSIRF molekulu nebo fragment obsahující cílenou aminokyselinovou sekvenci s proteinem, který je imunogenní v druzích, které mají být imunizovány, například, hemocyanin kuželnatky, sérový albumin,, hovězí tyreoglobulin nebo sojový trypsinový inhibitor za současného užiti bifunkčního nebo derivatizačního činidla, například, maleimidobenzoyl ester sulfosukcinimidu (konjugace přes cysteinové zbytky), N-hydroxysukcinimid (přes lysinové zbytky), glutaraldehyd, sukcinanhydrid, SOCI₂ nebo R¹N=C=NR, kde R a R¹ jsou rozdílné alkyl skupiny. Případně mohou být LSIRF-imunogenní konjugáty produkovány rekombinantně jako fúzní proteiny.

Zvířata jsou imunizována proti jmunogenním LSIRF konjugátům nebo derivátům (například fragmentem obsahujícím cílenou aminokyselinovou sekvenci) spojením asi 1 mg nebo asi 1 pg konjugátu (pro králíky nebo myši) s asi 3 objemy Freundova úplného adjuvans a očkováním tohoto roztoku intradermálně na více místech. Přibližné po 7 až 14 dnech jsou zvířata vykrvácena a v séru se stanoví anti-LSIRF titr. Zvířata jsou opakované očkovány antigenem až na hladinu titru. S výhodou je zvíře očkováno stejnou LSIRF molekulou nebo jejím fragmentem, která byla použita pro počáteční imunizaci, ale konjugována k jinému proteinu a/nebo pres jiné síťovací ·· · ·· ·· ·· ·· • · · · · · · ···«

IQ ······♦··· ········ ······· • · · · · 9 9 · • 999 · ·· ···· ·· 99 činidlo. Dále jsou používána agregační činidla, například kamenec v injekcích ke zvýšení imunní odpovědi.

Monoklonální protilátky mohou být připraveny izolováním buněk sleziny z imunizovaných zvířat a zvěčněním těchto buněk běžným způsobem, například, fúzí s buňkami myelomu. Tyto klony jsou pak zkoumány na ty, které exprimují požadovanou protilátku. Monoklonální protilátka s výhodou křížově nereaguje s dalšími LSIRF polypeptidy nebo izoformami LSIRF polypeptidu.

Příprava protilátek užívající rekombinantních DNA metod, například fágová metoda zobrazení, může být uskutečněna použitím komerčně dostupných souprav, například rekombinantní fágový protilátkový systém dostupný od Pharmacia (Uppsala, Sweden), nebo SurfZAP™ fagový zobrazovací systém (Stratagene lne., La Jolla, CA).

S výhodou protilátky pro podávání lidem, ačkoliv připravené v laboratorním zvířeti například myši, budou „polidštěné“ nebo chimémí, tzn., vytvořené tak, aby byly kompatibilní s lidským imunitním systémem tak, že si lidský pacient nevytvoří imunitní odpověď na tuto protilátku. Dokonce jsou lidské protilátky, které nyní mohou být připraveny použitím metod popsaných například v Lonberg a kol. (Nátuře Genetics, 7: 13-21 [1994]), upřednostňovány pro terapeutické podávání pacientům.

Protilátky produkované použitím kterékoliv z výše popsaných metod, mohou být konjugovány k látkám, které jsou schopny pronikat buněčnou membránou a jadernou membránou za účelem transportu protilátky do jádra, za použití například, do jádra zaměřeného signálu jako je ten, který se nalézá na fosforylované formě LSIRF.

Terapeutické kompozice a podávání

Terapeutické složení kompozic užitečné pro provedení vynálezu jako jsou LSIRF protilátky, mohou být připraveny pro skladování smícháním vybrané kompozice mající požadovaný stupeň čistoty s volitelnými fyziologicky přijatelnými nosiči, vehikuly nebo stabilizátory (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company [1990]) ve formě lyofilizovaného koláče nebo vodného roztoku. Přijatelné nosiče, vehikuly nebo stabilizátory jsou netoxické k příjemcům a jsou s výhodou inertní v používaných dávkách a koncentracích a zahrnují pufry, například fosfát, citrát nebo další organické kyseliny; antioxidanty, například kyselina askorbová; nízkomolekulámí polypeptidy; proteiny, například sérový

444 · · · 4 ··· • ······ 4 « · ·* 4 4· · 4 4 · ·* • 4 * «4 · · · · 4 4 ·* albumin, želatina nebo imunoglobuliny; hydrofilní polymery, například polyvinylpyrolidon; aminokyseliny například glycin, glutamin, asparagin, arginin nebo lysin; monosacharidy, disacharidy a další sacharidy, zahrnující glukosu, manosu nebo dextriny; chelatující činidla, například ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA); cukerné alkoholy, například manitol nebo sorbitol; solitvomé protiionty například sodík; a/nebo neiontové povrchově aktivní látky, například Tween, Pluronics nebo polyethylenglykol (PEG).

Kompozice, která má být použita pro podávání in vivo musí být sterilní. Toto je snadno proveditelné filtrací přes sterilní filtrační membrány, před nebo po lyofilizaci a rekonstituci. Kompozice pro parenterální podávání bude normálně skladována v lyofilizované formě nebo v roztoku.

Terapeutické kompozice jsou obecně umístěny v zásobníku majícím sterilní vstupní otvor, například, sáček pro vnitrožilní roztok nebo ampulka, mající uzávěr proniknutelný podkožní injekční jehlou.

Cesta podávání směsi je v souladu se známými metodami, například, orální, injekce nebo infúze vnitrožilními, intraperitoneálními, intracerebrálními, intramuskulámími, intraokulámími, intraarteriálními nebo intralesionálními cestami nebo trvalými uvolňovacími systémy nebo implantačním zařízením. Podle požadavku mohou být kompozice podávány kontinuálně infuzí, injekcí bolusu nebo implantačním zařízením.

Vhodné příklady trvale uvolňujících přípravků zahrnují semipermeabilní polymemí matrice v podobě tvarovaných položek, například, filmů nebo mikrokapslí. Trvale uvolňující matrice zahrnují polyestery, hydrogely, polyláktidy (U.S. 3,773,919, EP 58,481), kopolymery kyseliny L-glutamové a gamma ethyl-L-glutamatu (Sidman a kol., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), póly (2-hydroxyethyl-methakrylat) (Langer a kol.., J. Biomed. Mater, Res., 15: 167-277 [1981] and Langer, Chem. Těch., 12: 98105 [1982]), ethylenvinylacetat (Langer a kol., supra) nebo kyselinu poly-D(-)-3hydroxymáselnou (EP 133,988). Trvale uvolňující kompozice mohou také zahrnovat liposomy, které mohou být připraveny některou z metod známých ve stavu techniky (například, DE 3,218,121; Epstein a kol., Proč. Nati. Acad.Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985]; Hwang a kol.., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 [1980]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949).

·· ·

Účinné množství kompozic používaných terapeuticky bude například záviset na terapeutickém účelu, způsobu podání a pacientově kondici. Podle toho bude muset terapeut stanovit dávku a upravit způsob podání tak, aby se získal optimální terapeutický účinek. Typická denní dávka může být v rozsahu od asi 1 pg/kg do 100 mg/kg či více, v závislosti na výše uvedených faktorech. Typicky bude terapeut podávat směs tak dlouho, dokud dávka nedosáhne množství, které zabezpečí požadovaný účinek. Vývoj této terapie lze snadno monitorovat konvenčními zkouškami k vyhodnocování.

Molekuly LSIRF nukleové kyseliny, 5' koncové sekvence, polypeptidů a protilátek podle vynálezu mají rozmanité použití, které je zcela zřejmé odborníkům v dané oblasti.

LSIRF polypeptidy budou sloužit jako cíle pro terapeutické látky používané pro regulaci lymfocitní aktivace. Zablokováním buď exprese LSIRF genu (snížením LSIRF transkripce nebo translace) nebo aktivity LSIRF polypeptidů je možné potlačit lymfocitní aktivaci jako odpověď na určité stimuly prostředí. Zvýšením úrovně exprese LSIRF genu (regulací LSIRF 5' koncové sekvence) je možno stimulovat lymfocitní aktivaci a proliferaci, a tím zvyšovat imunní odpověď na určité antigeny.

Protilátky podle vynálezu mohou být polyklonální nebo monoklonální a mohou být vyvolány proti LSIRF z jakéhokoliv savce. Tyto protilátky mohou být použity k posouzení přítomnosti a/nebo množství LSIRF polypeptidů v dané tkáni nebo biologickém vzorku. Navíc mohou být použity k blokování aktivity LSIRF navázáním na aktivní místo tohoto polypeptidů. Proto, protilátky samotné mohou naleznout použití jako terapeutické látky ke snížení hladiny LSIRF polypeptidů.

Vynález může být snadněji pochopen pomocí odkazů na následující příklady. Tyto příklady by v žádném případě neměly být chápány jako limitující rozsah vynálezu. - —........

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování cDNA myší LSIRF

Dva PCR (polymerasová řetězová reakce) částečné degenerované primery byly použity pro PCR amplifikaci cDNA, připravené z úplné RNA, získané z tkáně sleziny C57B1/6 myši. Použité primery byly:

··

ATCCTGGAACACGC (SEQ ID N0:5)

GCACACGAACTGCCTTCCA (SEQ ID N0:6)

Primer č. 5 obsahoval tři inosinové báze, které se nacházely mezi nukleotidy 2 a 3 (T a C), nukleotidy 4 a 5 (C a T) a nukleotidy 9 a 10 (A a C). Primer č. 6 obsahoval čtyři inosinové báze v sekvenci, nacházely se mezi nukleotidy 5 a 6 (A a C), nukleotidy 7 a 8 (G a A), nukleotidy 9 a 10 (A a C) a nukleotidy 11 a 12 (T a G).

PCR byla provedena na programovatelném tepelném cykléru (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) v 50 μΙ PCR pufru (10mM Tris-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCh, a 50 mM KCI) obsahujícím 200 μΜ dNTPs, 2 U Taq polymerasu a 100 pM každého příměru. Třicet cyklů PCR bylo uskutečněno v následujícím teplotním režimu: 94°C po dobu 60 sekund; 37°C po dobu 60 sekund; a 72°C po dobu 60 sekund. PCR produkty byly následně vloženy přímo do pCRII plazmidu za použití TA-klonovacího systému (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Plazmidy obsahující inserty produktové PCR byly transformovány do příslušného kmenu E. coli INV-alpha F' (Invitrogen Corp.) pro amplifikaci. Plazmidová DNA z těchto hostitelských buněk byla připravena použitím standardní alkalické lýzové metody (Sambrook a kol., Supra) a plazmidová DNA pak byla podrobena elektroforéze na přibližně 1,5 procentním agarosovém gelu. Část DNA byla blotována na Hybond-N membránový papír (Amersham, Oakville, Ontario, Kanada) a hybridizována náhodně vzniklými ³²P značenými DNA fragmenty myších IRF-1 a IRF-2 použitím návodu podle výrobce (Amersham). Plazmidová DNA z klonů, které nehybridizovaly se žádným z fragmentů IRF-1 ani IRF-2, byla sekvenována použitím soupravy US Bioscience Sequenase (US Bioscience, Cleveland, Ohio). Jeden klon, „Spi 5“, obsahoval novou nukleotidovou sekvenci, která byla určena z průzkumu v genové bance. Tento klon byl náhodně označen ³²P (Amersham postup) a pak byl použit k pozorování myší IL-4 indukované slezinové cDNA knihovny (Clonetech, Palo Alto, CA). Po hybridizaci byly filtry obsahující klony cDNA knihovny promývány nejprve 1 krát SSC a 0,1 procentním SDS po dobu asi 30 minut při asi 65°C, a pak 0,2 krát SSC a 0,1 procentním SDS po dobu asi 30 minut při asi 65°C. Byly získány dva LSIRF cDNA klony bez ATG startovacího kodonu. Jeden z těchto klonů, „C13“, byl použit k opětovnému sceeningu téže knihovny za výtěžku přibližně 5 kb klonu „C16“, který také postrádal 5' sekvenci. Klon C16 byl pak použit ke sce• * · • · eningu λΖΑΡΙΙ myší slezinové cDNA knihovny (Stratagene, La Jolla, CA) a bylo získáno několik částečných klonů se zdánlivým ATG startovacím kodonem. Úplná cDNA sekvence obsahující celou kódující LSIRF oblast byla získána vytvořením umělého klonu za použití PCR s 5' rozšířeným primerem . Tento klon byl vložen do vektoru pBSlI, aby se vytvořil plazmid PV-I a byla ověřena sekvence LSIRF.

Byla získána předpovídaná aminokyselinová sekvence pro každý z částečných cDNA klonů a některé z těchto klonů obsahovaly navíc glutamin v místě aminokyseliny 164. Úplná délka cDNA sekvence PV-I , která je asi 1,4 kb, je uvedena na obrázku 1. PV-I cDNA obsahuje navíc glutamin v místě aminokyseliny 164. Předpovídaná celá délka aminokyselinové sekvence pro LSIRF, založená na LSIRF cDNA sekvenci, je uedena na obrázku 2.

Příklad 2 . Genomové klonování myší LSIRF

Přibližné 630 bp část klonu C16 LSIRF cDNA byla amplifikována PCR použitím následujících matric:

CAGCCCGGGGTACTTGCCGCTGTC (SEQ ID NO:7)

AGACCTTATGCTTGGCTCAATGGG (SEQ ID NO:8)

PCR podmínky byly 94°C po dobu jedné minuty a 72°C po dobu 30 sekund.

Získaný PCR fragment byl čištěn elektroforézou na 1 procentním agarosovém gelu, s následným průchodem přes Spin-X kolonu (CoStar Corp., Cambridge, MA). Tento fragment byl pak označen ³²P za použití techniky náhodného značení (Amersham) a následně užit ke screeningu genomové knihovny připravené z ledvinové tkáně 129/J myši. Několik klonů bylo získáno promýváním při 65 °C v 0,1 x SSC a 0,1 procentním SDS. Dva z těchto klonů (velikost 12 a 15 kb) byly subklonovány do vektor pBSlI (Stratagene, La Jolla, CA) pro sekvenování. Tyto klony obsahovaly překrývající sekvenci dovolující identifikaci asi 2 kb 5'koncové sekvence. 5' koncové sekvence je uvedeny na obrázku 3. Genomová sekvence obsahující exony a introny myšího LSIRF genu je uvedeny na obrázku 4 a místa, které v sekvenci nesouhlasí v důsledku sekvenční neurčitosti jsou vyznačeny jako „R“ pro A nebo G, „S“ pro G nebo C, „M“ pro A nebo C a „K“ pro T nebo G. Tyto nejednoznačné místa jsou:

·· · · · · ···· • · · · · · · · ·Ο ······ · · e ··· · 9 • · · · · · · • · · · ···· ·· 9·

Μ na nukleotidech 748, 4159, 7413, a 10357;

R na nukleotidech 5277, 5310, 10564, a 11713;

K na nukleotidech 4513, 5885, a 9812;

S na nukleotidu 6425.

Všechny nejednoznačné místa jsou u intronů, tudíž neovlivňují aktuální nukleotidovou sekvenci exonú, která zahrnuje kódující oblast LSIRF.

Nukleotidové (cDNA a genomové) sekvence a odvozené aminokyselinové sekvence LSIRF byly porovnány se všemi sekvencemi databází v GenBank a SwissProt, a žádné identické sekvence nebyly nalezeny. Avšak, amino konec sekvence LSIRF byl homologní s dalšími členy IRF skupiny. Největší homologie byla s polypeptidem ICSBP (sekvenční vazebný protein shodný s interferonem), který sdílí 83 procent homologie (přípustné pro jednu aminokyselinovou mezeru) s LSIRF na amino konci.

Příklad 3

Exprese myšího LSIRF

LSIRF celková délka cDNA sekvence byla vyštěpena z plazmidu PV-1 pomocí Eco R! restrikčního štěpení. LSIRF gen byl izolován z 0,7% agarosového gelu po elektroforéze, tupě zakončen použitím Klenow DNA polymerázy a navázán na Nhel místo plazmidu pETL (BlueBacll, Invitrogen Company), aby se vytvořil plazmid pETL-LSIRF. Plazmid byl amplifikován v buňkách E.coli kmene DH5-alfa (vyrůstal v přítomnosti ampicillinu) použitím standardních kultivačních metod a podmínek. Čištěný plazmid obsahující LSIRF gen vhodné orientace (jak bylo určeno mapováním pomocí restrikčního endonukleázového štěpení s EcoRI, HindlII nebo Pvull) byl přenesen do Sf9 hmyzích buněk (dostupných od Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD USA) spolu s linearizovanou genomovou DNA baculoviru (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) a tyto buňky byly inkubovány po dobu 48 hodin při asi 28 °C v Graceově médiu doplněném kvasinkami, hydrolyzátem laktalbuminu a 10 procentním fetálním telecím sérem.

Po inkubaci byly získány buňky a byly provedeny plakové zkoušky (Richardson, ed., Meth. Mol. Biol., vol 39: Baculovirus Expression Protocols, Humana Press, Totowa, NJ [1995] v přítomnosti Bluo-gal (Gibco-BRL, Grand Island, NY,

ΦΦΦ · φ ·· ·· ·· • · · · · · « · · φ • · φ φφ · φφφφ

Λ ······ « 6' Φ ΦΦΦΦ Φ • · · Φ Φ ΦΦΦ «φφφ · Φ· ΦΦΦΦ ΦΦ ·Φ

USA) za účelem izolace rekombinantního viru. Modré rekombinantní plaky byly vybrány po 5 až 7 dnech kultivování a tyto plaky byly amplifikovány v 24 jamkových mikrotitračních destičkách obsahujících Sf9 buňky. Další amplifikace rekombinantního viru byla uskutečněna kultivováním buněk ve velké míře v baňkách tkáňových kultur, dokud nebyl získán titr asi 10⁸ pfu/ml. Exprese LSIRF byla ověřena infikováním Sf9 buněk pň znásobení infekcí 1 pfu/buňku a odebráním buněk v 0, 24, 48, 72, a 96 hodině po infikování. Buněčné lyzáty pak byly připraveny solubilizací v SDSPAGE vzorkovém pufru (100mM DTT, 80 mM Tris-HCI, pH 6,8, 10 procentní glycerol, 0,0012 procentní bromfenolová modř) a byly analyzovány Western blot analýzou.

Byly analyzovány proteinové extrakty z obou Sf9 buněk a z myších periferních lymfocytů z hlediska přítomnosti LSIRF polypeptidu. Lymfocyty byly připraveny z mízních uzlin vyříznutých z myší, protlačením mízní uzlinové tkáně přes jemné síto. Lymfocyty byly udržovány v Iscovově mediu obohaceném 10 procenty fetálního telecího séra. Proteinové extrakty z Sf9 a lymfocytních buněk byly připraveny za použití návodu výrobce pro Sf9 buňky (Pharmingen, San Diego, CA) nebo metod uvedených v Sambrook a kol., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]; pro lymfocytní buňky). Proteiny byly rozpuštěny v 8 procentech polyakrylamidu/0,1 procento SDS gelu a tento gel byl přenesen na Immobilon-P membránu (millipore Company) za použití standardních postupů. Blot byl nejdříve inkubován s blokujícím pufrem (4 procenta odstředěného mléka a 0,5 procent Tween-20 v 1 X PBS) po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě. LSIRF králičí polyklonální antiserum získané proti LSIRF peptidu zakončeným karboxy skupinou ve zředění asi 1 : 2000 (v roztoku skládajícím se z 1 dílu blokujícího pufru a 1 dílu PBS). LSIRF peptid, kterým byl očkován králík za účelem generace protilátky byl:

GYELPHEVTTPDYHR (SEQ ID NO: 9)

Po inkubaci s LSIRF protilátkou po dobu asi 1 hodiny byl blot promyt a LSIRF protilátka byla dokazována konjugovanou protilátkou obsahující kozí antikráličí křenovou peroxidázu ve zředění asi 1 : 5000.

Výsledky ukazují, že byl rozpoznán přibližně pás 51 kD (předpovídaná molekulová hmotnost LSIRF) anti LSIRF protilátkou pro jak periferní T buňky stimulované anti-CD3 protilátkami tak rekombinantní Sf9 buňky.

• * β · · · ♦ · · • · · *· · * • ·. » · ·· ······ ·4 • 4* · ·· «»·· « ·· ····

Příklad 4

Analýza exprese myší LSIRF A. Tkáňové bloty

K posouzení tkáňové specifičnosti LSIRF transkriptů byla připravena celková RNA z tkáně myšího mozku, plic, brzlíku, kostní dřeně, sleziny, jater, střev, pankreatu, slinné žlázy, varlat, srdečního a hladkého svalu za použití metod popsaných v Wangm a kol. (EMBO J., 10: 2437-2450 [1991]). RNA kyseliny byly podrobeny elektroforéze na 1 procentním agarosa/formaldehydovém gelu za použití standardních postupů, a pak transferovány na nitrocelulosový papír, jak je popsáno v Sambrook a kol., supra. Bloty pak byly hybridizovány s náhodně vzniklou ³²P značenou 1,4 kb cDNA, obsahující celou kódující oblast LSIRF (vklad z PV-1), a následně promytou jak je popsáno v Stewart a ko\.(Meth. Mol. Cell Biol., 1: 73-76 [1989]) při asi 50 °C v 0,2 X SSC a 0,1 procentním SDS.

Výsledky ukázané na obrázku 5 naznačují, že LSIRF transkript o asi 5,5 kb je přítomen hlavně v tkáních sleziny a kostní dřeně, se méně častěji transkript téže velikosti v tkáních brzlíku a plic. Překvapivě nebyly pozorovány žádné přídavné pásy. Navíc obrázek 6 ukazuje, že tkáň mízní uzliny rovněž obsahuje LSIRF transkripty.

Byly vyhodnoceny různé linie T buněk obsahující CTLL-2, D10.G4.1, HT-2, EL-4 a BW5147 (všechny buňky dostupné z Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) z hlediska LSIRF exprese za použití Nothem blot analýzy. RNA byla extrahována z těchto buněčných linií použitím metody Chomczynski a kol. (Anal. Biochem., 162: 156-159 [1987]). Buněčné linie byly udržovány při 37 °C a 5 procentech CO2 v Iscovově médiu obohaceném 10 procentním fetálním telecím sérem a 2 mM L-glutaminem. Předpokládá se, že první tři buněčné linie jsou periferními T buněčnými rody , zatímco u posledních dvou se předpokládá, že jsou nezralými T buněčnými rody. Kultury HT-2 a CTLL-2 buněk byly obohaceny 50 U/ml IL-2 (Genzyme lne., Cambridge, MA) a 50 ti μΜ 2merkaptoethanolu; kultury D10.G4.1 byly obohaceny 50 U/ml IL-1 (Genzyme lne., Cambridge, MA), 50 ti U/ml IL-2 a 50 mM 2-merkaptoethanolu.

Nothem bloty byly připraveny z úplné RNA transferovány na Hybond N papír a zkoumány s 1,4 kb náhodně značenou cDNA, jak je výše popsáno, za použití Stewart a kol., supra metod.

'•fj ··· ♦ · · · · · · · z / «·· · · · · · · · ····*· · 9 · · · · · « • · · · ♦ ··« »··· · ·· ···· ·· ··

Výsledky ukazují, že LSIRF transkripty jsou viditelné pouze u periferních T buněčných linií , což naznačuje, že LSIRF je přednostně exprimován ve zralých T buňkách. Podobné analýzy mRNA transkripce v pre-B buněčných liniích CB17.51, B buněčných liniích WEHI231 (Američan Type Culture Collection), a buněčných liniích plazmocytomu J558 (Američan Type Culture Collection) ukazují přítomnost transkriptu ve všech buněčných liniích s tím, žé nejsilnější signál má J558.

Byla vyhodnocena indukce LSIRF v primárních lymfocytech získaných ze sleziny nebo mízních uzlin přidáním různých stimulátorů k pěstovaným buňkám a posouzením LSIRF mRNA hladin. Stimulanty použité pro buňky mízních uzlin byly 1000 U/ml myší interferon beta (IFN-beta; Lee Biomolecular Research, San Diego, CA), 100 U/ml myší interferon-gamma (IFN-gamma; Genzyme lne., Cambridge, MA) nebo 10 ng/ml myší nádorový nekrotický faktor (TNF; Genzyme lne.). Na splenocytámí buňky se působilo 20 pg /ml anti-IgM protilátek, 10 pg /ml lipopolysacharidů (LPS; bakteriální endotoxin), 10 ng/ml PMA (forbolmyristat acetat; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1 mg/ml cyklosporinu A (CsA; Sandoz Company, Basel, Switzerland), 10 pg /ml Concanavalinu A (ConA; Sigma), nebo 1 nebo 10 pg /ml cykloheximidu (CHX; Sigma). Na všechny buňky se působilo po dobu 6 hodin při teplotě 37°C.

Výsledky jsou ukázány na obrázcích 6, 7 a 8. Na všech obrázcích je znázorněn beta aktin jako indikátor množství celkové analyzované RNA.

Obrázek 6 ukazuje, že anti-CD3 protilátky indukovaly LSIRF transkripci. Mnohem překvapivější však je , že interferony neindukovaly LSIRF transkripty. Toto je v ostrém kontrastu k jiným známým IRF, protože transkripty ostatních dvou známých IRF jsou indukovány interferony.

Obrázek 7 ukazuje, že cykloheximid, inhibitor proteinové syntézy, indukuje LSIRF transkripci. Tyto výsledky nebyly očekávány, protože cykloheximid neindukuje transkripci IRF-1 nebo IRF-2 genů.

Obrázek 8 ukazuje, že anti-IgM a PMA indukují LSIRF transkripty. Tato indukce pomocí anti-IgM byla překvapující, protože ukazuje, že LSIRF je exprimován v B buňkách stejně tak, jako v T buňkách.

• ·

« · · · · ···· · ·♦ ····

B. Gelová detekce

Elektroforetická mobilní detekce byla prováděna k posouzení, zdali LSIRF polypeptid je DNA vazebným proteinem. Jaderné extrakty z kontrolních Sf9 buněk (přenesených pouze s) a LSIRF exprimující Sf9 (přenesený s divokým typem baculoviru obsahující LSIRF cDNA) buněk byly připraveny následovně. Sf9 buňky byly sedimentovány a pak dvakrát promyty v PBS. Po konečném promytí byly buňky resuspendovány v 0,5 ml „H-pufru“ (hypotonický pufr) na 107 buněk (H-pufr se skládá z : 25mM Hepes- NaOH, pH 8,0, 10 mM KCI, 5 mM MgCI₂, 0,5 mM EDTA a 0,5 mM DTT) a byly inkubovány na ledu po dobu 30 minut, během kterých buňky nabotnaly v důsledku přítomnosti hypotonického pufru. Buňky pak byly rozrušeny 15 údery tloučku typu B v Dounceho homogenizátoru. Jádra byla izolována z buněčného odpadu sedimentací při asi 4°C v mikrofuze při 10 K rpm po dobu asi 10 minut. Sedimenty, které obsahovaly většinu jader, pak byly extrahovány resuspendováním v 0,5 ml Npufru na 10⁷ buněk (N-pufr se skládá z : 25 mM Hepes-NaOH, pH 8,0, 400 mM KCI, 5mM MgCI_2l 0,5 mM EDTA, 10 procent glycerolu a 0,5 mM DTT) a inkubovány na ledu po dobu asi 20 minut. Suspenze pak byla odstředěna při 4 °C v mikrofuze při 15 K rpm po dobu asi 15 minut. U supematantu obsahujícím většinu LSIRF polypeptidu byl změněn pufr, aby se odstranil přebytek soli použitím Centricon 10 mikrokoncentrátoru (Amicon Corporation). Přidávaným pufrem pro zkoncentrování LSIRF polypeptidu byl E-pufr (25 mM Hepes -NaOH, pH 8,0, 50 mM KCI , 5 mM MgCI_2l 0,5 mM EDTA, 15 procent glycerolu a 0,5 mM DTT). Všechny pufry, H-pufr, N-pufr a E-pufr obsahovaly následující inhibitory proteázy: 0,5 mM PMSF, 0,5 pg /ml leupeptin, a 0,5 pg /ml aprotinin).

K posouzení elektroforetické mobility určitého DNA fragmentu, v důsledku LSIRF navázání fragmentu, byly tyto extrakty inkubovány s dvouvláknovou ³²Pznačenou DNA sondou. Sekvence citlivé části této sondy, myší MHC IRSE vazebná sekvence standardního typu je sestavena níže:

TGCAGAAGTGAAACTGAGG (SEQ ID NO: 10)

Pro vazebnou reakci, asi 25 X 10³ cpm (odpovídající asi 1 X 10'¹¹ molům sondy) byl připraven ve vazebném reakčním pufru (12 mM Hepes-KOH, pH 7,9, 30 mM KCI, 60 pM EGTA, 0,3 mM DTT, 2,5 procent Ficoll, 0,6 pg póly (dl-dC) [získané od Pharmacia], a 0,05 procent NP-40 ). Jaderné extrakty byly připraveny zředěním přibližně 8 krát v E-pufru, obsahujícím asi 0,1 gg /ml BSA (hovězí sérový albumin) , aby se získala konečná koncentrace asi 14 gg celkového proteinu/ml pro LSIRF obsahující reakce a asi 22 gg /ml pro kontrolní reakce. Vazebné reakce byly nastartovány přídavkem asi 1 gl jaderného extraktu k asi 6,24 gl zkoumaného roztoku, který v některých případech také obsahoval neznačený „ kompetitor“ DNA fragmentů. Sekvence každého z těchto fragmentů je sestavena dále v tabulce 1. Kompetitorové fragmenty byly přidány v molámím přebytku přibližné 750 krát (srovnáno se značeným fragmentem). Roztok jaderného extraktu/sondy byl inkubován při přibližné 23°C po dobu asi 20 minut, a pak byl nadávkován na 9 % polyakrylamidový gel (připravený s 0,25 X TBE), který byl nejdříve podroben elektroforéze pří asi 250 V po dobu asi 2 hodin, před nadávkováním vzorku. Gel byl vystaven po dobu asi 2 hodin napětí asi 300 V za účelem separace protein-DNA komplexů z nenavázané DNA sondy. Gel byl pak vysušen a vyfotografován k vyhodnocení migračního posunu DNA sondy v důsledku navázání proteinu.

TABULKA 1

FRAGMENT

SEKVENCE

mMHC ISREwt	TGCAGAAGTGAAACTGAG (SEQ ID NO: 11)
mlSRE mťl	TGCAGAAGTGAAACCTGG (SEQ ID NO: 12)
mlSRE mt2	TGCAGAAGTGAACATGAG (SEQ ID NO: 13)
mlSRE mt3	TGCAGAAGTGGTCCTGAG (SEQ ID NO: 14)
mlSRE mt 4	GCTAGAAGTGAAACTGAG (SEQ ID NO: 15)
mlgk B mlgkappa E3' hlSG54 ISRE	AAAGGAAGTGAAACCAAG (SEQ ID NO: 16) TGAGGAACTGAAAACAGA (SEQ ID NO: 17) . _ GGGAAAGTGAAACTAG (SEQ ID NO: 18)

V tabulce 1 „m“ indikuje myší sekvenci, a „h“ indikuje lidskou sekvenci.

Výsledky jsou znázorněny na obrázku 9. Jak je vidět, MHC ISRE sekvence standardního typu váže LSIRF protein. Navíc dva ISRE DNA fragmentové mutanty « * · 9 9 · · 9 9 · · ·· · · · · · · ·9j

9* 9 9 9 · 9 999 • ···»· · * · 999 99

9 9 9 9 9 99

999 9 99 9 9 9 999 99 m1 a m4 soutěží mezi sebou v navázání, podobně jako dva další DNA fragmenty Ig λΒ a ISG54.

Příklad 5

Lidské LSIRF klonování

K identifikaci lidské cDNA kódující LSIRF byla zkoumána lidská lymfocytní cDNA knihovna (Clontech, Palo Alto, CA; katalogové číslo HL 1031a) použitím myšího PV-1 klonu. Podmínky sceeningu byly: přes noc při 65°C v Churchově pufru (Church and Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1991-1995 [1984]). Filtry byly promývány dvakrát po dobu 30 minut každý v 2 X SSC a 0,1 procentním SDS. Bylo zkoumáno asi jeden milión plaků, byly identifikovány dva pozitivní klony, izolovány a DNA byla čištěna použitím standardních technik. Klony byly subklonovány na místo EcoRi pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA). Byl seřazen nejdelší z těchto klonů označený H14 , který byl delší než asi 2 kb. Tato sekvence indikovala, že klon je hybridem TNF (nádorový nekrotický faktor) receptoru p55 (asi 400 párů bází) a asi 1 kb sekvence, která je vysoce homologní k exonům 3-9 myší LSIRF sekvence. Navíc tento klon obsahuje konzervativní stopkodón, spletenou donorovou sekvenci, a asi 600 párů bází intronu 9. Došlo se tudíž k závěru, že tato 1019 sekvence párů bází reprezentuje část lidské LSIRF sekvence. Tato 1019 sekvence párů baží byla amplifikována pomocí PCR za použití následujících matric:

CTGGACATCTCAGACCCGTACAAAGTG (SEQ ID NO: 19)

CTTGACATI I I ICATTCTTGAATAGAG (SEQ ID NO: 20)

Podmínky amplifikace byly 94 °C po dobu 30 sekund, 65 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 90 sekund. Bylo použito asi 500 ng H14 templátu v přítomnosti Taq polymerázy a bylo provedeno asi 15 cyklů PCR. .Vznikající PCR produkt se přímo navázal na TA klonující vektor PCRII sady (Invitrogen, San Diego, CA) a seřadil, aby se ověřilo, že byl amplifikován vhodný fragment. Tento fragment 1019 páru bází cDNA, označený „FISH“, byl pak použit ke screeningu lidské leukocytní 5'prodloužené cDNA knihovny (Clontech; katalogové číslo HL 1169x). Podmínky screeningu byly: asi 65°C přes noc v Churchově pufru, následované dvojím promytím po dobu asi 30 minut v 2 X SSC a 0,1 procentním SDS a potom dvakrát v 0,2 X SSC a 0,1 procentním SDS po dobu asi 30 minut. Byl identifikován jeden plak asi 500 000 a DNA byla čištěna a sekvenována. Tento klon označený HIRF4XDR2 obsahoval intron2 a celodélkový exon 3 (byla nalezena pouze část exonu 3 v H14 klonu), stejně jako exony 5, 7, 8 a intron 8 . Podle všeho exony 4 a 6 byly rozpleteny nebo chyběly.

K získání zbytku LSIRF kódující sekvence byly použity dva přístupy. Nejdříve byla zkoumána lidská placentámí genomová knihovna v přenašeči lambda fix 2 (Stratagene, LaJolla, CA) za použití FISH cDNA jako sondy. Podmínky screeningu byly: asi 65°C přes noc v Churchově pufru, následované dvojím promytím po dobu asi 30 minut v 2 X SSC a 0,1 procentním SDS a pak dvakrát v 0,2 X SSC a 0,1 procentním SDS po dobu asi 30 minut. Bylo izolováno 10 fágových klonů a DNA byla čištěna z jednoho klonu označeného HG-1. Tato DNA byla digerována s restrikčními endonukleázami Bam Hl, Sac I, a Xba I a tyto fragmenty byly subklonovány do klonujícího vektoru pMOB (Strathmann a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 12471250 [1991]). Byla získána sekvence každého fragmentu a porovnána s myší LSIRF sekvencí. Byly identifikovány promotory exon I a exon II lidského LSIRF v tomto klonu založeném na homologii s myší sekvencí.

Druhým použitým přístupem byla RACE reakce používající sadu Clontech Marathon® podle návodu výrobce. Byla použita B-buňěčná lymfomová linie nazvaná OCILY8 (viz Blood, 69: 1307-1314 [1987]), která byla ukázána předchozí analýzou Nothem bloty a mající vysokou LSIRF expresi. Byl sekvenován a nalezen výsledný RACE produkt, aby se porovnala genomová sekvence exonu 1 a 2 (získaná dle výše uvedeného postupu).

K přípravě otevřeného čtecího rámu byla FISH cDNA vyříznuta z místa EcoRI přenašeče PCRII a navázána na EcoRI místo PGEX4T3 (Promega, Madison, Wl) za tvorby vektoru pGEX4T3-FISH. ^získání 5' konce otevřeného čtecího rámu v podobě, která by dovolila, aby byl fúzován do FISH klonu, byla použita lidská slezinová Marathon® (Clontech, katalogové číslo 7412-1) hotová cDNA s následujícími dvěma matricemi pro amplifikaci:

TGCCCTCAGCTCCGAGTCCAG (SEQ. ID. NO.: 21)

AACCATTTTCACAAGCTG (SEQ. ID. NO.: 22)

♦ · · · · · ·

9 9 9

999 99 ··

Amplifikace byla uskutečněna použitím PCR za následujících podmínek: 94°C po dobu 30 sekund, 64°C po dobu 30 sekund, a 68°C po dobu jedné minuty. Bylo provedeno 30 cyklů za použití Expand High Fidelity Polymerázy (Boehringer Manheim). Použitím tohoto postupu byla amplifikována sekvence N-konce LSIRF za vzniku očekávaného fragmentu DNA velikosti přibližně 600 párů bází.

Fragment mající přibližně 600 párů bází byl znovu amplifikován PCR za použití SEQ. ID. NO.: 22 (uvedené výše) a SEQ. ID. NO.: 23, jak je uvedena níže:

GGATCCGGATCCATGAACTGGAGGGCGGCGGCCGAGGC (SEQ. ID. NO.: 23)

Bylo provedeno patnáct cyklů PCR za následujících podmínek: 94°C po dobu 30 sekund, 64°C po dobu 30 sekund, a 72°C po dobu 90 sekund za použití přirozené PFU polymerázy (Stratagene, LaJolla, CA).

Vektor PGEX4T3 obsahující FISH vložku (pGEX4T3-FISH) byl štěpen oběma BamHI a Sac II, čímž se odstranila 5' část FISH insertu. PCR produkt obsahující přibližně 600 párů bází (viz výše) byl štěpen stejnými enzymy a navázán na pGEX4T3-FISH vektor za tvorby otevřeného čtecího rámového konstruktu GEX4T3 LSIRF Bam HI/EcoRI, jejíž kódující oblast je sestavena dále na obrázku 10. Předpokládaná sekvence aminokyselin je uvedena dále na obrázku 11. Tento klon byl vyhodnocen přípravou GST fúzního proteinu (Pharmacia) na základě návodu výrobce. Předpokládaná velikost fúzního proteinu byla asi 79 kD, z kterého asi 27 kD tvoří GST protein a asi 52 kD tvoří LSIRF protein. Fúzní protein migroval na 8 procentním SDS-PAGE na očekávanou velikost asi 79 kD, jak bylo určeno barvením pomocí Coomassi blue.

Nothem blot analýza lidského LSIRF ukázala, že tento gen je exprimován zejména ve tkáni sleziny a tkáni periferní krve, s nižší hladinou u tkání tračníku a střev. Navíc, použitím Nothem blotové linie mnohočetné rakovinové buňky, získané od Clontech (katalogové číslo 7757-1) byla pozorována slabá exprese tohoto genu v linii Ráji lidského B buněčného Burkittova lymfomu, a silná exprese byla pozorována v lidské melanomní linii G361 rakovinové linie.

Na základě sekvenování DNA několika klonů obsahujících částečnou hLSIRF sekvenci se předpokládá, že existují dvě formy hLSIRF sekvence. Jedna forma, „Single Q“ forma, obsahuje „CAG“ kodon u bází 490-492, který kóduje aminokyselinu

Q (Gin) v místě aminokyseliny 164. Druhá forma LSIRF DNA, „Double Q“ forma, obsahuje přídavný „CAG“ kodon mezi bázemi 492 a 493 „Single Q“ formy, což má za následek přídavnou aminokyselinu Q (Gin) mezi aminokyselinami 163 a 164 „Single Q“ formy. Kromě tohoto jednoho rozdílu jsou tyto dvě formy sekvence aminokyselin a nukleových kyselin identické.

Celá délka „Single Q“ DNA sekvence kódující lidský LSIRF (hLSIRF) ve vektoru pGEX4T3 byla uložena s ATCC pod přístupovým číslem 98016 a to 27. března 1996. Navíc, celá délka lidské LSIRF sekvence kódující „Double Q“ formu hLSIRF proteinu byla uložena s ATCC a to 27. března 1996 pod přístupovým číslem 98017.

·· ·

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

i) Přihlašovatel: Amgen Kanada lne.

ii) Název vynálezu: Nové geny kódující LSIRF polypeptidy iii) Číslo sekvencí: 25 iv) Kontaktní adresa:

A) Adresát: Amgen Kanada lne.

B) Ulice: 6733 Mississauga Road, Suitě 303

C) Město: Mississauga

D) Stát: Otario

E) Země: Kanada

F) ZIP: L5N 6JB

v) čtecí forma na počítači

A) Typ media: disketa

B) Počítač: IBM PC kompatibilní

C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D) Software: Patentln Release #1,0, verze #1,30 vi) stávající data přihlášky:

A) Číslo přihlášky:

B) Datum podání:

C) Klasifikace:

viii) právní zástupce/ informace o zástupci

A) Jméno: Oleski, Nancy A.

B) Registrační číslo: 34 688

C) Reference/ adresní číslo: A-338A

2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 1353 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární i i) Typ molekuly: cDNA «· · '·· xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

ATGAACTTGG	AGACGGGCAG	CCGGGGCTCA	GAGTTCGGCA *	TGAGCGCAGT	GAGCTGCGGC	60
AATGGGAAAC	TCCGACAGTG	GTTGATCGAC	CAGATCGACA	GCGGCAAGTA	CCCCGGGCTG	120
GTGTGGGAGA	ACGAGGAGAA	GAGCGTCTTC	CGCATCCCGT	GGAAACACGC	GGGCAAGCAG	180
GACTACAATC	GTGAGGAGGA	CGCTGCCCTC	TTCAAGGCTT	GGGCATTGTT	TAAAGGCAAG	240
TTCCGAGAAG	GGATCGACAA	GCCAGATCCT	CCTACTTGGA	AGACAAGATT	ACGATGTGCT	300
CTGAACAAGA	GCAATGACTT	TGAGGAATTG	GTCGAGAGGA	GCCAGCTGGA	TATCTCTGAC	360
CCATACAAGG	TGTACAGGAT	TGTTCCAGAG	GGAGCCAAAA	AAGGAGCAAA	GCAGCTCACT	420
TTGGATGACA	CACAGATGGC	CATGGGCCAC	CCCTACCCCA	TGACAGCACC	TTATGGCTCT	480
CTGCCAGCCC	AGCAGGTTCA	TAACTACATG	ATGCCACCCC	ATGACAGGAG	CTGGAGGGAT	540
TATGCCCCTG	ACCAGTCACA	CCCAGAAATC	CCATATCAAT	GTCCTGTGAC	GTTTGGCCCA	600
CGAGGCCACC	ACTGGCAAGG	CCCATCTTGT	GAAAATGGTT	GCCAGGTGAC	AGGAACCTTT	660
TATGCTTGTG	CCCCACCTGA	GTCCCAGGCT	CCTGGAATCC	CCATTGAGCC	AAGCATAAGG	720 i
TCTGCTGAAG	CCTTGGCGCT	CTCAGACTGC	CGGCTGCATA	TCTGCCTGTA	TTACCGGGAC	780 j
ATCCTCGTGA	AAGAGCTGAC	CACGACGAGC	CCTGAAGGCT	GCCGGATCTC	CCACGGACAC	840
ACCTATGATG	TTAGCAACCT	GGACCAGGTC	CTGTTTCCCT	ACCCGGACGA	CAATGGACAG	900
AGGAAGAACA	TTGAGAAGTT	GCTGAGCCAC	CTGGAGAGGG	GACTGGTCCT	CTGGATGGCT	960
CCAGATGGGC	TTTATGCCAA	AAGACTCTGC	CAGAGTAGGA	TCTACTGGGA	TGGGCCCCTG	1020
GCACTGTGCA	GCGATCGGCC	CAACAAGCTA	GAAAGAGACC	AGACTTGCAA	GCTCTTTGAC	1080
ACACAGCAGT	TTCTATCAGA	GCTGCAAGTG	TTTGCTCACC	ATGGCCGGCC	AGCACCGAGA	1140 j
TTCCAGGTGA	CTCTGTGCTT	TGGTGAGGAG	TTTCCAGACC	CTCAGAGACA	GAGGAAGCTC	1200
ATCACAGCTC	ATGTGGAACC	TCTGCTAGCC	AGACAACTGT	ATTACTTTGC	TCAACAAAAC	1260
ACTGGACATT	TCCTGAGGGG	CTACGAGTTA	CCTGAACACG	TTACCACTCC	AGATTACCAC	1320
CGCTCCCTCC	GTCATTCTTC	CATCCAAGAG	TGÁ	-		1353

·· ·

2) Informace pro SEQ ID NO:2:

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 450 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Met Asn Leu Glu Thr Gly Ser

	1	5 Asn	Gly	Lys
Val	Ser	Cys	Gly 20
	Asp	Ser	Gly 35	Lys	Tyr	Pro	Gly
	Val	Phe 50	Arg	Ile	Pro	Trp	Lys 55
	Glu 65	Glu	Asp	Ala	Ala	Leu 70	Phe
	Phe	Arg	Glu	Gly	Ile 85	Asp	Lys
	Leu	Arg	Cys	Ala 100	Leu	Asn	Lys
	Arg	Ser	Gin 115	Leu	Asp	Ile	Ser
	Pro	Glu 130	Gly	Ala	Lys	Lys	Gly 135
	Gin 145	Met	Ala	Met	Gly	His 150	Pro
	Leu	Pro	Ala	Gin	Gin 165	Val	His
	Ser	Trp	Arg	Asp 180	Tyr	Ala	Pro
	Gin	Cys	Pro 195	Val	Thr	Phe	Gly
	Ser	Cys 210	Glu	Asn	Gly	Cys	Gin 215
	Pro 225	Pro	Glu	Ser	Gin	Ala 230	Pro

Arg	Gly	Ser 10_	Glu	Phe	Gly	Met	Ser 15	Ala
Leu	Arg 25	Gin	Trp	Leu	Ile	Asp 30	Gin	Ile
Leu 40	Val	Trp	Glu	Asn	Glu 45	Glu	Lys	Ser
His	Ala	Gly	Lys	Gin 60	Asp	Tyr	Asn	Arg
Lys	Ala	Trp	Ala 75	Leu	Phe	Lys	Gly	Lys 80
Pro	Asp	Pro 90	Pro	Thr	Trp	Lys	Thr 95	Arg
Ser	Asn 105	Asp	Phe	Glu	Glu	Leu 110	Val	Glu
Asp 120	Pro	Tyr	Lys	Val	Tyr 125	Arg	Ile	Val
Ala	Lys	Gin	Leu	Thr 140	Leu	Asp	Asp	Thr
Tyr	Pro	Met	Thr 155	Ala	Pro	Tyr	Gly	Ser 160
Asn	Tyr	Met 170	Met	Pro	Pro	His	Asp 175	Arg
Asp	Gin 185	Ser	His	Pro	Glu	Ile 190	Pro	Tyr
Pro 200	Arg	Gly	His	His	Trp 205	Gin	Gly	Pro
Val	Thr	Gly	Thr	Phe 220	Tyr	Ala	Cys	Ala
Gly	Ile	Pro	Ile 235	Glu	Pro	Ser	Ile	Arg 240

• ·

!

Ser

Ala

Glu Ala

Leu 245

Ala

Leu Ser

Asp Cys Arg 250

Leu

His

Ile

Cys 255

Leu i i 1

Tyr

Tyr

Arg

Asp 260

Ile

Leu

Val

Lys

Glu 265

Leu

Thr

Thr

Thr

Ser 270

Pro

Glu i

Gly

Cys

Arg 275

Ile

Ser

His

Gly

His 280

Thr

Tyr

Asp

Val

Ser 285

Asn

Leu

Asp

Gin

Val 290

Leu

Phe

Pro

Tyr

Pro 295

ASp

Asp

Asn

Gly

Gin 300

Arg

Lys

Asn

Ile

Glu 305

Lys

Leu

Leu

Ser

His 310

Leu

Glu

Arg

Gly

Leu 315

Val

Leu

Trp

Met

Ala 320

Pro

Asp

Gly

Leu

Tyr 325

Ala

Lys

Arg

Leu

Cys 330

Gin

Ser

Arg

Ile

Tyr 335

Trp

Asp

Gly

Pro

Leu 340

Ala

Leu

Cys

Ser

Asp 345

Arg

Pro

Asn

Lys

Leu 350

Glu

Arg

Asp

Gin

Thr 355

Cys

Lys

Leu

Phe

Asp 360

Thr

Gin

Gin

Phe

Leu 365

Ser

Glu

Leu

Gin

Val 370

Phe

Ala

His

His

Gly 375

Arg

Pro

Ala

Pro

Arg 380

Phe

Gin

Val

Thr 1

Leu 385

Cys

Phe

Gly

Glu

Glu 390

Phe

Pro

Asp

Pro

Gin 395

Arg

Gin

Arg

Lys

Leu 400

Ile

Thr

Ala

His

Val 405

Glu

Pro

Leu

Leu

Ala 410

Arg

Gin

Leu

Tyr

Tyr 415

Phe

Ala

Gin

Gin

Asn 420

Thr

Gly

His

Phe

Leu 425

Arg

Gly

Tyr

Glu

Leu 430

Pro

Glu

His

Val

Thr

Thr

Pro

Asp

Tyr

His

Arg

Ser

Leu

Arg

His

Ser

Ser

Ile

435 440 445

Gin Glu

450

JÍ.

·· ·

2) Informace pro SEQ ID NO:3:

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 2139 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomová) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

AAGGGGCCAC	CTGGCCATTC	CTTCCTCTCC	ACCAGCAACA	ATGGGAGCAT	GTGATTCACA	60
AGGGAATCAC	ATTCAACTAA	AAAGAGAAAC	CGGGGTATGC	TGTTTGCAAG	GAACGGTTGA	120
AACTGGAACT	CAATATGTCG	TGTGGTGTGA	AATAAACGTG	TGTCTCACAT	GTTTTCCCAT	180
GCTGGGGGCA	GGGGTAAGAA	AGTAAAAGGC	AGACTGGTTA	AAGACATGGG	GTGGGGAGGG	240
CTGGAGGGAC	GAGTGGTAAG	AAATGGCGAC	AGAGGAGATG	AAGGTAATGT	CATAATGAAA	300
CCCATCACTG	CTGTGTGCAA	CTAATAGATG	CTAATAAAAT	AGGAAGTTTT	AATGATTTAG	360
GTAGCTTATT	GCTTGCATTC	ACCTCACTGT	TAAACTATCA	CTTCTGGGGG	ATCCACACAA	420
CGAGCGAGCG	AGTAAACCAG	AAGATGGCGT	TGGAAGATTA	GTAATCATAT	CTTTTAAACA	480
AGATAACCAT	GTGAAGTCTC	AAAAGGTTTC	TTGTAATGAC	TGTTGTTTAA	ACTTCTGAAA \	540
ACAGAGGATG	TAGATTGGCT	GAGGAAAATG	TTGAAACCGC	CTAAGTCAAG	GTAGAAGACA	600
CGTGTGTCTA	AGTGAAAAAA	AGAAAAAAGA	AAAAAAAAAA	AACCAAAAAC	CTCGGGTTGG	660
CTGCTTCTGT	CCTTAGTCTG	TGCACGCTTT	GAAGAAATGT	AATTCCTCAG	CAGCAAGGCT	720
GTGCTATCTG	AAGCTACAAT	CTCTGCTTTG	CTCCGAGGTG	TGTCTCTGGT	GACCGGGATA	780
GTTCCCGACA	GACAGAAGGT	GTTCAAAGAA	TATTTTTGAA	TGAATGAAAC	CCCAAAGGAA	840
GAAGAGGGGA	AAATGGGTGT	GACCAAAATT	TTCTTTGAAC	GAAACTCTGT	TGTTTACTAC	900
CAGGGCTCTG	ACAATGGAAA	ACTAATTGGG	GTGAAAGÁÁČ	GAČATGGCÁT	CCTGTTAATT	960
TCTGAGAAAG	CCTGTTGATG	TTAGGAAAAA	AAAACATGCC	GGTGGGCATC	TCTGCACCAG	1020
TTTTCCTGTG	GCCAAAATCA	GATGTTTCTC	CTAAAGTCCA	GAACCCAGGA	TGGAAGATTA	1030
AAAGAAAAAC	TGAGAAACAT	GTGAAATGAA	AAAGTTGTCA	AAAGCTTTAC	AAACGCTCCA	1140
AGTTGACCTG	TGGTGGTGGT	AATCTAAAAT	GATACAGAAA	CTGGTAGTCT	GCTTGCTTAC	1200
CTGAAAACAC	CAAGATAACA	TATAAGCTCC	AGGCATCCAA	GCTGAGCTGG	AGAAAGTCAG	1260
CGGCAAAAGC	TCATGGAGTT	TACATATGAA	GGTCAAAGAA	AACACGAAAA	TAAAGTAAAA	1320
CCTTCAGTCA	GCCTAGCTGT	TCTATTTGGG	GCATTGGTAC	CTCACCGCCA	ACTGCCTCCC	1380
ACGAGGCTGA	GGTTAAAATT	ATCATTTTAA	GGTGAATTGA	CATCCGGAAG	CGCGCTAACT	1440

·· ·· * · · · • · ·· ··· · · • · · • · · ····

CTTTGGGGAC ···· ··

ACCTGAGTAC

TCAGGGATCC

CCCATCTCTT

TTATGTTGCC • · · ·

ATGATTGAAA

TGTGCTTGTC

TGAGTCATCT

CAATTCGTCG

GTTTCATTCA

CCCAACATGT

CAAACACAGT

ATTTGGGCCA

CGGCTTATAA

ACTTGCCTTT

CTATTTTTCT

CGTGATATTC

TCTAAACGCT

CAGAGAGACA

AGACTCCGCT

TTGTTCAGGA

CTCTCTCAGT

CTATCTCTTC

TGTTACATCT

GTGAGAACAA

GTTCCCTGTG

ATAAGCGTTT

TTTTAGTGAG

TGCTCCCGAC

CTCCAGACTC

1500

1560

1620

1680

1740

TCCATCACTT

CCCACCTGTC

GATGAGCAGT

TAGTAGTTAT

CAGCTATGCT

CAGTGCAGAT

1800

TCCAGTATCC

CCTTTGTATG

CCTCCACCTT

CCACAGGAGG

GGGGCCATAC

CGACTTGTCC

1860

CATCCGGTTG

AGGATTTCTG

AGTACATCAG

AGTCCCCAGC

CCCCTCCACA

GGAGGAGCTG

1920

AAGAAAGCCA

GGGTTTGTCT

GAAGTGGGAC

AGCCCTTGAC

CCGGTGGGCT

CTAGTCCGAA

1980

GCTCCTGTTC

CTGCGGGACA

CCCAGGCACA

AGGCAGAGGT

GGGGGGCGGT

CCTGGGTATG

2040

GCCAACCCAC

GCCCTCTCAA

GGCGGGGCCG

AAGCGCCCGC

CCTGCACTCC

GCCTCCGGCT

2100

CTATAAAGTT

CCTCTTTCTC

ACCTCACTTT

CCTAGTTTC

2139

2) Informace pro SEQ ID NO:4:

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 12537 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomová) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

ACCACTTGAA	CTTGGGACCC	TTTGCTGCCC	TCAGCTAAGA	GTGCGGGTGA	GGTAAGGCCT	60 :
GTAGTCGGGC	AGAAGGAGGA	GTGTGAGGCT	GGTGGCAGAG	GAAGCCTGGC	TTCCATCTCT	120
GAGCCTGAGG	GAGAATGCTG	agatagcgga	CCCAGGCTCC	GCTCATCTAC	GCTGCCCTAG	180
GACCTGTGCA	CTTCGGGTTT	TGTATGAAGC	TGTTTGGGTG	GGAGTTCCAG	AACATCCCCC	240
ACGGGCTGGG	CGGGACGAGC	TAATGGGACT	GTGGTGTCAT	CAAAGGATCG	CACTGGCCAC	300
AGCTTGTCCT	CAGAGGGACA	GCCTCTGACT	CTCTCTGCTC	CAGTGGAAAG	CTCCTTTCCA	360
GCCCTGGTTC	CTAAAGGACC	CAAACTCATC	TAGGGCTCCA	GAGCGTGATT	CCTAGGCCGG	420
GCAGCCAAGA	AGAGCTGAGA	GCTCCAAACT	TAGGGTGCTC	AGAGCCCCTT	TCCCCGCATG	480
CCCCTTCTTC	ACTTCTCTGG	CAAGAGTGCT	AGTGTTGCTG	TCCGCAGCAC	CCCTTATTCC	540
CAGCCTCGGC	TTCATTCCTG	CCAGGGTTCG	CGCTGACATT	CTGCAGGTTG	GAATCTCCTG	600

TTTCTTGGCT	GCGCTGCTTG CCCCATAACC	40 AGACTTCCAC	• · 1 • · 4 • < • • TTGTTGdŤŤt	» 44 ·· » · · · ♦ » · · · · »444·· · 4 • 4 · · CXGGACfdcÁČ“	• 4 • 4 4 • 4 4 4 4 4 4
GTGATGGTCT	CTGGTTGGGT	AGGCCTGGGG	TTATTCCGAG	GACAAAGTAA	GGGTGTCATA	720
GAAGAAAGTC	AAGAGAGTAA	GCTAGGTMCC	CCAAACCTGC	ATGGCAGGGA	CACAGGACCT	780
GGACAAGGGC	TAGTCCATGT	GCCAGGTCCT	TTTCGCCTGG	GGCAGCCAGG	GCAACCTAAA	840
CCCAGGAAGG	GGCAAGTGTA	GAAACAGTGA	GGGAAAAGTG	GGATGAAAGC	TACTTGGATC	900
CAGCACAGAG	GGACGAGTGA	CCAAAGTGAG	CGCCCCAGCG	TGGCGCAAGA	CTTGGGATCT	960
GCAGAGAAGC	TGTGTAGCTA	GGAGCTTTCA	ACGGAGCGTG	TTAATGTAAA	TGTAAATGAA	1020
GAAATTACCT	aattttttta	ATAAAAGAAA	GAACAGACAG	GCAAAAAAAA	AAAAAGGAGG	1080
AGGAGGAGGA	GGAGGATGGT	GCGCGCCAAG	GGATGCTCTC	TATACCTTCG	TCAAAGTACC	1140
TTCTCTTGGG	GGACTTCGGA	GACTCTGTCA	CTGCACCCGA	GCACCTTGTC	AGCCTCAGAG	1200
ACTCGGGGCC	TCGTGGGCAC	TCCAAGAGTT	TGGGACGGGG	CTTCCTCCCG	CCTCCAAAGT	1260
GATACGAAGG	TAGTTGCAGG	GAATGTGTGT	CTCTCCTCAG	CGCACAAGCC	CAGGAGGAGG	1320
TCCCCACGCG	TCATGAACTT	GGAGACGGGC	AGCCGGGGCT	CAGAGTTCGG	CATGAGCGCA	1380
GTGAGCTGCG	GCAATGGGAA	ACTCCGACAG	TGGTTGATCG	ACCAGATCGA	CAGCGGCAAG	1440
TACCCCGGGC	TGGTGTGGGA	GAACGAGGAG	AAGAGCGTCT	TCCGCAŤCCC	GTGGAAACAC	1500
GCGGGCAAGC	AGGACTACAA	TCGTGAGGAG	GACGCTGCCC	TCTTCAAGGT	TAGCAGCATT	1560
CAGGGATCCC	TGGGCAGGGG	TGGGGGTGGG	GATGGGGAAT	CTGAAAGCTC	TGAATGTCTG	1620
TGGCTCCCGG	GCAAGGGACT	AAGAGGTGGG	CTCCTGCAAG	GAGGAGGCCA	GAGCATCAAG	1680
CATTGGACCC	TGCTTAGGCA	AAGTCCCCAG	GAGAAGGGAA	AGAGGTTGCA	AACTCTCCGG	1740
GGATTGCATA	CACAAGAAAC	CAGGTCCCAA	TACTGTTTGT	GTGGAGGAAA	GAACTTCCAG	1800
CTTCAGGGGC	ATCTCTGGGG	GACCGAGGTT	CCGTTTGCAT	AGCCCATTCG	CTGTTTCCTG	1860
CCACCACCAC	CGACTGCTAG	GGCCACTCTC	TGCTTCCCTG	TCTCTCTGTG	TTTTGTTATT	1920
TTTCTGAGTT	TCTCTCTCTG	ggttttgttt	CTTTGATTGG	GCACCTCTAC	TGTCTGGTTC	1980
TAGTTCTAGA	AGCTGCGATC	TCTGATTTTC	TTTCTTTGAG	TAGCTTTGAC	TATTCCGAGT	2040
CTTTCTCTGG	TATCCCCCTC	CGACCCCGTG	TGAGTCCCTT	AGGACTGATG	TCCCCAGAGA	2100
ACTGGCTCAC	TGAACTGTGA	AGCCCCCAGC	CTCCACCTGC	CAGCAGGCCG	AGGAAGGGGA	2160
CTTCCTGCGG	GAATTTGTTC	AAAGTACCTC	TGTGATTTTG	TAGATGTCCT	CTCTGGGGCC	2220
TGCCCCCTCC	ACAGCTCTGT	CCCCAGTCTT	GCCCACACTT	GATTCAGGCG	CTGGGCGTGT	2280
ACAGCCCÁTA	CTAGGGGTCT	CAGGACCCCA	CTAACATCAT	GTTCCACATT	TCAGGCAACA	2340
GCAAATTTGA	AACAGTAACC	TTCCTTGCTG	AAATGCAATC	CATAGAATTC	TTTTGACGCT	2400

CTGGGCTTGA CTTTTCTTAT CATCGTTCTT AGGCTTGGGC ATTGTTTAAA GGCAAGTTCC 2460 i

I <*

·· · • · · · « · · · • · · · · · · · ·· • ···· · · ♦ · · «··· ·

	• ····	• · · · • ·· ····	• · • 9
GAGAAGGGAT	' CGACAAGCCA	GATCCTCCTA	CTTGGAAGAC	AAGATTACGA	TGTGCTCTGA	2520
ACAAGAGCAA	. TGACTTTGAG	GAATTGGTCG	AGAGGAGCCA	GCTGGATATC	TCTGACCCAT	2580
ACAAGGTGTA	CAGGATTGTT	CCAGAGGGAG	CCAAAAAAGG	TAAGGGGTTT	TCCCAGCCCA	2640
GGTGGCAGGA	TAAAGGCATT	ATGGCACTCA	GAGAGCCCTT	CTTCCTAGAG	ACAGTCACGT	2700
CCTACCTCTG	CTGTAGGTTA	AGCCCAGATG	TCCTTTTGCC	CATGTCCTCT	CTGTTATAAG	2760
TGACAACCCT	GTGGTGTTAG	TATAGGATGA	CCTGGCAGAC	TTTAAGCCCC	ATGGGTGTGT	2820
GGGTTATGCA	CTTGAAGGCA	TTATTTTCAG	TTACTCCATT	CAGTTAGGAT	CTGGATCAAA	2880
TTTCCAAACA	AAATCTGGAA	AATCCATTAA	ATGTTTACTT	ACCTAATATC	CTCTAGTAAG	2940
CATTTTCAAG	AGGAGAAAGC	ACATCCCACA	CCCCATACAT	ATTCACACTT	CTTGTAATAA	3000
AACTGCTAGA	GTTTCTGGTT	TAACATGGCC	TGCTAGGGTG	GTTATGAATA	TTCAGATCTT	3060
GAGTTCCCTC	TCTTCCAACT	AGTCTACCTC	AAGCAGTGCT	CAGGAATCTG	CATTTGGTTC	3120
CAACCATACA	GGATGCCTTA	ACTAGGTACC	ATCTCACAAC	CAGAAACCAC	TTGGTGGATC	3180
ACAGGGATCC	TGGGTGGTGT	TTCCTTCCCT	GGCTGTCACT	CACAAGTCAG	CAAATGTTTA	3240
ATCAGTTTAA	TGGCAAAGAC	AAATATCTCT	CTAAGAAATT	GCTTGAAAAA	CAAACAAACA	3300
AACAAAACAA	AACAAACCTA	AAATACCCGA	TTGGTTAATA	GGGCTATGCA	TTCTAAGAAT	3360
TAAGTGCATA	GGTACTTTTA	TAAGATTTAA	GTCAGTTCCT	TGTCTTACTC	TGTGTTCTCT	3420
CTTCCTTTTC	CCCAAACACA	CAGGAGCAAA	GCAGCTCACT	TTGGATGACA	CACAGATGGC	3480
CATGGGCCAC	CCCTACCCCA	TGACAGCACC	TTATGGCTCT	CTGCCAGCCC	AGGTATGTGG	3540
TAGACTCTTG	GTCTTGTGGA	AGGCTGGCCC	ATGCCCTTTT	GACTGGCTCC	ACACAGAGAG	3600
GCAAACACAA	ATGAAAAGTG	TAGGGCTGAC	TTCTTATTTG	CTATGGCTAG	TACACACGCT	3660
GAACAAAAAC	TTGGTCAGAG	AAGGATGTTT	CAGTTCCAGT	GTGGTGTCAC	TGTCCCTGAC	3720
GCCACAGTTT	TGTTGGGGAG	TTTGATGTGT	CCCACCTGTG	GAGAGAGGCT	TCCACTGATG	3780
GTCAGATCTT	CTGGGAATCA	GACCTTTTGT	GGAAGTCAAA	ggttttggaa	GTAGTACTTT	3840
ATCATGTGAA	ACCGCAGAGC	AGCTGACTTC	TCTAGGCGTC	CCTGATGTGA	ATTACAGTAC	3900
TGTTTTATTC	ACTTTGGTGG	CTTAAAAAGG	GCAGATTTCA	CTGCGGTATT	CTTGGTGCCG	3960
TGTTCAGCCA	TATGATGAAG	CCTTACAAAA	ATCACAGCTT	TATACAATGT	CCTCATTGTG	4020
CTTTCAGACC	CTCTATGGCT	gttttttacc	TAGTGTGATA	GACAGTCCAT	GTCACTTTTT	4080
GGGCAAAATG	acttggctgc	TGGACAAAAA	AAGGGGTTCC	CTGAGGAGTT	TGGGTGATAT	4140
GAAAGGACTC	CGACACCCMC	TGATGTCTTC	CTCTTAGCAA	TCCCTGTTCT	CTGTCAGCAG	4200
GTTCATAACT	ACATGATGCC	ACCCCATGAC	AGGAGCTGGA	GGGATTATGC	CCCTGACCAG	4260

TCACACCCAG AAATCCCATA TCAATGTCCT	42 GTGACGTTTG TGTGCCAGGG	·· • · • • • ···« GCCCACGAGG CAGCAGACAG	• · · · ; • · · í · ···» · · · · • · · · • ·· ···· CCACCACTGG AAGAACAACC	·· < >4 · · • · • ··· · • · 4320 : 4380
CAAGGCCCAT	CTTGTGAAAA	TGGTAAGGAT
TGAGCTCGGG	GTGTGGACAG	CACCACAGGG	CTTTTCCCTA	CCATTGAGAT	ACCAGAGACA	4440
CATCATATGA	AGCTGCTACT	GTTGTTGTTG	TTGTTGTTGC	TGCTGCTGCT	GCTGGGGTGG	4500
TGGGGTGGTG	GGKTGGTGGG	GTGGTGGAGT	GGTGGTGGTG	GTGGTGGTTG	TGGGGTGTTG	4560 \ t
GGGTATGTTG	CCTTGTCCTG	TGAAATGTTG	AAGTCCTTAG	ATCCATGATA	GGCCTCAGTC	4620 1
TGTGTGGGGA	CTTAACTAGA	AGACCCCAGA	GATCATTCCA	AGTAGCTGAA	AAGTGCCCCA	4680
TTTTTAATAC	ATAGAGAAAA	ACATGGATGA	CAACAAATTC	TCAATGACAA	GTAATGTCAA	4740
TTATAAAACT	CGTCTATATT	TTGTTTTAAC	TTGAGTTATC	CCTTATTTCC	GATGGTGATT	4800
AAGTTGGGGG	gtttgttgta	TCCCACCTAT	CTCCCTAGTC	TGTATCTTTC	TACTCTCCTG	4860
TAAAGTAGAG	AGTTGTACCC	AGTCCACCTC	AGCAGGAAAT	CATTGCTAGT	TCATGTCTCT	4920
TGAATAATAA	TGAGTCATCT	ATAGCTGTTC	TTGGTACTAA	GGAAGGAAGG	ATCAGAGCGA	4980
AAGTAATCCA	CAAAGTGTCT	CTACAAATGA	GTGCCCTGCC	CGAAAAGACC	CACAGGGGTC	5040
CCCCCATGCT	AGCTGGGCTC	TCACAGAAGA	AACGCCCACT	AACCAGACAC	AAAAAAATTT	5100 .
CACAAACTAT	GTTCAGTGAG	ACTTGGGTCC	TTTAGTGTTT	ATTTAGGTGA	GTGCACCAAG	5160
CTCCACCTCG	GGTCCTTTTT	TGGCTGTGTA	TTTTAAGGTA	GAGTCTTGCT	AAATTACCAA	5220
GGCTAGGATC	TTCCTGCCTT	CAACTCTTGA	GTAGCTGGGA	CTACAATCTT	GTTCTARCGG	5280 j
GCTGAACATA	AAACAAGTTT	TTAGGACTTR	CAAGTTCACT	GTTTAAATAT	AAGTCTTGAC	5340
ATGGGTCGCC	GTGCGAGTAG	TTCTTTTATA	TTGTTCTGGC	AATACTTTAC	CTTGTGACAA	5400
TTTCATCAAC	ACCCTCACTC	AGTCTGTGCA	TGCTTACACT	AATCTTGCTT	TAGTGTGACA	5460
TAACTTCTCT	GCTGCCAGAG	AACACGGTTC	AGCCCCTCCC	CCTAGCTAAC	AAACAGTGAG	5520
CAGAATAAAT	GAGGGTTGAA	TAATTAATTC	ATCTTTGAAC	TAGTCTTATA	GAAGTTTGAA	5580
CTCTGACCCT	GCTGGTAACT	TGCTATGTGG	GCTGGTGCAA	GTCCCTCTCC	TTCTGGGCCT	5640
CAGTTTCCCT	ATAGATTTGG	AGTGAGCCCC	AGGTTTCCAT	CCAGAGCTGT	ACTGTGGCTC	5700
CTTCCTTCAT	CACCCTAATT	TTTATCACTG	GATGTGGACT	TTGGACTTTG	ŤCCCAŤAATC	5760
ACACGTTATT	CTGCTAGCAG	GTGCTTAGAG	GCTGTCAGGC	TTGGGTTGGA	GGCCATGGCC	5820
TCTCCCAACT	CAAGAGCCTC	CCCGCACTCA	GACTCGATAC	TTAGACATCA	TCTGATTTTT	5880
ATTTKCAAAT	GCAGGTTGCC	AGGTGACAGG	AACCTTTTAT	GCTTGTGCCC	CACCTGAGTC	5940 ’ (
CCAGGCTCCT	GGAATCCCCA	TTGAGCCAAG	CATAAGGTCT	GCTGAAGCCT	TAGCGCTCTC	1 6000 '
AGGTGAGTGT	GGCGCTTCCT	GTAAAGCTCC	GAGGGAGGGG	GCATCTCTCC	TCTACTGAGG	6060
TTGGGTGAGG	ATTTAGACTC	TCGCCTTGCA	GGCCCCGGGG	TCTGGAGTAG	GCATGGTCCA	6120

• ·

GGCTATGTGG	ACATCACGCT	GAGTCAAATA	CACTATTAGA	AATCTCCACA	GCAGTACCAG	6180
CTAGCCAAAT	ACTATTTGGA	CGATGTCTTT	AACCTTCTAC	ATCATTACCT	GCCCAGTTTT	6240
CCAGGAATGT	GTAACCAGGC	TCCTCCTCCA	GCCGACATTC	TCCATTCTCG	CAGTGTGGAA	6300
AGGCTTTATA	GGCACAAAAG	AATGCTGTTT	GTCCTTTTAG	GGTGTAGGGT	TGGCCACAAA	6360
CAGGTGGTCT	GAGTTGCTTC	CAAGGAACAC	TGGTTCTGAA	CCCTGGTCTC	TGAGAAGTTC	6420
TTATSCCCCC	TAAAGGATCA	TATAGGTCTG	ACTCCCTCAC	AACTTTGACA	GAATTGCTGA	6480
GCATGTGTGG	ATGTGATCTG	ATTTTAAAGT	TCTGTTACTA	AGGAAGCCTG	CACTTGGAGA	6540
TACTGACCAG	CATTTTAAAA	GCCCACACTC	CGTGGAAGCA	GACATCTTAT	GTCCATTTAG	6600
TCTTTAGATG	ATTTTTTTGG	ATGTTTTCAA	ATGGAATTAT	TAGAATTCTC	ATCATGCCCT	6660
CGGCTACCTT	AAAAGCCTČT	GACTGAAAAC	ATCAACTGCA	TTTTGACAAT	TTTAGACACT	6720
TCCCTTGTTC	TCGAGGGAGG	AAGAAGTTTT	AAAATCTAGT	TCCTTCCAGC	TCTGATGCTC	6780
AGGGAGACTT	TGTGAGCCAC	TCAAGAACAG	CCGAGGAGCA	CATCTGGGCA	TCAGGGGTTG	6840
TCACAGACAC	TAGAATGCTC	TAGATCCTCT	TCTGGAGCGC	CAAAGACTTG	TGTGGGTGCC	6900
CCAAGAGTAG	GAAATAAACA	GCTATTTATA	TCTCTGCAAT	CTTGTGATTT	TGGTGACATT	6960
AAATGAAATG	AAACCTGCCC	TACCACTCAC	CTCAGATGGC	CAACGCCCCC	TCTCTTTGGG	7020
TGCACCACTT	GTGCTGTTCA	TAGCTGCAGC	TATCGAAGAC	ACCATGATGT	GGGCTGTCAG	7080
AACTTGCCAT	TGAAGAATAC	GAGGCTTTTG	TGGGTTTCTT	CTTCTAGTTT	GCATAATTAA	7140
TTATCAACCC	TGAGTGCACT	TTTCAGAAAG	CTATTCTTTC	CAGGCATTGT	TGGGGCTCCA	7200
ACCACCAGCA	CGGGTATCTA	TCTCTGCCTG	GGGAGCCCTT	TGCACACCCA	GCTTGCCCTT	7260
TCGGCCCGTG	GGTGGTATTT	TAAAGTGGCT	TCTGAAATCA	ACAAAATCAT	GTGTCAATAA	7320
ATTCCTGTCT	TAAAGCTGTA	GAAAACCTAG	TTGTTGGGTT	CTTTTCAGAG	TTGAACACGA	7380
AGCTTAGAGG	GATTTCAGGG	GGTTTTACAT	TAMCCACTGG	CTTTTAGAGC	AGCTCTCATC	7440
AATTTCTTCC	CCTACTCCAA	GAGAGCTGAC	TTAAAAATAA	GAAAATAAAG	GTATCATTTT	7500
CCAGAGCCCA	GAAATTGTTA	TTTTAGTGCC	TGTCTCTAAC	ATATCTATGT	GGGTTTTGTT	7560
GTTGTGTGGT	TTTACTTAAT	GACATCATGG	TAACACCTTA	GGGAAGTTCC	AGAGCTGAGG	7620
ACACTATTTG	CTTTTCTTCT	AAGATGTTTC	TGTATTTCTT	TTACTAATAG	AAATCTGTCC	7680
CAGAGGTCAA	CTCCAAAATC	AAAATTGAGT	TGCTGGAAAA	CGAATTCCAA	TTCGGTAGTA	7740
TTATTTCATA	TTGTAGACAA	AATGCCACCA	CTGTTAACAC	CATCATCCGA	AAAGCCCTCA	7800
TAACAGGGGT	GTGCTTTCTA	ATAAAATTTG	GCTGAAAATT	CAAGAAATAT	ATACCTCTCC	7860
CCAAGAGAAG	TAAATGGCCA	CAACAACATT	TGAAAATGAT	CGTGTTAGAG	AGATCAGTTT	7920

	• • · · ·	• · · · • · · · · · ·	• · • a ·
CTTTCCACAA	GCTTCTCTTA	GTATTCTGTG	CTTGAGGTCT	AAGAATCTAC	AGGGAATAAG	7980
AGCAGCTAAC	ATCTCCAAGA	CTTCCTTGGT	CCTAGGATCT	TTCACTTGTT	CGTGGAGCAT	8040
CTTGACACTC	AAGTGTTCCA	CCTGCTGTCC	TTCGTATCAG	TCTAGTCACC	GAGTTTTTGG	8100
GGCTCTGAGC	AAGGTGGCAC	CTTTTTCAAA	TCCATCAGCA	CTGACTCCAG	AGTTTTGTTC	8160
ACAGACTGCC	GGCTGCATAT	CTGCCTGTAT	TACCGGGACA	TCCTCGTGAA	AGAGCTGACC	8220
ACGACGAGCC	CTGAAGGCTG	CCGGATCTCC	CACGGACACA	CCTATGATGT	TAGCAACCTG	8280
GACCAGGTCC	TGTTTCCCTA	CCCGGACGAC	AATGGACAGA	GGAAGAACAT	TGAGAAGTTG	8340 |
CTGAGCCACC	TGGAGAGGGG	ACTGGTCCTC	TGGATGGCTC	CAGATGGGCT	TTATGCCAAA	8400
AGACTCTGCC	AGAGTAGGAT	CTACTGGGAT	GGGCCCCTGG	CACTGTGCAG	CGATCGGCCC	8460 i
AACAAGCTAG	AAAGAGACCA	GACTTGCAAG	CTCTTTGACA	CACAGCAGTT	TCTATCAGGT	8520 t
AACACACCTC	ACAGTCTGTT	AGAATGGAGG	TGGTGGTGGG	TGCTGGCTAT	AAAGGTCTCA	8580
AATGGCAGTG	TCTGCCTACC	CCAGACAGAG	GTCTTCCTCC	TGAGATCTGT	GAGCTCATGC	8640
AGAAATAGAA	TTCCTGCCTG	ATTCATGCCT	AGCCTTTGTC	TGTTGTGTAC	TCCCCTGATT	8700
AGCAGAGGGC	CAGAAAGAGG	ATCCATATTT	GCTGCCCAGG	ATAGACACTG	GTGTGGGTTG	8760
ATCTCTTAAT	TTATCATCAT	ŤCTTTTCACT	CTAGGCTTTT	GTTTTGTTTG	TTTTGTCAGA	8820 '
ATATATGTAG	CTCAGGCTGG	CCTAGAACTC	CTGCCTCGGG	ATTTTATCTG	TACACCAGCA	8880
CATCTGGCCA	ATGAATTAAA	ATGTGGGCTT	TCAGCGGCAT	GTGCCCCACC	CCCAGAGAGG	8940 ;
TTTCACTGTG	TTGGCTCTCT	GCTCTCAGCA	AGTTTATCTG	CTGACACCTC	AGCTCTTTAG	9000 ί
GGGTTTCTAG	AAGCAGTTCG	GTTGCAGAGA	GCAGTGGAAA	TCTTTGATGT	CTACCCATTC	9060
TGGATTTGCA	CCCCACTAGG	GACAGTCCCC	ATAGGCACAG	TTGAGAATTC	ATATCTGATC	9120
AGGGCAGAGT	CTTCATGCCT	GCTCTGTGGA	GGCAGCTTTT	TAATGTCAGT	TCTTTGATGC	9180
AGACAAGACC	TGGGAACCTA	GCTCTGGGAG	GAGGAATAAA	GGTTAATGCC	AGTGAGTGGA	9240
TGTGGCTTTC	TGCTTGTGCT	GGGGGAGGAA	GCCAAGGCCT	TGCACATACA	AGGCAAGTGC	9300
TCTGCTCCAA	GTGGCGATGC	CCCCAGCCAT	GGGCAGGTTT	CTTTTCAGCA	ATCTTGTCTG	9360
TTTCATGTCT	CTCAGGCAGG	ACTAGCCTCA	GCATGACATC	CTTGTCAGAG	GGGCTTCATT	9420
GGTCCCCTTC	TCCCTGTATC	ATCCTGTCCC	CAAAGTGAGA	TTGAAGCCTA	CTCTGGTTCT	9480
CCAGTTATGG	AGTTTTAGAC	CTAGTGCCAA	GTAGGACACA	GCTGCCAACA	GCTGGTGAGA	9540 i
GAAACAGATG	CTCTTGGTGC	CCAGACACCA	CGTGGCCTCC	ATGGTTAGCT	AGTGAGGTTA	9600
AAAAAATAAC	CCTGGGCCAT	CAGAACATTG	TGACTCTTTA	CATTAAAATG	TCTCCTTGGC	9660
CTGTGCTGAT	TGCTTGACTC	AGCATGGCTA	CTTTTCTTTT	TCTTCTTTGT	CTTCTTCTCT	9720

·.· · tt

TTGACCTTGT	GCATTTCTGT	GAGTGTAGTG	CTGCAGACCC	AAGTTCTTAA	GGTTGGGTCA	9780
TGTTCCTTAA	GAGTAATGAA	GTAAAACCAG	TKCCAAGTCA	GGAGATCATA	TGTGAACTTG	9840
ACCATGTGAT	TTTGTGTCTA	GGGTCTGCTC	TAAGGGCTGG	ACTTAGGGGA	ACAGAGCCCG	9900
GGCTCTCCCA	AAGCAGACTT	CCACGTGACT	CTGGCTTTCC	GTTCACCCGC	TTTACCAGGT	9960
GTCTGAACAG	TTTGGTTTTT	TTTTTTCTTT	CTTTCTTGTG	ggttttcaga	GCTGCAAGTG	10020
TTTGCTCACC	ATGGCCGGCC	AGCACCGAGA	TTCCAGGTGA	CTCTGTGCTT	TGGTGAGGAG	10080
TTTCCAGACC	CTCAGAGACA	GAGGAAGCTC	ATCACAGCTC	ATGTGAGTAC	CTGGTTACAT	10140
CACCCGTAAA	TCACACACTG	TGGAGCTGTC	CCTTTTAGAG	AAGTGGCAAG	TGACGAGTAA	10200
ATGTCAGCTC	ACCTGGGAAA	ATAGATGTAG	ACCTTAAAAT	AGTGCAGGAG	GAAGCAGGCT	10260
CCAGTGAACA	CCACAGCTCA	GGGAGGCACC	CGCAACCTAC	TTCCAGACAA	ATTCTGTCAC	10320
CACCGAATCA	GCAGGGCAGA	TGACTTGGAC	CCAAGGMTCT	gtttgttctg	TATTCTTTAT	10380
TGTTTCATAC	AGACAGTTAC	CTGCCCTTTT	ATAGGAATTT	TCAATAGTTG	GGACCAAGTA	10440
CTGCCCTTCG	ACATCTCTGT	ŤTCTTGTGTG	GTTTTAAAGA	TGCTGTCCTT	TCGAGTAGAG	10500
TAGCACTTTC	TCCCTGGGAG	GCTGCCTGTT	ATGTATTATG	CTTCATCGGG	CCTCCTAACT	10560
TCARATAGTT	CCCAGACCCT	CGCTTTGTTG	CTGGACTTTA	GGGAGTTATT	TAACAGTTGG	10620
ACAAGGGAGG	TGGAGGAGGC	TGAGTCTTCC	CAGGAATCAG	GTAGGTCGGT	CTATCCTCAC	10680
AGCTAGGGTT	TATTCGGATA	ATGTTCATCA	CTCACTTAAT	AATTAAAAGG	TAATTCTGAA	10740
TACATGATGT	TTTTTAATTA	GAAAATTTTA	CTTAATTACA	TATCTTGAAA	AGTATGCAGT	10800
GTGGAGTAAA	GGTTGTGTCC	CAGATAGCCA	CAATATCTCA	GTGCAAATGG	GATATTAGCT	10860
CTGATGATAT	CTCTTAGTGG	AGACTGAAGA	CTAGGCATAC	AGCGCAATGG	AAGGCATTTG	10920
CTAGGCAGTG	GTAAAGCCCT	GGGTTCTAAA	CCCCGCCTAG	GATGGGGGTT	GGGCACTGAT	10980
GTTGAACATC	CAGCCTCCCT	TCTCGGTTGG	AAAAAGTAAA	ATCTAAGAAG	CAACAAACGG	11040
GCTGGAGAGA	TGGCTCAGTT	GTTAAGAGCA	CAGGCTGTTC	TTCCAGAGGT	CCTGAGTTTA	11100
ATTCCTAGAA	ACCACATGTG	CCTTACAACC	ATCTGCAGTG	AGCTCTAATG	CCATCTTCTG	11160
GTGTGTTTGA	AGACTGCTAC	AGTGAACTCA	CATACATATA	AATCTTAAAA	AAATAAAAGG	11220
CAATGAAACT	ATGATCCTGG	CCTTGAGCCT	TTTCTCAGTT	CTAACTGGTG	GTTGATATCA	11280
AATGAGACTG	CAGATGTGTG	GATGAATCTA	GCATAGATAA	GCAGTATTTT	TTTTTTAAGG	11340

• ·

				• · • ·	• · ♦ · · • * * · ·	• · * · ·
			-rv	•	······ « ·	• · · · · • ·
				• ·*· ·	• ·· ····	• 9
TAGTGAGTAA	ATTCTAGCAT	AGATCTCATT	TTAAGGACTT	TGGGTGCAGT	GGGGCTCCGC	11400
AAAAAGGGAG	CAACAATAGT	CATATAGGCA	AAGGGCCTCA	AAATGCTGCC	CCGTGGTCCA	11460
CAGATGGAAA	ACATACATGG	TCACCCATGA	ACTCTGCTGG	TCTCCTTATT	ACAGACTTAA	11520
TTCATATGGG	TGCTTACAGA	GGAATCCTAC	CAGACATCAC	ATATCAAATA	ACAAAGAGGC	11580
TTGATTTATT	GATGATTGGT	TGTTACAGAG	CACACAGCCT	GACTTGGTGA	GGCTGGCTTT	11640
GACTGGGGAT	GCAATCGATG	CTTATAAACA	AACTAGGTCC	ATCAGAGCCA	GCGAGCTGCT	11700
GTCTTGTGGC	TGRCCAGCTC	TGTCTTCTAC	TTGTGGTTCA	GAGTTCTGTC	TATTTCACAG	11760
TCATCTGGTT	CTTCAGGATG	AGCCCTTCTG	TCAGACTCAT	GAGCCTCACT	TACCCAGCAT	11820
GTTACTTAGC	CTTTTAATTT	GGTCATCTCA	TTCAATAATG	TCCAGTTAAC	TCATTCGCTA	11880
AATATCAAAT	CCAAGAGGCG	ATTGGTTTCA	AAATGCCATA	TTTATCTTCT	ATTATAGAAT	11940
CAAGAGTTCT	TTTTCCAGGG	TTTTTAATTC	CAGGTATTGT	AAGAGCAAAT	'GAAACTGGTT	12000
TTTCAAATGG	CTCTGAATGT	GAACTGCTTC	ACTGTGTTAT	GTTATCCTGT	GCAGCTTGTA	12060
GGTTTTTACT	TAGAGTCCTA	GGGTCATTTC	ATGATGTCCC	AATTGTATGG	TGTTGAGAAG	12120
AATATTCTAG	TGATGTCTTT	TTTTCTTAAA	TGTCTTATTA	AAGGTGGAAC	CTCTGCTAGC	12180
CAGACAACTG	TATTACTTTG	CTCAACAAAA	CACTGGACAT	TTCCTGAGGG	GCTACGAGTT	12240
ACCTGAACAC	GTTACCACTC	CAGATTACCA	CCGCTCCCTC	CGTCATTCTT	CCATCCAAGA	12300
GTGAGAAGAA	ATACTCTGAC	AGGGCAGCCG	GTTGCTGCCC	TTTCTCTTTG	GAAGAGCTAA	12360
GAAGTGAGTG	GGTTTCCACT	TGAAGACAAC	AACAGGGCTT	TGTGAGGAAA	ACAGCTGTAT	12420
CTGCTCAACA	GAGGAGCTTC	CCCCAGAAGA	GTGCCTGTCA	GTCATCCAGG	TCTTGACAAG	12480
TGCCAGGACT	TGGGTGACTG	TGCCCTGGCT	TATAACTGTG	AAACTTGATC	CGAATTC	12537

2) Informace pro SEQ ID NO:7:

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 24 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

CAGCCCGGGG TACTTGCCGC TGTC

2) Informace pro SEQ ID NO:8:

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 24 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA

AGACCTTATG CTTGGCTCAA TGGG

2) Informace pro SEQ ID NO:9:

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 15 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein

Gly Tyr Glu Leu Pro His Glu Val Thr Thr Pro Asp Tyr His Arg

10 15

2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 19 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

TGCAGAAGTG AAACTGAGG

2) Informace pro SEQ ID NO:11:

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka; 18 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

TGCAGAAGTG AAACTGAG 18

2) Informace pro SEQ ID NO:12

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 18 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12

TGCAGAAGTG AAACCTGG 18

2) Informace pro SEQ ID NO: 13

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 18 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13

TGCAGAAGTG AACATGAG • ·

2) Informace pro SEQ ID NO:14

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 18 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14 TGCAGAAGTG GTCCTGAG

2) Informace pro SEQ ID NO: 15

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 18 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15 GCTAGAAGTG AAACTGAG

2) Informace pro SEQ ID NO: 16

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 18 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární i i) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16 AAAGGAAGTG AAACCAAG

2) Informace pro SEQ ID NO: 17

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 18 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární • 9 ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17 TGAGGAACTG AAAACAGA

2) Informace pro SEQ ID NO: 18

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 16 párů baží

B) Typ: nukíeová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18 GGGAAAGTGA AACTAG

2) Informace pro SEQ ID NO:19

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 27 párů baží

B) Typ: nukíeová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19 CTGGACATCT CAGACCCGTA CAAAGTG 27

2) Informace pro SEQ ID NO:20

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 27 párů baží

B) Typ: nukíeová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20 CTTGACATTT TTCATTCTTG AATAGAG 2) Informace pro SEQ ID NO:21

i) Charakteristiky sekvence:

ς i · ·· ♦ · * * · · · ··· · · ····· »···♦·· · · · ··· · * * · · · · · ···· · · · * · ·· ♦ · ··

A) Délka: 21 párů baží

Β) Typ: nukleové kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21

TGCCCTCAGC TCCGAGTCCA G 21

2) Informace pro SEQ ID NO:22

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 18 párů baží

B) Typ: nukleové kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22

AACCATTTTC ACAAGCTG 18

2) Informace pro SEQ ID NO:23

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 38 párů baží

B) Typ: nukleové kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23

GGATCCGGAT CCATGAACTG GAGGGCGGCG GCCGAGGC 38

2) Informace pro SEQ ID NO:24

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 1353 párů baží

B) Typ: nukleová kyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24

ATGAACCTGG	AGGGCGGCGG	CCGAGGCGGA	GAGTTCGGCA	TGAGCGCGGT	GAGCTGCGGC	6U
AACGGGAAGC	TCCGCCAGTG	GCTGATCGAC	CAGATCGACA	GCGGCAAGTA	CCCCGGGCTG	120
GTGTGGGAGA	ACGAGGAGAA	GAGCATCTTC	CGCATCCCCT	GGAAGCACGC	GGGCAAGCAG	180
GACTACAACC	GCGAGGAGGA	CGCCGCGCTC	TTCAAGGCTT	GGGCACTGTT	TAAAGGAAAG	240
TTCCGAGAAG	GCATCGACAA	GCCGGACCCT	CCCACCTGGA	AGACGCGCCT	GCGGTGCGCT	300
TTGAACAAGA	GCAATGACTT	TGAGGAACTG	GTTGAGCGGA	GCCAGCTGGA	CATCTCAGAC	360
CCGTACAAAG	TGTACAGGAT	TGTTCCTGAG	GGAGCCAAAA	AAGGAGCCAA	GCAGCTCACC	420
CTGGAGGACC	CGCAGATGTC	CATGAGCCAC	CCCTACACCA	TGACAACGCC	TTACCCTTCG	480
CTCCCAGCCC	AGGTTCACAA	CTACATGATG	CCACCCCTCG	ACCGAAGCTG	GAGGGACTAC	540
GTCCCGGATC	AGCCACACCC	GGAAATCCCG	TACCAATGTC	CCATGACGTT	TGGACCCCGC	600
GGCCACCACT	GGCAAGGCCC	AGCTTGTGAA	AATGGTTGCC	AGGTGACAGG	AACCTTTTAT	660
GCTTGTGCCC	CACCTGAGTC	CCAGGCTCCC	GGAGTCCCCA	CAGAGCCAAG	CATAAGGTCT	720
GCCGAAGCCT	TGGCGTTCTC	AGACTGCCGG	CTGCACATCT	GCCTGTACTA	CCGGGAAATC	780
CTCGTGAAGG	AGCTGACCAC	GTCCAGCCCC	GAGGGCTGCC	GGATCTCCCA	TGGACATACG	840
TATGACGCCA	GCAACCTGGA	CCAGGTCCTG	TTCCCCTACC	CAGAGGACAA	TGGCCAGAGG	900
AAAAACATTG	AGAAGCTGCT	GAGCCACCTG	GAGAGGGGCG	TGGTCCTCTG	GATGGCCCCC	960
GACGGGCTCT	ATGCGAAAAG	ACTGTGCCAG	AGCAGGATCT	ACTGGGACGG	GCCCCTGGCG	1020
CTGTGCAACG	A.CCGGCCCAA	CAAACTGGAG	AGAGACCAGA	CCTGCAAGCT	CTTTGACACA	1080
CAGCAGTTCT	TGTCAGAGCT	GCAAGCGTTT	GCTCACCACG	GCCGCTCCCT	GCCAAGATTC	1140
CAGGTGACTC	TATGCTTTGG	AGAGGAGTTT	CCAGACCCTC	AGAGGCAAAG	AAAGCTCATC	1200
ACAGCTCACG	TAGAACCTCT	GCTAGCCAGA	CAACTATATT	ATTTTGCTCA	ACAAAACAGT	1260
GGACATTTCC	TGAGGGGCTA	CGATTTACCA	GAACACATCA	GCAATCCAGA	AGATTACCAC	1320
AGATCTATCC <	GCCATTCCTC	TATTCAAGAA	TGA			1353

I

2) Informace pro SEQ ID NO:25

i) Charakteristiky sekvence:

A) Délka: 450 aminokyselin

B) Typ: aminokyselina

C) Vlákno: jednoduché

D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25

Met 1

Asn

Leu Glu Gly 5

Gly

Gly

Arg Gly

Gly Glu 10

Phe

Gly

Met

Ser 15

Ala

Val

Ser

Cys

Gly

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ile

Asp

Gin

Ile

20

25

30

Asp

Ser

Gly

Lys

Tyr

Pro

Gly

Leu

Val

Trp

Glu

Asn

Glu

Glu

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Phe

Arg

Ile

Pro

Trp

Lys

His

Ala

Gly

Lys

Gin

Asp

Tyr

Asn

Arg

50

55

60

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Leu

Phe

Lys

Ala

Trp

Ala

Leu

Phe

Lys

Gly

Lys

65

70

75

80

Phe

Arg

Glu

Gly

Ile

Asp

Lys

Pro

Asp

Pro

Pro

Thr

Trp

Lys

Thr

Arg

85

90

95

Leu

Arg

Cys

Ala

Leu

Asn

Lys

Ser

Asn

Asp

Phe

Glu

Glu

Leu

Val

Glu

100

105

110

Arg

Ser

Gin

Leu

Asp

Ile

Ser

Asp

Pro

Tyr

Lys

Val

Tyr

Arg

Ile

Val

115

120

125

Pro

Glu

Gly

Ala

Lys

Lys

Gly

Ala

Lys

Gin

Leu

Thr

Leu

Glu

Asp

Pro

130

135

140

Gin

Met

Ser

Met

Ser

His

Pro

Tyr

Thr

Met

Thr

Thr

Pro

Tyr

Pro

Ser

145

150

155

160

Leu

Pro

Ala

Gin

Val

His-

Asn

Tyr

Met

-Met

Pro

Pro

Leu

Asp

Arg

‘Ser-

165

170

175

Trp

Arg

Asp

Tyr

Val

Pro

Asp

Gin

Pro

His

Pro

Glu

Ile

Pro

Tyr

Gin

180

185

190

Cys

Pro

Met

Thr

Phe

Gly

Pro

Arg

Gly

His

His

Trp

Gin

Gly

Pro

Ala

195

200

205

• ·

Cys

Glu Asn Gly 210

Cys

Gin

Val 215

Thr

Gly Thr Phe

Tyr 220

Ala

Cys

Ala

Pro

Pro

Glu

Ser

Gin

Ala

Pro

Gly

Val

Pro

Thr

Glu

Pro

Ser

Ile

Arg

Ser

225

230

235

240

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Phe

Ser

Asp

Cys

Arg

Leu

His

Ile

Cys

Leu

Tyr

245

250

255

Tyr

Arg

Glu

Ile

Leu

Val

Lys

Glu

Leu

Thr

Thr

Ser

Ser

Pro

Glu

Gly

260

265

270

Cys

Arg

Ile

Ser

His

Gly

His

Thr

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Leu

Asp

Gin

275

280

285

Val

Leu

Phe

Pro

Tyr

Pro

Glu

Asp

Asn

Gly

Gin

Arg

Lys

Asn

Ile

Glu

2 90

295

300

Lys

Leu

Leu

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Gly

Val

Val

Leu

Trp

Met

Ala

Pro

305

310

315

320

Asp

Gly

Leu

Tyr

Ala

Lys

Arg

Leu

Cys

Gin

Ser

Arg

Ile

Tyr

Trp

Asp

325

330

335

Gly

Pro

Leu

Ala

Leu

Cys

Asn

Asp

Arg

Pro

Asn

Lys

Leu

Glu

Arg

Asp

340

345

350

Gin

Thr

Cys

Lys

Leu

Phe

Asp

Thr

Gin

Gin

Phe

Leu

Ser

Glu

Leu

Gin

355

360

365

Ala

Phe

Ala

His

His

Gly

Arg

Ser

Leu

Pro

Arg

Phe

Gin

Val

Thr

Leu

370

375

380

Cys

Phe

Gly

Glu

Glu

Phe

Pro

Asp

Pro

Gin

Arg

Gin

Arg

Lys

Leu

Ile

385

390

395

400

Thr

Ala

His

Val

Glu

Pro

Leu

Leu

Ala

Arg

Gin

Leu

Tyr

Tyr

Phe

Ala

405

410

415

Gin

Gin

Asn

Ser

Gly

His

Phe

Leu

Arg

Gly

Tyr

Asp

Leu

Pro

Glu

His

420

425

430

Ile

Ser

Asn

Pro

Glu

Asp

Tyr

His

Arg

Ser

Ile

Arg

His

Ser

Ser

Ile

435 440 445

Claims (17)

1. Izolovaná molekula nukleová kyseliny kódující LSIRF polypeptid nebo jeho fragment, vybraná ze skupiny skládající se z:

a) molekuly nukleová kyseliny mající nukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO: 1;

b) molekuly nukleová kyseliny mající nukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO: 4;

c) molekuly nukleová kyseliny mající nukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO: 24 nebo její „Double Q“ variantu;

d) molekuly nukleová kyseliny mající nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. NO: 2;

e) molekuly nukleová kyseliny mající nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. NO: 25 nebo její „Double Q“ variantu; a

f) molekuly nukleová kyseliny mající nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s molekulou nukleová kyseliny bodu (a), (b), (c), (d), (e), nebo s jejím fragmentem.

2. Izolovaná molekula nukleová kyseliny podle nároku 1, kterou je cDNA, genomová DNA nebo syntetická DNA.

3. Izolovaná molekula nukleová kyseliny, kterou je SEQ ID NO:1.

4. Izolovaná molekula nukleová kyseliny, kterou je SEQ ID NO:4.

5. Izolovaná molekula nukleová kyseliny, kterou je SEQ ID NO:3.

6. Vektor zahrnující molekulu nukleová kyseliny podle nároku 1.

•

7. Prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfektovaná s vektorem podle nároku 6.

i • · • · · · · ♦ · • · · · ♦· • · · ··· · · • · · · · • ·· ··

8. Izolovaný polypeptid nebo jeho fragment mající specifickou DNA vazebnou aktivitu LSIRF polypeptidu.

9. Polypeptid podle nároku 8 mající aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. NO: 2.

10. Polypeptid podle nároku 8, který je produktem exprese exogenní sekvence molekuly nukleová kyseliny prokaryontní nebo eukaryontní hostitelské buňky.

11. Polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci zakódovanou pomocí DNA podle nároku 1.

12. Způsob výroby LSIRF polypeptidu zahrnující kultivaci hostitelské buňky podle nároku 7 za podmínek, které dovolují LSIRF expresi.

13. Protilátka specificky vázající polypeptid kódovaný pomocí DNA podle nároku 1.

14. Protilátka podle nároku 13, která je monoklonální protilátkou.

15. Způsob přípravy LSIRF polypeptidu zahrnující:

a) inserci vektoru zahrnujícího LSIRF gen do hostitelské buňky; a

b) kultivaci hostitelské buňky za podmínek, které dovolují expresi

LSIRF polypeptidu.

16. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, kterou je SEQ ID. NO.: 24, nebo její „Double Q“ varianta.

17. Polypeptid podle nároku 8 mající aminokyselinovou sekvenci SEQ. ID. NO.: 25, nebo její „Double Q“ varianta.