DE60213827T2

DE60213827T2 - Antikörper gegen Caspase-8, ihre Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE60213827T2
Application number: DE60213827T
Authority: DE
Inventors: David Wallach; Tanya Goncharov; Ganesh Seattle KOLUMAM
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2022-09-05
Also published as: WO2003020767A2; US20080311599A1; EA009770B1; MXPA04002104A; CA2458985A1; IL145279A0; EA200400393A1; BR0212289A; PT1423429E; WO2003020767A3; ES2265511T3; DE60213827D1; EP1423429B1; UA78526C2; KR20040044535A; US20050058648A1; CN1599755A; EP1423429A2; DK1423429T3; ATE335766T1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Antikörper für einen spezifischen Bereich in Caspase-8 und ihre Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Tumornekrosefaktor (TNF-alpha) und Lymphotoxin (TNF-beta) sind multifunktionelle pro-Entzündung-Cytokine, die hauptsächlich durch mononukleäre Leukozyten gebildet werden, die viele Wirkungen auf Zellen haben (Wallach, D. (1986) in: Interferon 7 (Ion Gresser, Hrsg.), S. 83-122, Academic Press, London; und Beutler und Cerami (1987). Sowohl TNF-alpha als auch TNF-beta initiieren ihre Wirkungen bzw. Effekte durch Binden an spezifische Zelloberflächenrezeptoren. Einige der Wirkungen sind wahrscheinlich vorteilhaft für den Organismus: Sie können z.B. Tumorzellen oder mit Virus infizierte Zellen zerstören und antibakterielle Aktivitäten von Granulozyten verstärken. Auf diese Art trägt TNF dazu bei, den Organismus gegen Tumore und infektiöse Mittel zu verteidigen und trägt zur Erholung bei einer Verletzung bei. Daher kann TNF verwendet werden als ein Antitumormittel, wobei es bei dieser Anwendung an seine Rezeptoren auf der Oberfläche der Tumorzellen bindet und wobei es Ereignisse initiiert, die zum Tod der Tumorzellen führen. TNF kann auch verwendet werden als ein Antiinfektionsmittel.
Jedoch hat TNF-alpha nachteilige Wirkungen. Es gibt Nachweise, dass Überproduktion von TNF-alpha eine hauptpathogene Rolle bei mehreren Krankheiten spielen kann. Zum Beispiel sind Wirkungen von TNF-alpha, primär auf das Gefäßsystem, dafür bekannt, dass sie einen Hauptgrund für Symptome von septischem Schock sind (Tracey et al., 1994). Bei einigen Krankheiten kann TNF eine übermäßige Kachexie bewirken durch Unterdrücken von Aktivitäten von Adipocyten und durch Bewirkung von Anorexie, und TNF-alpha wurde daher als Cachectin bezeichnet. Es wurde ebenfalls beschrieben als ein Vermittler der Schädigung von Geweben bei rheumatischen Krankheiten (Beutler und Cerami, 1987) und als ein Hauptvermittler der Schädigung, die beobachtet wird bei Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktionen (Grau GE et al., 1989). Zusätzlich ist TNF dafür bekannt, dass es im Entzündungsprozess und in vielen anderen Krankheiten beteiligt ist.
Zwei verschiedene, unabhängig exprimierte Rezeptoren, der p55 (CD120a)- und der p75 (CD120b)-TNF-Rezeptor, die beide TNF-alpha und TNF-beta spezifisch binden, initiieren und/oder vermitteln die oben angegebenen biologischen Wirkungen von TNF. Diese beiden Rezeptoren haben strukturell verschiedene intrazelluläre Domänen, was nahelegt, dass sie verschiedene Signale absenden (siehe Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Loetscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990). Jedoch müssen noch die zellulären Mechanismen, z.B. die verschiedenen Proteine und mögliche andere Faktoren, die beteiligt sind bei der intrazellulären Signalgebung des CD120a und CD120b, aufzuklären. Es ist intrazelluläre Signalgebung bzw. Signalisierung, die üblicherweise auftritt nach der Bindung des Liganden, d.h. TNF (alpha oder beta) an den Rezeptor, die verantwortlich ist für den Beginn der Kaskade der Reaktionen, die letztendlich zu der beobachteten Reaktion der Zelle auf TNF führen.
In Hinblick auf die oben genannte cytocidale Wirkung von TNF, wird in den meisten soweit untersuchten Zellen diese Wirkung hauptsächlich durch CD120a ausgelöst. Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne (Ligandenbindungsdomäne) von CD120a können an sich die cytocidale Wirkung auslösen (siehe EP 412486 ), was mit der Effektivität von Rezeptorquervernetzung durch die Antikörper korreliert, wovon angenommen wird, dass es der erste Schritt bei der Erzeugung des intrazellulären Signalisierungsprozesses ist. Weiterhin haben Mutationsstudien (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) gezeigt, dass die biologische Funktion von CD120a von der Integrität seiner intrazellulären Domäne abhängt und demgemäß ist nahegelegt worden, dass die Initiierung von intrazellulärem Signalisieren, was zu der cytocidalen Wirkung von TNF führt, als eine Konsequenz der Assoziation von zwei oder mehr intrazellulären Domänen von CD120a auftritt. Darüber hinaus tritt TNF (alpha und beta) als ein Homo-Trimer auf und es ist nahegelegt worden, dass es als solches intrazelläres Signalisieren über CD120a mittels seiner Fähigkeit zum Binden an und zum Quervernetzen der Rezeptormoleküle induziert, d.h. Bewirkung von Rezeptoraggregation (Engelmann H. et al. 1990).
Ein anderes Mitglied der TNF/NGF/Superfamilie von Rezeptoren ist der FAS/APO1-Rezeptor (CD95). CD95 vermittelt Zelltod in der Form von Apoptose (Itoh et al., 1991) und scheint ein Negativ-Selektor von autoreaktiven T-Zellen, d.h. während der Reifung von T-Zellen, zu sein, CD95 vermittelt den apoptotischen Tod von T-Zellen, die Eigenantigene erkennen. Es ist ebenfalls gefunden worden, dass Mutationen im CD95-Gen (Ipr) eine Lymphoproliferations-Krankheit bei Mäusen bewirken, die der Autoimmunkrankheit systemischer Lupus Erythematosus (SLE) bei Menschen ähnelt (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Der Ligand für CD95 ist ein Zelloberflächen-assoziiertes Molekül, das unter anderem von Killer-T-Zellen (oder cytotoxischen T-Lymphozyten – CTLs) getragen wird und daher sind sie wenn solche CTLs in Kontakt kommen mit Zellen, die CD95 tragen, in der Lage zum Induzieren von apoptotischem Zelltod der CD95-tragenden Zellen. Weiterhin sind monoklonale Antikörper hergestellt worden, die spezifisch für CD95 sind, wobei dieser monoklonale Antikörper in der Lage ist zum Induzieren von apoptotischem Zelltod in Zellen, die CD95 tragen, einschließlich Mauszellen, transformiert durch cDNA, die für humanen CD95 codieren (z.B. Itoh et al., 1991).
TNF-Rezeptor- und Fas-Signalmechanismen, die verschiedene Rezeptoren umfassen, ihre Regulierung und die abstromigen Signalmoleküle, die identifiziert sind, sind detailliert dargestellt von Wallach et al. (1990).
Es ist gefunden worden, dass bestimmte maligne Zellen und HIV-infizierte Zellen CD95 auf ihrer Oberfläche tragen, Antikörper gegen CD95 oder den CD95-Liganden verwendet werden können, um die CD95-vermittelten cytotoxischen Wirkungen in diesen Zellen auszulösen und dabei ein Mittel bereitstellen zum Bekämpfen solcher maligner Zellen oder HIV-infizierter Zellen (siehe Itoh et al., 1991). Das Auffinden noch weiterer Wege zum Verstärken der cyctotoxischen Aktivität von CD95 kann daher ebenfalls ein therapeutisches Potenzial haben.
Es bestand lange ein Bedarf zur Bereitstellung eines Wegs zum Modulieren der Zellantwort auf TNF (alpha oder beta) und CD95-Ligand. Zum Beispiel ist es in den pathologischen Situationen, die oben genannt sind, worin TNF- oder CD95-Ligand überexprimiert wird, wünschenswert die TNF- oder CD95-Ligandeninduzierten cytocidalen Wirkungen zu inhibieren, während in anderen Situationen, z.B. bei Wundheilungsanwendungen, es wünschenswert ist, die TNF-Wirkung zu verstärken, oder im Falle von CD95, bei Tumorzellen oder HIV-infizierten Zellen, ist es wünschenswert, die CD95-vermittelte Wirkung zu verstärken.
Eine Vielzahl von Ansätzen ist von der Anmelderin durchgeführt worden (siehe z.B. Europäische Patentanmeldungen Nr. EP 186,833 , EP 308,378 , EP 398,327 und EP 412,486 ), um die nachteiligen Wirkungen von TNF zu regulieren durch Inhibieren der Bindung von TNF an seine Rezeptoren, unter Verwendung von Anti-TNF-Antikörpern oder unter Verwendung von löslichen TNF-Rezeptoren (im Wesentlichen die löslichen extrazellulären Domänen des Rezeptors), um mit der Bindung von TNF an die Zelloberflächen-gebundenen TNF-Rezeptoren (TNF-Rs) zu konkurrieren. Weiterhin sind auf der Basis, dass TNF-Bindung an seine Rezeptoren erforderlich ist für die TNF-induzierten zellulären Wirkungen, Ansätze durch die Anmelderin gemacht worden (siehe z.B. EP 568,925 ) zum Modulieren der TNF-Wirkung durch Modulieren der Aktivität der TNF-Rs.
EP 568,925 betrifft ein Verfahren zum Modulieren von Signaltransduktion und/oder zur Spaltung in TNF-Rs, wobei Peptide oder andere Moleküle wechselwirken können, entweder mit dem Rezeptor an sich oder mit Effektorproteinen, die mit dem Rezeptor wechselwirken, wobei die normale Funktion der TNF-Rs moduliert wird. In EP 568,925 ist die Konstruktion und Charakterisierung verschiedener Mutantenformen von CD120a, mit Mutationen in seinen extrazellulären, transmembranen und intrazellulären Domänen, beschrieben worden. Auf diese Art wurden Regionen innerhalb der obigen Domänen von CD120a dahingehend identifiziert, dass sie wesentlich für die Funktion des Rezeptors sind, d.h. die Bindung des Liganden (TNF) und die nachfolgende Signaltransduktion und intrazelluläres Signalisieren, was letztendlich zu der beobachteten TNF-Wirkung auf die Zellen führt. Weiterhin ist ebenfalls eine Vielzahl von Ansätzen beschrieben zum Isolieren und Identifizieren von Proteinen, Peptiden oder anderen Faktoren, die in der Lage sind zum Binden an die verschiedenen Regionen in den obigen Domänen von CD120a, wobei diese Proteine, Peptide und andere Faktoren involviert sein können beim Regulieren oder Modulieren der Aktivität von TNF-Rs. Eine Vielzahl von Ansätzen zum Isolieren und Klonieren der DNA-Sequenzen, die für solche Proteine und Peptide codieren; zum Konstruieren von Expressionsvektoren zur Produktion dieser Proteine und Peptide; und zur Herstellung von Antikörpern oder Fragmenten davon, die mit CD120a oder mit den obigen Proteinen und Peptiden wechselwirken, die an verschiedene Regionen von CD120a binden, sind ebenfalls in EPO 368,925 angegeben. Jedoch spezifiziert EP 568,925 keines der tatsächlichen Proteine und Peptide, die an die intrazellulären Domänen der TNF-Rs binden. Ähnlich gibt es in EP 568,925 keine Offenbarung spezifischer Proteine oder Peptide, die in der Lage sind, zum Binden der intrazellulären Domäne von CD95.
Daher wäre es, wenn es wünschenswert ist, die Wirkung von TNF oder des CD95-Liganden zu inhibieren, wünschenswert, die Menge oder die Aktivität von TNF-Rs oder CD95 an der Zelloberfläche abzusenken, während eine Erhöhung der Menge oder der Aktivität von TNF-R oder CD95 wünschenswert wäre, wenn eine verstärkte TNF- oder CD95-Liganden-Wirkung angedacht ist. Schließlich sind die Promotoren von sowohl dem CD120a als auch CD120b sequenziert, analysiert worden und eine Vielzahl von Schlüsselsequenzmotiven ist gefunden worden, die spezifisch sind für verschiedene transkriptionsregulierende Faktoren, und als solche kann die Expression dieser TNF-Rs gesteuert werden an ihrem Promotorgrad, d.h. Inhibieren der Transkription der Promotoren für eine Krankheit mit der Anzahl von Rezeptoren und eine Verstärkung der Transkription von den Promotoren für eine Erhöhung der Anzahl von Rezeptoren ( EP 606,869 und WO 9531206).
Wenngleich es bekannt ist, dass die Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptoren und der strukturell verwandte Rezeptor CD95 bei Stimulierung durch Leukozytenproduzierte Liganden destruktive Aktivitäten in Zellen auslösen, die zu ihrem eigenen Tod führen, sind die Mechanismen dieses Auslösens bisher wenig verstanden. Mutationsstudien zeigen an, dass in CD95 und CD120a, die für Cytotoxizität signalisieren, verschiedene Regionen innerhalb ihrer intrazellulären Domänen umfassen (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh und Nagata, 1993). Diese Regionen (die „Toddomänen") haben Sequenzähnlichkeit. Die „Toddomänen" von sowohl CD95 als auch CD120a neigen zur Selbstassoziierung. Ihre Selbstassoziierung fördert anscheinend die Rezeptoraggregation, was notwendig ist zur Signalinitiierung (siehe Bigda et al., 1994; Boldin et al., 1995), und bei hohen Gehalten Rezeptorexpression zum Auslösen von Liganden-unabhängiger Signalisierung führen kann (Boldin et al., 1995).
Einige der cytotoxischen Wirkungen von Lymphozyten werden vermittelt durch Wechselwirken eines Lymphozyt-produzierten Liganden mit CD95 der Targetzelle (siehe ebenfalls Nagata und Goldstein, 1995). Zell-Abtötung durch mononukleäre Phagozyten umfasst TNF und seinen Rezeptor CD120a (siehe auch Vandenabeele et al., 1995). Wie andere Rezeptor-induzierte Wirkungen tritt Zelltodinduktion durch die TNF-Rezeptoren und CD95 über eine Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf, was von Ligand-Rezeptor-Bindung zu der evtl. Aktivierung von enzymatischen Effektorfunktionen führt, von welchen gezeigt worden ist, dass sie nicht-enzymatische Protein-Protein-Wechselwirkungen umfassen, die Signalisierung für Zelltod auslösen: Bindung von trimerem TNF- oder den CD95-Ligandenmolekülen an die Rezeptoren, wobei die resultierenden Wechselwirkungen ihrer intrazellulären Domänen (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh und Nagata, 1993) erhöht werden durch eine Neigung der Toddomäne-Motive zur Selbstassoziierung (Boldin et al., 1995a) und induzierte Bindung der beiden cytoplasmatischen Proteine (welche ebenfalls aneinander binden können) an die intrazellulären Domänen des Rezeptors – MORT-1 (oder FADD), an CD95 (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) und TRADD an CD120a (Hsu et al., 1996). Neben ihrer Bindung an CD95 und CD120a sind MORT-1 und TRADD ebenfalls in der Lage zum Binden aneinander, als auch an andere Toddomäne-enthaltende Proteine, wie etwa RIP (Stanger et al., 1995), was zu einer funktionellen „Beziehung" („cross-talk") zwischen CD95 und CD120a führt. Diese Bindung tritt durch ein konserviertes Sequenzmotiv auf, das „Toddomänemodul", das den Rezeptoren und ihren assoziierten Proteinen gemeinsam ist. Darüber hinaus, wenngleich im Hefe-zwei-Hybrid-Test gezeigt worden ist, dass MORT-1 spontan an CD95 bindet, findet in Säugerzellen diese Bindung nur nach Stimulierung des Rezeptors statt, wodurch nahegelegt wird, dass MORT-1 an dem Initiierungsereignis des CD95-Signalisierens teilnimmt. MORT-1 enthält keine Sequenzmotivcharakteristik der enzymatischen Aktivität und daher scheint seine Fähigkeit zum Auslösen von Zelltod keine Eigenaktivität von MORT-1 an sich zu umfassen, sondern eher eine Aktivierung von einem oder mehreren anderen Proteinen, die MORT-1 binden und weiter abstromig in der Signalkaskade wirken. Zelluläre Expression von MORT-1-Mutanten, denen der N-terminale Teil des Moleküls fehlt, erwiesen sich dahingehend, dass sie Cytotoxizitätinduktion durch CD95 oder CD120a blockieren (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), wodurch angezeigt wird, dass diese N-terminale Region die Signalisierung für die cytotoxische Wirkung beider Rezeptoren durch Protein-Protein-Wechselwirkungen überträgt.
Eine Gruppe cytoplasmatischer Thiolproteasen, die strukturell verwandt sind mit der Caenorhabditis elegans-Protease CED3 und dem Säuger-Interleukin-1-betakonvertierenden Enzym (ICE) sind impliziert gewesen beim Einsetzen verschiedener physiologischer Zelltodprozesse (in einer Übersicht dargestellt von Kumar, 1995, und Henkart, 1996). Es gab ebenfalls Hinweise darauf, dass Protease(en) dieser Familie beteiligt ist (sind) an der Zellcytotoxizität, die von CD95 und TNF-Rs induziert wird. Spezifische Peptidinhibitoren der Proteasen und zwei-Virus-codierte Proteine, die ihre Funktion blockieren, das Cowpox-Protein crmA und das Baculovirus p35-Protein, erwiesen sich so, dass sie den Zellen Schutz bereitstellen gegen diese Zellcytotoxizität (Enari et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). Rasche Abspaltung bestimmter spezifischer zellulärer Proteine, anscheinend vermittelt durch Protease(n) der CED3/ICE (Caspase)-Familie könnten in Zellen gezeigt werden kurz nach Stimulierung von CD95 oder TNF-Rs.
Eine solche Protease und verschiedene Isoformen davon (einschließlich inhibitorische) ist als MACH (nun Caspase-8) bekannt, welche ein MORT-1-Bindungsprotein ist, ist isoliert, kloniert, charakterisiert worden und seine möglichen Anwendungen sind ebenfalls beschrieben, wie im Einzelnen angegeben und wie hier unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeführt, in der PCT/US96/10521 des gleichen Anmelders, und in einer Publikation der Erfinder der vorliegenden Erfindung (Boldin et al., 1996). Eine andere solche Protease und verschiedene Isoformen davon (einschließlich inhibierende), bezeichnet als Mch4 (ebenfalls Caspase-10 genannt), ist ebenfalls isoliert und charakterisiert worden durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung (unveröffentlicht) und andere (Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996). Caspase-10 ist ebenfalls ein MORT-1-Bindungsprotein. Daher sind Einzelheiten, die alle Aspekte, Merkmale, Charakteristika und Verwendungen von Caspase-10 betreffen in den oben genannten Publikationen angegeben.
Es sollte ebenfalls festgehalten werden, dass Caspasen, Caspase-8 und Caspase-10, die ähnliche pro-Domänen aufweisen (siehe Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincent und Dixit, 1997) über ihre pro-Domänen mit MORT-1 wechselwirken, wobei diese Wechselwirkung über die „Todeffektordomäne", DED, geschieht, die in dem N-terminalen Teil von MORT-1 vorliegt und doppelt in Caspase-8 und Caspase-10 vorliegt (siehe Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995).
Caspasen (Cysteinaspartat-spezifische Proteinasen) sind eine wachsende Familie von Cysteinproteasen, die mehrere gemeinsame Merkmale teilen. Die meisten der Caspasen erwiesen sich so, dass sie teilnehmen bei der Initiierung und Ausführung von programmiertem Zelltod oder Apoptose, während die anderen an der Produktion von Proentzündungscytokinen beteiligt sind (Nicholson DW et al., 1997, Salvesen GS et al., 1997, Cohen GM 1997). Sie werden synthetisiert als katalytisch nahezu inaktive Vorläufer und werden im Allgemeinen aktiviert durch Spaltung nach spezifischen internen Aspartatresten, die in Interdomänelinkern vorliegen. Die Spaltungsstellen von Caspasen sind definiert durch Tetrapeptidsequenzen (X-X-X-D) und Spaltung tritt immer unterstromig von der Aspartamsäure statt. Als ein Ergebnis können bestimmte reife aktive Caspasen sich selbst als auch andere inaktive Vorläufer prozessieren und aktivieren (Fernandes-Alnemri T. et al., 1996, Srinivasula SM et al., 1996).
Aktivierung des programmierten Zelltodprozesses ist im Allgemeinen spezifisch und umfasst aufeinanderfolgendes Prozessieren von unterstromigen Caspasen, die als „Ausführungs"-Caspasen bezeichnet werden, durch oberstromige Caspasen, die als „Initiator"-Caspasen bezeichnet werden. Die funktionellen Charakteristika der beiden Klassen von Caspasen werden ebenfalls durch ihre Struktur widergespiegelt. Tatsächlich enthalten die „Initiatorcaspasen" längere pro-Domäneregionen im Vergleich mit „Ausführungscaspasen" (Salvesen GS et al., 1997, Cohen GM, 1997). Die lange pro-Domäne erlaubt es, den Initiator- oder „apicalen" Caspasen, dass sie aktiviert werden durch Auslösen der Todrezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie. Bei Liganden-induzierter Trimerisierung der Todrezeptoren werden die Initiatorcaspasen rekrutiert durch ihre lange N-terminale pro-Domäne, um mit spezifischen Adaptermolekülen wechselzuwirken, um den Tod-induzierenden Signalkomplex zu bilden (Cohen GM, 1997, Kischkel FC et al., 1995). Zum Beispiel werden Caspase-8/MACH und möglicherweise Caspase-10, die zwei DEDs enthalten, zu dem Rezeptorkomplex rekrutiert durch die Adaptermoleküle FADD/MORT-1, während angenommen wird, dass Caspase-2 rekrutiert wird durch CRADD/RAIDD und RIP (Nagata S. et al., 1997, MacFarlane M. et al., 1997, Ahmad M. et al., 1997, Duan H. et al., 1997). Aufgrund der trimeren Natur des aktivierten Rezeptorkomplexes wird angenommen, dass mindestens zwei Caspasemoleküle in enge Nähe zueinander gebracht werden, was zu ihrer Aktivierung durch autokatalytisches Prozessieren führt (Yang et al., 1998, Muzio et al., 1998).
Caspasen werden synthetisiert als pro-Enzyme, die aus drei Hauptunterheiten bestehen, der N-terminalen pro-Domäne und zwei Sub- bzw. Untereinheiten, welche manchmal durch ein Linkerpeptid getrennt sind. Die beiden Untereinheiten sind bezeichnet worden als „lange" oder Untereinheit 1 (Sub-1 ), die den Hauptteil der aktiven enzymatischen Stelle enthält, und „kurze" oder Untereinheit 2 (Sub-2). Zur vollen Aktivierung des Enzyms wird es prozessiert, um die pro-Domäne und die beiden Unterdomänen bzw. Subdomänen zu bilden. Die beiden Untereinheiten bilden ein Heterodimer. Basierend auf der deduzierten dreidimensionalen Struktur von Caspase-3 erscheint es, dass das C-terminate Ende der langen Domäne als auch des N-Terminus der kurzen Subdomäne freigesetzt werden müssen und der C-Terminus der kurzen Untereinheit in enge Nähe zu dem N-Terminus der langen Untereinheit gebracht werden muss, um ein korrekt gefaltetes und aktives Enzym zu ergeben (Rotonda et al., 1996, Mittl et al., 1997, Srinivasula et al., 1998).
Wenngleich Wege, die zu Apoptose oder Nekrose führen, immer so betrachtet wurden, dass sie vollständig verschieden sind, haben jüngere Entdeckungen nahegelegt, dass die Caspasen, die die Hauptvermittler von Apoptose darstellen, ebenfalls bei Nekrose impliziert sein können, sowohl auf eine negative als auch eine positive Art. Tatsächlich ist gezeigt worden, dass Überexpression des Caspaseinhibitors CrmA in L929-Zellen um einen Faktor von 1000 die Empfindlichkeit dieser Zellen für die Nekrose-Aktivität von TNF erhöhen (Vercammen et al., 1998), was eine inhibierende Rolle von Caspasen auf TNF-induzierte nekrotische Aktivität anzeigt. Darüber hinaus wurde kürzlich nahegelegt, dass die TNFR1- und Fas-assoziierten Toddomänen, die eine entscheidende Rolle bei der Apoptoseinduktion dieser Liganden spielen (in einer Übersicht dargestellt in Wallach et al., 1999), ebenfalls eine wichtige Rolle bei Nekroseinduktion spielen (Boone et al., 2000). Interessanterweise wurde gezeigt, dass FasL-induzierte Lebernekrose geblockt wird durch Caspaseinhibitoren (Kunstle et al., 1997).
Da Caspase-vermittelte Proteolyse ein kritisches und zentrales Element des Apoptoseprozesses ist [Nicholson D.W. und Thornberry, N.A. (1997), Villa et al. (1997) und Salvesen, G. S., und Dixit, V. M. (1997)] ist Identifizierung der äußerst wichtigen unterstromigen molekularen Targets dieser Proteasen unvermeidbar zum Verstehen von apoptotischer Signalübertragung. Es ist gezeigt worden, dass verschiedene Struktur- und Signalproteine durch Caspasen während apoptotischem Tod gespalten werden [Nicholson D.W. und Thornberry, N.A. (1997), Villa, P. et al., (1997)], einschließlich ICAD, ein Inhibitor von Caspaseaktivierter Dnase, der essenziell für Internukleosomal-DNA-Abbau, jedoch nicht für die Ausführung von Apoptose ist (Enari, M. et al., (1998) und Sakahira et al., (1998). Gelsolin, ein Actin-Regulator-Protein, das Cytoplasmaactingelsoltransformation moduliert (Yin, H.L. und Stossel, T.P. (1979) ist impliziert bei der Apoptose auf der Basis von (i) seiner Spaltung während Apoptose in vivo [Kothakota, S. et al. (1997)] (ii) Verhinderung von Apoptose durch seine Überexpression [Ohtsu, M. et al., (1997)] und (iii) Induktion von Apoptose durch eines der gespaltenen Produkte [Kothakota, S. et al. (1997)]. Gelsolin weist Ca+2-aktivierte Mehrfachaktivitäten auf, verstärkt Actinfilamente und cappt die schnell wachsenden Enden von Filamenten und bildet einen Keim für Actinpolymerisation [Yin, H.L. und Stossel, T.P., (1980). Kurth, M. und Bryan, J. (1984), Janmey, P.A. und Stossel, T.P. (1987)].
Die Anmeldung WO 0039160 offenbart Caspase-8-Wechselwirkungsproteine, die in der Lage sind zum Wechselwirken mit Sub-1 und/oder Sub-2 von Caspase-8.
Die Caspase-Wechselwirkungsproteine wurden durch zwei-Hybrid-Screening unter Verwendung eines Einzelkettenkonstrukts von Caspase-8 entdeckt.
Typischerweise umfasst Co-Reinigung von Caspase-8- und Caspase-8-gebundenen Proteinen Makierungs (tag)-Epitop-Modifizierung von Caspase-8 (z.B. HA-Fusion an Caspase-8, Roth et al.) und die Verwendung von Anti-Markierung (tag)-spezifischen Antikörpern. Jedoch kann Epitop-Markierung von Proteinen die Aktivität des markierten Proteins beeinträchtigen.
Caspase-8-spezifische Antikörper sind erhältlich:
Anti-Mach Kat. Nr. 218777, ist ein polyklonaler Antikörper aus Huhn von Calbiochem, der sowohl pro-Caspase-8 als auch aktive Caspase-8 erkennt. Das zum Erhalten dieses Antikörpers verwendete Immunogen war das humane Volllängen-rekombinante Caspase-8-Protein.
Caspase-8 (D384) 6B6 ist ein monoklonaler Antikörper von Cell Signaling Technology, erzeugt durch Immunisieren von Mäusen mit einem synthetischen Peptid, KLH-gekoppelt, das Resten entspricht, die am Aminoterminus von Caspase-8 Sub-2 angeordnet sind. Dieser Antikörper weist spezifisch endogene Gehalte einer abgespaltenen 10 kDa kleinen Sub- bzw. Untereinheit von Caspase-8 durch Western-Blotten nach. Dieser Mab ist erforderlich für Western-Blotting und reagiert nicht über Kreuz mit Volllängen-Caspase-8.
Der B9-2-Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper von Pharmingen (A Becton Dickinson Company), der eine 55 kDa-Bahn erkennt, die Caspase-8 entspricht. Ein rekombinantes humanes Caspase-8-Proteinfragment, das den Aminosäuren 335-469 von Caspase-8 entspricht, wurde als Immunogen verwendet (Weaver et al. 2000). Dieser monoklonale Antikörper ist erforderlich, um die Gehalte von Caspase-8 bei Western-Blot-Analyse darzustellen. Die Identifizierung von aktiver Caspase-8 unter Verwendung dieser Mabs kann nicht funktionieren aufgrund dessen, dass das Fragment, das verwendet wird zum Erzeugen der Antikörper nur in nicht-aktiver Caspase-8 intakt ist.
Caspase-8 p10 (s-19):sc-6135 ist ein Affinitäts-gereinigter polyklonaler Antikörper aus Ziege von Santa Cruz Biotechnology, entwickelt gegen ein Peptidmapping nahe des Carboxyterminus von Caspase-8 Sub-2 humanen Ursprungs. Dieser polyklonale Antikörper reagiert mit der p10-Untereinheit (Sub-2) und Vorläufer-Caspase-8 humanen Ursprungs durch Wester-Blotting, Immunpräzipitation und Immunhistochemie. Er ist nicht kreuzreaktiv mit Caspase-8 p20 (Sub-1).
Caspase-8 1C12 ist ein monoklonaler Antikörper von Cell Signaling Technology, erzeugt durch Immunisieren von Mäusen mit einem synthetischen Peptid, KLH-gekoppelt, entsprechend den Resten, die an dem Carboxyterminus von Caspase-8 Sub-1 angeordnet sind. Dieser Antikörper weist spezifisch pro-Caspase-8 und aktive Caspase-8 durch Western-Blotting nach, ist jedoch nicht in der Lage zum Co-Präzipitieren von p72.
Die genaue Sequenz des zum Immunisieren von Mäusen zur Erzeugung dieser Mab verwendeten Peptids ist unbekannt.
Ein anderer Antikörper, der spezifisch für Caspase-8 ist, bezeichnet als GD-13, wird von Sigma unter der Produktnummer C2976 bereitgestellt. Es ist ebenfalls ein Antikörper aus Kaninchen, erzeugt durch Immunisieren von Kaninchen mit einem synthetischen Peptid, das ähnlich zu dem einen gemäß SEQ ID No: 4 ist. Wie bei 1C12 von Cell Signaling ist dieser Antikörper ebenfalls nicht in der Lage zum Co-Präzipitieren von p72.
Caspase-8 p20 (H-134):sc-7890 ist ein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen von Santa Cruz Biotechnology, entwickelt gegen ein rekombinantes Protein, das den Aminosäuren 217-350 entspricht, angeordnet innerhalb der Caspase-8 Sub-1 humanen Ursprungs. Dieser polyklonale Antikörper reagiert mit der aktiven und Vorläufer-Caspase-8 aus Maus, Ratte und Mensch durch Western-Blotting, Immunpräzipitation und Immunohistochemie.
Jedoch gibt es keine Information im technischen Datenblatt über die Effizienz mit welcher Caspase-8 immunpräzipitiert wird und ob ein gebundenes Protein copräzipitiert werden kann und ob so die Gewinnung von Caspase-8- und Caspase-8-gebundenen Proteinen aus dem Immunkomplex möglich ist.
Daher ist derzeit von keinen polyklonalen und monoklonalen Antikörpern gegen Caspase-8 berichtet worden, welche alle die folgenden Merkmale umfassen: welche die in der Lage sind zum wirkungsvollen Immunpräziptieren von sowohl pro-Caspase-8 und aktiver Caspase-8 als auch zum Dissoziieren von Caspase-8 in dem Immunpräzipitat-Komplex, was eine Co-Reinigung von Caspase-8 und Caspase-8-gebundenen Proteinen erlaubt.
Daher löst das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein lange bestehendes Problem im Bereich der Co-Präzipitation und Reinigung von Caspase-8- und Caspase-8-gebundenen Proteinen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Antikörper (polyklonal, monoklonal, chimär, voll-humanisierter anti-anti Id-Antikörper oder Fragment davon), erhältlich durch Immunisierung eines Lebewesens mit einem Peptid aus dem C-terminalen Ende der Caspase-8 Sub-1-Einheit (z.B. CQGDNYQKGIPVETD), und Fragmente davon, worin das Peptid, das verwendet wird zur Immunisierung die Aminosäuresequenz CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID Nr: 4) aufweist, der in der Lage ist zum Co-Immunpräzipitieren der Caspase (sowohl aktive Caspase-8 als auch pro-Caspase-8) zusammen mit dem pro-Caspase-8-assoziierten Protein p72 (SEQ ID Nr: 3) und zum wirkungsvollen Freisetzen der Caspase und assoziiertem Protein aus dem Immunkomplex bei Elution unter Verwendung des Peptids, entsprechend SEQ ID Nr: 4. Im Spezielleren kann das Peptid, das zur Immunisierung verwendet wird, vorzugsweise an KLH gekoppelt sein.
In einer Ausführungsform ist der Antikörper gemäß der Erfindung der Immunglobulin-Isotyp IgG₁.
In einer anderen Ausführungsform löst der Antikörper der Erfindung das Prozessieren von Caspase-8 aus.
Unter einem Aspekt liefert die Erfindung einen Antikörper, der verwendet werden kann zur Entwicklung eines ELISA-Assays.
Unter einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers gemäß der Erfindung und die Verwendung des Antikörpers für das Verfahren zur Isolierung von Caspase-assoziierten Proteinen, bevorzugter Caspase-assoziiertes Protein, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr: 3 oder eine Isoform, Allelvariante, Fragment, ein funktionelles Analoges, ein Fusionsprotein, ein Mutant oder Derivat davon, vorliegend in Zellproben, z.B. Zellextrakten, Expressions-cDNA-Bibliotheken und genomischen oder kombinatorischen Peptidbibliotheken. Im Spezielleren betrifft die Erfindung die Verwendung des Antikörpers zur Isolierung von Caspase-assoziierten Proteinen, worin die Caspase Caspase-8 ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Immunogen, das zur Immunisierung verwendet wird an einen Träger, vorzugsweise KLH, gebunden.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Reinigen einer Caspase, vorzugsweise Caspase-8, und Caspase-assoziierten Proteinen, umfassend das Inkontaktbringen eines Materials, das humane Caspase enthält, mit dem monoklonalen Antikörper. Im Spezielleren werden die Caspase-assoziierten Proteine eluiert, vorzugsweise mit dem Peptid, das zur Immunisierung verwendet wird.
Zusätzlich liefert die Erfindung die Verwendung von Epitop 179 (SEQ ID:4) zum Erhalten eines Antikörpers gemäß der Erfindung, umfassend Immunisierung eines Lebewesens mit einem solchen Epitop.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Aminosäuresequenz von pro-Caspase-8. Die Peptidsequenzen von Caspase-8, die zur Herstellung von Mabs verwendet werden, sind fett und unterstrichen dargestellt.

Peptid 179 – Das Peptid CQGDNYQKGIPVETD, entsprechend dem C-Terminus der großen Subeinheit von Caspase-8 (Sub-1 ).
Peptid 182 – Das Peptid LSSPQTRYIPDEAD, entsprechend dem N-Terminus der kleinen Subeinheit der Caspase-8 (Sub-2, Reste Lys385-Gly399).
Peptid 183 – Das Peptid SESQTLDKVYQMKSKPR, entsprechend dem N-Terminus von Sub-1 (Reste Ser217-Gly234).

2 zeigt die effektive Immunpräzipitation von kleinsten Mengen von Caspase-8, die gefunden werden in Lysaten von BJAB-Zellen, unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen Epitop 179. Abreicherung von Caspase-8 aus den BJAB-Zelllysaten (hergestellt vor, –, und nach, +, Fas-Rezeptorstimulierung) durch Immunpräzipitation mit verschiedenen Antikörpern ist von links nach rechts gezeigt:

Bahnen 3 und 4, Mab 179: ein monoklonalen Antikörper, hergestellt gegen ein Peptid entsprechend dem C-Terminus von Sub-1 (die große Untereinheit der Caspase-8, Reste Cys360-Asp374).
Bahnen 5 und 6, Mab 183.1 und Bahnen 7 und 8, Mab 183.2, zwei monoklonale Antikörper, hergestellt gegen ein Peptid entsprechend dem N-Terminus von Sub-1 (Reste Ser217-Gly234).
Bahnen 9 und 10, Mab 182, ein monoklonaler Antikörper, hergestellt gegen ein Peptid entsprechend dem N-Terminus von Sub-2 (die kleine Subeinheit der Caspase-8) (Reste Lys385-Asp399).
Bahn 11, NMS – normales Serum aus Maus.

Die Figur zeigt Western-Blot-Beurteilungen der Caspase-8-Mengen, die in den Zelllysaten verbleiben, nachfolgend auf Immunpräzipitation durch die angegebenen Antikörper und in nichtpräzipitierten Gesamtzelllysaten (Bahnen 1 und 2).
3a zeigt die Elution der Caspase-8, immunpräzipitiert wie in 2 durch Konkurrieren mit den Peptiden, gegen welche die verschiedenen Antikörper entwickelt worden sind. Caspase-8 in den Eluaten der Immunpräzipitate, produziert mit den angegebenen Antikörpern, wird durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen (wie in 2).
3b zeigt die Elution der Caspase-8, immunpräzipitiert wie in 2, durch Konkurrieren mit den Peptiden, gegen welche die verschiedenen Antikörper entwickelt worden sind. Caspase-8 in den Eluaten der mit den Antikörpern produzierten Immunpräzipitate sind durch Silver-Färbung gezeigt.
4 zeigt eine wirkungsvolle Immunpräzipitation kleinster Mengen von Caspase-8, die in Lysaten von BJAB-Zellen gefunden werden, unter Verwendung von polyklonalem Serum, hergestellt durch Immunisierung mit einem Peptid entsprechend dem C-Terminus von Sub-1 (die große Untereinheit der Caspase-8, Reste Cys360-Asp374). Abreicherung von Caspase-8 aus den BJAB-Zelllysaten (hergestellt vor, –, und nach, +, Fas-Rezeptor-Stimulierung) durch Immunpräzipitation mit verschiedenen Antikörpern ist von links nach rechts gezeigt. Caspase-8, die in dem Lysat zurückbleibt, wird durch Western-Blot-Analyse nach Immunpräzipitation mit den folgenden Antikörpern nachgewiesen:

Bahnen 3 und 4, NMS – normales Serum aus Maus.
Bahnen 5 und 6, Anti-179-polyklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, hergestellt gegen den C-Terminus von Sub-1 (die große Untereinheit der Caspase-8, Reste Cys360-Asp374).
Bahnen 7 und 8 Mab182.
TL – Gesamtzelllysat.

5 zeigt immunpräzipitierte und eluierte Caspase-8 von Lysaten von nicht-stimulierten BJAB-Zellen, unter Verwendung verschiedener Antikörper. Es werden von links nach rechts die Gehalte von Caspase-8 gezeigt, nachgewiesen durch Western-Blot-Analyse nach Elution von Immunpräzipitaten, durchgeführt mit den folgenden Antikörpern:

Bahn 1, Anti-183-polyklonales Serum gegen den N-Terminus von Sub-1 (Reste Ser217-Gly234).
Bahn 2, Mab183.2, ein monoklonaler Antikörper gegen den N-Terminus von Sub-1 (Reste Ser217-Gly234).
Bahn 3, Mab179, ein monoklonaler Antikörper gegen den C-Terminus von Sub-1 (die große Untereinheit der Caspase-8, Reste Cys360-Asp374).

Das kleine (5,6 kDa) Fragment von Caspase-8, hergestellt durch das neue Prozessiererfahren, das durch Mab179 auferlegt wird, ist mit einem Pfeil markiert.
6 zeigt Caspase-8 und assoziiertes Protein (P72/Cari), das immunpräzipitiert worden ist durch Mab179 aus Lysaten von BJAB-Zellen vor oder nach einer Stunde Stimulierung mit Fas-Ligand und Elution durch Peptid 179. Immunpräzipitierte Caspase-8 und assoziierte Proteine mit Mab179 wurden eluiert (wie in 3b), aufgelöst durch SDS-PAGE und Silver-gefärbt. Die Bahnen 1 und 2 zeigen Kontrollen, worin die Zelllysate mit MIgG1, Immunglobulin aus Maus IgG1, immunpräzipitiert wurden.
7 zeigt eine schematische Darstellung von P72-Proteinmotiven. Ein wendelförmiges Wendelmotiv (coild coil-Motiv) (C) und zwei Tandem-lokalisierte „SURP-Motive" (S) sind nahe des N-Terminus des Proteins lokalisiert und ein „G-Patch"-Motiv ist am C-Terminus des Proteins (G-Motiv) lokalisiert. Der Aspartamrest D600, der in dem G-Motiv vorliegt, ist ebenfalls angegeben. D600, ein Mutant, worin der Rest D600 in dem Protein durch den Glutaminsäurerest ersetzt wurde.
8 zeigt eine schematische Darstellung des Ansatzes, der verwendet wird für die Volllängenherstellung von p72-cDNA. Ein EST-Klon IMAGE 2964545, erhalten von Incyte Genomics, dem die Sequenz der ersten 21 Nukleotide fehlt (die für die ersten 7 Aminosäuren codieren) wurde als das Templat für eine erste Polymerasekettenreaktion (PCR) zusammen mit einem Paar von Primern verwendet: der Vorwärtsprimer, P2, enthaltend überlappende Nukleinsäuren mit dem 5' EST-Klon und zusätzlichen 15 Nukleotiden von den 21 fehlenden Nukleotiden und der reverse Primer, P3, enthaltend überlappende Sequenzen mit dem 3' EST. Das resultierende PCR-Produkt wurde verwendet als ein Templat für eine zweite PCR, zusammen mit einem Paar von Primern: der Vorwärtsprimer, P1, enthaltend die gesamten 21 fehlenden Nukleotide und 5 Nukleinsäuren des EST und der reverse Primer, P3, enthaltend überlappende Sequenzen mit dem 3' EST.
9 zeigt Co-Immunpräzipitation von Caspase-8 und p72 durch Mab179 von den Lysaten von BJAB-Zellen zum Zeitpunkt Null und nach 20 Minuten Stimulierung mit Fas-Ligand. Die nach Immunpräzipitation mit Mab 179 eluierten Proteine werden in SDS-PAGE-Gelen aufgelöst und werden durch Silver-Färbung nachgewiesen. Eine Bahn mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 72,5 kDa, entsprechend p72, wird co-präzipitiert mit pro-Caspase-8 vor Fas-Ligand-Stimulierung (Bahn 3). Nach 20 Minuten Stimulierung nimmt der Gehalt der 72,5 kDa-Bahn ab und eine neue Bahn, die einem Protein mit einem geringeren scheinbaren Molekulargewicht von etwa 68 kDa entspricht, wird nachgewiesen (Bahn 4).
Die Bahnen 1 und 2 zeigen die negativen Kontrollen, die Immunpräzipitation von Zelllysaten mit MIgG1, Mausimmunglobulin IgG1, umfassen.
10 zeigt die Spaltung von p72 durch aktive Caspase-8. Ein Protein, das durch die P72 cDNA codiert wird, wurde in vitro in Reticulocytenlysaten in der Gegenwart von ³⁵S-Methionin exprimiert, unter Verwendung des TnT T7-gekoppelten Reticulocytenlysatsystems und getestet nach Inkubation für 1 Stunde bei 37 °C in der Gegenwart oder Abwesenheit rekombinanter aktiver Caspase-8. Zusätzlich wurde die Spaltung von p72 untersucht mit TnT-Produkten, die codiert werden durch zwei verschiedene p72 cDNA-Mutanten: einer, der codiert für p72, worin der Rest D600, von dem angenommen wird, dass er der Targetrest für Caspase-8 ist, mutiert war zu E [p72 (D600E)], und ein anderer, worin das Gen deletiert ist und dem resultierenden verkürzten Protein die Reste unterstromig fehlen [D600 p72 (1-600)]. Die resultierenden Proteine wurden auf SDS-PAGE getrennt und die Ergebnisse wurden durch Phosphobilddarstellung visualisiert.
11 zeigt Caspase-8 und p72, die co-immunpräzipitiert wurden durch Mab179 aus den Lysaten von BJAB-Zellen vor (0') und nach 5, 10, 20, 40 und 60 Minuten Stimulierung mit Fas-Ligand. Die Peptide wurden eluiert aufgelöst in SDS-PAGE-Gelen und nachgewiesen durch Silver-Färbung. Ein Peptid mit einem anscheinenden Molekulargewicht von 72,5 kDa wird vor Stimulierung (0') nachgewiesen. Nach 5 und 10 Minuten Stimulierung erscheint ein neues Protein mit einem geringeren scheinbaren Molekulargewicht von etwa 68 kDa. Nach 40 Minuten Stimulierung verschwindet die 72,5 kDa-Bahn vollständig und nur die 68 kDa-Bahn wird nachgewiesen. Bei 60 Minuten wurde keines der oben genannten Proteine co-präzipitiert mit Caspase-8.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen die C-terminale Domäne von Sub-1 von Caspase-8. Diese Antikörper, die auf diese Domäne gerichtet sind, erwiesen sich als herausragend in ihrer Fähigkeit zum Immunpräzipitieren von Caspase-8 (pro-Caspase-8 und aktive Caspase) mit hoher Effizienz, selbst wenn die Caspase in sehr geringer Konzentration vorliegt. Diese Antikörper können auch verwendet werden, um effektiv ein Protein, das an Caspase-8 gebunden ist, zu co-präzipitieren und zu isolieren.
Die Antikörper gemäß der Erfindung können polyklonal oder bevorzugter monoklonal sein. Ein Peptid, das von dem C-terminalen Ende von Caspase-8 Sub-1 stammt, umfassend die Reste Cys360-Asp374 und Sequenz CQGDNYQKGIPVETD (Peptid 179 SEQ ID:4) wurde zur Immunisierung verwendet, um den Antikörper zu erzeugen.
Das zur Immunisierung verwendete Peptid kann gereinigt synthetisiert werden durch reverse HPLC und gekoppelt werden an einen beliebigen Träger, wie etwa KLH, vorzugsweise durch sein natürliches Cystein oder durch ein künstlich fusioniertes Cystein, um das Peptid der Oberfläche des Trägers auszusetzen, und verwendet werden, um z.B. Mäuse zu Immunisieren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern und Kaninchen für polyklonale Antikörper.
In einer Ausführungsform wird die Co-Immunpräzipitation von Caspase-8 und Caspase-8-gebundenen Proteinen durchgeführt unter Verwendung eines Caspase-8-Antikörpers, der spezifisch für das Epitop 179 ist, das an der C-terminalen Domäne von Sub-1 gefunden wird.
Die Co-Immunpräzipitation gemäß der Erfindung wird auf Proben durchgeführt, die ausgewählt sind aus Zelllysaten von ruhenden oder stimulierten Zellen oder aus cDNA-Expessoons-Bibliotheken von genomischen oder kombinatorischen Peptid-Bibliotheken.
Die Zellen können stimuliert werden vor Lyse und Immunpräzipitation, unter Verwendung verschiedener Apoptose-induzierender Mittel, wie etwa Behandlung mit Lymphokinen, z.B. Fas-Ligand, TNF oder durch Umweltfaktoren, wie etwa Entkräftung, Wärmeschock, usw.
Unter Verwendung der Antikörper bei einer Co-Immunpräzipitation gemäß der Erfindung könnten Caspase-8 und das Caspase-gebundene Protein wirkungsvoll eluiert werden von dem Immunpräzipitatkomplex und in dem Überstand gewonnen werden durch Kompetitieren mit dem von Caspase-8 abgeleiteten Peptid CQGDNYQKGIPVETD, das gleiche Peptid, das zur Immunisierung verwendet wird.
Peptid 179 oder Epitop 179 von Caspase-8 mit der Sequenz CQGDNYQKGIPVETD und SEQ ID NO:4 oder ein Mutein, Fragment davon, Fusionsprotein, oder Derivat davon wird verwendet zur Immunisierung und zum Erzeugen von Antikörpern gemäß der Erfindung. Das Peptid zur Immunisierung kann hergestellt werden durch chemische Synthese, wie oben beschrieben, oder durch rekombinante DNA-Technologie in Säugerzellen, oder durch Spaltung eines gereinigten Proteins. Das Protein kann auch produziert werden in Bakterien- oder Insektenzellen, wie im Einzelnen dargestellt in Current Protocols in Molecular Biology, von F.M. Ausubel, ISBN: 047150338X, 1988, Kapitel 16.
Nicht umfasst in der Erfindung sind Muteine des obigen Epitops 179 (SEQ ID Nr:4) der Erfindung, wobei diese Muteine im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften des Peptids beibehalten, im Wesentlichen mit nur den natürlich auftretenden Sequenzen des Peptids. Solche „Muteine" können solche sein, worin Aminosäurereste deletiert, hinzugefügt oder substituiert sein können durch andere in dem Peptid, sodass Modifikationen dieser Art nicht im Wesentlichen die biologischen Eigenschaften des Peptidmuteins in Bezug auf das Peptid an sich verändern.
Diese Muteine werden hergestellt durch bekannte Synthese- und/oder durch Stellen-gerichtete Mutagenesetechniken oder eine beliebige andere Technik, die hierfür geeignet ist.
Bevorzugte Veränderungen für Muteine, sind diejenigen, die bekannt sind als „konservative" Substitutionen. Konservative Aminosäuresubstitutionen umfassen synonyme Aminosäuren innerhalb einer Gruppe, die ausreichend ähnliche physiologische Eigenschaften aufweisen, sodas Substitution zwischen Mitgliedern der Gruppe die biologische Funktion des Moleküls beibehalten wird, Grantham, Science, Band 185, S. 862-864 (1974). Es ist klar, dass Insertionen und Deletionen von Aminosäuren ebenfalls in den oben definierten Sequenzen durchgeführt werden können, ohne ihre Funktion zu verändern, insbesondere wenn die Insertionen oder Deletionen nur ein paar wenige Aminosäuren umfassen, z.B. unter 3, und vorzugsweise unter 2, und keine Aminosäuren entfernen oder ersetzen, die kritisch für eine funktionelle Konformation sind.

Vorzugsweise sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, die in Tabelle I definiert sind. Bevorzugter sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, die in Tabelle II definiert sind; und am bevorzugtesten sind die synonymen Aminosäuregruppen diejenigen, die in Tabelle III definiert sind. TABELLE I Bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren

Aminosäure	Synonyme Gruppe
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro

Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

TABELLE II Mehr bevorzugte Gruppen der synonymen Aminosäuren

Aminosäure	Synonyme Gruppe
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Ile, Phe, Met, Leu
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Met, Ile, Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Ser, Cys

His	Arg, Gln, His
Gln	Glu, His, Gln
Asn	Asp, Asn
Lys	Arg, Lys
Asp	Asn, Asp
Glu	Gln, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

TABELLE III Bevorzugteste Gruppen synonymer Aminosäuren

Aminosäure	Synonyme Gruppe
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Ile, Met, Leu
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Ser, Cys
His	His
Gln	Gln
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Ile, Leu, Met
Trp	Trp

Beispiele zur Erzeugung von Aminosäuresubstitutionen in Proteinen, die verwendet werden können zum Erhalten von Muteinen des Proteins umfassen alle bekannten Verfahrensschritte, wie etwa diejenigen, die dargestellt sind in den US-Patenten RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 und 4,737,462 von Mark et al.; 5,116,943 von Koths et al., 4,965,195 von Namen et al.; 4,879,111 von Chong et al.; und 5,017,691 von Lee et al.; und Lysin-substituierte Proteine, die dargestellt sind in dem US-Patent Nr. 4,904,584 (Straw et al.).
Das Protein oder Peptid wird dann aus dem synthetischen Gemisch oder aus den Zellen gereinigt, worin es produziert worden ist. Proteinreinigungsverfahren sind dem Fachmann in der Technik bekannt und sind detailliert z.B. dargestellt in den oben angegebenen Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 16, und in Current Protocols in Protein Science, Wiley and Sons Inc., Kapitel 5 und 6. Vorteilhafterweise kann das Peptid produziert werden als eine Fusion mit KLH oder Glutathion-S-Transferase oder dgl. oder einer Sequenz-Markierung, wie etwa der Histidin-Markierungs-Sequenz. Die Verwendung von Fusions- oder Markierungs (tag)-Proteinen vereinfacht das Reinigungsverfahren, wie detailliert dargestellt in den oben genannten Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 16, und in den Anleitungen zu dem oben angegebenen Quiagen-his-Markierungs-Proteinexpressions- und Reinigungskit.
Wenn das Protein oder Peptid als ein Fusionsprotein exprimiert worden ist, könnte der Fusionspartner abgespalten werden vor Verwendung des Proteins zur Erzeugung von Antikörpern, um die Erzeugung von Antikörpern gegen den Fusionspartner zu vermeiden. Die Abspaltung von Fusionspartnern und die Isolierung des gewünschten Proteins sind in den oben angegebenen Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 16, beschrieben. Vektoren, Protokolle und Reagenzien zum Exprimieren und Reinigen von Maltose-Bindungsproteinfusionierten rekombinanten Proteinen sind ebenfalls kommerziell erhältlich.
Beim Erzeugen eines Peptids kann es wünschenswert sein, den Fusionspartner nicht zu entfernen, da das Fusionsprotein die Produktion von Antikörpern gegen das Peptid stimulieren kann.
Wie weiter oben angegeben, kann Peptid auch synthetisiert werden durch Verfahren, die im Stand der Technik der Chemie bekannt sind.
Die Erzeugung von polyklonalen Antikörpern gegen Proteine ist in Kapitel 2 von Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc., beschrieben. Die Erzeugung von Antiköpern gegeben Peptide kann einige Veränderungen im Protokoll erforderlich machen, aufgrund der im Allgemeinen geringeren Antigenität von Peptiden im Vergleich mit Proteinen. Die Erzeugung polyklonaler Antikörper gegen Peptide ist in den oben angegebenen Current Protocols in Immunology, Kapitel 9, beschrieben.
Monoklonale Antikörper können hergestellt werden aus B-Zellen, die aus der Milz oder Lymphknoten immunisierter Lebewesen entnommen sind, im Besonderen von Ratten oder Mäusen, durch Fusion mit immortalisierten B-Zellen, unter Bedingungen, die das Wachstum von Hybridzellen bevorzugen. Zur Fusion von Maus-B-Zellen ist die Zelllinie Ag-8 bevorzugt.
Die Technik zum Erzeugen monoklonaler Antikörper ist in vielen Artikeln und Lehrbüchern beschrieben, wie etwa in Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc., Kapitel 2. Kapitel 9 darin beschreibt die Immunisierung mit Peptiden oder Lebewesen. Milz- oder Lymphknotenzellen dieser Lebewesen können auf dieselbe Art verwendet werden wie Milz- oder Lymphknotenzellen von Protein-immunisierten Lebewesen, z.B. zur Erzeugung monoklonaler Antikörper, wie in Kapitel 2 darin beschrieben.
Die Techniken, die verwendet werden zum Erzeugen monoklonaler Antikörper sind weiterhin beschrieben in Kohler und Milstein, (1975) und in USP 4,376,110.
Die Herstellung von Antikörpern aus einer Genbank humaner Antikörper, wobei die hypervariablen Regionen davon ersetzt sind durch nahezu statistische Sequenzen, ist beschrieben in USP 5,840,479. Solche Antikörper sind bevorzugt, wenn es schwierig ist, ein Lebewesen mit einem gegebenen Peptid oder Protein zu immunisieren. Einige Strukturen sind kaum immunogen und können so verbleiben, trotz der Zugabe von Hilfsmitteln und der Bindung an andere Proteine in Fusionskonstrukten. Die Antikörper, die in USP 5,840,479 beschrieben sind, sind weiterhin bevorzugt, wenn es gewünscht ist, Antikörper mit einer Struktur zu verwenden, die ähnlich humanen Antikörpern ist, z.B. wenn gewünscht ist, dass Antikörper eine geringe Immunogenität in Menschen aufweisen.
Wenn ein geeigneter Antikörper identifiziert worden ist, kann es wünschenswert sein, die Eigenschaften davon zu verändern. Zum Beispiel kann ein chimärer Antikörper höhere Produktionsausbeuten erreichen. Chimäre Antikörper, worin die konstanten Regionen ersetzt sind durch konstante Regionen von humanen Antikörpern sind weiterhin wünschenswert, wenn es gewünscht ist, dass der Antikörper geringe Immunogenität in Menschen aufweist. Die Erzeugung chimärer Antikörper ist in einer Vielzahl von Veröffentlichungen beschrieben, wie etwa in Cabilly et al., 1984, Morrison et al., 1984, Boulianne et al., 1984, EP 125023 , EP 171496 , EP 173494 , EP 184187 , WO86/01533, WO 87/02671 und Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
„Vollständig humanisierte Antikörper" sind Moleküle, die sowohl die variable als auch die konstante Region des humanen Immunglobulins enthalten. Vollständig humanisierte Antikörper können potenziell für therapeutische Anwendung verwendet werden, worin wiederholte Behandlungen erforderlich sind für chronische und Rückfallerkrankung, wie etwa Autoimmunerkrankungen. Ein Verfahren zur Herstellung vollständig humaner Antikörper besteht aus „Humanisieren des humoralen Immunsystems aus Maus, z.B. die Produktion von Mausstämmen, die in der Lage sind zum Produzieren von humanem Ig (Xeno-Maus), durch die Einführung von humanen Immunglobulin (Ig)-Loci in Mäuse, worin die endogenen Ig-Gene inaktiviert worden sind. Die Ig-Loci sind äußerst komplex sowohl bezüglich ihrer physikalischen Struktur als auch der Gen-Umordnungs- und Expressionsprozesse, die erforderlich sind, um letztendlich eine breite Immunantwort zu produzieren. Die Antikörperdiversität wird primär erzeugt durch kombinatorische Umordnung zwischen verschiedenen V-, D- und J-Genen, die in den Ig-loci vorliegen. Diese loci enthalten auch die darin verteilten regulatorischen Elemente, die Antikörperexpression, Allelexklusion, Klassenumschaltung und Affinitätsreifung steuern. Die Einführung von nichtumgeordneten humanen Ig-Transgenen in Mäuse zeigte, dass der Mausrekombinationsmechanismus kompatibel mit humanen Genen ist. Darüber hinaus können Hybridome, die Antigen-spezifische hu-mAbs verschiedener Isotypen sezernieren, erhalten werden durch Xeno-Maus-Immunisierung mit Antigen.
Vollständig humanisierte Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der Technik bekannt (Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997); Buggemann et al., Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991); Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 (2000), Patent WO 98/24893.
Ein anderer Typ Antikörper ist ein anti-idiotypischer Antikörper. Ein anti-idiotypischer (anti-Id)-Antikörper ist ein Antikörper, der einzigartige Determinanten, die im Allgemeinen assoziiert sind mit der Antigenbindungsstelle eines Antikörpers, erkennt. Ein Id-Antikörper kann hergestellt werden durch Immunisieren eines Lebewesens der gleichen Spezies und mit dem gleichen genetischen Typ (z.B. Mausstamm) als die Quelle des Mab, zu welchem ein Anti-Id hergestellt werden soll. Das immunisierte Lebewesen wird idiotypische Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und antworten durch Produktion eines Antikörpers für diese idiotypischen Determinanten (der Anti-Id-Antikörper). Siehe z.B. U.S. Patent Nr. 4,699,880.
Der Anti-Id-Antikörper kann auch verwendet werden als ein „Immunogen", um eine Immunantwort in noch einem anderen Lebewesen zu induzieren, wobei ein sogenannter Anti-Anti-Id-Antikörper produziert wird. Der Anti-Anti-Id kann epitopisch identisch sein mit dem ursprünglichen mAb, welcher den Anti-ID induzierte. Daher ist es durch Verwendung von Antikörpern für die idiotypischen Determinanten eines mAb möglich, andere Klone zu identifizieren, die Antikörper identischer Spezifität exprimieren.
Demgemäß können Mabs, die erzeugt werden gegen die C-terminale Subeinheit von Caspase-8, Analoga, Fragmente oder Derivate davon, der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Anti-Id-Antikörper in geeigneten Lebewesen, wie etwa BALB/c-Mäuse, zu induzieren. Milzzellen aus solchen immunisierten Mäusen werden verwendet, um Anti-Id-Hybridome zu produzieren, die Anti-Id mAbs sezernieren. Weiterhin können die Anti-Id-mAbs gekoppelt werden an Träger, wie etwa Schlüssellochschnecken-Hämocyanin (Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH)), und verwendet werden, um zusätzliche BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Seren von diesen Mäusen werden Anti-Anti-Id-Antikörper enthalten, die die Bindungseigenschaften des ursprünglichen mAb aufweisen, spezifische für ein Epitop der obigen Caspase-8, oder Analoga, Fragmente und Derivate davon.
Die Anti-Id-mAbs haben daher ihre eigenen idiotypischen Epitope oder „Idiotope", die strukturell ähnlich dem zu beurteilenden Epitop sind.
Der Ausdruck „Antikörper" soll auch sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie etwa z.B. Fab und F(ab')2 umfassen, die in der Lage sind zum Binden von Antigen. Fab- und F(ab')2-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment von intaktem Antikörper, sie clearen schneller aus dem Kreislauf und können weniger nichtspezifische Gewebebindung aufweisen als ein intakter Antikörper (Wahl et al., 1983).
Es wird einzuschätzen sein, dass Fab und F(ab')2 und andere Fragmente dieser Antikörper, die geeignet sind in dieser Erfindung, verwendet werden können zum Nachweis und zur Quantifizierung des p72-Proteins, entsprechend den Verfahren, die hier offenbart sind für intakte Antikörpermoleküle. Solche Fragmente werden typischerweise produziert durch proteolytische Spaltung, unter Verwendung von Enzymen, wie etwa Papain (um Fab-Fragmente zu produzieren) oder Pepsin (um F(ab')2-Fragmente zu produzieren).
Ein Antikörper wird als „in der Lage zum Binden" eines Moleküls bezeichnet, wenn er in der Lage ist zum spezifischen Reagieren mit dem Molekül, um dabei das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Ausdruck „Epitop" soll sich auf den Teil eines Moleküls beziehen, der in der Lage ist zum Gebundenwerden durch einen Antikörper, welches auch durch diesen Antikörper erkannt werden kann. Epitope oder „antigene Determinanten" bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie etwa Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und haben spezifische dreidimensionale Strukturcharakteristika als auch spezifische Ladungscharakteristika.
Ein „Antigen" ist ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, das in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, welches zusätzlich in der Lage ist zum Induzieren eines Lebewesen zum Produzieren von Antikörper, der in der Lage ist zum Binden an ein Epitop dieses Antigens. Ein Antigen kann ein oder mehrere Epitope aufweisen. Die spezifische Reaktion, auf welche oben Bezug genommen ist, soll angegeben, dass das Antigen reagieren wird auf eine hochselektive Art mit seinem entsprechenden Antikörper und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, die durch andere Antigene hervorgerufen werden können.
Das Epitop 179 der Erfindung kann verwendet werden, um spezifische polyklonale, monoklonale Antikörper für die bevorstehende Immunpräzipitation und Elution von Caspase-8 und Caspase-8-assoziierten Proteinen zu entwickeln. Die Antikörper können auch verwendet werden, um ein Neuprozessieren von Caspase-8 zu induzieren.
Die Antikörper, die gegen die C-terminale Domäne von Sub-1, wie etwa Mab 179, entwickelt sind, können verwendet werden in Kombination mit Antikörpern, die gegen die N-terminale Domäne von Sub-1, wie etwa Mab 183 entwickelt sind, um spezifisch Caspase-8-Regulationsproteine zu isolieren. Die C-terminale Domäne von Sub-1 ist dafür bekannt, dass sie ein Teil der aktiven Stelle von Caspase-8 ist und daher können regulatorische Proteine an sie binden (Thornberry et al., 1997). Co-Präzipitieren von Caspase-8 und regulatorischen bzw. Regulationsproteinen, die zuerst mit Mab 183 assoziiert sind und dann Anwenden von Mab 179 kann die regulatorischen Proteine von Caspase in das Medium freisetzen und zur Identifizierung von Schlüsselproteinen führen, die bei der Apoptosergulation umfasst sind.
In einer Ausführungsform wurden Cari (p72, SEQ ID Nr: 3), ein pro-Caspase-8-Bindungsprotein, isoliert, unter Verwendung der Immunpräzipitation der Erfindung mit Mab 179. Es wurde gefunden, dass Cari durch aktive Caspase-8 abgespalten wird und involviert wird in die Caspase-8-Aktivierung und Apoptose.
Die Antikörper (oder Fragmente davon), die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können histologisch verwendet werden, wie etwa bei der Immunfluoreszenz oder in der Immunelektronenmikroskopie, zum in situ-Nachweis von Caspase-8. In situ-Nachweis kann durchgeführt werden durch Entfernen einer histologischen Probe aus einem Patienten und Bereitstellen des markierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung für eine solche Probe. Der Antikörper (oder das Fragment) wird vorzugsweise bereitgestellt durch Anwenden oder Aufbringen des markierten Antikörpers (oder Fragments) auf eine biologische Probe. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung wird der Fachmann in der Technik leicht verstehen, dass ein beliebiges aus einer großen Vielzahl von histologischen Verfahren (wie etwa Färbeverfahren) modifiziert werden kann, um einen solchen in situ-Nachweis zu erreichen.
Die biologische Probe kann mit einem Festphasenträger oder einem Trägermaterial, wie etwa Nitrocellulose, oder einem anderen festen Träger oder Trägermaterial behandelt werden, das in der Lage ist zum Immobilisieren von Zellen, Zellteilchen oder löslichen Proteinen. Der Träger oder das Trägermatreial kann dann gewaschen werden mit geeigneten Puffern, gefolgt durch Behandlung mit einem nachweisbaren markierten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben angegeben. Der Festphasenträger oder das -Trägermaterial kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um nicht-gebundenen Antikörper zu entfernen. Die Menge von gebundener Markierung auf dem festen Träger oder Trägermaterial kann dann durch herkömmliche Mittel nachgewiesen werden.
Unter „Festphasenträger", „Festphasenträgermaterial", „festem Träger", „festem Trägermaterial", „Träger" oder „Trägermaterial" versteht sich jeder Träger oder jedes Trägermaterial, das in der Lage zum Binden von Antigen oder Antikörpern. Alllgemein bekannte Träger oder Trägermaterialien umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylonamylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit. Die Natur des Trägers kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder löslich zu einem gewissen Ausmaß oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann nahezu jede beliebige strukturelle Konfiguration aufweisen, solange das gekoppelte Molekül in der Lage ist zum Binden an Antigen oder Antikörper. Daher kann die Träger- oder Trägermaterialkonfiguration sphärisch sein, wie etwa als ein Kügelchen, zylindrisch, wie etwa auf der Innenseite eines Reagenzglases, oder die äußere Oberfläche eines Stabes. Alternativ kann die Oberfläche flach sein, wie etwa eine Folie, ein Teststreifen usw. Bevorzugte Träger oder Trägermaterialien umfassen Polystyrolkügelchen. Der Fachmann in der Technik wird viele andere geeignete Träger zum Binden von Antikörper oder Antigen kennen oder er wird in der Lage sein, dieselben zu erkennen durch die Verwendung von Routineexperimenten.
Die Bindungsaktivität einer gegebenen Charge von Antikörpern der Erfindung, wie oben angegeben, kann bestimmt werden durch allgemein bekannte Verfahren. Der Fachmann in der Technik wird in der Lage sein zum Bestimmen von Arbeitsbedingungen und optimalen Untersuchungsbedingungen für jede Bestimmung durch Verwenden von Routineexperimenten.
Andere solche Schritte, wie Waschen, Rühren, Schütteln, Filtrieren und dgl. können zu den Untersuchungen auf übliche oder notwendige Art für die spezielle Situation hinzukommen.
Einer der Wege, auf welche ein Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung nachweisbar markiert werden kann, ist durch Binden desselben an ein Enzym und die Verwendung in einem Enzymimmunoassay (EIA). Dieses Enzym wird wiederum wenn es später einem geeigneten Substrat ausgesetzt wird, mit dem Substrat auf eine solche Art reagieren, um eine chemische Gruppe zu produzieren, die z.B. nachgewiesen werden kann durch spektrophotometrische, fluorometrische oder visuelle Mittel. Enzyme, die verwendet werden können, um nachweisbar den Antikörper nachzuweisen, sind, ohne darauf begrenzt zu sein, Malatdehydrogenase, Staphylococcennuklease, delta-5-Steroidisomerase, Hefealkoholdehydrogenase, alpha-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase. Der Nachweis kann durchgeführt werden durch colorimetrische Verfahren, die ein chromogenes Substrat für das Enzym verwenden. Der Nachweis kann auch durchgeführt werden durch visuellen Vergleich des Ausmaßes der enzymatischen Reaktion eines Substrats im Vergleich mit ähnlich hergestellten Standards.
Der Nachweis kann durchgeführt werden unter Verwendung eines beliebigen aus einer Vielzahl anderer Immunoassays. Zum Beispiel ist es durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, R-PTPase nachzuweisen durch die Verwendung von Radioimmunoassay (RIA). Eine gute Beschreibung von RIA kann in Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology von Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) gefunden werden, unter besonderer Bezugnahme auf das Kapitel mit dem Titel „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von Chard, T. Das radioaktive Isotop kann nachgewiesen werden durch solche Mittel, wie etwa die Verwendung eines g-Zählers oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie.
Es ist ebenfalls möglich einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn der Fluoreszenz-markierte Antikörper Licht mit der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann sein Vorliegen aufgrund von Fluoreszenz nachgewiesen werden. Unter den zumeist verwendeten fluoreszenten Markierungsverbindungen sind Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Pycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin.
Der Antikörper kann auch nachweisbar markiert werden unter Verwendung von Fluoreszenz-emittierenden Metallen, wie etwa ¹⁵²Eu oder anderen aus der Lanthanidenreihe. Diese Metalle können gebunden werden an Antikörper, unter Verwendung solcher Metallchelatisierungsgruppen, wie etwa Diethylentriaminpentaessigsäure (ETPA).
Der Antikörper kann auch nachweisbar markiert werden indem er gekoppelt wird an eine chemilumineszente Verbindung. Das Vorliegen des chemolumineszent markierten Antikörpers wird dann bestimmt durch Nachweisen des Vorliegens von Lumineszenz, die auftritt im Verlauf einer chemischen Reaktion. Beispiele besonders geeigneter chemolumineszenter Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
Ähnlich kann eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist ein Typ von Chemilumineszenz, der in biologischen Systemen gefunden wird, worin ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemolumineszenzreaktion verstärkt. Das Vorliegen eines biolumineszenten Proteins wird bestimmt durch Nachweisen des Vorliegens von Lumineszenz. Wichtige biolumineszente Verbindungen zum Zwecke des Markierens sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Ein Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung kann adaptiert werden zur Verwendung in einer immunometrischen Untersuchung, die ebenfalls bekannt ist als ein „Zwei-Stellen-" oder „Sandwich"-Untersuchung bzw. Assay. In einer typischen immunometrischen Untersuchung wird eine Menge nicht-markierter Antikörper (oder Fragment des Antikörpers) an einen festen Träger oder ein festes Trägermaterial gebunden und eine Menge nachweisbar markierter löslicher Antikörper wird hinzugegeben, um einen Nachweis und/oder eine Quantizifierung des ternären Komplexes, der zwischen Festphasenantikörper, Antigen und markiertem Antikörper gebildet wird, zu erlauben.
Typischerweise und vorzugsweise umfassen immunometrische Untersuchungen bzw. Assays Vorwärts-Assays („Forward"-Assays), worin der Antikörper, der an die Festphase gebunden ist, zuerst in Kontakt gebracht wird mit der zu testenden Probe, um das Antigen von der Probe zu extrahieren durch Bildung eines binären Festphasenantikörper-Antigen-Komplexes. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer wird der feste Träger oder das feste Trägermaterial gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe, einschließlich nicht-umgesetztes Antigen, falls welches vorliegt, zu entfernen, und dann in Kontakt gebracht mit der Lösung, die eine unbekannte Menge von markiertem Antikörper enthält (welcher als ein „Reportermolekül" wirkt). Nach einer zweiten Inkubationsdauer, um zu erlauben, dass der markierte Antikörper mit dem Antigen komplexiert, das an den festen Träger oder das feste Material gebunden ist, über den unmarkierten Antikörper, wird der feste Träger oder das feste Trägermaterial ein zweites Mal gewaschen, um den nicht-umgesetzten markierten Antikörper zu entfernen.
In einem anderen Typ der „Sandwich"-Untersuchung der ebenfalls geeignet sein kann für Antigene der vorliegenden Erfindung, werden die sogenannten „simultanen" und „reversen" Assays bzw. Untersuchungen verwendet. Eine simultane Untersuchung umfasst einen einzelnen Inkubationsschritt, da beide, der Antikörper, der an den festen Träger oder das feste Trägermaterial gebunden ist und markierter Antikörper zu der zu untersuchenden Probe, gleichzeitig gegeben werden. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, wird der feste Träger oder das feste Trägermaterial gewaschen, um den Rückstand von Fluidprobe und nicht-komplexiertem markiertem Antikörper zu entfernen. Das Vorliegen von markiertem Antikörper, der assoziiert ist mit dem festen Träger oder Trägermaterial bzw. Carrier wird dann so bestimmt, wie es in einem herkömmlichen „Forward"-Sandwich-Assay geschehen würde.
In dem „reversen" Assay wird Zugabe von zuerst einer Lösung von markiertem Antikörper zu der Fluidprobe, gefolgt durch die Zugabe von nicht-markiertem Antikörper, gebunden an einen festen Träger oder Trägermaterial bzw. Carrier, nach einer geeigneten Inkubationsdauer, verwendet. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase auf eine herkömmliche Art gewaschen, um sie vom Rückstand der Probe, die zu testen ist, und der Lösung von nichtumgesetztem markiertem Antikörper zubefreien. Die Bestimmung von markiertem Antikörper, der assoziiert ist mit einem festen Träger oder Tägermaterial, wird dann durchgeführt wie in den „simultanen" und „Forward"-Assays.
Die Entwicklung von Immunoassays, wie etwa RIA oder ELISA, ist in vielen Artikeln, Lehrbüchern und anderen Publikationen beschrieben worden. Es wird Bezug genommen auf WO 97/03998, S. 48, Zeile 5 bis S. 52, Zeile 27. Immunoassays der Erfindung können zwei allgemeine Typen aufweisen: Erstens können Immunoassays, die eine immobilisierte Caspase oder ein äquivalentes Peptid verwenden, bei der Quantifizierung von Caspase-8 verwendet werden. Zum Zweiten können Immunoassays, die immobilisierte Antikörper, die gegen ein Epitop einer Caspase gerichtet sind, verwendet werden, um Caspase-Proteine zu quantifizieren.
Solche Untersuchungen können Anwendungen finden in Diagnostiken, wenn der Gehalt von Caspase und anderer Proteine, die in apoptotischen Wegen umfasst sind, in einer Vielzahl von Krankheiten oder Syndromen beurteilt werden müssen, worin eine Beteiligung solcher Wege eine Möglichkeit ist.
In einer Ausführungsform wurde ein pro-Caspase-8-Wechselwirkungsprotein, bezeichnet als Cari (p72, SEQ ID Nr: 3) isoliert, mit der Hilfe von Antikörpern gemäß der Erfindung. Wenn jedoch beabsichtigt ist, Proteine zu immunpräzipitieren, die an eine verschiedene Caspase gebunden sind, unter Verwendung des obigen Immunpräzipitationsverfahrens, kann eine Antikörperspezifische C-terminate Domäne des Sub-1 einer Caspase, die verschieden von Caspase-8 ist, verwendet werden.
Da Antikörper gemäß der Erfindung in der Lage sind zum Präzipitieren von entweder pro-Caspase-8 als auch Caspase-8, könnten Caspasebindungsproteine copräzipitiert werden zusammen mit aktiver Caspase oder pro-Caspase durch Coimmunpräzipitation.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden nicht-begrenzenden Beispiele weiter veranschaulicht.
BEISPIELE
Beispiel 1:
Immunisierung von Mäusen zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern die spezifisch für Caspase-8 sind.
Nachfolgend auf Aktivierung wird Caspase-8 gespalten und in zwei Subeinheiten (Sub-1 und Sub-2) zusammengestellt.
Zur Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch für neue mögliche Epitope sind, die gebildet werden nachfolgend auf Caspase-8-Aktivierung, wurden synthetische Peptide, die vom C-Terminus von Sub-1 und N-Terminus von Sub-1 und Sub-2 abstammen, verwendet, um Mäuse zu immunisieren.
Die folgenden Peptide wurden verwendet, um Mäuse zur Erzeugung monoklonaler Antikörper zu immunisieren:
Peptid 179 – Das Peptid CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID: 4), entsprechend dem C-Terminus der großen Untereinheit bzw. Subeinheit von Caspase-8 (Sub-1 ), (Epitop, das den Resten Cys360-Asp374, 1 entspricht) wurde gereinigt synthetisiert durch reverse HPLC und gekoppelt an das Trägermaterial KLH durch sein natürliches Cystein, um das Peptid der Oberfläche des Trägermaterials auszusetzen.
Peptid 182 – Das Peptid LSSPQTRYIPDEADC (SEQ ID: 5), entsprechend dem N-Terminus der kleinen Subeinheit der Caspase-8 (Sub-2, Reste Lys385-Gly399) wurde gereinigt synthetisiert durch reverse HPLC und gekoppelt an Trägermaterial-KLH durch das C, welches nicht von der Sequenz von Sub-2 stammt.
Peptid 183 – Das Peptid SESQTLDKVYQMKSKPRC (SEQ ID: 6), entsprechend dem N-Terminus von Sub-1 (Reste Ser217-Gly234) wurde gereinigt synthetisiert durch reverse HPLC und gekoppelt an Trägermaterial-KLH durch das C, das nicht von der Sequenz von Sub-1 stammt.
Vier Immunisierungen und zwei Verstärkungen (Boosts) mit der gleichen Menge Antigen (Peptid-KLH) wurden Mäusen wie folgt verabreicht:
Für die erste Immunisierung wurden 50 μg Peptid-KLH gelöst in 50 μl PBS und homogenisiert mit 50 μl vollständigem Freund's Adjuvanz und in den Fußballen jeder von fünf 7 Wochen alten weiblichen Balb/C-Mäuse injiziert.
Für die zweite Immunisierung, die 2 Wochen nach der ersten Immunisierung durchgeführt wurde, wurden Mäuse intramuskulär geboostet mit der gleichen Menge des Peptids in einer 50 %-igen (V/V) Lösung von unvollständigem Freund'schen Adjuvanz.
Für die dritte Immunisierung, die zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung durchgeführt wurde, wurden den Mäusen intraperitoneal 50 μg Peptid-KLH in 50 μl PBS injiziert.
Seren der injizierten Mäuse wurden 10 Tage nach der zweiten und der dritten Immunisierung getestet.
Die vierte Immunisierung (durchgeführt nur für die Peptide 182 und 183) wurde einen Monat später auf eine ähnliche Art wie die dritte Immunisierung durchgeführt.
Einen Monat nach der vierten Immunisierung (oder der dritten Immunisierung für Mäuse, die mit Peptid 179 angeregt wurden), wurden zwei Boosts durchgeführt (auf eine ähnliche Art wie die dritte und vierte Immunisierung) innerhalb eines zweitätigen Intervalls.
Vier Tage später wurde die Milz und Leistenlymphknoten der beiden Mäuse, die die höchste spezifische Immunreaktivität zeigten, zur Fusion mit Myelomzellen entnommen (Eshhar Z., 1985).
Beispiel 2:
Immunisierung von Kaninchen zur Erzeugung polyklonaler Antikörper, die spezifisch für Caspase-8 sind.
Kaninchen wurden mit 179-KLH und 183-KLH zur Erzeugung spezifischer polyklonaler Antikörper immunisiert.
Die erste Immunisierung wurde durchgeführt mit 100 μg Peptid-KLH, das gelöst war in 50 μl PBS, und homogenisiert mit 50 μl vollständigem Freund'schen Adjuvanz, und subkutan injiziert. Eine zweite Immunisierung wurde zwei Wochen später durchgeführt mit der gleichen Menge Peptid-KLH und intramuskulär zwei Wochen später injiziert mit unvollständigem Freund'schen Adjuvanz. Diese beiden Immunisierungen wurden gefolgt von zwei Verstärkungen bzw. Boosts derselben Menge Peptid-KLH, gelöst in PBS, und subkutan verabreicht in zwei Wochen-Intervallen.
Beispiel 3:
Hybridomherstellung, Auswahl von Antikörper-produzierenden Klonen und Reinigen von Antikörpern aus Aszites-Fluiden.
Das Fusionsverfahren und die Hybridomzellauswahl wurden gemäß den Protokollen in Eshhar Z., 1985, durchgeführt. Kurz gesagt wurde ein Gemisch von Milz- und Lymphknotenzellen von 2 reaktiven Mäusen, 110 × 10⁶, fusioniert mit 32 × 10⁶ NSO/1-Myelomvarianten, Myelomzellen durch eine kurze Inkubation mit PEG. Das PEG wurde zuerst langsam verdünnt mit DMEM und dann vollständig entfernt durch Zentrifugation. Die Zellen wurden resuspendiert in DMEM-HAT-Medium, verteilt in Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Konzentration von etwa 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung und inkubiert in einem 8 % CO₂-Inkubator bei 37 °C. Das Medium in allen den Hybridom-Vertiefungen wurde geändert in DMEM-supplementiert mit 10 % Pferdeserum (HS). Hybridomkulturüberstandsproben wurden auf das Vorliegen von spezifischen Mabs zwei Wochen nach der Fusion durch ELISA untersucht (beschrieben in Beispiel 12, unten). Zellen aus Vertiefungen, worin das Vorliegen spezifischer Antikörper nachgewiesen wurde in dem Kulturüberstand, wurden in Platten mit 24 Vertiefungen übergeführt. Positive Zellen wurden zweimal subkloniert; in diesem Stadium erwiesen sich alle Subklone als positiv. Die Klone wurden in 24 Vertiefungen expandiert und dann in 25 cm²-T-Kolben übergeführt. Die expandierten Kulturen wurden auf die Sezernierung von spezifischen Mabs untersucht. Ampullen von Zellen positiver Kulturen wurden eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Aus ungefähr 700 Klonen, die zum Nachweisen spezifischer Antikörper für Peptid 179 untersucht wurden, wurde nur ein positiver Klon (Mab 179) gefunden, aus 700 Klonen, die auf den Nachweis spezifischer Antikörper für Peptid 182 untersucht wurden, wurde nur ein positiver Klon (Mab 182) gefunden und aus 1100 Klonen, die untersucht wurden auf den Nachweis spezifischer Antikörper für Peptid 183, wurden nur 2 positive Klone (Mab 183.1 und 183.2) gefunden. Die positiven Klone wurden subkloniert durch Grenzverdünnung in Platten mit 96 Vertiefungen. Überstände der wachsenden Klone wurden mehrfach getestet auf spezifische Antikörper durch ELISA (beschrieben in Beispiel 12).
Positive Hybridomklone wurden in Gewebekulturflaschen in DMEM gezüchtet, das 15 % Pferdeserum enthielt, und Ampullen von einem Teil der Kulturen wurden eingefroren. Parallel wurden Zellen verschiedener Hybridomklone in jeweils 2-4 Mäuse injiziert, um Aszitesfluide zu erhalten. Die Antikörper wurden aus Aszitesfluid gereinigt durch Affinitätsreinigung unter Verwendung von Affigel-Kügelchen (Affigel 15 Biorad), quervernetzt mit BSA (Pierce Kat.-Nr. 77116), gekoppelt an das synthetische Peptid, das verwendet wird zur Immunisierung von Mäusen (Peptide 179, 182 oder 183).
Zur Antikörperreinigung wurde Aszites, präzipitiert durch 50 % Ammoniumsulfat, für 16 Stunden bei 0 °C gegen PBS dialysiert. Nachfolgend auf Dialyse wurden Aliquote für 16 Stunden bei 0 °C inkubiert mit 1 ml Affigel-BSA-Peptid-Kügelchen und die vorinkubierten Kügelchen wurden verwendet, um eine 1 ml-Säule zu packen. Anfangs wurde die Säule mit 10 ml PBS gewaschen, gefolgt von einer eine Waschung mit 10 mM Tris, pH-Wert 7,5, enthaltend 1 M NaCl, und einer Waschung mit PBS. Die Antikörper wurden von der Säule mit einer Lösung eluiert, die 100 mM Glycin HCl, pH-Wert 2,7 und 0,5 M NaCl enthielt. 1 ml Fraktionen wurden in Röhrchen gesammelt, die 40 μl Tris-Base für die Neutralisierung des Eluenten enthielten. Aus 25 ml Aszites wurden etwa 5-13,6 mg gereinigte Antikörper erhalten.
Beispiel 4:
Monoklonaler Antikörper-Isotyp.
Der Isotyp monoklonaler Antikörper wurde bestimmt unter Verwendung eines kommerziellen Isotypisierungskits (Southern Biotechnology Associates, INC, Kat.-Nr. 5300-05), entsprechend dem Untersuchungsverfahren, das vom Hersteller angegeben wird. Mabs 183 und 179 wurden als IgG1 identifiziert, während Mab 182 sich als die IgM-Klasse erwies.
Beispiel 5:
Immunpräzipitation von Caspase-8 mit Mabs 179, 182 und 183.
Die verschiedenen monoklonalen Anti-Caspase-8-Antikörper, die in Beispiel 3 oben beschrieben sind, wurden auf ihre Kapazität zum Immunpräzipitieren von Caspase-8 (siehe Beispiel 12 unten) aus Lysaten ruhender und aktivierter Bjab-Zellen getestet. Die Bjab-Linie ist eine kontinuierliche Lymphomzelllinie, die von dem Afrikanischen Fall des Burkittschen Lymphoms (African Case of Burkitt's Lymphom) (Clements GB et al., 1975) abgeleitet ist.
Bjab-Zellen wurden stimuliert mit Fas-Ligand für eine Stunde. Zelllysate wurden aus Bjab-Zellen vor und nach Stimulierung hergestellt. Nachfolgend auf Immunpräzipitation mit Mabs 179, 182 und 183 (wie in Beispiel 12 beschrieben) wurde das „abgereicherte bzw. depletierte Lysat" und die Caspase-8, eluiert mit den entsprechenden Peptiden, durch SDS-PAGE und Silver-Färbung oder durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung von Anti-Sub-1-Antikörper als der erste Antikörper (Cell Signaling Technology Caspase-8 ICI2 Kat.-Nr. 9746) analysiert.
2 zeigt eine Western-Blot-Analyse (durchgeführt wie in Beispiel 10 unten beschrieben) von Gesamtzellextrakten und „abgereicherten bzw. depletierten Lysaten", erhalten nach Immunpräzipitation mit Mabs 179, 183.1 und 183.2 und 182.
In nicht-stimulierten Zellen (Bahnen 2, 4, 6, 8 und 10) wurde ein Bahnenduplett, entsprechend pro-Caspase-8 Isoform α1 und α2 (pro-Caspase-8 53/55 kDa) nachgewiesen in Gesamtzellextrakten (Bahn 2) und in abgereicherten Lysaten, erhalten mit Anti 183- und Anti 182-Antikörpern (Bahnen 6, 8 und 10), wobei im Gegensatz hierzu keine pro-Caspase-8 in abgereicherten Lysaten erhalten wurde mit Mab 179 (Bahn 4).
In stimulierten Zellen waren die Gehalte von pro-Caspase-8 im Gesamtzellextrakt geringer (Bahn 1). Zusätzlich erschienen kleinere Bahnen, entsprechend aktivierten Caspase-8-Fragmenten, bei Aktivierung, d.h. ein Duplett von teilweise prozessierter Caspase-8, entsprechend Isoform α1 und α2 (teilweise prozessierte Caspase-8 p 41/43, der Sub-2 fehlt) und eine kleinere Bahn, entsprechend Sub-1 (p 20). Depletion bzw. Abreicherung der kleinsten Mengen von pro-Caspase-8 und aktivierten Caspase-8-Fragmenten durch die Mabs wurden auf Lysaten von Fas-Ligand-stimulierten Zellen getestet (2, Bahnen 3, 5, 7, 9 und 11).
Es sollte festgehalten werden, dass die Abreicherung bzw. Depletion von Sub-1 durch Mab 182, spezifisch für Sub-2, ebenfalls getestet wurde, da aktivierte Caspase-8 an Sub-2 gebundenes Sub-1 umfasst, und daher sollte die Entfernung von Sub-2 durch Immunpräzipitation mit Mab 182 folglich zur Abreicherung von Sub-1 führen.
Immunpräzipitation von Caspase-8 aus stimulierten Zelllysaten zeigt, dass Mabs 182, 183.1 und 183.2, ähnlich der normalen Mausserumkontrolle (2, Bahn 11), nicht die kleinen Mengen von verbleibender pro-Caspase-8 oder den aktiven Caspase-8-Fragmenten (Bahnen 9, 7, 5 bzw. 11) entfernte. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen entfernte Behandlung der Zelllysate mit Mab 179 (Bahn 3) wirkungsvoll alles von der pro-Caspase-8, als auch die aktiven Caspase-8-Fragmente.
Die 3a (Western-Blot-Analyse) und 3b (Proteinnachweis durch Silver-Färbung) zeigen, dass immunpräzipitierte pro-Caspase-8 und aktive Caspase-8-Fragmente durch Mabs 179-, 182- und 183.1- und 183.2-Antikörper wirkungsvoll gewonnen werden könnten in dem Überstand durch Konkurrenz mit den entsprechenden Peptiden, gegen welche die verschiedenen Antikörper entwickelt worden sind (Beispiel 12).
In nicht-stimulierten Zellen (3a, Bahnen 2, 4, 6, 8 und 10 und 3b, Bahnen 2, 3, 6, 8 und 10) wird pro-Caspase-8 wirkungsvoll gewonnen durch Immunpräzipitation mit Mab 179 und Konkurrenz mit Peptid 179 (3a und 3b, Bahn 8). In stimulierten Zellen wurde trotz der kleinen Menge von pro-Caspase-8, die nach Aktivierungsimmunpräzipitation mit Mab 179 zurückbleibt, eine wirkungsvolle Gewinnung des Proteins erhalten (3a und 3b, Bahn 9). Eine gewisse Gewinnung von pro-Caspase-8 konnte in nicht-aktivierten Zellen beobachtet werden durch Mab 183.2 (3a, Bahn 6) und in aktivierten Zellen durch Mab 183.1 (3a, Bahn 5), worin aktive Fragmente von Caspase 8 in Lysaten von aktivierten Zellen gewonnen werden konnten durch Mabs 182 ( 3a, Bahn 3), 183.1 (3a, Bahn 5) und 183.2 (3a, Bahn 7, nur p20).
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass der Mab 179, entwickelt gegen das Peptid, das dem C-Terminus von Sub-1 (179 Epitop) entspricht, sehr wirkungsvoll ist zur Immunpräzipitation und Reinigung von pro-Caspase-8, selbst wenn sie in Spurenmengen vorliegt, als auch für aktivierte Caspase-8.
Polyklonaler Antikörper, der spezifisch ist für das gleiche 179-Epitop (hergestellt wie in Beispiel 1 oben beschrieben), wurde erzeugt, um zu untersuchen, ob das 179-Epitop die einzigartige Fähigkeit aufweist zum Hervorrufen von Antikörpern, die allgemein verwendet werden können zur wirkungsvollen Immunpräzipitation und Reinigung von pro-Caspase-8 und aktiver Caspase-8. Die „abgereicherten bzw. depletierten Lysate", die durch Immunpräzipitation mit polyklonalem Antikörper, der spezifisch ist für Epito 179 (Bahnen 5 und 6 für aktivierte bzw. nicht-aktivierte Zellen) oder durch monoklonalen Antikörper, der spezifisch ist für Epitop 182 (Bahnen 7 und 8 für aktivierte bzw. nicht-aktivierte Zellen) wurden verglichen. Die Ergebnisse in 4 zeigen deutlich, dass tatsächlich pro-Caspase-8 und Caspase-8-Fragmente von stimulierten Zelllysaten wirkungsvoller entfernt werden aus dem Zelllysat durch polyklonalen Anti-179-Antikörper als durch monoklonalen Anti-182-Antikörper.
Bei paralleler Immunpräzipitation und Gewinnung von pro-Caspase-8 aus Proben ruhender Zelllysaten, durchgeführt mit Mab 183 und polyklonalen Antikörpern, die spezifisch sind für das 183-Epitop (beschrieben in Beispiel 1) sind, wurden verglichen mit denjenigen, die erhalten werden mit Mab 179. 5 zeigt, dass Immunpräzipitation von pro-Caspase-8 durch Mab 183 und Poly 183 nicht wirkungsvoll ist, während Immunpräzipitation von pro-Caspase-8 durch Mab 179 beachtlich überlegen ist.
Ein zusätzliches von Caspase-8 abgeleitetes Fragment von etwa 5,6 kDa wird nur in Immunpräzipitaten beobachtet, die getragen werden von Mab 179 (Bahn 3). Antikörper, die gegen die Region von Caspase-8 entwickelt sind, die dem C-Terminus des großen Caspase Sub-1 entspricht, haben eine einzigartige Fähigkeit der Caspase eine neue Art des Prozessierens aufzuerlegen.
Die oben beobachteten Ergebnisse zeigen, dass Epitop 179 von Caspase-8, im Unterschied zu anderen Epitopen, die spezielle Fähigkeit aufweist, spezifische Antikörper hervorzurufen, die sehr wirkungsvoll sind zur Immunpräzipitation von pro-Caspase-8 und aktivierter Caspase-8 und die Fähigkeit aufweisen zum Induzieren von pro-Caspase-8-Autoprozessieren.
Beispiel 6:
Isolierung und Identifizierung eines Caspase-8-Bindungsproteins (p72).
Aufgrund seiner Fähigkeit zum wirkungsvollen Immunpräzipitieren von Caspase-8 wurde Mab 179 genutzt zum Co-Immunpräzipitieren von Caspase-8 und Caspase-8-assoziierten Proteinen.
Bjab-Zellen (Steinitz M., Klein G. 1975) wurden mit Fas-Ligand für eine Stunde stimuliert und Zelllysate wurden aus Zellen vor und nach Stimulierung hergestellt.
Nachfolgend auf Immunpräzipitation und Elution, wie in Beispiel 12 beschrieben, wurden die gewonnenen Proteine durch SDS-PAGE aufgelöst und nachgewiesen durch Silver-Färbung. Immunpräzipitation mit Maus-IgG1 diente als die negative Kontrolle. Die Ergebnisse in 6 zeigen, dass ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 72,5 kDa (hier p72 genannt) copräzipitiert wird mit pro-Caspase-8 (p 53/55) in Lysaten aus ruhenden Zellen (Bahn 3), jedoch nicht mit aktiver Caspase-8 in Lysaten von stimulierten Zellen (Bahn 4).
Zusätzlich zeigte sich, dass ein p72-Protein mit pro-Caspase-8 ebenfalls in Lysaten co-immunpräzipitiert, die hergestellt sind aus nicht-stimulierten HeLa-, Raji-, H9-, K562-, HL-60-, CEM- und Hut78-Zellen (ATCC).
Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein Protein, p72, allgemein gebunden ist an pro-Caspase-8, jedoch nicht an aktive Caspase-8.
Die Bahn in SDS-PAGE, die p72 entspricht, wurde herausgeschnitten, mit Trypsin verdaut und einer gegrenzten Sequenzanalyse und Massenspektroskopieanalyse unterzogen. 7 Peptide, die durch Trypsinverdau erhalten werden, wurden verwendet, um eine Proteindatenbank, deduziert von Nukleotidsequenzen (oder ESTs) zu suchen. Die Proteinsequenz stimmte zum Teil überein mit einer vorhergesagten Proteinsequenz eines humanen EST-Klons (SEQ: ID1), der gefunden wird in der Genbank (Hinterlegungsnummer gi/2988397/gbAAC08052.1/(AC004475), dessen Funktion unbekannt war.
Beispiel 8:
Erzeugung der Volllängen-cDNA, die für p72 codiert.
Die Volllängen-cDNA, die für p72 codiert, wurde wie folgt erzeugt:
Die EST von (Beispiel 7) wurde verwendet, um einen TIGR-Humangenindex zu untersuchen und der THC-Report (THC510568 SEQ ID Nr.: 1), der die Übereinstimmung aller ESTs enthält, die mit diesen Sequenzen zusammenpassen, wurde erhalten.
Ein DNA-Klon, der für einen Teil des vorausgesagten Proteins codiert, wurde von Incyte Genomics (IMAGE Nr. 2964545) bezogen. Dem Klon fehlten die Nukleotidsequenzen, die für das erste Methionin und die 6 nachfolgenden Aminosäuren (d.h. 21 Nukleotide) codieren. Die Sequenzen aus Maus und Mensch dieser Proteine erwiesen sich als sehr ähnlich (etwa 90 % Identität), daher wurden die Nukleotidsequenzen, die für das erste Methionen und die 6 nachfolgenden Aminosäuren des Mausproteins codieren, die nicht in den ESTs aus Maus fehlen, verglichen mit der Arbeitsvorlagesequenz des humanen Genoms, um die fehlende humane Sequenz zu vervollständigen. Ein Treffer wurde erhalten, der der Sequenz des Homo sapiens-Chromosoms 19 entspricht, Klon LLNLR-232E12. Dieser Klon bestätigte die Nukleotidsequenz, die für die fehlenden 7 Aminosäuren von p72 codiert. Die Volllängen-cDNA von p72 wurde erhalten durch zwei PCR-Runden (Takara ExTaq, Takara, Katalog Nr. R001A wurde verwendet), was schematisch in 8 dargestellt ist.
In der ersten PCR wurde der Klon, der von Incyte Genomics erhalten wurde, als das Templat mit dem Vorwärts-Primer verwendet:
CTCAAGATGGACAACCGGGATGTTGCAGGAAAGG, synthetisiert, um 15 (unterstrichen) von 21 fehlenden Nukleotiden zusammen mit der bestehenden Sequenz von p72 (8, Primer 2) zu enthalten, und der reverse Primer:
CCACTCGAGTCAGTAGTAAGGCCGTCTGGGATT, enthaltend die 3'-Region, die mit dem Stoppcodon endet (8, Primer 3).
Die zweite PCR umfasst als das Templat das PCR-Produkt der ersten PCR-Runde und den Vorwärt-Primer:
AATGGATCCATGAGTCTCAAGATGGACAACCGGGA, enthaltend alle 21 fehlenden Nukleotide und 5 bestehende Nukleotide (7, Primer 1) und den gleichen reversen Primer (7, Primer 3). Die Gesamt-cDNA, die für p72 codiert, wurde gewonnen und sequenziert (SEQ ID Nr.: 2) und die Aminosäuresequenz wurde aus der Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr: 3) vorhergesagt.
Vergleich der in dem THC-Report (THC510568 SEQ:ID 1) erhaltenen Sequenz, enthaltend die Übereinstimmung aller ESTs, und des Proteins, das vorhergesagt wird durch die erzeugte Volllängen-cDNA (SEQ:ID 3) in 13 zeigt die fehlenden ersten 7 Aminosäuren in den ESTs, die fehlende 25-Aminosäuresequenz in den ESTs und die Ungenauigkeit von Aminosäure 397 (Prolin anstelle von Leucin).
Das p72-Protein erwies sich so, dass es drei konservierte Motive (7) enthält: das C-Motiv, ein spiralenförmiges Motiv, zwei Tandem-lokalisierte „SURP" (ebenfalls genannt „SWAP"-Motive, bezeichnet als S, 7) (Denhez F und Lafyatis R 1994), nahe dem N-Terminus des Proteins, und ein C-terminal lokalisierter „G-Patch" (8, bezeichnet als G) (Aravind L. und Koonin E.V. 1999). Sowohl die SURP- als auch die G-Patch-Motive tragen vermutlich zur RNA-Bindung bei, wodurch nahegelegt wird, dass das Target von p72 ein RNA-Molekül sein kann.
Beispiel 9:
Abspaltung von p72 durch Caspase-8.
Wie in Beispiel 8 gezeigt, wird p72 nur an pro-Caspase-8 und nicht an aktive Caspase-8 gebunden, wie nachfolgend auf eine Stunde Stimulierung getestet. Etwas pro-Caspase-8 kann noch nach 20 Minuten Stimulierung nachgewiesen werden. Zum Bestimmen, ob p72 copräzipitiert werden kann mit Caspase-8 bei kürzeren Stimulierungszeiten, wurden Bjab-Zellen, die für nur 20 Minuten aktiviert wurden, lysiert und immunpräzipitiert mit Mab 179. Nachfolgend auf Immunpräzipitation und Elution wurden Caspase-8 und gebundene Proteine aufgelöst durch SDS-PAGE und die Proteine wurden durch Silver-Färbung nachgewiesen. Eine Bahn von 72,5 kDa (9, Bahn 3), entsprechend p72, wurde immunpräzipitiert in Lysaten von Zellen vor Stimulierung, während nach 20 Minuten Stimulierung ein Protein mit einem geringen scheinbaren Molekulargewicht von etwa 68 kDa nachgewiesen wurde (9, Bahn 4). Beide Proteine, das mit 72,5 als auch 68 kDa, immunpräzipitiert von Bjab-Zellen, wurden massenspektroskopischer Analyse unterzogen. Nach Trypsinverdau zeigten beide Proteine ein ähnliches Peptidprofil, ausgenommen ein deutlicher Unterschied, nämlich ein zusätzliches Peptid mit der Sequenz FRPNPLNNPR (Reste 632-641) lag in den 72,5 kDa vor am C-Terminus-Protein, fehlte jedoch in dem 68 kDa-Protein.
Dieses Ergebnis legt nahe, dass bei Zellstimulierung ein Fragment von etwa 4,5 kDa von dem C-Terminus von p72 entfernt wird, möglicherweise durch aktivierte Caspase-8, was zu einem kleineren Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 68 kDa führt, das weiterhin gebunden ist an die verbleibende pro-Caspase-8.
Es ist vorstellbar, dass Rest D 600, lokalisiert am C-Terminus von p72 (8) ein Kandidatenrest sein könnte für Spaltung, da die mutmaßlichen Fragmente, die aus einer solchen Spaltung resultieren, ein ähnliches Molekulargewicht aufweisen wie die p72-Fragmente, die in vivo nachfolgend auf 20 Minuten Stimulierung nachgewiesen werden.
Um zu Testen, ob, wie angenommen, p72 ein Substrat von Caspase-8 ist und D 600 der Targetrest zur Spaltung ist, wurde ein in vitro transkribiertes-translatiertes und Radioisotop-markiertes (S³⁵) p72 (TnT-System) der Wirkung von rekombinanter aktiver Caspase-8 ausgesetzt. Das Protein, das codiert wird durch p72 cDNA wurde in vitro in Reticulocytenlysaten in der Gegenwart von ³⁵S-Methionin unter Verwendung von TnT T7-gekoppelten Reticulocyten-Lysat-System exprimiert und einer Spaltung durch rekombinante aktive Caspase-8 (jede Sub-Einheit 1 und 2 getrennt hergestellt in E. coli, gemischt und neu in vitro gefaltet) unterzogen. Kurz gesagt, wurden in vitro synthetisierte, ³⁵S-markierte p72-Proteine für 30 min in Proteasepuffer (25 mM Hepes, pH-Wert 7,5, 0,1 CHAPS, 5 mM EDTA und 2 mM DTT) bei 37 °C in der Gegenwart von bakteriell produzierter Caspase-8 inkubiert. Proteine und ihre Fragmente wurden auf SDS-PAGE getrennt und die Ergebnisse durch Phospho-Imaging visualisiert. Die Ergebnisse (10) zeigen, dass beim Fehlen von Caspase-8 nur die 72,5-Bahn, entsprechend p72 (Bahn 1), nachgewiesen wird. Diese Bahn verschwindet nach Zugabe von aktivierter Caspase-8 für 1 Stunde und ein neues kleineres Fragment, entsprechend 68 kDa, taucht auf (Bahn 4). Dieses Ergebnis zeigt, dass das Protein, das durch p72-cDNA codiert wird, bei Verwendung als Substrat wirkungsvoll gespalten wird durch Caspase-8. Zusätzlich wurde das TnT-Transkriptionstranslationssystem ebenfalls verwendet, um in vitro 2 verschiedene p72-Mutanten zu produzieren: p72, worin der Rest D 600, von welchem aus den in vivo-Versuchen vermutet wird, dass er der Targetrest für Caspase-8 ist, mutiert war zu E (D600E), und ein deletiertes p72, dem die Reste abstromig D600 fehlen (d.h. das exprimierte Protein wird die 1-600 Reste zeigen).
Spaltung der obigen beiden zwei p72-Mutanten wurde getestet in der Gegenwart (10, Bahnen 5 bzw. 6) oder in der Abwesenheit (Bahnen 2 bzw. 3) von aktivierter rekombinanter Caspase-8. Wie in 10 gezeigt (Bahnen 3 bzw. 6) wird das gleiche Proteinprofil von p72 D600E-Mutant in der Gegenwart oder Abwesenheit von Caspase-8 beobachtet, wodurch angezeigt wird, dass Caspase-8 den p72 D600E-Mutanten nicht spaltet. Der p72 1-600-Mutant co-migriert mit dem 68 kDa-Fragment, das erzeugt wird nach Spaltung des Wildtyp p72 und wird nicht weiter gespalten durch die Zugabe von Caspase-8 (Bahnen 2 und 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass bei Aktivierung Caspase-8 p72 an dem D600-Rest spaltet.
Untersuchungen, die in vivo durchgeführt wurden, legen nahe, dass die Spaltung von p72 rasch in Zellen innerhalb von 5 bis 20 Minuten auftritt nach Fas-Ligandenbehandlung (11) und dass das gespaltene Protein (oder eher sein größeres Fragment) assoziiert bleiben kann mit pro-Caspase-8.
Beispiel 10 Western Blot Analyse zum Nachweis von Caspase-8-immunreaktivem Serum
Ein Gemisch von rekombinanter gereinigter Sub-1 und Sub-2 wurde verwendet für Western Blot-Analyse von gegen synthetische Peptide entwickelten Antikörpern. Kurz gesagt, wurde ein 12 %-SDS-Polyacrylamidgel mit 100 ng/Bahn eines Gemisches aus Sub-1 und Sub-2 beladen, unter reduzierenden Bedingungen (40 mM DTT). Eine Bahn wurde mit Markern mit geringem Molekulargewicht (Low Molecular Weight Markers) (LMW) beladen. Die Proteine, die sich auf den Gelen trennten, wurden durch Elektroelution auf PVDF high bond-P (Amersham)-Membranen übergeführt. Die Membranen wurden in PBS, das 5 % fettarme Milch, 0,05 % Tween 20 enthielt, für 16 h inkubiert. Die Membranen wurden in Streifen geschnitten und jeder Streifen wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem Antiserum aus Maus (verdünnt 1/2000) inkubiert. Membranstreifen wurden mit PBS, das 0,05 % Tween 20 (3 × 15 min) enthielt, gewaschen und für eine Stunde mit dem zweiten Antikörper – Ziege-Anti-Maus, konjugiert an Meerrettichperoxidase (verdünnt 1:10.000, Jakson) – für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Streifen wurden mit PBS, das 0,1 % Tween 20 enthält (3 × 15 min) gewaschen. Die positiven Bahnen wurden durch verstärkte Chemolumineszenz (ECL, Amersham) nachgewiesen.
Für Western Blots, die in Beispiel 5 durchgeführt wurden, wurden Antikörper, die spezifisch für Sub-1 sind, verwendet (Cell Signaling Technology Caspase-8 ICI2 Kat.-Nr. 9746).
Beispiel 11 ELISA für Hybridomklonuntersuchung
Der direkte ELISA zur Untersuchung von Hybridomen, die spezifisch Antikörper produzieren, wurde wie folgt durchgeführt: Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 50 μl/Vertiefung BSA-Peptid (oder BSA allein für Kontrollplatten) in einer Konzentration von 2,5 μg/ml in Bindungslösung (0,1 M Na₂HPO₄, pH-Wert 9) für 1 Stunde bei 37 °C oder 16 Stunden bei 4 °C beschichtet. Nachfolgend wurden die Platten 3-mal mit PBS-T (PBS mit 0,05 % Tween-20) gewaschen und mit 200 μl/Vertiefung Blockierungslösung (1 % Hämoglobin in PBS) für 1 Stunde bei 37 °C beladen und 3-mal mit PBS gewaschen. 50 μl Hybridomkulturüberstand oder verdünnte Standards (mit PBS-T) wurden pro Vertiefung eingebracht und für 1 Stunde bei 37 °C oder 4 Stunden bei 22 °C inkubiert. Nach dieser Inkubationsdauer wurden die Vertiefungen 6-mal mit PBS-T gewaschen. Ein zweiter Antikörper, Anti-Maus-Antikörper, konjugiert an HRP (Jackson 115-025-100) wurde 1:5.000 in PBS-T verdünnt, inkubiert für 1 Stunde bei 37 °C und weggewaschen durch 6-maliges Waschen mit PBS-T. Das Substrat für HRP wurde frisch hergestellt (2,2 ml 0,2 M Na₂HPO₄, pH-Wert 9,2, 1,4 ml 0,2 M Zitronensäure, pH-Wert 4,35, 6,4 ml N₂O, 10 mg ABTS und 1 μl N₂O₂) und 50 μl/Vertiefung wurden eingebracht und bei 22 °C inkubiert bis sich Farbe entwickelte (etwa 5-80 Minuten). Die Farbreaktion wurde gestoppt durch Zugeben von 50 μl 0,2 M Zitronensäure pro Vertiefung. Die Platten wurden bei 405 nm ausgelesen.
Als ein positiver Kontrollantikörper wurde positives Maus-Anti-Serum, verdünnt 1:1000, verwendet und als negative Kontrolle das Medium.
Beispiel 12 Immunpräzipitation von Caspase-8.
Für jede Immunpräzipitation wurden 10⁸ Zellen verwendet. Zellen wurden gesammelt und lysiert durch Inkubation in 1 % NP-40 Lysepuffer und Komplettproteaseinhibitor (Komplettproteaseinhibitorcocktailtabletten von Roche Molecular Biochemicals), bei 0 °C für 40 min. Die Zelllysate wurden in Aliquote in Eppendorf-Röhrchen übergeführt, zentrifugiert bei 14.000 UpM für 10 Minuten bei 4 °C und der Überstand in einem neuen Röhrchen gesammelt. Die Zelllysate wurden einem Vorreinigungsschritt unterzogen, mit der Absicht, Proteine zu entfernen, die nicht spezifisch an die Protein-G-Sepharose binden. Zur Vorreinigung wurde Zelllysat vorinkubiert mit PBS-vorgewaschener Protein-G- Sepharose (Pharmacia) und mit Maus-IgG für 2-3 Stunden bei 4 °C. Nachfolgend auf diese Inkubation wurden die Lysate in Eppendorf-Röhrchen bei 14.000 UpM für 30 Sekunden zentrifugiert, die Protein-G-Sepharose wurde verworfen und der vorgereinigte Überstand gesammelt. Gereinigte monoklonale Antikörper (oder Maus-IgG 1 Kappa für negative Kontrollen) und PBS-vorgewaschene Protein-G-Sepharose wurden gemischt und mit dem vorgereinigten Überstand für 4 bis 16 Stunden bei 4 °C inkubiert. Nachfolgend auf diese Inkubationsdauer wurde das ungebundene Material, das als „abgereichertes bzw. depletiertes Lysat" bezeichnet wird, durch Zentrifugation (30 Sekunden bei 14.000 UpM) gesammelt und das gebundene Material wurde eluiert durch 6-maliges Waschen der Sepharosekügelchen mit Lysepuffer und durch Inkubation mit einer „Elutionslösung", enthaltend 0,2 % NP-40-Lysepuffer, Proteaseinhibitoren und 400 μg/ml Peptid, verwendet zur Immunisierung (300 μl Elutionslösung/100 μl Sepharose), für 2 Stunden bei 22 °C. Die Röhrchen wurden für 5 Minuten bei 5.000 UpM rotiert und der Überstand, der als „Caspase-8-Eluat" bezeichnet wird, wurde in ein neues Röhrchen übergeführt.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antikörper, erhalten durch Immunisierung eines Lebewesens mit einem Peptid aus dem C-terminalen Ende der Caspase-8 Sub-1-Einheit, und Fragmente davon, worin das Peptid, das zur Immunisierung verwendet wird, die Aminosäuresequenz CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID Nr.: 4) aufweist, der in der Lage ist zum Copräzipitieren der Caspase (sowohl aktive Caspase-8 als auch pro-Caspase-8) zusammen mit dem pro-Caspase-8-assoziierten Protein p72 (SEQ ID Nr.:3), und zum wirkungsvollen Freisetzen von Caspase und assoziiertem Protein von dem Immunkomplex bei Elution unter Verwendung des Peptids entsprechend SEQ ID Nr.: 4.
Antikörper nach Anspruch 1, der ein polyklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Antikörper nach Anspruch 1, der ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Antikörper nach Anspruch 1, der ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Antikörper nach Anspruch 1, der ein vollständig humanisierter Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Antikörper nach Anspruch 1, der ein anti-anti-Id-Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1-6, worin das zur Immunisierung verwendete Peptid an KLH gekoppelt ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1-7, der aus dem Immunglobulin-Isotyp IgG₁ ist.
Antikörper nach Anspruch 8, worin der Antikörper das Prozessieren von Caspase-8 auslöst.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1-9 zur Entwicklung eines ELISA-Assays.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach Anspruch 1 oder 2, umfassend Immunisieren eines Lebewesens mit einem Peptid von dem C-terminalen Ende von Sub-1 von Caspase-8, worin das Peptid, das zur Immunisierung verwendet wird, die Aminosäuresequenz CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID Nr.: 4) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der Antikörper monoklonal ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11-12, worin das Immunogen an einen Träger gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der Träger KLH ist.
Verfahren zur Reinigung einer Caspase und von Caspase-gebundenem Protein, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe, die eine Caspase und das Caspase-gebundenes Protein enthält, mit einem Antikörper nach einem der Ansprüche 1-9, Co-Immunpräzipitieren der Caspase und des Caspase-gebundenen Proteins, Waschen des erzeugten Immunkomplexes und Gewinnen der Caspase und des Caspase-gebundenen Proteins aus dem Immunkomplex, unter Verwendung von CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID Nr.: 4) als ein kompetetierendes Peptid.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Probe ausgewählt wird aus Körperfluiden, Zellextrakten und DNA-Expressionsbibliotheken.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 und 16, worin das kompetetierende Peptid die Aminosäuresequenz CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID Nr.: 4) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15-17, worin die Zellen in der Probe vor Extraktion stimuliert wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15-18, worin die Caspase Caspase-8 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15-19, worin zusätzlich ein Antikörper, der erhältlich ist durch Immunisierung eines Lebewesens mit dem Peptid entsprechend SEQ ID Nr.: 6, verwendet wird.
Verwendung von Epitop 179 (SEQ ID Nr.:4) zum Erhalten eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1-6, umfassen das Immunisieren eines Lebewesens mit einem solchen Epitop.