UA78526C2 - Antibody against caspase-8, a process for preparation and use of said antibody for development of elisa-analysis - Google Patents

Description

Опис винаходу

Винахід відноситься до антитіл до визначеної ділянки у каспазі-8 та до їх застосування. 2 Фактор некрозу пухлини (ТМЕ-альфа) і лімфотоксин (ТМЕ-бета) є поліфункціональними прозапальними цитокінами, що продукуються, головним чином мононуклеарними лейкоцитами, які здійснюють численні ефекти на клітини (МУайаси, ОО. (1986) Іп; Іпіепегоп 7 (оп Огеззег, ей), рр 833-122, Асадетіс Ргевзв, Іопаоп; і

Вешіег апа Сегаті (1987)). ТМЕ-альфа і ТМЕ-бета починають діяти внаслідок зв'язування зі специфічними рецепторами клітинної поверхні. Ймовірно деякі з їх ефектів виявляються корисними для організму: вони можуть, 70 наприклад, руйнувати пухлинні клітини або інфіковані вірусами клітини та посилювати протибактеріальну активність гранулоцитів. Таким чином, ТМЕ бере участь у захисті організму проти пухлин та інфекційних агентів і сприяє відновленню після пошкодження. Так, ТМЕ можна використовувати як протипухлинний агент, який при застосуванні зв'язується зі своїми рецепторами на поверхні пухлинної клітини і тим самим дає початок подіям, що ведуть до загибелі пухлинних клітин. ТМЕ також можна використовувати як протиінфекційний агент. 12 Однак ТМЕ-альфа здійснює шкідливу дію. Є докази, що надпродукція ТМЕ-альфа може грати основну патогенетичну роль при деяких захворюваннях. Наприклад, відомо, що дія ТМЕ-альфа передусім на судинну систему є головною причиною симптомів септичного шоку |ТГгасеу еї аї., 1994). При деяких захворюваннях ТМЕ може викликати надмірну втрату ваги (кахексію), пригнічуючи активність адипоцитів і викликаючи анорексію, і, тому, ТМЕ-альфа називають кахектин. Він також описаний як медіатор ураження тканин при ревматоїдних захворюваннях (Вешіег апа Сегаті, 19871) і як основний медіатор ураження, що спостерігається при реакціях "трансплантат проти хазяїна" |Сга (ЕЕ еї аї., 1989). Крім того, відомо, що ТМЕ бере участь у процесі запалення і багатьох інших захворюваннях.

Два окремих рецептори, що незалежно експресуються, ТМЕ-рецептори ро5 (СО 120а) і р7/5 (СО 1205), які специфічно зв'язують як ТМЕ-альфа, так і ТМЕ-бета, ініціюють і/або опосередковують описані вище біологічні с ефекти ТМЕ. Зазначені два рецептори містять структурно несхожі внутрішньоклітинні домени, дозволяючи Ге) припустити, що вони по-різному передають сигнал |Дивись Ноптапп еї а), 1989; ЕпдеІтапп еї аї., 1990;

ВгосКпайвз еї аїЇ., 1990; Іоеївспег еї аїЇ., 1990; БЗснай еї аїЇ., 1990; Морпаг еї аїЇ.,, 1990; тій еї аї., 1990). Однак клітинні механізми, наприклад, різних білків і можливо інших факторів, які залучені до внутрішньоклітинної передачі сигналу СО 120а і СО120р, ще не встановлені. Він включає внутрішньоклітинну ее, передачу сигналу, яка звичайно здійснюється після зв'язування ліганду, тобто, ТМР (альфа або бета), з с рецептором, який є відповідальним за початок каскаду реакцій, що зрештою приводить до відповіді, яка спостерігається, клітини на ТЕ. о

Що стосується зазначеного вище ефекту ТМЕ, що руйнує клітину, у більшості вивчених досі клітин, згаданий с ефект запускається, головним чином, СО 120а. Антитіла проти позаклітинного домену СО120а 3о (лігандзв'язувальний домен) самі можуть запускати дію, що руйнує клітину |дивись ЕР 412486), яка корелює з в ефективністю перехресного зв'язування рецептора антитілами, що, як вважають, є першою стадією у генерації процесу внутрішньоклітинної передачі сигналу. Крім того, мутаційні дослідження |Вгакеривзсп еї аї., 1992;

Тападіа ей аЇ, 1993)| показали, що біологічна функція СО 120а залежить від цілісності його « внутрішньоклітинного домену, і, відповідно, було висловлене припущення, що ініціація внутрішньоклітинної З 50 передачі сигналу, яка веде до ефекту ТМЕ, що руйнує клітину, відбувається як наслідок асоціації двох або с більше внутрішньоклітинних доменів СО 120а. Крім того, ТМЕ (альфа або бета) зустрічається як гомотример і, як

Із» вважають, сам по собі індукує внутрішньоклітинну передачу сигналу Через СО 120а завдяки його здатності зв'язуватися з рецепторними молекулами і зшивати їх, тобто, викликає агрегацію рецепторів (ЕпдеІтапп Н. еї аІ., 1990).

Іншим представником суперсімейства рецепторів ТМЕ/МОЕ є рецептор РАБ/АРОї1 (С2С095). С0е5 і опосередковує клітинну загибель у формі апоптозу (МОП еї аї., 19911 і, як виявилося, служить як негативний

Ге | селектор аутореактивних Т-клітин, тобто, під час дозрівання Т-клітин. СЮО95 опосередковує апоптотичну загибель

Т-клітин, що розпізнають аутоантигени. Також встановлено, що мутації у гені СОО5 (Ірг) викликають порушення і-й лімфопроліферації у мишей, яке нагадує аутоїмунне захворювання людини, системний червоний вовчак (ЗІ Е) ка 20 (Муагапаре-Рикапада еї аї., 19921. Ліганд для СЮ95 являє собою асоційовану з клітинною поверхнею молекулу, що переноситься, крім інших, Т-кілерами (або цитотоксичними Т-лімфоцитами - СТІ), і, отже, коли такі СТІ. щи контактують з клітинами, що несуть СОО5, вони здатні індукувати апоптотичну клітинну загибель клітин, шр несуть СОУ95. Крім того, були одержані моноклональні антитіла, специфічні для СОО5, які здатні індукувати апоптотичну загибель клітин, які несуть СЮ95, включаючи мишачі клітини, трансформовані кКДНК, що кодує СЮО5 52 людини Інаприклад, ЦОоНй еї аї., 19911.

ГФ) Рецептор ТМЕ і Раз-механізми передачі сигналу, що включають в себе різні рецептори, їх регуляцію та ідентифіковані молекули передачі сигналу детально розглянуті У/аІаснй еї а! (1999). о Встановлено, що визначені злоякісні клітини і ВІЛ-інфіковані клітини, які містять СОО5 на своїй поверхні, антитіла проти СОО5 або ліганд СОО5, можуть бути використані для запуску опосередкованої СООБ5 бо цитотоксичної дії у зазначених клітинах і, в зв'язку з цим, для забезпечення засобом для боротьби з такими злоякісними клітинами або ВІЛ-інфікованими клітинами |дивись, Мой еї аї., 1991). Тому відкриття ще інших шляхів збільшення цитотоксичної активності СОО5 може мати терапевтичне значення.

Вже давно існує потреба у забезпеченні способом модуляції клітинної відповіді на ТМЕ (альфа або бета) і ліганд СОО95. Наприклад, при згаданих вище патологічних ситуаціях, коли ТМЕ або ліганд С095 бо надекспресуються, виявляється бажаним інгібувати індуковані ТМЕ або лігандом СО95 ефекти, що руйнують клітини, у той час як в інших ситуаціях, наприклад при застосуванні для загоєння ран, бажано посилити дію

ТМЕ, або у випадку СОО5, у пухлинних клітинах або ВІЛ-інфікованих клітинах, бажано посилити дію, опосередковану СОО95.

Заявники використали ряд підходів |дивись наприклад, описи Європейських патентів Мо ЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 і ЕР 412486), щоб регулювати шкідливі дії ТМЕ за допомогою інгібування зв'язування ТМЕ з його рецепторами, застосовуючи анти-ТМР-антитіла або використовуючи розчинні рецептори ТМЕ (по суті розчинні позаклітинні домени рецепторів), щоб конкурувати зі зв'язуванням ТМЕ з ТМЕ-рецепторами, зв'язаними з клітинною поверхнею (ТМЕ-К). Далі, враховуючи, що зв'язування ТМЕ з його рецепторами є необхідним для 70 ТМЕ-індукованих клітинних ефектів, використовували способи |дивись, наприклад, ЕР 568925), що дозволяють модулювати дію ТМЕ модулюванням активності ТМЕ-К. (ЕР 568925) відноситься до способу модулювання трансдукції сигналу і/або розщеплення ТМЕ-К, при якому пептиди або інші молекули можуть взаємодіяти або з самим рецептором або ефекторними білками, що взаємодіють з рецептором, таким чином модулюючи нормальну функцію ТМЕ-К. В (ЕР 568925) описують 7/5 Конструкцію і властивості різних мутантних форм СО 12084, що мають мутації у позаклітинному, трансмембранному і внутрішньоклітинному доменах. Таким чином, ділянки у зазначених вище доменах СО120а були ідентифіковані як істотні для функціонування рецептора, тобто, зв'язування ліганду (ТМЕ) і подальшої трансдукції сигналу і внутрішньоклітинної передачі сигналу, що зрештою приводить до дії, що спостерігається,

ТМЕ на клітини. Крім того, також описують ряд способів виділення та ідентифікації білків, пептидів або інших факторів, які здатні зв'язуватися з різними ділянками у зазначених вище доменах СО120а, білків, пептидів та інших факторів, які можуть бути залучені до регуляції або модулювання активності ТМЕ-К. Також в (ЕР 368925) описують ряд способів виділення і клонування послідовностей ДНК, що кодують такі білки і пептиди; конструювання векторів, що експресують, для одержання зазначених білків і пептидів; та одержання антитіл або їх фрагментів, які взаємодіють з СО 120а або з зазначеними вище білками і пептидами, які зв'язують різні сч ов ділянки СО 120а. Однак в (ЕР 568925) не конкретизовані фактично існуючі білки і пептиди, які зв'язуються з внутрішньоклітинними доменами ТМЕ-К. Аналогічно, в (ЕР 568925) не описані специфічні білки або пептиди, і) здатні зв'язувати внутрішньоклітинний домен СОО5.

Таким чином, якщо бажано інгібувати дію ТМЕ або ліганду СО95, потрібно знизити кількість або активність

ТМЕ-К або СОО95 на поверхні клітини, в той час як виявляється необхідним збільшення кількості або активності Ге зо ТМЕ-К або С0О5, коли прагнуть досягти підвищеної дії ТМЕ або ліганду СО95. З цією метою секвенували і аналізували промотори як СО120а, так і СО1206 і встановили ряд мотивів ключових послідовностей, які є с специфічними відносно різних факторів, що регулюють транскрипцію, і по суті виявилося можливим ю контролювати експресію зазначених ТМЕ-К за рівнем їх промоторів, тобто, інгібування транскрипції на промоторах для зниження кількості рецепторів і підвищення транскрипції на промоторах для збільшення кількості со рецепторів (ЕР 606869 і М/О 95312061. ї-

Тоді як відомо, що рецептори фактора некрозу пухлини (ТМЕ) і структурно споріднений рецептор СОО5 при стимуляції лігандами, що продукуються лейкоцитами, запускають у клітинах деструктивну активність, яка приводить до їх власної загибелі, механізми згаданого запуску ще недостатньо вивчені. Мутаційні дослідження показали, що до передачі сигналу С0ОО5 і СО 120а для цитотоксичності залучені окремі ділянки в їх « внутрішньоклітинних доменах |Вгакеризсй еї аЇ., 1992; Тападіа ей аїЇ., 1993; Мой апа Мадаїа, 1993). ет») с Зазначені ділянки ("домени загибелі") характеризуються подібністю до послідовностей. "Домени загибелі" як

С0О5, так і СО 120а мають тенденцію до самоасоціації. їх самоасоціація очевидно стимулює агрегацію ;» рецепторів, яка є необхідною для ініціації передачі сигналу див. Відда еї аї., 1994; Воїдіп еї аї., 1995), і при високих рівнях експресії рецепторів може приводити до запуску ліганднезалежної передачі сигналу |Воїаїп г аї., 1995). -І Деякі з цитотоксичних ефектів лімфоцитів опосередковані взаємодією ліганду, що продукується лімфоцитами, з СО95 клітини-мішені, також |дивись Мадаїа апа Соїазіеїп, 1995). Загибель клітин під впливом со мононуклеарних фагоцитів залучає ТМЕ і його рецептор СО 120а |дивись також Мапдепабрееєїе еї аї., 1995). с Подібно до інших рецепторіндукованих ефектів, індукція клітинної загибелі рецепторами ТМЕ і С095 здійснюється через серію білок-білкових взаємодій, що ведуть від ліганд-рецепторного зв'язування до кінцевої ю активації ензиматичних ефекторних функцій, які, як було показано, включають неензиматичні білок-білкові

Ф взаємодії, які ініціюють передачу сигналу для загибелі клітини: зв'язування молекул тривимірного ТМЕ або ліганду СО0О5 з рецепторами, подальша взаємодія їх внутрішньоклітинних доменів |ВгаКеривзсп еї аї, 1992;

Тападіа ег аї, 1993; Цой апа Мадаїа, 1993), посилена схильністю мотивів "доменів загибелі" до ов бамоасоціації |(Воїдіп ей аї., 1995828), та індуковане зв'язування двох цитоплазматичних білків (які також можуть зв'язуватися один з одним) з внутрішньоклітинними доменами рецепторів - МОКТ-1 (або ЕАОЮВ) з СЮ95 (Ф) ІВоїадіп еї аї., 1995р; СПіппаїуап еї аїЇ., 1995; КівсиКеї еї аі., 1995) і ТКАБО з СО120а |Нзи еї аї., 19961). ка Крім їх зв'язування з С0О5 і СО120а, МОКТ-1 і ТКАБО також здатні зв'язуватися один з одним, а також з іншими "доменами загибелі", що містять білки, такі як КІР |Зіапдег еї аїЇ., 1995), що забезпечує функціональне бо перехресне спілкування" між СО95 і СО120а. Згадані зв'язування здійснюються через мотив консервативної послідовності, "модуль домену загибелі", спільний з рецепторами та їх асоційованими білками. Крім того, хоча на двогібридній дріжджовій системі показали, що МОКТ-1 спонтанно зв'язується з СОО5, у клітинах ссавців зазначене зв'язування має місце тільки після стимуляції рецептора, дозволяючи припустити, що МОКТ-1 бере участь в ініціації явищ передачі сигналу С0БО5. МОМКТ-1 не містить якого--себудь мотиву послідовності, 65 характерного для ензиматичної активності і тому виявилося, що його здатність запускати клітинну загибель не залучає активність, властиву самому МОКТ-1, а швидше активацію якогось іншого білка(ів), який зв'язує МОКТ-1 і діє далі у каскаді передачі сигналу. Показано, що клітинна експресія мутантів МОКТ-1, що не містять

М-кінцеву частину молекули, блокує індукцію цитотоксичності за допомогою СОО5 або СО120а |Нзи еї аї., 1996;

Спіппаїуап еї аї., 1996), означаючи, що зазначена М-кінцева ділянка передає сигнал для ефекту, що руйнує клітину, обох рецепторів через білок-білкову взаємодію.

Група цитоплазматичних тіолових протеаз, які є структурно спорідненими протеазі СЕЮОЗ Саепогпарайів еіедапз та інтерлейкін-1-бета-плеретворюючому ферменту (ІСЕ) ссавців, залучена до розвитку різних фізіологічних процесів клітинної загибелі див. огляд Китаг, 1995 і Непкагі, 1996). Також є докази, що протеаза(и) зазначеного сімейства бере участь у клітинній цитотоксичності, індукованій СОО5 і ТМЕ-К. 7/0 Виявлено, що специфічні пептидні інгібітори протеаз і два кодованих вірусами білки, які блокують їх функцію, білок сгпіА коров'ячої віспи і білок р35 бакуловірусу, забезпечують захист клітин проти зазначеної цитотоксичності (|Епагі ей аїЇ., 1995; Темагі ей аїЇ., 1995; Хице еї аї., 1995; Веїідіеєг еї аїЇ.,, 1995). Швидке розщеплення деяких спеціальних клітинних білків, очевидно опосередковане протеазою(ами) сімейства

СЕОЗЛСЕ (каспаза), може бути продемонстроване у клітинах невдовзі після стимуляції СОО5 або ТМЕ-К.

Одна така протеаза та її різні ізоформи (включаючи її інгібітори), відома як

МАСИ (нова каспаза-8) яка являє собою МОКТ-1-зв'язувальний білок, була виділена, клонована, охарактеризована, а також описано її можливе застосування, що детально викладено в описі, у заявці

РСТ/О596/10521, що частково належить заявникам, та у публікації заявників (Воїаїйп еї аї!., 1996) і включено в даний опис у повному обсязі. Інша така протеаза та її різні ізоформи (включаючи її інгібітори), позначена

Мена (також називається каспаза-10) була виділена і охарактеризована авторами винаходу (не опубліковано) та іншими дослідниками (Регпапде5з-АІпетгі ей аїЇ., 1996; Згіпімазша ей аїЇ., 1996). Каспаза-10 також є

МОКТ-1-зв'язувальним білком. Таким чином, подробиці, що стосуються всіх аспектів, особливостей, характеристик і застосувань каспази-10 викладені у вказаних вище публікаціях, всі з яких включені в опис в їх повному обсязі цитуванням. с

Також потрібно зазначити, що каспази, каспаза-8 і каспаза-10, які містять подібні продомени |дивись

Воїдіп ег аїЇ.,, 1996; Миіо сеї аїЇ, 1996; Регпапдез-АІпетгі ей аїЇ.,, 1996; Міпсепі апа Оіхі 1997, (8) взаємодіють через свої продомени з МОКТ-1, зазначена взаємодія здійснюється через "ефекторний домен загибелі", ОЕСО, присутній у М-кінцевій частині МОКТ-1 і присутній у двох екземплярах у каспазі-8 і каспазі-10

Ідивись Воїаїп еї аї!., 1995р; Спіппайїуап еї аї., 19951). Ге зо Каспази (цистеїнові аспартатспецифічні протеїнази) складають сімейство, що збільшується, цистеїнових протеаз, які характеризуються декількома спільними властивостями. Встановлено, що більшість з каспаз бере с участь в ініціації та здійсненні запрограмованої клітинної загибелі або апоптозу, в той час як виявилося, що ю інші залучені до продукції прозапальних цитокінів (Міспоївоп ЮОМУ еї аї., 1997, Замезеп О5 еї аї., 1997, Сопеп

СМ, 1997). Вони синтезуються у вигляді каталітично майже неактивних попередників і звичайно активуються со внаслідок розщеплення після специфічних залишків аспарагінової кислоти, розташованих у міждоменних ї- зв'язках. Сайти розщеплення каспаз визначаються тетрапептидними послідовностями (Х-Х-Х-О), а розщеплення завжди відбувається після аспарагінової кислоти. В результаті утворюються певні зрілі активні каспази і активують самих себе, а також інші неактивні попередники |Регпапдевз-АІпетгі Т еї аї., 1996, Згіпімазша 5.М. егаї., 1996). «

Активація процесу запрограмованої загибелі клітин в основному є специфічною і включає послідовний з с процесинг пізніх каспаз, які називаються "каспази-ефектори", який здійснюється ранніми каспазами, що називаються "каспази-ініціатори". Функціональні особливості двох класів каспаз також знаходять відображення в ;» їх структурі. Дійсно, "каспази-ініціатори" містять більш довгі продоменні ділянки у порівнянні з "каспазами-ефекторами" І(Заїмезеп 0.5. еї а!., 1997; Сопеп О.М., 1997). Довгий продомен дозволяє ініціаторним або "апікальним" каспазам активуватися при запуску рецепторів загибелі з сімейства рецепторів ТМЕ. Під час -І індукованої лігандом тримеризації рецепторів загибелі, каспази-ініціатори рекрутуються Через їх довгий

М-кінцевий продомен для взаємодії зі специфічними адапторними молекулами, щоб перетворити комплекс, що бо ініціює загибель, передачі сигналу |Сопйеп О.М., 1997; КізспиКеї! Е.С. еї аі., 1995). Наприклад, каспаза-В/МАСН с і, можливо, каспаза-10, які містять два ОЕО, рекрутуються у рецепторний комплекс адапторними молекулами 5р ЕАОО/МОКТ-, тоді як вважають, що каспаза-2 рекрутується за допомогою СКАОБ/КА!ІОО і КІР (Мадага 5. еї аї., де 1997; МасгЕапапе М. еї аїЇ., 1997; Аптай М. еї аї., 1997; Юца!Ї Н. еї аї., 1997). Вважають, що внаслідок

Ф тривимірної природи активованого рецепторного комплексу, принаймні, дві каспазні молекули підходять близько одна до одної, таким чином приводячи до їх активації внаслідок аутокаталітичного процесингу (Мапд еї аї., 1998; Ми?гіо еї аї., 19981. 5Б Каспази синтезуються у вигляді проферментів, що складаються з трьох основних субодиниць, М-кінцевого продомену і двох субодиниць, які іноді розділяються лінкерним пептидом. Дві субодиниці були названі "довга"

Ф) або субодиниця 1 (Зиб-1), що містить головну частину активного центра ферменту, і "коротка" або субодиниця 2 ка (5ир-2). Для повної активації ферменту, він піддається процесингу з утворенням продомену і двох суб-доменів.

Дві субодиниці утворюють гетеродимер. На основі виведеної тривимірної структури каспази-3 виявилося, що бо Є-кінець довгого домену, а також М-кінець короткого субдомену повинні бути вільними, а С-кінець короткої субодиниці повинен знаходитися у тісній близькості з М-кінцем довгої субодиниці, щоб утворився точно згорнутий і активний фермент |Койопава еї а/., 1996; МІ! еї а!., 1997; Згіпімазціа еї а/!., 19981.

Хоча завжди вважали, що метаболічні шляхи, які ведуть до апоптозу або некрозу, є абсолютно різними, останні дані дозволяють припустити, що каспази, які є головними медіаторами апоптозу, також можуть бути 65 причетні до некрозу як у негативному, так і у позитивному значенні. Дійсно, показано, що надекспресія інгібітору каспаз СптА у клітинах 1929 підвищує у 1000 разів чутливість зазначених клітин до некротичної активності ТМЕ |Мегсаттеп еї аЇ., 1998), вказуючи на інгібіторну дію каспаз на ТМЕ-індуковану некротичну активність. Крім того, нещодавно також було висловлене припущення, що ТМЕКТ1- і Раз-асоційовані "домени смерті", які виконують істотну роль в індукції апоптозу зазначеними лігандами |розглянуто УУайаси еї аї., 1999)| грають важливу роль в індукції некрозу (Воопе еї аїЇ., 2000). Показано, що Раві -індукований некроз печінки блокується інгібіторами каспаз (Кипейе еї аї., 19971.

Оскільки опосередкований каспазами протеоліз є вирішальним і центральним елементом апоптотичного процесу |Міспоївоп О.МУ. апа Тпогпрепу, М.А. (1997), МіШа еї аїЇ., (1997) і Заїмевзеп, 0.5., апа Оіхі, М.М. (1997)), ідентифікація важливих пізніх молекулярних мішеней зазначених протеаз виявляється неминучою для /о розуміння трансдукції апоптотичного сигналу. Показано, що різні структурні і сигнальні білки розщеплюються каспазами під час апоптотичної загибелі |Міспоївоп О.МУ. апа Трогпрегу, М.А. (1997), МіШа Р. еї аї., (1997)), включаючи ІСАБ, інгібітор ЮО-нази, що активується каспазою, що є важливим для міжнуклеосомної деградації ДНК, але не для здійснення апоптозу (Епагі, М. ей а). (1998) і БЗакКайіга еї аї., (1998).

Гельсолін, актинрегулювальний білок, який модулює цитоплазматичну трансформацію актин-гельсолю (Міп, Н.І... /5 апа зЗюзвеї, Т.Р. (1979)), залучений до апоптозу, судячи з (ї) його розщеплення під час апоптозу іп мімо

ІКоїнакоїа, 5. еї аї., (1997)), (ії) запобігання апоптозу при його надекспресії (Опівзи, М. еї аї., (1997)) та (ії) індукції апоптозу одним з розщеплених продуктів (Коїпакоїа, 5. еї а!., (1997).

Гельсолін характеризується численними активностями, що активуються Сач2, роз'єднує актинові філаменти і швидко перекриває зростаючі кінці філаментів, а також утворює ядро актинової полімеризації (Міп, Н.Г. апа 20 Зіоззеї, Т.Р., (1980), Кий, М. апа Вгуап, -). (1984), даптеу, Р.А., апа Біоззеї, Т.Р. (1987).

У Ізаявці МО 0039160) описані білки, що взаємодіють з каспазою-8, здатні взаємодіяти з ЗиБ-1 і/або 5ир-2 каспази-8. Білки, що взаємодіють з каспазою, виявлені при двогібридному скринінгу з використанням одноланцюгової конструкції каспази-8.

Звичайно, одночасне очищення каспази-8 і білків, зв'язаних з каспазою-8, включає модифікацію міченого сч об епітопу каспази-8 (наприклад, НА-злиття з каспазою-8, Коїп еї аї) і застосування анти-мічених специфічних антитіл. Однак епітопне мічення білків може впливати на активність мічених білків. (8)

Є антитіла специфічні до каспази-8:

Апіі-Маси, Мо у каталозі - 218777, є поліклональними курячими антитілами фірми Саїпріоспет, які розпізнають як про-каспазу-8, так і активну каспазу-8. Для одержання зазначеного антитіла як імуноген використовують «о зо повнорозмірний білок рекомбінантної каспази-8 людини.

Каспаза-8 (0384) 686 є моноклональним антитілом від СеїЇ Бідпаїїпуд (есппоіоду, одержаним імунізацією с мишей синтетичним пептидом, зв'язаним з КІН, який відповідає залишкам, картованим на амінокінці Зир-2 ю каспази-8. Зазначені антитіла специфічно виявляють ендогенні рівні відщепленої невеликої субодиниці каспази-8 кДа при вестерн-блотингу. Зазначені Мар рекомендують для вестерн-блотингу, і вони не дають перехресної со реакції з повнорозмірною каспазою-8. ї-

Антитіло В9-2 є моноклональним антитілом фірми Ріагтіпдеп (А Весіоп ОісКкіпвоп Сотрапу), яке розпізнає смугу 55 кДа, що відповідає каспазі-3. Рекомбінантний білковий фрагмент каспази-8 людини, що відповідає амінокислотам 335-469 каспази-8, використовували як імуноген (У/еамег еї аІ. 2000). Згадане моноклональне антитіло рекомендують для контролю рівнів каспази-8 при аналізі за допомогою вестерн-блотингу. Ідентифікацію « активної каспази-8 із застосуванням описаних Маре неможливо проводити внаслідок того, що фрагмент, який з с використовується для утворення антитіл, виявляється інтактним тільки у неактивній каспазі-8.

Каспаза-8 ріО (5-19):8с-6135 являє собою афінно-очищене козяче поліклональне антитіло фірми Запіа Сги? ;» БіоїесппоІоду, індуковане проти пептиду, картованого поблизу карбоксильного кінця 5ир-2 каспази-8 людини.

Зазначене поліклональне антитіло взаємодіє з субодиницею ріО (5ир-2) і попередником каспази-8 людини при вестерн-блотингу, імунопреципітації та імуногістохімії. Воно не дає перехресної реакції з каспазою-8 р20 (Зиб-1). -І Каспаза-8 1312 являє собою моноклональне антитіло фірми Сеї! Зідпаїїпд Їесппоіоду, одержане імунізацією мишей синтетичним пептидом, зв'язаним з КІ Н, який відповідає залишкам, картованим на карбоксильному кінці со ЗИр-1 каспази-8. Зазначене антитіло специфічно розпізнає про-каспазу-8 і активну каспазу-8 при с вестерн-блотингу.

Точна послідовність пептиду, використаного для імунізації мишей для утворення Маб, невідома. ю Каспаза-8 р20 (Н-134):5с-7890 являє собою кроляче поліклональне антитіло фірми Запіа Сти? БіоФесппоіоду,

Ф індуковане проти рекомбінантного білка, що відповідає амінокислотам 217-350, картованим у Зир-1 каспази-8 людини. Зазначене поліклональне антитіло взаємодіє з активною каспазою-8 і попередником каспази-8 миші, щура і людини при вестерн-блотингу, імунопреципітації та імуногістохімії.

Однак не існує ніякої інформації відносно ефективності, при якій каспаза-8 імунопреципітує, і чи може зв'язаний білок співосаджуватися і, якщо так, чи можливо одержання каспази-8 і білків, зв'язаних з

Ф) каспазою-8, з імунного комплексу. ка Таким чином, у наш час не описані поліклональні і моноклональні антитіла проти каспази-8, які володіють всіма наступними властивостями: здатні ефективно імунопреципітувати як про-каспазу-8, так і активну каспазу-8 бо | відділяти каспазу-8 з імунопреципітованого комплексу, допускаючи проведення одночасного очищення каспази-8 і білків, зв'язаних з каспазою-8.

Тому, спосіб даного винаходу вирішує проблему, що існує тривалий час, в області спів-преципітації і очищення каспази-8 і білків, зв'язаних з каспазою-8.

Антитіло (поліклональне, моноклональне, химерне, повністю гуманізоване анти-анти-И-антитіло або його 65 фрагмент), яке одержують імунізацією тварини пептидом з С-кінця Зир-1-одиниці каспази-8 (наприклад,

СОБОММОКОІРМЕТО), і його фрагменти, здатні спів-імунопреципітувати зазначену каспазу (як активну каспазу-8, так і про-каспазу-8) разом з білком, зв'язаним з каспазою, і ефективно вивільняти каспазу і зв'язаний білок з імунного комплексу при елюції. Зокрема, пептид, що використовується для імунізації, переважно може бути зв'язаний з КІ Н.

В одному аспекті, антитіло відповідно до винаходу являє собою ізотип імуноглобуліну Ід1с4.

В іншому аспекті антитіло винаходу запускає процесинг каспази-8.

У ще одному аспекті, у винаході представлене антитіло, яке можна використовувати для розробки

ЕГІЗА-аналізу.

У наступному аспекті, у винаході представлений спосіб одержання антитіла відповідно до винаходу і /о застосування антитіла у способі виділення асоційованих з каспазою білків, більш переважно асоційованого з каспазою білка, що містить амінокислотну послідовність ЗЕСО І МО:3, або ізоформи, алельного варіанту, фрагмента, функціонального аналога, злитого білка, їх мутанта або похідного, присутніх у клітинних зразках, наприклад клітинних екстрактах, бібліотеках КДНК, що експресуються, і геномних або комбінаторних пептидних бібліотеках. Більш конкретно, винахід відноситься до застосування зазначеного антитіла для виділення асоційованих з каспазою білків, причому каспазою є каспаза-8.

У ще одному аспекті винаходу, імуноген, який використовується для імунізації, зв'язують з носієм, переважно КІ Н.

У винаході також представлений спосіб очищення каспази, переважно каспази-8, та асоційованих з каспазою білків, що включає контактування матеріалу, який містить каспазу людини, з вказаним моноклональним антитілом. Зокрема, асоційовані з каспазою білки, елююють, переважно пептидом, використаним для імунізації.

Крім того, у винаході представлений спосіб очищення регуляторних білків каспази-8, зв'язаних з С-кінцевим доменом каспази-8, за допомогою антитіл, одержаних до С-кінцевого домену Зир-1 (наприклад, Мар 179), у комбінації з антитілами, одержаними до М-кінцевого домену Зиб-1 (наприклад, Мар 182), що включає спочатку співосадження каспази-8 і регуляторних білків антитілами до М-кінцевого домену, а потім використання антитіл сч ов проти С-кінцевого домену для елюції регуляторних білків каспази-8.

Крім того, у винаході представлене застосування епітопу 179 (ЗЕО 10:4) для одержання антитіла відповідно і) до винаходу, що включає імунізацію тварини таким епітопом.

Короткий опис фігур

На Фіг.1 представлена амінокислотна послідовність про-каспази-8. Пептидні послідовності з каспази-8, Ге

Зо Використані для одержання Маб, зображені жирним шрифтом і підкреслені.

Пептид 179 - пептид СОСОММОКОІРМЕТОЮ, що відповідає С-кінцю великої субодиниці каспази-8 (5ибБ-1). с

Пептид 182 - пептид | З5РОТКМІРОЕАО, що відповідає М-кінцю малої субодиниці каспази-8 (Зир-2, залишки ю

Ї уз385-С1уУ399).

Пептид 183 - пептид ЗЕБОТІ ОКМММОМКОКРК, що відповідає М-кінцю ЗибБ-1 (залишки бег217-С1у234). со

На Фіг.2 продемонстрована ефективна імунопреципітапія незначних кількостей каспази-8, виявлених у ї- лізатах клітин ВАВ, за допомогою моноклональних антитіл проти епітопу 179. Елімінація каспази-8 з лізатів клітин ВОАВ (одержаних до, -, і після, ї, стимуляції рецептора Раз) імунопреципітацією різними антитілами представлена зліва направо:

Доріжки З і 4, Мар 179, моноклональне антитіло, одержане проти пептиду, що відповідає С-кінцю Зибр-1 « (велика субодиниця каспази-8, залишки Суз360-Азр374). з с Доріжки 5 і 6, Маб 183.1 і доріжки 7 і 8, Мар 183.2, два моноклональних антитіла, одержаних проти . пептиду, що відповідає М-кінцю ЗиБ-1 (залишки Зег217-01у234). и? Доріжки 9 і 10, Маб 182, моноклональне антитіло, одержане проти пептиду, що відповідає М-кінцю Зир-2 (мала субодиниця каспази-8) (залишки І уз385-Азр399).

Доріжка 11, ММ5 - нормальна мишача сироватка. -І На фігурі представлені результати оцінки за допомогою вестерн-блотингу кількостей каспази-8, що залишилися у клітинних лізатах після імунопреципітації вказаними антитілами та у неосаджених спільних со клітинних лізатах (доріжки 1 і 2). На Фіг.За зображена елюція каспази-8, імунопреципітованої, як показано на с Фіг.2, за допомогою конкуренції з пептидами, проти яких були одержані різні антитіла. Каспазу-8 в елюатах з імунопреципітатів, утворених вказаними антитілами, визначали за допомогою вестерн-блотинг-аналізу (як на ю Фіг.2).

Ф На Фіг.30 зображена елюція каспази-8, імунопреципітованої, як показано на Фіг.2, внаслідок конкуренції з пептидами, проти яких були одержані різні антитіла. Каспазу-38 в елюатах з імунопреципітатів, утворених вказаними антитілами, виявляли забарвлюванням сріблом.

На Фіг.4 показана ефективна імунопреципітація незначних кількостей каспази-8, виявлених у лізатах клітин

ВОАВ, при використанні поліклональної сироватки, одержаної при імунізації пептидом, що відповідає С-кінцю

Ф) ЗИр-1 (велика субодиниця каспази-8, залишки Суз360-Азр374). Елімінація каспази-8 з лізатів клітин ВОАВ ка (одержаних до, -, і після, ї-, стимуляції рецептора Раз) імунопреципітацією різними антитілами показана зліва направо. Каспазу-8, що залишилася у лізаті визначали за допомогою вестерн-блотинг-аналізу після бо імунопреципітації наступними антитілами:

Доріжки З і 4, ММ5 - нормальна мишача сироватка.

Доріжки 5 і 6, анти-179 поліклональне антитіло, поліклональне антитіло кролика, одержане проти С-кінця

ЗИБ-1 (велика субодиниця каспази-8, залишки Суз360-Авр374).

Доріжки 7 і 8, Маб 182. 65 ТІ. - спільний клітинний лізат.

На Фіг.5 представлена каспаза-8, імунопреципітована та елюйована з лізатів нестимульованих клітин ВАВ при використанні різних антитіл. Рівні каспази-8, представлені зліва направо, визначали методом вестерн-блотингу після елюції імунопреципітатів, проведеного з наступними антитілами:

Доріжка 1, анти-183 поліклональна сироватка проти М-кінця 5цБ-1 (залишки Зег217-О1у234).

Доріжка 2, Мар 183.2, моноклональне антитіло проти М-кінця З!иБ-1 (залишки Зег217-О1у234).

Доріжка 3, Мав 179, моноклональне антитіло проти С-кінця ЗиБ-1 (велика субодиниця каспази-8, залишки

Суз360-Авзр374).

Невеликий (5,бкДа) фрагмент каспази-8, одержаний за допомогою нового режиму процесингу, індукованого

Маь 179, відмічений стрілкою. 70 На Фіг.б6 представлена каспаза-8 і асоційований білок (Р72/Сагі), які були імунопреципітовані Мар 179 з лізатів клітин ВОАВ перед або після одногодинної стимуляції Раз-лігандом і елюйовані пептидом 179. Каспазу-8 і асоційовані білки, імунопреципітовані Мабь179, елюювали (як показано на Фіг.35), розділлли за допомогою 5ЮОЗ-РАОЕ і забарвлювали сріблом. На доріжках 1 і 2 представлені контролі, в яких клітинні лізати імунопреципітували 7/5 МіО (імуноглобулін миші дос).

На Фіг.7 зображене схематичне представлення мотивів білка Р72. Один згорнутий спіральний мотив (С) і два розташованих один за одним "мотиви ЗОКР" (5) розташовані близько до М-кінця білка, а один мотив, "О-ділянка", локалізований на С-кінці білка (-мотив). Також вказаний залишок аспарагінової кислоти ОбО0, присутній всередині мотиву б. Об6О0 є мутантом, в якому залишок ОбО0 у білці заміщений залишком глутамінової кислоти.

На Фіг.8 зображене схематичне представлення підходу, що використовується для одержання повнорозмірної

КДНК р72. Клон Е5Т ІМАСЕ 2964545, придбаний у фірми Іпсуїе Сепотісз, в якому відсутня послідовність перших 21 нуклеотиду (які кодують перші 7 амінокислот), використовували як матрицю для першої полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) разом з парою праймерів: прямий праймер, Р2, що містить нуклеїнові кислоти, які перекриваються з клоном 5' ЕЗТ, і додаткові 15 нуклеотидів з 21 відсутнього нуклеотиду, і зворотний праймер, сч ов РЗ, що містить послідовності, які перекриваються з З ЕЗТ. Одержаний продукт ПЛР використовували як матрицю для другої ПЛР разом з парою праймерів: прямий праймер РІ, що містить всі 21 відсутні нуклеотиди і 5 і) нуклеїнових кислот Е5Т, і зворотний праймер РЗ, що містить послідовності, які перекриваються з З ЕТ.

На Фіг.9 продемонстрована спів-імунопреципітація каспази-8 і р/2 за допомогою Маь179 з лізатів клітин

ВОАВ у нульовий час і після 20 хвилин стимуляції Раз-лігандом. Білки, елюйовані після імунопреципітації Ге зо Маб179, розділяли у гелях ЗОЗ-РАСЕ і виявляли забарвлюванням сріблом. Зону з припустимою молекулярною масою приблизно 72,5 кДа, що відповідає р7/2, співосаджували з про-каспазою-8 перед Раз-лігандною с стимуляцією (доріжка 3). Після 20 хвилинної стимуляції зона доріжки 72,5 кДа зменшувалася і виявляли нову ю зону, що відповідає білку з більш низькою припустимою молекулярною масою приблизно 68 кДа (доріжка 4),

На доріжці 1 і 2 представлені негативні контролі, включаючи імунопреципітацію клітинних лізатів МІДСІ, со імуноглобулін миші Ідсі. ї-

На Фіг.10 продемонстроване розщеплення р/2 активною каспазою-8. Білок що кодується кКДНК р72, експресували іп мйго у ретикулоцитних лізатах у присутності 832-метіоніну, використовуючи систему ретикулоцитних лізатів, зв'язану з ТпТ 17, і тестували після інкубації протягом 1 години при 37 2С у присутності « та за відсутності рекомбінантної активної каспази-8. Крім того, розщеплення р72 вивчали з продуктами ТпТ, що кодуються 2 різними мутантами кДНК р72: один, що кодує р/2, в якому залишок ОбО0, як вважають, є - с залишком-мішенню для каспази-8, мутували в Е Ір/2 (О6О0ОЕ)), та інший, в якому делегований ген, а в ц одержаному зрізаному білку відсутні залишки (0600 р72 (1-600)), що лежать нижче. Одержані білки розділяли при ,» ЗОЗ-РАСЕ, а результати виявляли за допомогою фосфовізуалізації.

На Фіг.11 представлені каспаза-8 і р72, які були спів-імунопреципітовані Маь179 з лізатів клітин ВАВ до (0) або після 5, 10, 20, 40 і 60 хвилин стимуляції Раз-лігандом. Пептиди елюювали, розділяли у гелях - І ЗО5-РАСЕ і виявляли забарвлюванням сріблом. До стимуляції (0) виявлений пептид з припустимою молекулярною масою 72,5 кДа. Після 5 і 10 хвилин стимуляції з'являвся новий білок з більш низькою

Со припустимою молекулярною масою близько 68 кДа. Після 40 хвилин стимуляції зона доріжки 72,5 кДа повністю с зникала, а визначали тільки зону 68 кДа. На 60 хвилині жоден із згаданих вище білків не спів-преципітував з каспазою-8. іме) - о, .

Даний винахід відноситься до антитіл, направлених проти С-домену 5Иир-1 каспази-8. Встановлено, що 4) антитіла, проти зазначеного домену, представляють інтерес завдяки їх здатності імунопреципітувати каспазу-8 (про-каспазу-8 і активну каспазу) з високою ефективністю, навіть якщо каспаза присутня у дуже низькій концентрації. Зазначені антитіла також можна застосовувати для ефективного співосадження і виділення білка, зв'язаного з каспазою-8.

Антитіла відповідно до винаходу можуть бути поліклональними або, більш переважно, моноклональними. У

ІФ) переважному аспекті, пептид, одержаний з С-кінця 5Иир-1 каспази-8, що містить залишки Суз360-Азр374 і ко послідовність СОСОММОКОСІРМЕТО (пептид 179 ЗЕСО І0:4), використовують для імунізації, щоб одержати антитіла. 60 Пептид, що застосовується для імунізації може бути синтезований, очищений за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою і з'єднаний з будь-яким носієм, таким як КІН, переважно через його природний цистеїн або через штучно злитий цистеїн, щоб експонувати пептид на поверхні носія, і використаний для імунізації, наприклад, мишей для одержання моноклональних антитіл і кроликів для одержання поліклональних антитіл.

В одному аспекті спів-імунопреципітацію каспази-8 і білків, зв'язаних з каспазою-8, проводять з 65 використанням антитіла до каспази-8, специфічного до епітопу 179, виявленого на С-кінцевому домені ЗИиБ-1.

Спів-імунопреципітацію відповідно до винаходу проводять на зразках, вибраних з клітинних лізатів стимульованих і таких, що знаходяться у стані спокою, клітин з бібліотек КДНК, що експресуються, з бібліотек геномних або комбінаторних пептидів.

Клітини можна стимулювати перед лізисом та імунопреципітацією, використовуючи різні агенти, що індукують апоптоз, такі як обробка лімфокінами, наприклад Раз-лігандом, ТМЕ, або факторами, зв'язаними з навколишнім середовищем, такими як голодування, тепловий шок і так далі.

Використовуючи антитіла для спів-імунопреципітації відповідно до винаходу, можна ефективно елюювати каспазу-8 і зв'язаний з каспазою-8 білок, з імунопреципітованого комплексу і дістати у супернатант внаслідок конкуренції з пептидом, одержаним з СОСОММОКОІРМЕТО каспази-8, тим же пептидом, який використовували 7/о для імунізації.

Пептид 179 або епітоп 179 каспази-8 з послідовністю СОСОММОКОІРМЕТО і 5ЕО ІЮО МО:4 або мутеїн, його фрагмент, злитий білок або його похідне можна застосовувати для імунізації та утворення антитіл відповідно до винаходу. Пептид для імунізації може бути одержаний внаслідок хімічного синтезу, як описано вище, або технологією рекомбінантної ДНК у клітинах ссавця, або внаслідок розщеплення очищеного білка. Білок також /5 Може продукуватися у клітинах бактерій або комах, що детально описано в |Сигтепі РгоїосоЇв іп Моіесшаг

Віоіоду, БУР.М. А!йзгивеї, ІЗВМ: 047150338Х, 1988 спаріег 16).

Даний винахід також відноситься до мутеїнів зазначеного вище епітопу 179 (ЗЕО ІЮО МО:4) винаходу, які в основному зберігають ті ж властивості пептиду, що має, по суті, тільки послідовності пептиду, які зустрічаються у природі. Такі "мутеїни" можуть бути мутеїнами, в яких амінокислотні залишки можуть бути делетовані, додані або заміщені іншими залишками так, що модифікації даного виду істотно не змінюють біологічні властивості пептидного мутеїну у порівнянні з самим пептидом.

Зазначені мутеїни одержують за відомим способом синтезу і/або за способами сайт-направленого мутагенезу або будь-яким іншим відомим способом, придатним для цього.

Переважними змінами для мутеїнів відповідно до даного винаходу є зміни, які відомі як "консервативні" сч ов Заміщення. Консервативні амінокислотні заміщення включають подібні амінокислоти у межах групи, які мають досить подібні фізико-хімічні властивості, так що заміщення між представниками групи будуть зберігати і) біологічні функції молекули, (Сгапійат, Зсіепсе, Мої. 185, рр 862-864 (1974)). Зрозуміло, що інсерції та делеції з амінокислот також можуть бути здійснені в описаних вище послідовностях без зміни їх функції, особливо, якщо інсерції або делеції стосуються тільки декількох амінокислот, наприклад менше 3, і переважно Ге зо менше 2, і не видаляють або заміщають амінокислоти, які є істотними для функціональної конформації.

Переважно, подібними амінокислотними групами є групи, позначені у Таблиці І. Більш переважно, подібними с амінокислотними групами є групи, позначені у Таблиці ІІ; і найбільш переважно, подібними амінокислотними ю групами є групи, позначені у Таблиці ІП. тАпЛИДЯ? (ее)

Пс пі грали полібшсик лчігоспот 3о голівок коти 77 тота гпзпя в

Кат Баг, Пиг, 1, ат п йо. Си, Су, О;., Ніх

Їси Пе, Бе, ут, Мо, мазі. Те; « и 12. Ма, Сл. Рсе

Тнг Рго, хе, Ан. Ск, Вів, Сп, Сл о, с дя іх, Те, ге, Ав з» ча пет, Ві, Це, Ту ха! ТАБЛИЦЯ Ії с А. Тот, Род, Хег, сх 1 тс. Тут, Ге, ба, бе, Пе

Ре ТТ Нес, Туг, Ме, ші, Сви, Не - Ти "Лв, Ме, ех. Пе, ма, 1ж, Тут (о) Су: Хег, ТЕс, хх

Ні «іш. Ся, С, Таг, ледь іх о 1 спш. Гев, аш. Віа, Тнг, тд, стіп ко 20 Аг Сн, А»р, Зм, лчп. 1 Си, сс, Нік, гр, 1. щи дер С, Ав. лег

С пе, Так, вот, Ой, Нія, гу, Й "Ме ЕНе, Пе, б, Сеш, МК пр тт

Ф) іме) 60 б5

Біт ізерешижеві сплю полібізвіж, ді окт

Анінакніпінй. Полібигя срупя щ-г Зсе ге Піх, Слка, й й Те. Ре, м, Са

Есе А, Вес

Ти ЧНг

Аа Ро, Аа ча мет, Пе сів Сік

Пе Ме, Жья, Біде, Мій. б ле Ме Тут, Пе, Св, НК

Тег Ріко

Ст Сх

Ніг логи. хіп, 1425 «С См, Ні, СТп й говрі вв їх Ат вер БП, Лар

Си Сл, с

Ма. Ре, Пе. хаї, Гц, Міс

Ір ТТ о

ТАБЛИЦЯ ЇЇ

Екайбзьи) петесевегі реп олієих жене коелот (се)

А міжакнстіись Пидівня пре сч

Зсг Геть

АРЕ ЛЕ о іс Те, Місї, Сех с ха ти ї-

Тс Тс

АБ лін злий Ка «

Су СІ 70 Те Те, па ех, І селі як с Рг Ріє ;» Тя С

Су Баг, Сук

Ні Ех і піл Сл (ее) вл Акт с Іжа І му Кор Ар

Ся е січ 4) міне Пе, су, Ме

Те Тт

Приклади здійснення амінокислотних заміщень у білках, які можна використовувати для одержання мутеїнів білків для застосування у даному винаході включають в себе будь-які відомі стадії способів, такі як описані у

Ф) І(патентах США КЕ 33653, 4959314 і 4737462 (Магк еї аї.); 5116943 (Коїйз еї аІ.); 4965195 (Матеп еї аї).); ка 4879111 (Спопа еї аї); і 5017691 (І ее еї аї.); і лізин-заміщені білки, описані у патенті США Мо 4904584 (Зігаму еї аї|.

Потім білок або пептид очищають з синтезованої суміші або з клітин, в яких він продукується. Способи бо очищення білка відомі фахівцям у даній області і детально описані, наприклад, у згаданих вище Сигтепі

РгоїосоЇїв іп Моїіесціаг Віоіоду, спаріег 16, та у Ситепі РгоїосоЇв іп Ргоївеіп Зсіепсе, МУпеу апа Бопв Іпс.

Спаріег 5 апа 6. Виявляється сприятливим, якщо пептид можна одержувати у вигляді гібрида з КІН або глутатіон-З-трансферазою або тому подібним, або з послідовністю-міткою, такою як гістидин-мічена послідовність. Застосування злитих або мічених білків спрощує процедуру очищення, що детально описано у 65 згаданих Ситепі Ргоїосоїв іп Моіесціаг Віоіоду, спаріег 16 та в інструкціях для вказаної вище експресії

Нівз-мітка-білка Оіадеп і в інструкції до набору для очищення.

Якщо білок або пептид експресують у вигляді злитого білка, партнер злиття потрібно видаляти перед застосуванням білка для одержання антитіл для того, щоб уникнути утворення антитіл проти партнера злиття.

Розщеплення партнерів злиття і виділення бажаного білка описане у згаданих Сигтепі Ргоїосоів іп МоЇІесшаг

Віоіоду, спаріег 16. Вектори, протоколи і реагенти для експресії і очищення мальтозазв'язувального білка, злитого з рекомбінатними білками, також постачаються комерційно.

При одержанні пептиду може не потребуватися видалення партнера злиття, оскільки злитий білок може стимулювати продукцію антитіл проти пептиду.

Крім того, як зазначено вище, пептид також можна синтезувати хімічними способами, відомими в області хімії. 70 Одержання поліклональних антитіл проти білків описане у спаріег 2 ої Ситепі Ргоїосоїв іп Іттипоіоаду,

УУйеу апа Зопз Іпс. Одержання антитіл проти пептидів може потребувати деяких змін у протоколі, внаслідок звичайно більш низької антигенності пептидів у порівнянні з білками. Одержання поліклональних антитіл проти пептидів описане у вказаних Сигтепі Ргоїосоїв іп Іттипоіоду, спаріег 9.

Моноклональні антитіла можна одержувати з В-клітин, взятих з селезінки або лімфатичних вузлів 7/5 імунізованих тварин, зокрема щурів або мишей, за допомогою злиття з імморталізованими В-клітинами в умовах, які сприяють росту гібридних клітин. Для злиття мишачих В-клітин переважні клітини лінії Ад-8.

Спосіб одержання моноклональних антитіл описаний у багатьох статтях і керівництвах, таких як Сигтепі

РгоїосоЇїв іп Іттипоіоду, ММПеу апа бопз Іпс. Спарієг 2. У розділі 9 описують імунізацію тварин пептидами.

Клітини селезінки або лімфатичних вузлів зазначених тварин можна використовувати таким же чином, як 2о Використовують клітини селезінки або лімфатичних вузлів імунізованих білком тварин для одержання моноклональних антитіл, що описано у розділі 2 там же.

Крім того, способи, що використовуються для одержання моноклональних антитіл, описані (Койіег апа

Міїгіеїп, (1975), та у патенті США 4376110).

Одержання антитіл з банку генів антитіл людини, у яких їх гіперваріабельні ділянки заміщають майже сч ов випадковими послідовностями, описане в (ЗР 5840479). Такі антитіла є переважними, коли важко імунізувати тварину даним пептидом або білком. Деякі структури є поганими імуногенами і можуть залишатися такими, і) незважаючи на додавання ад'ювантів і зв'язування з іншими білками у злитих конструкціях. Крім того, антитіла, описані в (БР 5840479), виявляються переважними, якщо бажано застосовувати антитіла зі структурою подібною до антитіл людини, наприклад, коли потрібні антитіла, які мають низьку імуногенність у людини. Ге зо Після ідентифікації придатного антитіла, може виявитися бажаним змінити його властивості. Наприклад, використовуючи химерне антитіло, можна досягти більш високого виходу у продукуванні. Крім того, химерні с антитіла, в яких константні ділянки заміщають константними ділянками антитіл людини, потрібні, коли бажано, ю щоб антитіло володіло низькою імуногенністю у людини. Одержання химерних антитіл описане у ряді публікацій, таких як ІСарійу еї аїЇ.,, 1984; Могтізоп еїаІЇ.,, 1984; Воціаппе еї аЇ., 1984; ЕР 125023, ЕР 171496, ЕР со 173494, ЕР 184187, М/О 86/01533, МО 87/02671 і Нагпіом/ апа І апе, Апііродіев: А І арогаїогу Мапиаї, Соїа Зргіпд ї-

Нагбог І арогайогу, 19881. "Повністю гуманізовані антитіла" являють собою молекули, що містять як варіабельну, так і константну ділянку імуноглобуліну людини. Повністю гуманізовані антитіла потенційно можна використовувати для терапевтичного застосування, коли потрібне тривале лікування при хронічних і рецидивних захворюваннях, « таких як аутоімунні захворювання. Один спосіб одержання повністю гуманізованих антитіл людини складається 3 пт) с "гуманізації" гуморальної імунної системи миші, тобто одержання мишачих ліній, здатних продукувати Ід людини (ксеномиші) внаслідок введення локусів імуноглобуліну (4) людини мишам, у яких ендогенні гени Ід були ;» інактивовані. Локуси Ід є надзвичайно складними з точки зору як їх фізичної структури, так і реаранжування генів і способів експресії, необхідних, щоб викликати зрештою яскраво виражену імунну відповідь.

Різноманітність антитіл досягається, головним чином, комбінаторним реаранжуванням між різними генами М, О і -І У, присутніми у локусах Ід. Зазначені локуси також містять різноманітні регуляторні елементи, які контролюють експресію антитіл, алельне виключення, зміну класів і дозрівання афінності. Введення нереаранжованих со трансгенів (Ід людини мишам продемонструвало, що мишачий механізм рекомбінації є сумісним з генами людини. с Крім того, гібридому, що секретує антиген-специфічні пи-тАбБ різних ізотипів, можна одержувати внаслідок імунізації ксеномишей антигеном. де Повністю гуманізовані антитіла і способи їх одержання відомі у даній області |Мепде еї аїЇ, Машге

Ф Сепеїйїсв 15:146-156 (1997); Виддетапп еї аїЇ., Еиг. 9. Іттипої. 21:1323-1326 (1991); ТотігикКа еї аї., Ргос.

Май. Асаа 5сі. ОБА 97:722-727 (2000), патент УМО 98/248931І.

Іншим типом антитіла є антиідіотипічне антитіло. Антиідіотипічне (анти-І4) антитіло являє собою антитіло, ов яке розпізнає унікальні детермінанти, звичайно асоційовані з антигензв'язувальною ділянкою антитіла.

Ід-антитіло можна одержувати імунізацією тварини того ж виду і генетичного типу (наприклад, мишачу лінію) як (Ф) джерело Маб, до якого одержують анти-іІд. Імунізована тварина буде розпізнавати і відповідати на ідіотипічні ка детермінанти антитіла, що імунізує, за допомогою продукції антитіла до зазначених ідіотипічних детермінант (анти-Ід-антитіло). Дивись, наприклад, (патент США Мо4699880), який повністю включений в опис шляхом бор посилання.

Анти-М-антитіло також можна використовувати як "імуноген", щоб індукувати імунну відповідь ще у іншої тварини, одержуючи так зване анти-анти-Ід-антитіло. Анти-анти-Ій може бути ідентичним за антигенними детермінантами первинному тАб, яке індукувало анти-ід. Таким чином, внаслідок використання антитіл до ідіотипічних детермінант тАбБ, виявляється можливим ідентифікувати інші клони, що експресують антитіла з 65 ідентичною специфічністю.

Відповідно, Маре», одержані проти С-кінцевої субодиниці каспази-8, її аналогів, фрагментів або похідних даного винаходу можна використовувати, щоб індукувати анти-И-антитіла у відповідних тварин, таких як миші

ВАЇ В/с. Клітини селезінки від таких імунізованих мишей застосовують, щоб одержати анти-Іа-гібридоми, які секретують анти-Іій тА. Крім того, анти-ІА тАбБ можна зв'язувати з носієм, таким як гемоціанін лімфи равлика (КІН), і використовувати, щоб імунізувати додаткових мишей ВАЇ В/с. Сироватки від зазначених мишей будуть містити анти-анти-|а антитіла, які характеризуються зв'язувальними властивостями вихідних тАб, специфічних відносно епітопу згаданої вище каспази-8 або її аналогів, фрагментів і похідних.

Таким чином, анти-Ід-тАБ містять свої власні ідіотипічні епітопи або "ідіотопи", які структурно подібні до оцінюваного епітопу. 70 Термін "антитіло" також припускає включення обох інтактних молекул, а також їх фрагментів, таких як, наприклад, Рар і К(ар)2, які здатні зв'язувати антиген. Фрагменти Бар і Б(абБ)2 не містять фрагмент Ес інтактного антитіла, більш швидко виводяться з циркуляції і можуть характеризуватися меншим неспецифічним тканинним зв'язуванням, ніж інтактне антитіло (мані еї а/!., 19831.

Потрібно розуміти, що Раб і Е(абБ)2 та інші фрагменти антитіл, що використовуються у даному винаході, /5 Можна застосовувати для виявлення і кількісного визначення білка р72 відповідно до способів, представлених в описі для інтактних молекул антитіл. Звичайно такі фрагменти одержують в результаті протеолітичного розщеплення, використовуючи ферменти, такі як папаїн (щоб одержати фрагменти Рар) або пепсин (щоб одержати фрагменти К(аб)2).

Як зазначено, антитіло "здатне зв'язувати" молекулу, якщо воно може специфічно взаємодіяти з молекулою, щоб таким чином зв'язати молекулу з антитілом. Термін "епітоп", як вважають, відноситься до тієї частини будь-якої молекули, яка здатна зв'язуватися антитілом і яка також може бути розпізнана таким антитілом.

Епітопи або "антигенні детермінанти" звичайно складаються з хімічно активних поверхневих угруповань молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукрів, і володіють специфічними особливостями тривимірної структури, а також специфічними характеристиками заряду. с "Антиген" являє собою молекулу або частину молекули, здатну зв'язуватися антитілом, яка, крім того, здатна стимулювати тварину до продукції антитіла, здатного зв'язувати епітоп такого антигену. Антиген може і) мати один або більше епітопів. Припускається, що згадана вище специфічна реакція вказує, що антиген буде реагувати високоселективним способом зі своїм відповідним антитілом, а не з безліччю інших антитіл, які можуть бути індуковані іншими антигенами. Ге зо Епітоп 179 винаходу можна використовувати для створення поліклональних, моноклональних антитіл для вираженої імунопреципітації та елюції каспази-8 і білків, асоційованих з каспазою-8. Антитіла також можна с використовувати, щоб індукувати новий процесинг каспази-8. ю

Антитіла, одержані до С-кінцевого домену 5иИр-1, такі як Мар 179, можна застосовувати у комбінації з антитілами, одержаними до М-кінцевого домену ЗибБ-1, такими як Маб 183, щоб специфічно виділяти регуляторні со білки каспази-8. Відомо, що С-кінцевий домен 5ибБ-1 є частиною активного центра каспази-8 і, тому, регуляторні ї- білки можуть зв'язувати його |ППогпреггу еї аї.,, 1997). Співосадження каспази-8 і регуляторних білків, асоційоване спочатку з Мар 183, а потім із застосуванням Маб 179, може вивільняти регуляторні білки від каспази-8 у середовище і приводити до ідентифікації ключових білків, залучених до регуляції апоптозу.

В одному аспекті, Сагі, білок, що зв'язує про-каспазу-8, виділяють, використовуючи імунопреципітацію за «

Винаходом з Маб 179. Встановлено, що Сагі розщеплюється активною каспазою-8 і залучений до активації з с каспази-8 та апоптозу. . Антитіла (або їх фрагменти), що використовуються у даному винаході, можна застосовувати гістологічно в и?» імунофлуоресцентній або імуноелектронній мікроскопії для виявлення каспази-8 іп зйш. Виявлення іп зйШ може бути досягнуте внаслідок видалення гістологічного препарату у пацієнта і застосування міченого антитіла даного винаходу для такого препарату. Переважно, антитіло (або фрагмент) застосовують, піддаючи контакту -І мічене антитіло або покриваючи ним (або фрагментом) біологічний препарат. Застосовуючи даний винахід, фахівець у даній області повинен розуміти, що будь-який з великої різноманітності гістологічних способів со (таких як процедури забарвлення) можна модифікувати, щоб успішно виконати подібне виявлення іп зі. с Біологічний зразок можна обробляти твердофазовою основою або носієм, таким як нітроцелюлоза або іншою 5р твердою основою або носієм, які здатні іммобілізувати клітини, клітинні частинки або розчинні білки. Потім ю основу або носій можна промивати відповідним буфером з подальшою обробкою антитілом, міченим міткою, що

Ф виявляється, відповідно до даного винаходу, як зазначено вище. Потім твердофазову основу або носій можна промивати буфером, щоб другий раз видалити незв'язані антитіла. Кількість зв'язаної мітки на зазначеній твердій основі або носії потім можна визначати загальноприйнятими способами.

Під терміном "твердофазова основа", "твердофазовий носій", "тверда основа", "твердий носій", "основа" або "носій" мають на увазі будь-яку основу або носій, які здатні зв'язувати антиген або антитіла. Добре відомі (Ф) основи або носії включають скло, полістирол, поліпропілен, поліетилен, декстран, нейлонові амілази, природні ка та модифіковані целюлози, поліакриламіди, габро і магнетит. Для цілей даного винаходу носій може бути або розчинним до деякої міри, або нерозчинним. Матеріал основи фактично може мати будь-яку можливу структурну бо Конфігурацію, доки зв'язана молекула здатна зв'язуватися з антигеном або антитілом. Таким чином, конфігурація основи або носія може бути сферичною у вигляді гранул, циліндричною як внутрішня поверхня пробірки або зовнішня поверхня стрижня. Альтернативно, поверхня може бути плоскою як лист, тест-смужка і так далі.

Переважні основи або носії включають в себе полістиролові гранули. Фахівцям у даній області добре відомо багато інших відповідних носіїв для зв'язування антитіла або антигену, або вони зможуть їх вибрати при 65 звичайному експериментуванні.

Як зазначено вище, зв'язувальна активність даної партії антитіл винаходу може бути встановлена за допомогою добре відомих способів. Фахівці у даній області зможуть вибрати робочі та оптимальні умови дослідження для кожного визначення в результаті звичайного експериментування.

Інші стадії, такі як промивання, перемішування, струшування, фільтрування і тому подібні, можуть бути додані до дослідження, оскільки є звичайними і необхідними за певної ситуації.

Одним із способів, при якому антитіло відповідно до даного винаходу можна ефективно мітити, є зв'язування антитіла з ферментом і застосування в імуноферментному аналізі (ЕІА). У свою Чергу, зазначений фермент при експозиції з відповідним субстратом, буде взаємодіяти з субстратом так, щоб утворити хімічний фрагмент, який можна визначати, наприклад, спектрофотометричним, флуориметричним або візуальним способом. Ферменти, /о0 які можна використовувати для детектованого мічення антитіла, не обмежуючись, включають малатдегідрогеназу, стафілококову нуклеазу, дельта-5-стероїдизомеразу, алкогольдегідрогеназу дріжджів, альфа-гліцерофосфат-дегідрогеназу, триозофосфатізомеразу, пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, аспарагіназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-б-фосфатдегідрогеназу, глюкоамілазу і ацетилхолінестеразу. Виявлення можна проводити 7/5 Колориметричними способами, в яких застосовують хромогенні субстрати для ферменту. Виявлення також можна здійснювати візуальним порівнянням ступеню ензиматичної реакції з субстратом у порівнянні з реакцією, проведеною зі стандартами.

Виявлення можна проводити, використовуючи будь-який з цілого ряду інших імуноаналізів. Наприклад, за допомогою радіоактивного мічення антитіл або фрагментів антитіл виявилося можливим визначати К-РТР-азу за допомогою застосування радіоімуноаналізу (КІА). Хороший опис КІА представлений в | арогаїогу Тесппідцез апа Віоспетівігу іп МоїІесшаг Віоіоду, Бу УМУогк, Т.5. еї аЇ.,, Мой Ноїапа Рибіїзпіпд Сотрапу, ММ (1978), особливо це стосується розділу, озаглавленого "Ап Іпігодисіоп о Кадіоіїттипе Аззау апа Кеїаїедй Тесппідцев"

Бу Спага, Т.), включеного в опис у вигляді посилання. Радіоактивні ізотопи можна виявляти такими способами, як застосування д-лічильника або сцинтиляційного лічильника або за допомогою авторадіографії. сч

Також виявляється можливим мітити антитіло відповідно до даного винаходу флуоресцентною сполукою.

Коли мічене флуоресцентною міткою антитіло піддають дії випромінювання належної довжини хвилі, присутність і) антитіла потім можна визначити за флуоресценцією. До числа багатьох звичайно використовуваних флуоресцентно мічених сполук відносяться флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, фікоеритрин, пікоціанін, алофікоціанін, о-фтальальдегід і флуорескамін. Ге зо Антитіло також можна ефективно мітити, використовуючи метали, що випромінюють флуоресценцію, такі як Е або інші з ряду лантанідів. Зазначені метали можна приєднувати до антитіла, застосовуючи такі метал-хелатуючі с групи, як діетилентриамінпентаоцтова кислота (ЕТРА). ю

Антитіло також можна мітити зв'язуванням його з хемілюмінесцентною сполукою. Потім присутність міченого хемілюмінесцентною сполукою антитіла виявляють за люмінесценцією, яка виникає під час хімічної реакції. со

Прикладами особливо придатних хемілюмінесцентно мічених сполук є лумінол, ізолумінол, складний ї- ароматичний ефір акридинію, імідазол, сіль акридинію і складний ефір щавлевої кислоти.

Аналогічно, біолюмінесцентну сполуку можна застосовувати для мічення антитіла даного винаходу.

Біолюмінесценція є типом хемілюмінесценції, виявленої у біологічних системах, в яких каталітичний білок збільшує ефективність хемілюмінесцентної реакції. Присутність біолюмінесцентного білка виявляють, « визначаючи люмінесценцію. Важливою біолюмінесцентною сполукою для цілей мічення є люциферин, з с люцифераза та ехіорин.

Й Молекулу антитіла даного винаходу можна адаптувати для застосування в імунометричному аналізі, також и?» відомому як "двошаровий" або "сендвіч" аналіз. У типовому імунометричному аналізі, кількість немічених антитіл (або фрагментів антитіл) зв'язують з твердою основою або носієм, а кількість розчинних антитіл, зв'язаних з міткою, що виявляється, додають, щоб мати можливість виявити і/або кількісно визначити потрійний -І комплекс, утворений між твердофазовим антитілом, антигеном і міченим антитілом.

Типовий і переважний імунометричний аналіз включає в себе "прямий" аналіз, в якому антитіло, зв'язане з со твердою фазою, спочатку контактує із зразком, що тестується, щоб екстрагувати антиген із зразка за допомогою с утворення подвійного твердофазового комплексу антитіло-антиген. Після відповідного інкубаційного періоду, 5о тверду основу або носій промивають, щоб видалити залишок рідкого зразка, включаючи антиген, що не ю прореагував, якщо він взагалі є, а потім контактують з розчином, що містить невідому кількість мічених

Ф антитіл (які функціонують як "репортерна молекула"). Після другого періоду інкубації, під час якої мічене антитіло має можливість утворити комплекс з антигеном, зв'язаним з твердою основою або носієм Через немічене антитіло, тверду основу або носій промивають другий раз, щоб видалити мічені антитіла що не прореагували.

В іншому типі "сендвіч" аналізу, який також можна застосовувати з антигенами даного винаходу,

Ф) використовують так званий "одночасний" і "зворотний" аналіз. Одночасний аналіз включає одну стадію інкубації, ка при якій антитіло, зв'язане з твердою основою або носієм, і мічене антитіло одночасно додають до тестованого зразка. Після завершення інкубації, тверду основу або носій промивають, щоб видалити залишок рідкого зразка і бо не включені у комплекс мічені антитіла. Потім присутність мічених антитіл, асоційованих з твердою основою або носієм, фактично визначають за допомогою звичайного "прямого" седвіч-аналізу.

У "зворотному" аналізі, застосовують спочатку ступінчате додавання розчину міченого антитіла до рідкого зразка з подальшим додаванням неміченого антитіла, зв'язаного з твердою основою або носієм, після відповідного періоду інкубації. Після другого періоду інкубації, тверду фазу промивають загальноприйнятим 65 способом, щоб видалити з неї залишок тестованого зразка і розчину мічених антитіл, що не прореагували. Потім визначення мічених антитіл, асоційованих з твердою основою або носієм, проводять як в "одночасному" і

"прямому" аналізі.

Створення імуноаналізів, таких як КІА і ЕГІЗА, описане у багатьох статтях, керівництвах та інших публікаціях. Як посилання приведена (МУО 97/03998, стор. 48, рядок 4 до стор. 52, рядок 27). Імуноаналіз Винаходу може бути двох звичайних типів. По-перше, імуноаналіз, в якому використовують іммобілізовану каспазу або еквівалент пептиду, може бути застосований для кількісного визначення каспази-8. По-друге, для визначення кількості каспазних білків можна застосовувати імуноаналіз, в якому використовують іммобілізовані антитіла, направлені проти епітопу каспази.

Такий аналіз може бути використаний для діагностики, оскільки може бути необхідним оцінити рівень каспази /о0 та інших білків, залучених до апоптозних метаболічних шляхів, при цілому ряді порушень або синдромів, при яких є можливим залучення таких шляхів.

В одному аспекті, білок, що взаємодіє з про-каспазою-8, позначений Сагі, виділяють за допомогою антитіл відповідно до винаходу. Однак якщо бажано імунопреципітувати білки, зв'язані з іншою каспазою, застосовуючи описаний вище спосіб імунопреципітації, можна використовувати антитіло, специфічне до С-кінцевого домену

ИБ-1 іншої каспази, а не каспази-8.

Оскільки антитіла відповідно до винаходу здатні осаджувати про-каспазу-8 або каспазу-8, білки, що зв'язують каспазу, можуть співосаджуватися разом з активною каспазою або про-каспазою при спів-імунопреципітації.

Далі, винахід буде проілюстрований наступними прикладами, які не обмежують винахід.

Приклади

Приклад 1

Імунізація мишей для утворення моноклональних антитіл, специфічних до каспази-8

Після активації, каспазу-8 розщеплювали і збирали у дві субодиниці (ЗиБ-1 і 5ир-2).

Для утворення антитіл, специфічних до нових можливих епітопів, утворених після активації каспази-8, сч об синтетичні пептиди, одержані з С-кінця ЗибБ-1 і М-кінця ЗиБ-1 і Зир-2, використовували для імунізації мишей.

Наступні пептиди використовували для імунізації мишей для одержання моноклональних антитіл: і)

Пептид 179 - Пептид СОСОММОКОІРМЕТО (5ЕО ід:4), що відповідає С-кінцю великої субодиниці каспази-8 (5иБ-1), (епітоп, який відповідає залишкам Суз360-Азр374, Фіг.1), синтезували, очищали методом ВЕРХ з оберненою фазою і зв'язували з носієм КІ Н через його природний цистеїн, щоб експонувати пептид на поверхні Ге зо носія.

Пептид 182 - Пептид І 55РОТКМІРОЕАОС (5ЕО І0О:5), що відповідає М-кінцю малої субодиниці каспази-8 с (5,ир-2, залишки І уз385-СІу399), синтезували, очищали методом ВЕРХ з оберненою фазою і зв'язували з носієм ю

КІН через С, який не одержували з послідовності ЗИибБ-2.

Пептид 183 - Пептид 5ЕБОТ ОКММОМКОКРАС (5ЕБЕО 106), що відповідає М-кінцю 5ЗиИБ-1 (залишки со

Зег217-СІу234), синтезували, очищали методом ВЕРХ з оберненою фазою і зв'язували з носієм КІН через С, ї- який не походить з послідовності ЗИибБ-1.

Чотири імунізації та дві бустер-ін'єкції з однаковою кількістю антигену (пептид-КІН) вводили мишам наступним чином:

Для першої імунізації ЗХОмкг пептиду-КІ Н розчиняли у 5Омкл РВЗ і гомогенізували з 5Омкл повного ад'юванту «

Фрейнда і вводили у подушечку стопи кожної з п'яти самок мишей Ваїр/с у віці 7 тижнів. з с Для другої імунізації, яку проводили через два тижні після першої імунізації, мишам внутрішньом'язово робили бустер-ін'єкцію з такою ж кількістю пептиду в 5095 (об./об.) розчині неповного ад'юванту Фрейнда. ;» Для третьої імунізації, яку проводили через два тижні після другої імунізації, мишам внутрішньочеревинно вводили 50 мкг пептиду-КІ Н в 50 мкл РВ5.

Сироватки мишей, яким робили ін'єкції, тестували через 10 днів після другої і третьої імунізацій. -І Четверту імунізацію (виконували тільки для пептидів 182 і 183) проводили через місяць аналогічним чином, як третю імунізацію. со Через один місяць після четвертої імунізації (або третьої імунізації для мишей, стимульованих пептидом с 179) робили дві бустер-ін'єкції (таким же способом, як третю і четверту імунізацію) з дводенним інтервалом.

Через чотири дні селезінку і пахові лімфатичні вузли двох мишей, що виявляли найвищу специфічну ю імунореактивність, брали для з'єднання з клітинами мієломи (ЕзПпПаг 7, 1985).

Ф Приклад 2

Імунізація кроликів для утворення поліклональних антитіл, специфічних до каспази-8

Кроликів імунізували 179-КІ Н і 183-КІ Н для утворення специфічних поліклональних антитіл.

Першу імунізацію проводили з 100мкг пептиду-КІ Н, який розчиняли у 5Омкл РВЗ і гомогенізували з 5О0мкл повного ад'юванту Фрейнда і вводили підшкірно. Другу імунізацію проводили через два тижні з такою ж кількістю

Ф) пептиду-КІ Н і вводили внутрішньом'язово з неповним ад'ювантом Фрейнда. За описаними двома імунізаціями ка йшли дві бустер-ін'єкції такою ж кількістю пептиду-КІ Н, розчиненого у РВ25, і вводили підшкірно з двотижневим інтервалом. во Приклад З

Одержання гібридоми, селекція клонів, що продукують антитіла, і очищення антитіл з асцитних рідин

Процес злиття і відбір клітин гібридоми проводили відповідно до протоколу Езппаг 7, 1985. Коротко, проводили злиття суміші клітин селезінки та лімфатичних вузлів від 2 реактивних мишей 110х10 5 з 32х105 мієломних клітин варіанту мієломи МЗО/1 при короткочасній інкубації з РЕС. Спочатку РЕС повільно розбавляли 65 ОМЕМ, а потім повністю видаляли центрифугуванням. Клітини повторно суспендували у середовищі ОМЕМ-НАТ, розподіляли у 9б-ямкові планшети при концентрації приблизно 2,5х10 "7 клітин/ямку та інкубували у 896

СО, -термостаті при 372С. Середовище у всіх ямках з гібридомою замінювали на ОМЕМ, доповнене 1095 конячою сироваткою (Н5). Зразки супернатанту гібридомної культури через два тижні після злиття перевіряли відносно присутності специфічних Мар за допомогою ЕГІЗА (описано у прикладі 12, нижче). Клітини з ямок, в яких у

Культуральному супернатанті виявляли присутність специфічних антитіл, переносили у 24-ямкові планшети.

Позитивні клітини двічі субклонували; виявлено, що на описаній стадії всі субклони були позитивними. Клони вирощували у 24 ямках, а потім у 25 см 2-Т-колбах. Зростаючі культури контролювали відносно секреції специфічних Маб. Ампули з клітинами з позитивних культур заморожували і зберігали у рідкому азоті.

Приблизно з 700 клонів, підданих скринінгу на виявлення специфічних антитіл до пептиду 179, виявили 70 тільки один позитивний клон (Маб 179), з 700 клонів, підданих скринінгу на виявлення специфічних антитіл до пептиду 182, виявили тільки 1 позитивний клон (Мар 182) із 1100 клонів, підданих скринінгу на виявлення специфічних антитіл до пептиду 183, виявили тільки 2 позитивних клони (Маре 183.1 і 183.2). Позитивні клони субклонували при обмежувальному розведенні у 9б-ямкових планшетах. Супернатанти від зростаючих клонів декілька разів тестували на специфічні антитіла за допомогою ЕЇ ІЗА (описано у прикладі 12).

Позитивні гібридомні клони вирощували у тканинних культуральних колбах у ОМЕМ, що містить 1595 конячу сироватку, а ампули з матеріалом від частини культур заморожували. Паралельно, клітини різних гібридомних клонів вводили кожній з 2-4 мишей, щоб одержати асцитні рідини. Антитіла очищали з асцитної рідини методом афінної хроматографії, використовуючи гранули афігелю (афігель 15 Віогад), зшиті з В5А (Ріегсе Саї 77116), зв'язані з синтетичним пептидом, що використовується для імунізації мишей (пептиди 179, 182 або 183).

Для очищення антитіл, асцити, осаджені 5095 сульфатом амонію, діалізували проти РВЗ протягом 16 годин при 02С. Після діалізу, аліквоти інкубували з 1 мл гранул афігель-ВВА-пептид протягом 16 годин при 0 2С і заздалегідь інкубовані гранули використовували для упаковки колонки їмл. Спочатку колонку промивали 1Омл

РВ5, за яким йшло промивання 10мММ Трисом, рН 7,5, що містить 1 М Масі, і промивання РВ5. Антитіла елюювали з колонки розчином, що містить 100 мМ гліцин-НСЇІ, рН 2,7, і 0,5 М Масі. Фракції по їЇ мл збиралилу «СМ пробірки, що містять 40мкл основи Трису, для нейтралізації елюату. З 25мл асциту одержували приблизно о 5-13,б6мг очищених антитіл.

Приклад 4

Ізотип моноклональних антитіл

Ізотип моноклональних антитіл визначали, використовуючи комерційний набір для ізотипування (ЗоціНегп (Се) Віоїесппоіоду Авззосіаїез, ІМС саї 5300-05), відповідно до процедури аналізу виробника. Марз 183 і 179 сч ідентифікували як Ідсі, в той час як встановили, що Маб 182 належить до класу ІЗМ.

Приклад 5 Іо)

Імунопреципітація каспази-8 з Маб 179. 182 і 183 со

Різні моноклональні анти-каспаза-8 антитіла, описані вище у прикладі З, тестували щодо їх здатності імунопреципітувати каспазу-8 (дивись приклад 12, нижче) з лізатів активованих і таких, що знаходяться у стані - спокою, клітин ВОАВ. Лінія ВАВ являє собою стабільну лінію клітин лімфоми, що походить від африканського різновиду лімфоми Беркіта |(Сіетепів 0.В. еї а!., 1975).

Клітини ВАВ стимулювали Равз-лігандом протягом однієї години. Лізати клітин одержували з клітин ВАВ до і « після стимуляції. Після імунопреципітації з Мар 179, 182 і 183 (як описано у прикладі 12) "виснажений лізат" | каспазу-8, елюйовані відповідними пептидами, аналізували за допомогою 505-РАСЕ і забарвлювання сріблом - с або за допомогою вестерн-блотинг-аналізу, використовуючи анти-ЗИир-1 антитіло як перше антитіло (СеїЇ ч зЗідпаїйпоуд Тесппоіоду Сазразе-8 ІСІ2 Саї 9746). -» На Фіг.2 показаний вестерн-блотинг-аналіз (проведений, як описано у прикладі 10, нижче) цілих клітинних екстрактів і "виснажених лізатів", одержаних після імунопреципітаціїз Маб 179, 183.1 і 183.2 і 182.

У нестимульованих клітинах (доріжки 2, 4, 6, 8 і 10), подвоєння смуг, що відповідають ізоформам аї їі а? -і про-каспази-8 (про-каспаза-8 53/55кДа), спостерігали у цілих клітинних екстрактах (доріжка 2) та у виснажених со лізатах, одержаних з анти-183 і анти-182 антитілами (доріжки 6, 8 і 10), на противагу цьому про-каспази-8 не виявляли у виснажених лізатах, одержаних з Маб 179 (доріжка 4). 1 У стимульованих клітинах рівні про-каспази-8 в цілому клітинному екстракті були нижчі (доріжка 1). 7 50 Додаткові дрібніші смуги, що відповідають фрагментам активованої каспази-8, з'являлися після активації, тобто подвоєння частково процесованої каспази-8, що відповідає ізоформам аї і а2 (частково процесована каспаза-8 р 42) 41/43, відсутність Зир-2), і невелика смуга, що відповідає Зир-1 (р 20). Виснаження невеликих кількостей про-каспази-8 і фрагментів активованої каспази-34 за допомогою Мар досліджували на лізатах клітин, стимульованих ГРавз-лігандом (Фіг.2, доріжки 3, 5, 7, 9 і 11).

Потрібно зазначити, що також досліджували виснаження 5Зир-1 за допомогою Мар 182, специфічного до о ЗиИр-2, оскільки активована каспаза-8 містить 5иБ-1, зв'язаний з ЗибБ-2, і, тому, видалення 5ир-2 в результаті імунопреципітації з Мав 182 повинно, отже, приводити до виснаження ЗибБ-1. ко Імунопреципітація каспази-8 зі стимульованих клітинних лізатів показала що Мар 182, 183.1 і 183.2 подібно до контролю нормальної мишачої сироватки (Фіг.2, доріжка 11), не видаляли невеликі кількості 60 про-каспази-8, що залишилася, або активних фрагментів каспази-8 (доріжки 9, 7, 5 і 11, відповідно). На противагу цим результатам, обробка клітинних лізатів Маб 179 (доріжка 3) ефективно приводила до видалення всієї про-каспази-8, а також активних фрагментів каспази-8.

На Фіг.За (вестерн-блотинг-аналіз) і ЗБ (визначення білка забарвлюванням сріблом) показано, що про-каспаза-8 і активні фрагменти каспази-8, імунопреципітовані Маб 179, 182 і 183.1 і антитілами 183.2, 65 можуть ефективно відновлюватися у супернатанті внаслідок конкуренції з відповідними пептидами, проти яких були одержані різні антитіла (приклад 12).

У о нестимульованих клітинах (Фіг.За, доріжки 2,4, 6, 8 і 10 і Фіг.З3р, доріжки 2, 3,6, 8 і 10) про-каспазу-8 ефективно відновлювали імунопреципітацією з Ма 179 і конкуренцією з пептидом 179 (Фіг.За і ЗБ, доріжка 8). У стимульованих клітинах, незважаючи на невелику кількість про-каспази-8, що залишилася після активації, імунопреципітація з Мар 179 приводила до ефективного відновлення білка (Фіг.За і ЗБ, доріжка 9).

Деяке відновлення про-каспази-8 за допомогою Мар 183.2 можна було спостерігати у неактивованих клітинах (Фіг.За, доріжка 6) і активованих клітинах за допомогою Мар 183.1 (Фіг.За, доріжка 5), де активні фрагменти каспази-8 можна було відновлювати у лізатах активованих клітин за допомогою Маб 182 (Фіг.За, доріжка 3), 183.1 (Фіг.За, доріжка 5) і 183.2 (Фіг.За, доріжка 7, тільки р20). 70 Одержані результати показали, що Мар 179, одержане проти пептиду, що відповідає С-кінцю 5ибБ-1 (епітоп 179), є дуже ефективним для імунопреципітації та очищення про-каспази-8, присутньої навіть у слідових кількостях, а також активованої каспази-8.

Поліклональне антитіло, специфічне до того ж епітопу 179 (одержаний, як описано у прикладі 1, вище), одержували, щоб дослідити, чи володіє епітоп 179 унікальною здатністю індукувати вироблення антитіл, які звичайно можна використовувати для ефективної імунопреципітації і очищення про-каспази-8 і активної каспази-8. Порівнювали "виснажені лізати7, одержані імунопреципітацією з поліклональними антитілами, специфічними до епітопу 179 (доріжки 5 і б для активованих і неактивованих клітин, відповідно), або моноклональними антитілами, специфічними до епітопу 182 (доріжки 7 і 8 для активованих і неактивованих клітин, відповідно). Результати на Фіг.4 чітко показали, що про-каспаза-8З і фрагменти каспази-8 з лізатів стимульованих клітин дійсно більш ефективно видаляли з клітинних лізатів поліклональними анти-179 антитілами, ніж моноклональними анти-182 антитілами.

Імунопреципітацію і відновлення про-каспази-8 з лізатів клітин, що знаходяться у стані спокою, проведені з Мар 183 і поліклональним антитілом, специфічним до епітопу 183 (описано у прикладі 1), порівнювали з імунопреципітацією і відновленням, проведеними з Мар 179. На Фіг.5 показано, що імунопреципітація сч соб про-каспази-8 за допомогою Мар 183 і полі-143 виявилася неефективною, тоді як імунопреципітація про-каспази-8 за допомогою 179 була просто чудовою. і)

Додатковий фрагмент з каспази-8 близько 5,бкДа спостерігали тільки в імунопреципітатах, одержаних з Мар 179 (доріжка 3). Антитіла, одержані проти ділянки каспази-8, яка відповідає С-кінцю великої 5Ир-1 каспази, володіють унікальною здатністю піддавати каспазу новому режиму процесингу. «о зо Описані вище результати, вказують, що епітоп 179 каспази-8 на відміну від інших епітопів, характеризується особливою здатністю розпізнавати специфічні антитіла, які дуже ефективні для с імунопреципітації про-каспази-8 і активованої каспази-8, та здатні індукувати аутопроцесинг каспази-8. ю

Приклад 6:

Виділення та ідентифікація білка, що зв'язує каспазу-8, (р7/2) Використовували Маб 179 внаслідок його со здатності ефективно імунопреципітувати каспазу-8, щоб імунопреципітувати каспазу-8 і білки, асоційовані з ї- каспазою-8.

Клітини ВУАВ |З(еіпі2 М, КіІеіп б. 1975| стимулювали ГРаз-лігандом протягом однієї години, а клітинні лізати одержували з клітин до і після стимуляції. Після імунопреципітації та елюції, які описані у прикладі 12, білки, що дістали, розділяли за допомогою ЗОБЗ-РАСЕ і визначали забарвлюванням сріблом. « Імунопреципітація з мишачим Ідсі служила як негативний контроль. Результати, представлені на Фіг.б, показали, пт) с що білок з припустимою молекулярною масою близько 72,5 кДа (який називається в описі р72) сшв-преципітували з про-каспазою-8 (р53/55) у лізатах клітин, що знаходяться у стані спокою, (доріжка 3), а ;» не з активною каспазою-8 у лізатах стимульованих клітин (доріжка 4).

Крім того, виявлено, що білок р/2 також спів-імунопреципітував з про-каспазою-8 у лізатах, одержаних з Нестимульованих клітин Нега, Каїї, НО, К562, НІ-60, СЕМ і Наш8 (АТСО). -І Приведені результати дозволяють припустити, що звичайно білок р72 зв'язаний з про-каспазою-8, а не з активною каспазою-8. со Смугу в 5ЗО5-РАСЕ, яка відповідає р72, вирізали, розщеплювали трипсином і піддавали обмеженому с секвенуванню і мас-спектроскопічному аналізу. 7 пептидів, одержаних при трипсиновому розщепленні,

Використовували, щоб дослідити базу даних за структурою білків, виведених з нуклеотидних послідовностей де (або ЕТ). Білкова послідовність, що відповідає частині передбаченої послідовності білка клону ЕЗТ людини

Ф (ЗЕО 101), виявлена у банку генів (номер доступу ді/2988397/48БААСО8052.1ЛАСО04475), функція якого невідома.

Приклад 8

Одержання повнорозмірної кКДНК, шо кодує р/2 Повнорозмірну кКДНК, що кодує р72, одержували наступним чином: ЕЗТ з (прикладу 7) використовували, щоб скринувати генний показник ТІК людини і дані ТНС

Ф) (ТНОС510568 5ЕО ІЮО МО:1), що містять консенсусні послідовності всіх ЕЗТ, щоб встановити відповідність цих ка послідовностей.

Клон ДНК, що кодує частину передбаченого білка, придбавали у фірми Іпсуїе Сепотісв ((МАСЕ й 2964545). бо Клон не містив нуклеотидних послідовностей, що кодують перший метіонін і 6 наступних амінокислот (тобто 21 нуклеотид). Встановлено, що послідовності миші і людини згаданих білків характеризуються високою подібністю (близько 9095 ідентичності), таким чином, нуклеотид ні послідовності, що кодують перший метіонін і 6 наступних амінокислот мишачого білка, які були відсутні в Е5БТ миші, порівнювали з робочою передбачуваною послідовністю геному людини для того, щоб заповнити відсутню послідовність людини. Одержали попадання, що 65 відповідає послідовності хромосоми 19 Ното заріепз, клон ГІЇ МІ К-232Е12. Зазначений клон підтвердив нуклеотидну послідовність, яка кодує відсутні 7 амінокислот р72. Повнорозмірну кКДНК р72 одержували внаслідок двох циклів ПЛР (використовували ТаКкага ЕхТад, ТаКага, са! 5 КОО1А), які схематично представлені на Фіг.8.

У першій ПЛР, клон, одержаний від фірми Іпсуїе Сепотісв, використовували як матрицю з прямим праймером: синтезований СТСААСАТОСАСААС СОСОСАТОТТОСАСОСАДАСО, який містить 15 (підкреслені) з 21 відсутнього нуклеотиду разом з існуючою послідовністю р72 (Фіг.8, праймер 2), і зворотним праймером:

ССАСТООАСТСАСТАСТААООССОТСТООСАТТ, що містить У ділянку, яка кодує зі стоп кодоном (Фіг.8, праймер

З).

У другій ПЛР як матрицю використовували продукт ПЛР з першого циклу ПЛР і прямий праймер:

ААТОСАТССАТОАСТСТСААСАТОСАСАдДС СОССА, що містить всі 21 відсутніх нуклеотиди і 5 існуючих 7/0 нуклеотидів (Фіг.7, праймер 1) і той же зворотний праймер (Фіг.7, праймер З). Цілу кКДНК, що кодує р72г, виділяли і секвенували (ЗЕО ІО МО:2), а амінокислотну послідовність передбачали з нуклеотидної послідовності (ЗЕО ІО МО:3).

Встановлено, що білок р72 містить три консервативних мотиви (Фіг.7): мотив С, спірально згорнутий мотив, два розташованих один за одним "ЗИКР" (так звані мотиви "ЗМУАР", позначені як 5 на Фіг.7) (Оепнег Е апа /5 І аїуаїїв К, 1994) близько до М-кінця білка, і одну О-ділянку, локалізовану на С-кінці (Фіг.8, позначена як б) (Агаміпа І. апа Коопіп Е.М., 1999). Вважається, що мотиви як ЗОКР, так і С-ділянки беруть участь у зв'язуванні

РНК, дозволяючи припустити, що мішенню р72 може бути молекула РНК.

Приклад 9

Розщеплення р72 каспазою-8

Як показано у прикладі 8, після однієї години стимуляції р/72 зв'язаний тільки з про-каспазою-8, а не з активною каспазою-8. Деяку кількість про-каспази-8 ще можна було виявляти після 20 хвилин стимуляції. Щоб визначити, чи може р72 спів-преципітувати з каспазою-8 при більш коротких періодах стимуляції, клітини ВАВ, активовані тільки протягом 20 хвилин, лізували та імунопреципітували з Ма 179. Після імунопреципітації та елюції, каспазу-8 і зв'язані білки розділяли за допомогою 505-РАСЕ, а білки визначали забарвлюванням сч сріблом. Одна смуга 72,5 кДа (Фіг.9, доріжка 3), що відповідає р72, імунопреципітувала у лізатах клітин до стимуляції, тоді як після 20 хвилинної стимуляції визначали білок з більш низькою припустимою молекулярною і) масою близько 68 кДа (Фіг.9, доріжка 4). Обидва білки, 72,5 і 68 кДа, імунопреципітовані з клітин ВОАВ, піддавали мас-спектроскопічному аналізу. Після трипсинізації, обидва білки виявляли однаковий пептидний профіль за винятком однієї чіткої відмінності: додатковий пептид з послідовністю ЕКРМРІММРК (залишки Ге зо 532-641) був присутнім у білці 72,5 кДа на С-кінці, але був відсутнім у білці 68 кДа.

Результати дозволяють припустити, що при стимуляції клітини, фрагмент, близько 4,5 кДа, видалявся з с

С-кінця р72, можливо при активації каспази-8, приводячи в результаті до утворення білка меншого розміру з ю припустимою молекулярною масою 68 кДа, який ще зв'язаний з про-каспазою-8, що залишилася.

Зрозуміло, що залишок 0600, локалізований на С-кінці р72 (Фіг.8), може бути кандидатом на залишок для со з5 розщеплення, оскільки передбачувані фрагменти, одержані після такого розщеплення, мають таку ж ча молекулярну масу, що і фрагменти р72, виявлені іп мімо після 20 хвилин стимуляції.

Щоб з'ясувати, чи є, як припускали, р/2 субстратом каспази-8 і чи є 0600 залишком-мішенню для розщеплення, транскрибований-трансльований і мічений радіоактивним ізотопом (5 ЗУЗр72 (ТпТ-система) « піддавали іп міїго дії рекомбінантної активної каспази-8. Білок, що кодується кКДНК р72, експресували іп мйго у ретикулоцитних лізатах у присутності З58-метіоніну, використовуючи зв'язану систему ретикулоцитних лізатів - с Тит 17, і піддавали розщепленню рекомбінантною активною каспазою-8 (кожну субодиницю І! і 2 одержували ч окремо в Е.соїї, змішували і повторно складали разом іп міго). Коротко, р72, іп міго синтезовані З55-мічені » білки, інкубували протягом 30 хвилин у протеазному буфері (25мМ Нерез, рН 7,5, 0,196 СНАР5, 5ММ ЕОТА і 2 мМ

ОТТ) при 372С у присутності продукованої бактеріями каспази-8. Білки та їх фрагменти розділяли при 505-РАСЕ, а результати оцінювали фосфовізуалізацією. Результати (Фіг. 10) показали, що за відсутності - каспази-8 визначали тільки зону 72,5, що відповідає р72 (доріжка 1). Зазначена зона зникала після додавання со активованої каспази-8 протягом 1 години і з'являвся новий менший за розміром фрагмент, що відповідає 68 кДа (доріжка 4). Одержані результати показали, що білок, який кодується кКДНК р72, використаний як субстрат, 1 ефективно розщеплювався каспазою-8. Крім того, також використовували систему транскрипції-трансляції ТпТ, г 20 щоб продукувати іп мйго 2 різних мутанти р72: р72, в якому залишок ЮОбОО, як припускали за даними експериментів іп мімо, є залишком-мішенню каспази-8, мутували в Е (Об6ООЕ), і р/2 з делецією, відсутність 0 залишків нижче Об6О0 (тобто експресований білок буде мати залишки 1-600).

Досліджували розщеплення описаних вище двох мутантів р/2 у присутності (Фіг.10, доріжки 5 і 6, відповідно) або за відсутності (доріжки 2 і 3, відповідно) активованої рекомбінантної каспази-8. Як показано го на Фіг.10 (доріжки З і б, відповідно), однаковий білковий профіль мутанта ОбООЕ р72 спостерігали у

ГФ! присутності або за відсутності каспази-8, що свідчить про те, що каспаза-8 не розщеплює мутант ЮбООЕ р72.

Мутант 1-600 р72 мігрував разом з фрагментом 68 кДа, утвореним після розщеплення дикого типу р72, і далі не о розщеплювався при додаванні каспази-8 (доріжки 2 і 5). Одержані результати показали, що, після активації, каспаза-8 розщеплювала р72 по залишку ЮбОО0. бо Проведені іп мімо дослідження дозволили припустити, що розщеплення р72 відбувається у клітинах швидко протягом 5-20 хвилин після обробки Раз-лігандом (Фіг.11) і що розщеплений білок (або швидше - його більш великий фрагмент) може залишатися асоційованим з про-каспазою-8.

Приклад 10

Вестерн-блотинг-аналіз для визначення імунореактивної сироватки каспази-8 бо Суміш рекомбінантних очищених ЗиИир-1 і Зир-2 використовували для вестерн-блотинг-аналізу антитіл, одержаних до синтетичних пептидів. Коротко, на 1295 ЗЮО5-поліакриламідний гель наносили 100 нг/доріжку суміші Зир-1 і 5ир-2 при відновлювальних умовах (40мМ ОТ). На одну доріжку наносили низькомолекулярні стандарти (ІММУ). Розділені на гелях білки переносили за допомогою електроелюції на РМОБ-мембрани з високим вмістом Р (Атегзпат). Мембрани інкубували у РВ5, що містить 5956 молоко з низьким вмістом жиру, 0,0595 Твін 20, протягом 16 годин. Мембрани розрізали на смужки і кожну смужку інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з мишачою антисироваткою (розведеною 1/2000). Смужки мембрани промивали РВ5, що містить 0,0595 Твін 20 (З х 15 хвилин) та інкубували протягом однієї години з другим антитілом - козячим антимишачим антитілом, кон'югованим з пероксидазою хрону (розведені 1:10000, даквоп) протягом 1 години при кімнатній температурі. 76 Смужки промивали РВ5, що містить 0,190 Твін 20 (З х 15 хвилин). Позитивні смуги визначали за підвищенням хемілюмінесценції (ЕСІ, Атегепат).

Для вестерн-блотингів, проведених у прикладі 5 5 використовували антитіла, специфічні до Зир-1 (Сеї зЗідпаїйпод Тесппоїоду Сазразе-8 ІС12 9746).

Приклад 11

ЕПЗА для скринінгу гібридомних клонів

Прямий ЕГІЗА для скринінгу гібридоми, що продукує специфічні антитіла, проводили наступним чином: 9б-ямкові планшети покривали 5Омкл/'ямку ВЗА-пептидом (або тільки ВЗА для контрольних планшетів) у концентрації 2,5 мкг/мл у зв'язувальному розчині (0,1 М Ма»оНРО,, рН 9) протягом 1 години при 372С або 16 годин при 42. Згодом планшети промивали З рази РВЗ-Т (РВ5 з 0,0595 Твіном-20) і вносили по 200 мкл/ямку блокувального розчину (196 гемоглобін у РВ5) протягом 1 години при 372 і промивали З рази РВ5. 5Омкл супернатанту гібридомних культур або розбавлених стандартів (з РВ5-Т) вносили на ямку та інкубували протягом 1 години при 372С або 4 годин при 222С. Після вказаного періоду інкубації ямки промивали 6 разів

РВ5-Т. Друге антитіло, анти-мишаче антитіло, кон'юговане з НКР (дасквоп 115-025-100), розбавляли 1:5000 у

РВ5З-Т, інкубували протягом 1 години при 372С і вимивали шляхом шестиразового промивання РВ5О-Т. Субстрат СІ для НКР готували свіжий (2,2мл 0,2М МаоНРО,, рН 9,2, 1,4мл 0,2М лимонної кислоти, рН 4,35, б4мл НО, 10 мг о

АВТЗ і їмкл Н2О»5) і Хомкл/ямку вносили та інкубували при 222С доти, доки не з'являлося забарвлення (близько 5-80 хвилин). Кольорову реакцію зупиняли додаванням 5Омкл/ямку 0,2М лимонної кислоти. Планшети зчитували при 405нм.

Як позитивні контрольні антитіла використовували позитивні мишачі антисироватки, розведені 1:1000, а ре) також як негативні контрольні середовища. сч

Приклад 12

Імунопреципіташя каспази-8 Щео,

Для кожної імунопреципітації використовували 109 клітин. Клітини збирали і лізували інкубацією в 1965 с лізуючому буфері МР-40 і з повним протеазним інгібітором (таблетки повного протеазного інгібіторного коктейлю від фірми Коспе Моіесшіаг Віоспетісаів) при 09С протягом 40 хвилин. Клітинні лізати переносили у вигляді - аліквот у пробірки Епендорфа, центрифугували при 14000 обертів за хвилину протягом 10 хвилин при 49С і відбирали супернатант у нові пробірки. Клітинні лізати піддавали стадії попереднього освітлення, призначеній для видалення білків, які неспецифічно зв'язуються з протеїн-С-сефарозою. Для попереднього освітлення, « клітинний лізат пре-інкубували із заздалегідь промитою РВ5 протеїн-С-сефарозою (РНаптасіа) і мишачим до -о 70 протягом 2-3 годин при 42С. Після описаної інкубації лізати центрифугували у пробірках Епендорфа при 14000 с обертів за хвилину протягом 30 секунд, протеїн-С-сефарозу відкидали, а перед-освітлений супернатант збирали. :з» Очищені моноклональні антитіла (або мишачий ІдС, 1 кап для негативних контролів) і протеїн-С-сефарозу, заздалегідь промиту РВ5, змішували та інкубували з перед-освітленим супернатантом протягом 4-16 годин 15 при 42С. Після вказаного періоду інкубації незв'язаний матеріал, позначений "виснажений лізат", збирали - центрифугуванням (30 секунд при 14000 обертів за хвилину), зв'язаний матеріал елюювали промиванням гранул сефарози 6 разів лізуючим буфером та інкубацією з "розчином, що елюює", який містить 0,295 лізуючого буфера (ее) МР-40, протеазні інгібітори і 40Омкг/мл пептиду, що використовується для імунізації, (300 мкл буфера, що с елюює/10О0мкл сефарози) протягом 2 годин при 222. Пробірки центрифугували протягом 5 хвилин при 5000 обертів за хвилину, а супернатант, позначений "елюат каспази-8" переносили у нові пробірки. ко Посилання

Ф Аде!тап Ор еї аіІ. 1983 ОМА 2:183.

Аптаад Мегва|.Сапсег Кез 1997; 57(4):615-9.

Акаді УеїаіІ.1997 Кіапеу Іпі. 51, р. 1265-9.

Агаміпа І апа Коопіп ЕМ 1999 ТІВЗ 24: 342-344.

Агеї! Ре! аі!. 1988 Сепе 68, 213-9, (Ф. ВатікКоІ-УМагапабе 5 еї а). Віої Спот Норре Зеуїег 1994; 375(8):497-512. ко ВеїдіегОгега!. 1995. У) Віої Спет 1995 ці 14; 279(28):16526-8.

Вешег апа Сегаті 1987 М Епаї У Меа 1987 Реб 12; 316(7):379-85. во Відада . еї а). 1994 ) Ехр Мей Аца 1; 180(2):445-60.

Воїдіп МР еї аї. 1995 .) Віої Спет Арг 7; 270(14):7795-8.

Воїдіп МР еї а. 1995а Віої Спет 1995 дап 6; 270(1):387-91.

Воїдіп МР егїаї. 19956 РЕВЗ І ей 1995 дип 19; 367(І):39-44.

Воїдіп МР егї аї. 1996 СеїЇ 1996 дип 14; 85(6):803-15. 65 Воопе, Е еї а. .). Віо! Спет. 275,37596-603,

Вошіаппе С еї аї. 1984 Майшге 1984 ес 13-19; 312(5995):643-6.

ВгаКеризсі С еї а. 1992. ЕМВО у 1992 Маг; 11(3):943-50.

ВгосКпацз М еї аї. 1990 Ргос Майї! Асад Зсі ОБА 1990 Арг; 87(8):3127-31.

Сабрійу З еї а. 1984 РМАЗ 81, 3273.

Сапіог ейаІ. 1993 РМАЗ 90 109-32.

Сао Х еї аї. 1998 3) Іттипої! 161,6238-44,

Спеп С) еї а). 1992 Апп. МУ Асад. зЗсі. 660, 271-3.

Спіппаїуап АМ еї аї. 1995 Сеї| Мау 19; 81(4):505-12.

Спіппаїуап АМ еї аї. 1996 у Віої Спет Маг 1; 271(9):4961-5. 70 СІіетепів ОВ еї аї. 1975 Іпг у) Сапсег 16:125-33.

Сопеп ОМ 1997 Віоспет .; 326 (РІ 1). 1-16.

Оапіеєї К еї аї. 1998 )) Віотеа 5сі. 5, 383-94.

Оеппез ГРапа І агуайів К 1994 У Віої Спет 269:16170-16179.

Оігкв, УМіпА апа Найзег 1983 Сепе 128, 247-249.

Омап Н апа біхії УМ. Майшиге 1997; 385(6611):86-9.

Бипее Т еї а. Сепез ЮОем 1993; 7(4).555-69.

Едатаїви Н, Ка?іго У, Мой Н. 1997, Сепе 187,289-94,

Едіпдег АГ. еї аї. 1998 Мігоіоду. 249, р.367-78.

Епагі М еї а). 1995. Майте Мау 4; 375(6526):78-81.

Епагі М еї аї. 1998 Майтге (І опдоп) 391,43-50.

ЕпдеїІтапп Н еї аї. 1990. 9. Віої Спет дап 25; 265(3):1531-6.

Епдеїтапп Н еї аї. 1990 у). Вісі. Спет. 265, р.14497-504.

Езппаг 727, 1985 іп "Нургідота (есппоіоду іп (Ше Біозсіепсе апа теаісіпе", Едіей Бу Тітоїйу А. Зргіпдег (Ріепит Рибіївпіпуд Согрогаййоп, 1985; Спаріег 1). сч

Емегек КО еї аї. 1983 Мисіеїс Асідз Кезв. 11 2447-64.

ЕРегпапдез-АІпетті Т еї аі. 1996 Ргос Маї! Асад сі ОБА; 93(15):7464-9. і)

Ріеїдз 5 еї а). 1989; Машге 340(6230):245-6.

Ніападап, 1998 Сапсег Меїйавіазіз Кем 17, 1699-76.

Еипй РА еї аї. 1994 Ргос Май! Асад Зсі ОА 91, 9302-6. «о зо Сегеїег М еї а. 1998 Апаї! Віоспет. 262,177-84.

Сгапат А еї аї. 1991, Віоспет Віорпуз Кез Соттип 177, 8-16. с

СтайсЕ 1989 Зспмеі2 Мед УУоспепзснпг Оес 9; 119(49):1756-61. ю

Сгізсеїї Е єї аІ. 1998, Нит Сепе ТНег. 9, 1919-28.

Сцапо-Г іп М еї аї. 1998 Тгаперіапі Ргос 30, 2923-4. со

Сціпої апа Тетзатапі, 1998 Раїйої Віої (Рагів) 46, р.347-54. ї-

Наепадіег В еї а. Е. ЕМВО у 1987; 6(4):947-50.

Нетпті 5 еї а). 1998 Нит Сепе Тег 9, р.2363-73.

Непкагі, РА 1996. |Іттипйну Маг; 4(3):195-201.

Ноптапнп НР еї аї. 1989. У Віої Спет Зер 5; 264(25): 14927-34. «

Наи Н егаї. 1996. СеїЇ дап 26; 84(2):299-308. в с Нтіпо МТ апа Согтап СМ. 1990 Мисіевїс Асіаз Кез. 18, 937-47.

Й Іне УМСеїї 1996; 84(3). 331-4. Поп М еї а. 1991. а СеїІ ди! 26; 66(2):233-43. Цой апамадайа 1993

У. Віої Спет Мау 25; 268(15):10932-7.

Уаптеу, Р.А., апа 5юззеї, Т.Р. 1987 Майге (І опдоп) 352, 362-364. -І Чозерії апа Вигке, 1993 .). Віої. Спет. 268, 24515.

Катіпе ./ еї а). Рер 15; 216(2):357-66. со Кіпд Р апа Соодрошгп 5. У Віої Спет 1998; 273(15) 8699-7004. с Кізепкеї! ЕС егаІ. ЕМВО 1995; 1 4(22); 5579-88.

Копіег апа Міївіеіп, 1975 Майшге 256, 495-497. де Копао 5 еї а). 1998 Опсодепе 17, 2585-91.

Ф Коїпакоїга, 5 еї аї. 1997 Зсіепсе 278, 294-298.

Когак, М, 1984 Мисівїс Асідз Кезв. 12 р. 857-72.

Киптаг, 1995 Тгепаз Віоспет сі Мау; 20(5): 198-202.

Китаг, 1997 Зсіепсе 278(5343):1630-2.

Кипзейе, о еї а). 1997 |Іттипої! Гей. 55, 5-10, (Ф, Кит, М., апа Вгуап, 9). 1984 у). Віої. Спет. 259, 10895-10903. ка Ї оеізспегНега!. 1990 У Віої Спет 1990Мом25; 265(33):20131-8.

Масгагіапе М еї а). . Віо! Снет 1997; 272(41):25417-20. 60 МеїіпкКоїПега!.(1984).

Меїгі М еї а). 1998 Ргос Май! Асад 5сі ОБА 95 15037-15042.

МІК РЕ еїаї у Віої Спет 1997; 272(10):6539-47.

Місга К еї а. Віоспет ВіІорпуз Кез Соттип 1992; 1 87(1), З 75 -80.

Могтізоп еї аї., 1984 РМА5З 81, 6851. 65 Мигапівпі еї аї., 1991 Рпагт. Кезеагсй 8, 649.

Ми?іо еї а. 1996. СеїЇ дип 14; 85(6):817-27.

Мигіо М егаї .) Віої Спет 1998. 273(5):2926-30.

Мадаїа апа Соїавзівїп 1995.

Мадаїа З еї а). СеїІ 1997; 88(3):355-65.

МакКазпіта А еї а). Віо! Спет 1997; 272(14):9567-72.

Магиті еї аі!., 1995 Ат / Кегзріг СеїЇ Мої Віо! 19, 936-941.

Міспоїзоп ОЛМУ. апа Тпогпрегту, М.А. 1997 Тгепаз Віоспет. Зсі. 22, 299-306.

Мівпіда еї аї., 1998 Зріпе 23,2437-42.

Морпагегйа!. 1990. 70 Опівзи, М еї а, 1997 ЕМВО .). 16, 4650-4656.

Редегзоп еї аї, 1998 у Савігоїпіеві Зига 2, 283-91.

Опеїе ЕМУ еї а. У Віої Снет 1995; 270(35):20775-80.

Коюпава . ег а! Маї Бігисі Біо! 1996; 3(7):619-25.

Ки?іскКа еї аї. 1993 5сіепсе 260:487. закапіга, Н., еї аі. (1998) Майге (І опдоп) 391, 96-99.

Заїмезеп, 5.5., апа ріхії, М.М. (1997) Сеї| 91, 443-446.

Затьгоок еї аї., 1989. запо еї аї., (1991) Віосїесппіднез 9:1378. запо еї аї., (1992) Зсіепсе 258:120. зспаїена!|.1990. зЗепек еї а!., Мої Сеї! Віої., р. 5386-93,1992.

Зспулаггепрегодег еї а!., 1998 3 Іттипої 161, 6383-9.

Зпеуснпепко А, еї а). 1997 Карійа Соттип Мавзз Зресігот. 11, р.1015-24.

Зпітауата еї а!., 1993 Мисіевїс Асідз Зутр Зег 29,177. сч зЗпоїї еї аї., 1998 У Огид Тагдеї 5 261-73.

Зпоге еї аіІ., 1993 Опсодепе 8, 3183. (8) тій еї аї. 1990 У Іпгесі Оіз Оес; 162(6):1349-53. зЗошикспагецп еї а!., 1998 Віосопіцд Спет 9 466-75.

Згіпімазціа ЗМ еї а. 1996 Ргос Маї! Асад 5сі ОБА; 93(25):14486-91. Ге зо Згіпімазціа ЗМ еї а. 9 Віої Спет 1998; 273(17) 10107-11.

Зіапдегега!. 1995 СеїЇ Мау 19; 81(4):513-23. с

Зіеїпії2 М апа Ківїп Об.Ргос Май! Асай 5сі ОБА 1975 Бер; 72(9):3518-20. ю

БІіїх 1998 сі Ат. 279 46-50. зЗигіпуа еї а.) ВіоЇ Спет. 273, р. 16798-809, 1998. со

Тападіїа еї а. 1993 СеїЇ Зер 10; 74(5):845-53. ї-

Теоп егаї, 1998 Віоса 92,4591-4601.

Теухагі еї а). 1995 СеїЇ дип 2; 81(5):801-9.,

Тпотвзгеп, еї а). 1984 РМАБ 81 6599-63.

Трогпрегту МА еї а). Віо! Спет 1997; 272(29): 17907-11. «

Тігоде Е еї а. У Віої Спнет 1997; 272(37):22995-9. в с ТокКизпіде, еї а!., 1997 У МігоЇ Меїйпоавз. 64 р. 73-80.

Тгасеу еї аіІ. 1986 Аппи Кем Меа 45:491-503. ;» Мападепабееїйе еї а. 1995 |Іттипої! Маг 15; 154(6):2904-13.

Мегсаттеп, О., еї аіІ. 1998 у Ехр Мед. 4, 1477-85.

Міеікіпа апа Зм/егепда 1989 Нівіоспетівігу; 91(1):81-8. -І МіМа, Р егї аї. (1997) Тгтепаз Віоспет. зЗсі. 22, 388-393.

Міпсеп: С апа ріх ММ 1997. У Віо! Спет. Маг 7; 272(10):6578-83. со умані еї а!., 1983 9. Мисі. Мей. 24:316-325. с УмайМаси, О єї аІ. 1999 Ати Кем Іттигпо)Ї. 17331-67.

Ууапа, У 1998 СопігоїІед Кеїеазе 53,39-48. ю УУеамег еї а. 2000 Нубгідота Арг; 19 (2): 167-9.

Ф Хцие еї а. 1995 Майшге Зер 21; 377(6546):248-51.

МХататою еї аї. 1980. СеїІ 22, 787-97.

Уататоют еї аї. у) Віої Спет 1997; 272(49):30595-8. 5Б мапа Х еї а. Мої Сеї! 1998; 1(2)319-25.

Хенпеза!. 1998 у) Вопе Міпег Кез. 13. р.І870-9.

Ф) Уп, Н.Г. апа 5юззеї, Т.Р. (1979) Майте (І опдоп) 281, 583-586. ка іп, Н.Г. апа 5юззеї, Т.Р. (1980) 9. Вісі. Спет. 255, 9490-9493. 7аснагіа єї аі., 1991 Еиг. У). Ріпагтасої. 203, 353. во 7папо еї а. 1998 Сііп Сапсег Кез 4,2669-76. 7пао апа Ріск, 1993 Майшге 365, 448.

Список послідовностей

Claims (21)

Формула винаходу б5

1. Антитіло, одержане імунізацією тварини пептидом з С-кінця одиниці ЗИир-1 каспази-8, та його фрагменти, де пептид, який використовується для імунізації, має амінокислотну послідовність СОСОММОКОІРМЕТО (5ЕО ІЮ МО:4), здатні спів-імунопреципітувати вказану каспазу (як активну каспазу-8, так і прокаспазу-8) разом з прокаспазою-8, зв'язаною з білком р/2 (ЗЕО ІЮО МО:3), і здатні до ефективного вивільнення каспази та зв'язаного білка з імунного комплексу при елюції, з використанням пептиду, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:4.

2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що є поліклональним антитілом або його фрагментом.

3. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що є моноклональним антитілом або його фрагментом.

4. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що є химерним антитілом або його фрагментом. 70

5. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що є повністю гуманізованим антитілом або його фрагментом.

6. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що є анти-анти-Іі4 антитілом або його фрагментом.

7. Антитіло за будь-яким з пп. 1-6, яке відрізняється тим, що пептид, який використовується для імунізації, зв'язаний з КІ Н.

8. Антитіло за будь-яким з пп. 1-7, яке відрізняється тим, що є ізотипом імуноглобуліну дос.

9. Антитіло за п. 8, яке відрізняється тим, що запускає процесинг каспази-8.

10. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-9 для розробки ЕІ ІЗА-аналізу.

11. Спосіб одержання антитіла за п. 1 або 2, що включає імунізацію тварини пептидом з С-кінця ЗибБ-1 каспази-8, де пептид, що використовується для імунізації має амінокислотну послідовність СОСОМЖМОКОІРМЕТО (ЗЕО ІО МО 4).

12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що антитіло є моноклональним.

13. Спосіб за будь-яким з пп. 11-12, який відрізняється тим, що імуноген зв'язаний з носієм.

14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що носій являє собою КІ Н.

15. Спосіб очищення каспази і білка, зв'язаного з каспазою, що включає контактування зразка, який містить каспазу і білок, зв'язаний з каспазою, з антитілом за будь-яким з пп. 1-9, співімунопреципітацію каспази і сч білка, зв'язаного з каспазою, промивання утвореного імунного комплексу, і діставання каспази і зв'язаного з каспазою білка з імунного комплексу, з використанням СОСОММОКОІРМЕТО (5ЕО ІЮО МО:4) як конкуруючого і) пептиду.

16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що зразок вибраний з рідин організму, клітинних екстрактів і бібліотек ДНК, що експресуються. «о зо

17. Спосіб за будь-яким з пп. 15 або 16, який відрізняється тим, що конкуруючий пептид включає амінокислотну послідовність СОСОММОКОІРМЕТО (5ЕО І МО 4). с

18. Спосіб за будь-яким з пп. 15-17, який відрізняється тим, що клітини у зразку стимулювали перед ю екстракцією.

19. Спосіб за будь-яким з пп. 15-18, який відрізняється тим, що каспаза є каспазою-8. со

20. Спосіб за будь-яким з пп. 15-19, який відрізняється тим, що додатково використовують антитіло, яке ї- можна одержати імунізацією тварини пептидом ЗЕО ІЮ МО:6.

21. Застосування епітопу 179 (ЗЕО ІЮ МО:4) для одержання антитіла за будь-яким з пп. 1-6, що включає імунізацію тварини таким епітопом. « - с ;» -І (ее) 1 з 50 42) Ф) іме) 60 б5