KR100379207B1 - 재조합각질층키모트립신형효소(scce) - Google Patents

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레나르트 한슨
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핸슨, 레나르트
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Abstract

본 발명은 아미노산 서열 서열확인번호 2 하부서열을 가지는 폴리펩티드와 같이, 본 출원에서 정의된 SCCE 활성을 가지는 아미노산 서열 서열확인번호 2 또는 그의 유사체나 변이체를 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질발현계 형질발현 벡터, 플라스미드 및 인간을 제외한 생물체는 물론 SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 중요한 목적은 SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 제약, 화장용 및 피부 보호용 조성물, 및 어린선, 건선 기타 습진과 같은 염증성 피부병은 물론 좌창, 건피증 기타 변지와 모공성각화증과 같은 각화증 상태를 치료 또는 예방하기 위한 SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 더군다나 본 발명은 흔한 천포창 및 다리어 질병과 같이 자동면역 천포창 질병 또는 유극성위축증을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물의 제조를 위한 천연 SCCE의 효소 활성에 대한 저해 효과를 가지는 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

재조합 각질층 키모트립신형 효소(SCCE){Recombinant Stratum Corneum Chymotryptic Enzyme}
본 발명은 재조합 폴리펩티드와 이 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이 폴리펩티드를 함유하는 제약 및 화장용 조성물은 물론 이 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 시스템, 및 각종 화장용 또는 치료 목적용 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
조직으로서의 피부는 생물학적, 의학적 및 화장품학적 관점에서 흥미롭다. 건선과 습진 등의 조직-특이성, 또는 일반적인 알레르기 반응과 같은 일반 질병의 발현인 많은 피부 질병들이 있다. 피부-특이 질병들이 존재한다는 사실은 피부에 특이한 분자 메카니즘 존재의 증거로서 고려될 수 있다. 유사하게, 피부-특이 분자 프로세스에 관한 연구는 피부병의 이해 및 진료에 중요하다. 이들 프로세스중 일부는 어떤 식으로든 피부의 가장 분화된 기능, 즉 체외와 체내간의 물리화학적 장벽의 형성에 관련되어 있는 것으로 추정할 수 있다. 물리화학적 장벽은 피부의 최외각층인 각질층에 편재되어 있다.
각질층은 피부의 가장 분화된 구조이다. 이는 표피 분화 과정의 최종 산물, 즉 피부의 최외 부분을 차지하는 중층 편평상피이다. 대부분의 표피 세포들은 다양한 분화 상태의 케라티노사이트로 구성된다. 표피의 연결 조직인 진피와 접촉해 있는 기저막상에 존재하는 최저 케라티노사이트인 기저 세포는 분할능을 가지는 유일한 케라티노사이트이다. 기저 세포의 분획은 연속적으로 기저막을 출발하여 분화 과정을 거쳐 결국에는 세포가 각질층의 건축 저해물이 되도록 한다. 표피-특이적인 세포케라틴으로 구성된 세포체질의 함량의 증가가 있다. 인접 세포들의 중간 필라멘트는 증가된 수의 교소체에 의해 기능 단위체에 결합된다. 가장 극적인 변화는 통상 케라틴화라 불리는 과정에서 최외각 생세포층인 과립층으로부터 생육불능 각질층으로의 전이 과정중에 발생한다. 공유 결합된 단백질은 매우 저항성을 가지는 세포 외피를 형성하는 원형결막의 내면에 밀접하게 침전된다. 또한 케라티노사이트-특이적인 세포 소기관에서 생성되는 지질-풍부 물질은 세포의 공간으로 배출되고, 각질층 세포를 에워싸고 있는 지질 라멜라를 형성함으로써 친수성 물질에 대한 투과성 장벽을 구성한다. 최종적으로 꽉 채워져 있는 세포케라틴 필라멘트를 제외한 모든 세포내 구조들은 사라진다.
따라서 각질층 세포인 코르네오사이트는 생육불능이다. 이는 각질층에서의 다양한 과정들의 조절이 케라티노사이트가 여전히 생육하는 상태에서의 "프로그래밍"의 결과이어야 한다는 것을 의미한다. 세포가 약 2 주간 각질층의 일부인 동안 정상적으로는 약 4 주간 진행되는 표피의 전환은 표피의 낙설 과정에서 피부 표면으로부터 세포를 박리함으로써 종결된다. 이 과정은 각질층의 "프로그래밍"의 예이다. 각질층의 물리화학적 장벽으로서 기능의 선결조건은 그의 각 세포가 기계적 내성인 구조, 즉 교소체에 의해 유지된다는 점이다. 낙설의 선결조건인 교소체의 분해는 조직의 장벽 기능을 간섭하지 않으면서 각질층을 새로이 생산하는 것을 조절하는 피부 표면으로부터의 세포 박리를 얻기 위해 조절되어야 한다.
케라틴화의 장애
병세를 변화시키는 피부에서의 많은 병리적 조건하에서, 케라틴화 과정에는 장애가 있다. 건선에는 전형적인 만성 염증 이외에도, 이 질병의 전형적인 낙설을 초래하는 미성숙 각질층의 과생산이 있다. "피시 스칼즈(fish scales)", 소위 어린선(ichthyoses)의 형성을 초래하는 두꺼워진 각질층으로 특징지워진 유전적인 피부병 군이 있다. 많은 어린선에서는 낙설률이 감소된다. 어린선보다 경중이기는 하지만, "건조 피부"(건피증) 또한 단일 세포나 세포들의 소집단과 같은 정상적인 조건하에서가 아니라, 대규모의 육안 관찰가능한 인설(scales)로서 각질층으로부터 코르네오사이트가 박리되는 특징이 있다. 이러한 장애는 노인과 아토피성 체질인들에게는 매우 흔한 현상으로, 피부 자극제 및 소인에 대해 감소된 내성을 가지는 각 개인은 내생 습진의 특징적인 형태를 나타낸다. 좌창의 경우에는 여드름 및 전색(plugging)의 생성을 초래하는 피지선관에 케라틴화 장애가 있게 된다. 여드름의 생성이 선행되고 염증 좌창 병변을 일으키는 것으로 믿어진다. 단백질분해 효소가 케라틴화에 관련된다.
케라틴화 과정 및 단백질 가수분해 효소가 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 각질층의 전환중에는 많은 단계가 존재한다. 확실히 생육성 표피층과 각질화된 표피층 사이에서 전환이 일어나는 동안 발생하는 세포케라틴 필라멘트를 제외한 모든 세포내 구조들의 소멸은 단백질분해가 관여한다. 케라틴화중 프로필라그린의 세포케라틴 필라멘트의 응집의 특이한 유형에서 기능을 한다고 여겨지는 단백질인 필라그린으로의 전환은 특수한 단백질분해 효소에 의해 촉매될 수 있다. 각질층에서필라그린은 "천연 습윤제"로서 아마도 중요한 저분자량의 성분들로 더 분해된다. 더욱이, 케라틴화 과정중 세포케라틴 폴리펩티드의 단백질분해성 변형이 있다. 최종적으로, 단백질분해는 결국에는 낙설을 초래하는 과정중 각질층에서의 세포내 응집성 구조 분해에서 중요한 역할을 하는 것 같다.
각질층 세포 응집 및 낙설, 교소체의 역할
표피의 생육부에서는 물론 각질층에서 세포내 응집은 교소체에 의해 상당한 정도로 매개된다. 교소체는 두 개의 대칭성 절반으로 구성되는데, 각각은 두개의 인접한 세포에 의해 형성된다. 각 교소체의 절반은 사이토케라틴 필라멘트에 연결된 한 세포내 부분과 세포내에 고착되어 있은 당단백질에 이루어져 있고, 트랜스막 및 세포의 부분을 가진 일부를 가진다. 이들 단백질의 세포의 부분인 데스모글레인은 고착 분자로, 세포외 공간에서 서로간의 상호작용을 통해 응집 구조가 형성된다. 교소체의 분해는 비-수장족저(non-palmo-plantar) 각질층에 비해 수장과 족저의 각질층에서 다소 상이한 경로를 따르는 것으로 보인다. 후자의 조직에서 교소체의 약 85%는 세포들이 충분히 각질화된후 곧 사라진다. 바람직하게는 매우 평평한 세포의 융모 가장자리에 위치한 잔류 교소체는 낙설이 일어나는 수준까지 명백하게 남아있다. 수장족저 각질층에서 각막세포는 훨씬 덜 평평하며, 이 조직의 심층에서 교소체의 광범위한 분해는 일어나지 않는다. 양 조직에서 낙설은 교소체 분해와 연관된다. "건조 피부"에서는 물론 어린선 피부에서 각질층의 표면층에서 교소체 수는 증가하는 것으로 나타났다.
각질층 세포내 지질
수장족저와 비-수장족저 각질층간의 교소체 분해에서의 차이점은 두 유형의 조직에서 세포외 지질 양의 차이와 연관될 수 있다. 지질량은 비-수장족저 각질층에서 상당히 높다. 결과적으로 물과 다른 친수성 물질에 대한 투과 장벽으로서 이 조직의 효율성은 수장족저의 각질층에 비해 우수하다. 교소체가 상당한 공간을 차지하고 있고, 손상되지 않은 교소체는 세포의 공간의 확장을 방지하기 때문에, 교소체 분해는 지질에 대해 더 많은 세포외 공간이 제공될 수 있는 기작이 될 수 있다. 또한, 각질층의 세포외 지질은 일부 다른 방법에서 낙설과 관련된다. 이들이 세포외 공간의 주 성분들이기 때문에 이 국부에서 기능을 가진 효소, 예를 들어 교소체 분해을 일으키는 효소의 활성에 대한 중요한 영향을 가지는 것으로 기대할 수 있다. 실제로 지질 대사에서의 각종 장애가 몇 가지 유형의 어린선의 원인이 되는 것으로 보여진다. 또한 지질은 그 자체로 어느 정도 각질층 세포 응집에 기여하는 것같다. 더욱이, 각질층 세포외 공간으로의 지질 배출은 다수의 효소배출과 관련있는 것같다. 지질 전구체가 특이 소기관에서 상부 생육 케라티노사이트에 저장된다. 소위 박막체는 많은 가수분해 효소들을 포함하고 있는 것으로 보인다. 따라서 각질층에서 교소체 분해를 일으키는 효소는 케라티노사이트에 의해 아마도 불활성 프로-형으로 합성되어 박막체에 저장되고 케라틴화 과정중에 각질층 세포외 공간으로 배출되어, 여기에서 활성화되며, 그의 활성은 다른 인자들 중에서 세포외 지질의 조성에 의해 더욱 조절되는 것으로 기대된다.
생표피에서 세포 응집의 장애
비각질화된 생표피층에서 케라티노사이트간에 손상된 응집이 있는 많은 피부병이 존재한다. 이 질환의 특징은 외관상 정상인 케라티노사이트 사이에서의 교소체 접촉의 분해현상인 유극층위축증이라 불리우는 현상이다. 이 과정은 지금까지는 충분히 동정되지 않은 단백질분해효소에 의해 매개되는 것같다. 유극성위축증은 포진 형성을 널리 유도할때, 자가면역 질환인 심상성 천포창 및 낙엽성 천포창, 유전성 양성 가족계 천포창(하레이-하레이 질병), 및 유전성 디스케라토시스 폴리쿨라리스(다리어 질병)이 특징이 있다.
표피가 면역 및 염증 반응에서 활성부를 차지한다
체내와 체외 사이의 물리화학적 장벽의 제조자로서의 기능 외에, 표피는 활성 면역 장벽으로서의 기능도 한다. 케라티노사이트는 면역계 및 염증계 세포와 교통하며 상호작용하는 다수의 사이토킨 및 기타 염증 매개체에 반응하는 것은 물론 이들을 생산할 수 있는 능력을 가진다. 이는 미생물 감염에 대한 숙주 방어 및 상처 치료에서 큰 중요성을 가진다. 또한 최신 연구는 케라티노사이트가 건선과 좌창과 같은 많은 염증 피부병에서 활발한 역할을 하는 것을 보여주고 있다.
피부 단백질 분해효소는 염증에서 중요할 수 있다
케라티노사이트에 의해 제조된 사이토킨중 하나는 인터류킨-1(IL-1) 이다. IL-1 은 두 가지 형태, 즉 IL-1α 와 IL-1β로 존재하며, 이들은 모두 표피에 존재한다. IL-1α 가 합성되었을 때 완전한 활성인 반면에, IL-1β는 불활성 31 KD 프로-형으로서 합성된다. 프로-IL-1β는 예를 들어 단핵구에는 존재하지만 이제까지는 정상적인 표피에서 탐지되지 않았던 특이한 단백질 분해효소에 의해 활성형 17 KD 로 전환된다. 그러나, 키모트립신-유사 기질 특이성을 가지는 많은 세린 단백질가수분해 효소(췌장 키모트립신 및 호중구성 과립구의 카텝신 G)들은 프로-IL-1β 활성제로서 작용한다.
노리스(Norris (1990))에 의해 제시된 바와 같이, 각질층 세포내 공간에 존재하는 단백질 가수분해 효소들은 일정한 조건하에서 사이토킨의 불활성형을 활성형으로 전환시킬 수 있다. 이에 관련해서 특히 흥미로운 것은 생물학적으로 불활성인 프로-인터류킨-1β로, 이는 케라티노사이트에 생산되는 것으로 입증되었다(Mizutani et al., 1991). 지금까지는 프로-인터류킨-1β을 활성 인터류킨-1β로 전환시킬 수 있는 능력을 가진 표피 효소가 발견되지 않았다. 그러나 키모트립신과 카텝신 G (키모트립신-유사 효소)는 불활성 31 KD 재조합 프로-인터류킨 1β를 완전한 활성형 17 KD으로의 전환을 촉매할 수 있기 때문에, 표피 키모트립신-유사효소도 이러한 전환을 촉매할 수 있다.
본 발명은 각질층에서 교소체 분해를 일으키는 것으로 예상되는 각질층 키모트립신 효소(SCCE)로 명명된 효소에 관한 것이다. 증거는 피부의 각질화된 표면층의 표면으로부터의 세포 박리에 교소체 단백질 분해가 관여하며, 또한 관여하는 효소가 아연 이온에 의해 저해될 수 있는 키모트립신-유사 세린 단백질분해효소인 것으로 생각된다는 것을 보여주는 실시예 1에서 제시된다.
실시예 2는 각질층 키모트립신 효소(SCCE), 즉 시험관내에서 및 또한 가능하게는 생체내에서 각질층에서의 세포내 응집구조의 분해를 담당하는 기준을 만족시키는 단백질분해효소의 발견을 기술하고 있다. 실시예 3은 색소생성 기질을 사용한각질층 키모트립신 효소(SCCE) 활성의 일부 특성을 기술하고 있다.
그 결과는 SCCE 가 다른 키모트립신 단백질분해효소와 효소학적으로 상이함을 입증하고 있다. 소의 키모트립신 및 인간의 카텝신 G에 비교할 때, 키모트립신-유사 효소의 상이한 두 기질을 분해할 수 있는 저해제 프로파일 및 그 능력은 SCCE와 상당히 상이하다. 또한 SCCE는 인간 비만세포 치마제 (chymase)와 상이한 것으로 보인다. 후자의 효소는 SCCE가 촉매하지 않는 Sus-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA의 분해를 효율적으로 촉매하고 (참조 : Schwartz et al., 1987 및 Scheshter et al., 1989), SCCE가 저해되는 아프로티닌 또는 SBTI 에 의해 저해되지는 않는다 (Schechter et al., 1983 및 Wintroub et al., 1986).
실시예 4는 불용화된 대두 트립신 저해제(SBTI) 상에서의 친화성 크로마토그래피를 사용하여 각막세포의 KCl-추출물로부터 SCCE의 부분 정제 및 SCCE 의 N-말단 아미노산 서열의 결정을 기재하고 있다. 환원되지 않은 시료를 가지고 행한 수율은 1-6 단계에서 우수하였지만, 7 단계와 9 단계에서 0으로 감소되었고, 그후의 단계에서 수율은 현저하게 감소되었다. 또한 환원된 시료를 사용한 경우 7 및 9 단계에서는 어떠한 아미노산 유도체들도 관찰될 수 없었지만, 유도체가 관찰될 수 있는 그 후의 단계들에 있어서는 수율의 급격한 감소가 일어나지 않았다. 이러한 결과는 위치 7 및 9 에서 시스테인이 있음을 암시한다. 그러나 환원 및 요오드화아세트산(100 mM) 처리 후 단계 7 및 9 에서 카르복시메틸화 시스테인을 관찰하는 것은 불가능하였다. 획득된 서열(도 13, 서열 확인 번호:3)은 환원 및 비-환원 시료에서 동일하였다.
실시예 5는 모노클론 항체를 사용한 면역조직화학 연구는 물론 SCCE-특이적인 모노클론 항체 및 폴리클론 SCCE-특이적인 닭 및 토끼 항체의 제조방법에 대해 기재하고 있다. 실시예 6은 인간 SCCE를 코딩하는 cDNA의 클로닝 및 시퀀싱을 기재하고 있다. 처음에 표피 기원의 성인 케라티노사이트에서 유래된 mRNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 항-SCCE 토끼 폴리클론 항체로 스크린하였다. 항체중 하나는 높은 바탕 시그날을 나타내었고, 초기 단계에서의 광범위한 스크리닝 연구에서 제외하였다. 다른 폴리클론 항체(D-5)를 사용하여 진성 양성 플라크에 대해 예상된 대로 면역반응 플라크를 농후하게 하였다. 그러나, 어떠한 플라크에 대해서도 모노클른 항체 moAb 4 및 moAb 9와의 반응성은 어떠한 플라크에 대해서도 관찰되지 않았다. 11개의 단리된 플라크의 광범위한 제한효소 특성 분석 및 PCR 특성 분석은 여러 플라크 사이에 어떠한 유사점도 탐지될 수 없음을 보여주었다. 프로브가 될 수 있는 SCCE cDNA의 "지문(fingerprint)"을 특정하기 위한 이러한 실패에 근거하여 계획을 변경해야 했다.
초기저의 케라티노사이트에서 SCCE 면역반응성 물질의 선택적인 탐지에도 불구하고, 배양된 인간 케라티노사이트로부터 제조한 cDNA 라이브러리가 SCCE cDNA 스크리닝에 사용되었다. 이와 같은 라이브러리는 단지 기저 케라티노사이트로부터 cDNA를 포함하는 것으로 예상될 수 있다. 이 시도는 기저 케라티노사이트의 SCCE 모노클론 항체를 사용한 약하지만, 아마 상당한 면역염색법의 관찰에 근거한다.
실시예 4에 기재된 바와 같이 천연 SCCE 효소의 실험적으로 결정된 아미노-말단 서열중 아미노산 서열의 가장 신뢰할 수 있는 부분 Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro(서열확인번호 10, aa 1-aa 6)을 근거로 하여 고안된 합성 17-mer 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 플라크를 스크리닝하였다. 실험적으로 결정된 아미노산 서열내의 불확실성 때문에, 상기 헥사펩티드는 가장 신뢰할 만한 부분중 하나를 나타내는 것으로 판단된다. 또한 상기 헥사펩티드를 코딩하는 가능한 코돈은 DNA 프로브의 가장 낮은 가능성의 중첩을 초래한다. 실험적으로 결정된 보다 긴 서열 Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu (서열 확인 번호: 3, aa 15-aa 24)은 이 펩티드 서열을 코딩하는 서열의 고도의 변성으로 인해 배제되었다. 첫 번째 스크리닝에서 14 개의 양성 플라크들이 확인되었다. 이들 양성 플라크들은 상술한 것과 동일한 프로브 및 방법을 사용하여 재스크리닝하였다. 재-스크리닝 과정 후 2개의 양성 플라크를 확인한다. 선택된 2개의 플라크를 한 번 더 정제하고, SYM 1600과 SYM 1601을 사용한 PCR로 프라이머로서 2 개의 파지 암(arms)에 대해 상보적인 것을, 단리된 파지를 주형으로 사용하여 삽입물의 크기를 결정하였다. 이 클론된 단편을 부분 서열 분석을 하였다.
획득한 DNA 서열의 번역은 실험적으로 결정된 단백질 서열에 유사한 아미노산 서열을 나타낸다. 그러나 그 서열은 번역 개시 코돈이 없다. 전장 cDNA 를 단리하기 위하여, 획득한 DNA 단편을 아가로즈 겔상에서 분리하여 엄격한 조건하에서 혼성화를 허용하는 프로브로서 사용한다. 전장 cDNA를 획득하기 위하여, 혼성화를 엄격한 조건, 65℃에서 하는 것을 제외하고는 상술한 방법과 동일한 방법을 사용하여 이 프로브를 가지고 cDNA 라이브러리를 두번 재-스크리닝하였다. 이 실험으로 전체 5' 개방 판독틀을 포함하는 플라크의 확인을 위해 PCR 프라이머로서 SYM 3208과 조합하여 SYM 1600 또는 SYM 1601을 사용하여 PCR 분석법에 의해 초기에 스크리닝된 45개의 각 양성 플라크를 확인 및 단리할 수 있었다.
추가 스크리닝 및 서열 분석을 행한 후, 실시예 6에 상세하게 기재된 바와 같이, 상기 파지에서 유래한 생성된 PCR 증폭 단편들을 클로닝하였고, 그 결과는 파지 중 하나인 205.2.1이 전장 삽입물을 포함하고 있음을 보여주었다. cDNA 단편의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 뉴클레오티드 서열 (서열확인번호 1)은 신호 펩티드와 예비폴리펩티드를 포함하는 253개의 아미노산으로 구성된 SCCE 전구체 단백질의 전체 아미노산 서열(서열확인번호 2)을 코딩하기에 충분한 개방 판독틀을 포함하였다. 실시예 7은 SCCE cDNA 서열에 기초하여 제조된 cDNA 프로브로 혼성화할 수 있는 두 개의 SCCE mRNA-종의 인간 표피에서의 탐지를 기술하고 있다.
실시예 8은 대장균 (E.coli)에서의 재조합 SCCE의 발현을 기술하고 있다. 그 결과는 세균에서 재조합 SCCE를 제조할 수 있음을 보여준다.
실시예 9는 포유동물에서 재조합 인간 SCCE의 발현을 기재하고 있다. 기탁된 모노클론 항체는 물론 유용한 모든 폴리클론 토끼 및 닭 SCCE 항체와의 반응을 보여주는 3개의 단백질이 제조된다. 천연 SCCE 에 대해 생성된 항체와 반응하는 재조합 단백질은 정제된 천연 인간 SCCE보다 약 1 kDa 더 큰 외형 분자량을 보인다. 재조합 단백질은 어떠한 단백질 분해 활성도 보이지 않는다.
재조합 SCCE의 정제, 활성화 및 추가 특성 분석은 실시예 10에 기재되어 있다. 재조합 SCCE의 불활성 프로-형은 트립신 또는 엔도펩티다아제 Lys-C에 의한 단백질 절단에 의해 활성화될 수 있다. 염기성 아미노산 이후의 펩티드를 분해할 수 있는 많은 다른 단백질분해효소, 즉 엔도프로테이나제 Lys-C, 파파인 및 플라스민은 프로-SCCE를 활성 SCCE로 활성화시킬 수 있는 것으로 생각된다. 신호 펩티드는 22개의 아미노산으로 구성되며, 천연 활성 SCCE의 N-말단 아미노산 서열에 기초하여 프로펩티드는 7개의 아미노산으로 구성되어 있음이 발견되었다. 더욱이, 생성된 재조합 SCCE는 활성 천연 SCCE를 사용하여 획득한 결과와 유사한 두 개의 N-글리코실화 형태 및 하나의 비-글리코실화 형태로 존재함을 보여주고 있다.
"각질층 키모트립신 효소(SCCE)" 또는 "SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드"란 용어는 가장 광의의 의미로 단백질 분해효소에 의한 절단에 의해 활성화될 수 있는 효소 전구체 (프로-SCCE) 또는 융합 단백질과 같은 세린 단백질분해효소 또는 그의 프로-형을 의미하며, 상기 효소는 그 활성형에서 동일한 저해제 및 생리적 온도에서 중성 또는 중성 부근의 pH 에서 배양된 피부의 각질층의 시료를 가지고 모델 시스템에서 유도될 수 있는 자생 세포 분리와 유사한 방법으로 저해된다.
따라서, 보다 구체적으로 "SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드"란 용어는 키모트립신 및 카텝신 G와는 상이하고 또한 그 활성형은 기질 MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-2586)을 분해할 수 있고, 실시예 3과 13 및 도 9와 표 5에 기재되어 있는 바와 같이 아프로티닌, 키모트립신 및 황산아연에 의해 폴리펩티드의 분해가 실질적으로 저해되는 폴리펩티드를 의미한다.
더욱 보다 구체적으로 "SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드"란 용어는 족저 각질층의 시험관내 배양 중 교소체 단백질인 데스모글레인I의 단백질 가수분해를 일으킬 수 있는 폴리펩티드를 포함한다.
이와 같은 폴리펩티드는 일반적으로 분리된 족저 각질층 세포의 추출물로부터 정제된 천연 SCCE에 대해 생성된 항체와 반응할 것이다. 이와 같은 항체의 예로서 실시예 5.2 에 기재된 바대로 제조된 폴리클론 항체 및 실시예 5.1에 기재된 바대로 제조된 모노클론 항체 TE4b 및 TE9b 가 있다. 모노클론 항체들은 부다페스트 조약의 규정에 따라 각각 기탁번호가 ECACC 93061817 및 ECACC 93061816으로 영국 월트셔 SP4 OJG 살리스버리 포톤 다운 소재 동물세포 배양물 유럽 콜렉션(European Collection of Animal Cell Culture)에 기탁된 하이브리도마 TE4b 및 TE9b에 의해 제조된다.
인간 SCCE를 코딩하는 cDNA이 클로닝 및 서열이 실시예 6에 기재되어 있다. 신호 펩티드와 프리폴리펩티드를 포함하는 253개의 아미노산으로 구성된 SCCE 전구체 단백질의 전체 아미노산 서열을 코딩하기에 충분한 개방판독틀을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 발견되었다. 이 뉴클레오티드 서열을 서열확인번호 1에 나타내었고, "각질층 키모트립신 효소(SCCE)"의 추정된 아미노산 서열을 서열확인번호 2에 나타내었다.
"프로-SCCE 또는 그의 유사체 또는 변이체"란 용어는 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 적합한 발현 시스템에서 발현될 때 생성되고, 또한 단백질 분해 활성화시에 생리적 온도, 즉 약 37℃ 에서 중성 또는 중성 부근의 pH에서 배양한 피부의 각질층의 시료로 모델 시스템에서 유도될 수 있는 자생 세포 분리와 동일한 저해제에 의해 저해될 수 있는 세린 단백질분해효소를 생성하는, 서열확인번호 2의 아미노산 서열 또는 상기 서열의 유사체 또는 변이체를 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로 단백질은 정제된 천연 또는 재조합 SCCE에 대해 생성된 항체와 반응할 것이다.
"SCCE 또는 그의 유사체 또는 변이체"란 용어는 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 적합한 발현 시스템에서 발현될 때 생성되고, 또한 단백질 분해 활성화시에 생리적 온도, 즉 약 37℃에서 중성 또는 중성 부근의 pH에서 배양한 피부의 각질층의 시료로 모델 시스템에서 유도될 수 있는 자생 세포 분리와 동일한 저해제에 의해 저해될 수 있는 세린 단백질분해효소인, 서열확인번호 2의 아미노산 서열 또는 상기 서열의 유사체 또는 변이체를 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로 단백질은 정제된 천연 또는 재조합 SCCE에 대해 생성된 항체와 반응할 것이다.
따라서 "그의 유사체 또는 변이체"란 용어는 정확하게 서열확인번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖지는 않지만, 여전히 상기에서 정의된 "SCCE 활성"을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로 이와 같은 폴리펩티드는 어느 정도까지는 아미노산 조성이 변화하는 폴리펩티드이거나, 또는 실시예에서 기재된 SCCE 단백질과 비교할 때, 번역후 변형, 예를 들어 글리코실화 또는 인산화된 폴리펩티드를 의미한다.
따라서, "유사체" 또는 "변이체"란 용어는 아미노산 서열을 변경시키는 부수적인 변이, 즉 결실, 위치 지정된 돌연변이, 추가 아미노산의 삽입 또는 그들의 조합으로 SCCE 단백질 유사체를 생성하는 것을 허용하며, 본 명세서의 실시예 6에 기재된 SCCE 단백질로부터 유도된 특징적인 서열확인번호 2의 아미노산 서열과 유사한 아미노산 조성 또는 서열의 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 사용된다. 이들 변형은 흥미롭고 또한 유용한 신규한 성질이 유사체를 생성할 수 있다. 유사 폴리펩티드 또는 단백질은 동물 또는 인간으로부터 유도될 수 있으며, 또는 부분적으로 또는 완전히 합성 기원일 수 있다. 또한 유사체는 재조합 DNA 기술을 사용하여 유도될 수 있다.
따라서 본 발명의 중요한 실시태양은 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 치환되고(되거나) 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 또는 삽입되어 서열확인번호 2에 나타낸 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열 또는 하기에 정의된 바와 같이 상기 아미노산 서열의 하부서열을 포함하지만, 상기에서 정의된 SCCE 활성을 실질적으로 가지는 폴리펩티드를 생성하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 흥미로운 실시태양은 50 내지 250개의 아미노산, 즉 70개 이상의 아미노산, 100개 이상의 아미노산, 150개 이상의 아미노산 또는 200개 이상의 아미노산을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 유사체 또는 하부서열인 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 특히 중요한 실시태양은 서열확인번호 2 (프로-SCCE)에서 아미노산 서열 -7-224를 가지는 폴리펩티드 및 서열확인번호 2 (SCCE)에서 아미노산 서열 1-224를 가지는 폴리펩티드이다.
"효소적으로 활성인 하부서열"은 서열확인번호 2에 나타낸 폴리펩티드 서열의 일부만을 함유하며, 효소 활성을 가지는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 또한 본원에서 설명된 변형에 의해 유사체화된 폴리펩티드 하부서열이 포함된다. 효소적으로 활성부위를 함유하는 특이 폴리펩티드(또는 폴리펩티드)는 특히 흥미있는 것으로 생각된다.
예상된 서열확인번호 2의 아미노산 서열을 인간 키모트립신 (Toulta et al., 1989), 인간 카텝신 G (Salvesen et al., 1987) 및 인간 마스트 세포 치마제(Caughey et al., 1991) 효소의 아미노산 서열과 비교하였다. 추론된 아미노산 서열이 세린 단백질분해효소의 보존 활성영역을 포함하고 있다할 지라도, 상동성 정도는 약 33-38 % 정도로 매우 낮다. 따라서, 이러한 면에서, SCCE는 이미 공지된 세린 단백질분해효소와 단지 보통의 유사성을 가지는 것으로 보여진다. 반면에 SCCE는 활성 부위의 히스티딘, 아스파르테이트, 및 세린 단백질분해효소 및 이들 부위에 밀접하게 있는 보존된 영역에 관한한 전형적인 세린 단백질분해효소이다. 이는 또한 세린 단백질 분해효소의 대부분의 시스테인 잔기 및 다른 고도로 보존된 영역에 있어서 진정하다. 제1 특이성 낭(키모트립신에서 잔기 189)의 최저부에는 인간 키모트립신, 비만세포 치마제 및 프로스테이트-특이 항원에서의 세린 잔기 및 인간 카텝신 G에서의 알라닌 잔기가 있다. 한편 SCCE에는 이 부위를 아스파라진 잔기가 차지한다. 이는 비록 SCCE가 의심할 여지없이 키모트립신 활성을 가진다할지라도, 다양한 색소생성 펩티드 기질에 대한 그의 상대적인 활성이, 키모트립신-유사 효소의 저분자량 질량의 저해제인 키모스타틴의 저해 효율성과 마찬가지로 키모트립신 및 카텝신 G와는 상이함을 발견한 것을 설명할 수 있다.
인간 키모트립신, 인간 카텝신 G 및 인간 비만세포 치마제의 서열과 SCCE 서열간의 비교를 하기 서열 배열에서 나타내었다.
배열은 수작업으로 행하였다.
HUMCTRP = 인간 키모트립신 (Touita et al., BBRC 158:569-575, 1989)
HUMCHTG = 인간 카텝신 G (Salvesen et al., Biochemistry 26:2289-2293,1987)
HUMCHYM = 인간 마스트 세포 치마제 (Caughey et al., J. Biol Chem. 266: 12956-1296, 1991)
유사체 :
HUMCTRP/SCCE : 85/224 = 38 %
HUMCHTG/SCCE : 74/224 = 33 %
HUMCHYM/SCCE : 74/224 = 33 %
HUMCHTG/HUMCHYM : 109/226 = 48 %
넘버링은 키모트립신을 참조하였다.
강조사항 :
활성부위 부근의 보존된 영역 (키모트립신에서 Ile 15, His 57, Asp 102, Ser 195) 및 키모트립신의 제1 특이성 낭상공동 (키포트립신에서 Ser 189, Ser 213-Trp 215, Gly 226).
별표 : SCCE 에서 가능한 N-글리코실화 부위
따라서 본 발명의 중요한 실시태양은 20개의 아미노산의 연속적인 스트링이 서열확인번호 2에 나타낸 아미노산 서열로부터 선택된 같은 길이의 아미노산의 스트링과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.
서열확인번호 2에 나타낸 폴리펩티드와 함께 85%이상, 예를 들어 90%와 같이, 80% 이상의 상동성을 가지는 본 발명의 폴리펩티드 서열은 중요한 실시태양을 구성한다. 서열확인번호 2에 나타낸 서열이 매우 독특하므로, 본 발명의 범위는 서열확인번호 2에 나타낸 아미노산 서열로부터 선택된 20개의 아미노산의 유사한 연속 스트링에 대한 상동성 정도가 비록 바람직하게는 70% 이하이긴 하지만, 55% 이하일 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 서열은 다른 종, 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지 또는 소와 같은 포유동물에서 유사한 단백질로부터 유도될 수 있다. 서열 중 마이너 부분이 다른 세린 단백질분해효소과의 상당한 유사성을 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 범위는 또한 서열확인번호 2에 나타낸 아미노산 서열로부터 선택된 20개의 아미노산의 유사한 연속 스트링에 대한 상동성 정도가 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상인 펩티드를 포함한다.
"서열 상동성"이란 용어는 폴리펩티드의 아미노산의 동일성 및 위치 면에서 비교하였을 때 2개 이상의 아미노산 단편에서 아미노산의 서열에서의 동일성을 의미한다.
본원에서 사용된 "상동성"이란 용어는 서열확인번호 2에 나타낸 아미노산 서열과 주어진 폴리펩티드의 아미노산 서열간의 동일성 정도를 기술하는 것을 의미한다. 서열확인번호 2에 나타낸 아미노산 서열과 비교될 아미노산 서열은 하기에 정의된 혼성화에 의해 수득한 DNA 또는 RNA 서열과 같은 뉴클레오티드 서열로부터 유도할 수 있거나, 또는 통상의 아미노산 시퀀싱 방법에 의해 수득될 수 있다. 상동성 정도는 바람직하게는 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열 상에서, 즉 어떠한 선도서열을 고려하지 않고 결정한다. 일반적으로 유일한 코딩 지역은 이들의 내부 상동성을 결정하기 위하여 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 사용된다.
본 명세서에서 "기탁된 항체중 하나 이상에 의해 인식되는 폴리펩티드"란 용어는 기탁된 항체들 중 하나 이상에 의해 인식되는 서열확인번호 2에 나타낸 폴리펩티드의 임의의 서열의 직쇄 또는 공간 형태에 있어서 실질적으로 연속 스트레치를 구성하는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 의도되었다. 당업계에서 공지된 바와 같이, 2차 또는 3차 구조식은 또한 흥미있고 유용한 성질을 가질 수 있으며, 에피토프를 구성할 수 있다. 기탁된 항체 TE4b 및 TE9b는 SCCE이 구조 에피토프를 인식하는 것처럼 보인다.
실시예 5.2.2에서 기술된 대로 제조한 폴리클론 토끼 항체는 과립층의 과립자 염색 및 면역형광 현미경에서 저부 각질층의 다소의 확산 염색을 생성하는 것을 입증하였다.
정제된 천연 또는 재조합 SCCE에 대해 생성된 항체는 일반적으로 케라틴화(각질화)된 인간 편평상피에서 초기저 세포에는 결합하지만, 비각질화 편평상피의 상피세포에는 결합하지 않을 것이다. 이 항체들은 또한 인간 피부의 각질층의 세포간 공간에 결합할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드와 반응하는 항체들은 하기에서 열거된 바와 같이 다수의 목적을 위해 적합하다:
단백질 정제의 목적 : 항체는 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전 기술을 사용하여 생물학적 시료로부터 폴리펩티드 또는 그의 유사체를 정제하는데 사용될 수 있다.
진단 및 치료 목적 폴리펩티드 또는 그의 유사체에 대한 모노클론 항체는 동물 및 인간의 질병 상태를 진단 및 치료하는데 사용할 수 있다. 진단제는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 특이성을 가지는 항체일 수 있다. 항체는 다른 단백질 또는 고체 담체에 결합되고(되거나) 응집 시험 또는 색채 발색 시험에서 사용될 수 있다. 또한 이와 같은 항체는 표준 조직화학적 또는 면역화학적 기술을 사용하여 생물학적 시료에서 SCCE 폴리펩티드 또는 그의 유사체를 정량하는데 사용될 수 있다.
일면에서, 본 발명은 상기에서 정의된 것과 같은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히 본 발명은 서열확인번호 1의 서열을 실질적으로 포함하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 다른 중요한 실시태양은 서열확인번호 2의 아미노산 서열 -7-224를 포함하는 폴리펩티드 또는 서열확인번호 2의 아미노산 서열 1-224를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 같은 아미노산 서열 서열확인번호 2의 하부서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명은 실시예 7과 실시예 9 에 기술한 바와 같이 크게 엄격한 조건하에서 서열확인번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은
1) 서열확인번호 1에 나타낸 서열과의 상동성이 90% 이상이고(이거나),
2) 서열확인번호 2에 나타낸 아미노산 서열과 80% 이상 상동성인 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩하며
3) ECACC에 1993년 6월 18일자로 기탁되었고, 임시 기탁번호가 ECACC 93061817인 하이브리도마 세포계 TE4b에 의해 제조된 모노클론 항체 또는 ECACC에1993년 6월 18일자로 기탁되었고, 임시 기탁번호가 ECACC 93061816인 하이브리도마 세포계 TE9b에 의해 제조된 모노클론 항체에 의해 결합되는 폴리펩티드를 코딩하며,
4) 해리된 족저 각질층 세포의 추출물에서 정제한 천연 SCCE에 대해 생성된 폴리클론 항혈청에 의해 결합되는 폴리펩티드를 코딩하는
서열확인번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 그의 유사체나 하부서열을 가지는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
또한 본 발명의 범위내에서는 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환 또는 변형되거나 하나 이상의 부가 뉴클레오티드가 삽입되어 SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성한다는 점에서 상기에서 정의된 뉴클레오티드 서열과는 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열이 존재한다.
본 명세서 및 특허청구의 범위에서, "하부서열"이란 용어는 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 18개 이상의 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게는 21개 이상의 뉴클레오티드의 크기를 가지는 서열을 의미한다. 본 발명의 다수의 실시태양에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 하부서열 또는 유사체는 75개 이상의 뉴클레오티드 또는 99개 이상의 뉴클레오티드와 같은 48개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 것이다. "하부서열"은 상기의 기준인 1)-4) 중 하나 이상을 만족시켜야 하거나 또는 서열확인번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 혼성화해야 한다.
본원에 기술된 것과 같이 PCR 기법에서는 작은 단편들이 유용함이 공지되어있다. 이와 같은 단편들과 하부서열은 다른 유용성중에서도 실시예 7에서 기재된 바와 같이 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 단편을 확인하는 프로브로서 사용될 수 있다.
본 발명의 DNA 단편들에 관한 "유사체"란 용어는 본 발명의 DNA 단편에 의해 코딩된 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가르키는 것이다. 동일한 아미노산이 여러 코돈에 의해 코딩될 수 있고, 이 코돈의 사용은 무엇보다도 뉴클레오티드 서열을 발현하는 해당 생물체의 선호도와 관련된다. 따라서 본 발명의 DNA 단편중 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 코돈은 다른 것에 의해 교환될 수 있으며, 발현될 때 당해 DNA 단편에 의해 코딩된 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
또한 "유사체"란 용어는 실시예 3에 기재된 천연 SCCE 단백질의 활성과 비교할 때 유사체의 효소 활성상의 상당한 역효과를 가지지 않는 부변형을 허용하며, 본 명세서에서 SCCE 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 특징적인 DNA 서열 서열확인번호 1과 유사한 뉴클레오티드 조성 또는 서열의 DNA 단편 또는 DNA 서열을 가르키는 것으로 사용된다. 용어 "상당한 역효과"는 유사체의 효소 활성이 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정될 때, 천연 SCCE 효소 활성의 50% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 보다 더 바람직하게는 70% 이상, 즉 적어도 75% 이상이어야 함을 의미한다. 유사한 DNA 단편 또는 DNA 서열은 동물 또는 인간과 같은 생물체로부터 유래할 수 있거나 부분적으로 또는 완전히 합성 기원일 수 있다. 유사체는 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 유래할 수 있다.
더욱이, "유사체" 및 "하부서열"이란 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드의 하부-치환, 삽입(인트론 포함), 첨가 및 재배열과 같은 서열의 변형을 허용할 수 있도록 의도되었으며, 이러한 변형은 DNA 단편 또는 그의 하부서열에 의해 코딩된 폴리펩티드상에 어떠한 실질적인 역효과도 가지지 않는다.
"하부-치환"이란 용어는 전체 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 하나 이상의 상이한 뉴클레오티드로 치환하는 것을 의미하고, "첨가"란 전체 뉴클레오티드 서열의 각 말단에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가를 의미하며, "삽입"은 전체 뉴클레오티드 서열내 하나 이상의 뉴클레오티드가 도입되는 것을 의미하고, "결실"은 전체 뉴클레오티드 서열의 각 말단 또는 적절한 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 전체 뉴클레오티드 서열로부터 결실되는 것을 의미하며, 및 "재배열"은 두 개이상의 뉴클레오티드 잔기가 DNA 또는 폴리펩티드 서열내에서 교환되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 그러나 DNA 단편은 이를 생물체로 삽입하기 전 또는 후에 돌연변이될 수 있다.
"단편", "서열", "하부서열" 및 "유사체"란 용어는 본 발명에 따라 단편, 서열, 하부서열 및 유사체에 관하여 본 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 물론 그들의 천연환경에서의 현상들을 포함하는 것이 아니라, 오히려 분리, 정제, 시험관내에서 또는 재조합 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 한 실시태양에서, SCCE 폴리펩티드 mRNA의 탐지 및(또는) 정량은 세포 또는 조직으로부터 RNA를 추출하고 이것을 이후 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서의 사용을 위해 cDNA로 전환하여 획득할 수 있다. PCR 프라이머(들)는 서열확인번호 1에 나타낸 DNA 단편과 같은 본 발명의 DNA 단편에 기초하여 합성될 수 있다. 탐지 및(또는) 정량을 위한 이 방법은 SCCE mRNA가 정상보다 높은 양으로 또는 낮은 양으로 발현되는 질환 상태에서의 진단을 위한 진단 방법으로 사용될 수 있다.
또한 뉴클레오티드 서열을 탐지할 수 있는 뉴클레오티드 프로브를 포함하는 진단제는 물론 정상보다 높은 양의 SCCE가 존재하거나 또는 돌연변이된 형태의 SCCE가 있는 질환을 가지는 것으로 추정되는 환자의 시료를 PCR 분석을 하여, 이 시료를 상기에서 기술된 진단제와 접촉시키고 어떠한 뉴클레오티드 서열이라도 증폭되도록하고 또한 시료 증의 동일하거나 또는 상동성이 있는 어떠한 뉴클레오티드의 존재라도 측정할 수 있는 것을 포함하는 SCCE 발현이 탈조절된 질환 및(또는) SCCE 유전자가 돌연변이된 질환을 진단하는 방법도 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 중요한 실시태양 중 하나는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산에 사용되는 생물체는 고등 생물체, 예를 들어 동물, 또는 하등 생물체, 예를 들어 대장균과 같은 미생물일 수 있다. 사용된 생물체의 유형에 관계없이, 본 발명의 DNA 단편은 직접적으로 또는 적합한 벡터에 의해 생물체 중으로 도입될 수 있다. 별법으로, 직접적으로 또는 발현 벡터에 의해 본 발명의 DNA 단편 또는 유사체 또는 그 하부 서열을 도입하여 포유동물 세포주 중에서 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
DNA 단편 또는 그의 유사체 또는 하부서열은 또한 적합한 발현 벡터에서 클론되어 적합한 세포계에 넣을 수 있다. 이후 목적하는 폴리펩티드를 생산하는 세포는 사용된 벡터와 세포계에 적합한 조건하에서의 생산성을 기본으로 하여 선택된다. 선택된 세포들은 그후 생육하여 목적하는 폴리펩티드의 매우 중요하고 연속적인 공급원을 형성한다.
본 발명의 DNA 서열의 특이 유사체의 예는 서열확인번호 1에 나타낸 DNA 서열 또는 그의 일부를 포함하며, 특히 대장균에서 발현시키기에 적합한 DNA 서열이다. 이러한 DNA 서열은 대장균에서 적합한 조절 서열과 함께 삽입될 때, 서열확인번호 2에서 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 일부를 실질적으로 포함하는 폴리펩티드을 발현시키는 결과를 초래한다. 따라서 이러한 DNA 서열은 대장균에 의해 인지되는 특이한 코돈을 포함한다. 이러한 실시태양의 예가 실시예 8에 기재되어 있다.
본 명세서에서 "유전자"란 용어는 폴리펩티드 사슬을 생산하는데 관련되며, 각 코딩 세그멘트인 엑손 또는 5'-상류 영역이나 3'-하류 영역 사이에 존재하는 인트론은 물론 코딩 영역(5'-상류 및 3'-하류 서열)의 전후 영역을 포함하는 DNA 서열을 지칭하는데 사용된다. 5'-상류 영역은 유전자의 발현을 제어하는 조절서열, 일반적으로 프로모터를 포유한다. 3'-하류 영역은 유전자 전사 종결에 관련된 서열 및 임의로는 전사체 및 3'-비번역 영역의 폴리아데닐화를 일으키는 서열을 포함한다.
상기와 일치하여, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 상술한 바대로 코딩한 뉴클레오티드 서열을 함유하며, 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절할 수 있는 5'-플랭킹(flanking) 서열을 함유하는 발현 시스템에 관한 것이다.
특히 본 발명은 본 발명에 따르는 뉴클레오티드 서열을 운반하고 그 발현을 매개할 수 있는 복제 가능한 발현벡터에 관한 것이다. 본 발명의 특수한 실시태양은 부다페스트 조약의 규정에 따라 가맹번호 DSM 8282 하에 독일연방공화국 상릉 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠바하 (Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)) 콜렉션에 1993년 5월 11일자로 기탁된 복제가능한 발현벡터인 pS507로 명명된 플라스미드에 관한 것으로, 발현벡터는 상기 기탁된 발현벡터의 뉴클레오티드 서열과는 다르지만 SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 그의 유사체나 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현할 수 있다.
즉, 본 발명의 범위는 또한 상술한 복제가능한 발현벡터를 포함하며, 이때 발현된 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환 또는 변형되거나 하나 이상의 부가 뉴클레오티드가 삽입되어 SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 초래한다는 점에서 기탁된 벡터의 뉴클레오티드 서열과는 상이하다.
또한 본 발명은 부다페스트 조약의 규정에 따라 기탁번호 DSM 8281로 독일연방공화국 삼룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠바하 (DSM) 콜렉션에 1993년 5월 11일자로 기탁된 pS500로 명명된 플라스미드에 관한 것으로, 플라스미드는 서열확인번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열과는 다르지만 SCCE 활성을 가지는 서열확인번호 2에 나타낸 폴리펩티드 또는 그의 유사체나 변이체를 코딩하며, 또는 엄격한 혼성화 조건하에 서열확인번호 1에 나타난 뉴클레오티드 또는 그의 일부와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다.
또한 본 발명의 범위내에서 본 발명에 따른 발현 시스템을 운반하는 인간을 제외한 생물체가 있다. 본 발명의 이러한 면에서 사용될 수 있는 생물체는 바실러스, 에스체리치아 또는 살모넬라속과 같은 세균류, 사카로마이세스. 피치아, 프로토조안과 같은 효모와 같은 미생물, 또는 진균류와 같은 다세포 생물체에서 유도한 세포, 곤충세포, 식물세포, 포유동물 세포 또는 세포계를 포함한다. 생물체가 세균류라면, 세균은 에스체리치아속, 예컨대 대장균이 바람직하다.
또한 본 발명은 본원에서 정의된 대로 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 벡터에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 본원에서 정의된 본 발명의 DNA 단편 또는 그의 유사체나 하부서열 또는 본 발명의 융합 DNA 단편은 숙주 생물체 또는 세포주를 복제할 수 있는 복제가능한 발현 벡터에 의해 운반될 수 있다.
벡터는 특히 플라스미드, 파지, 코스미드, 소-염색체 또는 바이러스일 수 있다. 본 발명의 흥미있는 실시태양에서 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 숙주세포의 게놈에 합체되는 벡터일 수 있다.
만약 고등 생물체가 사용된다면, 폴리펩티드를 제조하는데 유전자변환 기술을 사용할 수 있다. 적합한 동물의 예로서, 양, 소, 돼지 등이 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편은 조직 특이 조절 인자의 제어하에 목적하는 조직에서 발현된다. 생성된 단백질은 그후 번역후 변형되어 본 발명의 폴리펩티드를 수득할 수 있다.
본 발명의 인간을 제외한 유전자 변환 포유동물은 "변환유전자"를 선택된 동물의 태아 표적 세포에 도입함으로써 제조된다. 본 발명의 한 측면에서 변환유전자는 인간을 제외한 유전자 변환 포유동물 세포의 게놈에 포함될 때 목적하는 표현형을 제조할 수 있는 DNA 서열이다. 특수한 구체예에서 변환유전자는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하며, 변환유전자는 폴리펩티드를 제조하기 위하여 발현될 수 있다.
발현 시스템을 포유동물의 발아 시스템으로 도입하는 것은 적합한 임의의 기술, 예컨대 호간(Hogan et al., 1986) 또는 WO 제93/04172호에 기재된 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 구체적인 측면에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드가 본 발명의 다른 흥미있는 관점을 여전히 구성하는 융합된 폴리펩티드를 제조할 목적으로 SCCE 폴리펩티드를 코딩하는 서열확인번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 서열이나 그의 유사체에 번역틀로 융합된 본 발명의 폴리펩티드와 동일 또는 상이한 폴리펩티드를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다(참조 : 실시예 8). 재조합 DNA 기술을 사용하여 융합된 DNA 서열을 적합한 벡터 또는 게놈에 삽입시킬 수 있다. 별법으로 뉴클레오티드 서열중 하나를 이미 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 게놈속에 삽입시킬 수 있다. 또한 두 개의 뉴클리오티드 서열을 개별적으로 삽입시키고 발현이 일어나도록 융합 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 진핵 또는 원핵 기원일 수 있는 숙주 생물체는 융합 서열의 발현을 보증하는 조건하에서 성장시킨다. 이후, 융합된 폴리펩티드를 정제하고, 적합한 방법을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 그의 융합 파트너로부터 분리한다.
본 발명의 하나의 목적은
(a) 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 발현벡터에 삽입하는 단계,
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 벡터를 사용하여 적합한 숙주 생물체를 형질전환시키는 단계,
(c) 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 적합한 조건하에서 상기 단계 (b) 에서 제조한 숙주 생물체를 배양하는 단계,
(d) 폴리펩티드를 수확하는 단계, 및
(e) 임의로 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 범위내에는 또한 상기에서 기술된 대로 제조된 폴리펩티드를 고정화 천연 또는 재조합 SCCE 폴리펩티드나 항체를 사용한 친화성 크로마토그래피 및(또는) 크로마토그래피 및 전기영동 공정과 같이 하나 이상의 단계들을 포함하는 방법에 의해 폴리펩티드를 분리시키는 상술한 방법이 있다.
상기에서 기술된 대로 제조된 폴리펩티드는 열처리, 화학처리 (포름알데히드, 글루타르알데히드 등) 또는 효소 처리 (펩티다아제, 프로테이나제 및 단백질 변형효소)의 결과로서 번역후 변형할 수 있다. 폴리펩티드는 생물체의 천연 제조환경과 비교하여 생물체에서 제조될 때와는 서로 다른 방법으로 가공될 수 있다. 예컨대, 글리코실화는 보통 폴리펩티드가 효모와 같은 고등 생물체 또는 바람직하게는 포유동물의 세포에 의해 폴리펩티드가 발현될 때 달성된다. 글리코실화는 정상적으로는 아미노산 잔기인 Asn, Ser, Thr 또는 히드록실리신과 연관되어 발견된다.당해 숙주 생물체에 의해 야기된 가공 특성을 제거하거나 변경시키는 것은 유리할 수도 또는 불리할 수도 있다.
생물체나 세포계에서 폴리펩티드를 본 발명에 따라 발현한 이후에는, 폴리펩티드 그 자체를 사용하거나 또는 우선 생물체나 세포계로부터 정제시킬 수 있다. 만일 폴리펩티드가 배출 생성물로서 발현된다면, 직접 정제할 수 있다. 만일 폴리펩티드가 결합 생성물로서 발현된다면, 정제 과정 이전에 숙주의 부분적 또는 전부 파괴를 필요로 할 수 있다. 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용한 방법들의 예는, (i) 항체를 사용한 면역침전법 또는 친화성 크로마토그래피, (ii) 적합한 리간드를 사용한 친화성 크로마토그래피, (iii) 겔 여과, 이온교환 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 다른 크로마토그래피 방법 또는 그 파생방법, (iv) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 아가로즈 겔 전기영동 및 등전점 포커싱과 같은 전기영동 기술, (v) 임의의 다른 특이 가용화 및(또는) 정제방법이 있다.
본 발명은 또한 실질적으로 순수한 SCCE 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 명세서에서 "실질적으로 순수한"이란 용어는 당해 폴리펩티드가 다른 성분들, 예를 들어 다른 폴리펩티드 또는 탄수화물이 실질적으로 없는 것을 의미하는 것으로 이해되며, 이는 폴리펩티드의 제조 및(또는) 회수 또는 기타 폴리펩티드와 함께 발견되는 것으로부터 초래될 수 있다. 단백질의 순도는 실시예 3에 기재된 바대로 수행된 SDS 겔 전기영동에 의해 평가될 수 있다.
폴리펩티드는 당업계의 숙련된 기술자에게 공지된 방법에 따라 항체 TE4b 항체와 같은 고정화 항체 상에서 SBTI 친화성 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 실시예 4에 기재된 대로 정제할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 고순도는 폴리펩티드를 제약용 또는 화장용 조성물로 사용할 때, 유리할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 그 고순도로 인해 대부분의 목적에서 종래의 저순도의 폴리펩티드보다 적은 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 목적에서 순수한 폴리펩티드는 실시예 9에 기재된 대로 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 적합한 세포계로부터 수득될 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드의 각 아미노산의 연속적인 커플링을 이용하는 공지된 액상 또는 고상 펩티드 합성방법에 의해 제조될 수 있다. 별법으로 폴리펩티드는 이후 목적하는 폴리펩티드를 제조하기 위하여 폴리펩티드 서열의 단편이 커플링되는, 폴리펩티드 서열의 단편을 형성하는 각 아미노산의 커플링에 의해 제조될 수 있다. 이 방법들은 따라서 본 발명의 다른 흥미있는 목적을 구성한다.
본 발명의 매우 중요한 측면은 SCCE 황성을 가지는 폴리펩티드 및 제약 및/또는 화장학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물, 화장 조성물 또는 피부 보호용 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 본 발명의 재조합 폴리펩티드 또는 정제된 천연 단백질, 또는 단백질가수분해에 의해 활성화될 수 있는 본 발명의 폴리펩티드의 효소 전구체 또는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 효소 전구체 형태는 "약물 전구체", 즉 적합한 단백질 가수분해시 활성형으로 전환되는 화합물로서 간주될 수 있다.
특히, 본 발명은 배타적인 것은 아니나 국소용, 예를 들어 피부용으로 적합한 조성물에 관한 것이다.
국소 투여용으로 적합한 본 발명의 제약 조성물은 크림, 연고, 로션, 도포제, 겔, 용액, 현탁액, 페이스트, 스틱, 스프레이, 샴푸, 비누, 모발 컨디셔너 또는 분말일 수 있다.
국소 투여는 당해 병리학적 변화를 나타내는 신체의 일부상에 또는 그 부근에, 예를 들어 피부 표면과 같은 신체의 외부상에 투여될 수 있다. 도포는 조성물의 단순한 도포이거나, 또는 폐색 드레싱, 예를 들어 본 발명의 조성물이 제공하는 폐색 플라스터와 같은 병리학적 장애와 조성물관의 접촉의 확립을 향상시키기에 적합한 임의의 장치를 포함할 수 있다. 조성물은 패드, 플라스터, 스트립, 가즈, 스폰지 재료, 목화 조각등에 함침시키거나 또는 살포될 수 있다. 임의로는 장애위치 또는 그 부근으로의 조성물 주입형태를 사용할 수 있다.
본 발명에 따르는 국소 조성물은 제제의 전체 중량을 기준으로 1-80 중량%의 활성화합물, 예컨대 0.001-25 % w/w의 활성화합물, 예를 들어 0.1-10%, 0.5-5% 또는 2-5% 를 포함할 수 있다. 하나 이상의 활성화합물이 조성물에 혼입될 수 있다. 즉 다른 제약 및(또는) 화장 화합물과 배합된 상태로 SCCE, 프로-SCCE 또는 SCCE 저해제를 포함하는 조성물은 본 발명의 범위내에 있다. 이 조성물을 장애의 유형, 병의 심도 및 병소 국재화에 따라 1 일 1-10회 용이하게 사용한다.
국소 적용을 위해 제제는 국소 적용을 위해 통상 사용되는 제약 부형제와 함께 통상의 제약학적 관행에 따라 제조될 수 있다. 어떠한 특정 조성물 중 하나의제제에 사용된 부형제의 특성은 그 조성물의 투여 방법으로 의도된 방법에 의존할 것이다. 조성물에 사용될 수 있는 물 이외의 부형제는 연화제, 용제, 습윤제, 농후제 및 분말과 같은 고체 또는 액체를 포함할 수 있다. 단독으로 또는 하나 이상의 부형제의 혼합물로서 사용할 수 있는 이들 유형의 부형제 각각의 예는 다음과 같다:
스테아릴 알콜, 글리세릴 모노리신올레에이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 프로판-1,2-디올, 부탄-1,3-디올, 세틸 알콜, 이소프로필 이소스테아레이트, 스테아르산, 이소부틸 팔미테이트, 이소세틸 스테아레이트, 올레일 알콜, 이소프로필 라우레이트, 헥실 라우레이트, 데실 올레에이트, 옥타데칸-2-올, 이소세틸 알콜, 세틸 팔미테이트, 디메틸폴리실록산, 디-n-부틸 세바케이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 스테아레이트, 부틸 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리클, 라놀린, 카스토르유, 아세틸화 라놀린 알콜, 석유, 광유, 부틸 미리스테이트, 이소스테아르산, 팔미트산, 이소프로필 리놀레이트, 라우릴 락테이트, 미리스틸 락테이트, 데실 올레에이트, 미리스틸 미리스테이트와 같은 연화제;
물, 연화메틸렌, 이소프로판올, 카스토르유, 에틸렌글리콜 모노에틸에테르, 디에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르, 디에틸렌글리톨 모노에틸에테르, 디메틸 술폭시드, 테트라히드로푸란, 식물유 및 동물유, 글리세롤, 에탄올, 프로판올, 프로필렌글리콜 기타 글리콜 또는 알콜, 고정유와 같은 용제;
글리세린, 소르비톨, 2-피롤리돈-5-카르복실산 나트륨, 가용성 콜라겐, 디부틸 프탈레이트, 젤라틴과 같은 보습제 또는 습윤제;
초크. 활석, 카올린, 전분과 그 유도체, 고무, 콜로이드성 이산화규소, 폴리아크릴산 나트륨, 화학적 변형 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 수화 알루미늄 실리케이트, 카르복시비닐 중합체, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트와 같은 분말;
펙틴, 젤라틴과 그의 유도체, 셀룰로오스 유도체, 즉 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 산화 셀룰로오스, 셀룰로오스 고무, 구아르 고무, 아카시아 고무, 카라야 고무, 트래거캔트 고무, 벤토나이트, 한천, 알긴산염, 카르보메프, 젤라틴, 블래더랙(bladderwrack), 세라토니아, 덱스트란과 그의 유도체, 가티(ghatti) 고무, 헥토라이트, 이스파굴라 허스크, 크산탄 고무와 같은 겔화제 또는 팽창제;
폴리아세트산 또는 폴리글리콜산 중합체 또는 그의 공중합체, 파라핀, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 산화물, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈과 같은 중합체;
글리콜과 글리세롤 에스테르, 마크로골 에테르와 에스테르, 소르비탄 에스테르와 같은 슈거 에테르와 에스테르 등의 비-이온성 계면활성제, 아민 비누, 메탈릭 비누, 황화 지방족 알콜, 알킬에테르 황산염, 황화 오일 등의 이온성 계면활성제, 및 양쪽성 계면활성제와 레시틴과 같은 계면활성제;
나트륨, 칼륨, 알루미늄, 마그네슘 또는 칼슘염 (즉 염화물, 탄산염, 중탄산염, 시트레이트, 글루코네이트, 락테이트, 아세테이트, 글루셉테이트 또는 타르타레이트)과 같은 완충제.
국소 적용을 위해 조성물의 pH 는 3-9와 같이 매우 넓은 범위내에서 정해질수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드의 적합한 단백질가수분해 활성이 수득되는 pH는 예를 들어 약 4-8이 바람직하다. 상기에서 기술된 대로 통상의 완충제를 사용하여 목적하는 pH를 수득할 수 있다.
본 발명의 제제는 또한 다른 첨가물, 즉 안정화제, 방부제, 가용화제, 착색제, 킬레이트화제, 겔 형성제, 연고 베이스, pH-조절제, 항산화제, 향료 및 피부보호제 등을 포함할 수 있다. 만일 조성물이 샴푸 또는 비누의 형태라면, 조성물은 발포제, 펄링제(pearling agent) 및(또는) 컨디셔너를 추가로 포함할 수 있다.
전형적인 방부제는 파라벤, 포름알데히드, 카톤 CG, 브로니독스, 브로노폴, p-클로로-m-크레졸, 클로르헥시딘, 염화벤잘코늄 등을 포함한다.
통상의 성분들은 본 발명의 조성물이 샴푸나 비누 형태로 존재할 때 사용될 수 있고, 전형적인 비누 및 샴푸 베이스는 베타인, 라우릴황산 나트륨, 노닐페놀, 이미다졸, 술폰숙시네이트, 재유지화제(refattening agents), 습윤제 및 컨디셔너와 같은 성분을 포함한다.
또한 활성 화합물이 중합체 매트릭스, 나노입자, 리포솜 또는 미셀에 혼입되었거나 이온교환수지에 흡착되었거나 또는 중합체에 의해 운반되는 변형된 방출제제를 제공하는 것이 유리할 수 있다.
조성물은 통상의 제약 관행에 따라 제조될 수 있으며, 다음과 같을 수 있다:
반고형 제제: 겔, 페이스트, 혼합물.
액체 제제: 용액, 현탁액, 습윤제, 에멀션화제.
지시된 바와 같이, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명 자체의 폴리펩티드 또는 그의 관능성 유도체, 또는 이와 같은 화합물들의 조합물을 포함할 수 있다. 적합한 관능성 유도체의 예를 들면, 특히 피부 환경에 사용하기에 적합한 제약 허용가능한 염들을 포함한다. 예를 들면, 아미노 기능의 제약 허용가능한 염, 예를 들어 특히 피부 환경에서 제약학적으로 허용가능한 음이온을 생성할 수 있는 산을 사용하는 염을 포함한다. 예를 들면, 인산염, 황산염, 질산염, 요오드화물, 브롬화물, 염화물, 붕산염은 물론 아세테이트, 벤조에이트, 스테아레이트 등을 포함하는 카르복실산으로부터 유도된 음이온들을 포함한다.
아미노 기능의 다른 유도체는 아미드, 이미드, 우레아, 카르바메이트 등을 포함한다.
다른 적합한 유도체는 염, 에스테르 및 아미드를 포함하여 본 발명의 폴리펩티드의 카르복실기의 유도체를 포함한다. 예를 들면 제약적으로 허용가능한 양이온과의 염, 예를 들면 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 저급 (C1-6)-알킬암모늄염을 포함한다. 에스테르는 저급 알킬에스테르를 포함한다.
실시예 11의 조성물의 예는, 본 발명에 따라 제약 화장용 및 피부-보호용 제제의 예를 설명하고 있지만, 어떠한 방법으로도 본 발명의 조성물의 범위를 제한해서는 안된다.
천연 또는 재조합 SCCE를 포함하는 화장용 조성물 또는 피부 보호용 조성물은 좌창, 피부건조증 기타 각질증식 및 모공성 각화증 등의 각화증식증 상태에 대해 활성이 있는 것으로 생각된다. 심상성 좌창에는 상이한 단계가 존재한다. 염증좌창 장애가 우세한 특징을 보이는 단계에서 SCCE를 저해하는 물질을 투여하는 것이 유리할 지라도 면포형성을 유도하는 피지선관에서 케라틴화가 방해를 받는 단계에서 SCCE를 투여하는 것이 유용하다고 생각된다.
따라서, 본 발명의 일면은 좌창, 피부건조증 기타 각질증식 및 모공성 각화증 등의 각화증식증 상태의 치료 또는 예방을 위한 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
상술한 과학적인 발견을 근거로 하여, 천연 또는 재조합 SCCE을 포함하는 제약 조성물은 특히 국소적으로 사용할 때, 각화증세가 있는 각종 어린선, 좌창, 건선 기타 습진과 같은 염증성 피부병을 치료 및 예방하고, 미생물감염 및 상처 치유에 유용하다고 생각된다.
본 발명의 다른 목적은 습진과 같이 각화증이 있는 각종 어린선, 좌창, 건선 기타 염증성 피부병을 치료 및 예방하기 위한 제약 조성물 제조하기 위한 SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일면은 SCCE 활성을 가지는 폴리펩티드의 치료학적 또는 예방학적 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 습진과 같이 각화증이 있는 각종 어린선 좌창, 건선 기타 염증성 피부 질환을 치료 및(또는) 예방하는 방법에 관한 것이다. 치료는 예방적, 완화적 또는 치유적일 수 있다.
단백질가수분해 효소의 "계단식 시스템"이 플라스미노겐 활성제와 유사한 피부 환경에 존재한다고 생각된다. SCCE는 이 시스템의 최종 생성물중 하나인 것으로 생각된다. SCCE 활성은 "SCCE 저해제"에 의해 저해될 수 있는 것으로 생각된다.
자동면역 천포창 질병 또는 유극층위축성 질병, 즉 흔한 천포창 및 다리어 질병과 같은 많은 피부병에서, 비-각질화 생육 표피층의 케라티노사이트 사이에 손상된 응집력이 있다 (참조 : 생육 표피에서 세포 응집력의 손상). 이 과정은 단백질분해효소에 의해 조절되며, 따라서 천연 SCCE 효소활성을 저해할 수 있는 화합물을 투여함으로써 치료할 수 있다. 염증 성분이 우세한 특성인 상황인 건선 기타 염증성 피부병을 치료하기 위하여 SCCE 저해제를 투여하는 것이 유리할 수도 있다.
다른 일면에서, 본 발명은 흔한 천포창 및 다리어 질병과 같은 자가면역 천포창 질환 또는 유극성위축성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 천연 SCCE 의 효소활성에 저해 효과를 나타내는 SCCE 저해제의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서, "SCCE 저해제"란 용어는 SCCE 활성이 감소될 수 있도록 효소학적 활성 폴리펩티드 서열 또는 본 발명의 하부서열이나 그의 유사체와 상호작용할 수 있는 기존 또는 신규 화합물을 말한다. 감소는 저해제로서 잠재적인 SCCE 저해제를 사용하여 실시예 3.2 에 기재된 실험을 수행함으로써 측정할 수 있다. 상기 화합물은 유기 분자, 작은 펩티드 또는 거대 폴리펩티드 또는 상기의 것들중 하나의 유도체일 수 있다. 이와 같은 접근은 SCCE 저해제를 동정하기 위한 약물 스크리닝 프로그램에서의 용도를 찾아 볼 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 본 발명에 의한 재조합 폴리펩티드의 사용을 포함하는 천연 SCCE의 효소 활성에 대한 영향을 미치는 화합물의 동정방법에 관한 것이다.
특히 본 발명은 천연 SCCE의 효소 활성에 대한 저해 효과를 가지는 화합물의 동정방법에 관한 것이다.
다른 일면에서, 본 발명은 천연 또는 재조합 SCCE의 효소 활성을 향상시킬 수 있는 화합물의 동정방법에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드의 중요한 용도는 약물 스크리닝 분석에 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 약물스크리닝 시스템에서 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 사용을 포함하는 SCCE의 효소 전구체 형태를 활성 SCCE로 전환시킬 수 있는 화합물의 동정방법에 관한 것이다.
본 발명의 개념내에서 SCCE 폴리펩티드와 결합할 수 있는 물질의 고안에서의 사용, 특히 효소의 활성부위에 결합하는 약물 물질의 고안에서 사용하기 위한 SCCE 폴리펩티드의 입체 구조를 추론할 목적으로 상기에서 정의된 아미노산 서열의 용도가 포함되어 있다.
본 발명의 중요한 일면은 최종적으로 SCCE 폴리펩티드에 의해 발현되는 활성을 조절하는 여러가지 방법들이다. 이러한 활성은 상술한 여러가지 질환 상태에 있어서 중요한 관련이 있을 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 유사체에 해당하는 mRNA의 최소한 일부에 상보적인 DNA 또는 RNA 단편은 인간 세포에서의 SCCE mRNA의 번역을 저지하고, 이에 의해 폴리펩티드의 합성을 저해하는 데 효과적일 수 있다. 이러한 접근은 흔한 천포창 및 다리어 질병과 같은 자가면역 천포창 질환 또는 유극성위축성 질환에서 높은 SCCE 발현이 발견되는 질환 상태에서 중요할 수 있고, 이는 안티센스 올리고치료법으로서 보다 잘 알려져 있으며, 따라서 본 발명은 이러한 접근법을 포함한다.
도면에 대한 설명
도 1. 시험관내에서 족저 각질층으로부터 박리하는 단극세포. 생체내에서 외부로 향한 조직 표면은 도면에서 윗쪽이다. 배양 중 상기 표면에서 진행성 세포 해리현상이 있지만, 다른 세포 표면에서는 세포 해리가 없었음을 주목한다.
도 2. 아프로티닌 부재 () 및 존재 () 상태에서 배양한 족저 각질층으로부터의 세포 방출에 대한 아프로티닌의 효과 및 시간 경과. 평균 (4 개의 조직편에 대한 누적치) 및 범위가 주어져 있다.
도 3. 응집성 족저 각질층 및 해리된 세포에서의 항-데스모글레인 (항-DG I) 반응성 성분. A. 쿠바시 블루-염색된 SDS-PAGE B. 면역블롯. 1-3: 응집성 조직, 원액(1), 희석 1/3 (2), 희석 1/9 (3). 4-5: 해리된 세포, 원액 (4), 희석 1/3 (5). 유집성 조직에서 Mr 160 KD를 가진 유일한 외관상 완전한 DG I, 및 해리된 세포에서 Mr 95 및 80 KD를 가진 DG I의 유일한 분해 산물임에 주의한다.
도 4. 시험관내에서 세포 박리가 일어나는 족저 각질층에서의 데스모글레인 I (DG I)의 분해에 대한 아프로티닌의 효과 및 시간 경과. 아프로티닌 (15)의 부재(A) 및 존재(B)하에 배양한 족저 각질층 추출물의 면역블롯의 농도계 검사법, 160 kD에서의 피크가 완전한 DG I에 해당한다. 95 및 80 kD에서의 피크가 상기 단백질의 분해 생성물에 해당한다 (도 3 참조). DG I의 분해에 대한 아프로티닌에 의한 효과적 저해를 주의한다.
도 5. 시험관내에서 세포 박기 중 족저 각질층에서의 데스모글레인 I (DG I)의 분해에 대한 아연 이온(A), 키모트립신 및 류펩틴(B)의 효과. 류펩틴을 제외한 아연 이온과 키모트립신에 의해 160 kD 에서 95 및 80 kD까지의 항-DG I 양성 성분들의 변화 저해를 주의한다.
도 6. 족저 각질층 세포과 관련된 펩티드 가수분해 활성. 두 기질의 가수분해는 405 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 추적하였다. 3조의 배양 평균.= S-2586;= S-2288.
도 7. 각질세포-연관된 S-2586 가수분해 활성의 pH-의존도. 3조의 배양 평균.= 아세트산 나트륨,= 인산 나트륨,= 트리스-HCl
도 8. 해리된 족저 각질층 세포의 추출물에서의 카제인분해 활성을 보여주는 효소 그래피. 실험의 상세한 기술에 관해서는 실시예 2.2이하의 텍스트를 참조할 것.
A : 소의 키모트립신 0.125 ng (c) 및 소의 트립신 0.5 ng (t)을 사용하고 환원제(sc/s) 및 KCl (sc/k)을 사용하지 않고, 램리(Laemmli) 시료 완충액을 사용하여 w족저 각질세포로부터 추출한 효소의 비교. 전기영동하기 전에 KCl 추출물을 5 mM 트리스-HCl, pH 6.8에 대해 투석하고, SDS 및 글리세롤을 가하여 시료 완충액에서 최종 농도를 제조하였다; 10 ㎕ 를 모든 레인에 넣었다. 분자량 표지는 왼쪽에 있음.
B : 배양 완충액 중에서 pH에 대한 의존도. 효소 공급원 = 해리된 족저 각질세포의 SDS-추출물. 트리톤 X-100 으로 전처리하고 배양하기 위한 완충액 : 0.1 M아세트산 나트륨 (pH 4.0 및 pH 5.5), 및 0.1 M 트리스-HCl (pH 7.0 및 pH 8.0). 다른 조건은 A 와 같다.
C : 저해제의 효과. sc = 족저 각질세포의 SDS-추출물: C =소의 키모트립신: t = 소의 트립신. 저해제는 트리톤 X-100 을 사용하여 전처리 및 이후의 배양 중에 존재하였다. 최종 농도는 류펩틴이 160, 아프로티닌이 160, 키모스타틴이 40이고 아연 이온 (황산염으로서) 100이었다. 류펩틴과 키모트립신을 디메틸술폭시드(DMSO)중에 용액으로서 가하였다. 전처리 및 배양용 완충액(DMSO 최종농도 1% (v/v) 사용)은 0.1 M 트리스-HCl pH 8이었다. 다른 조건은 A와 같다.
도 9. 저해제 효과(A: 아프로티닌, B: 키모스타틴, C: 황산 아연) 및 기질 특이성(D)에 관해서 SCCE, 소의 키모트립신, 및 인간 카텝신 G 의 비교. A-C: 저해제가 없는 효소 활성을 100% 로 표준화. D: MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA 서열을 가진 효소 활성을 임의의 단위체 1로 표준화.
도 10. 공유결합된 대두 트립신 저해제(SBTI) 상에서의 친화성 크로마토그래피. 점선 : 280 nm 에서의 흡광도, 용리액의 단백질 농도를 나타냄.: 기질로서 S-2586을 사용한 펩티드 가수분해 활성, 405 nm에서의 흡광도 변화로 주어짐.: 기질로서 S-2288을 사용한 펩티드 가수분해 활성, 405 nm에서의 흡광도 변화에 10배를 곱한 값으로 주어짐.
도 11. 도 10에 나타낸 크로마토그램으로부터 분획 2,6 및 10의 공중합화된 카제인과 함께 SDS-PAGE 한후 자이모그래피(B) 및 SDS-PAGE 와 쿠마시블루-염색(A). 분자량 표시는 왼쪽에 있음. B 1: 류펩틴(160)에 의해 저해될 수 있는 카제인 분해성 성분들의 군. c: 키모스타틴(40)에 의해 저해될 수 있는 카제인분해성 성분들의 군.
도 12. SBTI-친화성겔 15 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 SCCE 의 SDS-PAGE. 12.5% 겔. 1: 비환원 시료 2: 환원 시료. 분자량 표지는 왼쪽에 있음.
도 13. SCCE 의 N-말단 아미노산 서열. 별표는 위치 7 과 9에 추정된 시스틴에 대한 불확정성을 표시한다. 물음표는 다음 단계에서 수율이 감소되지 않았음을 제외하고 어떠한 아미노산 유도체도 탐지할 수 없는 위치를 표시한다.
도 14. 면역침전법 및 면역블로팅에 의한 모노클론 항체 TE4b 및 TE9b의 특성 분석.
a: 쿠마시-염색된 12.5 % SDS-PAGE, 비환원 조건.
레인 1 : 분자량 표지.
레인 2 : 실시예 3.1 에 기술된 대로 제조한 해리된 족저 각직세포의 KCl-추출물.
레인 3 : 실시예 4.1에 기술된 대로 불용성 대두 트립신 저해제에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 SCCE.
b: 0.1% 공중합 가열 변성된 카제인과 함께 한 12.5% SDS-PAGE에서의 면역침전물의 자이모그래피, 쿠마시 염색된 겔.
레인 1 : 분자량 표지.
레인 2 : a 에서 투석된 KCl-추출물.
레인 3-6 : moAb TE4b (20 ㎍), moAb TE9b (10 ㎍), moAb PZ (10 ㎍) 및 인산염 완충 염수로 (좌에서 우로) 가용화된 면역침전물. moAb PZ는 임신 대역 단백질에 대한 IgGl-카파형의 마우스의 모노클론 항체로, 관련없는 음성 대조구으로 사용되었다.
c: 12.5% SDS-PAGE (비환원 조건)로부터의 면역블롯.
레인 1 : 알칼리성 인산염-결합된 아비딘(바이오래드(BioRad)사)로 탐지된 바이오 티닐화된 분자량 표지. 레인 2,4 및 6 의 전기영동 시료는 2 의 레인 2 과 같고, 레인 3,5 및 7 에서는 a의 레인 3 과 같다.
레인 2 및 3 : 제1 항체 = moAb TE4b, 0.2 ㎍/㎖.
레인 4 및 5 : 제1 항체 = moAb TE9b, 0.1 ㎍/㎖.
레인 6 및 7 : 제1 항체 = moAb PZ, 0.1 ㎍/㎖.
a-c에서 화살표는 각각 상대적인 분자량 (위에서 아래로) 93, 66, 45, 31, 22 및 14 kD를 나타낸다.
도 15. 도15는 플라스미드 ps500을 나타낸다. 이 플라스미드는 pUC19에 클론된 전장 인간 SCCE cDNA를 포함한다. 상세한 내용은 실시예 6을 참조할 것.
도 16. 인간 표피로부터 제조된 mRNA를 사용한 노던 블롯. 약 100 g의 전체 RNA 양에 상응하는 폴리-T-정제 RNA를 각 레인에서 사용하였다. 1: SCCE-cDNA의 1070bp Hinc 2/Hinc 2 단편으로부터 제조한 프로브를 이응하여 수행된 혼성화. 2:SCCE-cDNA 의 655 bp Hinc 2/Bgl 2 단편으로부터 제조한 프로브를 이용하여 수행된 혼성화.
도 17.
a: 쿠마시-염색된 SDS-PAGE, 12.5% 겔. 1 및 2 pS510 및 pS511 로 각각 형질전환시키고, IPTG 로 유도한 초음파 처리한 TG 2 세포의 PBS-트리톤 X-100 불용성 펠렛. 3 : 인간 족저 각질층에서 정제한 SCCE.
b: 닭의 예비-면역혈청(1-3) 및 닭의 항-SCCE(4-6)을 사용한 면역블롯. 1 및 4 : pS510로 형질전환시키고 IPTG로 유도한 TG 2-세포. 2 및 5 : pS511로 형질전환시키고 IPTG로 유도한 TG 2-세포. 3 및 6 : 인간 족저 각질층에서 정제한 SCCE, 멀캅토에탄올을 사용하여 시료 완충액을 비등시킴으로써 시료를 제조하였다.
도 18. 도 18은 실시예 9에 기술된 대로 구성된 발현 벡터 pS507의 원형 지도를 나타낸다. 벡터 pS507은 포유동물 세포에서 재조합 인간 SCCE의 발현을 매개한다.
도 19. 도19는 포유동물 세포에서 pS507 의 재조합 인간 SCCE 유전자의 발현을 분석한 것이다.
레인 1 : C127 세포 유래의 RNA.
레인 2 : pS507로 트랜스펙션된 C127 세포의 단리된 클론 1:24의 RNA.
레인 3 : pS507로 트랜스펙션된 C127 클론들의 개체 혼합물의 RNA.
레인 4 및 5 : SCCE cDNA 서열이 결여된 것을 제외하고는 pS507과 동일한 발현 벡터 pS147로 트랜스펙션된 C127 세포의 RNA. 크기 표지는 왼쪽과 동일하다.
도 20.
C127 세포에서 발현된 SCCE의 면역블로팅을 수반하는 SDS-PAGE.
레인 1 과 6 : 사전 염색된 분자량 표지 (바이오-래드, 106, 80, 49.5, 32.5, 27.5 및 18.5 kDa)
레인 2 : pS507/C127, 혼합, T-플라스크
레인 3 : pS507/C127, 혼합, 롤러 A
레인 4 : pS507/C127, 혼합, 롤러 B
레인 5 : 음성 대조구 pS507/C127
레인 7 : 각질층에서 준비된 음성 SCCE
레인 8 : pS507/C127, 클론 24, T-플라스크
레인 9 : pS507/C127, 클론 24, 롤러 A
레인 10 : pS507/C127, 클론 24, 롤러 B
도 21. 플라스미드 pS507를 포함하는 세포와 함께 C127 세포배양 배지로부터 정제한 재조합 SCCE의 SDS-PAGE (A) 및 면역블로팅 (B).
레인 1 과 6 : 사전 염색된 분자량 표지 (바이오-래드, 106, 80, 49.5, 32.5, 27.5 및 18.5 kDa)
레인 2 : 정제 이전의 세포배지
레인 3 : 크로마토그래피로부터 회수한 결합되지 않은 물질.
레인 4 : 낮은 pH 완충액으로 용리한 결합된 물질.
제 22 도 : 카제인 폴리아크릴아미드 겔상에서의 활성에 대해 분석한 천연SCCE 및 활성화 재조합 SCCE.
레인 1 과 10 : 분자량 표지 (파마시아(Pharmacia)사 14-94 kDa)
레인 2 : 천연 SCCE.
레인 3 : 천연 SCCE.
레인 4-6 : 각각 1 시간, 3 시간 및 밤새 절단시킨 재조합 SCCE, (460 ng/웰)
레인 7 : APMSF 의 부재하에 레인 4-6 에서의 시료와 동일한 양의 트립신.
레인 8 : 시료에서와 동일한 양의 APMSF 의 존재하에 레인 4-6 에서의 시료와 동일한 양의 트립신.
레인 9 : 레인 3 과 동일함.
도 23. 천연 및 재조합 SCCE 으로 처리한 N-글리코시다제 F?의 면역블롯. 시료를 8-18% SDS-PAGE 상에서 분리하고 상기와 마찬가지로 면역블롯하였다.
레인 1 : 분자량 표지. 위로부터 분자량 : 106, 80, 49.5, 32.5, 27.5 및 18.5 kDa.
레인 2 와 3 : 각각 재조합 SCCE 0.3 과 3 ㎍.
레인 4 와 5 : 각각 천연 SCCE 1.5 와 1.8 ㎍.
레인 3 과 5의 시료를 N-글리코시다제 F?로 처리하였다.
실시예
실시예 1
피부의 각질화된 표면층으로부터의 세포 박리는 교소체 단백질의 분해를 포함하며, 이을 담당한느 효소가 아연 이온에 의해 저해될 수 있는 키모트립신-유사 세린 단백질 분해효소인 것 같다는 증거
1.1 각질층에서의 낙설
본 연구의 목적은 피부의 각질화된 층, 각질층에서의 세포 응집 및 표면세포 분해 (낙설)에 관여하는 메카니즘 특성을 밝히는 것이다. 정상 피부를 갖고 있는 지원자의 족저 아래로부터 두께가 0.3 내지 0.6 mm인 각질층의 박편을 피부 표면에 평행하게 절단하였다. 조직 단편을 0.1% 나트륨 아지드를 갖는 인산염 완충 염수중에 실온에서 3시간 동안 침지시킨 다음, 생체내에서 외부로 면하고 있는 표면으로부터 느슨하게 접착되어있는 세포를 긁어내었다. 조직 표면에 대해 수직으로 절단된 1 mm 두께 단편을 pH 8인 0.1M 트리스 HCl, 5 mM EDTA 0.1% 나트륨 아지드, 및 0.45% 아가로스를 함유하는 배지중에 놓았다 (아가로스의 존재에 기인하여 배지는 겔화되기 직전임). 37℃에서 0, 5 및 15 시간 배양시킨 후, 조직과 함께 겔 단편을 드라이 아이스상에서 동결시켰다. 동결절편기에서 20㎛ 동결절편기 절편을 피부 표면에 대해 수직으로 절단하여, 상 대비 현미경에 걸어 검사하였다. 시험관내에서 배양된 족저 각질층의 단편으로부터의 세포의 연속적인 단극 박리가 관측되었다 (도 1). 세포는 생체내에서 외부로 면한 조직 표면으로부터만 박리되었다. 관측된 과정은 낙설을 의태한 것이었다.
1.2 온도, pH, 및 효소 저해제의 효과
세포 박리의 정량 방법이 개발되었는데, 이는 온도, pH, 및 효소 저해제와같은 여러가지 인자의 효과에 대한 연구를 가능케 하였다. 직경이 3 mm인 족저 각질층의 원통형을 조직의 단편으로부터 생검 펀치로 채취하여 상기 1.1에 기술한 바와 같이 느슨하게 부착된 표면 세포를 없앴다. 상기 원통형 (생체내에서 외부로 면한 표면의 구획된 면적을 가짐)을 1.5 ml 에펜도르프 튜브 중에 아프로티닌(4x10-6mol/l) (독일, 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)사)을 함유하거나 함유하지 않는, 0.1M 트리스 HCl pH 8, 5 mM EDTA, 0.1% 소듐 아지드를 함유하는 배지 0.5 ml중에 37℃에서 5, 10 및 20시간 동안 배양한 다음 볼텍스 혼합기상에서 10초간 교반시켜 분리된 표면 세포를 방출시켰다. 나머지 조직은 회수하여 연속 배양을 위하여 신선한 배지중에 넣었다. 방출된 세포를 갖는 튜브를 5000g에서 2분간 원심분리시켜 세포를 수거하였다. 세포 펠릿을 인산염 완충 염수 0.5 ml로 한 번 세척한 다음 60℃에서 1.5 시간 동안 1M 수산화 나트륨 0.6 ml로 처리하였다. 알칼리 가용성 단백질을 로오리(Lowry et al., 1951)법에 따라서 정량하고, 방출된 세포의 양의 측정치로서 취하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.
유사한 방법으로, 여러가지 잠재적 저해제 (아프로티닌, 대두 트립신 저해제, 펩스타틴 (독일 베링거만하임사) 및 요오도아세트아미드 (미주리주 세인트루이스 소재, 시그마(Sigma)사)의 효과를 시험하였다. 단일 2 mm 조직 실린더를 준비하고 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 농도로 여러가지 잠재적 저해제를 함유하거나 함유하지 않는 배지중에서 16시간 동안 37℃에서 배양하고. 방출된 세포를 상술한 바와 같이 정량하였다. 최적의 세포 방출 속도를 제공하기 위해 EDTA (이는 메탈로단백질 분해효소의 저해제임)가 배양 배지중에 포함되어 있음을 주의해야 한다.
표 1
시험관내에서 족저 각질층으로부터의 세포 방출에 대한 단백질 분해효소 저해제의 효과
5개의 배양된 조직 단편에 대한 평균 및 SD
세린 단백질 분해효소 저해제인 아프로티닌 및 대두 트립신 저해제가 세포박리를 효율적으로 저해함을 발견하였다 (도 2 및 상기 표 1). 이들 2종의 물질은 저해하지만, 메탈로단백질 분해효소 (EDTA), 티올 단백질 분해효소 (요오도아세트아미드), 및 아스파르트산 단백질 분해효소 (펩스타틴)의 저해제는 저해하지 않기때문에, 세린 단백질 분해효소가 관측된 과정에 관여하는 것으로 결론지었다. 또한 각질층에서의 세포 응집은 단백질 구조에 따르며 관측된 시험관내 시험과 유사한 메카니즘은 생체내 낙설중에도 작용하여야 하는 것으로 결론지었다 (Lundstrom and Egelrud, 1988).
족저 각질층으로부터 시험관내 세포 박리의 추가 연구로 상기 공정이 2개의 별개의 단계로 분리될 수 있음을 알게되었다. 제1단계는 EDTA의 배양 배지중 존재 여부에 관계없이 일어난다. 제2단계는 EDTA가 존재하는 경우에만 일어난다. 제1단계는 아프로티닌 이외에, 키모스타틴 및 아연 이온에 의해 억제될 수 있었다.제2단계는 아프로티닌 및 키모스타틴에 의해서 억제될 수 있었다(Lundstrom and Egelrud 1990 a). 키모스타틴은 키모트립신-유사 기질 특이성을 갖는 단백질 분해효소의 저분자량 저해제이다. 또한, 트립신-유사 기질 특이성을 갖는 단백질 분해효소의 저분자량 저해제인 류펩틴은 시험관내 세포 박리에 대해 효과가 없는 것으로 밝혀졌다 (Lundstrom and Egelrud 1990a).
대부분 각질층에서 세포 응집에 관여하며 따라서 상술한 바와 같은 낙설-유사 세포 박리중 퇴화될 경우 가능한 후보 물질일 수 있는 단백질 구조물은 교소체이다. 교소체는 2개의 대칭형 반구로 이루어져 있는데, 이는 인접하는 세포중에 위치하고 있다. 상기 2개의 반구는 데스모글레인이라 명명된 막간 단백질에 의해 세포외 공간에 연결되어 있다.
1.3 시험관내 세포 박리중 데스모글레인 I (DG I)의 종말
족저 각질층으로부터 시험관내 세포 박리중 데스모글레인 I (DG I)의 종말을 연구하였다. 족저 각질층을 상기 1.1에 기술한 바와 같인 배양하고, 여전히 응집성인 조직을 분해된 세포로부터 분리시켰다. 세포 및 조직을 0.1M 트리스 HCl pH 9, 9M 우레아, 2% 소윰 도데실술페이트, 1% 멀캅토에탄올을 함유하는 완충액 중에서 조직 20 mg 당 완충액 1 ml의 비율로 15 시간 동안 37℃에서 추출하였다. 상기 추출물을 램리 (Laemmli, 1970)의 방법에 따라서 나트륨 도데실술페이트의 존재하에 7.5% 겔중에서의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)용으로 준비한 다음, 니트로셀룰로오즈 막 (캘리포니아주 리치몬드 소재 바이오-래드(Bio-Rad)사)으로 전기영동에 의해 이동시키는데 (Towbin et al., 1979), 니트로셀룰로오즈 막은 소의 비구부로부터 정제된 DG I에 대해 제조된 토끼의 폴리클론 항혈청으로 프로브하였다 (고브스키(Gorbsky) 등, 1985). 결합된 항체는 알칼리성 포스파타제 결합된 염소 항-토끼 면역글로블린으로 검출하였다 (캘리포니아주 리치몬드 소재 바이오-래드) (Blake et al. 1984).
결과를 도 3에 나타낸다. 면역블롯에 가한 시료의 양을 조절하여 응집성 조직 및 분해된 세포에 대해 대략 동일한 단백질 농도 (쿠오마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔의 가시적 검사에 의해 평가된 바와 같음)를 제공하였다. 응집성 각질층 및 분해된 세포중 상이한 항-DG I 반응성 성분양의 반-정량적 비교가 가능하도록 상기 추출물을 수 개의 희석물로 실험하였다.
여전히 응집성인 조직 및 분해된 세포를 각각 추출하는 경우, 여전히 응집성인 조직이 명백하게 천연 DG I만을 함유하는 반면, 분해된 표면 세포는 상기 단백질의 추정적인 분해 단백질만을 함유하는 것으로 밝혀졌다 (도 3).
도 4 및 도 5에는 족저 각질층으로부터 시험관내 세포 박리중 DG I 분해에 대한 아프로티닌, 아연 이온, 키모스타틴 (독일 베링거만하임사) 및 류펩틴 (독일 베링거 만하임사)의 효과를 나타낸다.
먼저, 시험관내 세포 박리가 일어나는 족저 각질층에서의 데스모글레인 I(DG I)의 분해에 대한 시간 경과 및 아프로티닌의 효과를 조사하였다. 족저 각질층의 추출물을 상기 1.2에 기술한 바와 같이 아프로티닌 (15)의 존재 또는 부재하에서 배양하고 (이때 추출전 분해된 세포로부터 응집성 조직은 분리하지 않음)0, 6, 12 또는 24시간후 추출하였다. SDS-PAGE 및 면역블로팅을 상기한 바와 같이 수행하였다. 면역블롯의 농도계 스캐닝을 지그재그 형태로 560 nm의 반사광을 사용하여 쉬마주 (Shimadzu) CS-9000 플라잉 스포트 스캐너 (일본 쿄토 소재 쉬마주사) 중에서 수행하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. DG I의 분해에 대한 아프로티닌에 의한 효율적인 저해를 알 수 있다.
이후, 세포 박리중 족저 각질층에서의 데스모글레인 I (DG I)의 분해에 대한 아연 이온, 키모스타틴 및 류펩틴의 효과를 조사하였다. 실험 고안은 상기한 바와 같았다. 배양은 0, 1 또는 5 mM 농도의 황산 아연, 및 330농도의 키모스타틴 또는 류펩틴과 함께 24시간 동안 수행하였다. 결과는 160 kD 내지 95 kD 및 80 kD로부터 항-DG I 포지티브 성분의 아연 이온 및 키모스타틴에 의한 형질전환 저해를 나타내지만, 류펩틴에 의한 저해는 나타나지 않았다.
이들 결과로부터 아프로티닌, 아연 이온, 및 키모스타틴은 저해제이지만, 류펩틴은 저해제가 아님이 명백하다. 따라서 DG I의 분해에 대한 저해 프로필은 시험관내 족저 각질층으로부터의 세포 박리에 대한 것과 동일하다 (Lundstrom and Egelrud 1990 b).
수장-족저 각질층으로부터의 세포 박리에 관여하는 것과 유사한 메카니즘이 수장과 발바닥을 제외한 다른 신체 부위로부터의 피부의 각질층에도 존재함을 입증하는 것이 중요한 것으로 인식되었다. 다까하시 (Takahashi et al. 1987)는 8:2 몰비의 세제 N,N-디메틸도데실아민 옥사이드 (미주리주 세인트 루이스 소재 시그마사) 및 소듐 도데실술페이트 (캘리포니아 리치몬드 소재 바이오-래드사)의 혼합물이, 전체 표피의 트립신화에 의해 제조한 비-수장족저 각질층에서 세포 분해를 일으킨다고 보고하였다. 외래 트립신에 의한 오염을 피하기 위하여 정상인의 둔부 피부를 펀치로 생검하여 상기 언급한 세제 혼합물 및 EDTA와 함께 pH 8에서 배양하였다 (Egelrud and Lundstrom 1990). 이들 조건하에서 각질화된 충은 단일 세포로 분해되는 것으로 밝혀졌다. 배양 배지에 아프로티닌을 가하여 상기 세포 분해를 방지하였다. 비-수장족저 각질층에서 세포 응집은 단백질 구조에 따르며, 상기 조직중에서의 낙설은 단백질 분해에 따르고, 상기 조직은 상기 단백질분해를 촉매할 수 있는 단백질 분해효소를 함유하는 것으로 결론지었다. 세포 분해가 단지 각질층만을 포함할 뿐 심층의, 각질화되지 않은 표피층은 포함하지 않기 때문에, 관련 단백질 분해효소는 심부층 중에 불활성화 또는 저해된 상태로 존재하는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 2
각질층 키모트립신 효소 (SCCE): 시험관내 및 잠재적으로는 생체내에서도 각질층내의 세포내 응집 구조의 분해를 일으킨다는 기준을 만족하는 단백질 분해 효소의 발견
실시예 1에서 서술한 실험으로부터, 족저 각질층에서의 박리의 시험관내 모델에서 단극성 표면 세포 해리를 일으키는 단백질 분해 효소는 다음 성질을 가져야 하는 것으로 추론되었다.
1. 각질층 내에 존재해야 한다.
2. 세린 단백질 분해 효소여야 한다.
3. 키모트립신과 유사한 기질 특이성과, 시험관내 세포 탈락 및 관련된 데스모글레인 I의 분해의 경우에 관찰되는 것과 유사한 저해제 프로필을 가져야 한다.
4. 각질층에서 세포외에 편재해야 한다.
5. 각질층의 pH가 4.5-6 정도인데 생리적 조건 하에서 활성을 띨 수 있는 pH 의존성을 가져야 한다.
6. 시험관내 실험에서, 족저 각질층으로부터의 세포 탈락은 배양 매질의 부피가 배양되는 조직편의 부피에 비해 아주 크거나 배양 도중에 배양 매질이 반복적으로 교환되더라도 배양시간이 장기화되면 지속적으로 일어나므로 이를 유발하는 효소는 배양시 배양 매질 내로 추출될 수 없는 방식으로 조직에 결합된 것이라고가정하는 것이 타당하다.
다음의 두 가지 실험으로 SCCE를 발견하게 되었다 (Egelrud & Lundstrom, 1991):
2.1 해리된 족저 각질세포와 관련된 효소 활성
족저 각질층을 실시예 1에서 기술한 바와 같이 배양하여 해리된 족저 각질층 세포 (각질세포)를 준비하였다. 세포를 100메쉬 크기의 나일론 망으로 여과한 다음 10 부피의 0.1 M 트리스-염산 pH 8, 5 mM EDTA로 3 회 및 0.1 M 트리스-염산 pH 8로 3 회 세척하였다. 이어서 세포를 2 종류의 색소원성 단백질 분해 효소 기질 S-2288 또는 S-2586 (스웨덴 스톡홀름 소재 카비 다이아그노스티카(Kabi Diagnostica)사 제품)과 함께 배양하였다. Ile-Pro-Arg-p-니트로아닐리드(S-2288)는 아르기닌 특이성을 가진 광범위한 세린 단백질 분해 효소 (예, 트립신)에 의해 절단된다. Arg-Pro-Tyr-p-니트로아닐리드 (S-2586)는 키모트립신형 단백질 분해 효소의 기질이다.
각 반응 혼합물 총 120에는 0.07 M 트리스-염산 pH 8, 0.1% 소듐 아지드, 1, 2.5, 5 또는 10의 세척된 족저 각질세포 25% 현탁액 및 1.04 mM(S-2586) 또는 1.25 mM (S-2288) 기질이 함유되어 있다. 마이크로타이터 플레이트에서, 37℃, 5 시간 배양한 후 10% 아세트산 125를 가하여 반응을 중지시켰다. 세포가 침강되도록 하고 각 상징액 200를 새로운 웰로 옮겼다. 베링 엘리자 프로세서 (Behring Elisa Processor) (독일 마르부르크 소재 베링베르크(Behringwerke)사 제품)에서 세포를 제거한 후 405 nm에서의 흡광도 변화를 측정함으로써 두 가지 기질의 가수분해를 추적하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이 S-2586의 가수분해를 촉매하는, 해리된 족저 각질세포와 관련된 효소 활성이 있었다. 대조적으로, S-2288에 대한 활성은 낮았다.
다음으로 S-2586 가수분해 활성의 pH 의존성을 조사하였다. 실험의 고안은 상기한 바와 같으며 세척된 족저 각질세포 25% 현탁액 10및 다양한 pH의 완충액 (아세트산나트륨, 인산나트륨 또는 트리스-염산)을 사용하였다. 최종 완충액 농도는 0.07 M이었다. 결과는 제7도에 나타내었는데, 여기에 의하면 활성이 pH 7-8에서 최적이지만 pH 5.5에서도 상당한 것으로 보인다.
추가 실험에서, 현탁된 족저 각질층 세포와 관련된 단백질 분해 효소에 의한 pH 8에서 S-2586의 가수분해에 대한 EDTA, 금속 이온 및 단백질 분해 효소 저해제의 영향을 조사하였다. 실험의 고안은 상기한 바 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
표 2
족저 각질층 세포와 관련된 단백질 분해 효소에 의한 S-2586의 가수분해에대한 EDTA, 금속 이온 및 단백질 분해 효소 저해제의 영향 (효소원: 현탁된 세포)
a 분석 혼합물 중에 존재하는 물질
b 본문에 기재된 바와 같이 제조된 족저 각질층 세포의 25% 현탁액을 mM PMSF (미국 세인트루이스 소재 시그마사 제품) 존재 하에 2-프로판올 (2-프로판올의 최종 농도 4% v/v)에 용해시키고 1 실온에서 1 시간 예비배양하였다. 대조용은 4% 2-프로판올만을 가하여 예비배양하였다.
c 디메틸 술폭사이드 (DMSO)에 용해시킨 저해제, 대조용을 포함하여 모든 배지는 5% (v/v) DMSO를 함유함.
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 류펩틴 (트립신 저해제)을 제외하고 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF; 세린 단백질 분해 효소의 보편적인 저해제), 아프로티닌, 대두 트립신 저해제, 키모스타틴 (키모트립신 저해제) 및 아연 이온은 S-2586 가수분해 활성을 억제하였다. 이 저해제 프로필은 따라서 시험관내 세포 탈락 및 관련 데스모글레인 I의 분해에서 관찰된 것과 아주 유사하다.
2.2 해리된 족저 각질층의 자이모그래피 (zymography)
상기 2.1에서 발견된 S-2586 가수분해 글성을 보이는 효소는 각질세포를 0.1 M 트리스-염산 pH 8 중의 1 M KCl로 추출하면 가용화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 자이모그래피를 통한 실험을 행하였다. 이 때문에 램리의 문헌[Laemmli, 1970]에 따른 전기영동을 위해 각질세포의 KCl 추출물을 준비하였으나, 단 샘플 완충액 중에 환원제는 가하지 않았으며 시료를 가열하지도 않았다. 또한 해리된 족저 각질세포를 실온에서 환원제가 없는 램리 샘플 완충액으로 추출하는 것으로도 시료를 준비하였다. 자이모그래피에는 호리 등[Horie 등, 1984]의 방법을 변형하여 적용하였다. 소를 도데실설페이트 존재 하의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 램리의 문헌에 따라 1%의 공중합시킨 열변성 카제인을 함유한 12.5% 겔에서 행하였다. 전기영동 후 겔을 실온에서 2% Triton X-100을 함유한 완충액에 1 시간 동안 침지시켜 SDS를 제거한 다음 37℃에서 15 시간 동안 배양하였다. 다음으로 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. 분리된 카제인 분해성 효소는 푸른 배경에 대해 투명한 밴드로 나타났다. 실험의 상세한 사항은 도 8의 설명을 참조한다.
결과를 도 847 나타내었다. 족저 각질세포의 추출물은 겉보기 분자량이 25 kD 정도인 하나의 주된 카제인 분해성 효소를 함유하였다. 분자량이 30 kD 정도인 부차적인 카제인 분해성 효소도 있었다 (이들 부차적인 성분은 도면에 명확히 나타나지 않는다. 후에 이들이 류펩틴에 의해서는 억제될 수 있으나 키모스타틴에 의해서는 억제되지 않는 것으로 밝혀졌다). 상기 25 kD 효소는 pH 5.5-8에서 상당한 활성을 나타내었다. 이것은 아프로티닌, 아연 이온 및 키모스타틴에 의해 억제되었으나 류펩틴에 의해서는 억제되지 않았다. 따라서 이 효소는 상기한 S-2586 가수분해 활성과 동일한 저해제 프로필을 보인다. 겔 배제 크로마토그래피를 통한 실험 (도시되지 않음)에서 이 25 kD 카제인 분해성 효소는 S-2586 가수분해 활성과 함께 크로마토그래피되는 것으로 나타났다.
상기 2.2에 기술한 바와 동일한 기술을 사용한 추가 실험 (도시되지 않음)에서 비수장족저 각질층은 족저 각질세포와 관련된, 이후 각질층 키모트립신 효소(SCCE)로 불리는 25 kD 단백질 분해 효소의 성질과 동일하게 보이는 성질을 가진 효소를 함유한다는 것이 밝혀졌다. 문헌[Lundstrom & Egelrud, 1991] 참조.
또한 SCCE가 각질층 세포외간에서 활성이 되도록 하는 방식으로 족저 각질세포와 관련되어 있다는 증거를 얻을 수 있었다. 이것은 먼저 해리된 각질세포가 고추냉이 과산화효소 (Mr 44 kD)에 대해 불투과성이라는 것을 증명함으로써 이루어졌다. 다음에는 인간의 피브리노겐 (Mr 340 kD)이 각질세포의 현택액에 의해 분해될 수 있으며, 이 분해는 SCCE에서와 동일한 저해제에 의해 저해될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 피브리노겐의 분해가 가용화된 효소에 의한 것이라는 가정은 배제할 수 있다 (Egelrud, 1992).
실시예 3
각질층 키모트립신 효소 (SCCE)의 부분 정제 및 색소원성 기질을 사용한 단백질 분해 효소 분석
3.1 족저 각질세포의 KCl 추출물의 제조
실시예 1에 나타낸 바와 같은 해리된 족저 각질세포의 제조를 대량화하고 실시예 2에 나타낸 바와 같이 SCCE를 함유한 세척된 족저 각질세포의 KCl 추출물을 수득하였다.
족저 각질세포의 KCl 추출물의 조제 과정을 하기 표 3에 개략적으로 나타내었다. 초형성성 인간 족저 각질층은 소사이어티 포 스웨디쉬 페디카이리스츠(Society for Swedish Pedicyrists)와 협력하여 수집하였다. 클리핑(clipping) 또는 절단에 의해서 얻어진 재료만을 사용하였다. 낙설 질환이 있는 발에서는 재료를 수집하지 않았다. 우송에 앞서 각질층을 대기 중에서 건조하고 플라스틱 백에 넣고 봉하였다. 실험실에서는 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
표 3
해리된 족저 각질세포의 SCCE 함유 KCl 추출물 제조의 개략적인 과정
후속적인 친화성 크로마토그래피 단계에서는 족저 각질층 각 50 g으로부터 얻은 2 개의 시료로부터 얻어진 추출물 1 및 2를 합하였다.
3.2 색소원성 물질을 이용한 단백질 분해 효소 분석
저해제인 아프로티닌, 키모스타틴, 황산아연의 효과 및 기질 특이성에 대하여 SCCE, 소 키모트립신 및 인간 카텝신 G를 비교하였다.
MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586)의 모액을 증류수로 제조하고, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (독일 베링거만하임사 제품)의 모액을 1-메틸-2-피롤리돈(배양 혼합물 중 용매의 최종 농도 4%) 중에 제조하고, 키모스타틴 모액은 디메틸술폭사이드 (배양 혼합물 중 용매의 최종 농도 1%) 중에 제조하였다. 스위스 제네바의 로티 (E. Lotti)로부터 인간의 화농성 담에서 유래된 카텝신 G를 얻었다. SCCE의 급원은 상기와 같이 제조된 해리된 족저 각질세포의 KCl 추출물이었다. 저해제 아프로티닌, 키모스타틴 및 황산아연의 급원은 상기한 바와 같다.
배양은 마이크로타이터 플레이트 중 37℃에서 행하였다. 총 배양 부피는 135였다. 각 배양 혼합물은 트리스-염산 pH 8.0 (최종 농도 0.08 M), KCl (최종 농도 0.2 M), 기질 용액 100, 효소원 25(0.1 M 트리스-염산 pH 8.0, 1.0 M KCl 중에 적절히 희석된 것) 및 저해제 용액 10로 구성되었다.
도 9의 A 내지 C에서는, MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586, 초기 농도 1.2 mM)를 기질로 사용하였다. D에서는 두 가지 기질의 초기 농도가 1.2 mM이었다.
배양이 종료되면 (1.5 시간) 각 웰에 10% 아세트산 125를 가하고, 효소를 가하지 않은 배양 혼합물을 블랭크로 하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 첨가한 효소의 양은 배양 종료시 405 nm에서의 흡광도 변화가 0.3 내지 0.7이 되도록 조정하였다.
그 결과는 도 9의 A 내지 D에서 요약하였다. 저해제의 효과를 조사하기 위해서 S-2586을 기질로 사용하였다. SCCE 및 키모트립신의 저해제로서 아프로티닌의효율은 높았으며 두 가지 효소에 대해 거의 동일하였다. 반면, 카텝신 G에 대한 효과는 훨씬 적었다 (도 9A). 키모스타틴은 세 가지 효소 모두의 억제를 일으켰으나 50% 억제를 일으키는 저해제 농도는 키모트립신 및 카텝신 G보다 SCCE에 대해 103배 이상 높았다 (도 9B). 황산아연은 SCCE의 효과적인 저해제이나 키모트립신 및 카텝신 G에 대해서는 그렇지 않았다 (도 9C). 기질인 MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) 및 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA에 대한 세 가지 효소의 활성 비교를 도 9D에 나타내었다. 실험의 목적이 시험된 효소 사이의 유사점 또는 차이점을 발견하는 것이었으므로 이들 실험은 각 기질에 대해 한 가지의 초기 농도에서만 행하였다. Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA가 키모트립신 및 카텝신 G에 대해서는 S-2586보다 상당히 나은 기질로 드러난 반면 SCCE에 대해서는 그 역이 성립하였다.
실시예 4
각질층 키모트립신 효소의 정제 및 N 말단 아미노산 서열 결정
4.1 불용화시킨 대두 트립신 저해제 (SBTI) 상의 친화도 크로마토그래피를 사용한 각질 세포 KCl 추출물로부터 얻어진 SCCE의 정제
도 10은 SBTI 상의 친화도 크로마토그래피의 결과를 보여주는 것이다. 친화성 겔은 50 mg의 SBTI (독일 베링거만하임사 제품)을 12 ml의 침강 아피겔(Affigel) 15 (카나다 리치몬드 소재 바이오래드사 제품)에 제조사의 설명서에 따라 연결시킴으로써 제조하였다. 겔 상에 잔존하는 활성 관능기는 에탄올아민으로 차단하였다. 100 g (건조 중량)의 족저 각질층으로부터 모아진 KCl 추출물 (총 부피 700 ml)을 유리 컬럼에 충전시킨 SBTI-Affigel 15의 0 8 x 2 cm 상에 유속 42ml/시로 통과시키고 용출액의 280 nm에서의 흡광도를 지속적으로 기록하였다. 용출액의 흡광도가 0.01 이하가 될 때까지 컬럼을 0.1 M 트리스-염산 pH 8.0. 1 M KCl로 세척한 다음 10 ml의 0.1 M 트리스-염산 pH 8로 세척하였다. 결합된 물질의 단계적 용출은 1, 10 및 100 mM의 염산을 사용하여 행하였다. 용출액의 흡광도가 0.01 이하로 감소하면 용출제를 변화시켰다. 트리스-염산 pH 8을 용출액의 pH를 7 이상으로 조정하기에 충분한 것으로 계산된 양인 총 0.4 ml 함유한 시험관에 3 ml 분획을 수집하였다. 각 분획의 pH를 즉시 검사하고, 필요시에는 소량의 1 M 트리스-염산 pH 8을 사용하여 약 7로 조정하였다. S-2586 (SCCE에 대한 기질) 및 S-2288 (트립신형 효소에 대한 기질)을 사용한 펩티드 가수분해 활성 분석을 실시예 2.1에 기재된 바와 같이 행하였다. 분석 혼합물 내 두 가지 기질의 초기 농도는 모두 1.1 mM이었다. S-2586 가수분해 활성의 약 90%가 겔에 결합하였다. 세척된 겔을 10-100 mM 염산을 사용하여 단계적으로 용출시키자 컬럼에 가한 KCl 추출물 중의 전체 S-2586 가수분해 활성의 약 60%를 회수할 수 있었다. 전체 S-2288 가수분해 활성 중 약 20%가 친화성 겔에 결합하였으며, 10%를 용출액 중에서 회수할 수 있엇다.
도 11은 SSTI-친화도 크로마토그래피에서 얻어진 용출액의 SDS 존재 하의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 자이모그래피를 통한 분석 결과를 보여주는 것이다. 12.5% 겔 상에서 환원되지 않은 시료를 전개시켰다. 실험의 상세한 사항은 문헌[이겔루드 및 룬드스트롬, 1991] 및 실시예 2, 2.2를 참조하면 된다.전기영동을 준비하기 전에 시료를 A에서는 Ultrafree-MC-여과지 (한계 10 kD; 미국 매사추세츠주 베드포드 소재 밀리포아(Millipore)사 제품)로 원심여과하여 약 20배 농축시키고, B에서는 10배 희석하였다.
도 12에는 SBTI-친화성 크로마토그래피에서 얻어진 비환원된 시료 및 환원된 시료의 SDS-PAGE에 의한 비교 결과를 나타내었다.
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, SBTI-친화성 크로마토그래피로 비-환원된 형태에서 겉보기 분자량이 대략 25 kD이고 환원된 형태에서 대략 28 kD인, 순도가 90% 이상인(쿠오마시 블루-염색된 SDS-PAGE 겔로부터 판단) 단백질을 수득한다. 또한, 겉보기 분자량이 주성분 보다 대략 1 kD 더 큰, 미량의 쿠오마시 블루-양성 성분이 있었다. 자이모그래피 겔상에 비-환원 시료를 사용하여 쿠오마시-블루 염색된 겔상에서 검출된 2개의 밴드와 동일한 전기영동적 이동성을 갖는 1개의 주성분 및 1개의 미량 성분 밴드가 있었다. 이들 카제인 분해성 성분은 둘 다 키모스타틴에 의해 억제될 수 있었다. 또한, 자이모그래피는 겉보기 분자량이 대략 30 kD인 미량 성분을 나타내는데, 이는 류펩틴에 의해 억제될 수 있었다. 정제된 주 단백질이 SCCE인 것으로 결론지었다.
4.2 SCCE의 N-말단 아미노산 서열 분석
SBTI-친화성 겔 15, A280nm0.2를 사용한 크로마토그램으로부터 분획물 200를 환원시키거나 시키지않고 SDS-PAGE용으로 준비하여 12.5% 폴리아크릴아미드겔 (두께 1 mm, 슬롯 폭 73 mm)상에서 수행하였다. 전기영동시킨 후, 분리된 단백질을이모빌론 필터 (Immobilon filter; 밀리포아사)로 전기영동에 의해 이동시키고 마쓰이다이라 (Matsuidaira, 1987)에 따라서 쿠오마시 블루로 염색한다. 주 단백질 밴드를 절단하고 온-라인 PTH 120A 분석기가 장착되어 있는 어플라이드 바이오시스템스 477A 펄스된 액체상 아미노산 서열 분석기 (미국 캘리포니아주 포스터 소재 어클라이드 바이오시스템사)로 처리하였다. 시퀀싱은 정상 사이클 프로그램 및 제조업자로부터의 화학 물질을 사용하여 수행하였다. 표준 단백질로부터 계산된 초기 및 반복 수율은 각각 25% 및 97%이었다.
아미노산 유도체의 수율은 시퀀싱되는 펩타이드 중 하나에 필적한다. 비환원 시료의 경우 수율은 단계 1 내지 6에서는 양호하지만, 단계 7 및 9에서는 제로(0)로 떨어졌다. 후속 단계에서의 수율은 급격하게 감소되었다. 또한 환원된 시료의 경우 단계 7 및 9에서는 아미노산 유도체가 검출되지 않았지만, 유도체가 검출될 수 있는 후속 단계의 경우 수율에 있어서 급격한 감소는 없었다. 이들 결과는 7번 및 9번 위치에 시스틴이 존재함을 제시한다. 그러나, 환원시키고 요오도아세트산 (100mM)으로 처리한 후 단계 7 및 9에서 카르복시메틸화 시스테인은 검출할 수 없었다. 수득한 서열 (도 13, 서열 확인 번호:3)을 환원된 시료 및 비-환원 시료에 대해 확인하였다.
실시예 5
5.1 SCCE-특이성 모노클론 항체의 제조
BALB/c 마우스 (덴마그 봄홀트가드)에게 프로인트 완전 보조제 (미시간주 디트로이트 소재, 디프코 래버러토리(Difco Laboratories)사)중의 실시예 4.1에 기술한 바와 같이 정제된 천연 SCCE 대략 30㎍을 피하 주사하였다. 프로인트 불완전 보조제 (미시간주 디트로이트 소재, 디프코 래버러토리) 중의 동량의 SCCE를 1개월 후 반복해서 주사하였다. 1차 주사후 4개월 경과후, 1마리의 마우스에게 연속해서 3일간 주사당 항원 30㎍을 정맥내 부스터 주사하였다. SP2/0 골수종 세포주 (ATCC CRL 1581)의 세포를 사용하여 문헌(Carlsson et al., 1985)에 기재된 방법으로 하이브리도마를 제조하였다. 정제된 SCCE-제제와 반응하는 항체의 확인은 ELISA 방법으로 수행하였다. 추가로 양성 클론으로부터의 배양 상등액을 SDS-PAGE한 후 면역블로팅 방법을 사용하여 분석하였다. 본 시험에서 SCCE와 반응하는 항체를 생산하는 클론을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고 문헌(Carlsson et al. 1985)에 기재된 방법으로 분류하였다. 2개의 유용한 항체, moAb TE4b 및 moAb TE9b를 수득하며, 이들 모두 IgG1-카파로 분류하였다.
면역침전법 및 면역블로팅법을 사용한 moAb TE4b 및 TE9b의 특성 분석을 도 14에 나타내었다.
도 14a (레인 2)는 실시예 3.1에 기술된 바와 같이 제조한, 해리된 족저 각질세포의 농축된 KCl-추출물에 대한 쿠오마시-염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 상기 시료를 0.1M 아세트산 나트륨, pH4에 대해 4시간 동안 투석시키고, 전기영동용으로 준비하기 전에 한외여과법에 의해 대략 100배로 농축시켰다. 도 14a (레인 3)는 실시예 4.1에 기술된 바와 같이 정제한, SCCE의 제제를 나타낸다.
도 14b는 항체를 각질세포의 KCl-추출물과 함께 배양시킨 다음, 불용해화 단백질 A를 사용하여 회수한 면역침전 실험의 결과를 나타낸다. 재용해화되고 해리된 항원-항체 복합체를 실시예 2에 기술된 바와 같이 자이모그래피로 분석하였다.
한외여과법에 의해 5배로 농축시키고 인산염 완충 염수에 대해 투석시키고, 여기에 소 혈청 알부민 (미주리주 세인트루이스 소재 시그마사)을 최종 농도 ml당 10 mg으로 하여 가한, 분해된 족저 각질세포의 KCl-추출물 250를 항체 용액 또는 인산염 완충 염수 10와 혼합하여 4℃에서 15시간 동안 배양시켰다. 침강된 단백질 A 세파로오즈 (스웨덴 웁슬라 소재 파마시아사) 25를 상기 튜브에 가하고 완만하게 진탕시키면서 실온에서 2시간 동안 계속 배양시켰다. 농축시켜 겔을 회수하고 0.05M 트리스 HCl, pH 7.5, 0.5M NaCl중 0.05% 트윈 20 (미시간주 세인트루이스 소재 시그마사) 1 ml로 5회 세척하였다. 최종 세척후, 상기 겔을 환원제 없이 램리 시료 완충액 100로 1시간 동안 실온에서 추출하였다. 추출물을 원심분리시켜 명징화하고 겔에 인가하였다.
moAb TE4b 및 TE9b 둘 다 정제된 SCCE와 동일한 Mr을 갖는 카제인분해성 효소 및 KCl-추출물 중 상응하는 카제인분해성 주효소를 침전시켰다. 상기 항체는 Mr이 대략 30kD인 추출물 중 소량의 카제인분해성 효소는 침전시키지 않는데, 이는 트립신-유사 세린 단백질 분해효소인 류펩틴에 의해 억제됨을 나타내는 것이다. 25 kDa 카제인분해성 효소이외에 상기 항체는 Mr이 대략 80 kDa인 소량의 단백질 분해 성분과 결합하는 것 같았다. 상기 성분은 통상적으로 제조전에 건조시킨 조직으로부터 제조한 족저 각질세포의 KCl-추출물에 존재하지만, 신선한 조직의 제제중에서는 발견되지 않는다 (T. Egelrud, 비공개된 관측). 친화성 크로마토그래피로 정제한 SCCE-제제중에는 존재하지 않지만 응집 생성물중에는 존재할 수 있다. 면역블롯상에서 항체와 반응하는 상응하는 성분은 검출할 수 없었다.
비-환원 조건하에서 수행된 SDS-PAGE 겔의 면역블롯상에서 (도 14c) moAb TE4b 및 TE9b는 족저 각질세포의 KCl-추출물 (도 14c 레인 2 및 4) 및 정제된 SCCE-제제 (도 14c 레인 3 및 5)중에 존재하는 성분과 반응하여, 이들 둘 다 자이모그램상의 정제된 주 단백질 및 카세인분해성 주성분과 동일한 Mr을 갖는다. 상기 항체는 SDS의 존재하에서 환원시킨 시료와는 반응하지 않았는데, 이는 이들이 형태-의존성 에피토프에 관한 것임을 제시하는 것이다.
비-환원형으로 Mr이 대략 25 kD인 주 단백질이외에, 정제된 SCCE-제제는 Mr인 대략 26 kD인 소량의 쿠오마시-양성 성분(비-환원: 실시예 3 참조)을 포함한다. 자이모그램상에 상응하는 카제인분해성 성분이 존재하며 25 kD 카제인분해성 주성분과 유사한 방법으로 키모스타틴에 의해 저해될 수 있었다 (실시예 3 참조). 더 높은 농도의 moAb TE4b 및 TE9b에서 (결과는 나타나 있지 않음) 상기 소량의 성분은 또한 면역블롯 상에서 항체와 반응함을 알 수 있다. 예비 전기영동법에 의해 정제된 쿠오마시-양성 주성분에 대해 발생시킨 폴리클론 토끼 항체에 대해 유사한 결과 (나타내지 않았음)를 수득하였다. SCCE-유사 반응성 및 명백한 면역학적 교차-반응성을 갖는 상기 2종의 단백질 사이의 정확한 관계는 공지된 바 없다.
5.2. SCCE-특이적인 폴리클론 항체
5.2.1 닭 항-SCCE
실시예 4.1에 기재된 바와 같이 SBTI-친화성 크로마토그래피에 의해 정제한 SCCE 45 ㎍을 0.1 M 트리스-HCl 0.2 ml 중에서 60 ℃에서 60 분 동안 열-변성시키고 프로인드 완전 보조액 (디프코 래버러토리즈 (Difco Laboratories)) 동량으로 균질화시켰다. 획득한 에멀젼을 약 20 주 연령의 더코 (Derco) 닭에 피하 주사하고, 그로부터 전면역 혈청을 제조하기 위한 혈액 시료를 채취하였다. 이 닭에 프로인드 불완전 보조액 및 3, 5 및 7 주 후 정제 열-변성시킨 SCCE (총 용적이 각 에멀젼 250임) 30 ㎍을 사용한 것 이외에는 상술한 바와 같이 제조한 에멀젼을 추가로 피하 주사하였다. 닭에 최종 주사한 지 2 주 후 채혈하였다. 이 혈액을 알세베르 (Alsever) 용액 (100 ml당, 글루코스 1.87 g, 구연산나트륨 0.8 g, 염화나트륨 0.62 g 및 구연산을 사용하여 pH 6.1로 맞춘 용액 100 ml) 2배 부피와 바로 혼합하고 원심분리하였다. 추가 연구용으로 선택한 닭 항-SCCE를 면역블로팅 실험시 1/2000으로 희석시켜 사용하였다. 항혈청 특이성의 예시는 도 17 및 실시예 8을 참조한다.
5.2.2. 토끼 항-SCCE
SBTI-친화성 크로마토그래피에 의해 정제한 SCCE에 램리 (1970년)에 따라 15 mm 두께의 겔상에서 실시예 4.1에 기술된 바와 같이 비환원 SDS-PAGE를 행하였다. 이전에 SCCE로 나타난 주 단백질 밴드를 이 (Lee) 등 (1987년)에 따라 염화구리 염색법을 사용하여 가시화하고 절제하였다. 이 등에 따라 EDTA를 사용하여 염화구리를 제거한 후, 겔 조각을 인산염 완충 생리식염수 중에서 균질화시켰다. 균질화된 조각의 시료를 동일 부피의 프로인드 보조액 중에 현탁시켰다. 완전 보조액 중의이 방법으로 제조한 순수 SCCE 약 30 ㎍을 토끼에게 피하 주사하였다. 3, 5 및 7 주 후, 불완전한 보조액을 사용한 것 이외에는 SCCE 동량을 사용하여 반복해서 주사하였다. 최종 주사한 지 2 주 후 토끼에게서 채혈하였다.
획득한 토끼 항-SCCE (D-5)를 2차 항체로서 알칼리성 인산염 결합된 항-토끼 면역글로불린을 사용하여 면역블롯 실험에서 1/500 내지 1/1,000으로 희석하여 사용하였다.
모든 면역블로팅 실험에서, 결합 2차 항체를 블레이크 (Blake) 등 (1984년)에 따라 검출하였다 (실시예 5, 8 및 9 참조).
SDS-PAGE 전에 환원된 SCCE를 항원으로 사용한 것 이외에는 동일 방법으로 토끼 항-SCCE Bo-1을 제조하였다.
5.3. 모노클론 항체를 사용한 면역조직화학적 연구
SCCE-특이성 모노클론 항체를 사용한 면역조직화학 연구에서, SCCE는 인간각화 편평 상피 (표피, 모낭의 내근 시트, 경구개)의 높은 기초 위의 세포 중에서는 검출할 수 있지만, 비각화 편평 상피 (모낭의 내근 시트, 입술 및 볼쪽의 점막)에서는 검출할 수 없었다. 따라서, SCCE는 각화 편평 상피에서 특이적으로 발현될 수 있다. 또한, SCCE는 시험관내 재현된 인간 표피의 상충 초기저 세포에서 발현되고 공기-물 계면에서 생장하는 것으로 밝혀졌다. 표피세포 증식을 자극하지만 각질층의 형성을 억제시키는 농도로 레티노산을 배지에 첨가했을 때, SCCE는 더이상 발현되지 않았다. 이것은 SCCE-발현이 표피 분화 프로그램의 일부일 수 있다는 것을 제안한다.
SCCE-특이성 모노클론 항체를 사용한 면역전자현미경 실험 결과는 교소체 분해에 있어서 및 따라서 박리에 있어서 SCCE의 역할과 양립한다. 항체가 구체적으로는 최상 과립 세포와 최하 각질층 세포 사이의 세포간 공간으로의 분비를 일으키는 라멜라체를 표지시키는 반면에, 각질층에서 항체는 세포의 공간에서 교소체와 밀접한 에피토프를 인식하였다.
실시예 6
인간 SCCE을 코딩하는 cDNA의 클로닝 및 시퀀싱
제한 효소는 프로메가사 (Promega)(미국 미시간주 매디슨 소재)로부터 얻고, TAQ-폴리머라제는 퍼킨-엘머-세터스 (Perkin-Elmer-Cetus)(미국 코넥티커트주 노르월크 소재)로부터 구입하였다. 표피원의 성인 각화세포로부터 유도된 mRNA로부터 제조한 λgt11 인간 표피세포 cDNA 라이브러리는 클론테크 래버러토리즈(Clontech Laboratories)(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 구입하였다(카탈로그 번호 HL 1045 b). 먼저, 항-SCCE 토끼 폴리클론혈청 D-5 및 Bo-1을 사용하여 라이브러리를 검색하였다 (실시예 5.2.2 참조). Bo-1 폴리클론항-SCCE 혈청은 높은 백그라운드 시그날을 나타내기 때문에, 초기 단계에서 광범위한 스크린 연구로부터 배재하였다. D-5 항혈청을 사용하여, 면역반응성 플라크의 수를 진성양성 플라크에 대해 예기되는 바와 같이 강화하였다. 어떠한 플라크에 대해서도 모노클론 항체 moAb 4 및 moAb 9에 대한 반응성은 관찰되지 않았다. 11개의 단리된 플라크의 광범위한 제한 효소 특성 및 PCR 특성으로부터, 여러 플라크들 사이의 상사성이 전혀 검출될 수 없다는 것을 알 수 있었다. 이러한 부분 상사성의 존재는 플라크가 동일cDNA 서열로부터의 상동 DNA 인서트 (insert)를 함유한다는 것을 나타낸다. 가능성있는 SCCE cDNA 서열의 "지문"을 정의하는데 실패한 것을 바탕으로, 전략을 변경하였다.
프로브로 중첩된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 플라크 혼성화에 의해 대장균(E. coli) Y 1090 (클론테크)에서 플라크를 스크린하였다. 실시예 4.2에 기재되어 있는 바와 같이, 천연 SCCE 효소의 실험적으로 결정된 아미노-말단 서열에 기초하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인하였다. SYM3067, 서열 확인 번호: 4로 명명된 합성 17-mer 올리고뉴클레오티드 프로브5'-ATHATHGAYGGNCNCC-3'(H= A 또는 C 또는 T: Y= C 또는 T: N= A 또는 C 또는 G 또는 T)의 구성화를 위해, 아미노산 서열, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (서열 확인 번호:3, aa 1 - aa 6)의 가장 신뢰성있는 부분을 선택하였다. 벤도르 (vendor)의 지침에 따라 포스포라미디트 (phosphoramidite) 기술을 사용하는 베크만 (Beckman) 200A DNA 합성기를 사용하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다.
0.2 % 말토스 및 10 mM MgSO4를 함유하는 LB 배지 (샘브룩 (Sambrook) 등, 1989년)에서 대장균 Y 1090 박테리아를 밤새 생장시켰다. 이어서, 배양액 0.4 ml를 묽은 라이브러리 파지주와 혼합하여, 37 ℃에서 20 분 동안 흡착시켰다. 감염된 배양액을 6 ml 연질 아가로스 (LB 및 10 mM MgSO4중의 0.75 % 아가로스)와 혼합하였다. 연질 아가로스 혼합물을 10개의 150 mm LA 평판상에 쏟아부었다. 평판을 37 ℃에서 5 시간 동안 배양하고, 4 ℃에서 밤새 정치시켰다. 전체적으로, 평판은 약4x105플라크를 함유한다.
플라크를 고정화시키기 위해, 각 평판을 NEN 듀폰 콜로니 (DuPont Colony)/플라크 스크린 막 (미국 델라웨어주 월밍톤 소재, 듀폰 (DuPont)사)을 사용하여 2분 동안 중층하였다. 이 막을 0.5 M NaOH 중에 2 분 동안 2 회, 트리스-HCl pH 7.5 중에 2분 동안 2회 침지시키고 공기 건조시켰다. 이어서, 이들 막을 후술하는 바와 같이 혼성화 실험에 사용하였다. 이 막들을 10 % 덱스트란 황산염, 1 MNaCl, 100 mg/ml 변질된 청어 정자 DNA (미국 미조리주 세인트 루이스 소재, 시그마사)를 함유하는 1 % SDS 용액 중에서 65 ℃에서 5 시간 동안 전혼성화(prehybridization)시켰다. 프로브, SYM 3067을 T4 폴리뉴클레오티드 활소 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가사)를 사용하여 [λ-32P] dATP 표지하고, 전혼성화 혼합물에 가하였다. 42 ℃에서 12-18 시간 동안 혼성화를 행하였다.
이 막들을 혼성화 후, 실온에서 2xSSC로 5 분 동안 4 회, 42 ℃에서 2xSSC, 1 % SDS로 30 분 동안 2 회, 마지막으로 실온에서 0.1 SSC로 30 분 동안 세척하였다. 이 막들을 X선 필름 (영국 애머샴 소재의 하이퍼필름-MP (Hyperfilm-MP))상에서 오토래디오그래피(autoradiography)하였다. 1차 스크리닝에서 14개의 양성 플라크를 확인하였다. 이들 양성 플라크를 상술한 바와 동일한 프로브 및 방법을 사용하여 재스크린하였다. 재스크린 과정 후, 2개의 양성 플라크를 확인하였다. 2개의 선택된 플라크를 다시 정제하고, 인서트의 크기를 프라이머로서 SYM 1600 및 SYM 1601을 사용하고 주형으로 단리된 파지를 사용하여 PCR에 의해 측정하였다. 이들 2개의 프라이머는 각각 λgt 11 파지 왼쪽 및 오른쪽 암(arm)에 대해 상보적이다. 이어서, 파지 A 6.2.2로부터 발생한 약 0.9 kb의 증폭된 DNA 단편을 EcoRI으로 절단하고, EcoRI 절단된 pUC19 (스웨덴왕국 웁슬라 소재의 파마시아(Pharmacia)사), pS96 중으로 클로닝하였다. 이 클로닝된 단편을 PUC19에 대해 상보적인 보체인 서열 프라이머를 사용하여 부분 서열 분석을 행하였다. 뉴클레오티드 서열은 T7 시퀀싱 키트 (스웨덴왕국 웁슬라 소재의 파르마시아 또는 미합중국 오하이오주 클레브랜드 소재의 USB를 사용하여 측정하였다.
얻어진 DNA 서열의 번역에 의해 실험적으로 측정한 단백질 서열과 상동성인 아미노산 서열을 얻었다. 그러나, 이 서열에는 번역 개시 코돈이 결여되어 있었다. 전장 cDNA을 단리하기 위해, 얻어진 DNA 단편을 아가로스 겔상에서 분리하고, 엄격한 조건하에서 교잡을 허용하는 프로브로 사용하였다. 이 프로브는 다음 과정에 의해 멀티프라임 (multiprime) DNA 표지 시스템 (영국 애머샴(Amersham)사)을 사용하여32p-표지하였다. 겔 1 g 당 3 ml의 비율로 물을 첨가하고, 끓는 수조 중에 7 분 동안 넣어 겔을 용융시키고 DNA를 변성화하였다. 이어서, 이후 최소한 10분 이상 튜브를 37 ℃의 수조로 옮겼다. DNA 약 25 ng을 함유하는 DNA/아가로스 용액의 부피를 공급업자의 지침에 따라 표지화 반응에 첨가하였다.
전장 cDNA을 얻기 위해, 혼성화를 65 ℃ 엄격한 조건하에 행한 것 이외에는, 상술한 바와 동일한 방법을 사용하여 이 프로브로 cDNA 라이브러리를 2회 재스크린하였다. 이들 실험에 의해, 전체 5' 개방 판독틀을 함유하는 플라크를 확인하기 위해 먼저 PCR 프라이머로 SYM 3208과 함께 SYM 1600 (5'-GTG GCG ACG ACT CCT GGA GCC-3'; 서열 확인 번호: 5) 또는 SYM 1601 (5'-ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3'; 서열 확인 번호: 6)을 사용하여 PCR 분석에 의해 검색한 45개의 각각의 양성 플라크들을 확인 및 단리시켰다. pS496으로부터 얻은 DNA 서열 정보에 근거하여, SCCE cDNA의 5' 부분에 적어도 부분적으로는 상보적인 SYM 3208, 5'-TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3'(서열 확인 번호: 7)을 고안하였다. 이 스크린 작업후, 추가 분석을 위해 4개의 파지를 선택하였다. 서역 분석을 위해, 이들 파지로부터 유도된 생성 PCR 증폭 단편을 상술한 바와 같이 pUC19 중으로 클로닝시켰다. 얻어진 결과로부터 파지들 중의 하나, 205.2.1은 전장 인서트를 함유한다는 것을 알 수 있었다.
파지 단리 205.2.1로부터의 DNA를 샘브룩 등 (1989년)에 따라 제조하고, DNA 제제를 EcoRI으로 절단시켰다. 절단된 DNA를 아가로스 전기영동에 의해 분리하고, 약 1 kb의 단편을 단리시키고 EcoRI으로 절단된 pUC19 중으로 클로닝시켰다. 생성된 플라스미드를 pS500으로 명명하였다 (도 15). cDNA 단편의 완전한 뉴클레오티드 서열을 상술한 바와 같이 결정하였다. 시퀀싱 반응에 대한 프라이머로 pUC19 또는 SCCE 서열에 대해 상보적인 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 뉴클레오티드 서열 (서열 확인 번호: 1)은 신호 펩티드 및 전폴리펩티드 (서열 확인 번호: 2)를 포함하는 253 아미노산으로 이루어지는 SCCE 전구체 단백질의 전체 아미노산 서열을 코딩하기에 충분한 개방 판독틀을 포함하였다.
106.1.2라 불리는 또다른 파지는 5'-비번역 서열 및 1차 3개의 코돈이 결여된 SCCE cDNA 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이 인서트를 954 bp EcoRI 단편으로서 단리하였고, EcoRI 절단으로 선형화된 pLC19 중으로 클로닝시켜 플라스미드 pS498을 얻었다. 이 플라스미드를 부분 시퀀싱하였다.
108.1.2라 명명된 제3 파지는 또한, 5'-비번역 서열 및 번역된 영역의 7개의 뉴클레오티드가 결여된 SCCE cDNA 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이 cDNA 인서트는 정지 코돈의 하류에서 1057 bp 연장하는 3'-비번역 영역의 보다 긴 변형체를 가진다. 이 1884 bp EcoRI 단편을 단리시키고, EcoRI 절단으로 선형화된 pUC19 중으로 클로닝시켰다. 생성된 플라스미드를 서열분석하고 pS501로 명명하였다.
실시예 7
인간 표피 중의 SCCE mRNA 검출
인간 표피로부터 총 RNA 제조
이는 콤진스키 및 사키(Chomczymski and Sacchi, 1987)에 따라 실시되었다. 병에 걸리지 않은 인간 복부 피부를 성형 외과로부터 얻었다. 제거한 후 그것을 즉시 얼음위에 냉각시켰다. 15분 이내에 표피를 외과용 메스로 확실히 스크레이프하여 재생시키고, 용액 D에 담그고(Chomczynski and Sacchi, 1987) 유리 균질기로 균질화하였다. 이후 콤진스키 및 사키에 의하여 기술된 프로토콜에 따랐다. 펠렛화된 총 RNA를 추가 분석할때까지 70% 에탄올 중에서 -20 ℃에서 저장하였다.
mRNA 제조
총 표피 RNA 중 500 ㎍ 을 제공자의 교시에 따라 폴리 A 트랙트 키트(Poly A Tract-Kit)(프로메가사)로 처리하였다.
RNA-전기 영동 및 블로팅
아가로스 겔(1.4 %)을 1 x MOPS 완충액 중의 0.66 M 포름알데히드 및 0.6 g/ml 브롬화 에티듐(미주리주 세인트루이스 소재 시그마사)으로 제조하였다. 총 RNA 100 ㎍에 해당하는 mRNA를 RNA-시료 완충용액(50% 포름아마이드, 2.2M 포름아마이드, 3% Ficoll, 1 x MOPS) 중에 용해시키고 사용하기 전에 60 ℃에서 5분 동안 가열시켰다. RNA 표지(메릴랜드 주 게티스버그 소재 BRL)을 유사하게 처리하였다. 전기 영동시킨 후, 겔을 증류수에 5분 동안 적신후 50 mM NaOH 에 30 분 및 0.1 M 트리스-HCl pH 7.5에 30분 동안 침지하였다. 10 x SSC 중에서 1 시간 동안 바쿠-젠(Vacu-Gene) 장치(스웨덴 웁슬라 소재, 파마시아사)를 사용하여 젠스크린 플러스 반투막(델라웨어주 윌밍톤 소재, NEN 듀퐁사)에 블호팅을 실시하였다. 반투막을 이후 3 x SCC 중에서 세척시키고, 밤새 건조시키고, 80 ℃에서 2 시간 동안 베이킹시켰다. UV 빛 하에서 RNA가 반투막상에 보였다.
cDNA-프로브
실시예 6에서 기술한 바와 같이 제조된 플라스미드 pS501을 HincII 및 BgIII로 절단하였다. 이 cDNA은 bp No 1060에서 하나의 HincII 및 bp No 1715에서 하나의 BglI 부위를 포함한다. 1070 bp 단편(pUC19 다중클로닝 위치 중의 HincII 부위-내생적인 HincII-부위)은 5' 말단에서 7 bp를 제외하고는 SCCE 코딩 지역, 및 단리된 모든 SCCE-cDNA에 공통적인 bp 944-951에서 폴리아데닐화를 포함하여 비번역 지역을 함유한다. 655 bp HincII - BgIII 단편은, 폴리 A-테일을 함유하지 않는데, 이는 SCCE cDNA108-1-2에 대해 특이적인 것이다. 상기 단편을 아가로스 전기 영동으로 정제하고 멀티프라임 DNA-표지화 키트(Multiprime Dna-labelling Kit)(영국 버킹검셔 소재, 에머샴사)와 함께32PdCTP-표지된 프로브의 제조를 위하여 사용하였다.
혼성화
막을 1 x TE 중의 1% SDS 에서 30분 동안 끓이고 1% SDS, 1M NaCl, 10% 덱스트란 황화물, 청어 정자 DNA 0.1 mg/ml중에서 3 시간 동안 예비 혼성화 시켰다. 혼성화를 일한 용액 중에서 60 ℃에서 밤새 수행하였다. 2 x SCC 중의 1% SDS에서 60 ℃에서 2 x 30분 동안 실시하고, 실온에서 0.1 x SCC 중에서 3 시간 동안 실시하였다. 막을 이후 오토래디오그래피시켰다. 인간 표피 중에 각각 약 1.2 kb 및 2.0 kb 크기를 지닌 2종의 mRNA 종이 존재함을 증명할 수 있었다(도 16). 이는 2종의 cDNA이 발견된 클로닝 실험으로부터 얻은 증거와 잘 일치하였다.
실시예 8
대장균 중의 재조합 SCCE의 발현
1. 정방향 PCR-프라이머
1. a CGTGGATCCATCGAAGGTCGTATTATTGATTGGCGCCCCATGT (SYM 3367; 서열 확인 번호: 8, 천연 활성 그대로의 SCCE의 N-말단 아미노산 IIDGAPC를 코딩하는 밑줄친 3'-부분, BamHI-부위를 갖는 5'-부분 및 인자 Xa부위 IEGR을 코딩하는 추가 서열.
1. b CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA (SYM 3368; 서열 확인 번호: 9, 1a에서처럼 5'-부분, 아미노산 서열 리타제(LETAGEE)를 코딩하는 전체SCCE-cDNA-서열 중의 염기쌍 76-96에 해당하는 밑줄친 3'-부분.
2. 역방향 PCR-프라이머
TGATCCTCTGAGCTCTCCTG(SYM 3371: bp 294에서 SacI-부위와 함께 전체 SCCE-cDNA-서열, 서열확인번호 1, 중의 염기쌍 285-304에 상보적임).
pS498(실시예 6)의 시퀀스를 프라이머 1a/2 및 1b/2로 PCR-증폭시켰다. 얻은 생성물을 페놀 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고, BamHI/SacI로 절단시키고, 아가로제 전기 영동으로 정제하였다. 이들은 이후 TG2-세포 중에서 pS498을 SacI 및 EcoRI로 절단시켜 얻은 SCCE 106-1-2의 3' 673 염기쌍과 함께 BamHI/EcoRI로 절단된 pGEX-2T(파마시아사) 중으로 클로닝하였다. 발현 연구를 위하여 사용한 박테리아 클론으로부터 플라스미드(인자 Xa 부위 근처의 천연 N 말단을 코딩하는 pS510, 및 인자 Xa 부위 근처의 제안된 프로펩타이드를 코딩하는 pS511)를 단리시키고, PCR-생성물로부터 유도된 삽입 변이물에 대응하는 핵산 서열을 T7 시퀀싱 키트(스웨덴 웁술라 소재, 파마시아사)을 사용하는 디데옥시 사슬 종결 방법에 의하여 확인하였다.
발현 연구
50 ㎍/ml 카베니실린()을 함유하는 LB 배지 중의 pS510 및 pS511을 갖는 TG 2세포의 밤샘 배양물을 신선한 배지 중에서 10배로 희석시키고 37 ℃에서 3 시간 동안 성장시켰다. IPTG(미주리주 세인트루이스 소재 시그마사)를 최종 농도 0.1 mM로 첨가하고, 그 배양물을 37 ℃에서 추가로 3 시간 동안 성장시켰다. 박테리아 펠렛을 PBS 1% 트리톤 X-100(미주리주 세인트루이스 소재 시그마사)중에서 초음파 파쇄하였다. 10000 x g에서 15분 동안 원심분리시킨 후, 상청액 및 펠렛을 SDS-PAGE로 분석하고 폴리클론 SCCE-특이적인 닭 항혈청으로 면역블로팅시켰다.
SCCE-유사 면역 저항성을 갖는 분자량 대략 50 kD(pS510) 및 52 kD(pS511)과 함께 다량의 IPTG 유도가능한 단백질을 PBS-트리톤 X-100 중의 펠렛 불용물에서 발견하였다(도 7 참조).
PBS-트리톤 X-100 중에서 초음파 분해 후 상징액은 불용성 펠렛에서와 동일한 크기를 갖는 GST/SCCE 접합 단백질을 포함하였지만, 그 양은 불용성 펠렛에 비하여 적었다.
이들 결과는 SCCE를 GST와의 융합 단백질로 발현하는 것이 가능하고 또한 프리-프로-SCCE-아미노산 서열 중의 특정 단백질 분해효소 부위에 해당하는 서열이 세균 중에서 재조합 SCCE를 제조하는 것이 가능하도록 이 실험을 반복하는 것을 가능하게 한다는 것을 보여준다. 제조된 단백질은 요소 또는 구아니디늄 염화수소에 가용화될 수 있고 이후 SCCE의 높은 등전점으로 인하여 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 정제된 단백질은 더 낮은 농도의 변성제를 갖는 완충 용액에 대하여 투석하여 재생될 수 있고 이후 인자 Xa로 절단시켜 SCCE 또는 프로-SCCE를 유리할 수 있다. GST/SCCE 융합 단백질은 또한 SCCE-특이적인 항체 제조를 위한 면역원으로써, 및 항체 정제에 있어 면역흡수제로써 사용될 수 있다.
실시예 9
포유류 세포에서 재조합 인간 SCCE의 발현
재조합 SCCE의 제조를 위한 발현 백터를 제조하기 위해 플라스미드 pS500으로부터 인간 cDNA 서열을 897 bp EcoRI/DraI 단편으로 단리하였다. 이 단편을 EcoRI 및 SmaI 절단된 pUC19 중으로 서브클로닝시켜, pS502를 얻었다. 이후 SCCE cDNA 서열을 0.9KB던편으로 단리하기 위해, 플라스미드 pS592를 EcoRI 및 SaII로 절단시켜 HindIII부위가 결여된 pUC19 변종으로 다시 서브클로닝하여 플라스미드 pS503을 얻었다. 이 pUC19 변종은 pUC19를 HindII로 절단시키고, 클레노우(Klenow) 효소를 사용하여 말단을 보충하고 재연결시켜 제조하였다. 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 하기 위하여, HindIII 부위를 SCCE cDNA의 5'말단에 도입하였다. 이는 pS503을 EcoRI로 절단시키고 그 부위를 HindIII, SYM3603 5'-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3'(서열확인번호 10)으로 전환하는 링커를 삽입시켜 수행하였다. 5' 말단에서 HindIII 부위 및 3' 말단에서 SaII 부위를 가지는 SCCE cDNA의 일부를 코딩하는 단백질을 가지는 생성된 플라스미드를 pS505로 명명하였다.
최종 발현 벡터는 3종의 상이한 DNA 단편을 연결시켜 얻었다. 먼저, pS505를 HindIII 및 SaII으로 절단시키고, 0.9 kb 단편을 단리시켰다.
두번째로, 쥐의 매탈로티오네인 상류 조절 원소의 말단 부분, 소의 파필로마 바이러스 서열, mRNA 가공 시그날 및 플라스미드 서열, pML2d를 제공하는 토끼 베타-글로빈 게논 단편을 제공하기 위하여, 대장균(Waldenstrom et al. 1992) 중의 선택 및 복제를 허용하기 위하여, SacI 및 SaII 및 약 12 kb의 단편으로 절단된 백터 pS147을 단리하였다.
세번째로, 쥐의 매탈로티오네인 촉진 유전자의 근접 부분을 단리하기 위하여 리더 서열에 위치한 천연의 BgIII가 HindIII부위로 전환된 플라스미드 pS42를 SacI및 HindIII로 절단시키고 대략 220 bp 단편을 단리하였다.
이들 3종의 단편들의 연결로 SCCE 발현 백터 pS507을 얻었다(도 18 참조).
발현 백터 pS507는 하베이(Harvey) 사코마바이러스 5' 긴 말단 반복에 의하여 유도된 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 백터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날(Lusky and Botcha, 1984)와 함께 쥐 C127 세포(ATCC CRL 1616)로 공동트랜스펙션되었다. 트랜스팩션 실험을 칼슘-인산염 침전 방법(Graham and Van der Eb,1973)에 따라 실시하였다. 세포를 10% 태내 송아지 혈청(유타주 노감 소재 하이클론(HyClone)사)으로 보강된 햄 배지(Ham'S F12/Dulbecco) 중에서 배양시켰다. 네오마이신 내성 세포 클론을 1.5 mg/ml의 G418(Gibco-BRL)로 선택하고, 선택한 날로부터 10 - 15일 후 내성 세포 클론을 마스터 판으로부터 확인하고 단리시키고 다음 분석을 위하여 계대배양하였다.
재조합 SCCE 유전자의 발현을 분석하기 위하여 총 RNA를 단리된 세포주로부터 제조하였다. 총 RNA를 C127세포로부터 제조하고 1% 포름알데히드-아가로제 겔상에서 분리시키고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시키고,32P-표지된 SCCE 프로브에 혼성화형성시켰다. 그 프로브는 pS500의 HincII 절단 및 아가로즈 전기이동에 의하여 단리된 SCCE cDNA의 1070 bp HincII 단편이었다. 실험 방법은 아우스벨 등(Ausubel et al., 1992)에 따랐다. 노던 블롯 실험 및32P-표지된 SCCE cDNA로 혼성화는 재조합 SCCE mRNA를 SCCE 백터, pS507을 함유하는 다수의 세포주 중에서 발견할 수 있다는 것을 보여 주었다. SCCE cDNA을 제외하고 동일한 백터를 함유하는C127세포 라인으로부터 유도된 대조 시료에서는 혼성화가 관측되지 않았다(도 19). 1.4 kB 크기는 예상된 크기에 해당한다.
조정된 세포 배양 배지의 시료를 수집하고 면역블로팅에 의하여 분석하였다. 램리(1970)에 따라 SDS-PAGE를 수행하고 면역블로팅을 위하여, 닭의 천연 SCCE에 대한 항체를 검출 항체로 사용하였다. 알칼리성 포스포타제 표지된 닭 항체 IgG(미주리주 세인트루이스 소재, 시그마사)를 효소 표지를 위하여 사용하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었다.
재조합 SCCE 발현을 분석하기 위하여, 발현 백터 pS507로 트랜스펙션된 C127 세포로부터 총 RNA를 준비하였다. 대조 시료로서, 트랜스펙션되지 않은 C127 세포 및 발현 백터 pS147로 트랜스펙션된 C127세포로부터 총 RNA를 준비하였다. 백터 pS147은 인간 SCCE cDNA 대신에 인간 담즙산염-자극된 리파제(Nilsson et al, 1990)의 cDNA을 포함한다는 것을 제외하고는 pS507과 유사하였다. RNA를 아우스벨(Ausubel, 1992) 등의 방법에 따라 준비하였다. 노던 블롯 실험 및32P-표지된 SCCE cDNA에 의한 혼성화는 SCCE 백터, pS507을 함유하는 C127세포 중에서 1.4 kb의 재조합 SCCE mRNA가 검출되었음을 보여 주었다(도 19). pS147를 포함하는 C127 세포주 또는 트랜스펙션되지 않은 C127세포주로부터 유도된 대조 시료에는 혼성화가 관측되지 않았다. 재조합 SCCE mRNA의 길이는 예상한 것이었다.
조정된 세포 배양 배지 시료를 수집하고, SDS-PAGE 및 면역블로팅에 의하여 분석하였다. 블롯은 블레이크(Blake, 1984) 등에 의해 기술된 대로 현상하였다. 얻어진 결과(도 20 참조)는 pS507을 포함하는 C127 세포가 실시예 5에서 기술된 대로 제조된 항-SCCE 모노클론 뿐만 아니라 모든 이용가능한 폴리클론 토끼 및 닭 SCCE 항체와 반응을 보여주는 3종의 단백질을 생산한다는 것을 보여 준다. 재조합 SCCE 반응성 단백질은 정제된 천연의 인간 SCCE 보다 약 1 kDa 더 큰 겉보기 분자량을 보여준다. 재조합 단백질은 어떠한 단백질 가수분해 활성도 나타내지 않았다. 추정된 SCCE 아미노산 시퀀스를 천연의 인간 SCCE의 실험적으로 결정된 NH-2 말단 및 단백질분해효소와 같은 다른 키모트립신의 서열과 비교함으로써, C127 세포 중에 생산된 재조합 SCCE는 그의 프로-효소 형으로 존재한다는 것을 결론지을 수 있다. 서열 데이타는 이 프로-효소가 시퀀스 ....AQGDKIIDGAP...중의 리신의 C-말단 부분에서 단백질 가수분해 절단에 의하여 활성화될 수 있고, 밑줄친 서열은 천연의 활성 인간 SCCE의 NH-2 서열이다(서열확인번호 2, aa 5-aa 6).
실시예 10
재조합 SCCE의 정제 및 특성 분석
정제
천연의 SCCE에 대한 모노클론 항체 TE4b 1.3 mg을 제조자들에 의하여 기술된 방법을 사용하여 CNBr-활성화된 세파로즈(스웨덴 웁슬라 소재, 파마시아-LKB 바이오텍) 1.5 ml에 커플링하였다. SCCE를 함유하는 배지 40 ml을 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과시키고 이후 칼럼에 사용하였다. 칼럼을 인산 나트륨 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.2로 수회 세척시키고, 이후 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.5 로 용출시켰다. 용출된 단백질을 1 M 트리스-HCl, pH 8.0을 첨가하여 즉시 중성화시켯다.
활성화
커플링된(상기 참조) 모노클론 항체를 포함한 겔을 사용하여 정제된 재조합 SCCE(200중의 4.6)을 37 ℃에서 0.1 mg/ml 트립신(질량비 10:1) 4.6로 소화시켰다. 시료(50)를 20분, 1시간, 3 시간 및 20 시간에서 빼내고, 10(4-아미디노페닐)매탄 술포닐(APMSF:독일 베링거만하임사) 5를 첨가시켜 반응을 종결시켰다. 절단된 SCCE의 활성을 실시예 2.2에 기술한 바와 같이 카제인 겔상의 비-환원 SDS-PAGE로 분석하였다. SCCE의 획득된 절단된 형태의 확인은 SDS-PAGE를 환원시키고, 천연 SCCE에 대한 항체를 사용하고, 알칼리 포스파타제에 대한 기질로서 알칼리 포스파타제 표지된 닭 IgG 항체 및 니트로 블루 테트라졸리움 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트를 사용하여 면역블로팅하여 분석하였다.
N-말단 시퀀싱
친화성 정제된 (상기 기술한 바와 같이) SCCE, 약, 35을 임모빌론 상에 바이오-도트 에스에프(Bio-Dot SF)단위(매샤츄세츠쥬 베드포드 소재, 밀리포아사)를 사용하여 슬롯-블로트하였다. 막을 이후 수회 증류수로 세척시켜 모든 트리스 및 글리신을 제거하였다. 단백질이 결합된 막의 부분을 잘라내고 온-라인 PTH 120A 분석기를 갖는 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) 477A 펄스 액상 시퀀싱기(캘리포니아주 포스터시티 소재) 를 사용하여 나열하였다. 규칙적인 사이클 프로그램 및 제조자로부터의 화학 물질로 시퀀싱을 수행하였다. 첫번째 여섯 위치에서 얻은 서열은 서열확인번호 2의 아미노산 -7 - -2에 해당하는 glu-glu-ala-gln-gly-asp였다. 이들 결과로부터 결론지을 수 있는 바와 같이, 신호 펩티드는 22개의 아미노산으로 구성되어 있고 천연의 활성 SCCE의 N-말단 아미노산 서열에 기초하며, 프로펩티드는 7개의 아미노산으로 구성된다.
데글리코실화
정제된 재조합 SCCE(5) 및 천연 SCCE(20) 을 0.5 % SDS 20및 0.1 M β-멀캅토에탄올 중에서 3 분 동안 끓였다. 시료를 각각 0.2 M 및 1.25%의 최종 농도로 인산나트륨 완충용액, pH 8.6, 및 노니데트(Nonidet) P-40으로 희석시켰다. N-글리코시다제 Fn (베링거 만하임)을 첨가시키고(재조합 단백질에 대해 0.6 효소 단위 및 천연 단백질에 대해 1.2 효소 단위) 그 반응 혼합물을 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 시료 분석에서 SDS의 최종 농도는 0.17%였다. N-글리코시다제 Fn 처리된 SCCE를 8 - 18% SDS-PAGE 상에서 분석한 후 상기에서 기술한 대로 면역블로팅시켰다. 얻어진 결과는 2개의 상부 밴드의 겉보기 분자량이 감소됨을 나타낸 반면 가장 하부 밴드의 겉보기 분자량은 변화되지 않음을 나타내었다(도 23). 이는 C127 세포에서 생산된 재조합 SCCE가 2종의 N-글리코실화된 형태와 하나의 비-글리코실화된 형태로 존재하는 것을 나타낸다. 이 결과는 활성인 천연의 SCCE로 볼 수 있는 것과 유사하다(도 23)
실시예 11
SCCE를 구성하는 조성물
상기 조성물은 활성 화합물을 다른 성분과 철저히 혼합하는 것을 포함하는 통상의 약학적 기술에 따라 제조할 수 있다. 모든 퍼센트는 중량 기준이다.
또한 하나 이상의 활성 화합물을 포함하는 조성물이 본 발명의 범위내이다. 따라서, 다음의 실시에는 또한 하나 이상의 활성 물질을 포함하는 것으로 해석할 수 있다. 비슷한 방식으로 "SCCE"란 용어는 "프로-SCCE"로 대체될 수 있다. 따라서, 프로-SCCE는 물론 SCCE를 구성하는 조성물은 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
SCCE = 임의적으로 다른 활성 화합물과 조합하여, 천연의 또는 재조합 각질층 키모트립신 효소(stratum corneum chymotryptic enzyme)
q.s. = 충분량(quantium satis)
각종 인자의 예 : 항산화제, 킬레이트화제, 방부제, 에멀싱화 시스템 (유상과 수상간의 비율 및 에멀싱화제 및 다른 관련 부형제의 함량).
각종 인자의 예 : 항산화제, 킬레이트화제, 방부제, 에멀싱화 시스템 (유상과 수상간의 비율 및 에멀싱화제 및 다른 관련 부형제의 함량).
각종 인자의 예 : 항산화제
각종 인자의 예 : 항산화제, 킬레이트화제, 방부제, 에멀싱화 시스템 (유상과 수상간의 비율 및 에멀싱화제 및 다른 관련 부형제의 함량).
각종 인자의 예 : 겔 형성제, 항산화제, 킬레이트화제, 방부제.
각종 인자의 예 : 항산화제, 킬레이트화제, 방부제, 재유지화제, 습윤제.
각종 인자의 예 : 항산화제, 킬레이트화제, 습윤제.
각종 인자의 예 : 항산화제, 킬레이트화제, 방부제, 현탁액.
각종 인자의 예 : 항산화제, 페이스트 베이스.
각종 인자의 예 : 항산화제, 스틱-베이스.
각종 인자의 예 : 항산화제, 킬레이트화제, 방부제, 재유지화제, 습윤제.
각종 인자의 예 : 재유지화제, 습윤제.
각종 인자의 예 : 추진제, 항산화제, 킬레이트화제.
각종 인자의 예 : 항산화제, 킬레이트화제, 방부제, 에멀싱화 시스템 (유상과 수상간의 비율 및 에멀싱화제 및 다른 관련 부형제의 함량).
각종 인자의 예 : 샴푸 베이스, 항산화제, 킬레이트화제, 방부제, 습윤제, 컨디셔너.
각종 인자의 예 : 샴푸 베이스, 항산화제, 킬레이트화제, 방부제, 첨가제, 컨디셔너.
각종 인자의 예 : 습윤제, 비누-베이스.
각종 인자의 예 : 분말 베이스, 방부제, 중량비.
각종 인자의 예 : 컨디셔너, 방부제, 킬레이트화제, 항산화제.
유사한 방법으로 SCCE 활성을 저해하거나 향상시킬 수 있는 화합물을 포함하는 국소용 조성물을 제조할 수 있다.
실시예 12
재조합 SCCE 의 데스모솜 분해 활성
완전한 데스모솜을 포함하는 각질세포는 각질층의 심층에 테이프 스트립핑함으로써 피부로부터 제거하였으며, 편평세포는 헥산으로 분리시키고, 등분하여 건조시켰다. 각질세포 분획(3 mg)을 4 ℃에서 1 M 염화나트륨으로 추출하여 내부 단백질분해효소를 용해시킨후, 배양 완충액(0.1 M 트리스/HCl pH 8.0)으로 광범위하게 세정하여 제제로부터 내생 단백질분해 활성을 제거한다. 37 ℃ 에서 24 시간동안10 ㎍ 의 재조합 SCCE의 WSWO 또는 부재하에 0.1 M 트리스 pH 8.0로 배양을 수행하였다. 효소에 의한 데스모솜 분해의 증거는 데스모솜 표지 단백질 데스모글레인 I (DG I)의 수준을 측정함으로써 입증하였다. 콘카나발린 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 DG I 당단백질의 추가 정제로 8M 우레아/2% SDS/β-멀캅토에탄올중에서 추출함으로써 편평세포에서 이를 분리하였다. 콘카나발린 A 용리액을 SDS-PAGE에 의해 분획시키고, 면역블로팅을 위해 전기영동에 의해 PDVF 막으로 이동시켰다. 특이 항혈청을 사용하여 DG I를 동정하고 증가된 화학루미넨스를 사용하여 탐지하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4
표 4 에 제시된 결과는 재조합 SCCE 가 시험관내 분석에서 각질층의 세포내 응집 구조를 분해시킬 수 있음을 보여주고 있다.
실시예 13
재조합 SCCE 의 활성에 대한 저해제의 효과
rSCCE 의 S-2586 가수분해 활성에 대한 아프로티닌, 키모스타틴 및 황산아연인 저해제의 효과를 관찰하였다. 실험 디자인은 실시예 3.2 에 개요되어 있다. 그 결과를 표 5 에 기재하였다.
표 5
상기 표 5 에 제시된 바와 같이, 아프로티닌, 키모스타틴 및 아연 이온은 천연 효소에 관해서와 유사한 방식으로 재조합 SCCE 의 S-2586 가수분해 활성을 저해하였다.

Claims (24)

  1. 서열확인번호 2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  2. 서열확인번호 1의 서열을 실질적으로 포함하는 뉴클레오티드 서열.
  3. SCCE 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드에 대한 프로브(probe) 또는 PCR 프라이머(primer)로 사용되기 위한, 서열확인번호 1의 서열 중 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
  4. 서열확인번호 2의 아미노산 서열 -7-224 또는 1-224를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  5. 제1항에 있어서, 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열확인번호 1의 뉴클레오티드와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열.
  6. 1) 서열확인번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고(가지거나),
    2) 서열확인번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상 상동성을 갖는 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩하고(코딩하거나),
    3) 부다페스트 조약의 규정에 따라 ECACC에 1993년 6월 18일자로 기탁된 기탁번호 ECACC 93061817의 하이브리도마 세포주 TE4b에 의해 제조된 모노클론 항체 또는 ECACC에 1993년 6월 18일자로 기탁된 기탁번호 ECACC 93061816의 하이브리도마 세포주 TE9b에 의해 제조된 모노클론 항체에 의해 결합되는 폴리펩디드를 코딩하는
    뉴클레오티드 서열.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 뉴클레오티드 서열을 보유하고 또한 그 발현을 매개할 수 있는 복제가능한 발현 벡터와 같은, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 시스템.
  8. 부다페스트 조약의 규정에 따라 독일연방공화국 삼릉 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠바하 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM))의 콜렉션에 기탁번호 DSM 82812로 1993년 5월 11일자로 기탁되고 pS507로 명명된 복제 가능한 발현 벡터, 및 상기 기탁된 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열과는 상이하지만, 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 발현 벡터.
  9. 부다페스트 조약의 규정에 따라 독일연방공화국 삼룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠바하 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSM))의 콜렉션에 기탁번호 DSM 8281로 1993년 5월 11일자로 기탁되고 pS500으로 명명된 플라스미드, 및 서열확인번호 1의 뉴클레오티드 서열과는 상이하지만, 서열확인번호 2의 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 엄격한 혼성화 조건하에서 서열확인번호 1의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하면서 SCCE 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 플라스미드.
  10. 제7항에 따른 발현 시스템을 보유하는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)와 같은 세균, 효모, 원생동물과 같은 미생물, 또는 진균과 같은 다세포 생물체로부터 유래한 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 세포 또는 세포주와 같은 인간을 제외한 생물체.
  11. 서열확인번호 2의 아미노산 서열을 가지는 실질적으로 순수한 폴리펩티드.
  12. 서열확인번호 2의 아미노산 서열 -7-224 또는 1-224를 가지는 실질적으로 순수한 폴리펩티드.
  13. SCCE 활성을 가지며 또한 20개 아미노산의 연속적 스트링이 서열확인번호 2의 아미노산 서열로부터 선택된 동일한 길이의 아미노산 스트링과 80% 이상의 상동성을 가지는 실질적으로 순수한 폴리펩티드.
  14. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 뉴클레오디트 서열을 발현 벡터에 삽입하는 단계
    (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 벡터를 사용하여 적절한 숙주 생물체를 형질전환시키는 단계
    (c) 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적절한 조건하에서 단계 (b)에서 제조된 숙주 생물체를 배양하는 단계
    (d) 폴리펩티드를 수집하는 단계, 및
    (e) 임의로는 폴리펩티드를 번역 후 변형시키는 단계
    를 포함하는, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에서 정의된 폴리펩티드의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 생성된 폴리펩티드가 고정화된 천연 또는 재조합 SCCE 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드와 반응성인 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피 및(또는) 다른 크로마토그래피 및 전기영동 방법과 같은 하나 이상의 단계를 포함하는 방법에 의해 단리된 것인 방법.
  16. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는, 화장용 또는 피부 보호용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 크림, 연고, 로션, 도포제, 겔, 용액, 현탁액, 페이스트.,스틱, 스프레이, 샴푸, 비누, 모발 컨디셔너 또는 분말과 같은 국소 투여에 적합한 형태인 조성물.
  18. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는, 좌창, 건피증 또는 기타 과각화증 질병의 치료 또는 예방을 위한 제약 조성물.
  19. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는, 어린선, 좌창, 건선 또는 기타 염증성 피부 질환의 치료 또는 예방을 위한 제약 조성물.
  20. 제11항에 따른 폴리펩티드의 효소 활성에 대해 저해 효과를 가지는 성분을 포함하는, 자가면역 천포창 질환 또는 극세포해리 질환의 치료 또는 예방을 위한 제약 조성물.
  21. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 사용을 포함하는 천연 SCCE의 효소 활성에 대한 효과를 가지는 화합물의 동정 방법.
  22. 제21항에 있어서, 천연 SCCE의 효소 활성에 대해 저해 효과를 가지는 화합물의 동정 방법.
  23. 제22항에 있어서,천연 또는 재조합 SCCE의 효소 활성을 향상시킬 수 있는 화합물의 동정 방법.
  24. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 사용을 포함하는 SCCE 효소 전구체 형태를 활성 SCCE로 전환시킬 수 있는 화합물의 동정 방법.
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