HU220339B - Rekombináns stratum corneum kimotriptikus enzimet (SCCE) kódoló izolált nukleotid-szekvencia, ezt tartalmazó vektor és nem humán gazdaszervezet és eljárás előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát a bőrszaruréteg kimotriptikus enzimének(SCCE=stratum corneum chymotryptic enzym) aktivitásával rendelkezőpolipeptidet kódoló izolált nukleotidszekvencia, valamint ezt hordozóés kifejezni képes expressziós rendszer, az SCCE-aktivitássalrendelkező polipeptid transzgenikus szervezetben történő előállításaés több, kromatográfiás és/vagy eletkroforézises műveletből állótisztítása és a rekombináns úton előállított SCCE-- aktivitássalrendelkező polipeptidet hatóanyagként tartalmazó, a bőr hámrétegénekpikkelyesedési rendellenességeivel járó betegségek kezelésére ésmegelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmények, és kozmetikaikészítmények képezik. ŕ

Description

A találmány tárgyát egy rekombináns polipeptid és a polipeptidet kódoló izolált nukleotidszekvencia, a polipeptid kifejezésére képes expressziós rendszer, a polipeptidet tartalmazó gyógyászati és kozmetikai készítmények és a polipeptid előállítása képezi.

A bőrnek mint szervnek, biológiai, gyógyászati és kozmetikai szempontból van jelentősége. Számos bőrbetegség van, amely vagy szervspecifikus, mint például a pszoriázis és az ekcémák, vagy általános betegség megnyilvánulásai, mint az általános allergiás reakciók. Az a tény, hogy vannak bőrspecifikus megbetegedések, az egyedül a bőr számára létező molekuláris mechanizmusok bizonyítékának tekinthető. Ehhez hasonlóan, a bőrspecifikus molekuláris folyamatok tanulmányozása fontos a bőrelváltozások megértésében és kezelésében. Értelemszerűnek tűnik annak feltételezése, hogy e folyamatok némelyike egyik vagy másik úton rokonságban van a bőr legspecializáltabb funkciójával, azzal, hogy a test külső és belső része között fizikai-kémiai akadályt képez. A bőr fizikai-kémiai akadályt képező része a bőr legkülső rétegében elhelyezkedő szaruréteg.

A bőr szarurétege a bőr legspecializáltabb szerkezete. Ez az epidermisz (a bőr felső hámrétege) differenciálódási folyamatának végterméke, a rétegződött pikkelyes fedőhám, amely indokolja, hogy a bőr legkülső része. Az epidermisz sejtjeinek többsége a differenciálódás különböző stádiumában levő keratinocitákból áll. A legalsó keratinociták, az alapsejtek, az alapmembránon helyezkednek el az irhával érintkezve, amely a bőr összekötő szövete, és ezek az egyedüli keratinociták, amelyek osztódási képességgel rendelkeznek. Az alapsejtek frakciója folyamatosan elhagyja az alapmembránt és egy olyan differenciálódási folyamaton megy keresztül, amely végül a szaruréteget felépítő egységekké alakítja a sejteket. Ebben a folyamatban a keratinociták számos adaptív változáson mennek át. Megnövekszik az epidermiszspecifikus citokeratinokat tartalmazó citoszkeletontartalom. Az összefüggő sejtek közbenső filamentumai funkcionális egységbe kapcsolódnak össze a dezmoszómák megnövekedett száma révén. A legjelentősebb változások a legfelső élősejtrétegből, a stratum granulosumból (a bőr szemcsés rétegéből) a nem élő szarurétegbe történő átmenet alatt történnek egy olyan folyamatban, amelyet többnyire keratinizációnak nevezünk. Kovalensen keresztkötött fehérjék rakódnak le közel a plazmamebrán belső oldalához, nagyon ellenálló sejtborítást képezve. Továbbá egy, a keratinocitaspecifikus sejtorganellumból származó, lipidben gazdag anyag választódik ki az extracelluláris térbe, és lipidlamellák képzése révén - amelyek körülveszik a sejteket a bőr szarurétegében - alkotja a permeábilis akadályt a hidrofil vegyületekkel szemben. Végül a sűrűre tömörödött citokeratin szálakat kivéve, minden intracelluláris szerkezet eltűnik.

A bőr szarurétegének sejtjei, a komeociták tehát nem élők. Ez azt jelenti, hogy a különböző folyamatok szabályozása a bőr szarurétegében egy olyan állapotban történő „programozás” eredménye kell legyen, amelyben a keratinociták még élők. Az epidermisz megújulása - amely normális esetben körülbelül négy hetet vesz igénybe, mialatt a sejtek körülbelül két hétig képezik a bőr szarurétegének részét - a sejteknek a bőr felületéről történő leválásával, a pikkelytelenedés folyamatával végződik. Ez a folyamat egy példa a bőr szarurétegének „programozására”. A bőr szarurétegének, mint fizikai-kémiai gátnak a funkciójához előfeltétel, hogy egyes sejtjeit mechanikailag ellenálló szerkezetek tartják össze, ezek a dezmoszómák. A dezmoszómák lebomlásának, amely a pikkelytelenedés előfeltétele, úgy kell szabályozódnia, hogy a sejtek leválása a bőr felületéről egyensúlyban legyen a bőr szarurétegének de novo termelődésével anélkül, hogy megzavarná a szövet gátfunkcióit.

A keratinizáció rendellenességei

A bőr nagyszámú, változó hevességű patológiás állapotai mögött a keratinizációs folyamatban bekövetkezett zavarások állnak. A pszoriázisban a tipikus krónikus gyulladáson kívül e betegségre tipikus hámlás lép fel, amelyet az éretlen bőrszaruréteg túltermelése eredményez. Az öröklött bőrbetegségek egy csoportja, amelyre a „halpikkely”-képződéshez vezető, megvastagodott bőrszaruréteg jellemző, az úgynevezett ichthyosis (halpikkelybőrűség). Az ichthyosisok néhány eseténél a pikkelytelenedés csökkent aránya áll fenn. Bár jóval ritkább, mint az ichthyosisok a „száraz bőr” (xeroderma) szintén olyan bőrszaruréteggel jellemzett, amelyről a komeociták nem normális körülmények között hámlanak le egyes sejtekként vagy sejtek kis aggregátumaiként, hanem nagy, szabad szemmel látható hámlás formájában. Ez a rendellenesség nagyon gyakori öregedő embereknél és atópiások (atópia=veleszületett allergiás túlérzékenység) körében, akik a bőrt irritáló anyagokkal szemben csökkent ellenállást mutató egyedek, és hajlamuk van az endogén ekcéma jellemző formájának kifejlődésére. Az akne (pattanás, mitesszer) betegségeknél zavart keratinizáció áll fenn a faggyúmirigyek kijárataiban, amely comedók (faggyúdugaszok) és eltömődések képződéséhez vezet. A comedók létrejötte megelőzi és valószínűleg kiváltja a gyulladásos akne laesiókat (bántalmakat).

A keratinizációban proteolitikus enzimek működnek közre

A keratinizációs folyamat és a bőr szarurétegének megújulása több lépcsőből áll, ahol úgy tűnik, hogy a proteolitikus enzimek fontos szerepet játszanak. Mindenesetre, az összes intracelluláris szerkezet - kivéve a citokeratin szálakat - eltűnésének az élő és az elszarusodott hámrétegek közötti átmenet során magában kell foglalnia a proteolízist. A profilaggrinnak - egy olyan fehérjének, amelyről feltételezik, hogy közreműködik a citokeratin szálak specifikus aggregációjában a keratinizáció során - filaggrinná történő transzformációját specifikus proteináz katalizálhatja. A bőr szarurétegében a filaggrin tovább bomlik olyan kis molekulatömegű komponensekre, amelyek valószínűleg fontosak, mint „természetes hidratálok”. Továbbá előfordulnak citokeratin polipeptidek proteolitikus módosulatai a keratinizációs folyamat alatt. Végül, a proteolízisek valószínűleg döntő szerepet játszanak a bőr szarurétegében a sejtek közötti összetartó szerkezetek lebontásában

HU 220 339 B olyan folyamatokban, amelyek végül pikkelytelenedéshez vezetnek.

A sejteket összetartó erő és pikkelytelenedés a bőr szarurétegében. Dezmoszómák szerepe

A sejtek közötti összetartó erőt a bőr szarurétegében, valamint az epidermisz élő részeiben jelentős mértékben a dezmoszómák közvetítik. A dezmoszóma két szimmetrikus fél részből áll, amelyeknek mindegyikét két szomszédos sejt alkotja. Mindegyik dezmoszómális fél rész rendelkezik egy, a citokeratin szálakhoz kapcsolódó intracelluláris résszel és egy glikoproteinekkel kiegészített, intracellulárisan rögzített résszel és transzmembrán és extracelluláris részekkel. Ezeknek a fehérjéknek az extracelluláris részei - a dezmogleinek adhéziós molekulák, és ezeknek egymással való kölcsönhatásain keresztül az extracelluláris térben összetartó szerkezet képződik, A dezmoszómák lebomlása, úgy tűnik, némiképp más útvonalat követ a tenyér és a talp bőrének szarurétegében a nem tenyér- vagy talpbőrszaruréteggel összehasonlítva. Az utóbbi szövetben a dezmoszómák körülbelül 85%-a hamarosan eltűnik, mihelyt a sejtek teljesen elszarusodtak. A maradék dezmoszómák, amelyek kedvezően helyezkednek el az extrém lapos sejtek puha szőrű szegélyein, láthatóan érintetlenek maradnak addig a szintig, ahol végbemegy a pikkelytelenedés. A tenyér és a talp bőrének szarurétegében a komeociták sokkal kevésbé laposak, és itt nem megy végbe a dezmoszómák kiteijedt lebomlása a szövet mélyebb rétegeiben. A pikkelytelenedés mindkét szövetben összefüggésben van a dezmoszómális lebomlással. Az ichthyosisos bőr, valamint a „száraz bőr” esetében kimutatták, hogy növekedett a dezmoszómák száma a bőr szarurétegének felszíni rétegeiben.

A bőr szarurétegének intercelluláris lipidjei

A tenyér- és talp- és a nem tenyér- és talpbőrszaruréteg dezmoszómális lebomlása közötti különbség kapcsolatban lehet a két szövettípus extracelluláris lipidjei mennyiségének különbségével. A lipidtartalom jelentősen magasabb a nem tenyér- és talpbőrszarurétegben. Ennek következtében e szövetnek mint permeábilis akadálynak a teljesítőképessége vízzel és más hidrofil vegyületekkel szemben kiválóbb, mint a tenyér- és talpbőr szarurétegének. Mivel a dezmoszómák jelentős térfogatot foglalnak el és mivel az érintetlen dezmoszómák megakadályozzák az extracelluláris tér kitágulását, a dezmoszómális lebomlás olyan mechanizmus szerint mehet végbe, amelynek révén több extracelluláris tér áll rendelkezésre a lipidek számára. A bőr szarurétegének extracelluláris lipidjei több más úton is kapcsolatban vannak a pikkelytelenedéssel. Mivel ezek az extracelluláris tér fő alkotórészei, várhatóan fontos befolyásuk van az ezen a helyen működő enzimek aktivitására, például a dezmoszómális lebomlásért felelős enzimekére. Valóban, a lipidmetabolizmus különböző zavarairól kimutatták, hogy az ichthyosis néhány típusának valószínű okozója. Valószínű az is, hogy valamilyen mértékben maguk a lipidek is hozzájárulnak a bőr szarurétege sejtjeinek összetartásához. Ezenkívül a lipidek kiválasztása a bőr szarurétegének extracelluláris terébe valószínűleg számos enzim kiválasztásával is kapcsolatban van. A lipidek prekurzorai a felső élő keratinocitákban raktározódnak, specifikus sejtszervecskékben. Ezekről az úgynevezett lamellás testekről kimutatták, hogy számos hidrolizáló enzimet tartalmaznak. Ezt tehát úgy tekinthetjük, hogy a bőr szarurétegében történő dezmoszómális lebomlásért felelős enzim a keratinociták segítségével szintetizálódik, esetleg inaktív előenzim formájában, a lamellás testekben raktározódik és a keratinizáció alatt kiválasztódik a bőr szarurétegének extracelluláris terébe, ahol - más faktorok között - az extracelluláris lipidek összessége aktiválhatja és aktivitását tovább szabályozhatja.

A sejteket összetartó erő rendellenességei az élő epidermiszben

Számos olyan bőrbetegség létezik, amelyeknél megromlott a keratinociták közötti összetartó erő az el nem szarusodott, élő felhámrétegekben. Ezek a betegségek az acantholysisnek nevezett jelenséggel jellemezhetők, amely az egyébként látszólag normális keratinociták közötti dezmoszómális érintkezés zavara. A folyamatot valószínűleg olyan proteinázok közvetítik, amelyeket eddig még teljes mértékben nem azonosítottak. Az acantholysis - amely ha kiterjedt, hólyagképződéshez vezet - a pemphigus vulgáris (idült, hólyagképződéssel járó bőrbetegség) és pemphigus foliaceus (rétegesen lefoszló hámrétegekkel járó hólyagképződéses bőrbetegség), az örökletes jóindulatú családi pemphigus (HayleyHayley’s betegség) és az örökletes dyskeratosis folliculáris (Darier’s betegség) autoimmun betegségekre jellemző.

Az epidermisz aktívan részt vesz az immunológiai és gyulladásos reakciókban

A test belseje és külseje között képzett fizikai-kémiai akadály funkcióján felül az epidermisz aktív immunológiai akadályként is működik. A keratinociták rendelkeznek a válaszadás képességével nagyszámú citokinre ugyanúgy, mint más gyulladást okozó közvetítőkre, amelyeken keresztül érintkeznek és kölcsönhatásba lépnek az immunológiai és gyulladáskeltő rendszerek sejtjeivel. Ez a legfontosabb a gazdaszervezet mikrobiális fertőzésekkel szembeni védekezésében és a sebek gyógyulásában. A modem kutatás azt is kimutatta, hogy a keratinociták valószínűleg aktívan részt vesznek sok gyulladásos bőrbetegségben, úgymint a pszoriázisban és ekcémákban.

Epidermális proteinázok fontosak lehetnek a gyulladásban

A keratinociták által termelt citokinek egyike az interleukin-1 (IL-1). Az IL-1 két formában létezik, IL- la és IL-1 β, amelyek közül mindkettő megtalálható az epidermiszben. Miközben az IL-Ία teljesen aktívan szintetizálódik, az IL-Ιβ egy inaktív, 31 kD elővegyület formájában szintetizálódik. Az elő-IL-Ιβ például a monocitákban jelen levő, de eddig a normál epidermiszben még ki nem mutatott, specifikus proteináz segítségével alakul át az aktív 17 kD formává. Számos, kimotripszinhez hasonló szubsztrátspecificitással rendelkező szerinproteináz (pankreász kimotripszin és a neutrofil granulociták katepszin G-je) szolgálhat azonban elő-IL-Ιβ aktivátorként.

HU 220 339 Β

Ahogyan azt Norris [J. Invest. Dermatol., 95, 371 (1990)] felvetette, a bőr szarurétegének intracelluláris terében jelen levő proteolitikus enzimek, bizonyos körülmények között, képesek lehetnek a citokinek inaktív formáit aktív formákká átalakítani. Különösen fontos ebben az összefüggésben a biológiailag inaktív elő-interleukin-ΐβ, amelyről kimutatták, hogy keratinociták termelik [Mizutani et al., J. Clin. Invest., 87, 1066-1071 (1991)]. Mindeddig nem találtak elő-interleukin-ip-t aktív interleukin-ip-vá átalakítani képes epidermális enzimet. Mivel azonban a kimotripszin és katepszin G (kimotripszinhez hasonló enzim) rendelkezik az inaktív 31 kD rekombináns elő-interleukin-ip-t a teljes mértékben aktív 17 kDa-os formává történő átalakítás képességével, lehetséges, hogy epidermális kimotripszinhez hasonló enzimek is képesek katalizálni ezt az átalakulást.

A találmány részletes leírása

A találmány tárgyát egy olyan enzim képezi, amelyet a bőrszaruréteg kimotriptikus enzim (stratum corneum chymotryptic enzyme=SCCE) kifejezéssel illetünk, amelyet felelősnek tartunk a bőr szarurétegében történő dezmoszómális lebomlásért. Bizonyítékot az 1. példa képvisel, mutatva, hogy a bőr elszarusodott felszíni rétegének felületéről történő sejtleválás magában foglalja a dezmoszómális fehérjék lebomlását, és hogy az ezért felelős enzim kimotripszinhez hasonló szerinproteináznak tűnik, amely cinkionokkal gátolható.

A 2. példa a bőrszaruréteg kimotriptikus enzimjének (az SCCE-nek) a felfedezését írja le; egy proteinázt, amely teljes mértékben eleget tesz annak a követelménynek, hogy felelős az intracelluláris összetartó szerkezetek lebomlásáért a bőr szarurétegében in vitro és talán in vivő is. A 3. példa a bőrszaruréteg kimotriptikus enzim (SCCE) aktivitásának részleges jellemzését ltja le kromogén szubsztrátok alkalmazásával.

Az eredmények azt mutatják, hogy az SCCE-enzimológiailag különbözik más kimotriptikus proteinázoktól. A kimotripszinhez hasonló enzimek inhibíciós profilja és két különböző szubsztrátot lebontó képessége jelentősen különbözik az SCCE-nél a szarvasmarha-kimotripszinnel és a humán katepszin G-vel összehasonlítva. Úgy tűnik, az SCCE különbözik a humán emlősejtkimáztól is. Az utóbbi enzim hatásosan katalizálja a Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA lebomlást [Schwartz et al., J. Immunoi., 138, 2611-2615 (1987) és Schechter et al., J. Bioi. Chem., 264, 21 308-21 315 (1989)] - amelyet az SCCE nem - és aprotinin vagy SBTI nem gátolja [Schechter et al., J. Bioi. Chem., 258, 2973-2978 (1983) és Wintroub et al., J. Clin. Invest., 77, 196-201 (1986)], amelyek az SCCE-t igen.

A 4. példa az SCCE részleges tisztítását írja le a komeociták KCl-os kivonatából affinitáskromatográfia segítségével, oldhatatlan szójababtripszin-inhibitoron (insolubilized soybean trypsin inhibitor=SBTI) és az SCCE N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározását. A nem redukált mintákkal az 1-6. lépésekben jó volt a hozam, de a 7. és 9. lépésben nullára zuhant, és az ezt követő lépésekben határozottan csökkent. A redukált mintákkal sem tudtunk kimutatni aminosavszármazékokat a 7. és 9. lépésekben, a következő lépésekben azonban, ahol származékokat ki tudtunk mutatni, nem volt meredek visszaesés a hozamban. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a 7. és 9. helyzetben ciszteinek vannak. Nem volt azonban lehetséges karboximetilált cisztein kimutatása a 7. és 9. lépésben redukció és jódecetsavas (100 mM) kezelés után. A kapott szekvencia (13. ábra, 3. számú szekvenciavázlat) a redukált és nem redukált mintáknál azonos volt.

Az 5. példa leírja az SCCE-specifikus monoklonális antitestek és poliklonális SCCE-specifikus csirke- és nyúlantitestek előállítását éppúgy, mint a monoklonális antitestekkel történő immunhisztokémiai vizsgálatokat.

A 6. példa leírja a humán SCCE-t kódoló cDNS klónozását és szekvenálását. Először epidermális eredetű, felnőtt humán keratinocitákból származó mRNS-ből készült cDNS-könyvtárat screeneltünk anti-SCCE nyúl poliklonális antitestekkel. Az antitestek egyike magas háttérszignált adott és kizártuk a kiterjedt screenelésből egy korai szakaszban. Egy másik poliklonális antitestet használva (D-5) számos immunreaktív plakkot dúsítottunk, mint valóban pozitívnak ígérkező plakkokat. A 4. moAb és 9. moAb monoklonális antitestekkel azonban egyik plakknál sem figyeltünk meg reaktivitást. Tizenegy izolált plakk kiterjedt restrikciós enzimes jellemzése és PCR-jellemzése azt mutatta, hogy a különböző plakkok között nem volt kimutatható hasonlóság. Okulva ebből a hibából, egy lehetséges SCCE-cDNS-szekvencia „ujjlenyomatának” definiálása céljából módosítani kellett a stratégiát.

Az SCCE immunreaktív anyagnak a szuprabazális keratinocitákban való kedvező kimutatása ellenére, tenyésztett humán keratinocitákból készített cDNSkönyvtárat használtunk az SCCE-cDNS screenelésére. Egy ilyen könyvtár várhatóan csak bazális keratinocitákból származó cDNS-t tartalmaz. Ez a próba egy gyenge, de valószínűleg szignifikáns immunfestődés megfigyelésén alapult, amelyet szintén bazális keratinociták SCCE monoklonális antitestjeinek felhasználásával végeztünk.

A plakkokat olyan szintetikus 17 tagú oligonukleotid-próba felhasználásával screeneltük, amelyet a 4. példában leírt natív SCCE-enzim kísérletileg meghatározott aminoterminális szekvenciájának legmegbízhatóbb aminosavszekvencia részére, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (10. számú szekvenciavázlat, 1-6. aminosavak) alapozva terveztünk meg. A kísérletileg meghatározott aminosavszekvencián belül adódó bizonytalanság alapján úgy ítéltük meg, hogy ez a hexapeptid képviseli az egyik legmegbízhatóbb részt. Ezenfelül az ezt a hexapeptidet kódoló lehetséges kodonok eredményezték a DNS-próba lehetséges legalacsonyabb degenerációját. A hosszabb, kísérletileg meghatározott szekvenciát, Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu (3. számú szekvenciavázlat, 15-24. aminosavak) kizártuk annak a szekvenciának magas fokú degenerációja miatt, amely ezt a peptidszekvenciát kódolja. Tizennégy pozitív plakkot azonosítottunk az első screenelésnél. Ezeket a pozitív plakkokat újra screeneltük, ugyanazt a próbát

HU 220 339 Β és módszereket használva, mint fent. Az újrascreenelési eljárás után két pozitív plakkot azonosítottunk. A két kiválasztott plakkot még egyszer tisztítottuk, és PCR segítségével - a két fág karjaival komplementer SYM 1600-at és SYM 1601-et használva primerekként és izolált fágokat tempótokként - meghatároztuk az inszertek méretét. Ezt a klónozott fragmentumot vetettük alá részleges szekvenciaanalízisnek.

A kapott DNS-szekvencia transzlációja olyan aminosavszekvenciát eredményezett, amely homológ a kísérletileg meghatározott fehérjeszekvenciával. A szekvenciából azonban hiányzott a transzlációs startkodon. Teljes hosszúságú cDNS izolálása céljából a kapott DNS-fragmentumot agarózgélen szeparáltuk és próbaként használtuk a hibridizációhoz szigorú körülmények között. Teljes hosszúságú cDNS kinyerése céljából ezzel a próbával kétszer újra screeneltük a cDNSkönyvtárat ugyanazokat a módszereket használva, mint fent, kivéve, hogy a hibridizációt szigorú körülmények között 65 °C-on végeztük. Ezek a kísérletek 45 olyan egyedi pozitív plakk azonosítását és izolálását eredményezték, amelyeket kezdetben PCR-analízissel screeneltünk primerként SYM 1600-at vagy SYM 1601-et SYM 3208-cal kombinációban alkalmazva, a teljes 5’ nyílt leolvasási keretet tartalmazó plakkok azonosítására.

További screenelés és szekvenciaanalízis után az eredményül kapott, ezekből a fágokból származó PCRrel megsokszorozott fragmentumokat klónoztuk, ahogyan azt részletesen leírtuk a 6. példában, és az eredmények azt jelezték, hogy a fágok egyike, a 205.2.1, tartalmazta a teljes hosszúságú inszertet. A cDNS-fragmentum teljes nukleotidszekvenciáját meghatároztuk. A nukletoidszekvencia (1. számú szekvenciavázlat) egy olyan nyílt leolvasási keretet tartalmazott, amely elegendő egy 253 aminosavat - beleértve a szignálpeptidet és előpolipeptidet - tartalmazó SCCE prekurzor fehérje egész aminosavszekvenciájának (2. számú szekvenciavázlat) kódolására.

A 7. példa két olyan SCCE mRNS-species kimutatását írja le a humán epidermiszben, amelyek képesek voltak SCCE-cDNS-szekvencia alapján elkészített cDNSpróbákkal hibridizálni.

A 8. példa a rekombináns SCCE kifejeződését írja le E. coliban. Az eredmények azt mutatják, hogy lehetséges rekombináns SCCE előállítása baktériumokban.

A 9. példa a rekombináns humán SCCE kifejeződését írja le emlőssejtekben. Három olyan fehérjét állítottunk elő, amelyek minden hozzáférhető poliklonális nyúl- és csirke-SCCE-antitesttel ugyanúgy, mint a letétbe helyezett monoklonális antitesttel reakciót mutatnak. Azok a rekombináns fehérjék, amelyek reaktívak a natív SCCE elleni antitestekkel, olyan látszólagos molekulatömeget mutatnak, amely körülbelül 1 kDanal nagyobb, mint a tisztított natív humán SCCE. A rekombináns fehérje nem rendelkezik proteolitikus aktivitással.

A rekombináns SCCE tisztítását, aktiválását és további jellemzését a 10. példában írjuk le. A rekombináns SCCE inaktív előformája aktiválható tripszinnel vagy endopeptidáz Lys-C-vel történő proteolitikus hasítás révén. Úgy tekintjük, hogy számos más proteáz, amely a pepiidet bázikus aminosav után hasítja, úgymint endoproteináz Lys-C, pápáin és plazmin, képes lesz aktiválni az elő-SCCE-t aktív SCCE-vé. Azt találtuk, hogy a szignálpeptid 22 aminosavból áll, és a natív, aktív SCCE N-terminális aminosavszekvenciáján alapul, az előpeptid hét aminosavból áll. Továbbá megmutatjuk, hogy az előállított rekombináns SCCE két Nglikozilált formában és egy nem glikozilált formában létezik, amely hasonló az aktív, natív SCCE-vel kapott eredményekhez.

A „bőr szarurétegének (stratum comeum) kimotriptikus enzimje (SCCE)” vagy az „SCCE-aktivitással rendelkező polipeptid” kifejezések alatt, ezek tágabb értelmében, olyan szerinproteázt vagy annak előformáját, úgymint előenzimet (elő-SCCE-t) vagy fúziós fehérjét értünk, amely proteolitikus hasítással aktiválható, a nevezett enzimet aktív formájában ugyanazok az inhibitorok gátolják és hasonló módon, mint a spontán sejtdisszociációt, amelyet modellrendszerekben a bőr szarusodott rétege mintáinak semleges vagy semlegeshez közeli pH-η, fiziológiás hőmérsékleten történő inkubálásával válthatunk ki.

Még kifejezettebben, az „SCCE-aktivitással rendelkező polipeptid” kifejezés tehát egy olyan polipeptidet definiál, amely különbözik a kimotripszintől és katepszin G-től, és amely aktív formájában képes a MeOSuc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) szubsztrát lebontására, a polipeptid általi lebontást alapvetően gátolja az aprotinin, kimosztatin és cink-szulfát, ahogyan azt a 3. és 13. példákban leírjuk és a 9. ábrán, valamint az 5. táblázatban szemléltetjük.

Még inkább kifejezetten, az „SCCE-aktivitással rendelkező polipeptid” kifejezés magában foglal egy olyan polipeptidet, amely a dezmoszómális fehéije, a dezmoglein I proteolitikus lebomlását képes előidézni a talp bőrének szarurétegében in vitro inkubáció során.

Egy ilyen polipeptid általában reagál a natív SCCE elleni antitestekkel is, amelyeket a talp bőrének szarurétege disszociált sejtjeinek kivonatából tisztítottunk. Példák ilyen antitestekre az 5.2.-ben leírtak szerint előállított poliklonális antitestek és az 5.1. példában leírtak szerint előállított TE4b és TE9b monoklonális antitestek. A monoklonális antitesteket a TE4b és TE9b hibridómák segítségével állítjuk elő, amelyek az European Collection of Animál Cell Cultures, Proton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom gyűjteményben az ECACC 93061817 és ECACC 93061816 beszerzési számok alatt vannak letétbe helyezve, a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően.

A humán SCCE-t kódoló cDNS klónozását és szekvenálását a 6. példában írjuk le. Találtunk egy olyan nyílt leolvasási keretet tartalmazó nukleotidszekvenciát, amely elegendő egy 253 aminosavat - beleértve a szignálpeptidet és előpolipeptidet - tartalmazó SCCE prekurzor fehérje egész aminosavszekvenciájának kódolására. A nukleotidszekvenciát az 1. számú szekvenciavázlatban mutatjuk be és az abból levezetett, a „bőr5

HU 220 339 Β szaruréteg kimotriptikus enzim (SCCE)” aminosavszekvenciáját a 2. számú szekvenciavázlatban mutatjuk be.

Az „elő-SCCE vagy annak analógja vagy változata” kifejezés alatt egy olyan polipeptidet értünk amely a 2. számú szekvenciavázlatban leírt szekvenciával vagy a nevezett szekvencia analógjával, vagy változatával rendelkezik -, amely akkor termelődik, ha a találmány szerinti nukleotidszekvenciát megfelelő expressziós rendszerben fejezzük ki, és amely proteolitikus aktiválással szerinproteinázzá alakul, amelyet ugyanazok az inhibitorok gátolnak, mint a modellrendszerekben a bőr szarusodott rétege mintáinak semleges vagy semlegeshez közeli pH-η, fiziológiás hőmérsékleten, azaz körülbelül 37 °C-on történő inkubálásával kiváltható spontán sejtdisszociációt. A fehéije általában reagál a tisztított natív vagy rekombináns SCCE elleni antitestekkel.

Az „SCCE vagy annak analógja vagy változata” kifejezés alatt egy olyan polipeptidet értünk - amely a 2. számú szekvenciavázlatban leírt szekvenciával vagy a nevezett szekvencia analógjával vagy változatával rendelkezik -, amely akkor termelődik, ha a találmány szerinti nukleotidszekvenciát megfelelő expressziós rendszerben fejezzük ki, és amely egy olyan szerinproteináz, amelyet ugyanazok az inhibitorok gátolnak, mint a modellrendszerekben a bőr szarusodott rétege mintáinak semleges vagy semlegeshez közeli pH-η, fiziológiás hőmérsékleten, azaz körülbelül 37 °C-on történő inkubálásával kiváltható spontán sejtdisszociációt. A fehérje általában reagál a tisztított natív vagy rekombináns SCCE elleni antitestekkel.

Az „analógja vagy változata” kifejezés alatt olyan polipeptidet értünk, amely nem pontosan a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvenciával rendelkezik, de még rendelkezik a fent definiált „SCCE-aktivitással”. Ilyen polipeptidek általában azok a polipeptidek, amelyek eltérnek - például bizonyos mértékben az aminosav-összetételben vagy a poszttranszlációs módosulatokban, például glikozilációban vagy foszforilációban - a példákban leírt SCCE fehérjétől.

Az „analóg” vagy „változat” kifejezéseket tehát ebben a szövegösszefüggésben olyan fehérje vagy polipeptid jelzésére használjuk, amelynek az aminosavÖsszetétele vagy szekvenciája hasonló a 6. példában leírt, SCCE fehérjéből leszármaztatott 2. számú szekvenciához, megengedve olyan kisebb eltéréseket, amelyek megváltoztatják az aminosavszekvenciát - például kivágásokat, irányított mutációkat, extra aminosavak beszúrását vagy ezek kombinációját - SCCE-fehéije analógokat létrehozva. Ezek a módosítások az analógok érdekes és hasznos új tulajdonságait eredményezhetik. Az analóg polipeptidek vagy fehéijék lehetnek állati vagy humán, vagy részlegesen vagy teljesen szintetikus eredetűek. Az analógok származhatnak rekombináns DNS-technikák alkalmazásából is.

A találmánynak egy fontos kiviteli alakja tehát egy olyan polipeptid, amelyben legalább egy aminosavmaradékot eltérő aminosavmaradékkal helyettesítettünk, és/vagy amelyben legalább egy aminosavmaradékot kivágtunk vagy beszúrtunk oly módon, hogy a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvenciától különböző aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet vagy a nevezett aminosavszekvenciának a következőkben definiált alszekvenciáját kapjuk eredményül, amelyek azonban rendelkeznek a fent definiált SCCE-aktivitással.

A találmánynak egy érdekes kiviteli alakja egy olyan polipeptid, amely analógja vagy alszekvenciája az 50-250 aminosavat - például legalább 70 aminosavat, legalább 100 aminosavat, legalább 150 aminosavat vagy legalább 200 aminosavat - tartalmazó, találmány szerinti polipeptidnek.

A találmánynak különösen fontos kiviteli alakjait képezik azok a polipeptidek, amelyek a 2. számú szekvencia -7-224. aminosavszekvenciájával (elő-SCCE) és azok a polipeptidek, amelyek a 2. számú szekvencia 1-224. aminosavszekvenciájával (SCCE) rendelkeznek.

Az „enzimesen aktív alszekvencia” kifejezés olyan polipeptidszekvenciát jelöl, amely a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott polipeptidszekvenciának csak egy részét tartalmazza, és amelyik enzimes aktivitással rendelkezik. Tehát olyan polipeptid-alszekvenciákat értünk bele, amelyeket az itt tárgyalt módosításokkal analogizáltunk. Az enzimes aktív helyet tartalmazó specifikus polipeptidet (vagy polipeptideket) különösen érdekesnek tartjuk.

Az említett 2. számú aminosavszekvenciát összehasonlítottuk a humán kimotripszin [Toulta et al., BBRC, 158, 569-575], humán katepszin G [Salvesen et al., Biochemistry, 26, 2289-2293] és a humán emlősejtkimáz [Caughey et al., J. Bioi. Chem., 266, 12 956-12 963] enzimek aminosavszekvenciáival. Bár a levezetett aminosavszekvencia tartalmazza a szerinproteázok konzervált aktív régióit, a homológia foka meglehetősen alacsony, körülbelül 33-38%. Ebben a tekintetben tehát úgy tűnik, hogy az SCCE csak mérsékelt hasonlóságot mutat az előzőleg ismert szerinproteinázokkal. Másrészt az SCCE tipikus szerinproteináz, ami az aktív hely hisztidin-, aszpartát- és szerinmaradékait és az ezekhez a helyekhez közeli konzervált régiókat illeti. Ez igaz a legtöbb ciszteinmaradékra és a szerinproteinázok más, nagymértékben konzervált régióira is. Az első specifikus zseb alján (189. aminosavmaradék a kimotripszinben) egy szerinmaradék található a humán kimotripszinben, az emlősejtkimázban és a prosztataspecifikus antigénben, és egy alaninmaradék a humán katepszin G-ben. Az SCCE-ben másrészt ezt a helyet egy aszparaginmaradék foglalja el. Ez magyarázhatná azt a felfedezést, hogy bár az SCCE kétségtelenül rendelkezik kimotriptikus aktivitással, különböző kromogén peptidszubsztrátokkal szembeni relatív aktivitása eltér a kimotripszintől és katepszin G-től, ahogyan eltér a kimosztatinnak, a kimotripszinhez hasonló enzimek kis molekulatömegű inhibitorának gátló hatékonysága.

A humán kimotripszin, humán katepszin G és humán emlősejtkimáz és az SCCE szekvenciáinak összehasonlítását a szekvenciák következő sorba állításával mutatjuk be.

HU 220 339 Β

SCCE

HUMCTRP

HUMCHTG

HUMCHYM

11DGAPCARGSHPWQVALLSGNQLHH. .CGGVLVNERWVLTAAHCKMN I VNGEDAVPGSWPWQVS LQDKTGFHF.. .CGGS LI S EEWWTAAHCGVR 11GGRESRPHSRPYMAYLQIQS PAGQS . RCGGFLVREDFVLTAAHCWGS IIGGTECKPHSRPYMAYLEIVTSNGPSKFCGGFLIRRNFVLTAAHCAGR

SCCE EYTV.. HLGSDTLGDRRA. QRIKASKS FR. HPGYSTQTHVNDLMLVKLN

HUMCTRP TSDVWAGEFDQGSDEENI . QVLKIAKVFK. NPKFS ILTVNNDITLLKLA

HUMCHTG NINV...TLGAHNIQRRENT .QQHITARRAIRHPQYNQRTIQNDI ML LQLS

HUMCHYM SI TV...TLGAHNITEEEDTWQKLEVIK.QF . RHPKYNTSTLHHDIMLLKLK

SCCE

HUMCTRP

HUMCHTG

HLMCHYM

SQARLSSMVKKVRLPSRC. . E. . PPGTTCTVSGWGTTTS PDVTFPSDLMC TPARFSQTVSAVCLPSADDDF..PAGTLCATTGWGKTKYNANKTPDKLQQ RRVRRNRNVNPVALPRAQ. . EGLRPGTLCTVAGW3RVSMRRGTDTLREVQ EKASLTLAVGT..LPFPSQFNFVPPGRMCRVAGWGRTGVLKPGSDTLQEV

110

140

SCCE

HUMCTRP

HUMCHTG

HUMCHYM

VDVK.L IS PQDCTEVYKDLLENSMLCAGI PDSKKNA. CNGDSGGPLVCRGT AALPLLSNAECKKSW3RRITDVMICAGA. GVS S . CMGDSGGPLVCQKD LRVQRDRQ..CLRIFGSYDPRRQICVGDRRERKAAFK.GDSGGPLLCNNV KLRLMDPQA.CSHFRDFDHNL.QLCVGNPRKTKSAFK.GDSGGPLLCAGV

T

170 200

SCCE

HUMCTRP

HUMCHTG

HUMCHYM

LQ.... GLVSWGIFPCGQ GAWTLVGIVSW3SDTCST AH....GIVSYGKSSGVP AQ....GIVSYGRSDAKP

A sorba állítást manuálisan végeztük el.

HUMCTRP=human chymotrypsin (humán kimotripszin) [Touita et al., BBRC, 158, 569-575 (1989)] HUMCHTG=human cathepsin G (humán katepszin G) [Salvesen et al., Biochemistry, 26, 2289-2293 (1987)] HUMCHYM=human mást cell chymase (humán emlősejtkimáz) [Caughey et al., Bioi. Chem., 226, 12 956-12 963(1991)]

Homológiák:

HUMCTRP/SCCE: 85/224=38%

HUMCHTG/SCCE: 74/224=33%

HUMCHYM/SCCE: 74/224=33%

HUMCHTG/HUMCHYM: 109/226=48%

A számozás kimotripszinogénre (chymotrypsinogen) vonatkozik.

Aláhúzások:

Az aktív helyhez közeli konzervált régiók (Ile 15, His 57, Asp 102, Ser 195 a kimotripszinben) és a kimotripszin első specifikus zsebe (Ser 189, Ser 213, Trp 215, Gly 226 a kimotripszinben).

Csillag:

Lehetséges N-glikozilációs hely az SCCE-ben.

A találmánynak egy fontos kiviteli alakját tehát egy olyan polipeptid képezi, amely olyan aminosavszekven*

PNDPGWTQVCKFTKWINDTMKKHR

S S.PGVYARVTKLIPWVQKILAAN . . . PEVFTRVSSFLPWIRTTMRSFKLLDQMETPL ...PAVFTRISHYRPWINQILQAN •

230 ciával rendelkezik, amelyből 20 aminosav egymást követő szála legalább 95%-ban homológ a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciából ki40 választott, azonos hosszúságú szállal.

A találmány szerinti polipeptidszekvenciák, amelyek legalább 95% homológiát mutatnak a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott polipeptiddel, fontos kiviteli alakot képeznek. Mivel a 2. számú szekvenciaváz45 latban bemutatott szekvencia meglehetősen egyedinek tűnik, a találmány hatókörébe tartoznak olyan polipeptidek, amelyeknél a homológia foka a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciából kiválasztott, egymást követő 20 aminosav hasonló szálá50 val nem lehet több mint 55%, noha előnyösen nem több mint 70%. Ilyen szekvenciák más fajok hasonló fehérjéiből származtathatók, például más emlősökből, úgymint egérből, patkányból, nyúlból, tengerimalacból, sertésből vagy tehénből. Mivel a szekvencia kisebb részei észreve55 hető hasonlóságokat mutathatnak más szerinproteázokkal, a találmány hatóköre felölel olyan peptideket is, amelyeknél a homológia foka legalább 95% és még előnyösebben legalább 99% a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciából kiválasztott, egy60 mást követő 20 aminosav hasonló szálával.

HU 220 339 Β

A „szekvenciahomológia” kifejezés alatt az aminosavszekvenciában levő azonosságot értjük két vagy több aminosav szegmentjeiben az összeillesztésnél, tekintettel a polipeptidek aminosavjainak azonosságára és helyzetére.

A „homológ” kifejezést tehát itt az adott polipeptid aminosavszekvenciája és a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvencia közötti azonosság fokának szemléltetésére használjuk. A 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciával összehasonlítandó aminosavszekvenciát levezethetjük nukleotidszekvenciából - úgymint DNS- vagy RNSszekvenciából, amelyet például a következtőkben definiált hibridizációval kapunk - vagy megkaphatjuk hagyományos amlnosavszekvenálási módszerekkel. A homológia fokát előnyösen az érett polipeptid aminosavszekvenciáján határozzuk meg, azaz anélkül, hogy vezető szekvenciákat figyelembe vennénk. Általában csak kódolórégiókat használunk, ha nukleotidszekvenciákat hasonlítunk össze azok belső homológiájának meghatározása céljából.

A jelen összefüggésben „a polipeptid, amelyet a letétbe helyezett antitesteknek legalább egyike felismer” kifejezés olyan aminosavszekvencia felölelésére irányul, amely tartalmazza a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott polipeptid bármelyik alszekvenciája lineáris vagy térbeli konformációjának kifejezéseiben lényegében egymás utáni szakaszt felépítő aminosavakat, és amelyet a letétbe helyezett antitesteknek legalább egyike felismer. Ahogyan az a szakmában jól ismert, a másodlagos és harmadlagos konformáció is rendelkezhet érdekes és hasznos tulajdonságokkal és alkothat epitópokat. Úgy tűnik, hogy a TE4b és TE9b letétbe helyezett antitestek felismerik az SCCE konformációs epitópjait.

Megmutattuk, hogy az 5.2.2. példában leírtak szerint előállított poliklonális nyúlantitest a stratum granulosum szemcsés festődését és az alsó stratum comeum (bőr szarurétege) meglehetősen diffúz festődését eredményezte immunfluoreszcens mikroszkópiában.

A tisztított natív vagy rekombináns SCCE ellen képződött antitestek általában kötődnek a szuprabazális sejtekhez a keratinizálódott (szarusodott) humán pikkelyes fedőhámban, a nem szarusodott pikkelyes fedőhám sejtjeihez viszont nem. Ezek az antitestek a humánbőr szarusodott rétegének intercelluláris teréhez szintén kötődnek.

A találmány szerinti polipeptidekkel reaktív antitestek számos célra alkalmasak, ahogyan azt a következőkben felsoroljuk:

Fehérjék tisztítására: Az antitestek felhasználhatók polipeptid(ek) vagy azok analógjainak biológiai mintákból történő tisztítására, az affínitáskromatográfia vagy az immunprecipitációs technikák felhasználásával.

Diagnózis és terápia céljára: A polipeptid(ek) vagy azok analógjai elleni monoklonális antitestek felhasználhatók az állatoknál és az embernél kóros állapotok diagnosztizálására és terápiájára. A diagnosztikai vegyület lehet a találmány szerinti polipeptidre specifikus antitest. Az antitest kapcsolódhat egy másik fehéréhez vagy szilárd hordozóhoz és/vagy használható az agglutinációs tesztekben vagy a színkifejlesztő tesztekben. Ilyen antitestek felhasználhatók SCCE-polipeptidek vagy azok analógjainak biológiai mintákban történő mennyiségi meghatározására is, standard hisztokémiai vagy immunkémiai technikák alkalmazásával.

A találmány tárgyát egy vonatkozásban a fentiekben definiált, találmány szerinti polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia képezi. A találmány különösen egy olyan polipeptidszekvenciára vonatkozik, amely lényegében az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvenciát tartalmazza. Más fontos kiviteli alakok olyan nukleotidszekvenciára vonatkoznak, amely a 2. számú aminosavszekvencia alszekvenciájával rendelkező polipeptidet kódol, úgymint egy olyan nukleotidszekvenciát, amely a

2. számú szekvencia -7-224. aminosavszekvenciáját vagy a 2. számú szekvencia 1-224. aminosavszekvenciáját tartalmazó polipeptidet kódol.

A találmány tárgyát képezi egy olyan nukleotidszekvencia is, amely hibridizál az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvenciával nagyon szigorú körülmények között, ahogyan azt a 7. és 9. példában leírjuk.

Egy másik vonatkozásban a találmány olyan nukleotidszekvenciára vonatkozik, amely az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukletoidszekvenciával vagy annak analógjával vagy alszekvenciájával rendelkezik, amely

1. az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvenciával legalább 95%-ban homológ, és/vagy

2. olyan polipeptidet kódol, amelynek aminosavszekvenciája legalább 95%-ban homológ a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciával, és/vagy

3. olyan polipeptidet kódol, amely az 1993. június 18-án az ECACC-nél letétbe helyezett és ECACC 93061817 letéti számot kapott, TE4b hibridoma sejtvonal által termelt monoklonális antitesthez vagy az 1993. június 1 δέη az ECACC-nél letétbe helyezett és ECACC 93061816 letéti számot kapott, TE9b hibridoma sejtvonal által termelt monoklonális antitesthez kötődik, és/vagy

4. olyan polipeptidet kódol, amely kapcsolódik a natív SCCE ellen képződött poliklonális antiszérumhoz, amelyet a talpbőr szarurétegének disszociált sejtjei kivonatából tisztítottunk.

A találmány hatókörébe tartozik az olyan módosított nukleotidszekvencia is, amely eltér a fentiek szerint definiált nukleotidszekvenciától, amelyben legalább egy nukleotidot kivágtunk, helyettesítettünk vagy módosítottunk, vagy legalább egy további nukleotidot beszúrtunk oly módon, hogy eredményül egy olyan nukleotidszekvenciát kapjunk, amely SCCE-aktivitással rendelkező polipeptidet kódol.

A jelen specifikációban és igénypontokban az „alszekvencia” kifejezés olyan szekvenciát jelöl, amely előnyösen legalább 15 nukleotid-, még előnyösebben legalább 18 nukleotid- és legelőnyösebben legalább 21 nukleotidméretű. A találmány számos kiviteli alakjában a találmány szerinti nukleotidszekvencia alszekven8

HU 220 339 Β ciája vagy analógja legalább 48 nukleotidot tartalmaz, úgymint legalább 75 nukleotidot vagy legalább 99 nukleotidot. Az „alszekvenciának” hasonlónak kell lennie legalább egy kritériumhoz a fenti 1-4. közül, vagy hibridizálnia kell az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvenciával.

Jól ismert, hogy kis fragmentumok alkalmasak a PCR-technikában, ahogyan itt leírjuk. Ilyen fragmentumok és alszekvenciák használhatók próbaként más felhasználások mellett a találmány szerinti nukleotidszekvencia mRNS-fragmentumainak azonosítására, ahogyan azt a 7. példában leírjuk.

Az „analóg” kifejezés tekintettel a találmány szerinti DNS-fragmentumokra, olyan nukletoidszekvenciát kíván jelezni, amely a találmány szerinti DNS-fragmentum által kódolt polipeptiddel azonos vagy lényegében azonos polipeptidet kódol. Jól ismert, hogy ugyanazt az aminosavat különböző kodonok kódolhatják, a kodonhasználat összefüggésben van - többek között - a nukleotidszekvencia kifejezésére szóba jövő szervezet előnyben részesítésével. Ezért tehát a találmány szerinti DNS-ffagmentum egy vagy több nukleotidja vagy kodonja kicserélhető másokkal, amely ha kifejeződik, a szóban forgó DNS-ffagmentum által kódolt polipeptiddel azonos vagy lényegében azonos polipeptidet eredményez.

Az „analóg” kifejezést a jelen szövegösszefüggésben a jellemző DNS-szekvenciához, az SCCE-polipeptideket alkotó aminosavszekvenciát kódoló 1. számú szekvenciához hasonló nukleotid-összetétel DNS-fragmentumának vagy DNS-szekvenciájának jelzésére is használjuk, megengedve kisebb eltéréseket, amelyek nem gyakorolnak szignifikáns ellentétes hatást az analóg enzimes aktivitására a natív SCCE-fehérje a 3. példában leírt aktivitásához képest. A „szignifikánsan ellentétes hatás” kifejezés alatt azt értjük, hogy az analóg enzimes aktivitásának a natív SCCE-enzimaktivitás legalább 50%-ának, előnyösebben legalább 60%-ának, még előnyösebben legalább 70%-ának, úgymint legalább 75%-ának kell lennie, ha például a 3. példában leírtak szerint határozzuk meg. Az analóg DNS-fragmentum vagy DNS-szekvencia származhat egy élő szervezetből, úgymint állatból vagy emberből, vagy lehet részlegesen vagy teljesen szintetikus eredetű. Az analóg származhat rekombináns DNS-technikák alkalmazásából is.

Továbbá az „analóg” és „alszekvencia” kifejezések számba vesznek változatokat a szekvenciában, úgymint egy vagy több nukleotid helyettesítését, beszúrását (beleértve intronokat), hozzáadását és átrendezését, amely változatok nem gyakorolnak alapvető ellentétes hatást a DNS-fragmentum vagy annak alszekvenciája által kódolt polipeptidre.

A „helyettesítés” (szubsztitúció) kifejezés a teljes nukleotidszekvenciában egy vagy több nukleotidnak egy vagy több eltérő nukleotiddal történő kicserélését jelenti, a „hozzáadás” (addíció) alatt egy vagy több nukleotidnak a teljes nukleotidszekvencia valamelyik végéhez történő hozzáadását értjük, a „beszúrás” (inszerció) alatt egy vagy több nukleotidnak a teljes nukleotidszekvenciába történő bevitelét értjük, a „kivágás” (deléció) azt jelenti, hogy a teljes nukleotidszekvenciából vagy a szekvencia valamelyik végén vagy azon belül egy megfelelő ponton, egy vagy több nukleotidot megsemmisítünk, és az „átrendezés” azt jelenti, hogy a DNS-en belül egy vagy több nukleotidmaradékot kicserélünk egymással, vagy a polipeptidszekvencián belül történik csere. A DNS-fragmentumot azonban mutagenezissel is módosíthatjuk, annak az élő szervezetbe történő beépítése előtt vagy után.

A „fragmentum”, „szekvencia”, „alszekvencia” és „analóg” kifejezések, ahogyan ezeket a jelen specifikációban és igénypontokban a találmány szerinti fragmentumok, szekvenciák, alszekvenciák és analógok vonatkozásában használjuk, természetesen úgy értendők, hogy ezeket nem természetes valójukban tartalmazzák, hanem inkább például izolált, tisztított, in vitro vagy rekombináns formában.

A találmány egy megvalósítási módjában az SCCEpolipeptid mRNS kimutatása és/vagy mennyiségi meghatározása történhet az RNS-nek a sejtekből vagy szövetekből való extrakciójával és cDNS-sé történő átalakításával az ezt követő polimeráz láncreakcióban (PCR=polymerase chain reaction) való felhasználáshoz. A PCRprimer(ek) szintetizálható(k) a találmány szerinti DNSfragmentum - úgymint az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott DNS-fragmentum - alapján. Ez a kimutatási és/vagy mennyiségi meghatározási módszer felhasználható diagnosztikus módszerként olyan kóros állapot diagnosztizálására, amelyben SCCE mRNS a normálisnál magasabb vagy alacsonyabb mennyiségben fejeződik ki.

Szintén a találmány hatókörébe tartozik egy olyan, nukleotidpróbát tartalmazó diagnosztikai vegyület, amely képes kimutatni a találmány szerinti nukleotidszekvenciát éppúgy, mint egy olyan betegségek diagnózisára szolgáló módszer, amelyekben szabályozatlan az SCCE-kifejeződés és/vagy olyan betegségeknél, ahol az SCCE-gén mutációt szenvedett. Ez magában foglalja a gyaníthatóan a normálisnál magasabb SCCE-szint vagy -mutációt szenvedett SCCE forma okozta betegségben szenvedő betegekből származó minták PCR-analízisét, amelyben a mintát - a fent leírtak szerint - összehozzuk a diagnosztikai vegyülettel, a nukleotidszekvenciákat hagyjuk sokszorozódni és meghatározunk minden azonos vagy analóg nukleotidszekvencíát a mintában.

A találmány szerinti polipeptideket előállíthatjuk rekombináns DNS-technológia alkalmazásával. A találmánynak egy fontos kiviteli alakját képezi a találmány szerinti nukleotidszekvencíát tartalmazó expressziós rendszer.

A polipeptid előállítására használt szervezet lehet magasabb rendű szervezet, például állat, vagy alacsonyabb rendű szervezet, például mikroorganizmus, úgymint E. coli. Tekintet nélkül a felhasznált szervezet típusára, a találmány szerinti DNS-fragmentumot vagy közvetlenül, vagy megfelelő vektor segítségével visszük be a szervezetbe. Másképpen, a polipeptideket úgy állítjuk elő az emlőssejtvonalakban, hogy a találmány szerinti DNS-fragmentumot vagy annak analógját, vagy

HU 220 339 B alszekvenciáját közvetlenül vagy expressziós vektor segítségével visszük be.

A DNS-fragmentumot vagy annak analógját, vagy alszekvenciáját klónozhatjuk is egy megfelelő stabil expressziós vektorba és utána bevihetjük egy alkalmas sejtvonalba. A kívánt polipeptideket termelő sejteket azután - a vektornak és az alkalmazott sejtvonalnak megfelelő körülmények között - produktivitást szintjük alapján kiválogatjuk. A kiválogatott sejteket tovább tenyésztjük, és ezek jelentik a kívánt polipeptid nagyon fontos és folyamatos forrását.

Egy példa a találmány szerinti DNS-szekvencia specifikus analógjára egy olyan DNS-szekvencia, amely tartalmazza az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott DNS-szekvenciát vagy annak egy részét, és amely különösen alkalmassá vált E. coliban történő kifejezésre. Ez egy olyan DNS-szekvencia, amelyet ha megfelelő szabályozórendszerrel együtt viszünk be E. coliba, olyan polipeptid kifejeződését eredményezi, amely lényegében a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciával vagy annak egy részével rendelkezik. Tehát ez a DNS-szekvencia az E. coli által felismert specifikus kodonokat tartalmaz. Egy példát erre a kiviteli alakra a 8. példában írtunk le.

A jelen szövegösszefüggésben a „gén” kifejezést olyan DNS-szekvencia jelzésére használjuk, amely részt vesz a polipeptidlánc előállításában, és amelybe beletartoznak a kódolórégiót megelőző és követő régiók (5’-upstream vagy 3’-downstream szekvenciák) ugyanúgy, mint a közbeeső szekvenciák, intronok, amelyek az egyes kódolószegmensek között foglalnak helyet, vagy exonok az 5’-upstream vagy 3’-downstream régióban. Az 5’-upstream régió olyan szabályozószekvenciát tartalmaz, tipikusan egy promotert, amely kontroll alatt tartja a gén kifejeződését. A 3’-downstream régió olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek részt vesznek a gén átírásának befejezésében és a transzkriptum és a 3’ nem transziáit régió poliadenilációjáért felelős, szabadon választható szekvenciákat.

A fentiekkel párhuzamosan a találmány tárgyát képezi egy fentiekben leírt, a találmány szerinti polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó expressziós rendszer, a rendszer magában foglalja a nevezett nukleotidszekvencia kifejeződését közvetíteni képes 5’-szegélyező szekvenciát.

A találmány tárgyát különösen egy olyan replikálódni képes expressziós vektor képezi, amely hordozza és képes közvetíteni a találmány szerinti nukleotidszekvencia kifejeződését. A találmány egy specifikus kiviteli alakját egy olyan replikációra képes expressziós vektor - pS507 jelű - képezi, amelyet 1993. május 11-én helyeztünk letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) gyűjteményben a DSM 8282 letéti szám alatt, a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően, valamint olyan expressziós vektorok, amelyek a nevezett, letétbe helyezett vektor nukleotidszekvenciájától eltérő nukleotidszekvenciákat fejeznek ki, azonban ugyanazzal az SCCE-aktivitással rendelkező a polipeptidet vagy annak analógját vagy változatát kódolják.

Más szavakkal, szintén a találmány hatókörébe tartozik a fent leírt, replikációra képes expressziós vektor, amelyben a kifejeződött nukleotidszekvencia olyan, amely különbözik a letétbe helyezett vektor nukleotidszekvenciájától, amelyben legalább egy nukleotidot kivágtunk, helyettesítettünk vagy módosítottunk, vagy legalább egy nukleotidot beszúrtunk oly módon, hogy ez egy SCCE-aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát eredményezett.

Ezenkívül a találmány tárgyát képezi egy olyan, pS500 jelű plazmid, amelyet 1993. május 11-én helyeztünk letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) gyűjteményben a DSM 8281 letéti szám alatt, a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően, valamint olyan nukleotidszekvenciával rendelkező plazmidok, amelyek eltérnek az 1. számú szekvenciavázlatban bemutott nukleotidszekvenciától, azonban az SCCE-aktivitással rendelkező, a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott polipeptidet vagy annak analógját vagy változatát kódolják, vagy amelyek az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvenciával vagy annak egy részével szigorú hibridizációs körülmények között hibridizálnak.

Szintén a találmány hatókörébe tartozik a találmány szerinti expressziós rendszert hordozó nem humán szervezet. Olyan szervezetek, amelyek ebben a vonatkozásban felhasználhatók, felölelnek mikroorganizmust, úgymint a Bacillus, Escherichia vagy Salmonella nemzetségekbe tartozó baktériumot, gombát, úgymint Saccharomycest, Pichiát, protozoát, vagy többsejtes szervezetből származó sejtet, növényi sejtet, emlőssejtet vagy sejtvonalat. Ha a szervezet egy baktérium, előnyben részesítjük az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot, például E. colit.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy plazmidvektor, amely a találmány szerinti polipeptidet vagy az itt definiált fúziós polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza. Egy különösen fontos kiviteli alakban a találmány szerinti DNS-fragmentumot vagy annak analógját vagy alszekvenciáját, vagy az itt definiált, találmány szerinti fúziós DNS-fragmentumot hordozhatja egy olyan replikációra képes expressziós vektor, amely a gazdaszervezetben vagy sejtvonalban replikálódni tud.

A vektor főleg plazmid, fág, kozmid, minikromoszóma vagy vírus lehet. A találmány egy érdekes kiviteli alakjában a vektor lehet egy olyan vektor, amely a gazdasejtbe történő bevitelkor beépül a gazdasejt genomjába.

Ha magasabb rendű szervezetet használunk, a polipeptid előállítására transzgén technikákat alkalmazhatunk. Példák megfelelő állatokra, juh, marha, sertés stb. A találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS-fragmentum a kívánt szövetben szövetspecifikus szabályozóelemek kontrollja alatt fejeződik ki. Az eredményül kapott fehérjét azután alávethetjük poszttranszlációs módosításoknak oly módon, hogy a találmány szerinti polipeptidet kapjuk.

A találmány szerinti transzgenikus nem humán emlőst a „transzgén”-nek a kiválasztott állat egy embrioná10

HU 220 339 B lis célsejtjébe történő bevitelével állítjuk elő. A találmány egy vonatkozásában a transzgén olyan DNS-szekvencia, amelyet, ha tartalmaz a transzgenikus nem humán emlős sejtjeinek genomja, képes a kívánt fenotípus előállítására. Specifikus kiviteli alakokban a transzgén tartalmazza a találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát, a transzgén képes a polipeptid termelésére kifejeződni.

Az expressziós rendszer beépítése az emlős csírasejtvonalába kivitelezhető bármilyen alkalmas technika felhasználásával, például Hogan és munkatársai [Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (1986)] vagy a WO 93/04172 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírtak szerint.

A találmány egy különleges vonatkozásában a találmány szerinti nukleotidszekvencia tartalmazhat egy másik, a találmány szerinti polipeptidtől különböző vagy azzal azonos polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát, SCCE-polipeptidet kódoló, az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia vagy annak analóg nukleotidszekvenciája keretébe fuzionálva fúziós polipeptid előállítása céljából, amely polipeptid a találmánynak még egy másik érdekes vonatkozását alkotja, lásd például a 8. példát. Ha rekombináns DNS-technológiát alkalmazunk, a fuzionált DNS-szekvenciákat inszertálhatjuk egy megfelelő vektorba vagy genomba. Egy másik lehetőség szerint a nukleotidszekvenciák egyikét már a másik nukleotidszekvenciát tartalmazó vektorba vagy genomba inszertáljuk. A fúziós polipeptidet elkészíthetjük a két nukleotidszekvencia egymástól elkülönített inszertálásával is, és hagyjuk végbemenni a kifejeződést. A gazdaszervezetet - amely lehet eukarióta vagy prokarióta eredetű - olyan körülmények között tenyésztjük, amely biztosítja a fuzionált szekvenciák kifejeződését. A fúziós polipeptidet azután tisztítjuk, és a találmány szerinti polipeptidet megfelelő módszer alkalmazásával elválasztjuk fúziós partnerétől.

A találmánynak egy megvalósítása tehát a találmány szerinti polipeptid előállításának olyan módszerére vonatkozik, amely a következő lépéseket tartalmazza:

a) a találmány szerinti nukleotidszekvencia inszertálását egy expressziós vektorba,

b) megfelelő gazdaszervezet transzformálását az a) lépésben előállított vektorral,

c) a b) lépésben előállított gazdaszervezet tenyésztését a polipeptid kifejezésére alkalmas körülmények között,

d) a polipeptid kinyerését, és

e) végül a polipeptid alávetését poszttranszlációs módosításnak.

A találmány hatókörébe tartozik egy olyan, a fentiek szerint leírt módszer is, amelyben az előállított polipeptidet immobilizált natív vagy rekombináns SCCEpolipeptid vagy a nevezett polipeptiddel reaktív antitest felhasználásával történő, affinitáskromatográfiához hasonló, egy vagy több lépést tartalmazó módszerrel és/vagy kromatográfiás és elektroforézises eljárásokkal izoláljuk.

Az előállított polipeptidet, ahogyan azt fent leírtuk, poszttranszlációs módosításoknak - hőkezelésnek, kémiai kezelésnek (formaldehid, glutáraldehid stb.) vagy enzimes kezelésnek (peptidázok, proteinázok és fehéijemódosító enzimek) - vethetjük alá. A polipeptid - természetes előállítási környezetéhez képest - különböző úton állítható elő egy szervezetben. Példaként, gyakran valósul meg glikoziláció, ha a polipeptidet magasabb rendű szervezet sejtjében fejezzük ki, úgymint élesztőben vagy előnyösen emlősben. Glikozilációt normális esetben Asn, Ser, Thr vagy hidroxi-lizin aminosavmaradékokkal kapcsolatban találunk. A szóban forgó gazdaszervezet által előidézett előállítási sajátságok eltávolítása vagy megváltoztatása lehet előnyös vagy előnytelen.

A polipeptidnek egy szervezetben vagy sejtvonalban történő, találmány szerinti kifejeződését követően a polipeptid használható így, vagy először megtisztítható a szervezettől vagy sejtvonaltól. Ha a polipeptid kiválasztott termékként fejeződik ki, közvetlenül tisztítható. Ha a polipeptid kapcsolt termékként fejeződik ki, szükség lehet a gazdaszervezet részleges vagy teljes feltárására a tisztítás előtt. Példák a polipeptidek tisztítása előtt alkalmazott eljárásokra: i) antitestekkel történő immunprecipitáció vagy affinitáskromatográfia, ii) affinitáskromatográfia megfelelő ligandummal, iii) más kromatográfiás eljárások, úgymint gélszűrés, ioncsere vagy nagynyomású folyadékkromatográfiás (high performance liquid chromatography=HPLC) módszerek, vagy bármelyik fenti módszer származéka, iv) elektroforézises eljárások, mint poliakrilamid-gélelektroforézis, denaturáló poliakrilamid-gélelektroforézis, agarózgélelektroforézis és izoelektromos fókuszálás, v) valamilyen más, specifikus oldhatósági és/vagy tisztítási technika.

A találmány tárgyát képezi egy lényegében tiszta SCCE-polipeptid is. A jelen szövegösszefüggésben a „lényegében tiszta” kifejezés alatt azt értjük, hogy a kérdéses polipeptid alapvetően mentes más olyan komponensektől, például más polipeptidektől, szénhidrátoktól, amelyek az a polipeptid előállítása és/vagy kinyerése eredményeként jöhetnek létre, vagy más módon találhatók együtt a polipeptiddel. A fehérje tisztasága megbecsülhető SDS-gélelektroforézissel a 3. példában leírtak szerint kivitelezve.

A polipeptid tisztítható a 4. példában leírtak szerint SBTI affinitáskromatográfiával vagy immobilizált antitesttel végzett affinitáskromatográfiával, úgymint TE4b antitesttel, a szakmában ismert eljárások szerint. A találmány szerinti polipeptid nagy tisztasága előnyös lehet, ha a polipeptidet gyógyszer vagy kozmetikai készítményben kívánjuk felhasználni. Szintén nagy tisztaságának köszönhetően, a lényegében tiszta polipeptidet kisebb mennyiségben alkalmazhatjuk, mint a hagyományosan alacsonyabb tisztaságú polipeptidet a legtöbb célra.

A találmány egy vonatkozásában a tiszta polipeptidet megkaphatjuk egy olyan alkalmas sejtvonalból, amely a találmány szerinti polipeptidet a 9. példában leírtak szerint fejezi ki. A találmány szerinti polipeptidet elkészíthetjük a folyadék vagy szilárd fázisú peptidszintézis jól ismert módszereivel is, alkalmazva a polipeptidszekvencia egyes aminosavainak egymás utáni összekö11

HU 220 339 B tését. Egy másik lehetőség szerint a polipeptid szintetizálható egyes aminosavak egymás utáni összekötésével a polipeptidszekvencia fragmentumait képezve, amelyeket később úgy kötünk össze, hogy a kívánt polipeptidet kapjuk eredményül. Ezek a módszerek tehát a találmánynak egy másik érdekes vonatkozását alkotják.

A találmánynak nagyon fontos vonatkozása SCCEaktivitással rendelkező polipeptidet és gyógyászatilag és/vagy kozmetikailag elfogadható kötőanyagot tartalmazó gyógyszerkészítményre, kozmetikai készítményre vagy bőrápoló készítményre irányul. A készítmény tartalmazhat tisztított natív fehérjét vagy találmány szerinti rekombináns polipeptidet, vagy a találmány szerinti polipeptid előenzim vagy fúziós fehérje formáját, amelyek proteolitikus hasítással aktiválhatok. A találmány szerinti polipeptidek előenzim formája egy „elődrog”-nak tekinthető, azaz olyan komponensnek, amely megfelelő proteolitikus hasítással az aktív formává alakul.

Különösen, de nem kizárólagosan a találmány tárgyát képezik helyileg, például bőrre történő felhasználásra alkalmas készítmények.

A helyileg történő beadásra alkalmas találmány szerinti gyógyszerkészítmények lehetnek krémek, kenőcsök, lemosok, híg kenőcsök, gélek, oldatok, szuszpenziók, paszták, rudak, spray-k, samponok, szappanok, hajkondicionálók vagy porok.

A helyi beadás történhet a testnek arra a részére, ahol a kérdéses patológiás elváltozások mutatkoznak, vagy közel ehhez a részhez, például a testnek egy külső részére, úgymint a bőr felszínére. Az alkalmazás lehet a készítménynek egyszerű szétkenése, vagy magában foglalhat valamilyen eszközt a készítmény és a patológiás laesiók közötti érintkezés fokozására, úgymint fedőkötéseket, például fedőtapaszokat, amelyekről a találmány szerinti készítmény gondoskodik. A készítményeket felitathatjuk vagy szétoszthatjuk tömítőpámákra, tapaszokra, szalagokra, gézre, tamponokra, vattadarabokra stb. Adott esetben a készítmény injekció formában is alkalmazható a laesióba vagy ahhoz közel.

A találmány szerinti helyi készítmények a preparátum teljes tömegére vonatkoztatva 1-80% aktív vegyületet tartalmazhatnak, úgymint 0,001-25% aktív vegyületet, például 0,1-10%-ot, 0,5-5%-ot vagy 2-5%-ot. Egynél több aktív vegyület építhető be a készítménybe, azaz SCCE-t elő-SCCE-t vagy SCCE-inhibitort más gyógyászati és/vagy kozmetikai összetevőkkel kombinációban tartalmazó készítmények szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. A készítményt megfelelően naponta 1-10-szer alkalmazzuk, a laesiók típusától, komolyságától és elhelyezkedésétől függően.

Helyi alkalmazáshoz a preparátumot formulázhatjuk a szokásos gyógyszerészeti gyakorlat szerint, hagyományosan helyi alkalmazásokhoz használt gyógyszerészeti kötőanyagokkal. Valamelyik különleges készítmény előállításánál alkalmazott vivőanyag természete ennek a készítménynek a tervezett beadási módjától függ. Víztől eltérő vivőanyagok, amelyek felhasználhatók a készítményekben, felölelnek szilárd anyagokat vagy folyadékokat, úgymint lágyítókat, oldószereket, hígítókat, sűrítőket és porokat. Példák ezekre a vivőanyagtípusokra, amelyek használhatók önmagukban vagy egy vagy több vivőanyag keverékeként, a következők: Lágyítók, úgymint sztearil-alkohol, gliceril-monoricinoleát, gliceril-monosztearát, 1,2-propándiol, 1,3-butándiol, cetil-alkohol, izopropil-izosztearát, sztearinsav, izobutil-palmitát, izocetil-sztearát, oleil-alkohol, izopropil-laurát, hexil-laurát, decil-oleát, 2-oktadekanol, izocetil-alkohol, cetil-palmitát, dimetil-polisziloxán, dibutil-szebacát, izopropil-mirisztát, izopropil-palmitát, izopropil-sztearát, butil-sztearát, polietilénglikol, trietilénglikol, lanolin, ricinusolaj, acetilezett lanolin-alkoholok, petróleum, ásványolaj, butil-mirisztát, izosztearinsav, palmitinsav, izopropil-linoleát, lauril-laktát, mirisztil-laktát, decil-oleát, mirisztil-mirisztát;

Oldószerek, úgymint víz, metilén-klorid, izopropanol, ricinusolaj, etilénglikol-monoetil-éter, dietilénglikolmonobutil-éter, dietilénglikol-monoetil-éter, dimetilszulfoxid, tetrahidrofurán, növényi és állati olajok, glicerin, etanol, propanol, propilénglikol és más glikolok vagy alkoholok, fixált olajok;

Hígítók vagy hidratálószerek, úgymint glicerin, szorbit, nátrium-2-pirrolidon-5-karboxilát, oldható kollagén, dibutil-ftalát, zselatin;

Porok, úgymint kréta, talkum, kaolin, keményítő és származékai, gumik, kolloid szilícium-dioxid, nátriumpoliakrilát, kémiailag módosított magnézium-alumínium-szilikát, hidratált alumínium-szilikát, (karboxi-vinil)-polimer, nátrium-(karboxi-metil)-cellulóz, etilénglikol-monosztearát;

Gélesítő- és duzzasztószerek, úgymint pektin, zselatin és származékai, cellulózszármazékok, úgymint cellulóz, (karboxi-metil)-cellulóz vagy oxidált cellulóz, cellulózgumi, guargumi, akaciagumi, karayagumi, baktövisgumi, bentonit, agar, alginát, karbomer, zselatin, hólyaghúzó, keratónia, dextrán és származékai, ghatti gumi, hektorit, isphagula hüvely, xantángumi;

Polimerek, úgymint politejsav vagy poliglikolsav-polimerek és ezek kopolimerei, paraffin, polietilén, polietilén-oxid, polietilénglikol, polipropilénglikol, poli(vinilpirrolidon);

Felületaktív anyagok, úgymint nemionos felületaktív anyagok, például glikol és glicerin-észterek, makrogoléterek és -észterek, cukor-éterek és -észterek, úgymint szorbit-észterek, ionos felületaktív anyagok, úgymint aminszappanok, fémszappanok, szulfátéit zsíralkoholok, alkil-éter-szulfátok, szulfátéit olajok és amfolitikus felületaktív anyagok és lecitinek;

Pufferolószerek, úgymint nátrium-, kálium-, alumínium-, magnézium- vagy kalciumsók (úgymint kloridok, karbonátok, dikarbonátok, cifrátok, glükonátok, laktátok, acetátok, gluceptátok vagy tartarátok).

Helyi alkalmazáshoz a készítmény pH-ja általában tág határokon belül mozoghat, úgymint 3-9. A találmány egy előnyben részesített kiviteli alakjában a polipeptid proteolitikus aktivitásához megfelelőnek talált pH-t, például pH 4-8 részesítünk előnyben. A kívánt pH-érték beállításához használhatjuk a fent leírt szokásos pufferolószereket.

A találmány szerinti preparátum tartalmazhat más adalékokat is, úgymint stabilizálószereket, tartósítószere12

HU 220 339 Β két, oldószereket, színezőanyagokat, kelátképzőket, gélképző anyagokat, kenőcsalapokat, pH-szabályozókat, antioxidánsokat, illatokat és bőrvédő anyagokat stb. Ha a készítmény sampon vagy szappan formában van, a készítmény tartalmazhat továbbá habképző szereket, gyöngyözőszereket és/vagy kondicionálókat.

A tipikus tartósítószerek közé tartoznak a parabének, formaldehid, Kathon CG, Bronidox, Bronopol, pklór-m-krezol, klór-hexidin, benzalkónium-klorid stb.

Hagyományos összetevőket használhatunk, ahol a találmány szerinti készítmények sampon vagy szappan formában vannak, és a tipikus szappan- és samponalapok magukban foglalnak olyan komponenseket, mint betaint, nátrium-lauril-szulfátot, nonilfenolt, imidazolt, szulfoszukcinátot, újrazsírozó szereket, hígítókat és kondicionálókat.

Továbbá előnyös lehet módosított kiengedőpreparátumokat szolgáltami, amelyekben az aktív vegyület egy polimer mátrixba vagy nanopartikulákba vagy liposzómákba vagy micellákba épül be, vagy ioncserélő gyantákon abszorbeálódik, vagy egy polimer hordozza.

Készítményeket formulázhatunk hagyományos gyógyszerészeti gyakorlat szerint, és ezek lehetnek: Félig szilárd készítmények: gélek, paszták, keverékek. Folyékony készítmények: oldatok, szuszpenziók, kanalas orvosságok, emulziók.

Ahogyan jeleztük, a találmány szerinti gyógyszerkészítmény tartalmazza magát a találmány szerinti polipeptidet vagy annak funkciós származékát vagy ilyen vegyületek kombinációját. A példák megfelelő funkciós származékokra felölelik a gyógyászatilag elfogadható sókat, különösen azokat, amelyek alkalmasak bőrrel kapcsolatos környezetben történő felhasználásra. A példákba beletartoznak gyógyászatilag elfogadható aminofiinkcióval rendelkező sók, például savakkal anionokat termelő sók, amelyek gyógyászatilag elfogadhatók, különösen bőrrel kapcsolatos környezetben. A példák felölelik a foszfátokat, szulfátokat, nitrátokat, jodidokat, bromidokat, kloridokat, bórátokat ugyanúgy, mint a karbonsavakból származó anionokat, beleértve az acetátokat, benzoátokat, sztearátokat stb.

Más származékok, amelyek aminofúnkcióval rendelkeznek, magukban foglalják az amidokat, imideket, karbamidokat, karbamátokat stb.

Más alkalmas származékok felölelik a találmány szerinti polipeptid karboxilcsoportjának származékait, beleértve sókat, észtereket és amidokat. A példákba beletartoznak a gyógyászatilag elfogadható kationnal például lítiummal, nátriummal, káliummal, magnéziummal, kalciummal, cinkkel, alumíniummal, vas(II)-vel, vas(III)-mal, ammóniummal - rendelkező sók és a kis szénatomszámú (C]_₆) alkil-ammóniumsók. Az észterek felölelik a kis szénatomszámú alkil-észtereket.

A készítmények példái all. plédában jelen találmány szerinti gyógyszer, kozmetikai és bőrápoló formulákat szemléltetnek, de ezek semmiképpen sem korlátozhatják a találmány szerinti készítmények oltalmi körét.

Látható, hogy a natív vagy rekombináns SCCE-t tartalmazó kozmetikai készítmények vagy bőrápoló készítmények aktívak akne, xeroderma (bőrszárazság) vagy más hiperkeratotikus állapotokban, úgymint callositasban (bőrkérgesedésben) és keratosis pilarisban (szőrtüszők körül kifejlődő, szarucsapokkal járó bőrelváltozásban). Az acne vulgárisnak (közönséges aknénak) különböző stádiumai vannak. Látható, hogy SCCE beadása hasznos azokban a stádiumokban, amelyekben megzavart keratinizáció áll fenn a faggyúmirigyek járataiban, amely komedók képződéséhez és eltömődésekhez vezet, míg ellenben azokban a stádiumokban, ahol gyulladásos akne laesio a domináns jelenség, egy olyan vegyület beadása lenne előnyös, amely gátolja az SCCE-t.

A találmány egy megvalósítását tehát az akne, xeroderma vagy más hiperkeratotikus állapotok, úgymint callositas és keratosis pilaris kezelésére és megelőzésére szolgáló polipeptid felhasználása képezi.

A fent leírt tudományos felfedezésekre alapozva látható, hogy a natív vagy rekombináns SCCE-t tartalmazó gyógyszerkészítmények felhasználhatók a különböző inchthyosisok, akne, pszoriázis vagy más gyulladásos bőrbetegség, úgymint hiperkeratózisos ekcémák, mikrobiális fertőzések kezelésére és megelőzésére és sérülések gyógyítására, különösen ha helyileg alkalmazzuk.

A találmány tárgyát egy másik vonatkozásában SCCE-aktivitással rendelkező polipeptidnek - a különböző ichthyosisok, akne, pszoriázis vagy más, hiperkeratózissal járó gyulladásos bőrbetegségek, úgymint ekcémák kezelésére és megelőzésére szolgáló - gyógyszerkészítmény előállítására történő felhasználása képezi.

A találmány tárgyát egy további vonatkozásban a különböző ichthyosisok, akne, pszoriázis vagy más, hiperkeratózissal járó gyulladásos bőrbetegségek, úgymint ekcémák kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló módszer képezi, a módszer magában foglalja az SCCE-aktivitással rendelkező polipeptid terápiásán vagy profilaktikusan hatásos mennyiségének szükség szerinti beadását a beteg számára. A kezelés lehet megelőző, csillapító vagy gyógyító.

Látható, hogy a bőnél kapcsolatos környezetben létezik a proteolitikus enzimek „kaszkádrendszere”, amely a plazminogén aktivációs rendszerhez hasonló. Az SCCE feltételezhetően egyik végterméke ennek a rendszernek. Látható, hogy az SCCE-aktivitás gátolható „SCCE-inhibitor” segítségével.

Számos bőrbetegségnél, úgymint az autoimmun pemphigus betegségeknél vagy acantholyticus betegségeknél, például családi pemphigusnál és Darier’s betegségnél, a keratinociták közötti összetartó erő meggyengülése áll fenn a nem szarusodott élő hámsejtrétegben (lásd A sejteket összetartó erő rendellenességei az élő epidermiszben című fejezetet). Látható, hogy ezt a folyamatot proteinázok közvetítik és ezért olyan vegyület beadásával kezelhető, amely képes a natív SCCE-enzim aktivitásának gátlására. Szintén előnyös lehet SCCEinhibitor beadása pszoriázisok és más gyulladásos bőrbetegségek kezelésére olyan állapotoknál, ahol a gyulladásos komponens a domináns jelenség.

A találmány tárgyát egy másik vonatkozásban tehát olyan SCCE-inhibitomak a felhasználása képezi, amely gátlóhatással rendelkezik - az autoimmun pemphigus

HU 220 339 Β betegségek vagy acantholyticus betegségek, úgymint családi pemphigus és Darier’s betegség kezelésére vagy megelőzésére előállított gyógyszerkészítmény - natív SCCE-enzim aktivitására.

A jelen szövegösszefüggésben az „SCCE-inhibitor” kifejezés olyan létező vagy új vegyületre vonatkozik, amely képes a találmány szerinti enzimesen aktív polipeptidszekvenciával vagy alszekvenciával, vagy ezek analógjával kölcsönhatásba lépni oly módon, hogy csökken az SCCE-aktivitás. A csökkenés mérhető például a 3.2. példában vázolt kísérlet elvégzésével a potenciális SCCE-inhibitort használva fel gátlószerként. A nevezett vegyületek lehetnek szerves molekulák, kis peptidek vagy nagy polipeptidek vagy a fentiek bármelyikének származékai. Egy ilyen megközelítés felhasználásra találhat az SCCE-inhibitorok azonosítására szolgáló drogscreenelő programban.

A találmánynak egy további megvalósítási módja tehát egy módszer olyan vegyület azonosítására, amely hatással van a natív SCCE enzimes aktivitására, beleértve a találmány szerinti rekombináns polipeptidek felhasználását.

A találmány tárgyát különösen egy olyan vegyület azonosítására szolgáló módszer képezi, amely gátlóhatással van a natív SCCE enzimes aktivitására.

Egy másik vonatkozásban a találmány tárgyát egy olyan vegyület azonosítására szolgáló módszer képezi, amely képes a natív vagy rekombináns SCCE enzimes aktivitását fokozni.

A találmány szerinti rekombináns polipeptideknek egy fontos alkalmazása a drogscreenelő vizsgálatban történik. A találmány szerinti polipeptidek felhasználhatók drogscreenelő rendszerben. A találmány tárgyát tehát egy olyan vegyület azonosítására szolgáló módszer is képezi, amely az SCCE előenzim formáját képes aktív SCCE-vé átalakítani a találmány szerinti polipeptid felhasználásával.

A találmány fogalmi körébe tartozik egy aminosavszekvencia felhasználása is - ahogyan azt fent az SCCEpolipeptid háromdimenziós szerkezetének levezetésére definiáltuk - az SCCE-polipeptidhez kötődni képes vegyület tervezésére, különösen egy olyan drogvegyület tervezésére, amely az enzim aktív helyéhez kötődik.

A találmány fontos vonatkozásai végezetül az SCCE-polipeptid által kifejtett aktivitás szabályozásának különböző módszerei. Ez az aktivitás fontos hatást gyakorolhat különböző kóros állapotokra, ahogyan azt fent leírtuk.

A találmány szerinti polipeptidnek vagy analógjának megfelelő mRNS-sel legalább részben komplementer DNS- vagy RNS-ffagmentum hatásos lehet az SCCEmRNS-ek transzlációjának megállításában humán sejtekben és ezáltal gátolva a polipeptid(ek) szintézisét. Ez a megközelítés, amely érdeklődésre tarthat számot olyan betegségeknél, ahol a normálisnál magasabb SCCEkifejeződést találtunk - úgymint autoimmun pemphigus betegségeknél vagy acantholyticus betegségeknél, úgymint családi pemphigus és Darier’s betegségnél - általánosabban antiszensz oligoterápiaként ismert, ezért a találmány tartalmaz ilyen megközelítéseket.

Az ábrák magyarázata

1. ábra

Egysarkú sejtvedlés a talp bőrének szarurétegéről in vitro. A szövet in vivő kifelé néző felülete az ábrán felfelé mutat. Megjegyezzük, hogy fokozatos sejtdisszociáció volt ezen a felületen az inkubáció alatt, más felületeken viszont nem volt sejtdisszociáció.

2. ábra

Időfiiggés és az aprotinin hatása a sejtelengedésre a talp bőrének szarurétegéből. A körök aprotinin nélküli, a háromszögek aprotininnel történő inkubációt jelölnek. Középértéket (négy szövetdarab összesített értékeit) és szórást adtunk meg.

3. ábra

Anti-dezmoglein (anti-DG I) reaktív komponensek összefüggő talp bőrszarurétegben és disszociált sejtekben. A) Coomassie blue-val festett SDS-PAGE. B) Immunbiot. 1-3.: összefüggő szövet, hígítatlan (1), 1/3-ra hígított (2), 1/9-re hígított (3). 4-5.: disszociált sejtek, hígítatlan (4), 1/3-ra hígított (5). Csak a nyilvánvalóan érintetlen, 160 kD molekulatömegű DG I-et vesszük figyelembe az összefüggő szövetben, és csak a 95 kD és 80 kD molekulatömegű DG I lebomlási termékeket a disszociált sejtekben.

4. ábra

Időfüggés és az aprotinin hatása a dezmoglein I (DG I) lebomlására a talpbőr szarurétegében in vitro sejtvedlésnek kitéve. A) aprotinin nélkül, és B) aprotinin jelenlétében (15 μΜ) inkubált talpbőrszaruréteg-kivonatok immunbiot analízisének denzitometriás vizsgálata. A csúcs 160 kD-nál megfelel az érintetlen DG I-nek. A csúcsok 95 és 80 kD-nál megfelelnek e fehéije bomlástermékeinek (lásd a 3. ábrát). Megjegyezzük az aprotininnek a DG I bomlására kifejtett hatékony gátlását.

5. ábra

Cinkion A), kimosztatin és leupeptin B) hatása a dezmoglein I (DG I) lebomlására a talp bőrének szarurétegében in vitro sejtvedlés alatt. Megjegyezzük az antiDG I pozitív komponensek 160 kD-ból 95 és 80 kD molekulatömegűvé történő transzformációjának gátlását cinkionokkal és kimosztatinnal, de leupeptinnel nem.

6. ábra

A talpbőr szarurétegének sejtjeivel kapcsolatos peptidhidrolizáló aktivitás. A két szubsztrát hidrolízisét a 405 nm-en mért abszorbanciában bekövetkezett változás mérésével követtük nyomon. Az inkubációk középértékei három párhuzamossal. Négyzetek=S-2586; körök=S-2288.

7. ábra

A komeocitához kapcsolódó S-2586 hidrolizáló aktivitás pH-függése. Az inkubációk középértékei három párhuzamossal. Négyzetek=nátrium-acetát; háromszögek=Tris-HCl.

8. ábra

A disszociált talpbőrszaruréteg-sejtek kivonataiban kazeinlebontó aktivitást mutató zimográfia. Lásd a 2.2. példa szövegét is a kísérleti részletekért.

A) A talpkomeociták kivonatából származó enzim öszszehasonlítása a Laemmli’s mintapufferrel redukálószer (sc/s) és KC1 (sc/k) nélkül marhakimotripszinnel,

HU 220 339 Β

0,125 ng (c) és marhatripszinnel, 0,5 ng (t). Az elektroforézis előtt a KCl-os kivonatot 5 mM Tris-HCl-val pH 6,8 szemben dializáltuk, és SDS-t és glicerint adtunk hozzá olyan végső koncentráció beállításához, mint a mintapufferben; 10 pl-t adtunk minden sávhoz. A molekulatömeg-markerek bal oldalon találhatók.

B) pH-fiiggés az inkubációs pufferben. Enzimforrás=a disszociált talpkomeociták SDS-kivonatai. Pufferek a Triton Χ-100-zal való előkezeléshez és inkubáláshoz: 0,1 M nátrium-acetát (pH 4,0 és pH 5,5) és 0,1 M TrisHC1 (pH 7,0 és pH 8,0). Az egyéb körülmények ugyanúgy, mint A)-ban.

C) Az inhibitorok hatása. sc=a talpkomeociták SDSkivonata; c=marhakimotripszin; t=marhatripszin. Az inhibitorok jelen voltak a Triton Χ-100-zal való előkezelés során és az azt követő inkubációnál. A leupeptin végső koncentrációja 160 μΜ volt, az aprotininé 15 μΜ, a kimosztatiné 40 μΜ és a cinkionoké (szulfát formájában) 100 μΜ. A leupeptint és kimosztatint oldat formájában adtuk a dimetil-szulfoxidhoz (DMSOhoz). Puffer az előkezeléshez és inkubációhoz=0,1 M Tris-HCl pH 8, 1% (v/v) DMSO végső koncentrációval. Az egyéb körülmények ugyanúgy, mint A)-ban.

9. ábra

SCCE, marhakimotripszin és humán katepszin G összehasonlítása tekintettel inhibitorok (A; aprotinin, B; kimosztatin, C; cink-szulfát) hatására és a szubsztrátspecificitásra (D). A-C az enzimaktivitást inhibitor jelenléte nélkül 100%-ra standardizáltuk. D-ben az enzimaktivitást MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA-val standardizáltuk 1 önkényesen választott egységre.

10. ábra

Affinitáskromatográfia kovalensen kötött szójababtripszin-inhibitoron (SBTI). Szaggatott vonal: A 280 nmen mért abszorbancia az eluátum fehérjekoncentrációját tükrözi. Folyamatos vonal üres négyzetekkel: Peptidhidrolizáló aktivitás S-2586-tal, mint szubsztráttal, a 405 nm-en mért abszorbanciában bekövetkezett változásként megadva. Folyamatos vonal üres körökkel: Peptidhidrolizáló aktivitás S-2288-cal, mint szubsztráttal, a 405 nm-en mért abszorbanciában bekövetkezett változásként megadva, tízzel szorozva.

11. ábra

A 10. ábrán bemutatott kromatogram 2., 6. és 10. frakcióinak SDS-PAGE és Coomassie blue festése (A) és a kopolimerizált kazeinnel végzett SDS-PAGE utáni zimográfiája (B). Molekulatömeg-markerek bal oldalon. A B. ábrán 1: olyan kazeinbontó komponensek csoportja, amelyek leupeptinnel (160 μΜ) gátolhatok; c: olyan kazeinbontó komponensek csoportja, amelyek kimosztatinnal (40 μΜ) gátolhatok.

12. ábra

Affinitáskromatográfiával tisztított SCCE SDS-PAGEse SBTI-Affigel 15-ön, 12,5% gél. 1: Nem redukált minta. 2: Redukált minta. Molekulatömeg-markerek bal oldalon.

13. ábra

Az SCCE N-terminális aminosavszekvenciája. A csillagok a feltételezett ciszteinek bizonytalanságát jelölik a

7. és 9. helyeken. A kérdőjel olyan helyet jelöl, ahol nem tudtunk aminosavszármazékot kimutatni, de nem volt hozamkiesés a rákövetkező lépésekben.

14. ábra

A TE4b és TE9b monoklonális antitestek jellemzése immunprecipitáció és immunbiot segítségével, a: Coomassie-vel festett 12,5% SDS-PAGE, nem redukált körülmények.

1. sáv: Molekulatömeg-markerek

2. sáv: Disszociált talpkomeociták KCl-os kivonata a

3.1. példában leírtak szerint elkészítve

3. sáv: A 4.1. példában leírtak szerint, oldhatatlan szój ababtripszin-inhibitoron affinitáskromatográfiával tisztított SCCE b: Az immunprecipitátumok zimográfiája 12,5% SDS-PAGE-ben, 0,1% kopolimerizált, hővel denaturált kazeinnel, Coomassie-vel festett gél.

1. sáv: Molekulatömeg-markerek

2. sáv: KCl-os kivonat, a) szerint dializálva

3-6. sáv: Oldott immunprecipitátumok TE4b monoklonális antitesttel (moab-vel) (20 pg), TE9b moab-vel (10 pg), PZ moab-vel (10 pg) (balról jobbra) és foszfátpuffersóval. A PZ moab IgGl-kappa típusú egér monoklonális antitest, terhességi zóna fehérje és ezt nem rokon negatív kontrollként használtuk.

c: Immunbiot 12,5% SDS-PAGE-ből (nem redukáló körülmények).

1. sáv: Biotinezett molekulatömeg-markerek, amelyeket alkalikus foszfatázzal konjugált avidinnel (BioRad) mutattunk ki. A 2., 4. és 6. sávokban levő elektroforetizált minta ugyanaz, mint a 2. az a)-ban, és a 3., 5. és 7. sávokban levő ugyanaz, mint a 3. az a)-ban.

2. és 3. sáv: első antitest=TE4b moab, 0,2 pg/ml

4. és 5. sáv: első antitest=TE9b moab, 0,1 pg/ml

6. és 7. sáv: első antitest=PZ moab, 0,1 pg/ml

A nyilak a-c relatív molekulatömegeket jelölnek: 93, 66,45, 31, 22 és 14 kD (felülről lefelé).

75. ábra

A 15. ábra a pS500 plazmidot mutatja. Ez a plazmid tartalmazza a teljes hosszúságú humán SCCE-cDNS-t pUC19-be klónozva. Részletekért lásd a 6. példát.

16. ábra mRNS-sel végzett Northern biot humán epidermiszből készítve. Körülbelül 100 g teljes RNS-nek megfelelő poli-T-vel tisztított RNS-t alkalmaztunk minden sávban. 1: A hibridizációt az SCCE-cDNS-nek egy 1070 bp Hinc 2/Hinc 2 fragmentumából készített próbával végeztük el. 2: A hibridizációt az SCCE-cDNSnek egy 655 bp Hinc 2/Bgl 2 fragmentumából készített próbával végeztük el.

17. ábra

a) Coomassie-vel festett SDS-PAGE, 12,5% gél. 1. és

2.: pS510-zel és pS511-gyel külön-külön transzformált és IPTG-vel indukált szonifikált TG 2 sejtek PBS-Triton X-100-ban oldhatatlan pelletei.

b) Immunbiot analízisek csirke-előimmunszérummal (1-3.) és csirke-anti-SCCE-vel (4-6.). 1. és 4.: pS51Ozel transzformált és IPTG-vel indukált TG 2 sejtek. 2. és 5.: pS511-gyel transzformált és IPTG-vel indukált

HU 220 339 Β

TG 2 sejtek. 3. és 6.: humán talp bőrének szarurétegéből tisztított SCCE.

A mintákat mintapufferben merkapto-etanollal forralva készítettük el.

18. ábra

A 18. ábra a 9. példában leírtak szerint összeállított pS507 expressziós vektor kör alakú térképét mutatja. A pS507 vektor közvetíti a rekombináns humán SCCE kifejeződését emlőssejtekben.

19. ábra

A 19. ábra a pS507 rekombináns humán SCCE gén emlőssejtekben történő kifejeződésének analízisét mutatja.

1. sáv: C127 sejtekből származó RNS

2. sáv: pS507-tel transzformált C127 sejtek 1:24 izolált kiónjából származó RNS

3. sáv: pS507-tel transzformált C127 kiónok keverék populációjából származó RNS

4. és 5. sávok: pS147 expressziós vektorral - amelyből hiányzik az SCCE-cDNS, egyébként azonos a pS507-tel - transzformált C127 sejtekből származó RNS. Méretmarkerek a bal oldalon.

20. ábra

C127 sejtekben kifejezett SCCE SDS-PAGE-t követő immunblotja.

1. és 6. sávok: Előfestett molekulatömeg-marker (BioRad, 106, 80,49,5, 32,5,27,5 és 18,5 kD)

2. sáv: pS507/C127, keverék, T-palack

3. sáv: pS507/C127, keverék, roller A

4. sáv: pS507/C127, keverék, roller B

5. sáv: Negatív kontroll pS522/C127

7. sáv: A bőr szarurétegéből készített natív SCCE

8. sáv: pS507/C127,24. klón, T-palack

9. sáv: pS507/C127,24. klón, roller A

10. sáv: pS507/C127, 24. klón, roller B

21. ábra

A pS507 plazmidot hordozó sejteket tartalmazó C127 sejttenyésztő tápoldatból tisztított rekombináns SCCE SDS-PAGE-se (A) és immunblotja (B).

1. és 5. sávok: Előfestett molekulatömeg-marker (BioRad, 106, 80,49,5, 32,5,27,5 és 18,5 kD)

2. sáv: A sejtek tápoldata tisztítás előtt

3. sáv: A kromatográfiából gyűjtött nem kötött anyag

4. sáv: Az alacsony pH-jú pufferrel eluált kötött anyag

22. ábra

Kazein poliakrilamid-gélen meghatározott natív SCCE és aktivált rekombináns SCCE-aktivitás.

1. és 10. sáv: Molekulatömeg-markerek (Pharmacia

14-94 kD)

2. sáv: natív SCCE

3. sáv: natív SCCE

4-6. sáv: Rekombináns SCCE hasítva 1 órán át, 3 óráig és egy éjszakán át, külön-külön (460 ng/mélyedés)

7. sáv: Ugyanolyan mennyiségű tripszin, mint a 4-6.

mintákban, de APMSF nélkül

8. sáv: Ugyanolyan mennyiségű tripszin, mint a 4-6.

mintákban, APMSF ugyanolyan mennyiségeinek jelenlétében, mint a mintákban

9. sáv: Ugyanaz, mint a 3. sáv

23. ábra

N-glükozidáz F®-el kezelt natív és rekombináns SCCE immunblotja. A mintákat 8-18% SDS-PAGE-sel választottuk el és immunblotnak vetettük alá a fent leírtak szerint.

1. sáv: Molekulatömeg-marker. Molekulatömegek felülről: 106, 80,49,5,32,5, 27,5 és 18,5 kD.

2. és 3. sávok: Rekombináns SCCE, 0,3 és 3 pg, külön-külön.

4. és 5. sávok: Natív SCCE, 1,5 és 1,8 pg, külön-külön. A 3. és 5. sávban levő mintákat N-glükozidáz F®-el kezeltük.

PÉLDÁK

1. példa

Nyilvánvaló, hogy a sejtek leválása a bőr elszarusodott felületi rétegéről magában foglalja a dezmoszómális fehérjék lebomlását, és az ezért felelős enzim egy olyan kimotripszin típusú szerinproteináznak tűnik, amely cinkionokkal gátolható.

1.1. Pikkelytelenedés a bőr szarurétegében

A vizsgálat célja a bőr elszarusodott rétegében - a bőr szarurétegében (stratum comeumban) - a sejteket összetartó erő és a felületi sejtek disszociációjáért (pikkelytelenedésért) felelős mechanizmusok természetének megvilágítása. A bőr szarurétegének 0,3-0,6 mm vastag pikkelyét vágtuk le a bőr felszínével párhuzamosan egy normál bőnél rendelkező önkéntes sarka alól. A szövetdarabot 0,1% nátrium-azidot tartalmazó foszfátpufferes sóoldatba áztattuk 3 órára szobahőmérsékleten és a lazán kapcsolódó sejteket a felszínről - amely in vivő kifelé mutatott - lekapartuk. A szövet felszínére merőlegesen vágott 1 mm vastag szeleteket ezután 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 mM EDTA, 0,1% nátrium-azid és 0,45% agaróztartalmú tápoldatba tettük, a tápoldatnak közvetlenül az agar jelenléte miatt bekövetkező gélesedése előtt. 0, 5 és 15 órás 37 °C-on történő inkubációs idők után a szövetet tartalmazó géldarabokat szárazjégen lefagyasztottuk. 20 pm kriosztát metszeteket vágtunk a bőrfelszínre merőlegesen, a tárgylemezre tett és fáziskontraszt mikroszkópban vizsgált kriosztátban. A sejtek folyamatos egy sarkú leválását figyeltük meg az in vitro inkubált talpbőr szarurétegének darabjairól (1. ábra). Sejtek csak arról a szövetfelületről váltak le, amely in vivő kifelé mutatott. A megfigyelt folyamat tehát a pikkelytelenedést modellezte.

1.2. Hőmérséklet, pH és enziminhibitorok hatása

A sejtleválás mennyiségi meghatározására szolgáló módszert fejlesztettünk ki, amely lehetővé tette különböző paraméterek - úgymint hőmérséklet, pH és enziminhibitorok - hatásainak vizsgálatát. A talp bőrének szarurétegéből 3 mm átmérőjű hengereket készítettünk biopszialyukasztóval az 1.1.-ben fent leírt, lazán kapcsolódó felületi sejtekből vett és kiszabadított szövet pikkelyeiből. A felületnek meghatározott - in vivő kifelé mutató - területéről származó hengereket 0,1 M Tris-HClt pH 8, 5 mM EDTA-t és 0,1% nátrium-azidot aprotininnel (4xl0~⁶ mol/1) (Boehringer Mannheim, Germany) vagy anélkül tartalmazó tápoldat 0,5 ml-ében

HU 220 339 Β

1,5 ml-es Eppendorf-csövekben inkubáltuk 37 °C-on 5, 10 és 20 órán át és utána 10 másodpercig egy Vortexkeverőben kevertettük a disszociált felületi sejtek elengedése céljából. A maradék szövetet eltávolítottuk és áthelyeztük friss tápoldatba a folytatólagos inkubáláshoz. Az elengedett sejteket tartalmazó csöveket 2 percig 5000 g mellett centrifugáltuk a sejtek összegyűjtése céljából. A sejtpelleteket egyszer mostuk 0,5 ml foszfátpufferes sóoldattal, azután 60 °C-on 1,5 órát 0,6 ml 1 M nátrium-hidroxiddal kezeltük. Az alkalikusan oldódó fehérje mennyiségét Lowry és munkatársai [J. Bioi. Chem., 193,265-275 (1951)] leírása szerint határoztuk meg, és az elengedett sejtek mennyiségének méréshez használtuk fel. Az eredményeket a 2. ábrán mutatjuk be.

Hasonló módon vizsgáltuk a különböző potenciális inhibitorok, aprotinin, szójababtripszin-inhibitor, pepsztatin (Boehringer Mannheim, Germany) és jód-acetamid (Sigma, St. Louis, MO) hatását. Egyedi 2 mm-es szövethengereket készítettünk és inkubáltuk különböző potenciális inhibitort - az 1. táblázatban jelzett koncentrációkban - tartalmazó vagy nem tartalmazó tápoldatban 16 óráig 37 °C-on, és az elengedett sejtek mennyiségét meghatároztuk a fentiek szerint. Megjegyezzük, hogy az optimális sejtelengedési arányok eléréséhez EDTA-t (amely a metalloproteinázok inhibitora) tartalmazott az inkubációs tápoldat.

1. táblázat

Proteázinhibitorok hatása a sejt elengedésére a talp bőrének szarurétegéből in vitro.

Középérték és standard deviáció öt inkubált szövetdarabra

Inhibitor	Koncentráció (mol/1)	Inhibíció (%)
Nincs	-	0±8
Aprotinin (Trasylol®)	1,5 xlO-7	18±8
Aprotinin (Trasylol®)	4xl0-7	53±13
Aprotinin (Trasylol®)	1,5 xlO-6	90±5
Aprotinin (Trasylol®)	4xl0-6	98±2
Szójababtripszin-inhibitor	5xl0-6	81±9
Pepsztatin	1 x 10-4	8 ±4
Jód-acetamid	1x10-’	6±13

Azt találtuk, hogy a szerinproteáz-inhibitorok, aprotinin- és szójbabtripszin-inhibitor, hatékonyan gátolták a sejtvedlést (2. ábra és 1. táblázat, fent). Mivel ez a két vegyület gátló hatású volt, viszont a metalloproteinázok (EDTA), tiolproteinázok (jód-acetamid) és aszpartát proteázok (pepsztatin) nem, azt a következtetést vontuk le, hogy a megfigyelt folyamatban szerinproteáz vesz részt. Azt a következtetést is levontuk, hogy a bőr szarurétegében a sejtösszetartó erők fehérjeszerkezetektől függnek és hogy az in vitro megfigyelthez hasonló mechanizmusnak kell működnie a pikkelytelenedésnél is in vivő [Lundström és Egelrud, J. Invest. Dermatol., 91, 340-343 (1988)].

A talp bőrének szarurétegéből in vitro történő sejtvedlés további tanulmányozása során azt találtuk, hogy a folyamat két különálló lépésre bontható. Az első lépés EDTA jelenlétére való tekintet nélkül megy végbe az inkubációs tápoldatban. A második lépés csak EDTA jelenlétében játszódik le. Az első lépést az aprotinin mellett kimosztatinnal és cinkionokkal lehetett gátolni. A második lépést aprotininnel és kimosztatinnal tudtuk gátolni [Lundström és Egelrud, Arch. Derm. Rés., 282, 234-237 (1990)]. A kimosztatin olyan alacsony molekulatömegű proteinázinhibitor, amely kimotripszinhez hasonló szubsztrátspecificitással rendelkezik. Továbbá azt találtuk [Lundström és Egelrud, Arch. Derm. Rés., 282, 234-237 (1990)], hogy a leupeptin, a proteinázok olyan alacsony molekulatömegű inhibitora, amely tripszinhez hasonló szubsztrátspecificitással rendelkezik, nem volt hatással az in vitro sejtvedlésre.

Azok a fehérjeszerkezetek, amelyek legvalószínűbben felelősek a sejtösszetartásért a bőr szarurétegében és így lehetséges jelöltjei a pikkelytelenedéshez hasonló sejtvedlés során történő lebomlásnak - ahogyan azt fent leírtuk - a dezmoszómák. A dezmoszóma két szimmetrikus félből áll, amelyek szomszédos sejtekben helyezkednek el. A két fél az extracelluláris térben kapcsolódik transzmembrán fehérjék segítségével, az úgynevezett dezmogleinekkel.

1.3. A dezmoglein I (DG I) sorsa in vitro sejtvedlés alatt

A dezmoglein I (DG I) sorsát tanulmányoztuk a talp bőrének szarurétegében in vitro sejtvedlés alatt. A talp bőrének szarurétegét inkubáltuk, ahogyan azt az 1.1.-ben leírtuk, és a még összetartó szövetet elválasztottuk a disszociált sejtektől. A sejteket és a szövetet 0,1 M TrisHCl-t pH 9, 9 M karbamidot, 2% nátrium-dodecilszulfátot, 1% merkapto-etanolt tartalmazó pufferben extraháltuk, 1 ml puffért számítva 20 mg szövetre, 15 óráig 37 °C-on. A kivonatokat poliakrilamid-gélelektroforézishez (PAGE) készítettük elő, 7,5% gél nátrium-dodecilszulfát (sodium-dodecylsulphate=SDS) jelenlétében (SDS-PAGE) Laemmli szerint [Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970)], amelyet nitrocellulóz-membránra (BioRad, Richmond, CA) történő elektroforetikus transzfer [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 4350-4354 (1979)] követett, amelyet DG I ellen készített, marhaorrból tisztított nyúl poliklonális antiszérummal [Gorbsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 810-814 (1985)] vizsgáltunk. A megkötődött antitesteket alkálikus foszfatázzal konjugált kecske antinyúl immunglobulinokkal (BioRad, Richmond, CA) mutattuk ki [Blake et al., Anal. Biochem., 136, 175-179 (1984)].

Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. Az immunblothoz adott minták mennyiségét úgy állítottuk be, hogy körülbelül ugyanazt a fehéqekoncentrációt (Coomassie blue-val festett SDS-PAGE gélek vizuális megfigyelésén alapuló becsléssel) adjuk az összetartó szövethez és a disszociált sejtekhez. A kivonatok több hígítását futtattuk a különböző anti-DG I reaktív komponensek mennyiségei szemikvantitatív összehasonlításának lehetővé tételére az összetartó bőrszarurétegben és disszociált sejtekben.

HU 220 339 Β

Amikor szétválasztottuk az összetartó szövetet és a disszociált sejteket, azt találtuk, hogy miközben a még összetartó szövet csak nyilvánvalóan érintetlen DG I-et tartalmazott, a disszociált felületi sejtek ennek a fehérjének csak vélhetően a lebomlási termékeit tartalmazták (3. ábra).

A 4. és 5. ábrán az aprotinin, cinkionok, kimosztatin (Boehringer Mannheim, Germany) és leupeptin (Boehringer Mannheim, Germany) hatását mutatjuk a DG I lebomlására a talp bőrének szarurétegéről történő in vitro sejtvedlés során.

Először az időbeli lefutást és az aprotininnek a dezmoglein I (DG I) lebomlására gyakorolt hatását vizsgáltuk a talp bőrének szarurétegében in vitro végbemenő sejtvedlés során. A talpbőr szarurétegének kivonatait az 1.2.-ben fent leírtak szerint inkubáltuk (de nem választottuk el az összetartó szövetet a disszociált sejtektől az extrakció előtt) aprotinin jelenlétében (15 μΜ) vagy anélkül és 0, 6, 12 vagy 24 óra után extraháltuk. SDS-PAGE-t és immunbiot analízist végeztünk a fentiek szerint. Az immunbiotok denzitometriás letapogatását egy Shimadzu CS-9000 áramló spot scannerben (Shimadzu, Kyoto, Japan) végeztük el 560 nm-en viszszavert fényben, cikk-cakk módban. Az eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be. Megjegyezzük az aprotininnek a DG I lebomlására kifejtett hatékony gátlását.

Ezután a cinkionnak, kimosztatinnak és leupeptinnek a dezmoglein I (DG I) lebomlására gyakorolt hatását vizsgáltuk a talp bőrének szarurétegében in vitro végbemenő sejtvedlés során. A kísérlet tervezése a fent közöltek szerint történt. Az inkubációkat 24 óráig végeztük, cink-szulfáttal 0, 1 vagy 5 mM koncentrációknál, és kimosztatinnal vagy leupeptinnel 330 μΜ koncentrációnál. Az eredmények az anti-DG I pozitív komponensek 160 kD molekulatömegűből 95 és 80 kD-ná történő transzformációjának gátlását mutatták cinkionokkal és kimosztatinnal, leupeptinnel viszont nem.

Ezekből az eredményekből nyilvánvaló, hogy az aprotinin, cinkionok és a kimosztatin gátló hatásúak voltak, miközben a leupeptin nem. Tehát a DG I-lebomlás gátlási profilja ugyanaz volt, mint a talp bőrének szarurétegéből történő in vitro sejtvedlés gátlási profilja [Lundström és Egelrud, J. Invest. Dermatol., 94, 216-220 (1990)].

Fontosnak tekintettük bemutatni, hogy azokhoz a mechanizmusokhoz hasonlóak, amelyek a talp bőrének szarurétegéből történő sejtvedlésért felelősek, jelen vannak - a talptól és tenyértől eltérő - más testrészek bőrének szarurétegében is. Takahashi és munkatársai [J. Soc. Cosmet. Chem., 38, 21-28 (1987)] arról számoltak be, hogy az Ν,Ν’-dimetil-dodecilamin-oxid (Sigma, St. Louis, MO) és a nátrium-dodecilszulfát (BioRad, Richmond, CA) detergensek keverékének 8:2 moláris aránya sejtdisszociációt okozott a teljes epidermisz tripszinizációjával előkészített nem tenyér- vagy talpbőrszarurétegben. Az exogén tripszinnel való fertőződés elkerülésére a normál humán bőrnek a gluteális (farhoz tartozó) régióiból lyukasztott biopsziáit inkubáltuk 8 pH-η a fent említett detergens keverékkel és EDTAval [Egelrud és Lundström, J. Invest. Dermatol., 95,

456-459 (1990)]. Azt találtuk, hogy ilyen körülmények között az elszarusodott réteg különálló sejtekre esett szét. Aprotinin hozzáadása az inkubációs tápoldathoz megakadályozta ezt a sejtdisszociációt. Azt a következtetést vontuk le, hogy az összetartó erő a nem talp és tenyér bőrének szarurétegében is a fehéijeszerkezet függvénye, hogy a pikkelytelendés ebben a szövetben proteolízisfüggő, és hogy a szövet olyan proteázokat tartalmaz, amelyek képesek katalizálni ezt a proteolízist. Mivel sejtdisszociáció csak a bőr szarurétegében történik és nem a mélyebb, nem szarusodott hámsejtrétegekben, azt a következtetést vontuk le, hogy a felelős proteináz a mélyebb rétegekben helyezkedik el inaktív vagy gátolt állapotban.

2. példa

A bőrszaruréteg kimotriptikus enzimjének (SCCE) felfedezése: egy olyan proteináz, amely teljesíti annak kritériumait, hogy felelős a bőr szarurétegében in vitro és talán in vivő is az intracelluláris összetartó szerkezetek lebomlásáért.

Az 1. példában bemutatott kísérletekből azt a következtetést vontuk le, hogy a talp bőrének szarurétegében fellépő pikkelytelenedés in vitro modelljében az egysarkú felületi sejtdisszociációjáért felelős proteináz a következő sajátságokkal kell hogy rendelkezzen:

1. Jelen kell lennie a bőr szarurétegében.

2. Szerinproteináznak kell lennie.

3. Kimotripszinhez hasonló szubsztrátspecificitással és az in vitro sejtvedlésnél és az ahhoz kapcsolódó dezmoglein I lebomlásánál megfigyelthez hasonló gátlási profillal kell rendelkeznie.

4. Extracellulárisan kell elhelyezkednie a bőr szarurétegében.

5. pH-függőséggel kell rendelkeznie, amely lehetővé teszi aktivitását fiziológiás körülmények között, a bőr szarurétegének pH-ja 4,5-6 körüli érték.

6. Mivel a talp bőrének szarurétegéből a sejtvedlés in vitro folyamatosan történik egy meghosszabbított inkubációs idő alatt, még ha az inkubációs tápoldat térfogata az inkubált szövetdarabokhoz képest nagyon nagy is, vagy ha az inkubációs tápoldatot ismételten cseréljük az inkubáció ideje alatt, ésszerűnek tűnt feltételezni, hogy a felelős enzim a szövethez oly módon kötődik, amely nem engedi meg kivonását az inkubációs tápoldatba az inkubáció ideje alatt.

A következő két kísérlet [Egelrud és Lundström, Arch. Derm. Rés., 283, 108-112 (1991)] vezetett az SCCE felfedezéséhez:

2.1. A disszociált talpkorneocitákhoz kapcsolódó enzimaktivitás

Disszociált talpbőrszaruréteg-sejteket (komeocitákat) készítettünk a talpbőr szarurétegének 1. példában leírtak szerinti inkubálásával. A sejteket átszűrtük egy 100 pm pórusméretű nejlonhálón, utána háromszor mostuk tíz térfogatnyi 0,1 M Tris-HCl pH 8 és 5 mM EDTA keverékében és háromszor 0,1 M Tris-HCl pH 8 pufferben. A sejteket ezután kromogén proteinázszubsztrátok két típusával, S-2288-cal vagy S-2586-tal (Rabi Diagnostica, Stockholm, Sweden) inkubáltuk:

HU 220 339 Β

Az Ile-Pro-Arg-p-nitro-anilid (S-2288) arginin specificitással rendelkező szerinproteinázok széles skálájával hasítható (például tripszinnel). Az Arg-Pro-Tyr-pnitro-anilid (S—2586) a kimotripszinhez hasonló proteinázok szubsztrátja.

120 μΐ teljes térfogatban mindegyik reakcióelegy 0,07 M Tris-HCl-t pH 8, 0,1% nátrium-azidot, a mosott talpkomeociták 25%-os szuszpenziójának 1, 2,5, 5 vagy 10 μΐ-ét és 1,04 mM (S-2586) vagy 1,25 mM (S-2288) szubsztrátot tartalmazott. Az 5 órás 37 °C-on mikrotiter lemezekben történő inkubálás után 125 μΐ 10%-os ecetsav hozzáadásával megállítottuk a reakciót. A sejteket hagytuk kiülepedni, és minden egyes felülúszó 200 μΐ-ét új mélyedésekbe vittük át. A két szubsztrát hidrolízisét a 405 nm-en mért abszorbanciában bekövetkezett változás mérésével követtük nyomon, miután a sejteket egy Behring Elisa Processorral (Behringwerke, Marburg, Germany) eltávolítottuk.

Ahogyan azt a 6. ábrán bemutatjuk, a disszociált talpkomeocitákkal kapcsolatos enzimaktivitást tapasztaltunk, amely katalizálta az S-2586 hidrolízisét. Ezzel összevetve az S-2288-cal szembeni aktivitás alacsony volt.

Ezután az S-2586 hidrolizáló aktivitás pH-függését vizsgáltuk. A kísérleti terv a fent közöltek szerint, mosott talpkomeociták 25%-os szuszpenziójának 10 μΐ-e és különböző pH-jú pufferek (nátrium-acetát, nátriumfoszfát vagy Tris-HCl) felhasználásával készült. A végső pufferkoncentrációk 0,07 M voltak. Az eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be, amelyekből úgy tűnik, hogy az aktivitás 7-8 pH-η volt optimális, viszont 5,5 pH-n is szignifikáns.

Egy további kísérletben az EDTA, fémionok és proteinázinhibitorok hatását vizsgáltuk az S-2586-nak szuszpendált talpbőrszaruréteg-sejtekhez kapcsolódó proteinázzal történő hidrolízisére 8 pH-η. A kísérleti terv a fentiek és a 2. táblázatban közöltek szerint készült.

2. táblázat

EDTA, fémionok és proteinázinhibitorok hatásának vizsgálata az S-2586-nak a talpbőrszaruréteg-sejtekhez kapcsolódó proteinázzal történő hidrolízisére (enzimforrás: szuszpendált sejtek)

Inhibitor	Koncentráció	Aktivitás (%) (±SD, η=3)
Nincs	-	100
EDTA3	4,2 mM	109±1
PMSFb	1 mM	8+3
Aprotinin2	3 μΜ	10+1
Szójababtripszin-inhibitor2	0,16 μΜ	6±1
Kimosztatin3’2	11 μΜ	66±9
55 μΜ	32±0
275 μΜ	15±3
Leupeptin3·2	325 μΜ	93+3
ZnSO4 a	100 μΜ	10±3

Inhibitor	Koncentráció	Aktivitás (%) (±SD, η=3)
HgCl2 a	100 μΜ	84±2
CuSO4 a	100 μΜ	85±2

³ Az analíziskeverékben jelen levő vegyület.

^b A talpbőrszaruréteg sejtjeinek 25%-os szuszpenzióját, ahogyan azt a szövegben leírtuk, előre inkubáltuk 1 órán át szobahőfokon 1 mM PMSF (Sigma, St. Louis, MO) jelenlétében, 2-propanolban (a 2-propanol végső koncentrációja 4% v/v) oldva. A kontrollokat csak 4% 2propanolban inkubáltuk előre.

² Dimetil-szulfoxidban (DMSO-ban) oldott inhibitor. Minden tápoldat, beleértve a kontrollokat, 5% (v/v) DMSO-t tartalmazott.

Ahogyan azt a 2. táblázatban fent megmutatjuk, benzil-szulfonil-fluorid (phenylmethylsulphonyl fluoride= =PMSF; a szerinproteinázok általános inhibitora), aprotinin, szójababtripszin-inhibitor, kimosztatin (kimotripszin inhibitor) és cinkionok gátolták, a leupeptin (tripszin inhibitor) viszont nem, az S-2586 hidrolizáló aktivitást. Az inhibitorprofil tehát nagyon hasonló volt ahhoz, amelyet az in vitro sejtvedlésnél és az ahhoz kapcsolódó dezmoglein I lebomlásnál figyeltünk meg.

2.2. A disszociált talpbőrszaruréteg zimográfiája

Azt találtuk, hogy a 2.1.-ben felfedezett, az S-2586 hidrolizáló aktivitásért felelős enzimet oldhatóvá tudtuk tenni, ha a komeocitákat 0,1 M Tris-HCl pH 8 pufferben oldott 1 M KCl-dal extraháltuk. Ennek érdekében zimográfiával végeztünk kísérleteket. Erre a célra komeociták KCl-os kivonatát készítettük elő Laemmli szerinti elektroforézishez [Natúré, 227, 680-685 (1970)] a mintapufferben azonban nem használtunk redukálószert és nem hevítettük a mintákat. A disszociált talpkomeociták redukálószer nélküli Laemmli-féle mintapufferrel, szobahőfokon történő extrakciójával szintén készítettünk mintákat. Zimográfiához Horie és munkatársai [Comp. Biochem. Physiol., 77B, 349-354 (1984)] eljárásának módosított változatát vettük át. Nátrium-dodecilszulfát jelenlétében történő gélelektroforézist (SDS-PAGE) végeztünk Laemmli szerint 1% kopolimerizált, hővel denaturált kazeinnel kiegészített 12,5% gélben. Az elektroforézis után a géleket 2% Triton Χ-100-at tartalmazó pufferben áztattuk 1 órán át szobahőmérsékleten az SDS eltávolítása céljából és utána 15 óráig inkubáltuk 37 °C-on. A géleket ezek után Coomassie blue-val festettük. Az elválasztott kazeinbontó enzimek tiszta sávokként jelentek meg a kék háttér előtt. Lásd a 8. ábrához tartozó feliratokat is a kísérleti részletek végett.

Az eredményeket a 8. ábrán mutatjuk be. A talpkorneociták kivonatai egy fő, körülbelül 25 kD molekulatömegű kazeinbontó enzimet tartalmaztak. Kisebb mennyiségben is előfordultak kazeinbontó enzimek, körülbelül 30 kD molekulatömeggel. (Ezek a kisebbségben levő komponensek nem látszanak tisztán az ábrán. Később derült ki, hogy ezeket a leupeptin gátolni tudta, a kimosztatin viszont nem.) A 25 kD enzim szignifikáns aktivitással rendelkezett 5,5-8 pH-η. Ezt gátolta az aprotinin, cinkionok és a kimosztatin, a leupeptin azonban nem. Tehát ugyanazzal az inhibitorprofillal

HU 220 339 B rendelkezett, mint az S-2586 hidrolizáló aktivitás (lásd fent). A gélkizárásos kromatográfiával végzett kísérletekben (nem mutatjuk) a 25 kD kazeinbontó enzimet az

S-2586 hidrolizáló aktivitással kokromatográfiásnak találtuk.

További kísérletekben (nem mutatjuk) a fent 2.2ben leírttal azonos technikával azt találtuk, hogy a nem talp bőrszaruréteg egy olyan enzimet tartalmaz, amelynek tulajdonságai nyilvánvalóan azonosak a talpkomeocitákhoz kapcsolódó 25 kD proteináz tulajdonságaival, 10 amelyet innentől kezdve a bőrszaruréteg kimotriptikus enzimjének (stratum comeum chymotryptic enzyme=SCCE) nevezünk [Lundström és Egelrud, Acta Dér. Venereol. (Stockholm), 71, 471-474 (1991)].

Annak a nyilvánvaló ténynek a megfigyelésére is adódott lehetőség, hogy az SCCE a talpkomeocitákhoz oly módon kapcsolódik, amely lehetővé teszi aktivitását a bőr szarurétegének extracelluláris terében. Először mutattuk meg, hogy a disszociált komeociták a torma-peroxidázra (44 kD molekulatömeg) nem áteresz- 20 tőek. Azután megmutattuk, hogy a humán fibrinogén (340 kD molekulatömeg) lebontható komeociták szuszpenziójával, és hogy ez a lebomlás ugyanazokkal az inhibitorokkal gátolható, mint az SCCE. Ki tudtuk zárni, hogy a fibrinogén lebomlását oldott enzim okozta [Egelrud, Eur. J. Dermatol., 2, 50-55 (1992)].

3. példa

A bőrszaruréteg kimotriptikus enzimjének (SCCE) részleges tisztítása és proteinázmeghatározások kromogén szubsztrátokkal

3.1. Talpkorneociták KCl-os kivonatának elkészítése Disszociált talpkomeocitáknak az 1. példában leírtak szerinti előállítását méretnöveltük és az SCCE-t tartalmazó mosott talpkorneociták KCl-os kivonatát készítettük el a 2. példában leírtak szerint.

A talpkorneociták KCl-os kivonatainak elkészítését 15 vázlatosan alább, a 3. táblázatban közöljük. Hiperplasztikus humán talpbőrszaruréteget gyűjtöttünk a Svéd Pedikűrösök Társasága közreműködésével. Csak lyukasztással vagy vágással nyert anyagot használtunk fel. Hámlási rendellenességeket mutató lábakról nem gyűjtöttünk anyagot. Elküldés előtt a bőr szarurétegét levegőn szárították és műanyag zacskókba csomagolták. A laboratóriumban felhasználásig -20 °C-on tároltuk.

3. táblázat

Az SCCE-tartalmú disszociált talpkorneociták KCl-os kivonata elkészítésének vázlata

Talp bőrének szarurétege 50 g °C-on 24 óráig inkubálva 0,1 M Tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA és 0,l%Na-azid keverékének 1000 ml-ében

Felülúszó- - Centrifugálás 740 χ g; 5 perc

Mosások- - A pelletek mosása 5 χ 600 ml 0,1 M Tris-HCl-lel pH 8; Centrifugálás, mint fent

A pelletek extrahálása 1 térfogat, 0,1 M Tris-HCl pH 8 puffer- —1. Extraktum ben készített, 2 M KCl-dal 30 percig 4 °C-on; (körülbelül 250 ml)

Centrifugálás, mint fent

A pelletek mosása 1 térfogat, 0,1 M Tris-HCl pH 8 pufferben --2. Extraktum készített, 1 M KCl-dal; (körülbelül 150 ml)

Centrifugálás, mint fent

Pellet

Minden egymást követő affinitáskromatográfiás lépéshez kétszer 50 g talpbőrszarurétegből készített 1. és 2. extraktumot gyűjtöttünk össze.

3.2. Proteinázmeghatározások kromogén szubsztrátokkal

Összehasonlítottuk az SCCE-t, a szarvasmarha-kimotripszint és a humán katepszin G-t tekintettel az aprotinin-, kimosztatin-, cink-szulfát-inhibitorok hatására és a szubsztrátspecificitásra.

Törzsoldatként készítettünk, MeO-Suc-Arg-ProTyr-pNA-t (S-2586) desztillált vízben, Suc-Ala-AlaPro-Phe-pNA-t (Boehringer Mannheim, Germany) 1metil-2-pirrolidonban (az oldószer végső koncentrációja az inkubációs keverékben 4%) és kimosztatint dimetil-szulfoxidban (az oldószer végső koncentrációja az inkubációs keverékben 1%). Gennyes humán köpetből származó katepszin G-t kaptunk E. Lottitól (Geneva, Switzerland). Az SCCE forrás disszociált talpkorneociták KCl-os kivonata volt a fentiek szerint elkészítve. Az inhibitorok - aprotinin, kimosztatin és cinkszulfát - forrását fent leírtuk.

Az inkubációkat 37 °C-on, mikrotiter lemezekben végeztük. A teljes inkubációs térfogat 135 pl volt. Mindegyik inkubációs keverék tartalmazott Tris-HCl-t pH 8

HU 220 339 Β (végső koncentráció 0,08 M), KCl-ot (végső koncentráció 0,2 M), 100 μΐ szubsztrátoldatot, 25 μΐ enzimforrást (megfelelően meghígítva 0,1 M Tris-HCl pH 8 és 1,0 M KC1 elegyében) és 10 μΐ inhibitoroldatot.

A 9. ábrán A-C, MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA-t (S-2586, kezdeti koncentráció 1,2 mM) használtunk szubsztrátként. D-ben mindkét szubsztrát kezdeti koncentrációja 1,2 mM volt.

Az inkubációk végén (1,5 óra) 125 μΐ 10%-os ecetsavat adtunk minden mélyedésbe, és leolvastuk a 405 nmen mért abszorbanciát az enzim hozzáadása nélküli inkubációs keverékekkel mint vakpróbákkal. A hozzáadott enzim mennyiségét úgy állítottuk be, hogy a 405 nm-en mért abszorbanciában bekövetkező változás az inkubáció végén 0,3-0,7 legyen.

Az eredményeket a 9. ábrán A-D-ig foglaljuk össze. Az inhibitorok hatásának vizsgálatához az S-2586-ot használtuk fel szubsztrátként. Az aprotinin hatékonysága SCCE- és kimotripszin-inhibitorként magas volt és körülbelül ugyanolyan mértékű mindkét enzimnél. Másfelől a katepszin G-re kifejtett hatás jóval alacsonyabb volt (9A. ábra). A kimosztatin mind a három enzimre gátló hatású volt, de az 50%-os gátlást eredményező inhibitorkoncentráció három nagyságrenddel magasabb volt SCCE esetében, mint kimotripszinre és katepszin G-re (9B. ábra). A cink-szulfát az SCCE hatékony inhibitorának bizonyult, kimotripszin és katepszin G esetében viszont nem (9C. ábra). A három enzim aktivitását hasonlítjuk össze a MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) és Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA szubsztrátokkal szemben a 9D. ábrán. Mivel a cél a vizsgált enzimek közötti hasonlóságok vagy eltérések felfedése volt, ezeket a kísérleteket mindegyik szubsztrátra csak egy kiindulási koncentrációnál végeztük el. Mialatt kimotripszin és katepszin-G esetében a Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA szignifikánsan jobb szubsztrátnak tűnt, mint az S-2586, ennek fordítottját találtuk SCCE esetében.

4. példa

A bőrszaruréteg kimotriptikus enzimjének tisztítása és N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározása

4.1. Az SCCE tisztítása komeociták KCl-os kivonatából affinitáskromatográfia segítségével oldhatatlan szójabab tripszin-inhibitoron (SBTI-n)

A 10. ábra az SBTI-n végzett affinitáskromatográfia eredményeit mutatja. Az affin gélt 50 mg SBTInek (Boehringer, Mannheim, Germany) 12 ml szedimentált Affigel 15-höz (BioRad, Richmond, CA) történő kapcsolásával készítettük el a gyártó utasításai szerint. A megmaradt aktív csoportokat a gélen etanolaminnal blokkoltuk. Talpbőrszaruréteg kombinált KClos kivonatainak 100 g-ját (szárazanyag) (teljes térfogat 700 ml) hajtottuk át üvegoszlopban elhelyezett 0,8x2 cm-es SBTI-Affigel 15 ágyon, 42 ml/óra áramlási sebesség mellett, a 280 nm-en mért abszorbancia folyamatos regisztrálásával. Az oszlopot 0,1 M Tris-HCl pH 8, 1 M KC1 oldatával mostuk addig, amíg az eluátum abszorbanciája 0,01 érték alá nem csökkent, és utána 10 ml 0,1 M Tris-HCl pH 8 pufferrel. A kötött anyag lépésenként! elúcióját végeztük el 1, 10 és 100 mM sósavval. Az eluenst akkor cseréltük, amikor az eluátum abszorbanciája 0,01 alá csökkent. 3 ml frakciókat gyűjtöttünk olyan tesztcsövekbe, amelyek 0,4 ml teljes térfogat Tris-HCl-t pH 8 tartalmaztak, olyan mennyiséget, amelyet elegendőnek becsültünk az elutáum pH-jának 7 fölé emeléséhez. Minden frakció pH-ja azonnal megváltozott, és ha szükség volt rá, 1 M Tris-HCl pH 8 kis térfogataival 7 körüli értékre állítottuk be. A peptidhidrolizáló aktivitás analíziseit S-2586-tal (SCCE szubsztrátjával) és S-2288-cal (tripszinhez hasonló enzimek szubsztrátjával) végeztük el, ahogyan azt a 2.1. példában leírjuk. Az analíziskeverékben mindkét szubsztrát kezdeti koncentrációja 1,1 mM volt. Az S-2586 hidrolizáló aktivitásnak körülbelül 90%-a kötődött a gélhez. A mosott gélnek 10-100 mM sósavval történő lépésenkénti elúciójával a teljes S-2586 hidrolizáló aktivitásnak körülbelül 60%-át nyertük vissza az alkalmazott KCl-os kivonatban. A teljes S-2288 hidrolizáló aktivitásnak körülbelül 20%-a kötődött az affm gélhez és 10%-át tudtuk visszanyerni az eluátumban.

All. ábra az SBTI affinitáskromatográfiából származó eluátumok analízisét mutatja poliakrilamid-gélelektroforézissel SDS jelenlétében (SDS-PAGE) és zimográfiával. A nem redukált minták 12,5% gélen futottak. Lásd még Egelrud és Lundström (1991) leírását és a 2. példában a 2.2. pontot a kísérleti részletek végett. Mielőtt a mintákat elkészítettük az elektroforézishez, körülbelül 20-szorosra koncentráltuk azokat A-ban centrifugális szűrés segítségével Ultrafree-MC filterek (10 kD-nál vág el; Millipore, Bedford, MA) felhasználásával, és B-ben 10-szeresre hígítottuk.

A 12. ábrán egy SBTI affinitáskromatográfiából származó nem redukált és redukált minta SDS-PAGE összehasonlítását mutatjuk be.

Ahogyan azt a 10. és 11. ábrákon bemutatjuk, az SBTI affinitáskromatográfia egy olyan fehérjét eredményezett, amely több mint 90%-os tisztaságot mutatott (Coomassie blue-val megfestett SDS-PAGE gélekből ítélve), nem redukált formában 25 kD körüli látszólagos molekulatömeggel és 28 kD körüli molekulatömeggel redukált formában. Ezenfelül kis mennyiségben volt egy Coomassie blue pozitív komponens körülbelül 1 kD-nal nagyobb látszólagos molekulatömeggel, mint a fő komponens. A zimográfíás géleken volt egy fő és egy kisebb sáv ugyanazokkal az elektroforetikus mobilitásokkal, mint a Coomassie blue-val festett géleken nem redukált mintákkal kimutatott két sáv. E mindkét kazeinbontó komponens gátolható volt kimosztatinnal. Ezenfelül a zimográfia kimutatott kisebb mennyiségben, körülbelül 30 kD látszólagos molekulatömegű komponenseket, amelyeket leupeptinnel gátolni tudtunk. Azt a következtetést vontuk le, hogy a fő tisztított fehéije SCCE volt.

4.2. Az SCCE N-terminális aminosavszekvenciájának analízise

Az SBTI-Affigel 15, A₂₈o_nm 0,2, kromatogramból származó frakció 200 μΐ-ét készítettük el SDS-PAGEhez redukcióval vagy redukció nélkül, és futtattuk 12,5% poliakrilamid-gélen (vastagság 1 mm, nyomszélesség 73 mm). Az elektroforézis után a szétválasztott fehéijé21

HU 220 339 B két elektroforetikusan Immobilon szűrőre (Millipore) vittük át és megfestettük Coomassie blue-val Matsuidaira szerint [J. Bioi. Chem., 262, 10 035-10 038 (1987)]. A fő fehéqesávot kivágtuk és egy on line PTH 120A-val ellátott Applied Biosystems 477A pulzáló folyadékfázisú aminosavszekvencia-analizátorban (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA) dolgoztuk fel. A szekvenálást a gyártó által megadott szabályosciklus-programokkal és vegyszerekkel végeztük el. A standard fehérjékből becsült kezdeti és ismétlődő hozamok 25% és 97% voltak külön-külön.

Az aminosavszármazékok hozamai csak egy megszekvenált peptiddel voltak összeegyeztethetők. Nem redukált mintákkal az 1-6. lépésekben voltak jó hozamok, a 7. és 9. lépésben azonban ez nullára csökkent. A következő lépésekben a hozamok erőteljesen csökkentek. A redukált mintákkal sem tudtunk kimutatni aminosavszármazékokat a 7. és 9. lépésben, a rákövetkező lépésekben azonban, ahol ki tudtunk mutatni származékokat, nem fordult elő meredek csökkenés a hozamokban. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a 7. és 9. helyeken ciszteinek vannak. Nem sikerült azonban (karboxi-metil)-ciszteint kimutatni a 7. és 9. lépésben redukciót és jód-ecetsavas (100 mM) kezelést követően. A kapott szekvencia (13. ábra, 3. számú szekvenciavázlat) azonos volt a redukált és nem redukált mintáknál.

5. példa

5.1. SCCE-specifikus monoklonális antitestek készítése

Balb/c egereknek (Bomholtgaard, Denmark) körülbelül 30 pg, a 4.1. példában leírtak szerint tisztított natív SCCE-t adtunk Freund-féle komplett adjuvánsban (Difco Laboratories, Detroit, MI) szubkután injekciók formájában. Az injekciókat egy hónap múlva ugyanolyan mennyiségű SCCE-vel Freund-féle inkomplett adjuvánsban (Difco Laboratories, Detroit, MI) megismételtük. Az első injekció után négy hónappal egy egérnek intravénás emlékeztető injekciókat adtunk három egymást követő napon, injekciónként 30 pg antigénnel. Hibridómákat Carlsson és munkatársai módszere szerint [Molec. Immun., 22, 1073-1080 (1985)] állítottunk elő az SP2/0 mielóma-sejtvonal (ATCC CRL 1581) sejtjeivel. A tisztított SCCE-készítménnyel reagáló antitestek azonosítását ELISA-technikával végeztük el. A pozitív kiónok tenyészetének felülúszóját tovább analizáltuk SDS-PAGE-t követő immunbiot segítségével. Az SCCE-vel reagáló antitesteket termelő kiónokat ebben a tesztben egér hasüregi folyadékában szaporítottuk, és az antitesteket Protein A affinitáskromatográfiával tisztítottuk, és Carlsson és munkatársai módszere [Molec. Immun., 22, 1073-1080 (1985)] szerint osztályoztuk. Két használható antitestet (moab) kaptunk, TE4b-t és TE9bt, mindkettőt IgGi-kappaként soroltuk osztályba.

A TE4b moab és TE9b moab immunprecipitáció és immunbiot segítségével végzett jellemzését a 14. ábrán mutatjuk be. A 14A. ábra (2. sáv) a 3.1. példában leírtak szerint, disszociált talpkomeociták koncentrált KC1os kivonatával készített, Coomassie blue-val festett SDS-PAGE gélt mutat. A mintát 4 óráig dializáltuk

0,1 M nátrium-acetáttal (pH 4) szemben és ultraszűréssel körülbelül 100-szorosra töményítettük, mielőtt előkészítettük az elektroforézishez. A 14A. ábra (3. sáv) olyan SCCE-készítményt mutat, amelyet a 4.1. példában leírtak szerint tisztítottunk.

A 14B. ábra mutatja egy immunprecipitációs kísérlet eredményeit, amelyben antitesteket inkubáltunk a komeociták KCl-os kivonatával és utána visszanyertük oldhatatlan Protein A-val. A visszaoldott és disszociált antigén-antitest komplexeket zimográfiával analizáltuk a 2. példában leírtak szerint.

Disszociált talpkomeociták KCl-os kivonatának 250 pl-ét - amelyet ultraszűréssel 5-szörösére töményítettünk - foszfátpufferes sóoldattal szemben dializáltuk, amelyhez szarvasmarha-szérumalbumint (Sigma, St. Louis, MO) adtunk 10 mg/ml végső koncentráció eléréséig, összekevertük 10 pl antitestoldattal vagy foszfátpufferes sóoldattal és 15 órán át 4 °C-on inkubáltuk. Ezután kiülepedett Protein A Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Sweden) 25 pl-ét adtuk a csövekhez, és folytattuk az inkubálást enyhe rázogatással, szobahőmérsékleten 2 órán keresztül. A gélt centrifiigálással nyertük vissza és ötször mostuk 0,05% Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO) 0,05 M Tris-HCl-ben pH 7,5, 0,5 M NaCl oldatának 1 ml-ében. Az utolsó mosás után a gélt 100 pl, redukálószer nélküli Laemmli-féle mintapufferrel extraháltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A kivonatokat centrifugálással tisztítottuk és felvittük a gélre.

Mind a TE4b és TE9b maob kicsapta a tisztított SCCE-vel azonos molekulatömegű kazeinbontó enzimet és a megfelelő fő kazeinbontó enzimet a KCl-os kivonatban. Az antitestek nem csapták ki a kivonatban kisebbségben levő, körülbelül 30 kD molekulatömegű kazeinbontó enzimeket, amelyekről megmutattuk, hogy leupeptinnel - tripszinhez hasonló szerinproteázok inhibitorával - gátolhatok. Úgy tűnt, hogy a 25 kD-os kazeinbontó enzimen felül az antitestek kötődtek egy körülbelül 80 kD molekulatömegű, kisebbségben levő proteolitikus komponenshez. Ez a komponens általában jelen van az előzőleg megszárított szövetből készített talpkomeociták KCl-os kivonataiban, viszont nem találtuk olyan készítményekben, amelyek friss szövetből készültek (T. Egelrud nem publikált megfigyelése). Nincs jelen olyan SCCE-készítményekben, amelyeket affmitáskromatográfiával tisztítottunk és aggregációs terméket képviselhetnek. Nem volt lehetséges antitestekkel reagáló megfelelő komponenst kimutatni immunblot analízisekben.

SDS-PAGE gélek immunblot analíziseiben nem redukáló körülmények között (14C. ábra) olyan TE4b és TE9b moab-k futottak, amelyek reagáltak a talpkorneociták KCl-os kivonataiban (14C. ábra, 2. és 4. sávok) és a tisztított SCCE-készítményben (14C. ábra, 3. és 3. sávok) jelen levő komponenssel, amelyek közül mindkettő ugyanazzal a molekulatömeggel rendelkezett, mint a fő tisztított fehérje és a fő kazeinbontó komponens a zimogramokon. Az antitestek nem voltak reaktívak olyan mintákkal, amelyeket SDS jelenlétében redukáltunk, azt sugallva, hogy konformációfüggő epitópok ellen irányulnak.

HU 220 339 Β

A nem redukált formában körülbelül 25 kD molekulatömegű fő fehérjén felül a tisztított SCCE-készítmény tartalmaz egy kis mennyiségben jelen levő, körülbelül 26 kD molekulatömegű (nem redukált; lásd a 3. példát) Coomassie-pozitív komponenst. A zimogramokon jelen van egy ennek megfelelő kazeinbontó komponens és a fő, 25kD kazeinbontó komponenshez hasonló módon gátolható kimosztatinnal (lásd a 3. példát). TE4b és TE9b moab-k magasabb koncentrációinál (eredményeket nem mutatunk) is láthattuk ezt a kis mennyiségű komponenst reagálni az antitestekkel immunbiot analízisekben. Hasonló eredményeket (nem mutatjuk) kaptunk a preparatív elektroforézissel tisztított fő Coomassie-pozitív komponens elleni poliklonális nyúlantitestekkel. A két SCCE-hez hasonló aktivitással rendelkező fehéije közötti pontos kapcsolat és nyilvánvaló immunológiai keresztreakció nem ismert.

5.2. Poliklonális SCCE-specifikus antitestek

5.2.1. Csirke-anti-SCCE

A 4.1. példában leírtak szerinti SBTI affmitáskromatográfiával tisztított SCCE 45 pg-ját 0,2 ml 0,1 M TrisHCl-ben hővel denaturáltuk 60 percig 60 °C-on és azonos térfogatú Freund-féle komplett adjuvánssal (Difco Laboratories) homogenizáltuk. A kapott emulziót szubkután oltottuk körülbelül 20 hetes Derco csirkékbe, amelyekből az előimmunszérum előállításához vérmintát vettünk. 3, 5 és 7 hét után a csirkéknek további szubkután injekciókat adtunk a fent leírtak szerint azonban Freund-féle inkomplett adjuvánssal és a tisztított, hőkezelt SCCE 30 pg-jával - készített emulziókból (minden emulzió teljes térfogata 250 pl volt). A csirkéket 2 héttel az utolsó injekció után elvéreztettük. A vért azonnal összekevertük 2 térfogatnyi Alsever-féle oldattal (100 ml-ként: 1,87 g glükóz, 0,8 g nátrium-citrát, 0,62 g nátrium-klorid, a pH-t citromsavval 6,1-re állítottuk be) és centrifugáltuk. A további vizsgálatokhoz kiválasztott csirke-anti-SCCE-t 1/2000 hígításban használtuk immunblottal végzett kísérletekhez. Az antiszérum specificitásának szemléltetésére lásd a 17. ábrát és a 8. példát.

5.2.2. Nyúl-anti-SCCE

SBTI affmitáskromatográfiával tisztított SCCE-t vezettünk alá SDS-PAGE-nek redukció nélkül - a 4.1. példában leírtak szerint - 15 mm vastagságú géleken Laemmli szerint [Natúré, 227, 680-685 (1970)]. Az előzőleg SCCE-nek mutatkozó fő fehérjesávot a Lee és munkatársai által kidolgozott réz-kloridos festési eljárással [Anal. Biochem., 166, 308-312 (1987)] láthatóvá tettük és kivágtuk. Miután a réz-kloridot EDTA-val eltávolítottuk (Lee és munkatársai szerint), a gélszeleteket foszfátpufferes sóoldatban homogenizáltuk. A homogenizált gélszeletek mintáit Freund-féle adjuváns egyenlő térfogataiban szuszpendáltuk. Körülbelül 30 pg ilyen módon készített tiszta SCCE-t adtunk komplett adjuvánsban szubkután a nyúlnak. Az injekciót 3, 5 és 7 hét után megismételtük ugyanazon mennyiségű SCCE-vel, de inkomplett adjuvánssal. A nyulat két héttel az utolsó injekció után elvéreztettük.

A kapott nyúl-anti-SCCE-t (D-5) 1/500-1/1000 hígításban használtuk fel alkalikus foszfatázzal konjugált antinyúl-immunglobulinokkal végzett immunbiot kísérletekben második antitestként.

A kötött második antitesteket mindegyik immunbiot kísérletben Blake és munkatársai szerint [Anal. Biochem., 136, 175-179 (1984)] mutattuk ki (hivatkozások az 5., 8. és 9. példára).

A nyúl-anti-SCCE Bo- 1-et ugyanilyen módon készítettük el, de olyan SCCE-vel, amelyet az SDS-PAGE előtt redukáltunk, mint antigént.

5.3. A monoklonális antitestekkel végzett immunhisztokémiai vizsgálatok

Az SCCE-specifikus monoklonális antitestekkel végzett immunhisztokémiai vizsgálatokban az SCCE-t ki tudtuk mutatni a humán keratinizálódó pikkelyes hám (epidermisz, hajtüszők külső gyökérlemeze, kemény szájpadlás) nagy szuprabazális sejtjeiben, a nem keratinizálódó pikkelyes hámban (hajtüszők belső gyökérlemezében, az ajakhoz és archoz tartozó nyálkahártyában) azonban nem. Az SCCE tehát valószínűleg specifikusan a keratinizálódó pikkelyes hámban fejeződik ki. Továbbá SCCE-kifejeződést tapasztaltunk az in vitro rekonstruált és a levegő-víz határon nőtt humán epidermisz nagy szuprabazális sejtjeiben. Ha retinasavat olyan koncentrációban adtunk a tápoldathoz, amely a keratinocitaszaporodást stimulálta, a bőr szarurétegének képződését azonban gátolta, SCCE már nem fejeződött ki. Ez azt sugallja, hogy az SCCE-kifejeződés a hámdifferenciálódási programnak egy része lehet.

Az SCCE-specifikus monoklonális antitestekkel végzett immunelektronmikroszkópos kísérletekből származó eredmények összeegyeztethetők az SCCE-nek a dezmoszómális lebomlásban játszott szerepével és így a pikkelytelenedéssel. Az antitestek specifikusan megjelölték a sejtek közötti térbe, a legfelső granuláris sejtek és a legalsó bőrszarurétegsejtek közé történő kiválasztódásnak kitett lamelláris testeket, miután a bőr szarurétegében az antitestek felismerték a dezmoszómákkal közeli kapcsolatban levő epitópokat az extracelluláris térben.

6. példa

A humán SCCE-t kódoló cDNS klónozása és szekvenálása

Restrikciós enzimeket a Promega cégtől (Madison, MI) és TAQ-polimerázt a Perkin-Elmer-Cetus-tól (Norwalk, CT) szereztünk be. A hám eredetű, felnőtt humán keratinocitákból származó mRNS-ből készített Xgtl 1 humán keratinocita-cDNS-könyvtárat a Clontech Laboratoriestől (Palo Alto, CA, Catalog #HL 1045 b) kaptuk. Kezdetben a könyvtárat a D-5 és Bo-1 antiSCCE nyúl poliklonális szérummal screeneltük (lásd az

5.2.2. példát). Mivel a Bo-1 poliklonális anti-SCCEszérum magas háttéijeleket adott, ezt egy korai szakaszban kizártuk a kiterjedt screenelési vizsgálatból. A D-5 antiszérum felhasználásával számos immunreaktív plakkot dúsítottunk, mint feltehetően valódi pozitív plakkot. Egyik plakknál sem figyeltünk meg reaktivitást a moab 4 és moab 9 monoklonális antitestekkel. Tizenegy izolált plakk kiterjedt restrikciós enzimes és PCR-jellemzése azt mutatta, hogy a különböző plakkok között semmiféle hasonlóság nem mutatható ki. Ilyen részleges ha23

HU 220 339 Β sonlóság fennállása azt jelzi, hogy a plakkok ugyanazon cDNS-szekvenciából származó homológ DNS-inszertet tartalmaznak. Egy lehetséges SCCE-cDNS-szekvencia „ujjlenyomata” definiálásának kudarcából kiindulva módosítottuk a stratégiát.

A plakkokat E. coli Y 1090-ben (Clontech) screeneltük plakkhibridizációval, degenerált szintetikus oligonukleotidot alkalmazva próbaként. Az oligonukleotid-próbát a natív SCCE-enzim - 4.2. példában leírt kísérletileg meghatározott aminoterminális szekvenciája alapján terveztük meg. Az aminosavszekvencia legmegbízhatóbb részét - Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (a 3. számú szekvencia 1 -6. teijedő aminosavait) - választottuk ki az 5’-ATHATHGAYGGNGCNCC-3’ (H=A vagy C vagy T; Y=C vagy T; N=A vagy C vagy G vagy T), SYM3067-nek jelölt, a 4. számú szekvenciavázlatban leírt, szintetikus 17 tagú oligonukleotid-próba megszerkesztéséhez. Az oligonukleotid-próbát Beckman 200A DNS-szintetizáló segítségével, foszfor-amidit technika alkalmazásával, a forgalmazó útmutatásai szerint szintetizáltuk.

E. coli Y 1090 baktériumokat szaporítottunk egy éjszakán keresztül 0,2% maltózt és 10 mM MgSO₄-ot tartalmazó LB tápoldatban [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor (1989)]. A tenyészet 0,4 ml-ét ezután összekevertük hígított fágtörzskönyvtárral és 20 percig 37 °C-on adszorbeáltattuk. A fertőzött tenyészetet 6 ml lágy agarózzal (0,75% agaróz LB-ben és 10 mM MgSO₄) kevertük össze. A lágy agarózos keveréket tíz 150 mm-es LA lemezre öntöttük. A lemezeket 37 °C-on 5 órán át inkubáltuk és 4 °C-on tároltuk egy éjszakán át. Összességében a lemezek körülbelül 4 χ 10⁵ plakkot tartalmaztak.

A plakkok rögzítésére minden egyes lemezt 2 percre NEN DuPont Colony/Plaque Screen membránokkal (DuPont, Wilmington, DE) fedtünk be. A membránokat 2-szer 2 percig áztattuk 0,5 M NaOH-ban, 2-szer 2 percig Tris-HCl-ben pH 7,5 és hagytuk levegőn megszáradni. Ezeket a membránokat használtuk azután az alább leírt hibridizációs kísérletben. A membránokat előhibridizáltuk 10% dextrán-szulfát, 1 M NaCl és 100 mg/ml denaturált heringsperma-DNS-t (Sigma, St. Louis, MO) tartalmazó 1% SDS-oldat keverékében 5 órán át 65 °C-on. A SYM3067 próbát T4 polinukleotid kináz (Promega, Madison, WI) felhasználásával [λ-³²Ρ] dATP-vel jelöltük meg és az elóhibridizációs keverékhez adtuk. A hibridizációt 12-18 óráig végeztük 42 °C-on.

A hibridizáció után a membránokat négyszer mostuk 5 percig 2 χ SSC-ben szobahőfokon, kétszer 30 percig 2 χ SSC, 1% SDS keverékében 42 °C-on és végül 0,1 SSC-ben szobahőfokon 30 percig. A membránokat autoradiográfiának vetettük alá röntgenfilmen (Hyperfilm-MP, Amersham, UK). Tizennégy pozitív plakkot azonosítottunk az első screenelésnél. Ezeket a pozitív plakkokat újra screeneltük ugyanazt a próbát és módszereket alkalmazva, mint fent. Az újrascreenelési eljárás után két pozitív plakkot azonosítottunk. A két kiválasztott plakkot egy másik alkalommal tisztítottuk és SYM 1600 és SYM 1601, mint primerek és izolált fágok mint templátok felhasználásával - PCR-technikával meghatároztuk az inszertek méretét. Ez a két primer komplementer a Xgtll fág bal és jobb karjával, külön-külön. Az A 6.2.2. fágból eredő, körülbelül 0,9 kb megsokszorozott DNS-fragmentumot ezután EcoRI-gyel emésztettük és EcoRI-gyel emésztett pUC 19-be (Pharmacia, Uppsala, Sweden) klónoztuk, pS496. Ezt a klónozott fragmentumot pUC19-cel komplementer primerek felhasználásával részleges szekvenciaanalízisnek vetettük alá. A nukleotidszekvenciát T7 szekvenáló kit (Pharmacia, Uppsala, Sweden vagy USB, Cleveland, Ohio) segítségével határoztuk meg.

A kapott DNS-szekvencia transzlációja olyan aminosavszekvenciát eredményezett, amely homlóg volt a kísérletileg meghatározott fehérje szekvenciájával. A szekvenciából azonban hiányzott a transzlációs startkodon. Teljes hosszúságú cDNS izolálása céljából a kapott DNS-fragmentumot agarózgélen szeparáltuk és próbaként felhasználtuk szigorú körülmények között végbemenő hibridizációhoz. Ezt a próbát multiprime DNS jelölő rendszer (Amersham, UK) alkalmazásával ³²P-vel jelöltük meg, a következő eljárással. A gélhez 3 ml/g arányban vizet adtunk és belehelyeztük egy forrásban levő vízfürdőbe 7 percre a gél megolvasztása és a DNS denaturálása céljából. A csövet ezután 37 °C-os vízfürdőbe vittük át legalább 10 percre. Körülbelül 25 ng DNS-t tartalmazó DNS/agaróz oldatadagot adtunk ajelölt reakcióhoz az ellátó útmutatásai szerint.

Teljes hosszúságú cDNS nyerése céljából a cDNSkönyvtárat kétszer újra screeneltük ezzel a mintával, ugyanazt a módszert használva, mint fent, kivéve, hogy a hibridizáció szigorú körülmények között 65 °C-on történt. Ezek a kísérletek az azonosítás és izoláció során 45 egyedi pozitív plakkot eredményeztek, amelyeket először PCR-analízissel, SYM 1600-at (5’-GTG GCG ACG ACT CCT GGA GCC-3’; 5. számú szekvenciavázlat) vagy SYM 1601-et (5’-ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3’; 6. számú szekvenciavázlat) kombinációban SYM 3208-cal, mint PCR-primereket alkalmaztunk a hibátlan 5’ nyílt leolvasási keretet tartalmazó plakk azonosítására. A SYM 3208-at (5’-TGG GTG GGA GCC TCT TGC ACA-3’; 7. számú szekvenciavázlat), amely legalább részben komplement az SCCEcDNS 5’-részével, a pS496 plazmidból kapott DNSszekvencia információra alapozva terveztük meg. Ezután a screenelés után négy fágot választottunk ki további analízishez. Az ezekből a fágokból származó, eredményül kapott PCR-rel sokszorozott fragmentumokat szekvenciaanalízishez pUC19 plazmidba klónoztuk, ahogyan fent leírtuk. A kapott eredmények azt jelezték, hogy a fágok egyike, a 205.2.1, tartalmazta a teljes hosszúságú inszertet.

Az izolált 205.2.1 fágból a DNS-t Sambrook és munkatársai [Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor (1989)] szerint készítettük el és a DNS-készítményt EcoRI-gyel emésztettük. Az emésztett DNS-t agaróz-gélelektroforézissel választottuk el, és egy körülbelül 1 kb fragmentumot izoláltunk és klónoztuk EcoRI-gyel emésztett pUC19-be. Az eredményül kapott plazmidot pS500-nak jelöltük

HU 220 339 Β (15. ábra). A cDNS-fragmentum komplett nukleotidszekvenciáját a fentiek szerint határoztuk meg. A szekvenáló reakcióhoz primerekként pUC19-cel vagy SCCE-szekvenciákkal komplementer specifikus oligonukleotidokat használtunk. A nukleotidszekvencia (1. számú szekvenciavázlat) tartalmazott egy nyílt leolvasási keretet, amely elegendő - a szignálpeptidet és egy előpolipeptidet is beleértve, 253 aminosavat tartalmazó - SCCE prekurzor fehétje hibátlan aminosavszekvenciájának (2. számú szekvenciavázlat) kódolásához.

Egy másik fágnál, a 106.1.2 jelűnél azt találtuk, hogy olyan SCCE-cDNS-szekvenciát tartalmaz, amelyből hiányzik az 5’-nem transziáit szekvencia és az első három kodon. Ezt az inszertet 954 bp EcoRI fragmentumként izoláltuk és EcoRI-gyel linearizált pUC19-be klónoztuk a pS498 plazmidot kapva eredményül. Ezt a plazmidot részlegesen szekvenáltuk.

Egy harmadik fágnál, a 108.1.2 jelűnél azt találtuk, hogy olyan SCCE-cDNS-szekvenciát tartalmaz, amelyből szintén hiányzik az 5’-nem transziáit szekvencia és hét nukleotid a transziáit régióból. Ez a cDNS-inszert a 3’-nem transziáit régiónak hosszabb változatával rendelkezik, 1057 bp-ral downstream ktieqesztve a stopkodont. Ezt az 1884 bp EcoRI fragmentumot izoláltuk és klónoztuk EcoRI-gyel linearizált pUC19-be. Az eredményül kapott plazmidot teljes mértékig szekvenáltuk és pS501-nek jelöltük.

7. példa

SCCE mRNS kimutatása humán epidermiszben Teljes RNS elkészítése humán epidermiszből

Ezt Chomczynski és Sacchi [Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)] szerint végeztük el. Nem beteg humán hasi bőrt szereztünk be plasztikai sebészetről. Az eltávolítás után azonnal lehűtöttük jégen. Kevesebb, mint 15 percen belül szikével történő erőteljes kaparással kinyertük az epidermiszt, D oldatba merítettük [Chomczynski és Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)] és üveghomogenizálóval homogenizáltuk. Ezután Chomczynski és Sacchi előírásait követtük. A pelletált teljes RNS-t -20 °C-on tároltuk 70%os etanolban a további analízisekig.

A messenger RNS elkészítése

500 pg teljes epidermisz-RNS-t kezeltünk a Poly A Tract-Kittel (Promega) az ellátó utasításai szerint. RNS-elektroforézis és biot

Az agarózgéleket (1,4%) 0,66 M formaldehiddel készítettük elő 1 xMOPS puffer és 0,6 g/ml etídium-bromid (Sigma, St. Louis, MO) keverékében. 100 pg teljes RNS-nek megfelelő mRNS-t oldottunk fel RNS mintapufferben (50% formamid, 2,2 M formaldehid, 3% Ficoll, 1 xMOPS) és felhasználás előtt 60 °C-on hőkezeltük 5 percig. Az RNS-markereket (BRL, Gaithersburg, MD) hasonlóan kezeltük. Az elektroforézis után a géleket 5 percig desztillált vízben, azt követően 30 percig 50 mM NaOH-ban és 30 percig 0,1 M Tris-HClben pH 7,5 áztattuk. GeneScreen Plus membránon (NEN DuPont, Wilmington, DE) biot analízist végeztünk 1 órán át lOxSSC-ben Vacu-Gene berendezéssel (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Ezután a membránokat

3xSSC-ben mostuk, egy éjszakán át szárítottuk és 2 órán keresztül 80 °C-on égettük. Az RNS-t a membránokon UV-fénnyel tettük láthatóvá.

cDNS-próbák

A 6. példában leírtak szerint készített pS501 plazmidot HincII és BglII restrikciós enzimekkel emésztettük. Ez a cDNS egy HincII helyet tartalmaz az 1060. bp-nál és egy BG1II helyet az 1715. bp-nál. Az 1070 bp fragmentum (HincII hely a pUC19 többszörös klónozási helyén - endogén HincII hely) tartalmazza az SCCE-t kódolórégiót, kivéve 7 bp-t az 5’-végen és egy olyan nem transziáit régiót - beleértve a poliadenilációs helyet a 944-951. bp között -, amely minden, eddig izolált SCCE-cDNS-ben előfordul. A 655 bp HincII-BglII fragmentum, amely nem tartalmazza a poli A farkat, egyedi a 108.1.2 SCCE-cDNS-re. A fragmentumokat agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk és felhasználtuk ³²P dCTP-vel jelölt próbák elkészítéséhez a Multiprime DNS jelölő kit (Amersham, Buckinghamshire, UK) segítségével.

Hibridizáció

Membránokat forraltunk 30 percig lxTE-ben 1% SDS-ben és előhibridizáltuk 60 °C-on 1% SDS, 1 M NaCl, 10% dextrán-szulfát, 0,1 mg/ml heringsperma DNS keverékében 3 óráig. A hibridizációt ugyanebben az oldatban végeztük 60 °C-on egy éjszakán át. A mosásokat 2x30 percig 60 °C-on 2 x SSC-ben 1% SDS oldattal és 3 órán keresztül 0,1 x SSC-vei szobahőfokon végeztük. A membránokat ezután autoradiográfiának vetettük alá.

Eredmények:

A humán epidermiszben két mRNS fajta, körülbelül 1,2 kb és 2,0 kb méretűek, jelenlétét tudtuk kimutatni (16. ábra). Ez jó egyezést mutat a klónozási kísérleteknél kapott egyértelmű eredményekkel, ahol a cDNSnek két típusát találtuk.

8. példa

Rekombináns SCCE kifejezése E. coliban pGEX-2T/SCCEplazmidok összeállítása

1. Szensz PCR-primerek

l.a. CGT GGA TCC ATC GAA GGT CGT ATT ATT GAT GGC GCC CCA TGT (SYM 3367; 8. számú szekvenciavázlat) az aláhúzott rész az aktív natív SCCE IIDGAPC N-terminális aminosavait kódoló 3’rész, az 5’-rész BamHI hellyel és további, az IEGR Xa faktor helyet kódoló szekvenciával.

l.b. CGT GGA TCC ATC GAA GGT CGT TTGGAA ACT GCA GGA GAA GAA (SYM 3368; 9. számú szekvenciavázlat) az aláhúzott 3’-rész megfelel a 76-96. bázispároknak a LETAGEE aminosavszekvenciát kódoló komplett SCCE-cDNS-szekvenciában, az 5’-rész ugyanaz, mint l.a-ban.

2. Antiszensz PCR-primerek

TGA TCC TCT GAG CTC TCC TG (SYM 3371; megfelel a 285-304. bázispároknak a komplett SCCE-cDNSszekvenciában, 1. számú szekvenciavázlat, a 294. bp-nál a SacI hellyel).

A pS498 szekvenciáját (6. példa) az la/2 és lb/2 primerek felhasználásával PCR-rel megsokszoroztuk. A ka25

HU 220 339 Β pott termékeket fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk, BamHI/ /Sacl-gyel emésztettük és agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk. Ezeket ezután BamHI/EcoRI-gyel emésztett pGEX-2T-be (Pharmacia), TG2 sejtekbe klónoztuk a pS498 plazmidnak Saclgyel és EcoRI-gyel történő emésztésével kapott 106.1.2 SCCE 3’ 673 bázispáijával együtt. Az expressziós vizsgálatokhoz használt bakteriális kiónokból plazmidokat (az Xa faktor helyhez közeli natív N-terminálist kódoló pS510-et és az Xa faktor helyhez közeli tervezett előpeptidet kódoló pS511-et) izoláltunk, és a PCR-termékekből származó inszerteknek megfelelő nukleotidszekvenciákat a didezoxi láncterminációs módszerrel, T7 szekvenáló kit (Pharmacia, Uppsala, Sweden) felhasználásával ellenőriztük.

Expressziós vizsgálatok

TG2 sejteknek 50 pg/ml carbenicillint (Sigma, St. Louis, MO) tartalmazó LB tápoldatban pS510-zel és pS511-gyel szaporított egy éjszakás tenyészetét friss tápoldatban tízszeresére hígítottuk és 3 órán át 37 °C-on szaporítottuk. IPTG-t (Sigma, St. Louis, MO) adtunk hozzá 0,1 mM végső koncentrációban, és a tenyészeteket további 3 órán át 37 °C-on szaporítottuk. A bakteriális pelleteket 1% Triton Χ-100-at (Sigma, St. Louis, MO) tartalmazó PBS-ben szonifikáltuk. 15 percig tartó, 10 000 xg mellett történő centrifugálás után a felülúszót és pelleteket SDS-PAGE-vel és poliklonális SCCE specifikus csirkeantiszérummal végzett immunblottal analizáltuk.

IPTG-vel kiváltható - körülbelül 50 kD (pS510) és 52 kD (pS511) molekulatömegű, SCCE-hez hasonló immunreaktivitással rendelkező - fehéijék nagy mennyiségeit találtuk a PBS-Triton X- 100-ban oldhatatlan pelletekben (lásd a 17. ábrát).

A felülúszók a PBS-Triton X-100-ban történő szonifikálása után ugyanolyan méretű GST/SCCE fúziós fehérjéket tartalmaztak, mint az oldhatatlan pelletek, a mennyiség azonban alacsony volt az oldhatatlan pelletekben talált mennyiségekhez képest.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy SCCE-t ki lehet fejezni fúziós fehérjeként GST-vel, és az elő-előSCCE aminosavszekvenciában a specifikus proteáz hasítási helynek megfelelő szekvenciák lehetővé teszik ennek a kísérletnek a megismétlését rekombináns SCCEnek baktériumokban történő előállítása céljából. Az előállított fehérje oldható karbamidban vagy guanidin-hidrokloridban és azután tisztítható kationos ioncserélő kromatográfiával az SCCE magas izoelektromos pontjának köszönhetően. A tisztított fehéije alacsony koncentrációban denaturálószert tartalmazó pufferekkel szemben végzett dialízissel denaturálható, és utána Xa faktorral hasítható a GST polipeptidnek az SCCE-ről vagy elő-SCCE-ről történő elengedése céljából. A GST/SCCE fúziós fehéije immunogénként is felhasználható SCCE-specifikus antitestek előállítására és immunszorbensként az antitest tisztításában.

9. példa

Rekombináns humán SCCE kifejezése emlőssejtekben

Rekombináns SCCE előállítására szolgáló expressziós vektor létrehozása céljából humán cDNS-szekvenciákat izoláltunk a pS500 plazmidból 897 bp EcoRI/Dral fragmentumként. Ezt a fragmentumot szubklónoztuk EcoRI-gyel és Smal-gyel emésztett pUC19be, pS502 plazmidot eredményezve. A pS502 plazmidot ezután EcoRI-gyel és Sall-gyel emésztettük SCCEcDNS-szekvenciáknak 0,9 kb fragmentumként történő izolálása céljából, amelyet ismét szubklónoztunk HindlII helyet nem tartalmazó pUC19 változatba, pS5O3 plazmidot eredményezve. Ezt a pUC19 változatot a pUC 19-nek HindlII-mal való emésztésével, Klenow-enzim alkalmazásával történő feltöltéssel és religációval hoztuk létre. Expressziós vektorba történő klónozás elősegítésére HindlII helyet vittünk be az SCCEcDNS 5’-végére. Ezt a pS503 plazmidnak EcoRI-gyel történő emésztésével és egy olyan linker inszerciójával oldottuk meg, amely átalakítja a helyet HindlII-má, 5’AAT TGT GGA AGC TTC CAC-3’ (SYM 3603; 10. számú szekvenciavázlat). Az eredményül kapott plazmidot - amely az SCCE cDNS-fehéijét kódoló részét az 5’-végen egy HindlII hellyel és a 3’-végen egy Sáli hellyel rejti magában - pS505-nek jelöltük.

A végső expressziós vektort három különböző DNS-fragmentum ligációjával kaptuk meg.

Először a pS505-öt HindlII-mal és Sall-gyel emésztettük, és egy 0,9 kb fragmentumot izláltunk.

Másodszor, a muréna-metallo-tionin upstream szabályozóeleme távoli részének, a szarvasmarha papillomavírus szekvenciáknak, az mRNS működési szignálokat és a pML2d plazmid szekvenciákat szolgáltató nyúl béta-globin genomiális fragmentumának biztosításához, az E. coliban történő szelekció és replikáció [Waldenström et al., Gene, 120, 175-181 (1992)] lejátszódásához a pS147 vektort SacI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztettük, és egy körülbelül 12 kb fragmentumot izoláltunk.

Harmadszor, a muréna-metallo-tionin promoter közelebbi részének izolálásához a pS42 plazmidot - amelyben a vezérszekvenciában elhelyezkedő natív BglII helyet HindlII hellyé alakítottuk át - Sacl-gyel és HindlIImal emésztettük és egy körülbelül 220 bp fragmentumot izoláltunk.

E három fragmentum ligációja eredményezte a pS507 SCCE expressziós vektort (lásd a 18. ábrát).

A pS507 expressziós vektort egy - a Harvey-szarkómavírus 5’ hosszú terminális ismétlődése által vezetett - neomicinrezisztencia-gént tartalmazó vektorral és SV40 poliadenilációs szignálokkal [Lusky és Botchan, Cell, 36, 391-401 (1984)] együtt vittük be muréna Cl27 sejtekbe (ATCC CRL 1616). A transzfekciós kísérleteket a kalcium-foszfát-kicsapásos módszer [Graham és Van dér Eb, Virology, 52, 456-467 (1973)] szerint végeztük. A sejteket 1.1 arányú Ham’sF12/Dulbecco’s módosított Eagle’s (DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 10% borjúmagzatszérummal (HyClone, Logan, UT) kiegészített tápoldatban tenyésztettük. A neomicinrezisztens sejtklónokat 1,5 mg/ml G418-cal (Gibco-BRL) választottuk ki, és a kiválogatás után 10-15 nappal a rezisztens sejtklónokat azonosítottuk és izoláltuk a mesterlemezekről és átvittük a következő analízishez.

HU 220 339 Β

A rekombináns SCCE-gének kifejeződésének analízise céljából teljes RNS-t készítettünk elő az izolált sejtvonalakból. A teljes RNS-t C127 sejtekből készítettük elő és elválasztottuk 1%-os formaldehid-agarózgélen, nitrocelluláz membránra vittük át és egy ³²P-vel jelölt SCCE-próbával hibridizáltuk. A próba az SCCE-cDNS 1070 bp HincII fragmentuma volt, amelyet a pS500 HincII-vel történő emésztésével és agarózelektroforézissel izoláltunk. A kísérletek kivitelezését Ausubel és munkatársai szerint [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1992)] végeztük el. A Northern biot kísérletek és hibridizáció ³²P-vel jelölt SCCE-cDNS-sel megmutatták, hogy rekombináns SCCE-mRNS kimutatható volt számos, a pS507 SCCE vektort rejtő sejtvonalban. Nem tapasztaltunk hibridizációt az azonos vektort SCCE-cDNS nélkül tartalmazó, Cl27 sejtvonalból származó kontrollmintákban (19. ábra). Az 1,4 kb méret megfelel a várt méretnek.

A kondicionált sejtszaporító tápoldat mintáit kinyertük és immunblottal analizáltuk. SDS-PAGE-t végeztünk Laemmli szerint [Natúré, 227, 680-685 (1970)] és az immunblothoz csirke anti-natív SCCE-t használtunk fel detektáló antitestként. Alkálikus foszfatázzal jelölt anti-csirke-IgG-t (Sigma, St. Louis, MO) használtunk enzimjelölésre. Az eredményeket a 20. ábrán mutatjuk be.

A rekombináns SCCE kifejeződésének analízise céljából teljes RNS-t készítettünk elő a pS507 expressziós vektorral fertőzött C127 sejtekből. Kontrollmintaként mind a nem transzformált Cl27 sejtekből, mind a pS147 expressziós vektorral fertőzött C127 sejtekből készítettünk teljes RNS-t. A pS147 vektor hasonló a pS507-hez azzal az eltéréssel, hogy a humán epesó által stimulált lipázt [Nilsson et al., Eur. J. Biochem., 192, 543-550 (1990)] tartalmazza a humán SCCEcDNS helyett. Az RNS-t Ausubel és munkatársai szerint [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1992)] készítettük elő. A Northern biot kísérletek és hibridizáció ³²P-vel jelölt SCCE-cDNSsel azt mutatták, hogy körülbelül 1,4 kb rekombináns SCCE mRNS volt kimutatható azokban a C127 sejtekben, amelyek a pS507 SCCE vektort rejtették magukban (19. ábra). Nem találtunk hibridizációt a pS147 plazmidot tartalmazó, C127 sejtvonalakból származó kontrollmintákban vagy a nem transzformált Cl27 sejtekben. A rekombináns SCCE mRNS-hossza a vártnak megfelelő.

A kondicionált sejtszaporító tápoldat mintáit kinyertük és SDS-PAGE-sel és immunblottal analizáltuk. A blotot Blake és munkatársai leírása [Anal. Biochem., 136, 175-179 (1984)] alapján fejlesztettük ki. A kapott eredmények (lásd a 20. ábrát) azt mutatják, hogy a pS507 plazmidot rejtő Cl27 sejtek három olyan fehéijét termelnek, amelyek ugyanúgy reakciót mutatnak minden hozzáférhető poliklonális nyúl és csirke SCCE antitesttel, mint az 5. példában leírtak szerint előállított, anti-SCCE monoklonális antitesttel. A rekombináns SCCE reaktív fehéijék a tisztított natív humán SCCEnél körülbelül 1 kD-nal nagyobb látszólagos molekulatömeget mutatnak. A rekombináns fehéije nem mutat proteolitikus aktivitást. A levezetett SCCE aminosavszekvenciát összehasonlítva a natív humán SCCE kísérletileg meghatározott NH2-terminálisával és más kimotripszinhez hasonló proteázok szekvenciáival, azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a C127 sejtekben termelt rekombináns SCCE, annak előenzim formájában van. A szekvenciaadatok azt jelzik, hogy ez az előenzim aktiválható a szekvenciában levő lizin C-terminálisának proteolitikus hasításával...AQGDKJIDGAP..., az aláhúzott szekvencia az aktív natív humán SCCE NH₂-szekvenciája (2. számú szekvenciavázlat, 5-6. aminosavak).

10. példa

A rekombináns SCCE tisztítása és jellemzése Tisztítás

A natív SCCE ellen irányuló TE4b monoklonális antitest 1,3 mg-ját kapcsoltuk 1,5 ml CNBr-dal aktivált Sepharose-hoz (Pharmacia-LKB Biotech., Uppsala, Sweden) az előállító által leírt módszer szerint. SCCE-t tartalmazó tápoldat 40 ml-ét 0,45 pm-es szűrőn szűrtük át és utána felvittük az oszlopra. Az oszlopot néhányszor mostuk 10 mM nátrium-foszfáttal, 150 mM NaCldal pH 7,2, és utána 0,1 M glicin-HCl-dal pH 2,5 eluáltuk. Az eluált fehéijét azonnal semlegesítettük 0,1 térfogat 1 M Tris-HCl-val, pH 8.

Aktiválás

A monoklonális antitesttel kapcsolt gél (lásd fent) felhasználásával tisztított rekombináns SCCE-t (4,6 pg 200 pl-ben) 4,6 pl 0,1 mg/ml tripszinnel (tömegarány 10:1) emésztettük 37 °C-on. Mintákat (50 pl) vettünk vissza 20 percnél, 1 óránál, 3 óránál és 20 óránál, és 5 pl 10 pM 4-amidino-fenil-metán-szulfonilt (APMSF; Boehringer Mannheim, Germany) adtunk hozzá a reakció megállítására. A hasított SCCE-aktivitását kazeingélen végzett nem redukáló SDS-PAGE segítségével határoztuk meg, ahogyan azt a 2.2. példában leírtuk. Az SCCE így nyert hasított formájának azonosítását redukáló SDS-PAGE-t követő immunblottal határoztuk meg, amelyben csirke anti-natív SCCE felhasználását alkalikus foszfatázzal jelölt anti-csirke-IgG és nitrokék tetrazólium és 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát követte az alkalikus foszfatáz szubsztrátjaként. N-terminális szekvenálás

Affinitás alapján tisztított (ahogyan azt fent leírtuk) SCCE-vel, körülbelül 35 pg-mal slot-blot-ot végeztünk Bio-Dot SF egység (Bio-Rad, Richmond, CA) alkalmazásával Immobilon membránon (Millipore, Bedford, MA). A membránt ezután néhányszor mostuk desztillált vízzel az összes Tris és glicin eltávolítása céljából. A membránnak azt a részét, amelyen a fehérje megkötődött, kivágtuk és megszekvenáltuk az Applied Biosystems (Foster City, CA) 477A pulzáló folyadékfázisú szekvenálónak on-line PTH 120A analizátorral történő alkalmazásával. A szekvenálást szabályos ciklusprogramokkal és az előállító vegyszereivel végeztük. Az első hat helyzetben kapott szekvencia Glu-Glu-AlaGln-Gly-Asp megfelel a 2. számú szekvenciavázlat (-7)-(-2). aminosavainak. Ebből az eredményből azt vonhatjuk le, hogy a szignálpeptid 22 aminosavból áll, és a natív aktív SCCE N-terminális aminosavszekvenciájára alapozta az előpeptid 7 aminosavból áll.

HU 220 339 Β

Deglikozílálás

Tisztított rekombináns SCCE-t (5 pg-ot) és natív SCCE-t (20 pg-ot) forraltunk 3 percig 0,5% SDS és 0,1 M β-merkapto-etanol 20 μΐ-ében. A mintákat nátrium-foszfát-pufferrel pH 8,6 és Nonidet Ρ-40-nel hígítottuk 0,2 M és 1,25% végső koncentrációkra különkülön. N-Glycosidase F®-et (Boehringer Mannheim) adtunk hozzá (a rekombináns fehérjéhez 0,6 egység és a natív fehérjéhez 1,2 egység enzimet), és a reakciókeveréket egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C-on. Az SDS végső koncentrációja a mintameghatározásnál 0,17% volt. Az N-Glycosidase F®-fel kezelt SCCE-t 8-18%-os SDS-PAGE-sel analizáltuk, amelyet immunbiot követett, ahogyan azt fent leírtuk. A kapott eredmények csökkenést mutattak a két felső sáv látszólagos molekulatömegében, míg a legalsó sáv látszólagos molekulatömege változatlan maradt (23. ábra). Ez azt mutatja, hogy a C127 sejtekben termelt rekombináns SCCE két N-glikozilált formában és egy nem glikozilált formában létezik. Ez az eredmény hasonló ahhoz, amelyet az aktív natív SCCE esetében láthatunk (23. ábra).

11. példa

SCCE-t tartalmazó készítmények

A készítményeket elkészíthetjük a hagyományos gyógyszerészeti technikák szerint, beleértve az aktív komponensnek a többi összetevővel való alapos összekeverését. Minden százalék tömegszázalékot jelent.

Azok a komponensek, amelyek több mint egy aktív komponenst tartalmaznak, szintén a találmány hatókörébe tartoznak. A következő példák ezért úgy is összeállíthatók, hogy egynél több aktív vegyületet tartalmazzanak. Hasonló módon az „SCCE” kifejezés helyettesíthető az „elő-SCCE”-vel. Tehát az olyan készítmények, amelyek SCCE-t tartalmaznak ugyanúgy, mint az elő-SCCE-t tartalmazók a találmány hatókörébe tartoznak.

SCCE=natív vagy rekombináns bőrszaruréteg kimotriptikus enzim, szabadon választható kombinációban más aktív vegyületekkel q.s.=quantum satis (bőven, amenynyi csak kell)

Krém olaj/viz %

SCCE 0,01-20 poliszorbát 80 0,5 emulgeáló gyanta 5 ásványolaj 4

Dimethicone 1 gliceril-sztearát 6 antioxidáns q.s.

EDTA 0,1 tartósítószer q.s.

85%-os glicerin 4 propilénglikol 7 pH-szabályozó szer 0,01-10 víz 65-76

Példák a változtatható faktorokra: antioxidánsok, kelátképző szerek, tartósítószerek, emulgeáló rendszerek (az olajos és a vizes fázis aránya és az emulgeálószer és más fontos kötőanyag-tartalom).

Krém viz/olaj %

SCCE 0,01-20 cetil-alkohol 0,5 lanolin 5 fehér vazelin 10 ásványolaj 45 antioxidáns q.s.

EDTA 1 pH-szabályozó szer 0,01-10 tartósítószer q.s.

víz 15-25

Példák a változtatható faktorokra: antioxidánsok, kelátképző szerek, tartósítószerek, emulgeáló rendszerek (az olajos és a vizes fázis aránya és az emulgeálószer és más fontos kötőanyag-tartalom).

Kenőcs %

SCCE 0,01-20 lanolin 15 vazelin 58-68 ásványolaj 15

Dimethicone 2 antioxidáns q.s.

Példák a változtatható faktorokra: antioxidánsok. Híg kenőcs %

SCCE 0,01-20 emulgeáló gyanta 4 gliceril-sztearát 3 ásványolaj 15 poliszorbát 80 0,6

85%-os glicerin 3 propilénglikol 5 antioxidáns q.s.

EDTA 0,1 tartósítószer q.s.

víz 59-69

Példák a változtatható faktorokra: antioxidánsok, kelátképző szerek, tartósítószerek, emulgeáló rendszerek (az olajos és a vizes fázis aránya és az emulgeálószer és más fontos kötőanyag-tartalom).

Gél %

SCCE 0,01-20 trietanol-amin 1-5 etil-alkohol 10 cetil-alkohol 10 cellulóz gumi 5

EDTA 0,1 tartósítószer q.s.

víz 59-74

Példák a változtatható faktorokra: gélképző szerek, antioxidánsok, kelátképző szerek, tartósítószerek.

Vizes oldat %

SCCE 0,01-20 pH-szabályozó szer 0,01 -10 cetil-alkohol 4 propilénglikol 5 tartósítószer q.s.

antioxidáns q.s.

EDTA 0,1 víz 37-89

HU 220 339 Β

Példák a változtatható faktorokra:	antioxidánsok, kelát-		Spray - aeroszolos oldat	%
képző szerek, tartósítószerek, újrazsírozó szerek, hí-		SCCE	0,01-20
gítók.			pH-szabályozó szer	0,01-10
Etanolos oldat	%		izopropil-mirisztát	3
SCCE	0,01-20	5	propilénglikol	5
pH-szabályozó szer	0,01-10		etil-alkohol	48-92
propilénglikol	5		hajtóanyag	q.s.
cetil-alkohol	3		Példák a változtatható faktorokra	: újrazsírozó szerek,
antioxidáns	q.s.		hígítók.
EDTA	0,1	10	Spray - aeroszolos hab	%
etanol	50-95		SCCE	0,01-20
Példák a változtatható faktorokra:	antioxidánsok, kelát-		viasz	3
képző szerek, hígítók.			etil-alkohol	50-55
Szuszpenzió	%		antioxidáns	q.s.
SCCE	0,01-20	15	EDTA	0,1
karbomer	0,5		víz	20-35
cellulóz gumi	0,5		hajtóanyag	q.s.
poliszorbát 80	0,1		Példák a változtatható faktorokra	: hajtóanyagok, anti-
propilénglikol	5		oxidánsok, kelátképző szerek.
aszkorbinsav	0,05	20	Spray - aeroszolos emulzió	%
cetil-alkohol	4		SCCE	0,01-20
poliszorbát	q.s.		cellulózszármazékok	1-3
EDTA	0,1		Tween® 60	1,0
pH-szabályozó szer	0,01-10		gliceril-sztearát	2,5
víz	72-80	25	kálium-szorbát	0,2
Példák a változtatható faktorokra:	antioxidánsok, kelát-		antioxidáns	q.s.
képző szerek, tartósítószerek, szuszpendálószerek.		EDTA	0,1
Paszta	%		tartósítószer	q.s.
SCCE	0,01-20		pH-szabályozó szer	0,01-10
vazelin	45-55	30	víz	50-95
cink-oxid	40		hajtóanyag	q.s.
ásványolaj	5		Példák a változtatható faktorokra:	antioxidánsok, kelát-
antioxidáns	q.s.		képző szerek, tartósítószerek, emulgeáló rendszerek (az
Példák a változtatható faktorokra:	antioxidánsok, pasz-		olajos és a vizes fázis aránya és	az emulgeálószer és
taalapok.		35	más fontos kötőanyag-tartalom).
Rúd	%		Sampon	%
SCCE	0,01-20		SCCE	0,01-20
Cutina LM	70-80		nátrium-lauril-szulfát	40
mirisztil-alkohol	5		cetil-alkohol	3
ricinusolaj	2	40	habosítószer vagy kondicionáló	3
fehér méhviasz	10		nátrium-klorid	2
fehér vazelin	3		antioxidáns	q.s.
antioxidáns	q.s.		EDTA	0,1
Példák a változtatható faktorokra	: antioxidánsok, rúd-		tartósítószer	q.s.
alapok.		45	víz	43-53
Kézi spray	%		Példák a változtatható faktorokra:	samponalapok, anti-
SCCE	0,01-20		oxidánsok, kelátképző szerek, tartósítószerek, hígítók,
pH-szabályozó szer	0,01-10		kondicionálók.
etil-alkohol	30		Tusfürdő	%
85%-os glicerin	5	50	SCCE	0,01-20
propilénglikol	5		nátrium-lauril-szulfát	40
cetil-alkohol	3		cetil-alkohol	4
antioxidáns	q.s.		habosítószer vagy kondicionáló	3
EDTA	0,1		gyöngyözőszer	10
tartósítószer	q.s.	55	tartósítószer	q.s.
víz	22-57		antioxidáns	q.s.
Példák a változtatható faktorokra:	antioxidánsok, kelát-		EDTA	0,1
képző szerek, tartósítószerek, újrazsírozó szerek, hí-		víz	40-50
gítók.

HU 220 339 Β

Példák a változtatható faktorokra: samponalapok, antioxidánsok, kelátképző szerek, tartósítószerek, adalékok, kondicionálók.

Gyógyszappan %

SCCE 0,01-20 l-hidroxi-etán-1,1 ’-difoszforsav 0,2 glicerin 0,8 kókuszdióolaj és faggyú

Na-szappanja 88-98 adalékok 0,7

Példák a változtatható faktorokra: hígítók, szappanalapok.

Por %

SCCE 0,01-20 talkum 65-70 kaolin 6 titán-dioxid 2 kalcium-karbonát 8 magnézium-sztearát 3 kukorica- vagy zabkeményítő 5-10

Példák a változtatható faktorokra: poralapok, tartósítószerek, tömegarányok.

Hajkondicionáló %

SCCE 0,01-20 cetil-alkohol 2,2 (alkil-trimetil-ammónium)-klorid 1,25 oktil-dodekán 1 citromsav 1

EDTA 0,1 tartósítószer q.s.

antioxidáns q.s.

víz ad 100

Példák a változtatható faktorokra: kondicionálók, tartósítószerek, kelátképző szerek, antioxidánsok.

Hasonló módon állíthatók elő olyan helyileg alkalmazható készítmények, amelyek az SCCE-aktivitását gátolni vagy fokozni képes vegyületet tartalmaznak.

12. példa

A rekombináns SCCE dezmoszóma emésztő aktivitása

Érintetlen dezmoszómákat tartalmazó komeocitákat távolítottunk el a bőrből a bőr szarurétege mélyebb rétegeinek felszakításával, a pikkelyeket elkülönítettük hexánnal és kis részletekben megszárítottuk. Komeociták kis részleteit (3 mg-ot) extraháltuk 1 M nátriumkloriddal 4 °C-on a belső proteázok oldhatóvá tételére, és utána alaposan mostuk inkubációs pufferrel (0,1 M Tris-HCl pH 8,0) a készítmények endogén proteolitikus aktivitásának eltüntetésére. Az inkubációkat 0,1 M Tris pH 8,0 pufferben végeztük 10 pg rekombináns SCCE jelenlétében vagy anélkül 24 óráig 37 °C-on. Nyilvánvaló dezmoszómális emésztést mutattunk ki az enzimmel a dezmoszómamarker-fehétje, a dezmoglein

SZEKVENCIAVÁZLATOK

1. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 986 bázispár

A szekvencia típusa: nukleinsav

Száltípusa: egyszálú

Topológia: lineáris

I (DG I) szintjének mérésével. Ezt a pikkelyekből 8 M karbamid/2% SDS/p-merkapto-etanol pufferrel történő extrakcióval és a DG I glikoproteinnek ezt követő, concanavalin A affinitáskromatográfia felhasználásával történő tisztításával izoláltuk. A concanavalin A eluátumot SDS-PAGE-sel frakcionáltuk és elektroforetikusan PDVF membránra vittük át immunblothoz. A DG I-et specifikus antiszérum felhasználásával azonosítottuk és felerősített kemilumineszcencia alkalmazásával mutattuk ki. Az eredményeket a 4. táblázatban mutatjuk be.

4. táblázat

	Kontroll	+ rSCCE, 10 gg
DG I (önkényesen választott egység/mg pikkely)	7950 ±4992	4059±2360

A 4. táblázatban bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a rekombináns SCCE képes lebontani az intracelluláris összetartó szerkezeteket a bőr szarurétegében in vitro meghatározásnál.

13. példa

Inhibitorok hatása a rekombináns SCCE-aktivitására

Az aprotinin-, kimosztatin- és cink-szulfát-inhibitorok hatását vizsgáltuk az rSCCE S-2586 hidrolizáló aktivitására. A kísérlet kivitelezését a 3.2. példában adtuk közre. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be.

5. táblázat

Inhibitor	Koncentráció (μΜ)	Aktivitás (%)
Aprotinin	0 0,35 1,4 5,7	100 51,6 21,2 7,4
Kimosztatin	0 0,64 2,56 41	100 74,9 33 1,9
ZnSO4	0 15,6 62,5 250	100 50,7 19,4 5,1

Ahogyan azt fent az 5. táblázatban mutatjuk, az aprotinin, kimosztatin és cink-szulfát gátolta a rekombináns SCCE S-2586 hidrolizáló aktivitását, hasonló módon, mint a natív enzimét.

HU 220 339 Β

A molekula típusa: cDNS Hipotetikus: nem Antiszenz: nem Eredete: Homo sapiens Jellemzők:

Név/kulcs: CDS Elhelyezkedés: 25..786 Név/kulcs: szignálpeptid Elhelyezkedés: 25..90 Név/kulcs: mát peptid Elhelyezkedés: 112..783

1. számú szekvencia leírása:

GAATTCCGCG GATTTCCGGG CTCC ATG GCA AGA TCC CTT CTC CTG CCC CTG 51

Met Alá Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu -29 -25

CAG Gin -20

ATC 11 e

CTA Leu

CTG Leu

CTA TCC TTA

GCC TTG GAA

ACT GCA GGA GAA

GAA Glu

GCC Al a -5

99

Le u

Ser -15

Leu

Al a

Leu

Glu

Thr -10

Al a

Gly

Glu

CAG

GGT

GAC

AAG

ATT

ATT

GAT

GGC

GCC

CCA

TGT

GCA

AGA

GGC

TCC

CAC

147

Gin

Gly

Asp

Lys

I le 1

I le

Asp

Gly

Al a 5

Pro

Cys

Al a

Arg

Gly 10

Ser

Hi s

CCA

TGG

CAG

GTG

GCC

CTG

CTC

AGT

GGC

AAT

CAG

CTC

CAC

TGC

GGA

GGC

195

Pro

Trp

Gin 15

Val

Al a

Leu

Leu

Ser 20

Gly

Asn

Gin

Leu

Hi s 25

Cy s

Gly

Gly

GTC

CTG

GTC

AAT

GAG

CGC

TGG

GTG

CTC

ACT

GCC

GCC

CAC

TGC

AAG

ATG

243

Val

Leu 30

Val

Asn

Glu

Arg

Trp 35

Val

Leu

Thr

Al a

Al a 40

Hi s

Cy s

Ly s

Me t

AAT

GAG

TAC

ACC

GTG

CAC

CTG

GGC

AGT

GAT

ACG

CTG

GGC

GAC

AGG

AGA

291

Asn 45

Glu

Tyr

Thr

Val

Hi s 50

Leu

Gly

Ser

Asp

Thr 55

Leu

Gly

Asp

Arg

Arg 60

GCT

CAG

AGG

ATC

AAG

GCC

TCG

AAG

TCA

TTC

CGC

CAC

CCC

GGC

TAC

TCC

339

Al a

Gin

Arg

11 e

Lys 65

Al a

Ser

Ly s

Ser

Phe 70

Arg

Hi s

Pro

Gly

Tyr 75

Ser

ACA

CAG

ACC

CAT

GTT

AAT

GAC

CTC

ATG

CTC

GTG

AAG

CTC

AAT

AGC

CAG

387

Thr

Gin

Thr

Hi s 80

Val

Asn

As p

Leu

Me t 85

Leu

Va 1

Lys

Leu

Asn 90

Ser

Gin

GCC

AGG

CTG

TCA

TCC

ATG

GTG

AAG

AAA

GTC

AGG

CTG

CCC

TCC

CGC

TGC

435

Al a

Arg

Leu 95

Ser

Ser

Me t

Val

Ly s 100

Ly s

Val

Arg

Leu

Pro 105

Ser

Arg

Cys

GAA

CCC

CCT

GGA

ACC

ACC

TGT

ACT

GTC

TCC

GGC

TGG

GGC

ACT

ACC

ACG

483

Glu

Pro 110

Pro

Gly

Thr

Thr

Cys 115

Thr

Val

Ser

Gly

Trp 120

Gly

Thr

Thr

Thr

AGC

CCA

GAT

GTG

ACC

TTT

CCC

TCT

GAC

CTC

ATG

TGC

GTG

GAT

GTC

AAG

531

Ser 125

Pro

Asp

Val

Thr

Phe 130

Pro

Ser

Asp

Leu

Me t 135

Cys

Val

Asp

Val

Ly s 140

CTC

ATC

TCC

CCC

CAG

GAC

TGC

ACG

AAG

GTT

TAC

AAG

GAC

TTA

CTG

GAA

579

Leu

I le

Ser

Pro

Gin

Asp

Cy s

Thr

Lys

Val

Tyr

Lys

Asp

Leu

Leu

Glu

145 150 155

HU 220 339 Β

AAT TCC ATG CTG

TGC GCT Cys Alá

GGC ATC CCC GAC

TCC Ser

AAG Ly s

AAA Ly s

AAC GCC

TGC Cys

627

Asn

Ser

Me t

Leu 160

Gly

I le

Pro 165

Asp

Asn 170

Al a

AAT

GGT

GAC

TCA

GGG GGA

CCG

TTG

GTG

TGC

AGA

GGT

ACC

CTG

CAA

GGT

675

Asn

Gly

Asp

Ser

Gly Gly

Pr o

Leu

Val

Cys

Arg

Gly

Thr

Leu

Gin

Gly

175

180

185

CTG

GTG

TCC

TGG

GGA ACT

TTC

CCT

TGC

GGC

CAA

CCC

AAT

GAC

CCA

GGA

723

Leu

Val

Ser

Trp

Gly Thr

Phe

Pro

Cys

Gly

Gin

Pro

Asn

Asp

Pro

Gly

190

195

200

GTC

TAC

ACT

CAA

GTG TGC

AAG

TTC

ACC

AAG

TGG

ATA

AAT

GAC

ACC

ATG

771

Val

Tyr

Thr

Gin

Val Cys

Ly s

Phe

Thr

Ly s

Trp

I le

Asn

As p

Thr

Me t

205

210

215

220

AAA

AAG

CAT

CGC

TAACGCCAC CTGAGTTAAT TAACTGTGTG

CTTCCAACAG

823

Lys Lys His Arg

225

AAAATGCACA	GGAGTGAGGA	CGCCGATGAC	CTATGAAGTC	AAATTTGACT	TTACCTTTCC	883
TCAAAGATAT	ATTTAAACCT	CATGCCCTGT	TGATAAACCA	ATCAAATTGG	TAAAGACCTA	943
AAACCAAAAC	AAATAAAGAA	ACACAAAACC	CTCAACGGAA	TTC		986

2. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 253 aminosav A szekvencia típusa: aminosav Topológia: lineáris

A molekula típusa: fehérje

2. számú szekvencia leírása:

Me t -29

Al a

Arg

Ser

Leu -25

Leu

Leu

Pro

Leu

Gin -20

I le

Leu

Leu

Leu

Ser -15

Leu

Al a

Leu

Glu

Thr -10

Al a

Gly

Glu

Glu

Al a -5

Gin

Gly

Asp

Ly s

I le 1

I le

As p

Gly

Al a 5

Pro

Cys

Al a

Arg

Gly 10

Ser

Hi s

Pro

Trp

Gin 15

Val

Al a

Leu

Leu

Ser 20

Gly

Asn

Gin

Leu

Hi s 25

Cys

Gly

Gly

Val

Leu 30

Va 1

Asn

Glu

Arg

Trp 35

Val

Leu

Thr

Al a

Al a 40

Hi s

Cy s

Ly s

Me t

Asn 45

Glu

Tyr

Thr

Val

Hi s 50

Leu

Gly

Ser

As p

Thr 55

Leu

Gly

Asp

Arg

Arg 60

Al a

Gin

Arg

11 e

Ly s 65

Al a

Ser

Ly s

Ser

Phe 70

Arg

Hi s

Pro

Gly

Tyr 75

Ser

Thr

Gin

Thr

Hi s 80

Val

Asn

Asp

Leu

Me t 85

Leu

Val

Ly s

Leu

Asn 90

Ser

Gin

Al a

Arg

Leu 95

Ser

Ser

Me t

Val

Ly s 100

Ly s

Val

Arg

Leu

Pro 105

Ser

Arg

Cys

Glu

Pro 110

Pro

G1 y

Thr

Thr

Cy s 115

HU 220 339 B

Thr

Va 1

Ser

Gly

Trp 120

Gly

Thr

Thr

Thr

Ser 125

Pro

Asp

Val

Thr

Phe 130

Pro

Ser

Asp

Leu

Me t 135

Cy s

Val

Asp

Val

Ly s 140

Leu

I le

Ser

Pro

Gin 145

Asp

Cy s

Thr

Ly s

Val 150

Tyr

Ly s

Asp

Leu

Leu 155

Glu

Asn

Ser

Me t

Leu 160

Cy s

Al a

Gly

I le

Pro 165

Asp

Ser

Ly s

Ly s

Asn 170

Al a

Cy s

Asn

Gly

Asp 175

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu 180

Val

Cy s

Arg

Gly

Thr 185

Leu

Gin

Gly

Leu

Val 190

Ser

Trp

Gly

Thr

Phe 195

Pro

Cy s

Gly

Gin

Pro 200

Asn

Asp

Pro

Gly

Val 205

Tyr

Thr

Gin

Val

Cy s 210

Ly s

Phe

Thr

Ly s

Trp

I le

Asn

Asp

Thr

Me t

Ly s

Ly s

Hi s

Arg

215 220

3. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 24 aminosav A szekvencia típusa: aminosav Topológia: lineáris

A molekula típusa: peptid Hipotetikus: nem Fragmentum típusa: N-terminális Eredete: Homo sapiens A 3. számú szekvencia leírása:

1 le 1	I le	As p	Gly	Al a 5	Pro	Cy s	Alá Cys	Gly Ser Xaa 10	Pro Xaa Gin Val 15
Al a	Leu	Leu	Ser	Gly	Asn	Gin	Leu

4. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 17 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav Száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris A molekula típusa: DNS

4. számú szekvencia leírása:

ATHATHGAYG GNGCNCC 17

5. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 21 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav Száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris A molekula típusa: DNS

5. számú szekvencia leírása:

GTGGCGACGA CTCCTGGAGC C 21

6. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 21 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav Száltípusa: egyszálú

HU 220 339 B

Topológia: lineáris A molekula típusa: DNS

6. számú szekvencia leírása:

ACACCAGACC AACTGGTAAT G 21

7. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 21 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav Száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris A molekula típusa: DNS

7. számú szekvencia leírása:

TGGGTGGGAG CCTCTTGCAC A 21

8. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 42 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav Száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris A molekula típusa: DNS

8. számú szekvencia leírása:

CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TATTATTGAT GGCGCCCCAT GT 42

9. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 42 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav Száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris A molekula típusa: DNS

9. számú szekvencia leírása:

CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TTTGGAAACT GCAGGAGAAG AA 42

10. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 18 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav Száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris A molekula típusa: DNS

10. számú szekvencia leírása:

AATTGTGGAA GCTTCCAC 18

Claims (28)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciájú, stratum comeum kimotriptikus enzim (SCCE) aktivitással rendelkező polipeptidet vagy annak analógját vagy változatát kódolja.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti izolált nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvenciából áll.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti izolált nukleo tidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a 2. számú ami nosavszekvenciával ábrázolt alszekvenciával rendelke ző polipeptidet kódolja.
4. 4. A 3. igénypont szerinti izolált nukleotidszekven cia, azzal jellemezve, hogy a 2. számú aminosavszek vencia -7-224. vagy 1-224. aminosavmaradékait tar talmazó polipeptidet kódol.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti izolált nukleotidszekven cia, azzal jellemezve, hogy az 1. számú nukleotidszek

   HU 220 339 Β venciával vagy annak egy részével szigorú hibridizációs körülmények között hibridizál.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti izolált nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvenciával legalább 95%ban homológ.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti izolált nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódol, amelynek aminosavszekvenciája legalább 95%ban homológ a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciával.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti izolált nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódol, amely a - Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően, 1993. június 18-án az ECACC-nél letétbe helyezett ECACC 93061817 letéti számú - TE4b hibridomasejtvonal vagy - az 1993. június 18-án az ECACC-nél letétbe helyezett ECACC 93061816 letéti számú TE9b hibridoma-sejtvonal által termelt monoklonális antitesthez kötődik.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti izolált nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódol, amely az elkülönített talpbőrszaruréteg sejtjeinek kivonatából tisztított natív SCCE ellen termelődött poliklonális antiszérumhoz kötődik.
10. 10. Expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy egy 1-9. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz olyan replikációra képes expreszsziós vektorként, amely egy 1 -9. igénypontok bármelyikében definiált nukleotidszekvenciát hordoz, és képes közvetíteni annak kifejeződését.
11. 11. Replikációra képes pS507 jelű expressziós vektor, amelyet 1993. május 11-én helyeztünk letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) gyűjteményben DSM 8282 letéti szám alatt a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően, valamint olyan expressziós vektorok, amelyek az említett, letétbe helyezett vektor nukleotidszekvenciájától eltérő, de ugyanazt a polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciákat fejeznek ki.
12. 12. A pS500 jelű plazmid, amelyet 1993. május 11én helyeztünk letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) gyűjteményben DSM 8281 letéti szám alatt a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően, valamint olyan plazmidok, amelyek az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvenciától eltérő, de a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott olyan polipeptidet vagy annak analógját vagy változatát, amely SCCE-aktivitással rendelkezik, kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaznak, vagy olyan nukleotidszekvenciát, amely az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvenciával vagy annak egy részével szigorú hibridizációs körülmények között hibridizál.
13. 13. Nem humán szervezet, például mikroorganizmus, így baktérium, például Escherichia coli, élesztő, protozoa vagy többsejtű szervezetből, például gombából származó sejt, rovarsejt, növényi sejt, emlőssejt vagy -sejtvonal, azzal jellemezve, hogy egy 10. igénypont szerinti expressziós rendszert hordoz.
14. 14. Lényegében tiszta polipeptid, azzal jellemezve, hogy a 2. számú szekvenciavázlattal megadott aminosavszekvenciával vagy annak analógjával vagy változatával rendelkezik és SCCE-aktivitása van, például a 2. számú aminosavszekvenciával megadott alszekvenciával rendelkező rekombináns polipeptid.
15. 15. Lényegében tiszta polipeptid, azzal jellemezve, hogy a 2. számú szekvenciavázlatban megadott aminosavszekvencia -7-224. vagy 1-224. aminosavmaradékainak megfelelő szekvenciával rendelkezik.
16. 16. Lényegében tiszta polipeptid, amelynek SCCEaktivitása van, azzal jellemezve, hogy olyan aminosavszekvenciával rendelkezik, amelyből egy 20 egymást követő aminosavat taratlmazó szakasz legalább 95%ban homológ a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciából választott ugyanolyan hoszszúságú szakasszal.
17. 17. Eljárás a 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) egy 1 -9. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciát inszertálunk egy expressziós vektorba;

    ii) egy alkalmas gazdaszervezetet transzformálunk az i) lépésben előállított vektorral;

    iii) az ii) lépésben előállított gazdaszervezetet a polipeptid kifejeződéséhez megfelelő körülmények között tenyésztjük;

    iv) a polipeptidet kinyerjük; és

    v) adott esetben a polipeptidet poszttranszlációs módosításnak vetjük alá.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termelt polipeptidet immobilizált natív vagy rekombináns SCCE-polipeptidet vagy az említett polipeptiddel reaktív antitest alkalmazó affinitáskromatográftaszerű műveletet és/vagy más kromatográfiás és elektroforézises műveletet tartalmazó módszerrel tisztítjuk.
19. 19. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmaz.
20. 20. Kozmetikai vagy bőrápoló készítmény, azzal jellemezve, hogy egy 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmaz.
21. 21. A 19. vagy 20. igénypontok szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy helyileg történő beadásra alkalmas, például krém, kenőcs, lemosó, híg kenőcs, gél, oldat, szuszpenzió, paszta, rúd, spray, sampon, szappan, hajkondicionáló vagy por formában van.
22. 22. A 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid alkalmazása akne, xeroderma (bőrszárazság) vagy más hiperkeratotikus állapotok, például callositas (bőrkérgesedés) és keratosis pilaris (szőrtüszők körül kifejlődő, szarucsapokkal járó bőrelváltozás) kezelésére vagy megelőzésére.
23. 23. A 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid alkalmazása különböző ichthyosisok, akne, pszoriázis vagy más gyulladásos bőrbetegségek, például ekcémák kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.
24. 24. A 14. igénypont szerinti polipeptid enzimaktivitására gátló hatással rendelkező vegyület alkalmazása autoimmun pemphigus betegségek vagy acantholyticus

    HU 220 339 B betegségek, például familiáris pemphigus és Darier-betegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
25. 25. Eljárás a natív SCCE-enzimaktivitására hatást gyakorló vegyület azonosítására, azzal jellemezve, hogy 5 az eljárásban egy 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet alkalmazunk.
26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a natív SCCE-enzimaktivitására gátló hatással rendelkező vegyületet azonosítunk. 10
27. 27. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a natív vagy rekombináns SCCE-enzim aktivitásának fokozására képes vegyületet azonosítunk.
28. 28. Eljárás az SCCE előenzimformájának aktív SCCE-vé való átalakítására képes vegyület azonosítására, azzal jellemezve, hogy az eljárásban egy 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet alkalmazunk.