CN100457908C - 重组角质层胰凝乳蛋白酶(scce) - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：2或者具有如本申请所定义之SCCE活性的其类似物或变异体的多肽，例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：2之亚序列的多肽。此外，本发明涉及编码具有SCCE活性之多肽的核苷酸序列以及含有所述核苷酸序列的表达系统，表达载体，质粒和非人生物体。本发明的重要方面涉及含有其SCCE活性之多肽的药物、化妆品和皮肤护理成分，以及该多肽的用途，所述多肽用于治疗或预防各种疾病如痤疮、干皮病或其它角化过度性疾病，如胼胝和毛发角化病以及各种鳞癣、牛皮癣、和其他炎性皮肤病如湿疹。此外，本发明涉及对天然SCCE之酶活性有抑制作用的化合物的用途，该化合物用于制备治疗或预防自身免疫性天疱疮疾病或皮肤棘层松解性疾病如家族性天疱疮和毛囊角化病的药物成分。

Description

重组角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)

本发明涉及重组多肽和编码所述多肽的核苷酸序列，能够表达所述多肽的表达系统以及含有所述多肽的药物和化妆品组合物和所述多肽用于各种化妆品或治疗目的的用途。

本发明简述

皮肤作为一种器官从生物学、医学和美容学的角度来说，均是令人感兴趣的。目前存在大量器官特异性(如牛皮癣和湿疹)或者全身性疾病表现(如一般的过敏反应)的皮肤病。可以认为存在皮肤特异性疾病的事实是存在皮肤所特有的分子机制的证据。类似地，对于皮肤特异性分子过程的研究对于理解和治疗皮肤病是非常重要的。似乎可以合理地推测：几种这类过程以这样或那样的方式与皮肤最特殊化的功能相关，这种功能即在人体外部和内部之间形成物理—化学屏障。该物理—化学皮肤屏障位于皮肤的最外层，即角质层。

角质层是皮肤最特殊化的结构。它是表皮分化过程的最终产物，即为构成皮肤最外层部分的复层扁平上皮。大部分表皮细胞由处于各种分化状态的角化细胞组成。最下层的角化细胞即基底细胞位于与真皮接触的基底膜(即皮肤的结缔组织)上，而且它是唯一有分化能力的角化细胞。不断有部分基底细胞离开基底膜，进行最终使细胞变成组成角质层构成单元的分化过程。在该过程中，角化细胞要经过大量的适应性改变。其中之一是增加由表皮特异性细胞角蛋白组成的细胞骨架的含量。通过增加桥粒的数目而使邻接细胞的中间丝与功能单位相连。最显著的变化发生于从最上面的活细胞层，即颗粒层到死亡的角质层的转变期间(该过程通常称为角质化)。在靠近质膜内面，沉淀有共价交联的蛋白质，形成了很坚固的细胞被膜。此外，在角化细胞特异性细胞器中产生的富脂物质被分泌到细胞外间隙，并通过形成环绕角质层细胞的脂质薄层而组成对亲水物质有通透性的屏障。最后，除致密包装的细胞角蛋白丝外，所有的细胞内结构均消失。

因此，角质层的细胞(角质细胞)是不具活力的。这意味着调整角质层内的各种过程一定是在角质化细胞仍存活时“演变进程(programming)”的结果。在脱屑过程中，细胞从皮肤表面脱落从而结束了表皮的循环，循环过程通常需要约4个星期，在此期间，约有2周的时间细胞作为角质层的部分，该过程就是角质层“演变进程”的一个实例。角质层起物理—化学屏障功能的先决条件是它的单个细胞要由机械性抗性结构，即桥粒固定在一起。必须要调节桥粒的降解作用(即脱屑的先决条件)以便使细胞从皮肤表面脱落，这样即可平衡角质层的重新产生而不会影响该组织的屏障功能。

角质化疾病

在许多严重程度不同的皮肤病理状态下，均有角质化过程失调。对于牛皮癣来说，除典型的慢性炎症外，还有未成熟角质层的过度产生，导致这种疾病典型的起鳞屑的症状。有一组遗传性皮肤病，其特征在于角质层增厚，从而导致形成“鱼鳞”，被称为鱼鳞病。在几种鱼鳞病中，均存在脱屑速度降低。尽管严重程度低于鱼鳞病，但“干皮”(干皮病)的特征也是角质细胞从角质层脱落，但与正常情况下，脱落单个细胞或小的细胞聚集物不同，而是脱落大的肉眼可见的鳞片。在老人和特应性者，即对皮肤刺激的抗性降低和有可能发展成内生性湿疹的特征形式之个体中间，这种紊乱很常见。在痤疮病中，在皮脂腺的导管中存在失调的角质化，从而导致了粉刺和堵塞的形成，粉剌的形成先于并被认为诱发了炎性痤疮损伤。

与角质化有关的蛋白水解酶

在蛋白水解酶似乎起重要作用的角质化过程和角质层循环期间存在几个阶段。可以肯定的是，除存在于在有活力的和角质化的表皮层之间转变过程中的细胞角蛋白丝外，所有细胞内结构均消失，这一定涉及蛋白水解作用。profilaggrin向filaggrin(据认为是在角质化过程中，对特殊类型的细胞角蛋白丝的聚集起作用的蛋白质)的转化可能由特异性蛋白酶催化。在角质层中，filaggrin被进一步降解成低分子量组分，这种组分作为“天然湿润剂”可能是很重要的。另外，在角质化过程中，存在细胞角蛋白多肽的蛋白水解修饰作用。最后，在最终导致脱屑的过程中，蛋白水解过程对于角质层内细胞间粘连结构的降解可能起重要作用。

角质层细胞粘连和脱屑。桥粒的作用

在角质层和表皮有活力部分内的细胞间粘连中，桥粒的介导程度非常明显。桥粒由2个对称的部分组成，每一半均由两个邻接的细胞形成。每一半桥粒均有一个与细胞角蛋白丝相连的细胞内部分和由固定于细胞内并带有跨膜和细胞外部分的糖蛋白组成的部分。这些蛋白质的细胞外部分(desmogleins)是粘连分子，并通过在细胞外间隙中它们彼此间的相互作用而形成粘连结构。在手掌和足底的角质层中，桥粒的降解似乎沿与非手掌—足底的角质层不同的途径进行。在后者的组织中，在细胞完全角质化后不久，约85％的桥粒就会消失。剩下的桥粒(优先地位于极扁平细胞的长软毛的边缘)直到脱屑时仍会保持完整。在手掌—足底角质层中，角质细胞不太平坦，在该组织的较深层内，没有大范围的降解。在这两种组织中，脱屑均与桥粒降解有关。在鱼鳞皮肤和“干性皮肤”中，已经表明角质层表层中的桥粒数目增加。

角质层细胞间的脂质

手掌—足底和非手掌—足底角质层间桥粒降解的不同，可能与这两类组织中细胞外脂质数量的不同有关。在非手掌—足底角质层中，脂质含量相当高。作为对水和其它亲水物质的通透性屏障，该组织的效率必然优于手掌和足底的角质层。由于桥粒占相当的体积并且由于完整的桥粒防止细胞外间隙的扩展，桥粒的降解可能是一种使脂质得到更大的细胞外间隙的机制。角质层的细胞外脂质还以其它几种方式与脱屑相关。由于它们是细胞外间隙的主要组分，所以认为它们对在该位置具有功能之酶(如引起桥粒降解的酶)的活性可能有重要的影响。的确，已表明脂质代谢的各种失调可能是几种鱼鳞病的原因。还有可能是，脂质本身造成了不同程度的角质细胞粘连。此外，脂质分泌到角质层细胞外间隙可能也与分泌的大量酶有关。脂质的前体贮存于特定细胞器内的上层有活力的角质化细胞中。已证明这些所谓的片层体还含有大量的水解酶。因此设想角质化细胞可能以失活的酶原形式合成使角质层中之桥粒降解的酶，该酶贮存于片层体中，然后在角质化过程中活化并被分泌到角质层细胞外间隙，而且由其他因素中的细胞外脂质之组合物进一步调节其活性。

在有活力的表皮中之细胞粘连的紊乱

有许多皮肤病，其中在非角质化的有活力表皮层中的角质化细胞间存在粘连受损。这些疾病以所谓皮肤棘层松解现象为特征，皮肤棘层松解即其它明显正常的角质细胞间之桥粒接触断裂。该过程可能是由迄今尚未完全鉴定的蛋白酶介导的。皮肤棘层松解(在广泛导致水疮形成时)是自身免疫疾病寻常天疱疮和落叶状天疱疮、遗传性良性家族天疱疮(Hayley-Hayley′s病)和遗传性异常角化滤泡症(follicularis)(毛囊角化病)的特征。

表皮在免疫和炎症反应中起积极作用

除其作为机体内部和外部之间物理—化学屏障之产生者的功能外，表皮还作为活性免疫屏障而起作用、通过与免疫和炎症系统之细胞联系和相互作用，角质化细胞具有产生大量细胞因子和其它炎性介质并对其作出反应的能力。在宿主抗微生物感染的防御和损伤愈合中，这是最重要的。现代科学研究表明：在许多炎症性皮肤病如牛皮癣和湿疹中，角质化细胞可能起积极作用。

在炎症中表皮蛋白酶可能是重要的

由角质化细胞产生的细胞因子之一是白细胞介素1(I l-1)。I l-1以两种形式即I l-1α和I l-1β存在，两者均存在于表皮中。合成的I l-1α有完全的活性，而I l-1β以无活性的31KD原形式(pro-form)被合成。由例如在单核细胞中但迄今在正常表皮中尚未检测到的特异性蛋白酶，将I l-1β原转变成有活性的17KD形式，但许多具有胰凝乳蛋白酶样底物特异性的丝氨酸蛋白酶(嗜中性粒细胞的胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)和组织蛋白酶G)也可作为I l-1β原激活剂。

正如Norris(1990)所说明的，角质层细胞内空间中的蛋白水解酶可在特定条件下将无活性形式的细胞因子转变成活化形式。在该文中，特别研究了已表明由角质化细胞产生的(Mizutani et al.，1991)没有生物学活性的白细胞介素-1β原。迄今，尚未发现能将白细胞介素-1β原转变成活性白细胞介素-1β的表皮酶。但由于胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶G(一种胰凝乳蛋白酶样酶)有能力催化无活性的31KD重组白细胞介素1β原转变为有完全活性的17KD形式，因此，表皮胰凝乳蛋白酶样酶也可能催化这种转变。

本发明详述

本发明涉及已定义为角质层胰凝乳蛋白酶(stratum corneumchymotryptic enzyme，SCCE)的酶，认为所述SCCE引起角质层中桥粒的降解。实施例1提供的证据表明细胞从皮肤角质化之表层的表面脱落涉及桥粒蛋白的降解，而且有关酶似乎是可由锌离子抑制的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

实施例2描述角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)的发现；所述蛋白酶满足引起体外而且可能也是体内降解角质层细胞内粘连结构的要求。实施例3用产色素的底物描述角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)活性的部分特征。

结果说明SCCE在酶学上不同于其它胰凝乳蛋白酶。与牛胰凝乳蛋白酶和人组织蛋白酶G相比，SCCE的抑制剂图谱和降解两种不同胰凝乳蛋白酶样酶之底物的能力显著不同。SCCE似乎也不同于人肥大细胞胃促胰酶。后者有效地催化Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的降解(参见Schwartz et al.，1987和Schechter et al.，1989)，而SCCE不能；且胃促胰酶不受抑肽酶或SBTI的抑制(Schechter etal.，1983和Wintroub et al.，1986)，但SCCE会受到这种抑制。

实施例4描述了通过对不溶性大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)进行亲和层析而从角质细胞的KCl-提取物中部分纯化SCCE并确定SCCE的N端氨基酸序列。用未还原的样品，在1-6步中产率较好，但在7和9步，产率降至零，而且在随后的步骤中，产率明显降低。再用还原样品，在步骤7和9中检测不到氨基酸衍生物，但在可检测到衍生物的随后步骤中，产率没有急剧的降低。这些结果说明，在7和9位有Cys。但在用碘乙酸(100mM)还原和处理后，在步骤7和9中不可能检测到羧甲基化的Cys。由还原和未还原样品得到的序列(图13，SEQ ID NO：3)相同。

实施例5描述了制备SCCE特异性单克隆抗体和多克隆的SCCE特异性鸡和兔抗体以及用单克隆抗体进行的免疫组织化学研究。

实施例6描述了编码人SCCE之cDNA的克隆和测序。首先，用抗SCCE的兔多克隆抗体筛选由得自成人表皮源之角质化细胞的mRNA制备的cDNA文库。一种抗体产生了高本底信号，将其排除于早期的广泛筛选研究之外。用另一多克隆抗体(D-5)，按预计为得到真正阳性噬菌斑而富集大量的免疫反应性噬菌斑。但对于任何噬菌斑，用单克隆抗体moAb 4和moAb 9均未观察到反应性。11个分离的噬菌斑的广泛限制酶特征和PCR特征表明，在不同噬菌斑之间没有检测到相似性。基于这种未能定义可能的SCCE cDNA序列的“指纹”，不得不对策略进行修改。

除优先检测上基底角化细胞中的SCCE免疫反应性物质外，还用从培养的人角化细胞制备的cDNA文库筛选SCCE cDNA。期望所述文库含有仅来自基底角化细胞的cDNA。这种尝试是以用基底角化细胞的SCCE单克隆抗体而观察到的弱但可能明显的免疫着色为基础的。

用合成的17-聚体寡核苷酸探针筛选噬菌斑，所述探针是以实施例4中所述之实验确定的天然SCCE酶之N端序列的最可靠部分的氨基酸序列，Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro(SEQ ID NO：10，aa1-aa6)为基础设计的。由于实验确定的氨基酸序列内的不确定性，所以判断该六肽为代表最可靠的部分之一。另外，编码该六肽的可能密码子会使DNA探针的简并性最低。排除了较长的实验确定的序列(Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu(SEQ IDNO：3，aa15-a24)，原因在于编码该肽序列的序列有高度的简并性。在初次筛选中鉴定了14个阳性噬菌斑。用相同的探针和上述方法，再筛选这些阳性噬菌斑。再筛选过程后，鉴定了2个阳性噬菌斑。将所选的2个噬菌斑再纯化一次，然后用SYM 1600和SYM 1601(与两个噬菌体臂互补)作为引物和分离的噬菌体作为模板通过PCR确定插入片段的大小。将该克隆片段进行部分序列分析。

翻译所得的DNA序列得到与实验确定的蛋白质序列同源的氨基酸序列。但该序列缺乏翻译的起始密码子。为了分离全长cDNA，在琼脂糖凝胶上分离所得的DNA片段，然后作为在严格条件下可进行杂交的探针。为了得到全长cDNA，用与上述相同的方法，除于65℃在严格条件下杂交外，用该探针将cDNA文库再筛选2次。这些实验使得最终鉴定并分离了45个阳性噬菌斑，所述噬菌斑最初是通过使用SYM1600或SYM 1601与SYM 3208组合作为引物的PCR分析法筛选的，所述引物是为了鉴别含完整5′开放阅读框架的噬菌斑。

进一步筛选并进行序列分析后，按实施例6中的详述克隆得自这些噬菌体的所述PCR扩增片段，结果表明其中的一个噬菌体205.2.1含有全长插入片段。确定cDNA片段的完整核苷酸序列。核苷酸序列(SEQ ID NO：1)含有足以编码SCCE前体蛋白之完整氨基酸序列的开放阅读框架，所述前体蛋白由包括信号肽和前多肽(SEQ ID NO：2)的253个氨基酸组成。

实施例7描述了在人表皮中检测两种SCCE mRNA，所述的mRNA能与在SCCE cDNA序列基础上制备的cDNA探针杂交。

实施例8描述了在E.coli中表达重组SCCE。结果表明在细菌中有可能生产重组SCCE。

实施例9描述了在哺乳动物细胞中表达重组人SCCE。得到了三种蛋白质，它们能与所有可得到的多克隆兔和鸡SCCE抗体以及保藏的单克隆抗体反应。与抗天然SCCE的抗体反应的重组蛋白质的表观分子量，比纯化的天然人SCCE大约1KDa。重组蛋白质没有任何蛋白水解活性。

实施例10中描述了重组SCCE的纯化、活化及进一步的特征描述。用胰蛋白酶或内肽酶Lys-C可经蛋白水解裂解而激活无活性的重组SCCE的原形式。已考虑到大量在碱性氨基酸后能裂解肽的其它蛋白酶，如内蛋白酶Lys-C、木瓜蛋白酶和血纤维蛋白溶酶能将SCCE原激活成有活性的SCCE。已发现信号肽由22个氨基酸组成并以天然活性SCCE的N端氨基酸序列为基础，多肽由7个氨基酸组成。此外，还表明产生的重组SCCE存在两种N-糖基化形式和一种非糖基化形式，这与用有活性的天然SCCE得到的结果类似。

术语“角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)”或者“有SCCE活性的多肽”在最广泛的意义上指丝氨酸蛋白酶或其原形式，如可经蛋白水解裂解而激活的酶原(SCCE原)或融合蛋白，通过与自发的细胞解离相同的抑制剂和相似的方法可抑制所述酶的活性形式，所述解离可以在含有皮肤角化层之样品的模型系统中诱导，所述样品于生理温度在中性或近似中性的pH中温育。

具体地说，术语“具有SCCE活性的多肽”因此指一种多肽，它不同于胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶G而且其活性形式能降解底物MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-25-86)，按实施例3和13以及图9和表5中的说明，由所述多肽进行降解可由抑肽酶、抑糜朊酶素和硫酸锌抑制。

更进一步说，术语“具有SCCE活性的多肽”是指一种多肽，它能够在足底角质层体外培养期，经蛋白水解降解桥粒蛋白desmoglein I。

所述多肽通常还与抗天然SCCE的抗体反应，所述SCCE是从分离的足底角质层细胞之提取物中纯化的。所述抗体的实例是按5.2中描述产生的多克隆抗体和按实施例5.1中所述产生的单克隆抗体TE 4b和TE 9b。所述单克隆抗体由根据布达佩斯条约分别以保藏号ECACC 93061817和ECACC 93061816保藏于欧洲动物细胞培养物收集中心(Porton，Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，UnitedKingdom)的杂交瘤TE 4b和TE 9b产生。

实施例6中描述了编码人SCCE之cDNA的克隆和测序。已经发现了含有足以编码SCCE前体蛋白之完整氨基酸序列的开放阅读框架的核苷酸序列，所述前体蛋白由包括信号肽和前多肽的253个氨基酸组成。核苷酸序列列于SEQ ID NO：1，推测的“角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)”之氨基酸序列列于SEQ ID NO：2。

术语“SCCE原或其类似物或变异体”指含有氨基酸序列SEQ IDNO：2或所述序列之类似物或变异体多肽，所述序列是在适当的表达系统中表达本发明的核苷酸序列时产生的，并且经蛋白水解活化后产生可由与自发性细胞解离过程中相同的抑制剂抑制的丝氨酸蛋白酶，在含有皮肤角质层之样品的模型系统中可诱导所述的细胞解离，而所述样品是在生理温度，即约37℃，于中性或近似中性pH上培养的。通常，所述蛋白质与抗纯化的天然或重组SCCE的抗体反应。

术语“SCCE或其类似物或变异体”指具有氨基酸序列SEQ IDNO：2或所述序列之类似物或变异体的多肽，所述序列是在适当的表达系统中表达本发明的核苷酸序列时产生的，而且是一种可经与自发性细胞解离过程中相同的抑制剂抑制的丝氨酸蛋白酶，可以在含皮肤角质层之样品的模型系统中诱导所述的细胞解离，所述样品是在生理温度，即约37℃，于中性或近似中性pH下培养的。通常，所述蛋白质将会与抗纯化的天然或重组SCCE抗体反应。

因此，术语“其类似物或变异体”指并不具有精确的SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，但仍具有如上所定义之“SCCE活性”的多肽。通常，与实施例中所述的SCCE蛋白质相比，所述多肽是例如在氨基酸组成，或翻译后修饰如糖基化或磷酸化方面，在一定范围内变化的多肽。

因此，本发明说明书中所用的术语“类似物或变异体”是指具有与来自实施例6所述的SCCE蛋白的特征性的氨基酸序列SEQ ID NO：2有相似的氨基酸组成或序列的蛋白质或多肽，允许改变氨基酸序列的微小改变，如，氨基酸的缺失，定点诱变，额外氨基酸的插入，或其组成，以得到SCCE蛋白质类似物。这些修饰使得可以得到类似物的所需和有用的新特性。类似物多肽或蛋白质可以得自动物或人或者可以是部分或完全来自合成。使用重组DNA技术，也可以得到所述的类似物。

因此，本发明的一个重要的实施方案涉及一种多肽，其中，已用不同的氨基酸残基取代了至少一个氨基酸残基，和/或其中已至少缺失或增加了一个氨基酸残基以便得到含有不同于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或如下文所定义的所述氨基酸序列之亚序列的氨基酸序列，但基本具有上述SCCE活性的多肽。

本发明的一个有价值的实施方案涉及一种多肽，它是本发明多肽的类似物或亚序列，含有50-250个氨基酸，例如，至少70个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸或至少200个氨基酸。

本发明特别重要的实施方案是具有SEQ ID NO：2中氨基酸序列-7-224(前-SCCE)的多肽和具有SEQ ID NO：2中氨基酸序列1-224(SCCE)的多肽。

术语“酶活性的亚序列”指含有部分SEQ ID NO：2所示之多肽序列并且具有酶活性的多肽序列。还包括由本文所解释的修饰而类似化的多肽亚序列。认为具有酶活性位点的一种或多种特异性多肽是特别有用的。

以预测的氨基酸序列SEQ ID NO：2与人胰凝乳蛋白酶(Toultaet al.，1989)，人组织蛋白酶G(Salvesen et al.，1987)和人肥大细胞胃促胰酶(Caughey et al.，1991)的氨基酸序列进行了比较。尽管推测的氨基酸序列含有丝氨酸蛋白酶的保守活性区，但同源性程度很低约33-38％。由此可见，SCCE与以前已知的丝氨酸蛋白酶相比只有中度的相似性。另一方面，从活性位点的His，Asp，Ser残基和靠近这些位点的保守区看，SCCE是一种典型的丝氨酸蛋白酶。这对于丝氨酸蛋白酶的大多数Cys残基和其它高度保守区来说也是成立的。在一级特异性囊(在胰凝乳蛋白酶的残基189)的底部，在人胰凝乳蛋白酶，肥大细胞胃促胰酶中有一个丝氨酸残基，在人组织蛋白酶G中有一个前列腺特异性抗原和一个Ala残基。另一方面，在SCCE中，该位置是由一个Asn残基占据。这可以解释尽管SCCE毫无疑问具有胰凝乳蛋白酶活性，但其对各种产色肽底物的相对活性却不同于胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶G，象抑糜朊酶素(一种低分子量的胰凝乳蛋白酶样酶的抑制剂)的抑制效率。

在下列的序列排列中列出了人胰凝乳蛋白酶、人组织蛋白酶G和人肥大细胞胃促胰酶序列和SCCE序列之间的比较。

用人工进行排列

HUMCTRP＝人胰凝乳蛋白酶(Touita et al.，BBRC 158：569-575，1989)

HUMCHTG＝人组织蛋白酶G(Salvesen et al.，Biochemistry26：2289-2293，1987)

HUMCHYM＝人肥大细胞胃促胰酶(Caughey et al.，J.Biol.Chem.266：12956-12963，1991)

Homologies：

HUMCTRP/SCCE：85/224＝38％

HUMCHTG/SCCE：74/224＝33％

HUMCHYM/SCCE：74/224＝33％

HUMCHTG/HUMCHYM：109/226＝48％

                                        

计数指胰凝乳蛋白酶原

划下线部分：

靠近活性位点(胰凝乳蛋白酶中的Ile 15，His 57，Asp 102，Ser 195)和胰凝乳蛋白酶一级特异性囊(胰凝乳蛋白酶中的Ser 189，Ser 213-Trp 215，Gly 226)的保守区。

星号：SCCE中可能的N-糖基化位点

本发明的一个重要的实施方案涉及含有氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列中其连续排列的20个氨基酸与选自SEQ ID NO：2所示氨基酸序列之相同长度的一串氨基酸有至少80％的同源性。与SEQ ID NO：2所示的多肽有至少80％，如至少85％(如90％)同源性的本发明的多肽序列构成了重要的实施方案。由于SEQ ID NO：2所示的序列似乎非常独特，因此，本发明范围包括与选自SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的相似连续排列的20个氨基酸的同源性程度可不超过55％的同源性的多肽，尽管优选的不超过70％，所述序列可以得自其它种，例如其它哺乳动物，如小鼠，大鼠，兔，豚鼠，猪或牛的相似蛋白质。由于小部分的序列可以与其它丝氨酸蛋白酶有相当的相似性，因此，本发明的范围还包括与相似连续排列的20个氨基酸有至少95％，且最佳为至少99％同源性的肽，所述的20个氨基酸选自SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列。

术语“序列同源性”指就多肽中氨基酸的一致性和位置而言，在相比较的两个或多个氨基酸长的片段中，氨基酸序列的一致性。

因此本文所用术语“同源性”说明了所给多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列之间的一致性程度。由如，按下文所定义的杂交而得到的核苷酸序列如DNA或RNA序列可以推断得到与SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列相比较的氨基酸序列，或者用常规的氨基酸测序方法也可以得到所述序列。优选的是以成熟多肽的氨基酸序列为基础，即不考虑前导序列，来确定同源性的程度。通常，在比较核苷酸序列时只用编码区以便确定其内部同源性。

在本发明说明书中，术语“由至少一种保藏的抗体识别的多肽”包括一种氨基酸序列，就SEQ ID NO：2所示多肽之任何亚序列的线性或空间构型而言，它含有基本上连续排列的氨基酸，所述SEQ IDNO：2由至少一种保藏的抗体识别。正如本领域熟知的，二级或三级构型也可以具有所需和有用的特性并可以构成表位。保藏的抗体TE4b和TE9b似乎识别SCCE的构型表位。

已经表明按实施例5.2.2中所述制备的多克隆兔抗体在免疫荧光显微镜下发现，在颗粒层产生颗粒染色和在较低的角质层产生相当分散的染色。

抗纯化的天然或重组SCCE的抗体通常与角质化的人鳞状上皮中的前基底细胞而不是非角质化的鳞状上皮中的上皮细胞结合。这些抗体还与人皮肤角质层的细胞间空间结合。

与本发明多肽反应的抗体适用于下文所列的各种目的：

用于纯化蛋白质：用亲和层析或免疫沉淀技术从生物样品中可以纯化多肽或其类似物。

用于诊断和治疗：在动物和人的疾病的诊断和治疗中可以使用抗多肽或其类似物的单克隆抗体。诊断试剂可以是具有本发明多肽特异性的抗体。可以将抗体与另一种蛋白质或固体支持物结合和/或将其用于凝集试验或显色试验。用标准的组织化学或免疫化学技术，用所述的抗体可以确定生物样品中SCCE多肽或其类似物的数量。

一方面，本发明涉及编码上述本发明多肽的核苷酸序列。具体的是，本发明涉及基本上含有SEQ ID NO：1所示之序列的核苷酸序列。重要的实施方案涉及编码含有氨基酸序列SEQ ID NO：2之多肽的核苷酸序列，如，编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列-7-224之多肽或含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列1-224之多肽的核苷酸序列。

本发明还涉及在实施例7和实施例9所述的高度严格条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

另一方面，本发明涉及含有SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列或其类似物或其亚序列的核苷酸序列，所述的核苷酸序列

(1)与SEQ ID NO：1所示的序列有至少90％的同源性，和/或

(2)编码一种多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少80％的同源性，和/或

(3)编码由在1993年6月18日保藏于ECACC保藏号为ECACC93061817的杂交瘤细胞系TE 4b生产的单克隆抗体和在1993年6月18日保藏于ECACC保藏号为ECACC 93061816的杂交瘤细胞系TE 9b生产的单克隆抗体结合的多肽，和/或

(4)编码由抗天然SCCE的多克隆抗血清结合的多肽，所述天然SCCE已从分离的足底角质层的提取物中被纯化。

在本发明范围内还包括不同于上述核苷酸序列的经修饰的核苷酸序列，即其中至少一个核苷酸被缺失，取代或修饰或者至少一个附加的核苷酸被插入以便得到编码具有SCCE活性之多肽的核苷酸序列。

在本发明说明书和权利要求书中，术语“亚序列”指优选的大小为至少15个核苷酸，更优选的为至少18个核苷酸，最佳为至少21个核苷酸的序列。在本发明的大量实施方案中，本发明核苷酸序列的亚序列或类似物含有至少48个核苷酸，如，至少75个核苷酸或至少99个核苷酸。所述“亚序列”应符合上述标准1)-4)中的至少一个或者应与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交。

正如本文所述的，已经熟知小片段在PCR技术中也是有用的。按实施例7所述，在鉴定本发明核苷酸序列的mRNA片段时，可以用所述片段和亚序列连同其它功用一起作为探针。

就本发明的DNA片段来说，术语“类似物”用于说明编码等同于或基本等同于本发明DNA片段所编码的多肽之多肽的核苷酸序列。已经熟知，相同的氨基酸可以由不同的密码子编码，此外，密码子的使用还与将要表达核苷酸序列的生物的偏好有关。因此，在表达时，本发明DNA片段的一个或多个核苷酸或密码子可以由其它核苷酸或密码子替换，表达时会得到与由所述DNA片段编码的多肽相同或基本相同的多肽。

另外，本文用术语“类似物”说明特征性的DNA序列SEQ ID NO：1有相似的核苷酸组成或序列的DNA片段或DNA序列，SEQ ID NO：1编码构成SCCE多肽的氨基酸序列，从而如实施例3所述允许与天然SCCE蛋白质的活性相比，对类似物的酶活性没有显著不利影响的微小改变。术语“显著不利影响”指例如，在按实施例3所述测定时，类似物的酶活性应至少是天然SCCE活性的50％，优选的至少是60％，最佳至少是70％如至少75％。类似的DNA片段或DNA序列可以得自生物例如动物或人，或者部分或全部来自合成。也可以通过重组DNA技术得到类似物。

此外，术语“类似物”和“亚序列”用于说明序列中的改变例如，一个或多个核苷酸的取代，插入(包括内含子)，增加和重排，所述改变对DNA片段或其亚序列编码的多肽没有任何实质性的不利影响。

术语“取代”指用一个或多个不同的核苷酸代替全长核苷酸序列中的一个或多个核苷酸，“增加”指在全长核苷酸序列的任一末端加入一个或多个核苷酸，“插入”指在全长核苷酸序列中掺入一个或多个核苷酸，“缺失”指在序列的任一末端或其内的任何适宜的位点，从全长核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸，“重排”指在DNA或多肽序列内分别交换两个或多个核苷酸残基，但在将DNA片段插入生物之前或之后也可以经诱变对其进行修饰。

就本发明的片段，序列，亚序列和类似物来说，当然应当将本发明说明书和权利要求中所用的术语“片段”、“序列”、“亚序列”和“类似物”理解为在其天然环境中不含有这些现象，但以分离的、纯化的、体外或重组形式存在。

在本发明的实施方案中，通过从细胞或组织中提取RNA并将其转变成cDNA随后用于聚合酶链反应(PCR)而完成SCCE多肽mRNA的检测和/或定量。以本发明的DNA片段例如SEQ ID NO：1所示的DNA片段为基础可以合成PCR引物。可以将检测和/或定量的方法用作诊断疾病的诊断方法，在所述的疾病中，SCCE以比正常高或低的量被表达。

在本发明范围内还包括含有能检测本发明之核苷酸序列的核苷酸探针的诊断试剂和诊断其中SCCE表达失调的疾病和/或SCCE基因发生突变的疾病之方法，包括使来自怀疑有病的患者(其中SCCE的量比正常值高或有突变形式的SCCE)的样品经PCR分析，其中，使样品与上述诊断试剂接触，以扩增任何核苷酸序列并检测样品中是否存在任何相同的或同源核苷酸序列。

用重组DNA技术可以生产本发明的多肽。本发明的重要实施方案涉及含有本发明核苷酸序列的表达系统。

用于生产本发明多肽的生物可以是高等生物，例如动物，或者低等生物，例如E.coli.这样的微生物。不考虑所用的生物类型，将本发明的DNA片段直接或利用适当的载体导入生物中。另外，通过直接或利用表达载体，导入本发明的DNA片段或其类似物或亚序列，从而可以在哺乳动物细胞系中生产多肽。

在适当的稳定表达载体中克隆DNA片段或其类似物或亚序列，然后放到适当的细胞系中。在适于所用载体和细胞系的条件下，以生产率的水平为基础筛选生产所需多肽的细胞。进一步培养所筛选的细胞并形成所需多肽的重要和连续的来源。

本发明DNA序列具体类似物的实例是含有SEQ ID NO：1所示之DNA序列或其一部分并特别适于在E.coli.中表达的DNA序列。将所述DNA序列与适宜的调节序列插入E.coli.后，可以表达基本具有SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列或其一部分的多肽。因此，该DNA序列含有由E.coli.识别的特异性密码子。在实施例8中描述了该上述方案的一个实例。

在本发明说明书中，用术语“基因”说明与生产多肽链有关的DNA序列并包括编码区前和后区(5′上游和3′下游序列)以及置于单个编码片段外显子之间或5′上游或3′下游区内的插入序列内含子。5′上游区含有控制基团表达的调节序列，特别是启动子。3′下游区含有与终止基团转录有关的序列和可选择性地包括与转录物的多腺甘酸化和3′非翻译区有关的序列。

与上述一致，本发明涉及含有编码本发明之多肽的上述核苷酸序列的表达系统，该系统含有能够调节所述核苷酸序列之表达的5′侧翼序列。

具体地说，本发明涉及携带并能调节本发明核苷酸序列之表达的可复制性表达载体。本发明的具体实施方案涉及称为pS507(根据布达佩斯条约，以保藏号DSM 8282于1993年5月11日保藏于thecollection of Deutsche Sammlung von Milroorganismen undZellkulturen GmbH(DSM)的可复制性表达载体和表达不同于所述保藏表达载体的核苷酸序列的表达载体，但其编码具有SCCE活性的相同多肽或其类似物或变异体。

换句话说，本发明的范围还包括上述的可复制性表达载体，其中，被表达的核苷酸序列与被保藏载体的核苷酸序列的不同在于缺失，取代，或修饰了至少一个核苷酸或已插入了至少一个额外的核苷酸以产生编码具有SCCE活性的多肽之核苷酸。

此外，本发明涉及称为pS500的质粒(根据布达佩斯条约，该质粒以保藏号DSM 8281于1993年5月11日保藏于the collectionof Deutsche Sammlung von Milroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSM))和含有一段核苷酸序列的质粒，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，但其编码SEQ ID NO：2所示的多肽或其具有SCCE活性的类似物或变异体或在严格杂交条件下与SEQID NO：1所示的核苷酸序列或其部分杂交。

在本发明范围内还包括携带本发明表达系统的非人生物体。在本发明的该方面可以用的生物体包括微生物例如，杆菌属，埃希氏杆菌属，沙门氏菌属的细菌，如啤酒酵母属，毕赤氏酵母属的酵母，原生动物或得自多细胞生物如真菌的细胞，昆虫细胞，植物细胞，哺乳动物细胞或细胞系。如果所述生物体是细菌，则优选的是埃希氏杆菌属细菌，如，E.coli.。

本发明还涉及含有编码本发明之多肽或本文所定义的融合蛋白的DNA序列的质粒载体。在一个重要的实施方案中，可以由能在宿主生物体或细胞系中复制的可复制性表达载体携带本发明的DNA片段或其类似物或其亚序列或本文所定义的本发明融合DNA片段。

本发明的载体具体的可以是质粒，噬菌体，粘粒，小染色体或病毒。在本发明优选的实施方案中，在导入宿主细胞时，载体可以是整合到宿主细胞基因组中的载体。

如果使用高等生物，可以用转基因技术生产多肽。适宜动物的实例是羊，牛，猪，等。在所需的组织中于组织特异性调节元件的控制下，表达编码本发明多肽的DNA片段。然后，使所得的蛋白质经转译后修饰以得到本发明的多肽。

通过将“转基因”导入所选动物的胚胎靶细胞而生产本发明的转基团非人哺乳动物。在本发明的一方面，转基团是DNA序列，当该DNA序列被包含在转基因非人哺乳动物细胞的基因组中时，能够生产所需的表型。在具体的实施方案中，转基因含有编码本发明多肽的DNA序列，转基因能够被表达以便生产所需的多肽。

用任何适宜的技术，例如按Hogan et al.，1986或WO 93/04172中所述，均可以将表达系统掺入哺乳动物的种系。

在本发明的一个具体的方面，本发明的核苷酸序列含有编码多肽的另一核苷酸序列，所述多肽不同于或等同于本发明的多肽，所述的另一核苷酸序列在阅读框架中与编码SCCE多肽的SEQ ID NO：1所示之序列或其类似物的核苷酸序列相融合，以生产构成本发明另一目的的融合多肽，参见例如，实施例8。若使用重组DNA技术，可以将融合的DNA序列掺入适宜的载体或基因组中。另外，将核苷酸序列之一插入已含有另一核苷酸序列的载体或基因组中。通过插入两个分别的核苷酸序列并使其表达也可以生产融合多肽。在确保表达融合序列的条件下，使宿主生物生长(可以是真核或原核源)。然后纯化融合多肽并用适宜的方法从其融合同伴中将其分离出来。

因此，本发明的一方面涉及生产本发明多肽的方法，包括下列步骤：

(a)将本发明的核苷酸序列插入表达载体中，

(b)用步骤(a)中生产的载体转化适宜的宿主生物，

(c)在表达多肽的适宜条件下，培养步骤(b)中生产的宿主生物，

(d)收集所述的多肽，和

(e)选择性的使多肽可进行转译后修饰。

在本发明范围内还包括上述方法，其中，通过一个或多个亲和层析步骤和/或其它层析和电泳方法，分离所生产的多肽，所述的亲和层析使用固定的天然或重组SCCE多肽或与所述多肽有反应性的抗体。

通过热处理，化学处理(甲醛，戊二醛等)或酶处理(肽酶，蛋白酶和蛋白质修饰酶)可以使上述生产的多肽进行转译后修饰。与其天然生产环境相比，当在生物中生产时，可以以不同的方式加工所述的多肽。作为一个实例，当由高等生物例如，酵母或优选的哺乳动物的细胞表达所述的多肽时，常常要进行糖基化。糖基化常常与氨基酸残基Asn，Ser，Thr或羟赖氨酸有关。除去或改变因所用的宿主生物引起的加工特性不一定是有利的。

在生物或细胞系中表达本发明的多肽后，可以这样使用所述多肽或首先从生物或细胞系中将其纯化。如果作为分泌产物表达多肽，则可以直接纯化。如果多肽被表达为联合产物，则在纯化前要求部分或完全破碎宿主。用于纯化多肽的方法的实例是：(i)用抗体免疫沉淀或亲和层析，(ii)用适宜的配体亲和层析，(iii)其它层析方法例如，凝胶层析，离子交换或高效液相色谱或上述方法的衍生方法，(iv)电泳方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳，变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳和等电聚焦，(v)任何其它特异性的溶解和/或纯化技术。

本发明还涉及基本上纯的SCCE多肽。在本文中术语“基本上纯的”指所需的多肽基本上没有其它组分，例如其它肽或碳水化合物，所述的其它组分是因多肽的生产和/或回收或以其它方式所述的多肽在一起。按实施例3中所述，用SDS凝胶电泳可以评估蛋白质的纯度。

根据本领域专业人员熟知的方法，用SBTI亲和层析或在固定抗体例如，抗体TE 4b上的亲和层析，按实施例4所述可以纯化所述多肽。当在药物或化妆品组合物中使用所述多肽时，高纯度的本发明多肽是有益的。还因其具有高纯度，对于大多数目的来说，可以以比传统低纯度多肽低的数量使用基本上纯化的多肽。

在本发明的一方面，从按实施例9所述表达本发明多肽的适宜细胞系中可以得到纯化的多肽。通过利用熟知的连续结合多肽序列之单个氨基酸的液相或固相肽合成法，也可以合成本发明的多肽。另外，通过偶联单个氨基酸形成多肽序列的片段，然后偶联在一起以得到所需的多肽，也可以合成多肽。这些方法因此构成了本发明的另一个方面。

本发明的一个重要方面涉及药物组合物，化妆品组合物或皮肤护理组合物，它们含有具有SCCE活性的多肽和药物学和/或美容可接受的赋形剂。所述组合物可以含有本发明的纯化天然蛋白或重组多肽，或通过蛋白水解裂解可以活化的本发明之多肽的酶原或融合蛋白形式。可以将本发明多肽的酶原形式看成“前药”，即，一旦经适当的蛋白水解裂解后，将转化成活性形式的化合物。

具体地说，但不排除其它情况，本发明涉及适宜于局部应用例如，应用于皮肤的组合物。

本发明适宜于局部施用的药物组合物可以是乳膏，油膏，洗剂，擦剂，凝胶，溶液，膏药，帖剂，喷雾剂，香波，皂，头发调理剂或粉末。局部施用可以是施用于靠近于呈现所述病理改变的身体部分，例如，施用到身体的外表部分如皮肤表面上。应用可以是简单的涂抹所述的组合物，或可以用适于加强所述组合物与病理损伤之间的接触的装置，例如，使用封闭的敷裹，如配有本发明组合物的封闭石膏。可以将所述组合物浸透或分散到垫，石膏带，纱布，海绵材料，棉毛片等。可选择地使用将本发明的组合物注射入或注射到损伤附近的形式。

本发明的局部组合物可以含有1-80％w/w的活性化合物(以制品的全部重量计)，例如，0.001-25％w/w的活性化合物，如，0.1-10％，0.5-5％或2-5％。可以将一种以上的活性化合物掺入所述的组合物中，即含有SCCE，SCCE原或SCCE抑制剂与其它药物学和/或化妆品化合物的组合物也在本发明的范围内。根据损伤的类型，严重程度和位置，所述组合物可以方便地一天用1-10次。

为了局部的应用，根据常规的药物学实践，可以用常用于局部应用的药物学赋形剂配制所述制品。制备任何具体组合物所用的载体的性质取决于施用所述组合物时的方法。除水外，在组合物中可以使用的载体包括固体或液体，例如，软化剂，溶剂，湿润剂，增稠剂或粉末。这些载体的实例(可以单独或作为一种或多种载体的混合物使用)如下：软化剂，如，十八烷醇，单蓖麻醇酸甘油酯，单硬脂酸甘油酯，1，2-丙二醇，1，3-丁二醇，鲸蜡醇，异硬脂酸异丙酯，硬脂酸，棕榈酸异丁酯，硬脂酸异鲸蜡酯，油醇，月桂酸异丙酯，月桂酸己酯，油酸癸酯，2-十八醇，异鲸蜡醇，棕榈酸鲸蜡酯，二甲基聚硅氧烷，癸二酸二正丁酯，肉豆蔻酸异丙酯，棕榈酸异丙酯，硬脂酸异丙酯，硬脂酸丁酯，聚乙二醇，三甘醇，羊毛脂，蓖麻油，乙酰化的羊毛脂醇，石油，矿物油，肉豆蔻酸丁酯，异硬脂酸，棕榈酸，亚油酸异丙酯，乳酸月桂酯，乳酸肉豆蔻酯，油酸癸酯，肉豆蔻酸肉豆蔻酯；

溶剂，例如，水，二氯甲烷，异丙醇，蓖麻油，乙二醇单乙基醚，二甘醇单丁基醚，二甘醇单乙基醚，二甲亚砜，四氢呋喃，植物油和动物油，甘油，乙醇，丙醇，丙二醇，和其它甘油或醇，固定油；

湿润剂或润湿剂例如，甘油，山梨醇，2-吡咯烷酮-5-羧酸钠，可溶性胶原，邻苯二甲酸二丁酯，明胶；

粉末，如，白垩，滑石，高岭土，淀粉和其衍生物，胶，胶体状的二氧化硅，聚丙烯酸钠，化学改变的硅酸镁铝，水合硅酸铝，羧乙烯基聚合物，羧甲基纤维素钠，单硬脂酸乙二醇酯；

胶凝剂或溶胀剂，如，果胶，明胶和其衍生物，纤维素衍生物如，甲基纤维素，羧甲基纤维素或氧化的纤维素，纤维素胶，耳胶，阿拉伯胶，刺梧桐树胶，黄蓍胶，膨润土，琼脂，藻酸盐，carbomer，明胶，墨角藻，峨眉藻，葡聚糖和其衍生物，茄替胶，水辉石，卵叶车前子壳，黄原胶；

聚合物，例如，聚乳酸或聚乙醇酸聚合物或其共聚物，石蜡，聚乙二烯，聚环氧乙烷，聚乙二醇，聚丙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，

表面活性剂，例如，非离子表面活性剂，如，1，2-亚乙基二醇和甘油酯，macrogol酯和醚，糖醚和酯，例如，脱水山梨醇酯，离子表面活性剂，例如，胺皂，金属皂，硫酸化的脂肪醇，烷基醚硫酸盐，硫酸化的油和两性的表面活性剂和lecithins；

缓冲剂例如，钠，钾，铝，镁或钙盐(例如氯化物，碳酸盐，碳酸氢盐，柠檬酸盐，葡糖酸盐，乳酸盐，葡庚糖酸盐，或酒石酸盐)。

为了局部应用，组合物的pH原则上可以有很宽的范围例如，3-9。在本发明优选的实施方案中，适宜多肽水解活性的pH优选的是4-8。也可以使用上述的常规缓冲剂以得到所需的pH。

本发明的制剂还可以含有其它附加成分，例如，稳定剂，防腐剂，增溶剂，增色剂，螯合剂，凝胶成型剂，软膏基，pH调节剂，抗氧化剂，香料和皮肤保护剂等。如果组合物是香波或皂的形式，则组合物还可以含有起泡剂，珠光剂和/或调理剂。

典型的防腐剂包括对羟基苯甲酸酯，甲醛，Kathon CG，Bronidox，Bronopol，对-氯-间-甲酚，chlorhexidine，杀藻铵等。

在本发明的组合物为香波或皂的形式时，可以使用常规组分，而且典型的皂和香波基包括甜菜碱，月桂基硫酸钠，壬基醇，咪唑，硫代琥珀酸盐，refattening agents，湿润剂和调理剂。

此外，还可以提供改进的释放制剂，其中，将活性化合物掺入聚合物基质或纤颗粒或脂质体，或微团中或吸附在离子交换树脂上，或由聚合物携带。

按常规的药物学实践可以配制组合物并可以是：

半固体配方：凝胶，糊，混合物。

液体配方：溶液，悬浮液，浸润液，乳液。

正如所述的，本发明的药物组合物可以含有本发明本身的多肽或其功能衍生物，或所述化合物的组合。适宜的功能衍生物的实例包括药物学可接受的盐，特别是适于皮肤环境中的那些。实例包括药物学可接受的氨基功能的盐，例如，特别是在皮肤环境中，具有产生药物学可接受之阴离子的酸的盐。实例包括磷酸盐，硫酸盐，硝酸盐，碘化物，溴化物，氯化物，硼酸盐以及得自包括乙酸盐，苯甲酸盐，硬脂酸盐等的羧酸的阴离子。

氨基功能的其它衍生物包括酰胺，酰亚胺，脲，氨基甲酸酯(或盐)，等。

其它适宜的衍生物包括本发明多肽之羧基的衍生物，包括盐，酯和酰胺。实例包括具有药物学可接受的阳离子，例如锂，钠，钾，镁，钙，锌，铝，铁，亚铁，铵和低(C1-6)烷基铵盐。酯包括低烷基酯。

实施例11中组合物的实例说明本发明的药用化妆品和皮肤护理配方，但不以任何方式限制本发明的范围。

已考虑到含有天然或重组SCCE的化妆品组合物或皮肤护理组合物对痤疮、干皮病或其它角化过度现象例如，胼胝和毛发角化病是有活性的。在寻常性痤疮中有不同的阶段。考虑到在皮脂腺的导管中有角质化障碍的阶段施用SCCE是有益的，所述的角质化障碍会导致形成粉刺和堵塞，而它可能有利于在以炎性痤疮损伤为明显特征的阶段施用抑制SCCE的物质。

因此，本发明的一方面涉及多肽治疗或预防痤疮，干皮病或其它角化过度疾病例如，胼胝和毛发角化病的用途。

以上述的科学研究为基础，认为特别是局部施用时，含有天然或重组SCCE的药物组合物可用于治疗或预防带有角化过度，微生物感染的各种鳞癣，痤疮，牛皮癣，或其它炎性皮肤病如，湿疹，并使伤口愈合。

本发明的另一方面涉及具有SCCE活性的多肽用于制备药物组合物，所述的药物组合物用于治疗或预防各种鳞癣，痤疮，牛皮癣，或其它具有角化过度的炎性皮肤病，例如湿疹。

本发明的另一方面涉及治疗和/或预防各种鳞癣、痤疮、牛皮癣或具有角化过度的其它炎性皮肤病，例如，湿疹的方法，该方法包括给患者按需要施用治疗或预防有效量的具有SCCE活性的多肽。治疗可以是预防性的，缓解性的或治愈性的。

认为蛋白水解酶的“级联系统”存在于皮肤环境中，与纤溶酶原活化系统相似。假设SCCE是该系统的终级产物之一。认为SCCE的活性可以由“SCCE抑制剂”抑制。

在大量的皮肤病中，例如自身免疫性天疱疮病或皮肤棘层松解病，如家族性天疱疮和毛囊角化病中，在非角质化的活表皮层内的角质细胞间的粘连受损(参见活表皮中的细胞粘连紊乱)。认为该过程是蛋白酶介导的，因此，通过施用能够抑制SCCE酶活性的化合物可以使其得到治疗。也可以施用SCCE抑制剂以治疗炎性组分为明显特征的牛皮癣和其它炎性皮肤病。

因此，本发明另一方面涉及SCCE抑制剂在制备药物组合物中的用途，所述SCCE抑制剂对天然SCCE的酶活性有抑制作用，所述药物组合物用于治疗和预防自身免疫性天疱疮病或皮肤棘层松解病，例如，家族性天疱疮和囊角化病。

在本文中，术语“SCCE抑制剂”指能够与本发明的酶活性多肽序列或亚序列或其类似物相互作用，以降低SCCE活性的现存或新化合物，例如通过实施例3.2中描述的使用潜在的SCCE抑制剂为抑制剂的试验，可以测量活性降低的程度。所述的化合物可以是有机分子，小肽或大多肽或上述各种的衍生物。在鉴定SCCE抑制剂的药物筛选程序中，可发现所述方法的用途。

因此，本发明的另一实施方案涉及对天然SCCE的酶活性有作用的化合物的鉴别方法，包括利用本发明重组多肽。

具体地说，本发明涉及鉴别化合物的方法，所述化合物对天然SCCE的酶活性有抑制作用。

另一方面，本发明涉及鉴别化合物的方法，所述化合物能够增强天然或重组SCCE的酶活性。

本发明之重组多肽的重要用途是用于药物筛选检测中。本发明的多肽可用于药物筛选系统。因此本发明涉及包括利用本发明的多肽鉴别能够将SCCE的酶原形式转化成活性SCCE之化合物的方法。

本发明的范围内还包括使用以上之定义的氨基酸序列推导的SCCE多肽的三维空间结构来设计能够与SCCE多肽结合的物质，特别是用于设计与酶之活性位点结合的药物。

最后，本发明的重要方面是各种调节SCCE多肽之活性的方法。

该活性与上述的各种疾病有重要的联系。

与对应于本发明多肽或其类似物的至少部分mRNA互补的DNA或RNA在人细胞中可以有效的抑制SCCE mRNA的翻译并由此抑制多肽的合成。在发现有高于正常SCCE表达的所研究的疾病中，例如，自身免疫性天疱疮或皮肤棘层松解病如家族性天疱疮和毛囊角化病中，这种方法是熟知的反义寡核苷酸治疗方法，因此本发明包括所述的方法。

附图说明

图1表示离体的从足底角质层脱落的单极细胞。在体时朝外的组织表面在图中朝上。注意到在温育过程中该表面存在渐进性细胞分离，但在其它表面无此现象。

图2表示时间过程和有(▲)和无(●)抑肽酶一起温育时抑肽酶对足底角质层细胞释放的影响。图中给出了均数(4个组织片的累加值)和范围。

图3表示粘连的足底角质层和分离的细胞中的抗desmoglein(抗-DGI)反应性成分。A.考马斯兰染的SDS-PAGE。B.免疫印迹。1-3：粘连组织，未稀释的(1)，1/3稀释的(2)，1/9稀释的(3)。4-5：分离的细胞，未稀释的(4)，1/3稀释的(5)。注意到在粘连的组织中只有分子量为160KD的外观完整的DGI，在分离的细胞中只有分子量为95KD和80KD的DGI降解产物。

图4表示时间过程和抑肽酶对经历细胞脱落的离体足底角质层中DG I之降解的影响。显示了缺乏(A)和存在(B)抑肽酶(15μM)一起温育的足底角质层之提取物的免疫印迹的光密度计扫描图。160KD的峰对应于完整的DGI。95KD和80KD的峰相当于该蛋白质的降解产物(参考图3)。注意到抑肽酶对DGI降解的有效抑制作用。

图5表示Zn²⁺(A)、抑糜朊酶素和亮肽素(B)对离体细胞脱落过程中的足底角质层的DGI降解的影响。注意到Zn²⁺和抑糜朊酶素对抗-DGI阳性成分从160KD转变成95KD和80KD的抑制作用，但亮肽素无此作用。

图6表示与足底角质层细胞有关的肽水解活性。通过检测在405nm吸光度的变化来跟踪两种底物的水解。给出的是温育混合物重复三次的均数。■表示S-2586；●表示S-2288。

图7表示角质细胞相关的S-2586水解活性之pH值依赖性。给出的是温育混合物重复三次的均数。■表示乙酸钠，●表示磷酸钠，▲表示Tris-HCl。

图8表示反映分离的足底角质层细胞提取物中酪蛋白水解活性的酶图。还可以参考下文实施例2.2的详细实验说明。

A：对用无还原剂(sc/s)的Laemmli样品缓冲液和含牛胰凝乳蛋白酶0.125ng(c)及牛胰蛋白酶0.5ng(t)的KCl(sc/k)抽提的足底角质细胞中的酶进行比较。电泳前先将KCl提取物对5mM Tris-HCl pH 6.8透析，加入SDS和甘油得到如样品缓冲液中一样的终浓度，所有泳道加10μl。分子量标记加到左边。

B：温育缓冲液中pH的依赖性。酶源为分离的足底角质细胞的SDS提取物。含Triton X-100进行预处理和进行温育的缓冲液包括0.1M乙酸钠(pH 4.0和pH 5.5)和0.1M Tris-HCl(pH 7.0和pH 8.0)。其它条件同A。

C：抑制剂的作用。sc为足底角质细胞的SDS提取物；c为牛胰凝乳蛋白酶；t为牛胰蛋白酶。抑制剂存在于用Triton X-100进行预处理和后续的温育过程中。各抑制剂的终浓度分别为亮肽素160μM、抑肽酶15μM、抑糜朊酶素40μM和Zn²⁺(如ZnSO₄)100μM。

亮肽素和抑糜朊酶素作为二甲亚砜(DMSO)的溶液加入。预处理和温育的缓冲液为含终浓度1％(v/v)DMSO的0.1M Tris-HCl pH 8。其它条件同A。

图9对于SCCE、牛胰凝乳蛋白酶和人组织蛋白酶的抑制剂(A：抑肽酶，B：抑糜朊酶素，C：ZnSO₄)的作用和底物特异性(D)进行比较。在A-C中，不存在抑制剂的酶活性标化为100％。在D中，有MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA的酶活性标化为1个任意单位(arbitrary Unit)。

图10表示共价连接的大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)的亲和层析。……：280nm的吸光度，反映洗脱物的蛋白质浓度。-□-□-□-：以S-2586作底物的肽水解活性。以405nm吸光度的变化给出。-○-○-○-：以S-2288作底物的肽水解活性，以405nm处吸光度的变化乘10倍给出。

图11表示图10所示层析的级分2、6和10的SDS-PAGE和考马斯兰染色(A)以及有共聚的酪蛋白的SDS-PAGE后的酶图(B)。左边为分子量标记。B中：1，能被亮肽素(160μM)抑制的酪蛋白水解成分组。C，能被抑糜朊酶素(40μM)抑制的酪蛋白水解成分组。

图12表示用在SBTI-Affigel 15上亲和层析纯化的SCCE的SDS-PAGE，12.5％的凝胶。1：未还原的样品，2：还原样品。左边为分子量标记。

图13表示SCCE的N端氨基酸序列。^*表示7位和9位上被推定的Cys的不确定性。？表示检测不到氨基酸衍生物但其在后续步骤的产率中没有降低的位置。

图14表示借助免疫沉淀法和免疫印迹法描述的单克隆抗体TE4b和TE9b的特征。

a：考马斯兰染色的12.5％SDS-PAGE，非还原条件。

泳道1：分子量标记

泳道2：如实施例3.1所述制备的分离的足底角质细胞之KCl提取物。

泳道3：如实施例4.1所述通过对不溶的大豆胰蛋白酶抑制剂进行亲和层析纯化的SCCE。

b：在具有0.1％共聚的热变性酪蛋白之12.5％SDS-PAGE中的免疫沉淀物的酶图，用考马斯兰染色的凝胶。

泳道1：分子量标记。

泳道2：KCl提取物，如a所述透析。

泳道3-6：(从左→右)具有moab TE4b(20μg)、moabTE 9b(10μg)、moab PZ(10μg)和磷酸盐缓冲的盐水的溶解的免疫沉淀物。Moab PZ是抗妊娠区带蛋白质的IgG₁-Kappa型单克隆抗体，用作不相关的阴性对照。

c：来自12.5％SDS-PAGE的免疫印迹(非还原条件)。

泳道1：用碱性磷酸酶结合的亲合素(BioRad)检测的生物素化的分子量标记，在泳道2、4和6中电泳的样品同a中的泳道2，在泳道3、5和7中电泳的样品同a中的泳道3。

泳道2和3：第一抗体为moab TE4b，0.2μg/ml。

泳道4和5：第一抗体为moab TE9b，0.1μg/ml。

泳道6和7：第一抗体为moab PZ，0.1μg/ml。

a-c中的箭头表示相对分子量分别为(从上至下)93、66、45、31、22和14KD。

图15表示质粒pS 500。该质粒含有克隆到pUC19中的全长人SCCE cDNA。详细说明可参见实施例6。

图16表示从人表皮制备的mRNA的Northern印迹。每泳道使用相当于约100g总RNA经Poly-T纯化的RNA。1：与从SCCE-cDNA的1070bp Hinc 2/Hinc 2片段制备的探针杂交。2：与从SCCE-cDNA的655bp Hinc 2/Bgl 2片段制备的探针杂交。

图17

a.考马斯兰染色的SDS-PAGE，12.5％的凝胶。1和2：超声处理TG 2细胞的PBS-Triton X-100不溶性细胞沉淀物，该TG 2细胞是分别经pS510和pS511转化并经IPTG诱导的。3：从人足底角质层纯化的SCCE。

b.用鸡免疫前血清(1-3)和鸡抗-SCCE(4-6)进行的免疫印迹。1和4：用pS510转化并用IPTG诱导的TG 2细胞。2和5：用pS511转化并用IPTG诱导的TG 2细胞。3和6：从人足底角质层纯化的SCCE。

通过在含巯基乙醇的样品缓冲液中煮沸来制备样品。

图18表示表达载体pS507的环形图。该载体如实施例9所述构建。它介导重组人SCCE在哺乳动物细胞中的表达。

图19表示对pS507中的重组人SCCE基因在哺乳动物细胞中表达的分析。

泳道1：得自C127细胞的RNA。

泳道2：从用pS507转染的C127细胞的分离克隆(1∶24)中得到的RNA。

泳道3：从用pS507转染的C127克隆的群体混合物中得到的RNA。

泳道4和5：用表达载体pS147转染的C127细胞的RNA，pS147除了缺乏SCCE cDNA序列外与pS507相同。分子量标记在左侧指示。

图20表示在C127细胞中表达的SCCE在SDS-PAGE后进行免疫印迹。

泳道1和6：预染的分子量标记(Bio-Rad，106，80，49.5，32.5，27.5和18.5KDa)。

泳道2：pS507/C 127，混合，T-烧瓶。

泳道3：pS507/C 127，混合，roller A。

泳道4：pS507/C 127，混合，roller B。

泳道5：阴性对照pS522/C 127。

泳道7：由角质层制备的天然SCCE。

泳道8：pS507/C127，克隆24，T-烧瓶。

泳道9：pS507/C127，克隆24，roller A。

泳道10：pS507/C127，克隆24，roller B。

图21表示从含有携带质粒pS507的细胞之C127细胞培养物培养基中纯化的重组SCCE的SDS-PAGE(A)和免疫印迹(B)。

泳道1和5：预染的分子量标记(Bio-Rad，106，80，49.5，32.5，27.5和18.5KDa)。

泳道2：纯化前的细胞培养基。

泳道3：从层析法中收集的未结合物。

泳道4：用低pH缓冲液洗脱的结合物。

图22表示在酪蛋白聚丙烯酰胺凝胶上测定天然SCCE和活化的活性重组SCCE的活性。

泳道1和10：分子量标记(Pharmacia 14-94KDa)。

泳道2：天然SCCE。

泳道3：天然SCCE。

泳道4-6：分别裂解1小时、3小时及过夜的重组SCCE(460ng/孔)。

泳道7：与泳道4-6的样品中相同量的胰蛋白酶，但不含APMSF。

泳道8：与泳道4-6的样品中相同量的胰蛋白酶，也含有所述样品中相同量的APMSF。

泳道9：同泳道3。

图23表示用N-糖苷酶F处理的天然和重组SCCE的免疫印迹。如上所述，样品在8-18％SDS-PAGE中分离，然后进行免疫印迹分析。

泳道1：分子量标记。自上而下分子量分别为106，80，49.5，32.5，27.5和18.5KDa。

泳道2和3：重组SCCE，含量分别为0.3μg和3μg。

泳道4和5：天然SCCE，含量分别为1.5μg和1.8μg。泳道3和5中的样品都用N-糖苷酶F

处理过。

实施例1

细胞从皮肤的角化表层的表面脱落之证据包括桥粒蛋白质降解并且起此作用的酶(responsible enzyme)似为能被Zn²⁺抑制的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

1.1.角质层脱屑

本研究的目的是阐明负责细胞粘连和皮肤角化层(角质层)表层细胞分离(脱屑)的机理的性质。从具有正常皮肤的志愿者足跟下与皮肤表面平行地切取一片0.3-0.6mm厚的角质层。该组织片被置于含0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲的盐水中，于室温下浸泡3小时，然后从在体时朝外的表面刮除疏松附着的细胞。再与组织表面垂直地切取1mm厚的切片，正好在培养基胶化之前(因为该培养基含琼脂糖)将切片放入含0.1M tris-HCl pH 8、含0.1％叠氮化钠的5mM EDTA和0.45％琼脂糖的培养基中。于37℃温育0、5和15小时后，将含组织的凝胶片置于干冰上冷冻。在低温控制器中与皮肤表面垂直地切取20μm的低温控制器切片，将其固定于载片上，用相差显微镜检查。观察到体外温育的足底角质层片的连续单极细胞脱落(图1)。细胞只从在体时朝外的组织表面脱落。因此所观察到的过程模拟了脱屑。

1.2.温度、pH和酶抑制剂的作用

于是开发了定量细胞脱落的方法，以使对各种参数如温度、pH和酶抑制剂的作用进行研究。用活组织检查钻取器从得自如上文1.1所述并不含疏松附着的表层细胞的组织片制备直径为3mm的足底角质层圆柱体。所得的圆柱体(具有所限定大小的、在体时朝外的表面)在装有0.5ml培养基的1.5ml Eppendorf微型离心管中于37℃温育5、10和20小时，所说的培养基含有0.1M tris-HCl pH 8，5mM EDTA、0.1％叠氮化钠和含或不含抑肽酶(4×6^-6mol/l)(Boehringer Mannhem，Germany)，然后在涡旋混合器中振荡10秒钟以释放分离的表层细胞。移出剩余组织，置于新鲜培养基中继续温育。装有释放细胞的离心管以5000g离心2分钟以收集细胞。用0.5ml磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀物一次，然后再用0.6ml 1M NaOH于60℃处理1.5小时。碱性可溶性蛋白用Lowry等人的方法(1951)定量，并作为对被释放细胞量的检测。检测结果如图2所示。

以类似方式研究了各种可能性抑制剂(抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制素(Boehringer Mannheim，Germany))和碘乙酰胺(Sigma，St.Louis，MQ)的作用。制备单个的2mm组织圆柱体，与含或不含如下表1所示浓度的各种可能性抑制剂的培养基一起在37℃温育16小时，用如上所述方法对被释放的细胞定量。应注意到，作为金属蛋白酶抑制剂的EDTA也包括在温育培养基中，以产生最理想的细胞释放率。

表1

蛋白酶抑制剂对离体的足底角质层细胞释放的影响。

5片温育组织片的均值和SD。

发现丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶和大豆胰蛋白酶抑制剂能有效地抑制细胞脱落(图2和表1)。因为这两种物质有抑制作用，但金属蛋白酶抑制剂(EDTA)、硫醇蛋白酶(碘乙酰胺)和天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶抑制素)却没有这种抑制作用，所以得出结论，丝氨酸蛋白酶参予了所观察到的过程。由此还可以认为角质层的细胞粘连依赖于蛋白质结构，而且类似于离体观察到的机理一定也在在体脱屑过程中起作用

在对足底角质层的离体细胞脱落过程的进一步研究中发现，该过程可分为两个不同的步骤。第一步的发生无论温育培养基中是否存在EDTA。第二步仅发生于有EDTA存在的情况下。第一步除受抑肽酶的抑制外，还可被抑糜朊酶素和Zn²⁺抑制。第二步能被抑肽酶和抑糜朊酶素的抑制

抑糜朊酶素是一种具有胰凝乳蛋白酶样底物特异性的低分子量蛋白酶抑制剂。而且已发现

具有胰蛋白酶样底物特异性的低分子量蛋白酶抑制剂亮肽素对离体的细胞脱落没有影响。

极可能负责角质层的细胞粘连的蛋白质结构，和因此而成为在上述脱屑样细胞脱落中退化的可能的考虑成分即为桥粒。桥粒由位于邻接细胞上的两个对称部分组成。这两半部分由称为desmoglein的跨膜蛋白在胞外间隙相连。

1.3.离体细胞脱落过程中desmoglein I(DG I)的命运

研究了离体足底角质层细胞脱落过程中DG I的命运。如上文1.1所述培养足底角质层，将仍然粘连的组织与分离的细胞分开，在含有0.1M Tris-HCl pH 9，9M尿素、2％十二烷基硫酸钠(SDS)、1％巯基乙醇的缓冲液中于37℃抽提细胞和组织15小时(1ml缓冲液/20mg组织)。所制备的提取物根据Laemmli的方法(Laemmli，1970)在存在SDS的7.5％凝胶中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后电转移(Towbin et al.，1979)至硝化纤维素膜(Bio-Rad，Richmond，CA)，该膜用抗自牛鼻口部纯化的DGI的兔多克隆抗血清探针标记(Gorbsky et al.，1985)。用碱性磷酸酶结合的羊抗兔免疫球蛋白(Bio-Rad，Richmond，CA)检测被结合的抗体(Blake etal.，1984)。

实验结果如图3所示。将加至免疫印迹中的样品量调节到对于粘连组织和分离的细胞产生大约相同的蛋白质浓度(如通过肉眼观测考马斯兰染色的SDS-PAGE凝胶来估计)。将提取物的几种稀释液进行电泳，以可能对粘连的角质层和分离细胞中不同的抗DG I反应性成分的量进行半定量性比较。

在分别提取粘连组织和分离细胞时发现，仍然粘连的组织只含有外观完整的DG I，而分离的表面细胞只含有推测的该蛋白质的降解产物(图3)。

图4和图5显示了在离体的足底角质层细胞脱落过程中抑肽酶、Zn²⁺、抑糜朊酶素(Baehringer，Mannheim，Germany)和亮肽素(Baehringer，Mannheim Germany)对DG I降解的影响。

首先，研究了时间过程和抑肽酶对进行离体细胞脱落的足底角质层中DG I降解的影响。如上文1.2中所述在缺乏或存在抑肽酶(15μM)的条件下培养足底角质层的提取物(抽提前先不把粘连组织与分离细胞分开)并分别在0、6、12或24小时后进行提取。如上所述进行SDS-PAGE和免疫印迹。在Shimadzu CS-9000扫描点扫描仪(Shimadzu，kyoto，Japan)用560nm处的反射光以Z形方式进行免疫印迹物的光密度体扫描。结果如图4所示。注意到抑肽酶对DG I降解的有效抑制作用。

然后，研究了Zn²⁺、抑糜朊酶素和亮肽素对离体细胞脱落过程中足底角质层的DG I降解的影响。上文已概述了实验设计。与浓度为0、1或5mM的ZnSO₄及330μM的抑糜朊酶素或亮肽素一起培养24小时。其结果表明了Zn²⁺和抑糜朊酶素对抗DG I阳性成分从160KD转变成95和80KD的抑制作用，而亮肽素则无此作用。

这些结果表明抑肽酶、Zn²⁺和抑糜朊酶素都有抑制作用，而亮肽素则无。因此，DG I降解的抑制图谱与离体足底角质层细胞脱落的相同

据认为，证明类似于负责足底手掌(palmo-plantar)角质层细胞脱落的机理也存在于除了

及足底外的身体其它部位的皮肤角质层中是很重要的。Takahashi等人(Takahashi et al.，1987)已报道去污剂N，N-二甲基十二烷胺氧化物(Sigma，St.Louis，MO)和十二烷基硫酸钠(Bio-Rad，Richmond，CA)之8∶2(摩尔比)混合物在导致经胰蛋白酶消化整个表皮所制备的非手掌足底(non-palmo-plantar)角质层中的细胞分离。为了避免外源性胰蛋白酶的污染，将得自正常人臀部皮肤的钻取活组织检查物于pH 8与上述去污剂混合物和EDTA一起温育

发现在上述条件下，角质层分离为单个细胞。向温育培养基中加入抑肽酶能防止这一分离过程。由此得出结论，在非足掌足底角质层细胞粘连中也依赖于蛋白质结构，该组织中的脱屑依赖于蛋白质水解，并且该组织含有能催化该蛋白质水解的蛋白酶。因为细胞分离仅涉及到角质层而不涉及较深的非角化表皮层，所以可以得出这样的结论，有关的责任蛋白酶以非活化或被抑制状态存在于深层。

实施例2

角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)的发现：该酶是一种蛋白酶，所符合的标准是负责降解离体并且也可能是在体的角质层中细胞间的粘连结构。

从实施例1中所述的实验可以得出结论，负责足底角质层脱屑离体模型中单极表面细胞分离的蛋白酶应该具有下列特性：

1.必须存在于角质层。

2.必须是丝氨酸蛋白酶。

3.应该具有胰凝乳蛋白酶样底物特异性和类似于在离体的细胞脱落和相关的DG I降解中所观察到的抑制剂图谱。

4.必须定位在角质层的细胞外。

5.必须具有使其在生理条件下有活性的pH值依赖性，角质层的pH值大约为4.5-6。

6.因为即使温育培养基的体积与被温育的组织片相比很大，或者即使在温育过程中反复地更换温育培养基，离体足底角质层的细胞脱落过程仍然不断进行，因此似乎有理由假设有关的责任酶在温育过程中以不使之被抽提至温育培养基中的方式与所说的组织结合。

下面的两个实验导致发现了SCCE(Egelrud and Lundstrom 1991)：

2.1.与分离的足底角质细胞相关的酶活性

借助如实施例1所述的培养足底角质层的方法制备分离的足底角质层细胞(角质细胞)。所说细胞经筛孔大小为100μm的尼龙网过滤，然后用10体积的0.1M Tris-HCl pH 8、5mM EDTA洗3次，用0.1M Tris-HCl pH 8洗3次。再将细胞与下列两类产色素的蛋白酶底物S-2288或S-2586(Kabi Diagnostica，Stockholm，Sweden)一起温育：Ile-Pro-Arg-对硝基苯胺(S-2288)被具有精氨酸特异性的广谱丝氨酸蛋白酶裂解(例如胰蛋白酶)；Arg-Pro-Tyr-对硝基苯胺(S-2586)是胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的底物。

在120μl总体积中，每一反应混合物含0.07M Tris-HCl pH 8，0.1％叠氮化钠，1、2.5、5或10μl被洗过的足底角质细胞之25％悬液和1.04mM(S-2586)或1.25mM(S-2288)底物。在微量滴定板中于37℃温育5小时后，加入125μl 10％乙酸中止反应。沉积细胞，取每一上清液200μl转移至新孔中。在Behring ElisaProcessor(Behringwerke，Marburg，Germany)中除去细胞后水解两种底物，随后检测405nm处吸光率的改变。

如图6所示，存在与分离的足底角质细胞相关的酶活性，能催化S-2586水解。相比之下，其对S-2288的催化活化要低一些。

其后研究了S-2586水解活性的pH依赖性。如上所述的实验设计，应用了10μl洗过的足底角质细胞的25％悬液和具有不同pH的缓冲液(乙酸钠、磷酸钠或Tris-HCl)。最终的缓冲液浓度为0.07M。结果如图7所示。从中可以看到，pH 7-8时的活性很理想，但在pH5.5时也有效。

在进一步的实验中，研究了EDTA、金属离子和蛋白酶抑制剂对与悬浮的足底角质层细胞相关的蛋白酶在pH 8时水解S-2586的影响。上文及表2概述了实验设计。

表2

EDTA、金属离子和蛋白酶抑制剂对与足底角质层细胞有关的蛋白酶水解S-2586的影响(酶源：悬浮细胞)

^a存在于测定混合物中的物质。

^b如上文所述制备的足底角质层细胞之25％悬液在溶于2-丙醇(2-丙醇终浓度为4％v/v)中的1mM PMSF(Sigma，St.Louis，MO)存在的条件下于室温预温育1小时。对照只与4％2-丙醇预温育。

^c抑制剂溶解于二甲亚砜(DMSO)。所有的培养(包括对照)含5％(v/v)DMSO

如表2所示，除了亮肽素(一种胰蛋白酶抑制剂外)，苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF，一种通用的丝氨酸蛋白酶抑制剂)、抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、抑糜朊酶素(一种胰凝乳蛋白酶抑制剂)和Zn²⁺都抑制S-2586的水解活性。因此，其抑制剂图谱非常类似于在离体细胞脱落和DG I的有关降解过程中所观察到的。

2.2.分离的足底角质层的酶图

已经了解到，在用溶于0.1M Tris-HCl pH 8中的1M KCl抽提角化细胞时，上文2.1中所发现的负责S-2586水解活性的酶可溶。因此，进行了有关酶图的实验。为此，除了样品缓冲液中不含还原剂并且不加热样品外，根据Laemmli(Laemmli 1970)的方法制备用于电泳的角化细胞之KCl提取物。还借助用不含还原剂的Laemmli样品缓冲液于室温抽提分离的足底角质细胞的方法制备样品。为了得到酶图，采用改良的Horie等人的方法(Horie et al.，1984)。根据Laemmli的方法在含1％共聚的热变性酪蛋白的12.5％凝胶中进行SDS-PAGE。电泳后，凝胶在含2％Triton X-100的缓冲液中于室温浸泡1小时以除去SDS，然后于37℃温育15小时。再用考马斯兰将凝胶染色。分离的酪蛋白水解酶在兰色背景下显出了清晰的条带。实验详细的过程也可参见图8之附图说明。

实验结果如图8所示。足底角化细胞的提取物含有一个表观分子量大约25KD的主要酪蛋白水解酶。还存在一个分子量约30KD的次要酪蛋白水解酶(在图中不能清楚地看到这些次要成分。但后来发现它们能被亮肽素而不能被抑糜朊酶素抑制)。25KD酶在pH 5.5-8有显著的活性。除了亮肽素外，它能被抑肽酶、Zn²⁺和抑糜朊酶素抑制。它因此而具有与上述S-2586水解活性相同的抑制剂图谱。在凝胶排阻层析实验中(未显示)发现25KD酪蛋白水解酶与S-2586水解活性共层析。

在运用上述2.2相同技术的进一步实验中(未显示)发现非手掌足底角质层含有与足底角化细胞相关的25KD蛋白酶特性明显一致的酶，从现在起，该酶被称为角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)(Lundstrom and Egelrud 1991)。

还有可能得到SCCE以使其在角质层细胞外空间具有活性的方式与足底角质细胞相关的证据。为此，首先证实分离的角化细胞不可渗透辣根过氧化物酶(分子量44KD)。然后证明人纤维蛋白原(分子量340KD)能被角质细胞悬液降解，并且该降解过程能被与SCCE一样的抑制剂抑制。可以排除纤维蛋白原的降解是因为可溶性酶的可能性(Egelrud 1992)。

实施例3

部分纯化角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)和用产色素的底物进行蛋白酶测定

3.1.制备足底角质细胞的KCl提取物

按比例扩大如实施例1所述的分离的足底角质细胞的产量，并制备如实施例2所述含SCCE的洗涤过的足底角质细胞的KCl提取物。

下列表3用图解方式概述了足底角质细胞KCl提取物的制备过程。通过与Society for Swedish Pedicyrists合作收集增生的人足底角质层。只使用经剪切得到的材料。不从脱落紊乱的足收集材料。在加袋之前先在空气中干燥角质层，并装入塑料袋中。在实验室里，将其贮存于-20℃备用。

表3

图示说明分离的足底角化细胞之含SCCE的KCl提取物的制备过程足底角质层50g

为了每一个后续的亲和层析步骤，合并得自两种制备物的提取物1和提取物2。所说的制备物来自50克的各种足底角质层。

3.2.用产色的底物进行蛋白酶测定

比较SCCE、牛胰凝乳蛋白酶和人组织蛋白酶G有关抑制剂抑肽酶、抑糜朊酶素、ZnSO₄和底物特异性的影响。

MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-2586)的贮液用蒸馏水制备，Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Boehringer，Mannkeim，Germany)的贮液用1-甲基-2-吡咯烷酮(温育混合物中溶剂的终浓度为4％)制备，抑糜朊酶素的贮液以二甲亚砜(温育混合物中溶剂的终浓度为1％)制备。从E.Lotti，Geneva，Snitzerland得到人脓痰中的组织蛋白酶G。SCCE的来源是如上所述制备的分离的足底角质细胞之KCl提取物。抑制剂抑肽酶、抑糜朊酶素和ZnSO₄的来源如上所述。

温育过程在微量滴定板中于37℃进行。总温育体积是135μl。每一温育混合物含Tris-HCl pH 8.0(终浓度0.08M)、KCl(终浓度0.2M)、100μl底物溶液、25μl酶源(在0.1M Tris-HCl pH8.0，1.0M KCl中适当稀释)和10μl抑制剂溶液。

图9中，A-C，MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-2586，起始浓度1.2mM)用作底物。D，两种底物的起始浓度为1.2mM。

在温育过程结束时(1.5小时)，向每孔中加入125μl 10％乙酸，以不加酶的温育混合物作空白读取405nm处的吸光率。调整所加酶量，使温育结束时405nm处产生0.3～0.7的吸光率改变。

所得结果总结于图9，A-D。为了研究抑制剂的作用，用S-2586作底物。抑肽酶作为SCCE和胰凝乳蛋白酶的抑制剂的效率较高，且对于两种酶而言大约相等。另一方面，对组织蛋白酶G的影响非常之小(图9A)。抑糜朊酶素导致对所有三种酶的抑制作用，但引起50％抑制作用的抑制剂浓度对于SCCE比对胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶G要高三个数量级(图9B)。ZnSO₄是SCCE的有效抑制剂，但不能有效抑制胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶G(图9C)。图9D比较了三种酶对底物MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-2586)和Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的活性。因为其目的是要找出所测酶之间的相似性和区别，所以这些实验仅在针对每种底物的一种起始浓度下进行。对于胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶G而言，Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA似乎是比S-2586好得多的底物，而对SCCE却正相反。

实施例4

纯化角质层胰凝乳蛋白酶及测定其N-末端氨基酸序列

4.1.通过于不溶性大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)上进行亲和层析从角质细胞KCl提取物中纯化SCCE

图10显示在SBTI上亲和层析的结果。通过按照厂商的推荐将50mg SBTI(Boehringer，Mannbeim，Gernnany)连至12ml沉淀的Affigel 15(BioRad，Richmond，CA)以制备亲和凝胶。凝胶上剩余的活性基团用乙醇胺封闭。将自100克(干重)足底角质层的合并的KCl提取物(总体积700ml)通过铺于玻璃柱中的0.8×2cm SBTIAffigel 15床，流速42ml/h，持续记录洗出液在280nm处的吸光率。用0.1M Tris-HCl pH 8、1M KCl冲洗该柱直至洗出液吸光率低于0.01，然后用10ml 0.1M Tris-HCl pH 8冲洗。用1、10和100mMHCl逐步洗脱结合的物质。当洗出液吸光率的变化降至0.01以下时更换洗脱液。在含有pH 8，总体积0.4ml Tris-HCl的试管中收集3ml级分，直至使其量足以将洗出液的pH调整至7以上。立即检查各级分的pH值，且如果必要可用小量1M Tris-HCl pH 8调节其至7左右。如实施例2.1所述，用S-2586(SCCE的底物)和S-2288(胰蛋白酶样酶的底物)分析肽水解活性。测定混合物中两种底物的初始浓度为1.1mM。约90％的S-2586水解活性结合至凝胶上。在用10-100mM HCl逐步洗脱凝胶时，可以回收所应用的KCl提取物中总S-2586水解活性的约60％。约20％的总S-2288水解活性结合至亲和凝胶上，且在洗出液中可回收10％。

图11显示了在SDS(SDS-PAGE)存在下用聚丙烯酰胺凝胶电泳对SBTI亲和层析的洗出液的分析结果及酶图。在12.5％凝胶上对未还原的样本进行电泳。并请参见Egelrud和Kundstrom 1991以及实施例2、2.2以了解实验的细节。在制备样本进行电泳前，通过用Ultrafree-MC-过滤器(截流分子量10KD；Millipore，Bedford，MA)进行离心过滤将样本在A中浓缩20倍，并在B中稀释10倍。

图12中显示了自SBTI亲和层析的未还原及还原样本SDS-PAGE的比较。如图10和11所示，SBTI亲和层析产生了纯度大于90％(由考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶所判断)、未还原形式时表观分子量约25KD、以还原形式时表观分子量约28KD的蛋白质。另外，存在着表观分子量比主要成分约大1KD的次要考马斯蓝阳性成分。酶图凝胶上，未还原样本存在着与在考马斯蓝染色凝胶上测出的两条带一样，电泳迁移率的一主要条带和一次要条带。这两种酪蛋白水解成分可被抑糜朊酶素抑制。另外，酶图显示了表观分子量约30KD的次要成分，它可被亮肽素抑制。可以得出主要的纯化蛋白为SCCE。

4.2.SCCE N末端氨基酸序列的分析

制备200μl自SBTI-Affigel 15层析的、A 280nm 0.2的级分以进行还原或未还原的SDS-PAGE，将其在12.5％聚丙烯酰胺凝胶(厚1mm，槽宽73mm)电泳。电泳后将分开的蛋白电转移至Immobilon滤膜(Millipore)上，并用考马斯蓝按Matsuidaira(1987)的方法染色。切下主要蛋白带，并将其在具有联机PTH 120A分析仪(AppliedRiosystems Inc.，Foster City，CA，USA)的Apphied Biosystems477A脉冲液相氨基酸序列分析仪中进行处理。以常规循环程序和来自厂家的化学品进行测序。初始及重复的产率(从标准蛋白计算)分别为25％和97％。

氨基酸衍生物的产率只与被测序的一个肽相符。用未还原样本，产率在步骤1-6中较好，但在第七步骤和第九步骤时则降至0。随后的步骤中的产率显著下降。同样用还原样本，在步骤7和9中未检测到氨基酸衍生物，但在后续能检测到衍生物的步骤中产率没有急剧下降。这些结果表明在7位和9位存在胱氨酸。但是，在用碘乙酸(100mM)还原处理后不可能在第7步骤中检测到羧甲基化的半胱氨酸。对于还原的和非还原的样本而言，所获序列是一致的(图13，SEQ ID NO：3)。

实施例5

5.1.SCCE特异性单克隆抗体的制备

将用实施例4.1中描述的方法纯化的、溶于福氏完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)中的约30μg天然SCCE皮下注射给BALB/C小鼠(Bomho ltgaard，Denmark)。一个月后重复注射溶于福氏不完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)中、含有相同量SCCE的注射液。于第一次注射后四个月，给一只小鼠连续3天每次静脉加强注射30μg抗原。用SP 2/0骨髓瘤细胞系(ATCC CRL 1581)的细胞按照Carlsson et al.，1985描述的方法制备杂交瘤。用ELISA技术鉴定与纯化的SCCE制备物反应的抗体。

在SDS-PAGE后用免疫印迹法进一步分析阳性克隆的培养上清液。于小鼠腹水液中增殖与本试验中SCCE产生反应的抗体的克隆，且以蛋白A亲和层析法纯化抗体并以Carlsson et al.，1985描述的方法对抗体进行分类。获得了两种有用的抗体，moab TE4b和moab TE9b，两种抗体均为IgG₁-Kappa。

用免疫沉淀法和免疫印迹确定的moabs TE4b和TE9b的特征示于图14中。图14a(2泳道)显示了含分离的足底角质细胞的浓缩KCl提取物的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶，所说细胞提取物按实施例3.1中的描述制备。将样本用0.1M乙酸钠pH 4透析4小时，并在制备用于电泳前用超滤法将其浓缩约100倍。图14a(3泳道)显示了按实施例4.1中的描述纯化的SCCE的制备物。

图14b显示了免疫沉淀实验的结果，实验中，抗体与角质细胞KCl提取物温育一段时间，然后与不溶性蛋白A一起回收。用实施例2中描述的酶谱法分析重新溶解并分离的抗原抗体复合物。

将250μl分离的足底角质细胞KCl提取物与10μl抗体溶液或磷酸盐缓冲液混匀并温育(于4℃)15小时，所说提取物已被超滤浓缩5倍，且用磷酸盐缓冲液进行了透析并向其中加入牛血清白蛋白(Sigma，St.Louis，MO)至终浓度为每毫升10mg。然后将25μl沉淀的蛋白A Sepharose(Pharmacia，Uppsala，Sweden)加至试管，于室温下轻摇继续温育2小时。离心回收凝胶，用1ml溶于0.05MTris-HCl(pH 7.5)、0.5M NaCl中的0.05％Tween 20(Sigma，St.Louis，MO)洗5次。最后一次冲洗后，于室温下用100μl不含还原剂的Laemmli′s样本缓冲液对凝胶进行抽提1小时。离心澄清提取物并加至凝胶上。

Moabs TE4b和TE9b两者均能沉淀与纯化的SCCE具有相同分子量的酪蛋白水解酶以及KCl提取物中相应的主要的酪蛋白水解酶。这些抗体不能沉淀提取物中分子量约30KDa的次要的酪蛋白水解酶，这些酶已表明可被亮肽素(胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的一种抑制剂)所抑制。除25KDa酪蛋白水解酶外，所说抗体似乎可与分子量约80KDa的次要的蛋白水解成分结合。该成分通常存在于从制备前已干燥的组织中制得的足底角质细胞KCl提取物中，但在新鲜的组织制备物中未能发现(T.Egelrud，未发表的观察结果)。它在通过亲和层析纯化的SCCE制备物中也不存在，且可能代表了一凝集的产物。已不可能在免疫印迹中检测出与抗体反应的相应成分。

在于非还原条件下进行的SDS-PAGE凝胶的免疫印迹上(图14c)，moabs TE4b和TE9b可与存在于足底角质细胞KCl提取物中的成分反应(图14c泳道2和4)以及与纯化的SCCE制备物中存在的成分反应(图14c泳道3和5)，两者与酶谱上主要的纯化蛋白以及主要的酪蛋白水解成分具有相同的分子量。抗体与在SDS存在下已还原的样本不反应，这表明它们针对的是构象依赖性抗原决定簇。

除分子量约25KDa的以非还原形式存在的主要的蛋白质外，纯化的SCCE制备物还含有分子量约26KD的次要的考马斯阳性成分(非还原的；参见实施例3)。酶谱上存在一相应的酪蛋白水解成分且能被抑糜朊酶素以相似于主要的25KD酪蛋白水解成分的方式抑制(参见实施例3)。在moabs TE4b和TE9b较高浓度(结果未显示)时，也可见该次要成分与免疫印迹上的抗体反应。用针对以制备性电泳纯化的主要考马斯阳性成分的多克隆兔抗体已获得相似的结果(未显示)。还不知道具有SCCE样活性和表现免疫交叉反应的两种蛋白之间确切的关系。

5.2.多克隆SCCE特异性抗体

5.2.1.鸡抗SCCE

于60℃将溶于0.2ml 0.1M Tris-HCl中通过实施例4.1中描述的SBTI亲和层析法纯化的45μg SCCE加热变性60分钟，并在等体积的福氏完全佐剂(Difco Laboratories)中搅匀。将得到的乳剂给约20周龄的Derco鸡进行皮下注射，注射前先从鸡中抽血以制备免疫前血清。于3、5和7周后，给鸡另外皮下注射按上述方法制备的乳剂，但该乳剂为含福氏不完全佐剂和30μg纯化的热变性的SCCE(各乳剂的总体积为250μl)。最后一次注射2周后取鸡血。将血迅速与2体积的Alsever′s液(每100ml∶100ml 1.87克葡萄糖、0.8克柠檬酸钠、0.62克氯化钠，柠檬酸调整pH至pH 6.1)混和并离心。将经1/2000稀释的选为进一步研究用的鸡抗SCCE用于免疫印迹的实验中。参见图17、实施例8说明该抗血清的特异性。

5.2.2.兔抗SCCE

根据Laemmli 1970的方法，将SBTI亲和层析纯化的SCCE如实施例4.1描述的、在厚15mm的凝胶上进行未还原的SDS-PAGE。按照Lee，et al，1987的氯化铜染色法看见了以前显示为SCCE的主要蛋白质条带，将其切下。根据Lee et al，1987的方法，用EDTA去除氯化铜之后，在磷酸盐缓冲液中将凝胶片均化。搅匀的凝胶片样本悬于等体积的福氏佐剂中。将约30μg按此种方法制备的、溶于完全佐剂中的纯SCCE皮下注射给兔。3、5和7周后以同量SCCE重复注射，但是是用不完全佐剂。最后一次注射后2周取兔血。

将所得兔抗SCCE(D-5)以1/500-1/1000的稀释度用于以碱性磷酸酶连接的从抗兔免疫球蛋白作为第二抗体的免疫印迹实验中。

在所有的免疫印迹实验中，按照Blake et al.1984的方法检测结合的第二抗体(参见实施例5、8和9)。

以同样的方法制备兔抗SCCE Bo-1，但用在SDS-PAGE之前已被还原的SCCE作为抗原。

5.3.用单克隆抗体进行免疫组化研究

在用SCCE特异性单克隆抗体进行的免疫组化研究中，可在人角化鳞状上皮的高基底上细胞(表皮、毛囊的内根层(inner rootsheet)、硬腭)检测出，但在非角化鳞状上皮(毛囊的内根层、嘴唇以及颊粘膜)中不能被检测出。因此SCCE可在角化鳞状上皮中特异性表达。而且，发现SCCE在体外重新构建并在气—水交界面生长的人表皮的高基底上细胞中表达。当向培养基中加入视黄酸使其浓度达到能刺激角化细胞增殖但抑制角质层形成时，SCCE不再表达。这表明SCCE表达可能是表皮分化过程的一部分。

用SCCE特异性单克隆抗体进行的免疫电镜实验的结果与SCCE在桥粒降解以及脱屑中的作用相符。抗体特异性地标记了向最上层囊泡细胞与最下层角质层细胞内空间进行分泌的层状体(lamellarbodies)，而在角质层中，抗体识别出细胞外空间中与桥粒密切相关的抗原决定簇。

实施例6

编码人SCCE的cDNA的克隆与测序

从Promega(Madison，MI)获得限制性酶，从Perkin-Elmer-Cetus(Norwalk，CT)获得TAQ-聚合酶。从Clontech Laboratories(Palo Alto，CA)获得成人上皮来源的角质细胞mRNA制备的λgt11人角质细胞cDNA文库。起初，用抗SCCE兔多克隆血清D-5和Bo-1(见实施例5.2.2)筛选该文库。由于Bo-1多克隆抗SCCE血清产生高的背景信噪，所以早期即将其排除在更深入的筛选研究之外。正如对真正的阳性斑所估计的，用D-5抗血清富集了许多免疫反应斑。对于任何噬菌斑，未观察到与单克隆抗体moAb 4和moAb 9的反应性。11个已分离的噬菌斑的广泛的限制性酶特征以及PCR特征显示在不同的噬菌斑间未测到相似性。这种部分相似性的存在表明噬菌斑含有来自同一cDNA序列的同源DNA插入片段。基于不能对可探测SCCE cDNA序列的“指纹”作出定义，对策略进行了修改。

利用变性的合成寡核苷酸作为探针，借助噬菌斑杂交法在E.coli Y 1090(Clontech)中筛选噬菌斑。基于如实施例4.2描述的、经实验确定的天然SCCE酶的氨基末端序列设计寡核苷酸探针。为构建称为SYM 3067，SEQ ID NO：4的合成17-聚体寡核苷酸探针5′-ATHATHGAYGGNGCNCC-3′(H＝A或C或T；Y＝C或T；N＝A或C或G或T)，选择了氨基酸序列最可靠的部分Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro(SEQ ID NO：3，aa1-aa6)。利用Beckman200A DNA合成仪，根据商家说明用亚氨基磷酸酯(phosphoramidite)合成寡核苷酸探针。

在含0.2％麦芽糖和10mM MgSO₄的LB培养基中过夜培养E.coliY 1090菌(Sambrook et al.1989)。然后用稀释的文库噬菌体贮存液与0.4ml的培养物混和并于37℃吸附20分钟。将受感染的培养物与6ml软质琼脂糖(在LB和10mM MgSO₄中的0.75％琼脂糖)混和。将软质琼脂糖混和物倾至10个150mm LA平板上。于37℃将这些平板温育5小时，放置4℃下过夜。这些平板含总数约为4×10⁵的噬菌斑。

为使这些噬菌斑固定，将每个平板上覆盖NEN DuPont Colony/噬菌斑筛选膜(DuPont，Wihnington，DE)2分钟。将膜浸入0.5MNaOH中2分钟2次，浸入Tris-HCl pH 7.5中2分钟2次，然后空气干燥。然后将这些膜如下文所述用于杂交实验中。将膜在10％硫酸葡聚糖、1M NaCl、含10mg/ml变性鲱鱼精子DNA(Sigma，St.Louis，MO)的1％SDS溶液中于65℃预杂交5小时。将探针(SYM3067)用T4聚核苷酸激酶(Promega，Medison，WI)标记上[λ-³²P]dATP，然后加至预杂交混和物中。于42℃进行杂交12-18小时。

杂交后于室温下在2×SSC中洗膜5分钟，共四次，在2×SSC、1％SDS中于42℃洗膜30分钟，共2次；最后于室温下在0.1SSC中洗膜30分钟。用X光片(Hyperfilm-MP，Amersham，UK)对膜进行放射自显影。在初次筛选中鉴定出14个阳性噬菌斑。按上文描述的方法和用同样的探针，对这些阳性噬菌斑再次筛选。再次筛选过程后鉴定出两个阳性噬菌斑。再一次纯化这两个已筛出的噬菌斑，用SYM 1600和SYM 1601作为引物，用已分离的噬菌体作为模板，通过PCR测定插入片段的大小。这两个引物分别与λgt11噬菌体的左臂和右臂互补。然后用EcoRI消化由噬菌体A 6.2.2产生的约0.9kb的扩增DNA片段并克隆入EcoRI消化的pUC19(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pS496中。用与pUC19互补的序列引物时该已克隆的片段进行部分序列分析。用T7测序盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden或USB，Cleveland，Ohio)测定核苷酸序列。

所得DNA序列的翻译产生了与实验确定的蛋白序列同源的氨基酸序列。然而，该序列缺乏一翻译起始密码子。为分离全长cDNA，在琼脂糖凝胶上分离所得的DNA片段，并在严格的条件下用其作为杂交的探钟。按下述步骤用多引物(multiprinme)DNA标记系统(Amersham，UK)对该探针进行³²P  标记。以每克凝胶3ml的比例加入水，然后置入沸水浴中7分钟以溶化凝胶并使DNA变性。然后将试管转至37℃的水浴中放置至少10分钟。按商家的说明将含约25ng DNA的一个体积DNA/琼脂糖溶液加至标记反应中。

为得到全长cDNA，用上文描述的同样方法以该探针对cDNA文库再筛选2次，除杂交是在65℃于严格条件下进行外。这些实验导致了45个单个阳性噬菌斑的鉴定与分离，这些阳性斑起初是用SYM1600(5′-GTG GCG ACG ACT CCT GGA GCC-3′；SEQ ID NO：5)或SYM 1601(5′-ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3′；SEQ ID NO：6)与SYM 3208一起作为PCR引物(以鉴定含整个5′开放阅读框的噬菌斑)，用PCR分析进行筛选的。根据从pS496获得的DNA序列信息，设计了至少部分与SCCE cDNA 5′部分互补的SYM 3208，5′-TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3′，SEQ ID NO：7。此次筛选后，选出四株噬菌体进行进一步分析。为了序列分析，按上文所述，将源自这些噬菌体的所产生的PCR扩增片段克隆至pUC 19中。所得结果表明其中的一株噬菌体205.2.1含有全长的插入片段。

根据Sambrook et al.(1989)制备噬菌体分离物205.2.1的DNA，用EcoRI消化该DNA制备物。用琼脂糖电泳分离消化的DNA，分离出约1kb的片段并将其克隆至EcoRI消化的pUC 19中。所产生的质粒称为pS500(图15)。按上文所述测定该cDNA片段的完整核苷酸序列。作为测序反应的引物，应用了互补于pUC 19或SCCE序列的特异的寡核苷酸。该核苷酸序列(SEQ ID NO：1)包含了足以编码由253个氨基酸(包括信号肽和前多聚肽(SEQ ID NO：2))组成的SCCE前体蛋白的全部氨基酸序列。

发现另一株噬菌体106.1.2含有缺乏5′未翻译序列和头三个密码子的SCCE cDNA序列。该插入片段分离为954bp的EcoRI片段并被克隆至EcoRI线性化的pUC 19中，产生质粒pS498。该质粒被部分测序。

发现称为108.1.2的第三株噬菌体含有也缺乏5′未翻译序列和翻译区七个核苷酸的SCCE cDNA序列。将cDNA插入片段具有3′未翻译区较长的变异体，从终止密码子下游延伸1057bp。分离该1884bp的EcoRI片段并将其克隆至EcoRI线性化pUC 19中。对所产生的质粒进行彻底测序并称之为pS501。

实施例7

人表皮中SCCE mRNA的检测

从人表皮中制备总RNA

按照Chomczynski和Sacchi，1987的方法进行此制备。从整形外科手术中得到无病的人腹部皮肤。切除后立即置冰上冷冻。在少于15分钟的时间内，通过用手术刀片有力的刮擦收取表皮，并将其浸入溶液D(Chomczynski和Sacchi，1987)中并用玻璃均浆器进行均化。然后进行由Chomczynski和Sacchi描述的实验方案。于-20℃将颗粒状的总RNA贮于70％乙醇中直至进一步分析。

信使RNA的制备

根据商家的说明，用Poly A Tracf盒(Promega)处理500μg总表皮RNA。

RNA电泳和印迹

用溶于1×MOPS缓冲液中的0.66M甲醛和0.6g/ml溴化乙啡啶(Sigma，St.Louis，MO)制备琼脂糖凝胶(1.4％)。将相应于100μg总RNA的mRNA溶于RNA样本缓冲液(50％甲酰胺，2.2M甲醛，3％Ficoll，1×MOPS)中并在应用前于60℃加热5分钟。用同样方法处理RNA标准物(BRL，Gaithersburg，MD)。电泳后，将凝胶浸入蒸馏水中5分钟，然后浸在50mM NaOH中30分钟和0.1MTris-HCl pH 7.5中30分钟。在10×SSC中用Vacu-Gene设备(Pharmacia，Uppsala，Sweden)进行至GeneScreen Plus膜(NENDuPont，Wilmington，DE)的印迹1小时。然后在3×SCC中洗膜，过夜干燥，于80℃烘焙2小时。于UV光下可在膜上看到RNA。

cDNA探针

将按实施例6的描述制备的质粒pS501用HincII和Bgl II消化。该cDNA在bp No 1060处含一个Hinc II位点，在bp No 1715处含一个Bgl II位点。1070bp片段(pUC 19多克隆位点中Hinc II位点—内源性Hinc II位点)含有除5′端7个bp外的SCCE编码区以及包括于bp 944-951的多聚腺苷酸化位点的未翻译区，该区对已分离的所有SCCE-cDNAs均是普遍的。不含Poly A-尾的655bp Hinc II-Bgl II片段对SCCE cDNA 108-1-2是独特的。用琼脂糖电泳纯化这些片段，且用多引物DNA标记盒(Amersham，Buckinghamshire，UK)将其用于³²P dCTP标记的探针的制备。

杂交

在溶于1×TE的1％SDS中将膜煮沸30分钟并于60℃在1％SDS、1M NaCl、10％硫酸葡聚糖和含鲱鱼精子DNA 0.1mg/ml的溶液中预杂交3小时。于60℃在同样的溶液中杂交过夜。在溶于2×SCC的1％SDS中于60℃洗膜2×30分钟，于室温下在0.1×SCC中洗膜3小时。然后将膜进行放射自显影。

结果：

可以显示出人表皮中存在大小分别为大约1.2kb和2.0kb的两种mRNA(图16)。这与自发现了两种类型cDNA的克隆实验所得到的证据相符得很好。

实施例8

在E.coli中表达重组SCCE

pGEX-2T/SCCE质粒的构建

1.有义PCR引物

1.a CGTGGATCCATCGAAGGTCGTATTATTGATGGCGCCCCATGT(SYM 3367；SEQ ID NO：8，下划线的3′部分编码活性天然SCCE的N端氨基酸IIDGAPC，带BamHI位点和一另外序列的5′部分编码因子Xa位点IEGR)。

1.b CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA(SYM 3368；SEQ ID NO：9，下划线的3′部分相应于完整SCCE-cDNA序列中编码氨基酸序列LETAGEE的碱基对76-96，5′部分如1a)。

2.反义PCR引物

TGATCCTCTGAGCTCTCCTG(SYM 3371，互补于具有于pb294处SacI位点的完整SCCE-cDNA序列SEQ ID NO：1中的碱基对285-304)。

用引物1a/2和1b/2 PCR扩增pS498(实施例6)的序列。借助酸抽提和乙醇沉淀纯化所得产物，并用BamHI/SacI消化和用琼脂糖电泳纯化。然后将其与用SacI和EcoRI消化pS498得到的SCCE106-1-2的3′673个碱基对一起，在TG 2细胞中克隆至用BamHI/EcoRI消化的pGEX-2T(Pharmacia)中。从用于表达研究的细菌克隆中分离到质粒(编码紧邻于因子Xa位点的天然N末端的pS510，和编码紧邻于因子Xa位点的所预计的前肽的pS511)。借助T7测序盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)用双脱氧链终止法检查相应于PCR产物插入片段的核苷酸序列。

表达研究

用新鲜培养基，将生长于含50ng/ml羧苄青霉素(Sigma，St.Louis，MO)LB培养基中的含pS510和pS511的TG 2细胞过夜培养物稀释10倍，并于37℃培养3小时。加入IPTG(Sigma，St.Louis，MO)至终浓度为0.1mM，将培养物在37℃再培养3小时。于PBS 1％Triton X-100(Sigma St.Louis，MO)中超声处理细菌沉淀物。以10,000×g离心15分钟后，用SDS-PAGE分析上清液及沉淀物，且与多克隆SCCE特异性鸡抗血清进行免疫印迹。

在不溶于PBS-Triton X-100的沉淀物中发现了大量的分子量约50KD(pS5100和52KD(pS511)具有SCCE样免疫反应性的IPTG可诱导蛋白(参见图17)。

经在PBS-Triton X-100中超声处理后，上清液含有与在不溶沉淀物中相同大小的GST/SCCE融合蛋白，但其量与不溶沉淀物相比较低。

这些结果表明表达SCCE作为具有GST的融合蛋白是可能的，并且相应于前SCCE原氨基酸序列中特异蛋白酶裂解位点的序列将使重复进行目的为在细菌中产生重组SCCE的这一实验成为可能。产生的蛋白可溶于尿素或盐酸胍中，然后由于SCCE的高等电点，用阳离子交换层析进行纯化。通过将纯化的蛋白质对含较低浓度变性剂的缓冲液进行透析使之变性，然后用因子Xa裂解以从SCCE或SCCE原中释放GST多肽。也可将GST/SCCE融合蛋白用作免疫原以生产SCCE特异性抗体，且也可用作抗体纯化中的免疫吸附剂。

实施例9

哺乳动物细胞中重组人SCCE的表达

为了产生生产重组SCCE的表达载体，从质粒pS500中分离出897bp EcoRI/DraI片段的人cDNA序列。将该片段亚克隆至EcoRI和SmaI消化的pUC 19中，产生pS502。然后用EcoRI和SalI消化质粒pS502以分离出0.9kb片段的SCCE cDNA序列，然后将其再亚克隆至缺失HindIII位点的pUC 19变异体中，形成质粒pS503。该pUC 19变异体是通过用HindIII消化pUC 19、用Klenow酶填平并再连接而产生的。为了便于克隆至表达载体，在SCCE cDNA 5′端导入HindIII位点。这一步骤通过用EcoRI消化pS503并插入将该位点转变为HindIII的接头，SYM 3603 5′-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3′，SEQ ID NO：10。将所产生的质粒称为pS505，该质粒编码于5′末端具有HindIII位点且在3′端具有SalI位点的部分SCCE cDNA的蛋白。

通过将三个不同的DNA片段连接获得最终的表达载体。首先，用HindIII和SalI消化pS505，并分离出0.9kb片段。

其次，为提供调控元件上游的鼠源金属硫因的远端部分、牛乳头瘤病毒序列、提供mRNA加工信号的兔β球蛋白基因组片段以及质粒序列，pML 2d，以便可以在E.coli中进行筛选和复制(Waldenstrom et al，1992)，用SacI和SalI消化载体pS 14)，分离出约12kb的片段。

第三，为分离鼠源硫因启动子近端，用SacI和HindIII消化质粒pS 42，该质粒中位于前导序列中的天然BglII已转变成HindIII位点，分离出约220bp片段。

这三个片段的连接产生了SCCE表达载体pS507(参见图18)。

将表达载体pS507与含有由Harvey肉瘤病毒5′长末端重复序列启动的新霉素抗性基因并带有SV40多聚腺苷酸化信号序列的载体(Lusky and Botchan，1984)共转染至鼠C127细胞(ATCC CRL1616)中。按照磷酸钙沉淀法(Graham and Van der Eb，1973)进行转染实验。于补充有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的Ham′s F 12/Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM；Gibco BRL，Gaithersburg，MD)(1∶1)中培养细胞。以1.5mg/ml的G418(Gibco-BRL)筛选新霉素抗性细胞克隆，在10-15天筛选后，鉴定出抗性细胞克隆并从主盘中分离用于以后进一步分析。

为分析重组SCCE基因的表达，从已分离的细胞系中制备总RNA。从C127细胞中制备总RNA并将其在1％甲醛琼脂糖凝胶上分离，转至硝化纤维素膜并与³²P标记的SCCE探针杂交。探针为由HincII消化pS500及琼脂糖电泳分离得到的SCCE cDNA 1070pb HincII片段。实验过程按Ausubel et al.，1992的方法进行。Northern印迹实验以及以³²P标记的SCCE cDNA进行的杂交表明在含有SCCE载休pS507的几个细胞系中可检测到重组SCCE mRNA。在含有同样载体但除SCCEcDNA外的C127细胞系的对照样本中，未发现杂交(图19)。

1.4kb的大小对应于所预期的大小。

收获条件细胞培养基样本并用免疫印迹分析。根据Laemmli(1970)进行SDS-PAGE，且为了进行免疫印迹，用鸡抗天然SCCE作为检测抗体。用碱性磷酸酶标记的抗鸡IgG(Sigmc，St.Louis，MO)进行酶标。结果示于图20中。

为分析重组SCCE的表达，从以表达载体pS507转染的C127细胞中制备总RNA。从非转染的C127细胞和用表达载体pS147转染的C127细胞中制备作为对照样本的总RNA。载体pS147与pS507相似，只是它含有人胆汁盐激发的脂酶的cDNA(Nilsson et al.，1990)而不是含有人SCCE cDNA。按照Ausubel et al.(1992)的方法制备RNA。

Northern印迹实验以及用³²P标记的SCCE cDNA进行的杂交表明在含有SCCE载体pS507的C 127细胞中可检测出约1.4kb的重组SCCEmRNA(图19)。在来自C127细胞系含pS147的或非转染的C127细胞的对照样本中未发现杂交。重组SCCE mRNA的长度正如预先所料。

收获条件细胞培养基样本并用SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。如Blake et al.1984所述对印迹显影。所得结果(见图20)表明含pS507的C127细胞产生三种蛋白，这三种蛋白显示了可与所有商售可得多克隆兔和鸡SCCE抗体以及如实施例5所述制备的抗SCCE单克隆抗体发生反应。重组SCCE反应性蛋白显示了比纯化的天然的人SCCE大约大1KDa的表观分子量。重组蛋白未显示出任何蛋白水解活性。通过将推断的SCCE氨基酸序列与实验测定的天然的人SCCENH-2末端以及与其它胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的序列进行比较，可以得出C127细胞中产生的重组SCCE是以其酶原形式存在的结论。序列数据表明该酶原可通过序列…AQGDKIIDGAP…中赖氨酸的C末端侧的蛋白水解裂解被激活，下划线的序列为活性天然人SCCE的NH-2序列(SEQ ID NO：2，aa5-aa6)。

实施例10

重组SCCE的纯化及特征确定

纯化

将1.3mg抗天然SCCE的单克隆抗体TE4b按照生产商描述的方法与1.5ml CNBr活化的Sepharose(Phormacia-LKB Biotech.，Uppsala，Sweden)偶联。将40ml含SCCE的培养基通过0.45μm滤器过滤，然后上柱。用10mM磷酸钠、150mM NaCl、pH 7.2，冲洗该柱几次，然后用0.1M甘氨酸盐酸洗脱。立即向洗脱的蛋白中加入0.1体积1M Tris-HCl(pH 8.0)使之中和。

活化

于37℃将以单克隆抗体偶联的凝胶(见上文)纯化的重组SCCE(200μl中含4.6μg)用0.1mg/ml胰蛋白酶4.6μl(质量比10∶1)消化。于20分钟、1小时、3小时和20小时时取样(50μl)，并加入5μl 10μM(4-脒苯基)磺酰甲烷(APMSF；BoehringerMambeim，Germany)终止反应。如实施例2.2描述的在酪蛋白凝胶上进行非还原SDS-PAGE测定裂解的SCCE的活性。通过还原的SDS-PAGE，然后用鸡抗天然SCCE，接着用抗鸡IgG标记了的碱性磷酸酶以及氮蓝四唑和作为碱性磷酸酶底物的5-溴代-4-氯代-3-吲哚磷酸盐所进行的免疫印迹测定所得SCCE裂解形式的一致性。N末端测序

用Bio-Dot SF装置(Bio-Rad，Richmond，CA)将亲和纯化(如上文所述)的SCCE约35μg狭缝印迹(slot-bloued)至Immobilon膜(Millipore，Bedfore，MA)上。然后用蒸馏水洗脱几次以除去所有的Tris和甘氨酸。切下结合有蛋白的那部分膜并用具有联机的PTH 120A分析仪的Applied Biosyslems(Foster City，CA)477A脉冲液相测序仪测序。用常规循环程序及来自厂家的化学品进行测序。获得的序列的头六个位置为glu-glu-ala-gln-gly-asp，它相应于SEQ ID NO：2氨基酸-7--2。从这一结果可以得出结论，信号肽含有22个氨基酸并基于天然活性SCCE的N末端氨基酸序列，前肽含七个氨基酸。

去糖基化

在20μl 0.5％SDS和0.1M β-巯基乙醇中将纯化的重组SCCE(5μg)和天然SCCE(20μg)煮沸3分钟。用磷酸钠缓冲液(pH8.6)和Nonidet P-40稀释样本至终浓度分别为0.2M和1.25％。加入N-糖苷酶F

(Boehringer，Mannbeim)(对重组蛋白加0.6单位酶，对天然蛋白加1.2单位酶)，并于37℃将反应混合物温育过夜。测定样本中SDS终浓度为0.17％。在8-18％SDS-PAGE上分析N-糖苷酶F

处理的SCCE，然后如上文所述进行免疫印迹。所得结果表明靠上方的两条带的表观分子量降低而最下方的条带的表观分子量未变(图23)。这表明C127细胞中产生的重组SCCE以两种糖苷化形式以及一种非糖苷化形式存在。这一结果与用活性天然SCCE所见结果类似(图23)。

实施例11

包含SCCE的组合物

可按照常规药剂技术制备该类组合物，它包括将活性成分彻底与其它成分混和。所有百分含量均以重量计。

包含超过一种活性成分的组合物也在本发明的范围内。因此下述实施例也被解释为包括不只一种活性物质。以相似的方法，名词“SCCE”可被“前SCCE(Pro-SCCE)”替代。包含SCCE以及前SCCE的组合物因而也在本发明的范围内。

SCCE＝天然或重组角质层胰凝乳蛋白酶，选择性地与其它活性化合物结合。

q.s.＝总量足至

霜剂O/W                                    ％

SCCE                                       0.01-20

多乙氧基醚                                 0.5

乳化蜡                                     5

矿物油                                     4

二甲基硅油                                 1

硬脂酸甘油酯                               6

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       0.1

防腐剂                                     q.s.

甘油85％                                   4

丙二醇                                     7

pH调节剂                                   0.01-10

水                                         65-76

可变因素的例子：抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、乳化系统(油相与水相间的比例以及乳化剂的含量和其它相关赋形剂)。

霜剂W/O                                    ％

SCCE                                       0.01-20

鲸蜡醇                                     0.5

羊毛脂                                     5

白矿脂                                     10

矿物油                                     45

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       1

pH调节剂                                   0.01-10

防腐剂                                     q.s.

水                                         15-25

可变因素的例子：抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、乳化系统(油相与水相间的比例以及乳化剂的含量和其它相关赋形剂)。

软膏                                       ％

SCCE                                       0.01-20

羊毛脂                                     15

矿脂                                       58-68

矿物油                                     15

二甲基硅油                                 2

抗氧化剂                                   q.s.

可变因素的例子：抗氧化剂。

搽剂                                       ％

SCCE                                       0.01-20

乳化蜡                                     4

硬脂酸甘油酯                               3

矿物油                                     15

多乙氧基醚                                 0.6

甘油85％                                   3

丙二醇                                     5

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       0.1

防腐剂                                     q.s.

水                                         59-69

可变因素的例子：抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、乳化系统(油相与水相间的比例以及乳化剂的含量和其它相关赋形剂)。

凝胶                                       ％

SCCE                                       0.01-20

三乙醇胺                                   1-5

乙醇                                       10

鲸蜡醇                                     10

纤维素胶                                   5

EDTA                                       0.1

防腐剂                                     q.s.

水                                         59-74

可变因素的例子：凝胶形成剂、抗氧化剂、螯合剂、防腐剂。

溶液，水                                   ％

SCCE                                       0.01-20

pH调节剂                                   0.01-10

鲸蜡醇                                     4

丙二醇                                     5

防腐剂                                     q.s.

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       0.1

水                                         37-89

可变因素的例子：抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、refattening剂、湿润剂。

溶液，乙醇                                 ％

SCCE                                       0.01-20

pH调节剂                                   0.01-10

丙二醇                                     5

鲸蜡醇                                     3

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       0.1

乙醇                                       50-95

可变因素的例子：抗氧化剂、螯合剂、湿润剂。

悬液                                       ％

SCCE                                       0.01-20

Carbomer                                   0.5

纤维素胶                                   0.5

多乙氧基醚                                 0.1

丙二醇                                     5

抗坏血酸                                   0.05

鲸蜡醇                                     4

聚山梨醇酯(商品名)                         q.s.

EDTA                                       0.1

pH调节剂                                   0.01-10

水                                         72-80

可变因素的例子：抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、悬浮剂。

糊剂                                       ％

SCCE                                       0.01-20

矿脂                                       45-55

氧化锌                                     40

矿物油                                     5

抗氧化剂                                   q.s.

可变因素的例子：抗氧化剂、糊剂基质。

帖剂                                       ％

SCCE                                       0.01-20

Cutina LM                                  70-80

肉豆蔻醇                                   5

蓖麻油                                     2

蜂蜡，白色                                 10

矿脂，白色                                 3

抗氧化剂                                   q.s.

可变因素的例子：抗氧化剂、帖剂基质。

喷雾剂—手动                               ％

SCCE                                       0.01-20

pH调节剂                                   0.01-10

乙醇                                       30

甘油85％                                   5

丙二醇                                     5

鲸蜡醇                                     3

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       0.1

防腐剂                                     q.s.

水                                         22-57

可变因素的例子：抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、refattenig剂、湿润剂。

喷雾剂气溶胶溶液                           ％

SCCE                                       0.01-20

pH调节剂                                   0.01-10

异丙基肉豆蔻酸酯                           3

丙二醇                                     5

乙醇                                       48-92

推进剂                                     q.s.

可变因素的例子：refattenig剂、湿润剂。

喷雾剂—气溶胶泡沫                         ％

SCCE                                       0.01-20

蜡                                         3

乙醇                                       50-55

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       0.1

水                                         20-35

推进剂                                     q.s.

可变因素的例子：推进剂、抗氧化剂、螯合剂。

喷雾剂气溶胶乳化剂                         ％

SCCE                                       0.01-20

纤维素衍生物                               1-3

吐温

60                                          1.0

硬脂酸甘油酯                               2.5

山梨酸钾                                   0.2

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       0.1

防腐剂                                     q.s.

pH调节剂                                   0.01-10

水                                         50-95

推进剂                                     q.s.

可变因素的例子：抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、乳化系统(油相与水相间的比例以及乳化剂的含量和相关的赋形剂)。

洗发香波                                   ％

SCCE                                       0.01-20

月桂基硫酸钠                               40

鲸蜡醇                                     3

发泡剂或调理素                             3

氯化钠                                     2

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       0.1

防腐剂                                     q.s.

水                                         43-53

可变因素的例子：香波基质、抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、湿润剂、调理素。

浴用香波                                   ％

SCCE                                       0.01-20

月桂基硫酸钠                               40

鲸蜡醇                                     4

发泡剂或调理素                             3

珠光剂                                     10

防腐剂                                     q.s.

抗氧化剂                                   q.s.

EDTA                                       0.1

水                                         40-50

可变因素的例子：香波基质、抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、添加剂、调理素。

药皂                                       ％

SCCE                                       0.01-20

1-羟乙烷-1，1-二磷酸                       0.2

甘油                                       0.8

椰油及牛脂钠皂                             88-98

添加剂                                     0.7

可变因素的例子：湿润剂、皂基质。

粉剂                                       ％

SCCE                                       0.01-20

滑石                                       65-70

高岭土                                     6

二氧化钛                                   2

碳酸钙                                     8

硬脂酸镁                                   3

玉米或燕麦淀粉                             5-10

可变因素的例子：粉剂基质、防腐剂、质量比。

护发素                                     ％

SCCE                                       0.01-20

鲸蜡醇                                     2.2

烷基三甲基氯化铵                           1.25

辛基十二烷醇                               1

柠檬酸                                     1

EDTA                                       0.1

防腐剂                                     q.s.

抗氧化剂                                   q.s.

水                                         ad 100

可变因素的例子：调理素、防腐剂、螯合剂、抗氧化剂。

以类似的方式制备含有能够抑制或增强SCCE活性之化合物的局部用组合物。

实施例12

重组SCCE的桥粒消化活性

通过带状剥离(tape stripping)至角质层的深层而从皮肤取出了含完整桥粒的角质细胞，用己烷去掉其鳞屑并分成等分试样彻底干燥。取角质细胞等分试样(3mg)用1M NaCl于4℃抽提以溶解固有的蛋白酶，然后用温育缓冲液(0.1M Tris/HCl pH 8.0)充分洗涤以从制备物中除去内源性蛋白水解活性。温育过程在有或无10μg重组SCCE的0.1M Tris pH 8.0中于37℃进行24小时。通过检测桥粒标记蛋白质desmoglein I(DG I)的浓度来证明桥粒被酶消化的事实。这是通过在8M尿素/2％SDS/β-巯基乙醇缓冲液中抽提而从鳞屑中分离DG I，继而用伴刀豆球蛋白A亲和层析纯化所说的DG I糖蛋白。所得的伴刀豆球蛋白A洗脱物用SDS-PAGE进行分级分离，并经电泳转移至PDVF膜上用于免疫印迹。用特异性抗血清鉴定DG I，并用增强的化学发光进行检测。所得结果如表4所示。

表4

表4的结果表明重组rSCCE能在体外测定中降解角质层的细胞内粘性结构。

实施例13

抑制剂对重组SCCE活性的影响

本实施例研究了抑制剂抑肽酶、抑糜朊酶素和硫酸锌对rSCCE的S-2586水解活性的影响。实施设计概要已在实施例3.2.中描述。所得结果如表5所示。

表5

如表5所示，抑肽酶、抑糜朊酶素和Zn²⁺以类似于天然酶的方式抑制重组SCCE的S-2586水解活性。

                                序列表

(1)一般信息：

    (i)申请人：

        (A)姓名：SYMBICOM AB

        (B)街道：PO BOX 1451

        (C)城市：UMEA

        (E)国家：SWEDEN

        (F)邮编(ZIP)：S-901 24

    (ii)发明名称：重组角质层胰凝乳蛋白酶

    (iii)序列数：10

    (iv)计算机可读形式：

        (A)介质类型：Floppy disk

        (B)计算机：IBM PC兼容机

        (C)操作系统：PC-DOC/MS-DOS

        (D)软件：patentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)

(2)SEQ ID NO：1的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：986bp

        (B)类型：核酸

        (C)链型：双

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：cDNA

    (iii)假设：无

    (iii)反义：无

    (vi)来源：

        (A)生物体：人类(Homo sapiens)

    (ix)FEATURE：

        (A)NAME/KEY：CDS

        (B)LOCATION：25..786

    (ix)EFATURE：

        (A)NAME/KEY：sig_peptide

        (B)LOCATION：25..90

    (ix)EFATURE：

        (A)NAME/KEY：mat_peptide

        (B)LOCATION：112..783

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GAATTCCGCG GATTTCCGGG CTCC ATG GCA AGA TCC CTT CTC CTG CCC CTG      51

                           Met Ala Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu

                           -29             -25

CAG ATC CTA CTG CTA TCC TTA GCC TTG GAA ACT GCA GGA GAA GAA GCC     99

Gln Ile Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Glu Thr Ala Gly Glu Glu Ala

-20                 -15                 -10                  -5

CAG GGT GAC AAG ATT ATT GAT GGC GCC CCA TGT GCA AGA GGC TCC CAC    147

Gln Gly Asp Lys Ile Ile Asp Gly Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser His

                  1               5                  10

CCA TGG CAG GTG GCC CTG CTC AGT GGC AAT CAG CTC CAC TGC GGA GGC    195

Pro Trp Gln Val Ala Leu Leu Ser Gly Asn Gln Leu His Cys Gly Gly

         15                  20                  25

GTC CTG GTC AAT GAG CGC TGG GTG CTC ACT GCC GCC CAC TGC AAG ATG    243

Val Leu Val Asn Glu Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Met

     30                  35                  40

AAT GAG TAC ACC GTG CAC CTG GGC AGT GAT ACG CTG GGC GAC AGG AGA    291

Asn Glu Tyr Thr Val His Leu Gly Ser Asp Thr Leu Gly Asp Arg Arg

 45                  50                  55                  60

GCT CAG AGG ATC AAG GCC TCG AAG TCA TTC CGC CAC CCC GGC TAC TCC    339

Ala Gln Arg Ile Lys Ala Ser Lys Ser Phe Arg His Pro Gly Tyr Ser

                 65                  70                  75

ACA CAG ACC CAT GTT AAT GAC CTC ATG CTC GTG AAG CTC AAT AGC CAG    387

Thr Gln Thr His Val Asn Asp Leu Met Leu Val Lys Leu Asn Ser Gln

             80                  85                  90

GCC AGG CTG TCA TCC ATG GTG AAG AAA GTC AGG CTG CCC TCC CGC TGC    435

Ala Arg Leu Ser Ser Met Val Lys Lys Val Arg Leu Pro Ser Arg Cys

         95                 100                 105

GAA CCC CCT GGA ACC ACC TGT ACT GTC TCC GGC TGG GGC ACT ACC ACG    483

Glu Pro Pro Gly Thr Thr Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr

    110                 115                 120

AGC CCA GAT GTG ACC TTT CCC TCT GAC CTC ATG TGC GTG GAT GTC AAG    531

Ser Pro Asp Val Thr Phe Pro Ser Asp Leu Met Cys Val Asp Val Lys

125                 130                 135                 140

CTC ATC TCC CCC CAG GAC TGC ACG AAG GTT TAC AAG GAC TTA CTG GAA    579

Leu Ile Ser Pro Gln Asp Cys Thr Lys Val Tyr Lys Asp Leu Leu Glu

                145                 150                 155

AAT TCC ATG CTG TGC GCT GGC ATC CCC GAC TCC AAG AAA AAC GCC TGC    627

Asn Ser Met Leu Cys Ala GlyIle Pro Asp  Ser Lys Lys Asn Ala Cys

            160                 165                 170

AAT GGT GAC TCA GGG GGA CCG TTG GTG TGC AGA GGT ACC CTG CAA GGT    675

Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Arg Gly Thr Leu Gln Gly

        175                 180                 185

CTG GTG TCC TGG GGA ACT TTC CCT TGC GGC CAA CCC AAT GAC CCA GGA    723

Leu Val Ser Trp Gly Thr Phe Pro Cys Gly Gln Pro Asn Asp Pro Gly

    190                 195                 200

GTC TAC ACT CAA GTG TGC AAG TTC ACC AAG TGG ATA AAT GAC ACC ATG    771

Val Tyr Thr Gln Val Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Asn Asp Thr Met

205                 210                 215                 220

AAA AAG CAT CGC TAACGCCACA CTGAGTTAAT TAACTGTGTG CTTCCAACAG        823

Lys Lys His Arg

                225

AAAATGCACA GGAGTGAGGA CGCCGATGAC CTATGAAGTC AAATTTGACT TTACCTTTCC  883

TCAAAGATAT ATTTAAACCT CATGCCCTGT TGATAAACCA ATCAAATTGG TAAAGACCTA  943

AAACCAAAAC AAATAAAGAA ACACAAAACC CTCAACGGAA TTC                    986

(2)SEQ ID NO：2的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：253个氨基酸

        (B)类型：氨基酸

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：蛋白质

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Ala Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu Gln Ile Leu Leu Leu Ser Leu

-29             -25                 -20                 -15

Ala Leu Glu Thr Ala Gly Glu Glu Ala Gln Gly Asp Lys Ile Ile Asp

            -10                  -5                   1

Gly Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser His Pro Trp Gln Val Ala Leu Leu

      5                  10                  15

Ser Gly Asn Gln Leu His Cys Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Arg Trp

 20                  25                 30                   35

Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Met Asn Glu Tyr Thr Val His Leu

                 40                  45                  50

Gly Ser Asp Thr Leu Gly Asp Arg Arg Ala Gln Arg Ile Lys Ala Ser

             55                  60                  65

Lys Ser Phe Arg His Pro Gly Tyr Ser Thr Gln Thr His Val Asn Asp

         70                  75                  80

Leu Met Leu Val Lys Leu Asn Ser Gln Ala Arg Leu Ser Ser Met Val

     85                  90                  95

Lys Lys Val Arg Leu Pro Ser Arg Cys Glu Pro Pro Gly Thr Thr Cys

100                 105                 110                 115

Thr Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr Ser Pro Asp Val Thr Phe Pro

                120                 125                 130

Ser Asp Leu Met Cys Val Asp Val Lys Leu Ile Ser Pro Gln Asp Cys

            135                 140                 145

Thr Lys Val Tyr Lys Asp Leu Leu Glu Asn Ser Met Leu Cys Ala Gly

        150                 155                 160

Ile Pro Asp Ser Lys Lys Asn Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro

    165                 170                 175

Leu Val Cys Arg Gly Thr Leu Gln Gly Leu Val Ser Trp Gly Thr Phe

180                 185                 190                 195

Pro Cys Gly Gln Pro Asn Asp Pro Gly Val Tyr Thr Gln Val Cys Lys

                200                 205                 210

Phe Thr Lys Trp Ile Asn Asp Thr Met Lys Lys His Arg

            215                 220

(2)SEQ ID NO：3的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：24个氨基酸

        (B)类型：氨基酸

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：肽

    (iii)假设：无

    (v)片段类型：N末端

    (vi)来源：

        (A)生物体：人类(Homo sapiens)

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Ile Ile Asp Gly Ala Pro Cys Ala Cys Gly Ser Xaa Pro Xaa Gln Val

1               5                   10                  15

Ala Leu Leu Ser Gly Asn Gln Leu

            20

(2)SEQ ID NO：4的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：17bp

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

ATHATHGAYG GNGCNCC                                                 17

(2)SEQ ID NO：5的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：21bp

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

GTGGCGACGA CTCCTGGAGC C                                            21

(2)SEQ ID NO：6的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：21bp

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

ACACCAGACC AACTGGTAATG                                             21

(2)SEQ ID NO：7的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：21bp

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

TGGGTGGGAG CCTCTTGCAC A                                            21

(2)SEQ ID NO：8的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：42bp

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TATTATTGAT GGCGCCCCAT GT                     42

(2)SEQ ID NO：9的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：42bp

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TTTGGAAACT GCAGGAGAAG AA                     42

(2)SEQ ID NO：10的信息：

    (i)序列特征：

        (A)长度：18bp

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单

        (D)拓扑学：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

AATTGTGGAA GCTTCCAC                                                18

Claims (23)

1.一种编码一种多肽的核酸，所述多肽的活性形式能降解底物MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-2586)，所述多肽的降解作用受抑肽酶、抑糜朊酶素和硫酸锌抑制，其中所述多肽的氨基酸序列选自：

a)SEQ ID NO：2；

b)SEQ ID NO：2的1-224位氨基酸；

c)SEQ ID NO：2的-7-224位氨基酸。

2.一种表达载体，该表达载体含有权利要求1的核酸，所述表达载体携带并能够介导权利要求1所限定的核酸表达。

3.权利要求2的表达载体，该载体是可复制表达载体。

4.一种命名为pS507的可复制表达载体，该表达载体已根据布达佩斯条约于1993年5月11日保藏于the collection of Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，保藏号为DSM 8282。

5.一种命名为pS500的质粒，该质粒已根据布达佩斯条约于1993年5月11日保藏于the collection of Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH(DSM)，保藏号为DSM 8281。

6.一种携带权利要求2的表达载体的细胞，所述细胞不是动物胚胎干细胞、生殖细胞或受精卵。

7.权利要求6的细胞，其中所述细胞是细菌、酵母、原生动物或得自多细胞生物的细胞。

8.权利要求7的细胞，其中所述多细胞生物的细胞是昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞或细胞系。

9.权利要求7的细胞，其中所述细菌是大肠杆菌。

10.权利要求7的细胞，其中所述多细胞生物是多细胞真菌。

11.一种纯多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：

a)SEQ ID NO：2；

b)SEQ ID NO：2的1-224位氨基酸；

c)SEQ ID NO：2的-7-224位氨基酸；

其活性形式能降解底物MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA(S-2586)，所述多肽的降解作用受抑肽酶、抑糜朊酶素和硫酸锌抑制。

12.一种生产如权利要求11所限定的多肽的方法，该方法包括下列步骤：

(a)将如权利要求1所限定的核酸插入表达载体，

(b)用步骤(a)中产生的载体转化适宜的宿主生物，

(c)在适宜表达多肽的条件下培养步骤(b)中产生的宿主生物，

(d)收集多肽，

(e)任选地使多肽进行翻译后修饰。

13.权利要求12的方法，其中通过包括一个或多个亲和层析步骤和/或其它层析和电泳程序的方法分离所生产的多肽，所述的亲和层析使用固定的天然或重组SCCE多肽或与所述多肽有反应性的抗体。

14.一种药物组合物，该组合物含有权利要求11的多肽。

15.一种化妆品或皮肤护理组合物，该组合物含有权利要求11的多肽。

16.权利要求14或15的组合物，该组合物是适于局部施用的形式。

17.权利要求16的组合物，其为乳液、软膏、洗剂、擦剂、凝胶、溶液、悬浮液、糊剂、帖剂、喷雾剂、香波、皂、头发护理剂或粉末。

18.权利要求11的多肽制备药物组合物的用途，所述的药物组合物用于治疗或预防各种鳞癣、痤疮、牛皮癣或其它炎性皮肤病。

19.权利要求18的用途，其中所述炎性皮肤病是湿疹。

20.一种鉴别对天然SCCE酶活性有作用的化合物的方法，该方法包括使用权利要求11的多肽。

21.权利要求20的方法，其中所述化合物对天然SCCE的酶活性有抑制作用。

22.权利要求20的方法，其中所述化合物能够增强天然或重组SCCE的酶活性。

23.一种鉴别能够将SCCE的酶原形式转化成活性SCCE的化合物的方法，该方法包括使用权利要求11的多肽。

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