DE69434609T2

DE69434609T2 - Acethylhydrolase des Plättchen aktivierenden Faktors

Info

Publication number: DE69434609T2
Application number: DE69434609T
Authority: DE
Inventors: S. Laurence Oakland Cousens; Hai Seattle Le Trong; Christine D. Auburn Eberhardt; Larry W. Bothell Tjoelker; Patrick W. Seattle Gray; Cheryl L. Bellevue Wilder
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1993-10-06
Filing date: 1994-10-06
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2014-10-07
Also published as: EP1096016B1; CA2151045A1; EP1634953A3; EP0673426B1; EP0673426A1; DE69427392D1; DE69427392T2; ATE315655T1; ES2258955T3; ATE201905T1; EP1634953A2; US5698403A; CA2151045C; EP1096016A1; ES2159573T3; HK1038587A1; WO1995009921A1; DK0673426T3; DK1096016T3; US5605801A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf Acetylhydrolase des Plättchen-aktivierenden Faktors und im speziellen auf neu gereinigte und isolierte Polynukleotide, die für Acetylhydrolase des plasmatischen Plättchen-aktivierenden Faktors aus Mensch kodieren, auf Produkte der Acetylhydrolase des Plättchen-aktivierenden Faktors, die durch diese Polynukleotide kodiert werden, auf Materialien und Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Produkten der Acetylhydrolase des Plättchen-aktivierenden Faktors und auf Antikörpersubstanzen spezifisch gegen Acetylhydrolase des Plättchen-aktivierenden Faktors.
HINTERGRUND
Der Plättchen-aktivierende Faktor (PAF) ist ein biologisch aktives Phospholipid, das von verschiedenen Zelltypen synthetisiert wird. In vivo und bei normalen Konzentrationen von 10^–10 bis 10^–9 M aktiviert PAF Zielzellen wie Plättchen und Neutrophile durch Binden an spezifische G-Protein-gekoppelte Zelloberflächenrezeptoren [Venable et al., J. Lipid Res., 34:691-701 (1993)]. PAF hat die Struktur von 1-O-Alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholin. Für optimale biologische Aktivität muß die sn-1-Position des PAF-Glycerolrückrads in einer Etherverbindung mit einem Fettalkohol vorliegen und die sn-3-Postion muß eine Phosphocholin-Kopfgruppe tragen.
PAF hat bei normalen physiologischen Prozessen eine Funktion (Entzündungen, Hämostase und Gebären) und ist bei pathologisch inflammatorischen Reaktionen beteiligt (Asthma, Anaphylaxie, septischer Schock und Arthritis) [Venable et al., supra, und Lindsberg et al., Ann. Neurol, 30:117-129 (1991)]. Die Wahrscheinlichkeit der PAF-Beteiligung bei pathologischen Reaktionen hat Bemühungen veranlaßt, die Aktivität des PAF zu modulieren und der Hauptschwerpunkt dieser Bemühungen lag auf der Entwicklung von Antagonisten der PAF-Aktivität, welche in die Bindung des PAF an Zelloberflächenrezeptoren eingreifen. Siehe zum Beispiel Heuer et al., Clin. Exp. Allergy, 22:980-983 (1992).
Die Synthese und Sekretion des PAF scheint ebenso wie sein Abbau und die Beseitigung desselben streng kontrolliert zu sein. Soweit die inflammatorischen Prozesse des PAF auf einen Fehler des PAF-Regulationsmechanismus zurückgeht, durch Ansteigen auf eine übermäßige Produktion, eine unangemessene Produktion oder einen fehlenden Abbau, könnte ein alternatives Mittel zur Veränderung der PAF-Aktivität das Nachahmen oder Steigern des natürlichen Prozesses beinhalten, wodurch eine Auflösung der Entzündung entsteht. Wie berichtet, wurde entlassen Makrophagen [Stafforini et al., J. Biol. Chem., 265(17):9682-9687 (1990)], Heptazyten und die humane Hepatomazellinie HepG2 [Satoh et al., J. Clin, Invest., 87:476-481 (1991) und Tarbet et al., J. Biol. Chem., 266(25):16667-16673 (1991)] eine Enzymaktivität, die PAF-Acelylhydrolase (PAF-AH), die PAF inaktiviert. Zusätzlich zur Inaktivierung des PAF inaktiviert die PAF-AH oxidativ fragmentierte Phospholipide wie Produkte der Arachidonsäurekaskade, die Entzündungen vermittelt. Siehe Stremler et al., J. Biol. Chem., 266(17):11095-11103 (1991). Die Inaktivierung des PAF durch die PAF-AH geschieht hauptsächlich durch Hydrolyse der PAF-sn-2-Acetylgruppe und die PAF-AH metabolisiert oxidativ fragmentierte Phospholipide durch Entfernen der sn-2-Acylgruppen. Zwei Typen der PAF-AH wurden identifiziert: cytoplasmatische Formen, gefunden in einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben wie Endothelzellen und Erythrozyten und eine extrazelluläre Form, gefunden im Plasma und Serum. Plasmatische PAF-AH hydrolisiert bis auf PAF keine intakten Phospholipide, und diese Substratspezifität erlaubt dem Enzym, in vivo in vollaktiver Form ohne nachteilige Effekte zu zirkulieren. Die plasmatische PAF-AH scheint für den Abbau des gesamten PAF im humanen Blut ex vivo verantwortlich zu sein [Stafforini et al., J. Biol. Chem., 262(9):4223-4230 (1987)].
Während die cytoplasmatischen Formen und die plasmatische Form der PAF-AH identische Substratspezifitäten zu haben scheinen, weist die plasmatische PAF-AH biochemische Charakteristika auf, die sie von der cytoplasmatischen PAF-AH und von anderen charakterisierten Lipasen unterscheidet. Speziell ist die plasmatische PAF-AH mit Lipoproteinpartikeln assoziiert, durch Diisopropylfluorophosphat inhibierbar, nicht durch Kalziumionen beeinflußt, relative empfindlich gegen Proteolyse und hat ein vermutliches Molekulargewicht von 43.000 Daltons. Siehe Stafforini et al. (1987), supra. Derselbe Stafforini et al.-Artikel beschreibt ein Verfahren zur partiellen Reinigung der PAF-AH aus humanem Plasma und die Aminosäurezusammensetzung des in diesem Verfahren gewonnen plasmatischen Materials. Cytoplasmatische PAF-AH wurde aus Erythrozyten nach Stafforini et al., J. Biol. Chem., 268(6):3857-3865 (1993) gereinigt und es sind auch zehn aminoterminale Reste der cytoplasmatischen PAF-AH in dem Artikel beschrieben. Hattori et al., J. Biol. Chem., 268(25)18748-18753 (1993) beschreibt die Reinigung cytoplasmatischer PAF-AH aus Rinderhirn. Später wurde zur Hinterlegung der Patentanmeldung hierfür die Nukleotidsequenz der cytoplasmatischen PAF-AH aus Rinderhirn bei Hattori et al., J. Biol, Chem., 269(237):23150-23155 (1994) publiziert. Bis heute wurde keine Nukleotidsequenz der plasmatischen Form der PAF-AH publiziert.
Die rekombinante Herstellung der PAF-AH würde es ermöglichen, die Verwendung exogener PAF-AH nachzuahmen oder die normalen Prozesse des Rückgangs von Entzündungen in vivo zu steigern. Der Einsatz der PAF-AH würde im Gegensatz zum Einsatz der PAF-Rezeptorantagonisten einen physiologischen Vorteil bieten, da die PAF-AH ein Produkt ist, was normalerweise im Plasma gefunden wird. Die PAF-Rezeptorantagonisten, welche strukturell dem PAF verwandt sind, inhibieren native PAF-AH-Aktivität und außerdem wird der erwünschte Metabolismus des PAF und der oxidativ fragmentierten Phospholipide dadurch verhindert. Somit wirkt die Inhibition der PAF-AH-Aktivität durch PAF-Rezeptorantagonisten der kompetetiven Blockade des PAF-Rezeptors durch die Antagonisten entgegen. Siehe Stremler et al., supra. Zusätzlich führt in Bereichen akuter Entzündung zum Beispiel die Freisetzung von Oxidationsmitteln zu einer Inaktivierung des native PAF-AH-Enzyms, was wiederum in einem erhöhten lokalen Niveau des PAF und der PAF-ähnlichen Verbindungen resultiert, welche mit jedem exogen verabreichten PAF-Rezeptorantagonisten um die Bindung des PAF-Rezeptors konkurrieren. Im Gegensatz dazu würde die Behandlung mit rekombinanter PAF-AH die endogene PAF-AH-Aktivität steigern und für jedes inaktivierte endogene Enzyme kompensieren.
Somit existiert ein Bedarf im Stand der Technik, Polynukleotidsequenzen zu identifizieren und isolieren, die für plasmatische PAF-AH aus Mensch kodieren, um Materialien und Verfahren zu entwickeln, die für die rekombinante Produktion von PAF-AH nützlich sind und die Herstellung von Reagentien zur Detektion der PAF-AH im Plasma ermöglichen.
ZUSAMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue gereinigte und isolierte Polynukleotide zur Verfügung (d.h. DNA und RNA, sowohl sense- als antisense-Stränge), die für die plasmatische PAF-AH aus Mensch oder enzymatisch aktiven Fragmenten derselben kodieren. Bevorzugte DNA- Sequenzen der Erfindung umfassen genomische- und cDNA-Sequenzen ebenso, wie vollständig oder teilweise chemisch synthetisierte DNA-Sequenzen. Die für die PAF-AH kodierende DNA-Sequenz, die in der SEQ ID NO: 7 niedergelegt ist und DNA-Sequenzen, welche unter stringenten Standardbedingungen nicht mit dem nicht-kodierenden Strang hybridisieren oder welche hybridisieren würden, aber aufgrund der Resondanz des genetischen Codes dies nicht tun, werden durch die Erfindung in Erwägung gezogen. Ebenfalls durch die Erfindung in Erwägung gezogen sind biologische Repliken (d.h. Kopien von isolierten DNA-Sequenzen, die in vivo oder in vitro hergestellt wurden) von DNA-Sequenzen der Erfindung. Unabhängig replizierende, rekombinante Konstrukte wie Plasmide und virale DNA-Vektoren, die PAF-AH-Sequenzen der Erfindung enthalten und insbesondere Vektoren, in denen die PAF-AH kodierende DNA wirksam an eine endogene oder exogene Expressionskontroll-DNA-Sequenz und an einen Transkriptionsterminator gebunden sind, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.
Entsprechend eines anderen Aspektes der Erfindung werden prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen stabil mit DNA-Sequenzen der Erfindung in der Art transformiert, daß die Expression der gewünschten PAF-AH hierin ermöglicht wird. Wirtszellen, die PAF-AH-Produkte exprimieren, können für eine Vielzahl nützlicher Verwendungen dienen. Solche Zellen begründen eine wertvolle Quelle als Immunogen zur Entwicklung von Antikörpersubstanzen, die spezifisch mit PAF-AH reagieren. Wirtszellen der Erfindung sind auffallend nützlich für Verfahren zur größeren Produktion von PAF-AH, wobei die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium wachsen und die erwünschten Polypeptidprodukte aus den Zellen oder aus dem Medium, in welchem die Zellen wachsen sind, durch zum Beispiel Immunaffinitätsreinigung isoliert werden.
Ein durch die Erfindung in Erwägung gezogenes, nicht-immunologisches Verfahren zur Reinigung des PAF-AH-Enzyms aus Plasma, beinhaltet folgende Schritte: (a) Isolieren von Lipoproteinpartikeln niedriger Dichte; (b) Lösen besagter Lipoproteinpartikel niedriger Dichte in einem Puffer umfassend 10mM CHAPS, um die erste PAF-AH-Enzymlösung zu erzeugen; (c) Aufbringen besagter erster PAF-AH-Enzymlösung auf eine DEAE-Anionenaustauschersäule; (d) Waschen besagter DEAE-Anionenaustauschersäule unter Verwendung eines 1 mM CHAPS-Puffers mit einem ungefähren pH-Wert von 7,5; (e) Elution des PAF-AH-Enzyms von besagter DEAE-Anionenaustauschersäule in Fraktionen unter Verwendung eines Puffers, mit dem ungefähren pH 7,5, der einen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl umfaßt; (f) Vereinen der Fraktionen von besagter DEAE-Anionenaustauschersäule, die PAF-AH-Enzymaktivität aufweisen; (g) Einstellen besagter vereinigter, aktiver Fraktionen von besagter DEAE-Anioneaustauschersäule auf 10 mM CHAPS, um eine zweite PAF-AH-Enzymlösung zu erzeugen; (h) Aufbringen besagter PAF-AH-Enzymlösung auf eine "Blue dye ligand"-Affinitätssäule; (i) Elution des PAF-AH-Enzyms von besagter "Blue dye ligand"-Affinitätssäule unter Verwendung eines Puffers, der 10 mM CHAPS und ein chaotropes Salz umfaßt; (j) Aufbringen des Eluats von besagter "Blue dye ligand"-Affinitätssäule auf eine Cu-Ligandenaffinitätssäule, (k) Eluieren des PAF-AH-Enzyms von besagter Cu-Ligandenaffinitässäule unter Verwendung eines Puffers, der 10 mM CHAPS und Imidazol umfaßt; (1) Aufbringen des Eluats von besagter Cu-Ligandenaffinitässäule auf eine SDS-PAGE; und (m) Isolieren des ungefähr 44 kDa PAF-AH-Enzyms aus dem SDS-Polyacrylamidgel. Bevorzugt besteht der Puffer aus Schritt (b) aus 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, pH 7,5; der Puffer aus Schritt (d) ist 25 mM Tris-HCl, 1 mM CHAPS; die Säule aus Schritt (h) ist eine Blau-Sepharose-Schnellflußsäule; der Puffer aus (i) ist 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M KSCN, pH 7,5; die Säule aus Schritt (j) ist eine Cu-Chelat-Sepharosesäule; und der Puffer aus Schritt (k) ist 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, 50 mM Imidazol und hat einen pH in einem Bereich von ungefähr pH 7,5-8,0.
Ein durch die Erfindung benanntes Verfahren zur Reinigung enzymatisch aktiver PAF-AH aus E.coli, die PAF-AH produzieren, beinhaltend folgende Schritte: (a) Herstellen eines Zentrifugationsüberstandes von lysierten E.coli, die PAF-AH-Enzym produzieren; (b) Aufbringen besagten Zentrifugationsüberstandes auf eine "Blue dye ligand"-Affinitätssäule; (c) Eluieren des PAF-AH-Enzyms von besagter "Blue dye ligand"-Affinitätssäule unter Verwendung eines Puffers, der 10 mM CHAPS und ein chaotropes Salz umfaßt; (d) Aufbringen besagten Eluats von besagter "Blue dye ligand"-Affinitätssäule auf eine Cu-Ligandenaffinitätssäule; und (e) Eluieren des PAF-AH-Enzyms von besagter Cu-Ligandenaffinitätssäule unter Verwendung eines Puffers der 10 mM CHAPS und Imidazol umfaßt. Bevorzugt ist die Säule aus Schritt (b) eine Blau-Sepharose-Schnellflussäule; der Puffer aus Schritt (c) ist 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M KSCN, pH 7,5; die Säule aus Schritt (d) ist eine Cu-Chelat-Sepharosesäule; und der Puffer aus Schritt (e) ist 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, 100 mM Imidazol, pH 7,5.
Ein anderes durch die Erfindung benanntes Verfahren zur Reinigung enzymatisch aktiver PAF-AH aus E. coli, die PAF-AH produzieren, beinhaltet folgende Schritte: (a) Herstellen eines Zentrifugationsüberstandes von lysierten E. coli, die PAF-AH-Enzym produzieren; (b) Verdünnen besagten Zentrifugationsüberstandes in einem Niedrig-pH-Puffer, der 10 mM CHAPS umfaßt; (c) Aufbringen besagten verdünnen Zentrifugationsüberstandes auf eine Kationenaustauschersäule, die auf einen pH von ungefähr 7,5 äquilibriert wurde; (d) Eluieren des PAF-AH-Enzyms von besagter Kationenaustauschersäule unter Verwendung von 1 M Salz; (e) Erhöhen des pHs besagten Eluats von besagter Kationenaustauschersäule und Einstellen der Salzkonzentration des besagten Eluats auf 0,5 M Salz; (f) Aufbringen besagten eingestellten Eluats von besagter Kationenaustauschersäule auf eine "Blue dye ligand"-Affinitätssäule; (g) Eluieren des PAF-AH-Enzyms von besagter "Blue dye ligand"-Affinitätssäule unter Verwendung eines Puffers, der ungefähr 2 M bis 3 M Salz umfaßt, und (h) Dialysieren besagten Eluats von besagter "Blue dye ligand"-Affinitätssäule unter Verwendung eines Puffers, der ungefähr 0,1% Tween umfaßt. Bevorzugt ist der Puffer aus Schritt (b) 25 mM MES, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, pH 4,9; die Säule aus Schritt (c) ist eine S-Sepharosesäule, äquilibriert in 25 mM MES, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 5,5; PAF-AH ist in Schritt (d) unter Verwendung von 1 mM NaCl eluiert worden; der pH des Eluats in Schritt (e) ist auf pH 7,5 eingestellt worden unter Verwendung von 2 M Tris-Base; die Säule in Schritt (f) ist eine Sepharosesäule; der Puffer in Schritt (g) ist 25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 3 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5; und der Puffer in Schritt (h) ist 25 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 80, pH 7,5.
PAF-AH-Produkte können als Isolate aus natürlichen Zellquellen erhalten oder chemisch synthetisiert werden, werden aber bevorzugt durch chemische Verfahren hergestellt, die prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen der Erfindung umfassen. PAF-AH-Produkte, die zum Teil oder vollständig die Aminosäuresequenz wie in der SEQ ID NO: 8 haben, werden mit erwägt. Die Verwendung von Säugetierwirtszellen läßt erwarten, das sie solche posttranslationalen Modifikationen (zum Beispiel Bindung von Myristat, Glycosylierung, Abspaltung, Lipidisierung, und Tyrosin-, Serin- oder Threoninphosphorylierung) ermöglichen, wie sie benötigt werden, um den rekombinant expremierten Produkten der Erfindung eine optimale biologische Aktivität zu verleihen. PAF-AH-Produkte der Erfindung können Polypeptide der Gesamtlänge, Fragmente oder Varianten sein. Varianten können PAF-AH-Analoga umfassen, wobei ein oder mehrere der spezifischen (d.h. natürlich kodierten) Aminosäuren deletiert oder ersetzt oder wobei ein oder mehrere nicht-spezifische Aminosäuren hinzugefügt worden sind: (1) ohne Verlust einer oder mehrere der enzymatischen Aktivitäten oder immunologischen Charakteristika spezifisch für PAF-AH; oder (2) mit spezifischem Verlust einer speziellen biologischen Aktivität der PAF-AH. Proteine oder andere Moleküle, die PAF-AH binden, können zur Modulation derselben verwendet werden.
Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt sind Antikörpersubstanzen (monoklonale und polyklonale Antikörper, Einzelkettenantikörper, chimäre Antikörper, Antikörper, die in den CDR-Regionen verändert wurden und ähnliche) und andere bindende Proteine spezifisch gegen PAF-AH der Erfindung. Speziell dargestellte, bindende Proteine der Erfindung sind die monoklonalen Antikörper, produziert durch die Hybrydomalinien 90G11D und 90F2D, welche bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockvill, MD 20852 am 30. September 1994 hinterlegt worden sind und unter den Accession-Nrn. HB 11724 und HB 11725 geführt werden. Proteine oder andere Moleküle (z.B. Lipide oder kleine Moleküle), welche spezifisch an PAF-AH binden, können unter Verwendung von aus Plasma isolierter PAF-AH, rekombinanter PAF-AH, PAF-AH-Varianten oder Zellen, die solche Produkte exprimieren, identifiziert werden. Bindende Proteine sind wiederum ebenso nützlich bei Zusammensetzungen zur Immunisierung, wie zur Reinigung der PAF-AH und sie sind zur Detektion oder Quantifizierung der PAF-AH in Flüssigkeiten und Gewebeproben durch bekannte immunologische Verfahren nützlich. Anti-Idiotyp Antikörper, spezifisch für PAF-AH spezifische Antikörpersubstanzen, sind ebenso umfaßt.
Der wissenschaftliche Wert an Informationen, beigetragen durch die Offenbarungen der DNA- und Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung, ist offenkundig. Als eine Reihe von Beispielen ermöglicht das Wissen der cDNA-Sequenz der PAF-AH die Isolierung durch DNA/DNA-Hybridisierung genomischer DNA-Sequenzen, die für PAF-AH kodiert und die Spezifizierung von PAF-AH-Expressionskontroll- und Regulationssequenzen wie Promotoren, Operatoren und ähnlichem. Von DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren, ausgeführt mit DNA-Sequenzen der Erfindung unter Stringenzbedingungen, die dem Stand der Technik entsprechen, wird ebenfalls erwartet, das sie die Isolierung von DNAs ermöglichen, die allele Varianten der PAF-AH, andere strukturell verwandte Proteine, die ein oder mehrere der biochemischen und/oder immunologischen Eigenschaften der PAF-AH teilen und Proteine aus nicht-humanen Spezies, homolog zur PAF-AH, kodieren. Die durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellte DNA-Sequenzinformation ermöglicht auch durch homologe Rekombination oder "Knockout"-Strategien [siehe z.B. Kapecchi, Science, 244:1288-1292 (1989)], die Entwicklung von Nagetieren, die kein funktionelles PAF-AH-Enzym oder eine Variante des PAF-AH-Enzyms exprimieren. Polynukleotide der Erfindung sind bei geeigneter Markierung nützlich, um in Hybridisierungsversuchen die Kapazität der Zellen zur Synthese von PAF-AH zu ermitteln. Polynukleotide der Erfindung können auch die Grundlage für diagnostische Verfahren sein, die zur Identifizierung einer oder mehrerer genetischer Veränderung im PAF-AH-Lokus nützlich sind, der einem Krankheitsstadium oder Stadien unterliegt. Ebenso werden durch die Erfindung anti-sense Polynukleotide verfügbar, die zur Expressionsregulation der PAF-AH durch solche Zellen relevant sind, die gewöhnlich dieselbe exprimieren.
Das Verabreichen von PAF-AH-Zubereitungen der Erfindungen an Säugetiere, inbesondere Menschen, zum Zweck der Verbesserung pathologisch inflammatorischer Zustände wird umfaßt. Basierend auf der Auswirkung der Beteiligung des PAF bei pathologisch inflammatorischen Zuständen, ist die Verabreichung der PAF-AH indiziert, zum Beispiel zur Behandlung von Asthma [Miwa et al., J. Clin. Invest., 82:1983-1991 (1988); Hsieh et al., J. Allergy Clin. Immunol., 91:650-657 (1993); und Yamashita et al., Allergy, 49:60-63 (1994)], Anaphylaxie [Venable et al., supra], Schock [Venable et al., supra], Reperfusionsschädigung und Ischämie des Zentralen Nervensystems [Lindsberg et al. (1991), supra], antigeninduzierte Arthritis [Zarco et al., Clin. Exp. Immunol., 88:318-323 (1992)], Atherogenese [Handley et al., Drug Dev. Res., 7:361-375 (1986)], Crohn-Krankheit [Denizot et al., Digestive Diseases and SClences, 37(3):432-437 (1992)], ischämischer Darmnekrose/nekrotisierender Enterocolitis [Denizot et al., supra und Caplan et al., Acta Paediatr., Suppl. 396:11-17 (1994)], ulzerative Colitis (Denizot et al., supra), Ischämischem Schlag [Satoh et al., Stroke, 23:1090-1092 (1992)], Ischämischer Hirnverletzung [Lindsberg et al., Stroke, 21:1452-1457 (1990) und Lindsberg et al. (1991), supra], systemischer Lupus erythematodes [Matsuzaki et al., Clinica Chimica Acta, 210:139-144 (1992)], akuter Pancreatitis [Kald et al., Pancreas, 8(4):440-442 (1993)], Sepsis (Kald et al., supra), akuter poststreptococcaler Glomerulonephritis [Mezzano et al., J. Am. Soc. Nephrol., 4:235-242 (1993)], pulmonaren Ödemen als Folge einer IL-2-Therapie [Rabinovici et al., J. Clin. Invest., 89:1669-1673 (1992)], allergischer Entzündung [Watanabe et al., Br. J. Pharmacol., 111:123-130 (1994)], ischämischem Nierenfehler [Grino et al., Annals of Internal MediClne, 121(5):345-347 (1994)]; Frühgeburt [Hoffman et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 162(2):525-528 (1990) und Maki et al., Proc. Natl. Acad. SCl. USA, 85:728-732 (1988)]; und akuter respiratorischer Insuffizienz [Rabinovici et al., J. Appl. Physiol., 74(4):1791-1802 (1993); Matsumoto et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19 509-515 (1992), und Rodriguez-Roisin et al., J. Clin. Invest., 93:188-194(1994)].
Tiermodelle für viele der vorangegangenen pathologischen Zustände sind im Stand der Technik beschrieben worden. So ist zum Beispiel ein Mausmodell für Asthma, Rhinitis und Hautausschlag in Beispiel 16 beschrieben; ein Kaninchenmodell für Arthritis ist bei Zarco et al., supra, beschrieben; Rattenmodelle für ischämische Darmnekrose/nekrotisierende Enterocolitis sind bei Furukawa et al., Ped. Res., 34(2):237-241 (1993) und Caplan et al., supra, beschrieben; ein Kaninchenmodell für Schock ist bei Lindsberg et al., (1990), supra, beschrieben; ein Mausmodell für Lupus ist bei Matsuzaki et al., supra, beschrieben; ein Rattenmodell für akute Pancreatitis ist bei Kald et al., supra, beschrieben; ein Rattenmodell für pulmonare Ödeme, hervorgerufen durch eine IL-2-Therapie, ist bei Rabinovici et al., supra, beschrieben; ein Rattenmodell für allergische Entzündung ist bei Watanabe et al., supra, beschrieben; ein Hundemodell für ein Nieren-Fremdimplantat ist bei Watson et al., Transplantation, 56(4):1047-1049 (1993) beschrieben; und ein Rattenmodell für akute respiratorische Insuffizienz ist bei Rabinovici et al., supra, beschrieben.
Speziell umfaßt sind PAF-AH-Zusammensetzungen der Erfindung zur Verwendung bei Behandlungsverfahren von einem Säugetier, das anfällig ist für oder leidend an PAF-vermittelten pathologischen Zuständen, umfassend eine Verabreichung der PAF-AH nach der Erfindung an Säugetiere in ausreichender Menge, um endogene PAF-AH-Aktivität zu ergänzen und pathologische Mengen des PAF in Säugetieren zu inaktivieren.
Therapeutische Zusammensetzungen, umfaßt durch die Erfindung, beinhalten PAF-AH der Erfindung und ein physiologisch akzeptables Verdünnungsmittel oder einen Träger und können auch andere Agentien beinhalten, die anti-inflammatorische Effekte haben. Indizierte Dosierungsmengen würden ausreichen, um endogene PAF-AH-Aktivität zu ergänzen und pathologische Mengen des PAF zu inaktivieren. Für allgemeine Dosierungsüberlegungen siehe Remmington's Pharmaceutical SClences, 18^th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Die Dosierungen werden zwischen ungefähr 0,1 und ungefähr 1000 μg PAF-AH/kg Körpergewicht variieren. Therapeutische Zusammensetzungen der Erfindung können auf verschiedenen Wegen in Abhängigkeit von dem zu behandelnden pathologischen Zustand behandelt werden. So kann die Verabreichung z.B. intravenös, subkutan, oral, durch Zäpfchen und/oder über die Lunge erfolgen.
Für pathologische Bedingungen der Lunge ist die Verabreichung der PAF-AH über den Lungenweg insbesondere indiziert. Zur Verwendung der Verabreichung über die Lunge sind eine große Auswahl von Verabreichungsvorrichtungen umfaßt, wozu zum Beispiel Vernebler, Dosisinhalatoren und Pulverinhalatoren gehören, welche Stand der Technik sind. Das Verabreichen verschiedener Proteine in die Lungen und das Kreislaufsystem durch Inhalation der Aerosolrezepturen wurde beschrieben bei Adjei et al., Pharm. Res., 7(6):565-569 (1990) (Leuprolidacetat); Braquet et al., J. Cardio. Pharm., 13(Supp.5):s. 143-146 (1989) (Endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal MediClne, III(3), 206-212 (1989) (α1-Antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest., 84:1145-1146(1989) (α-1-Proteinase-Inhibitor); Debs et al., J. Immunol., 140:3482-3488 (1933) (rekombinantes Gamma-Interferon und Tumornecrosefaktor-alpha); Patent Cooperation Treaty (PCT) International Publictaion No. WO 94/20069, veröffentlicht 15. September 1994 (rekombinanter Granulozyten koloniestimulierender Faktor).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Zahlreiche andere Aspekte und Vorzüge der vorliegenden Erfindung werden unter Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung derselben offensichtlich, wobei auf folgende Zeichnungen verwiesen wird:
1 ist eine Fotografie einer PVDF-Membran, die aus humanem Plasma gereinigte PAF-AH enthält;
2 ist eine Grafik, die die enzymatische Aktivität der rekombinanten, plasmatischen PAF-AH aus Mensch zeigt;
3 ist eine schematische Zeichnung, die die rekombinanten PAF-AH-Fragmente und deren katalytische Aktivität darstellt;
4 ist ein Balkendiagramm, das die Blockierung eines PAF-induzierten Rattenfußödems durch lokal verabreichte, rekombinante PAF-AH der Erfindung darstellt;
5 ist ein Balkendiagramm, das die Blockierung eines PAF-induzierten Rattenfußödems durch intravenös verabreichte PAF-AH darstellt;
6 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, daß PAF-AH PAF-induzierte Ödeme, aber nicht Zymosan A-induzierte Ödeme blockiert.
7A und 7B präsentiert Ergebnisse der Dosis-Antwort der PAF-AH antiinflammatorischen Aktivität in Rattenfußödemen;
8A und 8B präsentiert Ergebnisse, die die in vivo-Wirksamkeit von einer Einzeldosis PAF-AH im Zeitverlauf darstellen;
9 ist ein Liniendiagramm das die Pharmakokinetiken der PAF-AH im Rattenkreislauf darstellt; und
10 ist ein Balkendiagramm, das die anti-inflammatorischen Effekte der PAF-AH im Vergleich mit den geringeren Effekten der PAF-AH-Antagonisten im Rattenfußödem zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die folgende Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 präsentiert eine neues Verfahren zur Reinigung von PAF-AH aus humanem Plasma. Beispiel 2 beschreibt die Aminosäuremikrosequenzierung der gereinigten plasmatischen PAF-AH aus Mensch. Die Klonierung einer Volllängen-cDNA, die für die plasmatische PAF-AH aus Mensch kodiert, ist in Beispiel 3 beschrieben. Die Identifizierung einer möglichen Spleißvariante des plasmatischen PAF-AH-Gens aus Mensch ist in Beispiel 4 beschrieben. Die Klonierung genomischer Sequenzen, die für die plasmatische PAF-AH aus Mensch kodieren, ist in Beispiel 5 beschrieben. Beispiel 6 beschreibt die Klonierung von cDNAs aus Hund, Maus, Nagetier und Affe, die zur plasmatischen PAF-AH-cDNA aus Mensch homolog sind. Beispiel 7 präsentiert die Ergebnisse einer Untersuchung, die die enzymatische Aktivität rekombinanter PAF-AH in transient exprimierenden COS 7- Zellen belegt. Beispiel 8 beschreibt die Expression von PAF-AH aus Mensch in E. coli und S. cerevisiae. Beispiel 9 präsentiert ein Protokoll zur Reinigung rekombinanter PAF-AH aus E. coli und Untersuchungen, die deren enzymatische Aktivität bestätigen. Beispiel 10 beschreibt verschiedene rekombinante PAF-AH-Produkte inklusive Aminosäuresubstitutionsanaloga und amino- und carboxytrunkierte Produkte. Ergebnisse einer Northern-Blot-Untersuchung zur Expression der plasmatischen PAF-AH-RNA aus Mensch in verschiedenen Geweben und Zelllinienen sind in Beispiel 11 dargestellt, während Ergebnisse zur in situ-Hybridisierung in Beispiel 12 präsentiert werden. Beispiel 13 beschreibt die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen plasmatische PAF-AH aus Mensch gerichtet sind. Die Beispiele 14, 15 und 16 beschreiben jeweils die in vivo-therapeutischen Effekte bei Verwendung rekombinanter PAF-AH-Produkte der Erfindung auf akute Entzündungen, Rippenfellentzündung und Asthma bei Ratten. Beispiel 17 legt die Ergebnisse von Immununtersuchungen des Serums von Humanpatienten dar, die einen Mangel in der PAF-AH-Aktivität zeigen und beschreibt die Identifizierung einer genetischen Läsion bei den Patienten, welche offensichtlich für den Defekt verantwortlich ist.
Beispiel 1
PAF-AH wurde aus humanem Plasma gereinigt, um Material zur Aminosäuresequenzierung zur Verfügung zu stellen.
A. Optimierung der Reinigungsbedinungen
Ursprünglich wurden Lipoproteinpartikel niedriger Dichte (LDL) aus dem Plasma mit Wolframatophosphat präzipetiert, anschließend in 0,1% Tween 20 gelöst und zur Chromatografie auf eine DEAE-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) entsprechend der Methode von Stafforini et al., (1987), supra, gegeben, aber eine nicht-übereinstimmende Elution einer PAF-AH-Aktivität von der DEAE-Säule hat eine neue Abschätzung der Löslichkeit und der anschließenden Reinigungsbedingungen notwendig gemacht.
Tween 20, CHAPS (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) und Octylglucoside wurden durch Zentrifugation und Gelfiltrationschromatographie auf ihre Eigenschaft zur Lösung von LDL-Partikeln bewertet. CHAPS erreichte eine 25% größere Wiedergewinnung der löslichen Aktivität als Tween 20 und eine 300% größere Wiedergewinnung als Octylglucosid. Das in 10 mM CHAPS gelöste LDL-Präzipitat wurde anschließend auf einer DEAE-Sepharose-Schnellflußsäule (eine Ionenaustauschersäule; PharmaCia) mit einem Puffer, der 1 mM CHAPS enthält, fraktioniert, um einen großen Pool partiell gereinigter PAF-AH ("der DEAE-Pool") zur Einschätzung zusätzlicher Säulen zur Verfügung zu stellen.
Der DEAE-Pool wurde als Ausgangsmaterial verwendet, um eine Reihe von Chromatographiesäulen hinsichtlich der Brauchbarkeit in der weiteren Reinigung der PAF-AH-Aktivität zu untersuchen. Die zu untersuchenden Säulen umfaßten: Blau-Sepharose-Schnellfluß (Pharmacia), eine Farbstoffliganden-Affinitätssäule; S-Sepharose-Schnellfluß (Pharmacia), eine Kationenaustauschersäule; Cu-Chelat-Sepharose (Pharmacia), eine Metallligandenaffintätssäule; Fractogel S (EM Separations, Gibbstown, NJ), eine Kationenaustauschersäule; Sephacryl-200 (Pharmacia), eine Gelfiltrationssäule. Diese Chromatographieverfahren lieferten alle niedrige, unbefriedigende Reinigungsgrade, wenn sie mit 1 mM CHAPS durchgeführt wurden. Die folgende Gelfiltrationschromatographie mit Sepharcryl 5-200 in 1 mM CHAPS ergab eine enzymatisch aktive Fraktion, welche eher über einen weiten Größenbereich eluierte, als die angenommene, erwartete 44 kDa Größe. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, daß die LDL-Proteine in Lösung aggregiert waren.
Verschiedene LDL-Proben wurden deshalb durch analytische Gelfiltrationschromatographie auf die Aggregation der PAF-AH-Aktivität hin untersucht. Proben des DEAE-Pools und frisch gelöste LDL-Präzipitate wurden auf Superose 12 (Pharmacia), äquilibriert in 1 mM CHAPS, analysiert. Beide Proben wurden über einen ausgedehnten Molekulargewichtsbereich eluiert, wobei die meiste Aktivität bei ungefähr 150 kDa eluierte. Bei anschließender Analyse der Proben auf Superose 12, äquilibriert mit 10 mM CHAPS, eluierte der Großteil der Aktivität in der Nähe von 44 kDa, wie für die PAF-AH-Aktivität erwartet. Die Proben enthielten jedoch, entsprechend zu Aggregaten, in Bereichen höheren Molekulargewichts einige PAF-AH-Aktivität.
Andere Proben eluierten PAF-AH-Aktivtät ausschließlich im ungefähren 44 kDa-Bereich, wenn sie anschließend durch Gelfiltration getestet wurden. Diese Proben waren ein LDL-Präzipitat, gelöst in 10 mM CHAPS in Gegenwart von 0,5 M NaCl und ein frischer DEAE-Pool, der nach Elution von der DEAE-Säule auf 10 mM CHAPS eingestellt worden war. Diese Daten zeigen, daß mindestens 10 mM CHAPS notwendig sind, um nicht-aggregierte PAF-AH zu erhalten. Ein Ansteigen der CHAPS-Konzentration von 1 mM bis 10 mM nach der Chromatographie mit DEAE, aber vor weiteren folgenden Chromatographieschritten, führte zu dramatischen Unterschieden in der Reinigung. So wurde zum Beispiel der Grad der PAF-AH-Reinigung auf "S-Sepharose Fast Flow" vom Zweifachen auf das Zehnfache gesteigert. PAF-AH-Aktivität band irreversibel in 1 mM CHAPS die Blau-Sepharose- Schnellflussäule, aber die Säule bot den höchsten Reinigungsgrad in 10 mM CHAPS. Die DEAE-Chromatographie wurde durch vorherigen Zusatz von 10 mM CHAPS nicht verbessert.
Die Chromatographie mit Cu-Chelat-Sepharose nach der Blau-Sepharose-Schnellflußsäule konzentrierte die PAF-AH-Aktivität 15-fach. Es wurde auch festgestellt, daß die PAF-AH-Aktivität von einem reduzierten SDS-Polyacrylamidgel wiedergewonnen werden konnte, solange die Proben nicht gekocht worden waren. Die Aktivität des von der Cu-Chelat-Sepharosesäule eluierten Materials, stimmte nach einer SDS-Polyacrylamidgelelectrophorese mit der Hauptproteinbande des silbergefärbten Gels überein.
B. PAF-AH-Reinigungsprotokoll
Das neue Protokoll, was benutzt wurde, um die PAF-AH zu die Aminosäuresequenzierung zu reinigen, umfaßt die folgenden Schritte, welche bei 4°C durchgeführt wurden. Humanplasma wurde in 900 ml Aliquots in 1 Liter Nalgene-Flaschen geteilt und auf pH 8,6 eingestellt. LDL-Partikel wurden dann durch Zusatz von 90 ml 3,85% Natriumphosphowolframat, gefolgt von 23 ml 2 M MgCl₂, präzipitiert. Anschließend wurde das Plasma für 15 Minuten bei 3.600 g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 800 ml 0,2% Natriumcitrat resuspendiert. LDL wurde erneut durch Zusatz von 10 g NaCl und 24 ml 2 M MgCl₂ präzipitiert. LDL-Partikel wurden durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 3.600 g pelletiert. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Pellets wurden dann bei –20°C eingefroren. LDL-Partikel von 5 l Plasma wurden in 5 l Puffer A (25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, pH 7,5) resuspendiert und über Nacht gerührt. Gelöste LDL-Partikel wurden bei 3.600 g für 1,5 Stunden zentrifugiert. Die Überstände wurde vereinigt und durch Whatman 113-Filterpapier zur Entfernung zurückgebliebener fester Bestandteilen filtriert. Der gelöste LDL-Überstand wurde auf einen DEAE-Sepharose-Schnellflußsäule geladen (11 cm × 10 cm; 1 l Matrixvolumen; 80 ml/Minute), äquilibriert in Puffer B (25 mM Tris-HCl, 1 mM CHAPS, pH 7,5). Die Säule wurde mit Puffer B gewaschen, bis die Absorption auf die Basislinie zurückgekehrt war. Proteine wurden mit einem 81, 0-0,5 M NaCl-Gradienten eluiert und 480 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Dieser Schritt war notwendig, um eine Bindung an die folgende Blau-Sepharose-Schnellflußsäule zu erreichen. Die Fraktionen wurden auf Acetylhydrolaseaktivität hin untersucht, wie im wesentlichen in der Methode in Beispiel 4 beschrieben.
Aktive Fraktionen wurden vereinigt und ausreichend CHAPS zugegeben, bis der Pool ungefähr 10 mM CHAPS enthielt. Der DEAE-Pool wurde über Nacht mit 4 ml/Minute auf eine Blau-Sepharose-Schnellflußsäule geladen (5 cm × 10 cm; 200 ml Bettvolumen) äquilibriert in Puffer A, enthaltend 0,5 M NaCl. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer bei 16 ml/Minute gewaschen, bis die Absorption auf die Basislinie zurückgekehrt war. PAF-AH-Aktivität wurde schrittweise mit Puffer A, enthaltend 0,5 M KSCN (ein chaotropes Salz), bei 16 ml/Minute eluiert und in 50 ml Fraktionen gesammelt. Dieser Schritt führte zu einer größer als 1.000-fachen Reinigung. Aktive Fraktionen wurden vereinigt und der Popl auf pH 8,0 mit 1 M Tris-HCl pH 8,0 eingestellt. Der aktive Pool von der Blau-Sepharose-Schnellflußchromatographie wurde auf eine Cu-Chelat-Sepharosesäule geladen (2,5 cm × 2 cm; 10 ml Bettvolumen; 4 ml/Minute), äquilibriert in Puffer C [25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 8,0 (pH 7,5 funktionierte auch)], und die Säule wurde mit 50 ml Puffer C gewaschen. PAF-AH-Aktivität wurde mit 100 ml 50 mM Imidazol in Puffer C eluiert und in 10 ml Fraktionen gesammelt. Fraktionen mit PAF-AH-Aktivität wurden vereinigt und gegen Puffer A dialysiert. Außer einer 15-fachen Konzentrierung der PAF-AH-Aktivität ergab die Cu-Chelat-Sepharosesäule nur eine geringe Reinigung. Der Cu-Chelat-Sepharosepool wurde mit 50 mM DTT für 15 Minuten bei 37°C reduziert und auf ein 0,75 mm, 7,5% Polyacrylamidgel geladen. Gelstücke wurden alle 0,5 cm ausgeschnitten und in Einwegmikrozentrifugationsbehältern, enthaltend 200 μl 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 150 mM NaCl, gegeben. Die Gelstücke wurden durchmischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Der Überstand jedes Gelstückchens wurde auf PAF-AH-Aktivität hin untersucht, um herauszufinden, welche Proteinbande der SDS-PAGE PAF-AH-Aktivität enthielt. PAF-AH-Aktivität wurde in einer ungefähr 44 kDa-Bande gefunden. Das Protein eines Duplikatgels wurde auf eine PVDF-Membran (Immobilon-P, Millipore) elektrotransferriert und mit Coomassieblau gefärbt. Ein Foto der PVDF-Membran wird in 1 gezeigt.
Wie in Tabelle 1 unten gezeigt, wurden ungefähr 200 μg PAF-AH 2 × 10⁶-fach aus 5 l Humanplasma gereinigt. Im Vergleich ist eine 3 × 10⁴-fache Reinigung der PAF-AH-Aktivität bei Stafforini et al. (1987), supra, beschrieben.
Tabelle 1
Zusammengefaßt waren folgende Schritte zur erfolgreichen Reinigung der plasmatischen PAF-AH zur Mikrosequenzierung einzigartig und entscheidend: (1) Lösen und Chromatographie in 10 mM CHAPS, (2) Chromatographie mit einer "Blue ligand"-Affinitätssäule, wie eine Blau-Sepharose-Schnellfluß, (3) Chromatographie mit einer Cu-Ligandenaffinitätssäule, wie eine Cu-Chelat-Sepahrose, und (4) Elution der PAF-AH aus einer SDS-PAGE.
Beispiel 2
Zur Aminosäuresequenzierung wurde die ungefähr 44 kDa Proteinbande der PAF-AH-enthaltenden PVDF-Membran, beschrieben in Beispiel 1, ausgeschnitten und unter Verwendung eines Applied Biosystems 473A-Protein-Sequenzierers sequenziert. N-terminale Sequenzanalysen der ~44 kDa Proteinbande, entsprechend zu der PAF-AH-Aktivität, weisen darauf hin, daß die Bande zwei Hauptsequenzen und zwei Nebensequenzen enthält. Das Verhältnis der zwei Hauptsequenzen war 1:1 und es war deshalb schwierig, die Sequenzdaten zu interpretieren.
Um die Sequenzen der zwei Hauptproteine, welche aus dem SDS-Gel herausgelöst worden waren, zu unterscheiden, wurde eine Duplikat-PVDF-Membran, die die ungefähr 44 kDa-Bande enthält, in zwei Hälften geschnitten, so daß der obere und untere Teil der Membran getrennt voneinander sequenziert werden konnten.
Die N-terminale Sequenz, erhalten von der unteren Hälfte der Membran, war:
SEQ ID NO: 1
FKDLGEENFKALVLIAF
Eine Suche in Proteindatenbanken ergab, daß diese Sequenz ein Fragment humanen Serumalbumins ist. Die obere Hälfte derselben PVDF-Membran wurde auch sequenziert und die N-terminale Aminosäuresequenz war:
SEQ ID NO: 2
IQVLMAAASFGQTKIP
Diese Sequenz stimmte mit keinem Protein der durchsuchten Datenbanken überein und unterschied sich von der N-terminalen Aminosäuresequenz:
SEQ ID NO: 3
MKPLVVFVLGG
welche bei Stafforini et al. (1993), supra für cytoplamatische PAF-AH aus Erythrocyten berichtet worden war. Die neue Sequenz (SEQ ID NO: 2) wurde zur cDNA-Klonierung der plasmatischen PAF-AH aus Mensch, wie im folgenden Beispiel 3 beschrieben, eingesetzt.
Beispiel 3
Ein Volllängenklon, kodierend für plasmatische PAF-AH aus Mensch, wurde aus einer Makrophagen-cDNA-Bibliothek isoliert.
A. Konstruktion einer Makrophagen-cDNA-Bibliothek
Poly-A⁺RNA wurde aus peripherem Blut Monocyten-abgeleiteter Makrophagen geerntet. Doppelsträngige, geblundete cDNA wurde mit Hilfe des Invitrogen Copy Kit (San Diego, CA) hergestellt und BstXI-Adapter an die cDNA ligiert, bevor sie in den Säugetierexpressionsvektor pRc/CMV (Invitrogen) eingefügt wurde. Die erhaltenen Plasmide wurden in den E.coli-Stamm XL-1 Blue durch Elektroporation eingeführt. Die transformierten Bakterien wurden in einer Dichte von ungefähr 3.000 Kolonien pro Agaroseplatte in einer Gesamtzahl von 978 Platten ausplattiert. Separat von jeder Platte präparierte Plasmid-DNA wurde in individuellen Pools behalten und wurde auch zu größeren Pools, die jeweils 300.000 Klone repräsentieren, vereinigt.
B. Screenen der Bibliothek durch PCR
Die Makrophage-Bibliothek wurde durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines degenerierten Antisense-Oligonukleotid-PCR-Primers, basierend auf der neuen N-terminalen Aminosäuresequenz, wie in Beispiel 2 beschrieben, gescreent. Die Sequenz des Primers ist in der IUPAC-Nomenklatur unten dargelegt, wobei "I" Inosin ist.
SEQ ID NO: 4
5' ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA 3'
Zur Auswahl der Nukleotide in der dritten Position jeden Codons der Primer wurden die Codonwahltabellen von Wada et al., Nuc. AClds Res., 195:1981-1986 (1991) genutzt. Der Primer wurde in Kombination mit einem Primer spezifisch für entweder die SP6 oder T7 Promotosequenzen verwendet, wobei beide die Klonierungsstelle des pRc/CMV flankieren, um die Makrophagenbibliothekpools von 300.000 Klonen zu screenen. Alle PCR-Reaktionen enthielten 100 ng Template-cDNA, 1 μg jeden Primers, 0,124 mM von jedem dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM MgCl₂ und 2,5 Units Taq-Polymerase. Einem anfänglichen Denaturierungsschritt von 94°C für vier Minuten folgten 30 Zyklen einer Amplifikation von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 60°C und 2 Minuten bei 72°C. Das erhaltene PCR-Produkt wurde in den pBluescript SK^– (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert und seine Nukleotidsequenz durch die Dideoxy-Kettenterminationsmethode bestimmt. Das PCR-Produkt enthielt die durch die neue Peptidsequenz vorhergesagte Sequenz und entsprach den Nukleotiden 1 bis 331 der SEQ ID NO: 7.
Die unten beschriebenen PCR-Primer, welche spezifisch für das oben beschriebene, klonierte PCR-Fragment sind, wurden dann zur Identifizierung eines Volllängenklons entworfen.
Sense-Primer (SEQ ID NO: 5)
5' TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG 3'
Antisense-Primer (SEQ ID NO: 6)
5'CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC 3'
PCR-Raktionen wurden wie oben beschrieben unter Verwendung der Primer durchgeführt um die cDNA-Pools der 300.000 Klone zuerst zu screenen und dann die geeignete Teilmenge der kleineren Pools von 3.000 Klonen zu untersucht. Drei Pools von 3.000 Klonen, welche ein PCR-Produkt der erwarteten Größe ergaben, wurden zur Transformation von Bakterien verwendet.
C. Screenen der Bibliothek durch Hybridisierung
Anschließend wurde DNA der transformierten Bakterien durch Hybridisierung mit dem ursprünglich klonierten PCR-Fragment als Sonde hybridisiert. Kolonien wurden auf Nitrozellulose geblottet und in 50% Fromamid, 0,75 M Natriumchlorid, 0,075 M Natriumcitrat, 0,05 M Natriumphosphat pH 6,5, 1% Polyvinylpyrrolidon, 1% Ficoll, 1% Rinderserumalbumin und 50 ng/ml sonifizierter Lachssperma-DNA prähybridisiert und hybridisiert. Die Hybridisierungssonde wurde durch Random-Hexamerpriming markiert. Nach über Nacht-Hybridisierung bei 42°C wurden die Blots extensiv in 0,03 M Natriumchlorid, 3 mM Natirumcitrat, 0,1% SDS bei 42°C gewaschen. Die Nukleotidsequenz der 10 hybridisierenden Klone wurde bestimmt. Einer der Klone, Klon sAH 406-3, enthielt die Sequenz, die durch die ursprüngliche Peptidsequenz der aus Humanplasma gereinigten PAF-AH-Aktivität vorhergesagt war. Die DNA und abgeleiteten Aminosäuresequenzen der plasmatischen PAF-AH aus Mensch finden sich unter den entsprechenden SEQ ID NOs: 7 und B.
Klon sAH 405-3 enthält ein 1,52 kb-Insert, mit einem offenen Leserahmen, der für das vorhergesagte Protein von 441 Aminosäuren kodiert. Am Aminoterminus geht ein relativ hydrophobes Segment von 41 Resten den N-terminalen Aminosäuren (das Isoleucin an Position 42 der Sequenz ID NO: 8), identifiziert die Proteinmikrosequenzierung, voran. Das kodierte Protein könnte entweder eine lange Signalsequenz oder eine Signalsequenz plus einem zusätzlichen Peptid besitzen, das abgespalten wird, um das reife funktionale Enzym zu erhalten. Das Vorhandensein einer Signalsequenz ist ein Charakteristikum für sekretierte Proteine. Zusätzlich enthält das Protein, kodiert durch den Klon sAH 406-3, das Konsensusmotiv GxSxG (Aminosäuren 271-275 der SEQ ID NO: 8), das vermutlich die aktive Serinstelle aller bekannten Säugetierlipasen, mikrobieller Lipasen und Serinproteasen enthält. Siehe Chapus et al., Biochimie, 70:1223-1224 (1988) und Brenner, Nature, 334:528-530 (1988).
Tabelle 2 unten ist ein Vergleich der Aminosäurezusammensetzung der plasmatischen PAF- AH aus Mensch der Erfindung wie durch die SEQ ID NO: 8 vorhergesagt und der Aminosäureszusammensetzung des wie behauptet gereinigten Materials, beschrieben bei Stafforini et al. (1987), supra.
Tabelle 2
Die Aminosäurezusammensetzung der reifen Form der plasmatischen PAF-AH aus Mensch der Erfindung und die Aminosäurezusammensetzung des zuvor gereinigten Materials, das wie behauptet die plasmatische PAF-AH aus Mensch war, sind eindeutig verschieden.
Beim Versuch des Vergleichs der Hattori et al., supra Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen der cytoplasmatischen PAF-AH aus Rinderhirn mit den Nukleotid und Aminosäuresequenzen der plasmatischen PAF-AH aus Mensch der Erfindung, konnten keine signifikanten, strukturellen Ähnlichkeiten der Sequenzen beobachtet werden.
Beispiel 4
Eine mutmaßliche Spleißvariante des humanen PAF-AH-Gens wurde bei PCR mit Makrophagen und stimulierter PBMC-cDNA entdeckt, wobei Primer eingesetzt wurden, die mit der 5' untranslatierten Region (Nukleotide 31 bis 52 der SEQ ID NO: 7) und der über das Translationsterminationscodon hinausgehenden Region am 3' Ende der PAF-AH-cDNA (Nukleotide 1465 bis 1487 der SEQ ID NO: 7) hybridisierten. Die PCR-Raktionen ergaben zwei Banden auf einem Gel, von denen eine mit der erwarteten Größe der PAF-AH-cDNA aus Beispiel 3 übereinstimmte und die andere um ungefähr 100 bp kürzer war. Sequenzierung beider Banden ergaben, daß die größere Bande die PAF-AH-cDNA aus Beispiel 3 war, während der kürzeren Bande Exon 2 (Beispiel 5 unten) der PAF-AH-Sequenz fehlte, welche für die mutmaßlichen Signal- und Propeptidsequenzen der plasmatischen PAF-AH kodieren. Die vorhergesagte katalytische Triade und alle Cysteine waren in dem kurzen Klon vorhanden, deshalb ist es wahrscheinlich, daß die biochemische Aktivität durch den Klon des kodierten Proteins mit der des plasmatischen Enzyms übereinstimmt.
Beispiel 5
Genomische, plasmatische PAF-AH-Sequenzen aus Mensch wurden auch isoliert. Die Struktur des PAF-AH-Gens wurde durch Isolieren von Lambda- und P1-Phagenklonen, die humane genomische DNA enthielten, durch DNA-Hybridisierung unter Bedingungen hoher Stringenz bestimmt. Fragmente der Phagenklone wurden subkloniert und unter Verwendung von Primern, entworfen, um an regelmäßige Intervalle entlang des cDNA-Klons sAH 406-3 zu binden, sequenziert. Zusätzlich wurden neue Sequenzierprimer entworfen, die an die exonflankierenden Intronregionen binden, um zurück über die Exon-Introngrenzen zu sequenzieren, um die Sequenzen zu bestätigen. Exon/Introngrenzen wurden definiert als Punkte, an denen die genomischen- und cDNA-Sequenzen unterschiedlich waren. Diese Analysen ergaben, daß das humane PAF-AH-Gen 12 Exons umfaßt.
Exons 1, 2, 3, 4, 5, 6 und teilweise 7 wurden aus einer männlichen fötalen Plazentabibliothek isoliert, die in Lamda FIX (Stratagene) kloniert war. Phagenplaques wurden auf Nitrozellulose geblottet und in 50% Formamid, 0,75 M Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,5), 1% Polyvinylpyrrolidon, 1% Ficoll, 1% Rinderserumalbumin und 50 ng/ml sonifizierter Lachssperma-DNA prähybridisiert und hybridisiert. Die Hybridisierungsprobe zur Identifizierung eines Phagenklons enthielt Exons 2-6 und teilweise 7, bestehend aus dem gesamten cDNA-Klon sAH 406-3. Ein Klon enthaltend Exon 1 wurde unter Verwendung eines Fragments vom 5'-Ende des cDNA-Klons (Nukleotide 1 bis 312 der SEQ ID NO: 7) identifiziert. Beide Proben wurden mit ³²P durch ein Hexamer-Random-Priming markiert. Nach Hybridisierung bei 42°C über Nacht wurden die Blots extensiv in 30 mM Natriumchlorid, 3 mM Natriumcitrat, 0,1% SDS bei 42°C gewaschen. Die DNA-Sequenzen der Exons 1, 2, 3, 4, 5 und 6 zusammen mit partiellen Intronrandsequenzen finden sich in den entsprechenden SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13 und 14.
Der Rest des Exons 7 ebenso wie der Exons 8, 9, 10, 11 und 12 wurden von einem P1-Klon subkloniert, der von einer humanen P1-Genombibliothek isoliert worden war. P1-Phagenplaques wurden auf Nitrozellulose geblottet und in 0,75 M Natriumchlorid, 50 mM Natriumphosphat (pH 7,4), 5 mM EDTA, 1% Polyvinylpyrrolidon, 1% Ficoll, 1% Rinderserumalbumin, 0,5% SDS, und 0,1 mg/ml Gesamt-DNA aus Mensch prähybridisiert und hybridisiert. Die Hybridisierungssonde, markiert mit ³²P durch Hexamer-Random-Priming, bestand aus einem 2,6 kb EcoR1-Fragment der genomischen DNA, gewonnen vom 3'-Ende des oben isolierten Lambda-Klons. Dieses Fragment enthielt Exon 6 und den Teil von Exon 7, der im Phagenklon vorhanden war. Nach Hybridisierung bei 65°C über Nacht, wurden die Blots wie oben beschrieben gewaschen. Die DNA-Sequenzen der Exons 7, 8, 9, 10, 11 und 12, zusammen mit partiellen Intronrandsequenzen, sind in den entsprechenden SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19 und 20 aufgeführt.
Beispiel 6
Volllängen-cDNA-Klone der plasmatischen PAF-AH wurden von Maus- und Hundemilz-cDNA-Bibliotheken isoliert, und ein partieller Nagetierklon wurde von einer Rattenthymus-cDNA-Bibliothek isoliert. Die Klone wurden bei niedrig-stringenter Hybridisierung identifiziert (Hybridisierungsbedingungen waren dieselben wie für Exon 1 bis 6 im oberen Beispiel 5 beschrieben, mit Ausnahme, daß 20% Formamid anstelle von 50% Formamid eingesetzt wurden). Ein 1 kb HindIII-Fragment des humanen PAF-AH sAH 406-3 cDNA-Klons (Nukleotide 309 bis 1322 der SEQ ID NO: 7) wurde als Sonde verwendet. Zusätzlich wurde ein partieller Affenklon von einer Affenhirn-cDNA mit PCR isoliert, unter Verwendung von Primern, basierend auf den Nukleotiden 285 bis 303 und 851 bis 867 der SEQ ID NO: 7. Die Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen von den Maus-, Hund-, Ratten- und Affen-cDNA-Klonen, sind in den entsprechenden SEQ ID NOs: 21, 22, 23 und 24 wiedergegeben.
Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der cDNA-Klone mit dem humanen cDNA-Klon ergibt eine prozentuale Identität in den Aminosäuren, deren Werte sich in der folgenden Tabelle finden.
Tabelle 3
Beispiel 7
Um zu bestimmen, ob der human plasmatische PAF-AH cDNA-Klon sAH 406-3 (Beispiel 3) für ein Protein mit PAF-AH-Aktivität kodiert, wurde das Expressionskonstrukt pRc/CMV tansient in COS 7- Zellen exprimiert. Drei Tage nach der Transfektion mit einer DEAE-Dextranmethode wurde das Medium der COS-Zellen auf PAF-AH-Aktivität hin untersucht. Zellen wurden in einer Dichte von 300.000 Zellen pro 60 mm Gewebekulturschale ausgesäht. Am folgenden Tag wurden die Zellen in DMEM, enthaltend 0,5 mg/ml DEAE-Dextran, 0,1 mM Chloroquin und 5-10 μg der Plasmid-DNA, für 2 Stunden inkubiert. Zellen wurden anschließend mit 10% DMSO in phosphatgepufferter Salzlösung für 1 Minute behandelt, mit Medium gewaschen und in DMEM, enthaltend 10% fötales Kälberserum, zuvor mit Diisopropylfluorphosphat (DFP) zur Inaktivierung endogener Rinderserum-PAF-AH behandelt, inkubiert. Nach 3 Tagen Inkubation wurde das Medium der transfizierten Zellen auf PAF-AH-Aktivität hin untersucht. Untersuchungen wurden in Anwesenheit und Abwesenheit von entweder 10 mM EDTA oder 1 mM DFP durchgeführt, um zu bestimmen, ob das rekombinante Enzym kalziumunabhängig war und durch den Serinesteraseinhibitor DFP wie zuvor durch Stafforini et al. (1987), supra, für plasmatische PAF-AH beschrieben, inhibiert wird. Negativkontrollen umfaßten Zellen, transfiziert mit pRc/CMV entweder ohne Insert oder mit dem sAH 406-3-Insert in umgekehrter Orientierung.
PAF-AH-Aktivität in den Transfektionsüberständen wurde durch das Verfahren von Stafforini et al. (1990), supra, mit den folgenden Veränderungen bestimmt. Zusammengefaßt wurde die PAF-AH-Aktivität durch Messung der Hydrolyse von ³H-Acetat aus [Acetyl-³H]PAF (New England Nuclear, Boston, MA) bestimmt. Das wasserfreie 3H-Acetat wurde von markiertem Substrat durch eine Umkehrphasen-Chromatographiesäule über Octadecylsilicagel-Partronen (Baker Research Products, Phillipsburg, PA) getrennt. Untersuchungen wurden unter Verwendung von 10 μl Transfektionsüberstand in 0,1 M Hepespuffer, pH 7,2, in einem Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Eine Gesamtmenge von 50 pmol des Substrats wurde pro Reaktion in einem Verhältnis von 1:5 markierten unmarkierten PAFs eingesetzt. Reaktionen wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und durch Zugabe von 40 μl 10 M Essigsäure gestoppt. Anschließend wurde die Lösung durch die Octadecylsilicagel-Partronen gewaschen, welche dann mit 0,1 M Natriumacetat gespült wurden. Das wäßrige Eluat von jeder Probe wurde gesammelt und in einem Flüssig-Scintillationszähler für eine Minute gezählt. Enzymaktivität wurde in Zählwerte pro Minute ausgedrückt.
Wie in 2 gezeigt, enthielten die Medien von mit sAH 406-3 transfizierten Zellen um eine 4-fach größere PAF-AH-Aktivität, als der Hintergrund. Diese Aktivität wurde nicht durch das Vorhandensein von EDTA beeinflußt, aber verschwand bei 1 mM DFP. Diese Beobachtungen zeigen, daß der Klon sAH 406-3 für eine Aktivität kodiert, die mit der des plasmatischen PAF-AH-Enzyms aus Mensch übereinstimmt.
Beispiel 8
Unter Verwendung der PCR wurde ein proteinkodierendes Fragment der plasmatischen PAF-AH-cDNA aus Mensch vom Klon sAH 406-3 erzeugt, welches für die Subklonierung in einem E.coli-Expressionsvektor leicht zugänglich war. Das subklonierte Segment begann am 5' Ende des humanen Gens mit dem Codon, das für Ile₄₂ (SEQ ID NO: 8) kodiert, dem N-terminalen Rest des aus Humanplasma gereinigten Enzyms. Der Rest des Gens bis zum nativen Terminationscodon war im Konstrukt enthalten. Der benutzte 5'-Sense-PCR Primer war:
SEQ ID NO: 25
5'TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG3'
und enthielt eine XbaI-Klonierungsstelle ebenso wie ein Tanslationsinitiationscodon (unterstrichen). Der verwendete 3'-Antisense-Primer war:
SEQ ID NO: 26
5'ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG3'
und umfaßte das Terminationscodon des sAH 406-3 und enthielt eine EcoRV-Klonierungsstelle. PCR-Reaktionen wurden im wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit XbaI und ExoRV verdaut und in einen pBR322-Vektor subkloniert, der den Trp-Promoter [deBoer et al., PNAS, 80:21-25 (1983)] direkt stromaufwärts der Klonierungsstellt trägt. Der E.coli Stamm XL-1 Blue wurde mit dem Expressionskontrukt transformiert und in L-Flüssigmedium mit 100 μg/ml Carbenicillin kultiviert. Transformanten von Übernachtkulturen wurden pelletiert und in Lysispuffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl in pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 100 μg/ml Lysozym und 0,05 Trypsin-Inhibitoreinheiten (TIU)/ml Aprotinin, resuspendiert. Gefolgt von einer 1 stündigen Inkubation auf Eis und einer Sonifizierung für 2 Minuten wurden die Lysate auf PAF-AH-Aktivität hin durch die in Beispiel 4 beschriebene Methode untersucht. Mit dem Expressionskonstrukt (benannt als trp AH) transformierte E.coli erzeugten ein Produkt mit PAF-AH-Aktivität. Siehe Tabelle 6 in Beispiel 9.
Es wurden auch Konstrukte mit drei zusätzlichen Promotoren, dem tacII-Promotor (deBoer, supra), dem Arabinose (ara)B-Promotor aus Samonella typhimurium [Horwith et al., Gene, 14:309-319 (1981)] und dem Bakteriophagen T7-Promoter, zur Steuerung der Expression der PAF-AH-Sequenzen aus Mensch in E.coli verwendet. Konstrukte umfassend den Trp-Promotor (pUC trp AH), den tacII-Promotor (pUC tac AH), und den araB-Promotor (pUC ara AH) wurden im Plasmid pUC 19 (New England Biolabs, MA) zusammengesetzt, während das Konstrukt, umfassend den T7-Promotor (PET AH) im Plasmid pET15B (Novagen, Madison, WI) zusammengesetzt wurde. Ein Konstrukt enthaltend einen Hybrid-Promoter, pHAB/PH, bestehend aus dem araB-Promotor, fusioniert an die Ribosomenbindungsstelle der T7-Promotorregion, wurde ebenfalls in pET15B kloniert. Alle E.coli-Konstrukte produzierten PAF-AH-Aktivität in einem Bereich von 20 bis 50 U/ml/OD₆₀₀. Diese Aktivität entsprach einer gesamten rekombinanten Proteinmasse von ≥ 1% des Gesamtzellproteins.
Rekombinante PAF-AH aus Mensch wurde ebenfalls in Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Der ADH2-Promotor wurde verwendet, um die rPAF-AH Expression zu steuern und um 7 U/ml/OD₆₀₀ zu produzieren (siehe folgende Tabelle 4).
Tabelle 4
Verschiedene E.coli-Expressionskonstrukte, die PAF-AH mit verlängertem Aminoterminus produzieren, wurden ebenfalls evaluiert. Der N-Terminus der natürlichen plasmatischen PAF-AH wurde als Ile₄₂ durch Aminosäuresequenzierung (Beispiel 2) identifiziert. Jedoch stimmt die direkt stromaufwärts von Ile₄₂ liegende Sequenz nicht mit den gefundenen Aminosäuren der Signalsequenzschnittstellen überein [z.B. wird die "-3-1-Regel" nicht befolgt, da Lysin nicht an Position –1 gefunden wird; siehe von Heijne, Nuc. AClds Res., 14:4683-4690 (1986)]. Vermutliche wird eine klassischere Signalsequenz (M₁-A₁₇) durch das zelluläre Sekretionssystem erkannt, gefolgt von endoproteolytischer Spaltung. Die gesamte kodierende Sequenz der PAF-AH, beginnend am Initiationsmethionin (Nukleotide 162 bis 1487 der SEQ ID NO: 7), wurde für die Expression in E.coli, unter Verwendung des trp-Promotors, verändert. Wie in Tabelle 5 gezeigt, erzeugt dieses Konstrukt aktive PAF-AH, wobei die Expression ungefähr ein Fünfzigstel des Ursprungskonstrukts, beginnend mit Ile₄₂, betrug. Ein anderes Expressionskonstrukt, beginnend mit Val₁₈ (Nukleotide 213 bis 1487 der SEQ ID NO: 7), produzierte aktive PAF-AH zu ungefähr einem Drittel der Höhe des Originalkonstrukts. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß aminoterminale Endverlängerungen nicht kritisch oder notwendig für die Aktivität der rekombinanten PAF-AH, produziert in E.coli, sind.
Tabelle 5 PAF-AH-Aktivität (U/ml/OD₆₀₀
Beispiel 9
Rekombinante plasmatische PAF-AH aus Mensch (beginnend mit Ile₄₂), exprimiert in E.coli, wurde zu einer einzelnen Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Bande mit Hilfe verschiedener Verfahren gereinigt und auf die durch das native PAF-AH-Enzym gezeigte Aktivität hin untersucht.
A. Reinigung der rekombinanten PAF-AH
Das erste verwendete Reinigungsverfahren ist dem in Beispiel 1 für native PAF-AH beschriebenen ähnlich. Die folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Pellets von 50 ml PAF-AH-produzierenden E.coli-Zellen (tranformiert mit Expressionskonstrukt trp AH) wurden wie in Beispiel 8 beschrieben lysiert. Feste Bestandteile wurde durch Zentrifugation bei 10.000 g für 20 Minuten entfernt. Der Überstand wurde mit 0,8 ml/Minute auf eine Blau-Sepharose-Schnellflußsäule gegeben (2,5 cm × 4 cm; 20 ml Bettvolumen), equilibriert mit Puffer D (25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 7,5). Die Säule wurde mit 100 ml Puffer D gewaschen und mit 100 ml Puffer A, enthaltend 0,5 M KSCN, mit 3,2 ml/Minute eluiert. Eine 15 ml aktive Fraktion wurde auf eine 1 ml Cu-Chelat-Sepharosesäule, equilibriert mit Puffer D, geladen. Die Säule wurde mit 5 ml Puffer D gewaschen, gefolgt durch Elution mit 5 ml Puffer D, enthaltend 100 mM Imidazol, durch Schwerkraft. Fraktionen enthaltend PAF-AH-Aktivität wurden durch SDS-PAGE analysiert.
Die Ergebnisse der Reinigung sind in Tabelle 6 dargestellt, wobei eine Einheit μmol PAF-Hydrolyse pro Stunde entspricht. Das bei 4°C gewonnene Reinigungsprodukt erscheint auf einer SDS-PAGE als einzelne intensive Bande unterhalb des 43 kDa-Markers mit einigen diffusen Anfärbungen direkt über und unter derselben. Das rekombinante Material ist deutlich reiner und zeigt größere spezifische Aktivität im Vergleich mit PAF-AH-Präparationen aus Plasma, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Tabelle 6
Wenn dasselbe Reinigungsprotokoll bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, fanden sich zusätzlich zu der Bande unterhalb des 43 kDa-Markers eine Gruppe von Banden unterhalb des 29 kDa-Markers, korrellierend mit PAF-AH-Aktivität der untersuchten Gelstücke. Diese Banden niedrigen Molekulargewichts könnten proteolytische Fragmente der PAF-AH sein, die enzymatische Aktivität behalten haben.
Ein anderes Reinigungsverfahren wurde ebenfalls bei Raumtemperatur durchgeführt. Pellets (100 g) der PAF-AH-produzierenden E.coli-Zellen (transformiert mit dem Expressionskonstrukt pUC trp AH) wurden in 200 ml Lysispuffer (25 mM Tris, 20 mM CHAPS, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 μg/ml Benzamidin, pH 7,5) resuspendiert und durch dreimaliges Laufen durch einen Mikroverflüssiger bei 15.000 psi lysiert. Feste Bestandteile wurden durch eine Zentrifugation bei 14.300 g für 1 Stunde entfernt. Der Überstand wurde 10-fach in Verdünnungspuffer verdünnt [25 mM MES (2-[N-morpholino]ethansulfonsäure), 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, pH 4,9] und mit 25 ml/Minute auf eine S-Sepharose-Schnellflußsäule (200 ml) (eine Kationenaustauschersäule), äquilibriert in Puffer E (25 mM MES, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 5,5), geladen. Die Säule wurde mit 1 Liter Puffer E gewaschen, mit 1 M NaCl eluiert und das Eluat in 50 ml Fraktionen gesammelt, wobei ein pH 7,5 mit 0,5 ml 2 M Tris-Base eingestellt wurde. Fraktionen mit PAF-AH-Aktivität wurden vereinigt und auf 0,5 M NaCl eingestellt. Der S-Pool wurde mit 1 ml/Minute auf eine Blau-Sepharose-Schnellflußsäule (2,5 cm × 4 cm; 20 ml) geladen, die mit Puffer F (25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) equilibriert worden war. Die Säule wurde mit 100 ml Puffer F gewaschen und mit 100 ml Puffer F, enthaltend 3 M NaCl, mit 4 ml/Minute eluiert. Der Blau-Sepharose-Schnellflußchromatographieschritt wurde danach wiederholt, um das Endotoxinniveau in der Probe zu reduzieren. Fraktionen enthaltend PAF-AH-Aktivität wurden vereinigt und gegen Puffer G (25 mM Tris, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 80, 1 mM EDTA) dialysiert.
Die Ergebnisse der Reinigung sind in Tabelle 7 gezeigt, wobei eine Einheit μmol PAF-Hydrolyse pro Stunde gleichkommt.
Tabelle 7
Das erhaltene Reinigungsprodukt erschien auf einer SDS-PAGE als eine einzelne, starke Bande unterhalb des 43 kDa-Markers, mit einigen diffusen Färbungen direkt oberhalb und unterhalb derselben. Das rekombinante Material ist signifikant reiner und zeigt größere spezifische Aktivität im Vergleich mit PAF-Präparationen aus Plasma, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Noch eine anderes durch die Erfindung in Erwägung gezogenes Reinigungsverfahren beinhaltet die folgenden Zelllyse-, Klärungs- und ersten Säulenschritte. Zellen wurden 1:1 in Lysispuffer (25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Tween 80, 2 mM EDTA) verdünnt. Die Lyse wurde in einem gekühlten Mikroverflüssiger bei 15.000-20.000 psi durch 3-faches passieren des Materials durchgeführt, um einen Zellaufschluß von > 99% zu erreichen. Das Lysat wurde 1:20 in Verdünnungspuffer (25 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA) verdünnt und auf eine Säule mit Q-Sepharose-"Big Bead"-Chromatographiemedium (Pharmacia), die mit 25 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,015% Tween 80 äquilibriert worden war, gegeben. Das Eluat wurde 1:10 mit 25 mM MES pH 5,5, 1,2 M Ammoniumsulfat, 1 mM EDTA verdünnt und auf ein Butyl-Sepharose-Chromatographiemedium (Pharmacia), äquilibriert im selben Puffer, aufgebracht. PAF-AH-Aktivität wurde mit 25 mM MES pH 5,5, 0,1% Tween 80, 1 mM EDTA eluiert.
8. Aktivität der rekombinanten PAF-AH
Die bemerkenswerteste Eigenschaft der PAF-Acetylhydrolase ist gekennzeichnet durch eine Spezifität für Substrate mit einem kurzen Rest in der sn-2-Position des Substrats. Diese strikte Spezifität unterscheidet PAF-Acetylhydrolase von anderen Formen der PLA₂. Deshalb wurde zur Bestimmung, ob rekombinante PAF-AH Phosphorlipide mit langkettigen Fettsäuren in der sn-2-Position abbaut, die Hydrolyse von 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholin(ArachidonoylPC) eingesetzt, da dies das bevorzugte Substrat einer gut charakterisierten Form der PLA₂ ist. Wie von vorherigen Studien mit nativer PAF-AH vorherzusagen war, wurde dieses Phosphorlipid nach Inkubation mit rekombinanter PAF-AH nicht hydrolisiert. In zusätzlichen Experimenten wurde ArachidonoylPC in einem Standard-PAF-Hydrolyseversuch bei Konzentrationen um von 0 bis 125 μM eingesetzt, um zu bestimmen, ob es die Hydrolyse des PAF durch rekombinante PAF-AH inhibierte. Es konnte keine Inhibition der PAF-Hydrolyse festgestellt werden, selbst bei der höchsten Konzentration der PAF-AH, die 5-fach größer war als die Konzentration des PAF. Somit zeigt rekombinante PAF-AH dieselbe Substratselektivität wie das native Enzym; langkettige Substrate werden nicht erkannt. Ferner baut das rekombinante PAF-AH-Enzym rasch ein oxidiertes Phosphorlipid (GlutaroylPC) ab, welches einer oxidativen Abspaltung der sn-2 Fettsäure unterworfen worden war. Native plasmatische PAF-AH hat verschiedene andere Eigenschaften, wie Calciumunabhängigkeit und Resistenz gegenüber Verbindungen, die Sulfhydrylgruppen modifizieren oder Disulfide zerstören, die sie von anderen Phospholipasen unterscheidet.
Beide, das native und das rekombinante, plasmatische PAF-AH-Enzym sind sensitiv gegenüber DFP, was darauf schließen läßt, daß ein Serin einen Teil ihrer aktiven Zentren umfaßt. Eine ungewöhnliche Eigenschaft der nativen plasmatischen PAF-Acetylhydrolase ist, daß sie eng mit zirkulierenden Lipoproteinen assoziiert ist und ihre katalytsiche Wirksamkeit durch die Lipoproteinumgebung beeinflußt ist. Wird rekombinante PAF-AH der Erfindung mit Humanplasma inkubiert (vorher mit DFP behandelt, um die endogene Enzymaktivität zu beseitigen), assoziiert sie mit Lipoproteinen niedriger und hoher Dichte in derselben Weise, wie die native Aktivität. Dieses Ergebnis ist wichtig, da ein wesentlicher Hinweis besteht, daß die Modifikation der Lipoproteine geringer Dichte wesentlich für die in Atheroma beobachtete Cholesterinablagerung ist, und das Oxidieren von Lipiden ein Initiationsfaktor in diesem Prozeß ist. PAF-AH schützt Lipoproteine geringer Dichte vor Modifikationen unter oxidativen Bedingungen in vitro und könnte solch eine Rolle auch in vivo haben. Die Verabreichung der PAF-AH ist somit für die Supression der Oxidation von Lipoproteinen in atherosklerotischen Plaques ebenso wie für das Auflösen von Entzündungen angezeigt.
Alle Ergebnisse bestätigen, daß der cDNA Klon sAH 406-3 ein Protein mit den Aktivitäten der plasmatischen PAF-Acetylhydrolase aus Mensch kodiert.
Beispiel 10
Verschiedene andere rekombinante PAF-AH-Produkte wurden in E.coli exprimiert. Die Produkte umfaßten PAF-AH-Analoga mit Einzelaminosäuremutationen und PAF-AH-Fragmente.
A. PAF-AH Aminosäuresubstitutionsprodukte
PAF-AH ist eine Lipase, da sie das Phospholipid PAF hydrolisiert. Während keine offensichtlich allgemeine Ähnlichkeit zwischen der PAF-AH und andern charakterisierten Lipasen besteht, werden konservierte Reste im Vergleich mit strukturell charakterisierten Lipasen gefunden. Ein Serin wurde als ein Mitglied des aktiven Zentrums identifiziert. Das Serin, zusammen mit einem Aspartatrest und einem Histidinrest, bildet eine katalytische Triade, die das aktive Zentrum der Lipase darstellt. Die drei Reste stoßen in der primären Proteinsequenz nicht aneinander, aber strukturelle Studien haben gezeigt, daß die drei Reste im dreidimensionalen Raum beieinander liegen. Vergleiche der Strukturen von Säugetierlipasen schlagen vor, daß der Asp-Rest im allgemeinen 24 Aminosäuren C-terminal vom Serin des aktiven Zentrums ist. Zusätzlich ist das Histidin im allgemeinen 109 bis 111 Aminosäuren C-terminal vom Serin des aktiven Zentrums.
Durch ortsspezifische Mutagenese und PCR wurden individuelle Codons der humanen PAF-AH-kodierenden Sequenz so modifiziert, daß sie für Alaninreste kodieren und in E.coli exprimiert wurden. Wie in Tabelle 8 unten gezeigt, wobei zum Beispiel die Abkürzung "S 108A" andeuten, daß der Serinrest an Position 273 durch Alanin ausgetausche wurde, zerstören Punktmutationen von Ser₂₇₃, Asp₂₉₆ oder His₃₅₁ komplett die PAF-AH-Aktivität.
Die Entfernung zwischen den Resten des aktiven Zentrum ist für die PAF-AH (Ser bis Asp, 23 Aminosäuren; Ser bis His, 78 Aminosäuren) und anderen Lipasen ähnlich. Diese Experimente zeigen, daß Ser₂₇₃, Asp₂₉₆ und His₃₅₁ entscheidende Reste für die Aktivität und deshalb wahrscheinliche Kandidaten für die Reste der katalytischen Triade sind. Cysteine sind häufig entscheidend für die funktionale Vollständigkeit von Proteinen, da sie die Fähigkeit besitzen, die Sulfidbindungen zu bilden. Das plasmatische PAF-AH-Enzym enthält fünf Cysteine. Um zu bestimmen, ob eines der fünf Cysteine entscheidend für die Enzymaktivität ist, wurde jedes Cystein einzeln in ein Serin mutiert und die daraus resultierenden Mutanten wurden in E.coli exprimiert. Wie unten in Tabelle 8 gezeigt, ergibt sich ein signifikanter, aber nicht totaler Verlust der PAF-AH-Aktivität durch die Umwandlung von entweder Cys₂₂₉ oder Cys₂₉₁ zu Serin. Deshalb scheinen diese Cysteine für die vollständige PAF-AH-Aktivität notwendig zu sein. Andere Punktmutationen hatten einen geringen oder keinen Effekt auf die katalytische PAF-AH-Aktivität. In Tabelle 8 repräsentierten "+ + + +" eine Wildtyp-PAF-AH-Aktivität von ungefähr 40-60 U/ml/OD₆₀₀, "+ + +" eine Aktivität von ungefähr 20-40 U/ml/OD₆₀₀, "+ +" eine Aktivität von ungefähr 10-20 U/ml/OD₆₀₀, "+" repräsentiert 1-10 U/ml/OD₆₀₀ und "–" gibt eine Aktivität < 1 U/ml/OD₆₀₀ an. Tabelle 8

Mutation PAF-AH-Aktivität

Wildtyp ++++

S108A ++++

S273A –

D296A –

D338A ++++

H351A –

H395A, H399A ++++

C67S +++

C229S +

C291S +

C334S ++++

C407S +++
B. PAF-AH-Fragmentprodukte
C-terminale Deletionen wurden durch Verdauen des 3'-Endes der PAF-AH-kodierenden Sequenz mit Exonuklease III für verschiedene Mengen und Zeiten erzeugt und anschließend wurden die verkürzten kodierenden Sequenzen in Plasmid-DNA ligiert, die in allen drei Leserahmen Stopcodons kodiert. Zehn verschiedene Deletionskonstrukte wurden durch DNA-Sequenzanalysen, Proteinexpression und PAF-AH-Aktivität charakterisiert. Das Entfernen von einundzwanzig oder dreißig C-terminalen Aminosäuren reduziert die katalytische Aktivität erheblich und das Entfernen von zweiundfünfzig Resten zerstört die Aktivität vollständig. Siehe 3.
Ähnliche Deletionen wurden am aminoterminalen Ende der PAF-AH gemacht. Fusionen der PAF-AH mit E.coli Thioredoxin am N-Terminus wurden hergestellt, um ein einheitliches hohes Expressionsniveau der PAF-AH-Aktivität zu ermöglichen [LaVallie et al., Bio/technology, 11:187-193 (1993)]. Das Entfernen von neunzehn Aminosäuren des natürlicher Weise prozessierten N-Terminus (Ile₄₂) zerstört vollständig die enzymatische Aktivität des Fusionsproteins. Siehe 3.
Beispiel 11
Eine vorherige Analyse des Expressionsmusters der plasmatischen PAF-AH-mRNA aus Mensch in humanen Geweben wurde mit Northern Blot-Hybridisierung durchgeführt.
RNA wurde aus humanen, zerebralem Cortex, Herz, Niere, Plazenta, Thymus und Mandel unter Verwendung des RNA Stat 60 (Tel-Test "B", Friendswood, TX) präpariert. Zusätzlich wurde RNA aus humanen, hämatopoetischen, vorläuferähnlichen Zelllinien, THP-1 (ATCC TIB 202), präpariert, welche zur Differenzierung in einem makrophagen-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung des Phorbolesters Phorbolmyristylacetat (PMA) induziert worden waren. Gewebe-RNA und RNA, präpariert aus der promyelozytischen THP-1-Zellinie, vor, während und 1 bis 3 Tage nach Induktion, wurden elektrophoretisch auf einem 1,2% Agaroseformaldehydgel aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran transferriert. Die Vollängen-human-plasmatische PAF-AH-cDNA, sAH406-3, wurde durch Random-Priming markiert und mit der Membran unter wie in Beispiel 3 beschriebenen identischen Bedingungen für das Bibliotheks-Screening hybridisiert. Anfängliche Ergebnisse lassen vermuten, daß die PAF-AH-Sonde mit einer 1,8 kb-Bande der RNA aus Thymus, Mandel und zu einem geringeren Teil Plazenta hybridisierte.
Die Expression der PAF-AH-RNA in Monozyten, isoliert aus Humanblut und während ihrer Spontandifferenzierung in Makrophagen während der Kultur, wurde ebenfalls untersucht. Wenig oder keine RNA wurde in frischen Monozyten detektiert, die Expression wurde aber während der Differenzierung in Makrophagen induziert und erhalten. Es wurde eine gleichzeitige Akkumulation der PAF-AH-Aktivität im Kulturmedium der sich differenzierenden Zellen gefunden. Expression des plasmatischen PAF-AH-Transkripts aus Mensch wurde auch in THP-1-Zell-RNA nach 1 Tag, aber nicht nach 3 Tagen nach der Induktion beobachtet. THP-1-Zellen haben keine mRNA für PAF-AH im Grundstadium exprimiert.
Beispiel 12
PAF-AH-Expression in Geweben von Mensch und Maus wurden durch in situ-Hybridisierung untersucht.
Humanes Gewebe wurde vom National Disease Reserch Interchange und dem Cooperative Human Tissue Network erhalten. Normales Maushirn und Rückenmark, sowie EAE Stufe 3-Mausrückenmark wurden von S/JLJ-Mäusen geerntet. Normale S/JLJ-Mausembryonen wurden elf bis achtzehn Tage nach der Befruchtung geerntet.
Die Gewebeteile wurden in Tissue Tek II cryomolds (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) mit einer geringen Menge von OCT-Zusammensetzung (Miles, Inc., Elkhan, IN) gegeben. Sie wurden im Kryogefäß zentriert, das Kryogefäß mit OCT-Zusammensetzung gefüllt, anschließend in einem Container mit 2-Methylbutan [C₂H₅CH(CH₃)₂, Alrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, WI] gegeben und der Container in flüssigem Stickstoff plaziert. Sobald das Gewebe und die OCT-Zusammensetzung im Kryogefäß gefroren waren, wurden die Blöcke bei –80°C bis zum Schneiden gelagert. Die Gewebeblöcke wurden auf 6 μm Dicke geschnitten und an Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) beschichteten Objekträgern gebunden, bei –70°C gelagert und bei 50°C für ungefähr 5 Minuten plaziert, um sie aufzuwärmen und Kondensat zu entfernen und wurden anschließend für 20 Minuten in 4% Paraformaldehyd bei 4°C fixiert, für 1 Minute bei 4°C in jeder Stufe (70%, 95%, 100% Ethanol) dehydriert und für 30 Minuten bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Die Schnitte wurden für 2 Minuten bei 70°C in 70% Formamid/2X SSC denaturiert, zweimal in 2X SSC gespült, dehydriert und anschließend für 30 Minuten an der Luft getrocknet. Die Gewebe wurden in situ mit radioaktiv markierter Einzelstrang-mRNA hybridisiert, hergestellt aus DNA, abgeleitet von einem internen 1 Kb HindIII-Fragment des PAF-AH-Gens (Nukleotide 308 bis 1323 der SEQ ID NO: 7) mit in vitro RNA transcription incorporation ³⁵S-UTP (Amersham). Die Sonden wurden in unterschiedlichen Längen von 250-500 bp eingesetzt. Die Hybridisierung wurde über Nacht (12-16 Stunden) bei 50°C bp durchgeführt; die ³⁵S-markierten Riboproben (6 × 10⁵ cpm/Schnitt), tRNA (0,5 μg/Schnitt) und Diethylpyrocarbonat (depc)-behandeltes Wasser wurden zum Hybridisierungspuffer dazugegeben, um die Endkonzentration von 50% Formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10% Dextransulfat, 1X Denhardt's Lösung, 100 mM Dithiothreitol (DTT) und 5 mM EDTA zu erreichen. Nach Hybridisierung wurden die Schnitte für 1 Stunde beim Raumtemperatur in 4X SSC/10 mM DTT, anschließend für 40 Minuten bei 60°C in 50% Formamid/1X SSC/10 mM DTT, 30 Minuten bei Raumtemperatur in 2X SSC und 30 Minuten bei Raumtemperatur in 0,1X SSC gewaschen. Die Schnitte wurden dehydriert, für 2 Stunden luftgetrocknet, mit einer Kodak NTB2-Fotoemulsion beschichtet, für 2 Stunden luftgetrocknet, entwickelt (nach Lagerung bei 4°C in kompletter Dunkelheit) und mit Hematoxylin/Eosin gegengefärbt.
A. Hirn
Cerebellum. Sowohl in den Gehirnen von Maus und Mensch wurden in der Purkinje-Zellschicht des Cerebellums, ebenso wie in individuellen neuronalen Zellkörpern des Dentatums (eines der vier tiefen Nuklei des Cerebellums) starke Signale gesehen. Zusätzlich wurden Signale auf einzelnen Zellen in den granulären und molekularen Schichten der grauen Hirnmasse gesehen.
Hippocampus. Im humanen Hippocampusschnitt zeigten einzelne Zellen, welche wie neuronale Zellkörper aussahen, über den Schnitt verteilt starke Signale.
Hirnstamm. Hirnstammschnitte von Mensch und Maus zeigten starke Signale in einzelnen Zellen der grauen Hirnmasse.
Cortex. In Cortexschnitte vom Mensch, entnommen dem cerebralen, okzipitalen und temporalen Cortex und in Gesamthirnschnitten der Maus zeigten einzelne Zellen überall im Cortex starke Signale. Es scheint keine Differenzierung im Expressionsmuster der verschiedenen Cortexschichten zu geben. Diese in situ-Hybridisierungsergebnisse unterscheiden sich von den Ergebnissen, die mit Hilfe des Northern Blots für den cerebralen Cortex gewonnen wurden. Der Unterschied ist vermutlich ein Ergebnis der größeren Sensitivität der in situ-Hybridisierung, verglichen mit den Northern Blot.
Hypophyse. Ein etwas schwächeres Signal wurde in verstreuten einzelnen Zellen des Pars distalis des humane Gewebeschnitts gesehen.
B. Humaner Dickdarm
Sowohl der normale als auch der Dickdarm der Crohn-Krankheit zeigen Signale in der lymphatischen Aggregation, vorhanden in der Mucosa der Schnitte, wobei die Höhe des Signals in dem Schnitt von Patienten mit der Crohn-Krankeit leicht höher ist. Der Dickdarm bei der Chrohn-Krankheit zeigt starke Signale in der Lamina propria. Ein ähnlich hohes Signalniveau wurde im Schnitt eines erkrankten Wurmfortsatzes beobachtet, während der normale Wurmfortsatz ein niedriges aber dennoch detektierbares Signal zeigte. Die Schnitte von Patienten mit ulzerativer Colitis zeigten weder in den lymphatischen Aggreagationen noch der Laminia propria deutliche Signale.
C. Humane Mandeln und Th.
Starke Signale wurde in zerstreuten Gruppen einzelner Zellen innerhalb des Keimzentrums der Mandeln und innerhalb des Thymus gesehen.
D. Humane Lymphknoten
Starke Signale wurden in dem Lymphknotenschnitt eines normalen Spenders beobachtet, wobei etwas schwächere Signale im Lymphknotenschnitt eines Spenders mit septischem Schock beobachtet wurden.
E. Humaner Dünndarm
Sowohl im normalen Dünndarm als auch im Dünndarm der Crohn-Krankheit waren schwache Signale in den Peyerschen Plaques und Schnitten der Lamina propria vorhanden, wobei das Signal im erkrankten Gewebe leicht höher war.
F. Humane Milz und Lunge
In keinem der Milz- (normale und Milzabzeßschnitte) oder Lungen- (normal und Emphysemschnitte) Gewebe wurde ein Signal beobachtet.
G. Mausrückenmark
Sowohl im normalen als auch EAE Stadium 3-Rückenmark waren starke Signale in der grauen Masse des Rückenmarks vorhanden, wobei die Expression leicht höher im EAE Stadium 3-Rückmark war. Im EAE Stadium 3-Rückenmark zeigten Zellen der weißen Masse und perivaskulären Manschetten, wahrscheinlich aufgrund infiltrierender Makrophagen und/oder anderer Leukozyten, Signale, die im normalen Rückenmark nicht vorhanden waren.
H. Mausembryonen
In Tag 11-Embryonen war das Signal im Zentralnervensystem im vierten Ventrikel offensichtlich, wobei es während der embryonalen Entwicklungsphase konstant blieb und sich im Cerebellum und Hirnstamm entwickelte. Während die Embryonen reiften, wurde das Signal im Zentralnervensystem im Rückenmark (Tag 12), im primären Cortex und Ganglion Gasseri (Tag 14) und der Hypophyse (Tag 16) sichtbar. Im peripheren Nervensystem (beginnend an Tag 14 oder 15) wurde bei Nerven, die das Rückenmark verlassen, ein Signal beobachtet und an Tag 17 erschien ein starkes Signal in der Nähe der Schnurrhaare des Embryo. In der Leber und Lunge an Tag 14, dem Darm (beginnend an Tag 15) und dem hinteren Teil des Mund/Rachens (beginnend an Tag 16) wurde auch eine Expression gesehen. Mit Tag 18 hatte sich das Expressionsmuster in Signale im Cortex, im Nachhirn (Cerebellum und Stammhirn), in Nerven, die die lumbale Region des Rückenmarks verlassen, in hinteren Bereichen des Mund/Rachenraums, in der Leber, in den Nieren und wahrscheinlich schwache Signale in Lunge und Darm differenziert.
G. Zusammenfassung
PAF-AH-mRNA-Expression in den Mandeln, Thymus, Lymphknoten, Peyerschen Plaques, Wurmfortsatz und lymphatischen Ansammlungen des Darms bestätigt die Schlüsse, daß die vermutlich vorherrschende in vivo-Quelle der PAF-AH Makrophagen sind, da diese Gewebe alle durch Gewebemakrophagen besiedelt sind, die als phagozytierende und Antigenprozessierende Zellen dienen.
Expression der PAF-AH in entzündeten Geweben würde die Hypothese bestätigen, daß die Rolle der von Monozyten abgeleiteten Makrophagen das Auflösen der Entzündung ist. Von der PAF-AH wird angenommen, daß sie PAF und die pro-inflammatorischen Phospholipide inaktiviert und somit die inflammatorische Kaskade von Ereignissen, die auf diese Mediatoren zurückzuführen sind, herunterreguliert.
PAF ist im gesamten Gehirngewebe nachgewiesen worden und wird von zerebellären, granulären Rattenzellen in Kultur sekretiert. In vitro- und in vivo-Experimente haben gezeigt, daß PAF einen spezifischen Rezeptor im neuralen Geweben bindet und funktionale und phänotypische Veränderungen induziert, wie Calciummobilisierung, Hochregulierung von tanskriptionsaktivierenden Genen und die Differenzierung der neuralen Vorläuferzelllinie PC 12. Diese Beobachtungen lassen eine physiologische Rolle des PAF im Gehirn vermuten und im Einklang damit haben neueste Experimente mit Kulturen hippocampaler Gewebebereiche und PAF-Analoga und -Antagonisten impliziert, daß PAF ein wichtiger retrograder Bote im hippocampalen Langzeitleistungsvermögen ist. Zusätzlich zu seinen pathologischen Effekten bei Entzündungen scheint daher PAF an normalen, neuronalen Signalprozessen teilzunehmen. Die Expression extrazellulärer PAF-AH im Gehirn könnte zur Regulierung der Dauer und Stärke der PAF-vermittelten Signalübertragung dienen.
Beispiel 13
Monoklonale Antikörper spezifisch gegen rekombinante, plasmatische PAF-AH aus Mensch wurden unter Verwendung von E.coli produzierter PAF-AH als Immunogen erzeugt.
Die Maus Nr. 1342 wurde am Tag 0, am Tag 19 und Tag 40 mit rekombinanter PAF-AH gespritzt. Zur Perfusionsverstärkung wurde die Maus mit dem Immunogen in PBS gespritzt, vier Tage später wurde die Maus getötet, die Milz steril entnommen und in 10 ml serumfreien RPMI 1640 gegeben. Eine Einzelzellsuspension wurde durch Zerreiben der Milz zwischen den Milchglasenden zweier Glasmikroskopträger, überschwemmt mit serumfreien RPMI 1640, hergestellt, mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 Units/ml Penicillin und 100 μg/ml StreptomyCln (RPMI) (Gibco, Canada) versetzt. Die Zellsuspension wurde durch ein steriles 70-Maschen Nitex-Zellsieb (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) gegeben und zweimal durch Zentrifugation bei 200 g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 20 ml serumfreien RPMI gewaschen. Thymozyten, entnommen von 3 nicht-immunisierten Balb/c-Mäusen, wurden in ähnlicher Weise präpariert. NS-1-Myelomazellen, für 3 Tage vor der Fusion in der Logphase in RPMI mit 11% fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) gehalten, wurden bei 200 g für 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet zweimal wie im vorhergegangenen Abschnitt beschrieben gewaschen.
1 × 10⁸ Milzzellen wurden mit 2,0 × 10⁷ NS-1-Zellen vereinigt, zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Zellpellet wurde durch Klopfen des Gefäßes aufgelockert und 1 ml 37°C warmes PEG 1500 (50% in 75 mM Hepes, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) wurde unter Schwenken innerhalb 1 Minute zugefügt, gefolgt von 7 ml Serum-freiem RPMI über 7 Minuten. Zusätzliche 8 ml RPMI wurden zugefügt und die Zellen bei 200 g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstands wurde das Pellet in 200 ml RPMI, enthaltend 15% FBS, 100 μM Natriumhypoxanthin, 0,4 μM Aminopterin, 16 μM Thymidin (HAT) (Gibco), 25 Units/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) und 1,5 × 10⁶ Thymozyten/ml, resuspendiert und in 10 Corningflachboden-96 Well-Gewebekulturplatten (Corning, Corning New York) ausplattiert.
An den Tagen 2, 4 und 6 nach der Fusion wurden 100 μl Medium aus den Wells der Fusionsplatten entfernt und durch frisches Medium ersetzt. An Tag 8 wurde die Fusion mit Hilfe eines ELISAs gescreent und auf das Vorhandensein von Maus-IgGs hin, bindend an rekombinante PAF-AH, untersucht. Immunolon-4-Platten (Dynatech, Cambridge, MA) wurden für 2 Stunden bei 37°C mit 100 ng/well rekominanter PAF-AH, verdünnt in 25 mM TRIS, pH 7,5, beschichtet. Die Beschichtungslösung wurde abgesaugt und 200 μl/well einer Blockierungslösung [0,5% Fischhautgelatine (Sigma), verdünnt in CMF-PBS] wurden zugegeben und und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS mit 0,05% Tween 20 (PBST) gewaschen und 50 μl Kulturüberstand wurden zugefügt. Nach Inkubation bei 37°C für 30 Minuten und einem wie oben beschriebenen Waschen, wurden 50 μl Meerrettichperoxidase, gekoppelt an einen Ziege-Anti-Maus IgG(fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania), verdünnt 1:3500 in PBST, zugefügt. Die Platten wurden wie oben inkubiert, viermal mit PBST gewaschen und 100 μl Substrat, enthaltend 1 mg/ml O-Phenylendiamin (Sigma) und 0,1 μl/ml 30% H₂O₂ in 100 mM Citrat, pH 4,5, zugegeben. Die Farbreaktion wurde nach 5 Minuten durch die Zugabe von 50 μl 15% H₂SO₄ gestoppt. A₄₉₀ wurde mit Hilfe eines Plattenlesegeräts (Dynatech) gelesen.
Die selektierten Fusionswells wurden zweimal durch Verdünnung in 96-Wellplatten subkloniert und visuell die Anzahl von Kolonien/Well nach 5 Tagen bestimmt. Die klonierten Hybridomaklone waren 90D1E, 90E3A, 90E6C, 90G11D (ATCC HB 11724) und 90F2D (ATCC HB 11725).
Die durch die Hybridomas produzierten monoklonalen Antikörper wurden unter Verwendung des Isotyping-Systems (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) isotypisiert. Die Ergebnisse zeigten, daß die durch die Hybridomas der Fusion 90 produzierten monoklonalen Antikörper alle IgG₁ waren.
Beispiel 14
Experimentelle Studien wurden zur Evaluierung der in vivo therapeutischen Effekte der rekombinanten PAF-AH der Erfindung auf akute Entzündungen unter Verwendung eines Rattenfußödemmodells [Henriques et al., Br. J. Pharmacol, 106:579-582 (1992)] durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Studien demonstrierten, daß PAF-AH PAF-induzierte Ödeme blockiert. Parallele Studien wurden zum Vergleich der Effektivität der PAF-AH mit zwei kommerziell zur Verfügung stehenden PAF-Antagonisten durchgeführt.
A. Herstellung der PAF-AH
Mit dem PAF-AH-Expressionsvektor puc trp AH transformierte E.coli wurden in einem Mikroverflüssiger lysiert, die festen Bestandteile abzentrifugiert und der Zellüberstand auf eine S-Sepharosesäule (Pharmacia) geladen. Die Säule wurde extensiv mit einem Puffer, enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, 25 mM MES und 1 mM EDTA, pH 5,5, gewaschen. PAF-AH wurde durch Ansteigen der NaCl-Konzentration des Puffers auf 1 M eluiert. Die Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Blau-Sepharosesäule (Pharmacia) wurde dann als zusätzlicher Reinigungsschritt genutzt. Vor Aufladen der PAF-Präparation auf die Blau-Sepharosesäule wurde die Probe 1:2 verdünnt, um die NaCl-Konzentration auf 0,5 M zu reduzieren und der pH wurde auf 7,5 eingestellt. Nach extensivem Waschen der Blau-Sepharosesäule mit einem Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, 25 mM Tris, 10 mM CHAPS und 1 mM EDTA, pH 7,5, wurde die PAF-AH durch Ansteigen der NaCl-Konzentration auf 3,0 M eluiert.
Die Reinheit der auf diese Weise isolierten PAF-AH betrug im allgemeinen 95%, wie durch SDS-PAGE geschätzt wurde, mit einer Aktivität im Bereich von 5.000-10.000 U/ml. Zusätzliche Qualitätskontrollen jeder PAF-AH-Präparation, beinhaltend die Bestimmung des Endotoxingehalts und Hämolyseaktivität bei frisch gewonnenen Rattenerythrocyten, wurde durchgeführt. Ein Puffer mit 25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 7,5 diente als Lagermedium für das Enzym ebenso wie als Träger für die Verabreichung. Die im Experiment verwendeten Dosen basierten auf dem Enzymaktivitätstest, der direkt vor dem Experiment durchgeführt wurde.
B. Induktion von Ödemen
Sechs bis acht-Wochen-alte weibliche Long Evans Ratten (Charles River, Wilmington, MA) mit einem Gewicht von 180-200 g, wurden für alle Experimente verwendet. Vor dem experimentellen Eingriff wurden die Tiere mit einem Gemisch des Anästhetikums Ketaset (Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA), Rompun (Miles, Shawnee Mission, KS) und Ace Promazine (Aveco, Fort Dodge, IA) anästhetisiert, indem subkutan ungefähr 2,5 mg Ketaset, 1,6 mg Rompun, 0,2 mg Ace Promazine pro Tier pro Dosis verabreicht wurden. Das Ödem wurde durch Verabreichung von entweder PAF oder Zymosan im Fuß wie folgt induziert. PAF (Sigma Nr. P-1402) wurde für jedes Experiment frisch hergestellt aus einer 19,1 mM Stock-Lösung, gelagert in Chloroform/Methanol (9:1) bei –20°C. Die benötigten Volumina wurden unter N₂ heruntergetrocknet, in einem Puffer mit 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5 und 0,25% BSA verdünnt und für 5 Minuten sonifiziert. Tiere, denen 50 μl PAF (Enddosis 0,96 nmol) subkutan zwischen die hinteren Fußballen verabreicht worden war, zeigten ein Ödem nach 1 Stunde und in einigen Experimenten wieder nach 2 Stunden. Zymosan A (Sigma Nr. A-8800) wurde frisch vor jedem Experiment als eine Suspension von 10 mg/ml in PBS hergestellt. Tiere, die 50 μl Zymosan (Enddosis 500 μg) subkutan zwischen die hinteren Fußballen erhielten, zeigten die Entwicklung eines Ödems nach 2 Stunden.
Das Ödem wurden durch Messung des Fußvolumens direkt vor der Verabreichung des PAF oder Zymosans und zu einem angegebenen Zeitpunkt nach Behandlung mit PAF oder Zymosan quantifiziert. Das Ödem wird beschrieben als das Ansteigen des Fußvolumens in Millilitern. Die Vermessung der Volumenänderung wurde bei anästhetisierten Tieren unter Verwendung eines Plethysmometers (UGO Basile, Modell Nr. 7150) durchgeführt, was das veränderte Wasservolumen des untergetauchten Fußes mißt. Um sicherzustellen, daß das Untertauchen des Fußes von einem Zeitpunkt zum nächsten vergleichbar war, wurden die hinteren Füße mit unauslöschlicher Tinte, wo die Haarlinie den Hacken trifft, markiert. Wiederholte Messungen desselben Fußes unter Verwendung dieser Technik ergaben, daß die Präzision innerhalb von 5% liegt.
C. PAF-AH-Verabreichungswege und -Dosen
PAF-AH wurde lokal zwischen den Fußpolstern oder systematisch durch IV-Injektion in die Schwanzvene injiziert. Bei lokaler Verabreichung erhielten die Ratten 100 μl PAF-AH (4000-6000 U/ml), subkutan verabreicht zwischen die rechten hinteren Fußpolster. Der linke Fuß diente als Kontrolle bei Verabreichung von 100 μl Träger (gepufferte Salzlösung). Für die systemische Verabreichung der PAF-AH erhielten die Ratten die injizierten Einheiten der PAF-AH in 300 μl des Trägers, IV-verabreicht in die Schwanzvene. Kontrollen erhielten das entsprechende Volumen des Trägers IV in die Schwanzvene.
D. Lokale Verabreichung der PAF-AH
Ratten (N=4) wurde 100 μl der PAF-AH (4000-6000 U/ml) subkutan zwischen die rechten Fußpolster injiziert. Der linke Fuß wurde mit 100 μl Träger (gepufferte Salzlösung) gespritzt. Vier anderen Ratten wurden nur Träger injiziert. Alle Ratten wurden sofort mit PAF über subkutane Fußinjektion behandelt und das Fußvolumen 1 Stunde nach der Behandlung gemessen. 4, wobei das Ödem als durchschnittlicher Anstieg im Fußvolumen (ml) SEM für jede behandelte Gruppe ausgedrückt wurde, illustriert, daß das PAF-induzierte Fußödem durch lokale Verabreichung der PAF-AH blockiert ist. Die Gruppe, die vor der PAF-Behandlung lokal PAF-AH verabreicht bekommen hatten, zeigte eine reduzierte Entzündung verglichen mit der injizierten Kontrollgruppe. Ein Ansteigen des Fußvolumens auf 0,08 ml 10,08 (SEM) wurden in der PAF-AH-Gruppe im Vergleich zu 0,63 ± 0,14 (SEM) in den trägerbehandelten Kontrollen beobachtet. Der Anstieg des Fußvolumens war ein direktes Ergebnis der PAF-Injektion, wobei Tiere, die nur mit Carrier injiziert worden waren, kein Anstieg des Fußvolumens zeigten.
E. Intravenöse Verabreichung der PAF-AH
Ratten (N=4 pro Gruppe) wurden 15 Minuten vor Verabreichung des PAF IV mit entweder PAF-AH (2000 U in 300 μl Träger) oder Träger allein vorbehandelt. Ein Ödem war ein bis zwei Stunden nach PAF-Behandlung aufgetaucht. 5, wobei Ödem als durchschnittliche Volumenzunahme (ml) + SEM für jede Behandlungsgruppe ausgedrückt wird, illustriert, daß die IV-Verabreichung von PAF-AH PAF-induzierte Fußödeme nach ein und zwei Stunden nach der Behandlung blockiert. Die Gruppe, die 2000 U der PAF-AH über den IV-Weg erhalten hatte, zeigte eine Reduktion der Entzündung über den zweistündigen Zeitraum. Das mittlere Volumen steigt für die PAF-AH-behandelte Gruppe innerhalb von zwei Stunden um 0,10 ml ± 0,08 (SEM) im Vergleich zu 0,56 ml ± 0,11 für die trägerbehandelten Kontrollen an.
F. Vergleich des PAF-AH-Schutzes in durch PAF oder Zymosan induzierten Ödemen
Ratten (N=4 pro Gruppe) wurden IV mit entweder PAF-AH (2000 U in 300 μl Träger) oder Träger allein vorbehandelt. Fünfzehn Minuten nach der Vorbehandlung erhielten die Gruppen entweder PAF oder Zymosan A und das Fußvolumen wurde entsprechend nach 1 und 2 Stunden gemessen. Wie in 6 gezeigt, wobei das Ödem als durchschnittlicher Volumenanstieg (ml) ± SEM für jede Behandlungsgruppe ausgedrückt wird, war die systemische Verabreichung der PAF-AH (2000 U) zur Reduktion PAF-induzierter Fußödeme effektiv, aber scheiterte daran, Zymosan-induzierte Ödeme zu blockieren. Ein mittlerer Volumenanstieg von 0,08 ± 0,02 wurde in der PAF-AH-behandelten Gruppe im Vergleich zu 0,49 ± 0,03 der Kontrollgruppe beobachtet.
G. Effektive Dosistitration für den PAF-AH-Schutz
In zwei unabhängigen Experimenten wurden Rattengruppen (N=3 bis 4 pro Gruppe) IV mit entweder seriellen Verdünnungen der PAF-AH oder Träger als Kontrolle in je 300 μl Volumen 15 Minuten vor der Verabreichung des PAF vorbehandelt. Beide Füße wurden mit PAF behandelt (wie oben beschrieben) und das Ödem nach 1 Stunde vermessen. 7 zeigt, wobei das Ödem als durchschnittlicher Volumenzunahme (ml) ± SEM für jede Behandlungsgruppe ausgedrückt wird, den Anstieg des Schutzes vor PAF-induzierten Ödemen in Ratten, die mit einer steigenden Dosis PAF-AH injiziert worden sind. In den Experimenten wurde herausgefunden, daß der ID₅₀ der PAF-AH, verabreicht über den IV-Weg, zwischen 40 und 80 U pro Ratte lag.
H. In vivo-Wirksamkeit der PAF-AH als eine Funktion der Zeit nach Verabreichung
In zwei unabhängigen Experimenten wurden zwei Rattengruppen (N=3 bis 4 pro Gruppe) IV mit entweder PAF-AH (2000 U in 300 μl Träger) oder Träger allein vorbehandelt. Nach Verabreichung erhielten die Gruppen PAF zu Zeitpunkten zwischen 15 Minuten und 47 Stunden nach der PAF-AH-Verabreichung. Das Ödem wurde 1 Stunde nach PAF-Verabreichung gemessen. Wie in 8 gezeigt, wobei das Ödem als durchschnittlicher Volumenanstieg (ml) ± SEM für jede Behandlungsgruppe ausgedrückt wird, schützt die Verabreichung von 2000 U der PAF-AH Ratten für mindestens 24 Stunden vor PAF-induzierten Ödemen.
I. Pharmakokinetiken der PAF-AH
Vier Ratten erhielten 2000 U der PAF-AH durch IV-Injektion in 300 μl Volumen. Plasma wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und bei 4°C gelagert und die Plasmakonzentrationen der PAF-AH durch einen ELISA unter Verwendung eines doppelten mAb-Fänger-Versuchs bestimmt. Zusammengefaßt wurde der monoklonale Antikörper 90G11D (Beispiel 13) in 50 mM Carbonatpuffer pH 9,6 auf 100 ng/ml verdünnt und auf Immulon 4-ELISA-Platten über Nacht bei 4°C immobilisiert. Nach extensivem Waschen mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20, wurden die Platten für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 0,5% Fischhautgelatine (Sigma), verdünnt in PBS, blockiert. Die Serumproben, verdünnt in PBS mit 15 mM CHAPS, wurden im Duplikat in die gewaschene ELISA-Platte gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurde ein Biotinkonjugat des monoklonalen Antikörpers 90F2G (Beispiel 13) zu den Wells in einer Konzentration von 5 μg/ml, verdünnt in PBS, dazugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden 50 μl einer 1:1000-Verdünnung von ExtraAvidin (Sigma) in die Wells gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden die Wells unter Verwendung von OPD als Substrat entwickelt und quantifiziert. Dann wurde Enzymaktivität mit Hilfe einer Standardkurve bestimmt. 9 zeigt, wobei die Datenpunkte den Durchschnitt ± SEM repräsentieren, daß nach 1 Stunde das Plasmaenzymniveau die vorhergesagte Konzentration, basierend auf einen 5-6 ml Plasmavolumen für 180-200 g-Ratten, erreicht, das bedeutet = 374 U/ml ± 58,2. Über einer Stunde sank das Plasmaniveau stetig, wobei innerhalb von 24 Stunden eine durchschnittliche Plasmakonzentration von 19,3 U/ml ± 3,4 erreicht wird, welche noch erwähnenswert höher ist als die endogene PAF-AH-Menge, die nach enzymatischen Versuchen bei ungefähr 4 U/ml liegt.
J. Wirksamkeit der PAF-AH gegenüber PAF-Antagonisten
Gruppen von Ratten (N=4 pro Gruppe) wurden mit einer der drei potentiellen antiinflammatorischen Substanzen behandelt: der PAF-Antagonist CV3988 (Biomol Nr. L-103) IP verabreicht (2 mg in 200 μl EtOH), der PAF-Antagonist Alprazolam (Sigma Nr. A-8800) IP verabreicht (2 mg in 200 μl EtOH) oder PAF-AH (2000 U) IV verabreicht. Kontrollratten wurden IV mit einem 300 μl-Volumen des Trägers injiziert. Die PAF- Antogonisten wurden IP verabreicht, da sie in Ethanol aufgelöst worden waren. Ratten, injiziert mit entweder CV3988 oder Alprazolam, wurde 30 Minuten nach Verabreichung des PAF-Antagonisten PAF verabreicht, um es dem PAF-Antagonsiten zu ermöglichen, in den Kreislauf zu gelangen, während PAF-AH und trägerbehandelte Ratten 15 Minuten nach Enzymverabreichung behandelt wurden. Mit PAF-AH injizierte Ratten zeigten eine Rekuktion bei PAF-induzierten Ödemen über das hinaus, was durch die etablierten PAF-Antagonisten CV3988 und Alprazolam geleistet wurde. Siehe 10, worin das Ödem als durchschnittliche Volumenzunahme (ml) ± SEM für jede Behandlungsgruppe beschrieben ist.
Zusammengefaßt ist PAF-AH in der Blockierung PAF-vermittelter Ödeme in vivo wirksam. Die Verabreichung der PAF-AH kann entweder lokal oder systemisch durch IV-Injektion stattfinden. In Dosisstudien wurde gefunden, daß IV-Injektionen im Bereich von 160-2000 U/Ratte dramatisch PAF-vermittelte Entzündung reduzieren, während die ID₅₀-Dosis im Bereich von 40-80 U/Ratte zu liegen scheint. Kalkulationen, basierend auf dem Plasmavolumen von 180-200 g-Ratten, ermöglichen Vorhersagen, daß eine Plasmakonzentration im Bereich von 25-40 U/ml durch PAF ausgelöste Ödeme blockieren sollte. Diese Vorhersagen werden durch vorläufige pharmakokinetische Studien unterstützt. Es wurde gefunden, daß eine Dosis von 2000 U der PAF-AH wirksam in der Blockierung PAF-vermittelter Ödeme für mindestens 24 Stunden ist. 24 Stunden nach Verabreichung der PAF-AH betrug die Plasmakonzentration des Enzyms noch ungefähr 25 U/ml. Es wurde gefunden, daß die PAF-AH PAF-induzierte Ödeme effektiver als die zwei bekannten PAF-Antagonisten, die getestet wurde, blockiert.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß PAF-AH wirksam PAF-induzierte Entzündung blockiert und von therapeutischem Nutzen bei Krankheiten, die primär durch PAF vermittelt sind, sein könnte.
Beispiel 15
Rekombinante PAF-AH der Erfindung wurde in einem zweiten in vivo-Modell, PAF-induzierter Pleuritis, getestet. Wie bereits gezeigt, induziert PAF Gefäßundichtigkeit, wenn es in die Pleurahöhle eingeführt wird [Henriques et al., supra]. Weiblichen Ratten (Charles River, 180-200 g) wurden mit 200 μl des 1% Evans Blaufarbstoffes in 0,9% mit 300 μl rekombinanter PAF-AH (1500 μmol/ml/Stunde, hergestellt wie in Beispiel 14 beschrieben) oder mit einem äquivalenten Volumen des Kontrollpuffers in die Schwanzvene gespritzt.
Fünfzehn Minuten später erhielten die Ratten eine 100 μl-Injektion PAF (2,0 nmol) in die Pleurahöhle. Eine Stunden nach PAF-Verabreichung wurden die Ratten getötet und die Pleuraflüssigkeit durch Spülen der Höhle mit 3 ml heparinisierter, phosphatgepufferter Salzlösung gesammelt. Der Grad der Gefäßundichtigkeit wurde mit Hilfe der Quantität des Evans Blaufarbstoffes in der Pleurahöhle bestimmt, welche durch einen Absorption bei 620 nm quantifiziert wurde. Mit PAF-AH vorbehandelte Ratten hatten eine sehr viel geringere Gefäßundichtigkeit als die Kontrolltiere (entsprechend mehr als 80% Reduktion bei Entzündung).
Die vorangegangenen Ergebnisse unterstützen die Behandlung von Subjekten, leidend an Pleuritis, mit rekombinantem PAF-AH-Enzym der Erfindung.
Beispiel 16
Rekombinantes PAF-AH-Enzym der Erfindung wurde auch auf die Wirksamkeit in einem Modell antigen-induzierter Anreicherung von Eosinophilen untersucht. Die Anreicherung von Eosinophilen im Luftweg ist eine charakteristische Eigenschaft der späten Phase von Immunantworten, wie sie bei Asthma, Rhinitis und Ekzemen auftauchen. BALB/c-Mäuse (Charles River) wurden durch zwei intraperitoneale Injektionen, enthaltend 1 μg Ovalbumin (OVA) in 4 mg Aluminiumhydroxid (Imject alum, Pierce Laboratories, Rockford, IL), gegeben in 2-wöchigen Intervalen, sensibilisiert. Vierzehn Tage nach der zweiten Immunisierung wurde den sensibilisierten Mäusen entweder vernebeltes OVA oder Salzlösung als Kontrolle verabreicht.
Vor Verabreichung wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen mit je vier Mäusen/Gruppe zusammengesetzt. Die Mäuse in den Gruppen 1 und 3 wurden mit 140 μl des Kontrollpuffers, enthaltend 25 mM Tris, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA und 0,1% Tween 80, durch IV-Injektion, vorbehandelt. Die Mäuse in den Gruppen 2 und 4 wurden mit 750 Units der PAF-AH (Aktivität 5.500 Units/ml gegeben in 140 μl des PAF-AH-Puffers) vorbehandelt. Dreißig Minuten nach Verabreichung der PAF-AH oder des Puffers wurden die Mäuse in den Gruppen 1 und 2 vernebeltem PBS, wie unten beschrieben, ausgesetzt, während die Mäuse in den Gruppen 3 und 4 vernebeltem OVA ausgesetzt wurden. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Mäuse ein zweites Mal mit entweder 140 μl des Puffers (Gruppen 1 und 3) oder 750 Units der PAF-AH in 140 μl Puffer (Gruppen 2 und 4), verabreicht durch intravenöse Injektion, behandelt.
Die Infiltration der Eosinophilen in die Trachea wurde in den sensibilisierten Mäusen durch Exponieren der Tiere gegenüber vernebeltem OVA induziert. Sensibilisierte Mäuse wurden in 50 ml konische Zentrifugengefäßen (Corning) gesetzt und gezwungen, mit einem Vernebler (Modell 646, DeVilbiss Corp., Somerset, PA) vernebeltes OVA (50 mg/ml), gelöst in 0,9% Salzlösung, für 20 Minuten zu atmen. Kontrollmäuse wurden in einer ähnlichen Art und Weise behandelt, mit dem Unterschied, daß 0,9% Salzlösung im Vernebler benutzt wurde. Achtundvierzig Stunden nach Aussetzen gegenüber vernebeltem OVA oder Salzlösung, wurden die Mäuse getötet und die Tracheae herausgeschnitten. Tracheae von jeder Gruppe wurden in OCT eingebettet und bei –70°, bis die Präparate geschnitten wurden, gelagert.
Um die Infiltration der Eosinophilen in die Trachea zu evaluieren, wurden Gewebeschnitte der vier Mausgruppen entweder mit Lunalösung und Hematoxylin-Eosin-Lösung oder mit Peroxidase gefärbt. Zwölf 6 μm dicke Schnitte wurden von jeder Mausgruppe angefertigt und entsprechend numeriert. Ungerade numerierte Schnitte wurden mit Lunalösung wie folgt gefärbt. Die Schnitte wurden in Formalalkohol für 5 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, durch dreimaliges Wechseln von Leitungswasser für 2 Minuten bei Raumtemperatur gespült und dann durch zweimaliges Wechseln von destilliertem Wasser für 1 Minute bei Raumtemperatur gespült. Die Gewebeschnitte wurden mit Luna-Farbstoff 5 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt (Luna-Farbstoff enthält 90 ml Weigert's Iron Hematoxylin und 10 ml 1% Biebrich Scarlet). Die gefärbten Schnitte wurden in 1% sauren Alkohols sechsmal getaucht, mit Leitungswasser für 1 Minute bei Raumtemperatur gespült, in eine 0,5% Lithiumcarbonat-Lösung fünfmal getaucht und mit Leitungswasser für 2 Minuten bei Raumtemperatur gespült. Die Schnitte wurden über 70%-95%-100% Ethanol für je 1 Minute bei Raumtemperatur dehydriert, dann durch zweimaligen Wechsel von Xylen für 1 Minute bei Raumtemperatur freigelegt und in Cytoseal 60 fixiert.
Für den Peroxidasefarbstoff wurden gradzahlig numerierte Schnitte bei 4°C in Aceton für 10 Minuten fixiert und luftgetrocknet. 200 μl der DAB-Lösung wurden zu jedem Schnitt dazugegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkuzier. Die Schnitte wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit Leitungswasser gespült und auf jeden Schnitt wurden für 3- 5 Sekunden 2 Tropfen 1% Osmiumtetroxid gegeben. Die Schnitte wurden in Leitungswasser für 5 Minuten bei Raumtemperatur gespült und mit Mayers Hematoxylin bei 25°C gegengefärbt. Die Schnitte wurden anschließend in laufendem Leitungswasser für 5 Minuten gespült und über 70%-95%-100% Ethanol für je 1 Minute bei Raumtemperatur dehydriert. Die Schnitte wurde über zweimaligen Wechsel von Xylen für 1 Minute bei Raumtemperatur freigelegt und in Cytoseal 60 fixiert.
Die Anzahl der Eosinophilen im submucolsalen Gewebe der Trachea wurde evaluiert. In Trachea von Mäusen der Gruppen 1 und 2 wurden nur sehr wenig Eosinophile verstreut über das submucosale Gewebe gefunden. Wie erwartet, wurde in Tracheae von Mäusen der Gruppe 3, welche mit Puffer vorbehandelt worden waren und vernebeltem OVA ausgesetzt waren, eine große Anzahl von Eosinophilen über das submucosale Gewebe verteilt gefunden. Im Gegensatz dazu wurde in den Tracheae von Mäusen der Gruppe 4, welche mit PAF-AH vorbehandelt und vernebeltem OVA ausgesetzt waren, sehr wenige Eosinophile im submucosalen Gewebe, im Vergleich zu dem, was in den zwei Kontrollgruppen, den Gruppen 1 und 2, gesehen worden war, gefunden.
Somit ist die therapeutische Behandlung mit PAF-AH von Subjekten, die eine Spätphasen-Immunantwort, beinhaltend die Akkumulation von Eosinophilen im Luftweg, so wie es bei Asthma, Rhinitis und Ekzemen auftritt, indiziert.
Beispiel 17
Annährend vier Prozent der Japanischen Bevölkerung haben eine niedrige oder nicht nachzuweisende Menge an PAF-AH-Aktivität in ihrem Plasma. Dieser Mangel wurde mit ersten respiratorischen Symptomen bei asthmatischen Kindern [Miwa et al., J. Clip. Invest,. 82:1983-1991 (1988)] korreliert, die eine ererbte Defizienz in einer autosomal rezessiven Art zu haben scheinen.
Um zu bestimmen, ob die Defizienz auf ein inaktives, aber vorhandenes Enzym oder auf der Unfähigkeit, PAF-AH zu synthetisieren, beruht, wurde das Plasma von verschiedenen Patienten, die eine unzureichende PAF-AH-Aktivität zeigten, sowohl auf die PAF-AH-Aktivität (durch das in Beispiel 10 für Tranfektanten beschriebene Verfahren) als auch für das Vorhandensein der PAF-AH unter Verwendung der monoklonalen Antikörper 90G11D und 90F2D (Beispiel 13) in einem Sandwich-ELISA wie folgt untersucht. Immunolon 4-Flachbodenplatten (Dynatech, Chantilly, VA) wurden mit 100 ng/Well des monoklonalen Antikörpers 90G11D gecoated und über Nacht gelagert. Die Platten wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 0,5% Fischhautgelatine (Sigma), verdünnt in CMF-PBS, blockiert und anschließend dreimal gewaschen. Das Patientenplasma wurde in PBS mit 15 mM CHAPS verdünnt und in jedes Well der Platte (50 μl/Well) gegeben. Die Platten wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und viermal gewaschen. Fünfzig μl von 5 μg/ml des monoklonalen Antikörpers 90F2D, welcher mit einer Standardmethode biotinyliert und in PBST verdünnt worden war, wurden zu jedem Well dazugeben und die Platten für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend dreimal gewaschen. Fünfzig μl ExtraAvidin (Sigma), 1:1000 in CMF-PBST verdünnt, wurde anschließend zu jedem Well dazugegeben und die Platten für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie entwickelt wurden.
Eine direkte Korrelation zwischen PAF-AH-Aktivität und Enzymmenge wurde beobachtet. Ein Fehlen von Aktivität in einem Patientenserum wurde durch ein Fehlen des detektierbaren Enzyms widergespiegelt. Ebenso enthielten Plasmaproben mit der Hälfte der normalen Aktivität die Hälfte der normalen Menge der PAF-AH. Diese Beobachtungen lassen vermuten, daß der Mangel an PAF-AH-Aktivität auf die Unfähigkeit zur Synthese des Enzyms oder auf ein inaktives Enzym, was der monoklonale Antikörper nicht erkennt, zurückzuführen war.
Weitere Experimente haben offenbart, daß der Mangel in einer genetischen Läsion des humanen plasmatischen PAF-AH-Gens begründet liegt. Genomische DNA von PAF-AH-defizienten Individuen wurde isoliert und als Template für eine PCR-Reaktion mit PAF-AH-genspezifischen Primern eingesetzt. Jede der kodierenden Exonsequenzen wurde anfänglich amplifiziert und von einem Individuum sequenziert. Ein einzelner Nukleotidaustausch innerhalb des Exon 9 wurde beobachtet (ein G zu einem T an der Position 996 der SEQ ID NO: 7). Der Nukleotidaustausch führt zu einer Aminosäuresubstitution eines Phenylalanins zu einem Valin an Position 279 der PAF-AH-Sequenz (V279F). Exon 9 wurde aus genomischer DNA von zusätzlichen elf PAF-AH-defizienten Individuen amplifiziert, bei denen die selbe Punktmutation gefunden wurde.
Um zu testen, ob diese Mutation das Enzym lahmlegte, wurde ein E.coli-Expressionskonstrukt mit der Mutation nach Methoden, ähnlich den in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt. Nach Einbringen in E.coli erzeugte das Expressionskonstrukt keine PAF-AH-Aktivität, während ein Kontrollkonstukt ohne die Mutation voll aktiv war. Diese Aminosäuresubstitution führt vermutlich zu einer strukturellen Modifikation, die den beobachteten Mangel an Aktivität und Fehlen der Immunreaktivität mit PAF-AH-Antikörpern der Erfindung verursacht.
PAF-AH spezifische Antikörper der Erfindung können daher in diagnostischen Verfahren verwendet werden, um unnormale Mengen an PAF-AH im Serum nachzuweisen (normale Mengen sind ungefähr 1 bis 5 U/ml) und um das Fortschreiten der Behandlung von pathologischen Zuständen mit PAF-AH zu verfolgen. Weiterhin erlaubt die Identifikation einer genetischen Läsion im PAF-AH-Gen das genetische Screening für PAF-AH-Defizienz, gezeigt durch die Japanischen Patienten. Die Mutation führt zum Erwerb einer zusätzlichen Restriktionsendonukleaseschnittstelle (Mae II) und somit erlaubt das einfache Verfahren des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) die Analyse, um zwischen aktiven und Mutantenallelen zu unterscheiden. Siehe Lewin, Seiten 136-141 in Genes V, Oxford University Press, New York, New York (1994).
Das Screening genomischer DNA von zwölf PAF-AH-defizienten Patienten wurde durch Verdau der DNA mit MaeII, Southern-Blot und Hybridisierung mit einer Exon-9-Sonde (Nukleotide 1-396 der SEQ ID NO: 17) durchgeführt. Es wurde herausgefunden, daß alle Patienten mit dem Mutantenallel übereinstimmende RFLPs hatten.
Weitere Merkmale der Erfindung sind wie folgt eingeschlossen:

1. Ein Verfahren zur Behandlung eines Säugers empfindlich für oder an einem PAF-vermittelten pathologischen Zustand leidend, umfassend Verabreichen von PAF-AH an den Säuger in einer Menge, die ausreichend ist, um endogene PAF-AH Aktivität zu ergänzen und pathologische Mengen an PAF in dem Säuger zu inaktivieren.
2. Ein Verfahren zur Behandlung eines Säugers empfindlich für oder an Pleuritis leidend, umfassend Verabreichen von PAF-AH an den Säuger in einer Menge, die ausreichend ist, um endogene PAF-AH Aktivität zu ergänzen und pathologische Mengen an PAF in dem Säuger zu inaktivieren.
3. Ein Verfahren zur Behandlung eines Säugers empfindlich für oder an Asthma leidend, umfassend Verabreichen von PAF-AH an den Säuger in einer Menge, die ausreichend ist, um endogene PAF-AH Aktivität zu ergänzen und pathologische Mengen an PAF in dem Säuger zu inaktivieren.
4. Ein Verfahren zur Behandlung eines Säugers empfindlich für oder an Rhinitis leidend, umfassend Verabreichen von PAF-AH an den Säuger in einer Menge, die ausreichend ist, um endogene PAF-AH Aktivität zu ergänzen und pathologische Mengen an PAF in dem Säuger zu inaktivieren.
5. Ein Verfahren zur Behandlung eines Säugers empfindlich für oder an Ekzemen leidend, umfassend Verabreichen von PAF-AH an den Säuger in einer Menge, die ausreichend ist, um endogene PAF-AH Aktivität zu ergänzen und pathologische Mengen an PAF in dem Säuger zu inaktivieren.

Sequenzprotokoll

Claims

Therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein PAF-AH Polypeptid und ein physiologisch akzeptables Verdünnungsmittel oder Träger und, wahlweise, ein anderes anti-inflammatorisches Agens, wobei das PAF-AH Polypeptid ist: (i) ein aufgereinigtes und isoliertes PAF-AH Polypeptid, bestehend im wesentlichen aus der humanen Plasma PAF-AH Aminosäuresequenz, festgelegt in SEQ ID NO: 8; oder (ii) eine Variante des aufgereinigten und isolierten PAF-AH Polypeptids, bestehend im wesentlichen aus den Aminosäuren 42 bis 441 der SEQ ID NO: 8, wobei die Variante eine Aminosäure-Austauschvariante ist, die einen Aminosäure-Austausch in der Sequenz der SEQ ID NO: 8 hat, ausgewählt von: (a) S108A (b) D338A (c) H395A (d) H399A (e) C67S (f) C334S; oder (g) C407S
PAF-AH Polypeptid zur Verwendung bei der Linderung pathologischer entzündlicher Zustände, oder zur Behandlung von Pleuritis, Asthma, Rhinitis, Ekzema, Sepsis oder vorzeitiger Geburt in einem Säuger, insbesondere zur Behandlung eines Säugers, anfällig für oder leidend an einem PAF-vermittelten pathologischen Zustand, durch Verabreichung dieses PAF-AH Polypeptids zu dem Säuger in einer Menge, ausreichend um endogene PAF-AH Aktivität zu ergänzen und um pathologische Mengen des PAF in diesem Säuger zu inaktivieren, wobei das PAF-AH Polypeptid ist: (i) ein aufgereinigtes und isoliertes PAF-AH Polypeptid, umfassend im wesentlichen die humane Plasma PAF-AH Aminosäuresequenz, festgelegt in SEQ ID NO: 8; oder (ii) eine Variante des aufgereinigten und isolierten PAF-AH Polypeptids, bestehend im wesentlichen aus den Aminosäuren 42 bis 441 der SEQ ID NO: 8, wobei die Variante eine Aminosäureaustauschvariante ist, die einen Aminosäureaustausch in der Sequenz der SEQ ID NO: 8 hat, ausgewählt von: (a) S108A (b) D338A (c) H395A (d) H399A (e) C67S (f) C334S; oder (g) C407S
Aufgereinigtes und isoliertes PAF-AH Polypeptid, umfassend im wesentlichen Aminosäuren 42 bis 441 der SEQ ID NO: 8, zur Verwendung in der Behandlung der Sepsis oder der vorzeitigen Geburt in einem Säuger.
Verwendung eines PAF-AH Polypeptids zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Säugers, anfällig auf oder leidend an einem PAF-vermittelten pathologischen Zustand, zur Verabreichung dieses PAF-AH Polypeptids zu einem Säuger in einer Menge, ausreichend um endogene PAF-AH Aktivität zu ergänzen und um pathologische Menge des PAF in diesem Säuger zu inaktivieren, wobei das PAF-AH Polypeptid ist: (i) ein aufgereinigtes und isoliertes PAF-AH Polypeptid, bestehend im wesentlichen aus der humanen Plasma PAF-AH Aminosäuresequenz, festgelegt in SEQ ID NO: 8; oder (ii) eine Variante des aufgereinigten und isolierten PAF-AH Polypeptids, bestehend im wesentlichen aus den Aminosäuren 42 bis 441 der SEQ ID NO: 8, wobei die Variante eine Aminosäureaustauschvariante ist, die einen Aminosäureaustausch in der Sequenz der SEQ ID NO: 8 hat, ausgewählt von: (a) S108A (b) D338A (c) H395A (d) H399A (e) C67S (f) C334S; oder (g) C407S
Verwendung eines PAF-AH Polypeptids zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Pleuritis, Asthma, Rhinitis, Ekzema, Sepsis oder vorzeitiger Geburt in einem Säuger, wobei das PAF-AH Polypeptid ist: (i) ein aufgereinigtes und isoliertes PAF-AH Polypeptid, bestehend im wesentlichen aus der humanen Plasma PAF-AH Aminosäuresequenz, festgelegt in SEQ ID NO: 8; oder (ii) eine Variante des aufgereinigten und isolierten PAF-AH Polypeptids, bestehend im wesentlichen aus den Aminosäuren 42 bis 441 der SEQ ID NO: 8, wobei die Variante eine Aminosäureaustauschvariante ist, die einen Aminosäureaustausch in der Sequenz der SEQ ID NO: 8 hat, ausgewählt von: (a) S108A (b) D338A (c) H395A (d) H399A (e) C67S (f) C334S; oder (g) C407S
Verwendung eines aufgereinigten und isolierten PAF-AH Polypeptids, umfassend im wesentlichen die Aminosäuren 42 bis 441 der SEQ ID NO: 8, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Sepsis oder der vorzeitigen Geburt in einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei das PAF-AH Polypeptid in einer Menge vorliegt, ausreichend um endogene PAF-AH Aktivität zu ergänzen und pathologische Mengen von PAF in diesem Säuger zu inaktivieren.
Verfahren zur Durchführung einer Genanalyse auf die An- oder Abwesenheit einer genetischen Läsion in einem humanen Plasma PAF-AH Gen aus einer Subjektprobe, umfassend die Schritte von: (a) isolieren von mindestens einem Teil der humanen Plasma PAF-AH Gen-DNA von dieser Subjektprobe; und (b) vergleichen der DNA von (a) mit der DNA der SEQ ID NO: 7, wobei eine Differenz die Anwesenheit einer genetischen Läsion in der Subjektproben-DNA anzeigt.