PT673426E - Acetil-hidrolase do factor activador das plaquetas - Google Patents

Description

ψ 1 *

Descrição “Acetil-hidrolase do factor actívador das plaquetas”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito genericamente à acetil-hidrolase do factor actívador das plaquetas e mais concretamente diz respeito a novos polinucleótidos purificados e isolados que codificam a acetil-hidrolase do factor actívador das plaquetas do plasma humano, aos produtos de acetil-hidrolase do factor actívador das plaquetas codificados pelos polinucleótidos, aos materiais e aos métodos para a produção recombinante de produtos de acetil-hidrolase do factor actívador das plaquetas e às substâncias que são anticorpos específicos para a acetil--hidrolase do factor actívador das plaquetas.

ANTECEDENTES O factor actívador das plaquetas (FAP, em inglês PAF) é um fosfolípido biologicamente activo sintetizado por diversos tipos de células. In vivo e em concentrações normais entre IO'10 e 10‘9 Μ, o FAP activa células destinatárias, tais como plaquetas e neutrófilos, ao ligar-se aos receptores específicos da superfície de células acopladas à proteína G [Venable et al., J. Lipid Res., 34:691-701 (1993)]. O FAP tem a estrutura l-0-alquil-2-acetil-sn-ghcero-3-fosfocolina. Para que a sua actividade biológica seja óptima, a posição sn-1 da estrutura glicerólica do FAP tem de estar numa ponte éter com um álcool gordo e a posição sn-3 tem de possuir um grupo principal fosfocolina. ?sé O FAP actua em processos fisiológicos normais (v.g., inflamação, hemostase e parto) e está implicado em respostas inflamatórias patológicas (v.g., asma, anafilaxia, choque séptico e artrite) [Venable et ai, supra, e Lindsberg et ai, Ann. Neurol., 30: 117-129 (1991)]. A eventualidade de o FAP estar envolvido em respostas patológicas determinou esforços no sentido de se modular a actividade do FAP e todas as experiências incidiram fundamentalmente no desenvolvimento de antagonistas da actividade do FAP, que interfere com a ligação do FAP aos receptores da superfície das células. Ver, por exemplo, Heuer et al., Clirt. Exp. Allergy, 22: 980-983 (1992).

Admite-se que a síntese e a secreção do FAP e também a sua degradação e depuração estejam perfeitamente controladas. Na medida em que as acções inflamatórias patológicas do FAP resultam de uma deficiência dos mecanismos regulativos do FAP, dando origem a uma produção excessiva, a uma produção inadequada ou à falta de degradação, um mecanismo alternativo para a modulação da actividade do FAP implicaria a simulação ou o aumento do processo natural pelo qual ocorre a resolução da inflamação. Sabe-se já que os macrófagos [Stafforini et al., J. Biol. Chem.., 265(17): 9682-9687 (1990)], os hepatócitos e a linhagem celular HepG2 do hepatoma humano [Satoh et al., J. Clin. Invest., 87: 476-481 (1991) e Tarbet et ai, J. Biol. Chem., 266(25): 16667-16673 (1991)] libertam uma actividade enzimática, a acetil-hidrolase do FAP (AH-FAP; em inglês PAF-AH), que inactiva o FAP. Para além de inactivar o FAP, a AH-FAP também inactiva os fosfolípidos oxidativamente fragmentados, tais como os produtos da cascata do ácido araquidónico que intervêm na inflamação. Ver, por exemplo, Stremler et al., J. Biol. Chem., 266(11): 11095-11103 (1991). A inactivação do FAP pela AH-FAP ocorre essencialmente por hidrólise do grupo acetilo na posição sn-2 do FAP e a AH-FAP metaboliza os fosfolípidos oxidativamente fragmentados, mediante a remoção dos za grupos acilo na posição sn-2. Foram já identificados dois tipos de AH-FAP: as formas citoplásmicas existentes em diversos tipos de células e tecidos, tais como as células endoteliais e os eritrócitos, e uma forma extracelular existente no plasma e no soro. A AH-FAP do plasma não hidrolisa os fosfolípidos intactos, excepto no caso do FAP e este substrato permite especificamente que a enzima circule in vivo num estado totalmente activo, sem efeitos adversos. A AH-FAP do plasma parece ser responsável por toda a degradação do FAP no sangue humano ex vivo [Stafformi et al.,J. Biol. Chem.., 262(9): 4223-4230 (1987)].

Embora as formas citoplásmica e plásmica da AH-FAP pareçam ter uma especificidade idêntica para o substrato, a AH-FAP do plasma tem características bioquímicas que a distinguem da AH-FAP citoplásmica e de outras lipases já caracterizadas. Dito de forma concreta, a AH-FAP do plasma está associada a partículas de lipoproteínas, é inibida pelo fluorofosfato de diisopropilo, não é afectada pelos iões cálcio, é relativamente insensível à proteólise e tem um peso molecular aparente igual a 43 000 dalton. Ver Stafforini et al. (1987), supra. No mesmo artigo de Stafforini et al. está descrito um procedimento para a purificação parcial da AH-FAP a partir de plasma humano e também está descrita a composição dos aminoácidos do material plásmico obtido graças à utilização desse procedimento. A AH-FAP citoplásmica foi já purificada a partir de eritrócitos, conforme descrito por Stafforini et al. em \7. Biol. Chem. 268(6): 3857-3865 (1993), e nesse artigo estão também descritos 10 resíduos do terminal amino da AH-FAP citoplásmica. Hattori et al. em lJ. Biol. Chem.', 268(25): 18748-18753 (1993), descrevem a purificação da AH-FAP citoplásmica a partir do cérebro de bovinos. Depois de ter sido depositado o pedido da patente de invenção original aqui referida, foi publicada a sequência de nucleótidos da AH-FAP citoplásmica do cérebro de bovino, por Hattori et al. em V. Biol. Chem.', 269(231): 23150-23155 (1994). Até ao momento presente não foi publicada nenhuma sequência de nucleótidos para a AH-FAP do plasma. A produção recombinante de AH-FAP faria com que fosse possível utilizar AH-FAP exógena para simular ou para aumentar os processos normais de resolução da inflamação in vivo. A administração de AH-FAP iria proporcionar uma vantagem fisiológica relativamente à administração de antagonistas dos receptores de FAP, uma vez que a AH-FAP é um produto que existe normalmente no plasma. Além disso, uma vez que os antagonistas dos receptores de FAP, que são estruturalmente afins do FAP, inibem a actividade natural da AH-FAP, o metabolismo desejável do FAP e dos fosfolípidos oxidativamente fragmentados é assim evitado. Posto isto, a inibição da actividade da AH-FAP, pelos antagonistas dos receptores de FAP, contraria o bloqueio competitivo dos receptores de FAP pelos antagonistas. Ver Stremler et al., supra. Além do mais, em locais de inflamação aguda, por exemplo, a libertação de oxidantes tem como consequência a inactivação da enzima natural AH-FAP, daí resultando, por sua vez, níveis locais elevados de FAP e de compostos de tipo FAP que iriam competir com qualquer antagonista dos receptores de FAP administrado exogenamente para ligação aos receptores de FAP. Pelo contrário, o tratamento com a AH-FAP recombinante iria aumentar a actividade da AH-FAP endógena e compensar qualquer enzima endógena inactivada.

Por tal motivo é necessário identificar e isolar tecnicamente sequências de polinucleótidos que codifiquem a AH-FAP do plasma humano para o desenvolvimento de materiais e métodos úteis para a produção recombinante de AH-FAP e para a produção de reagentes para a detecção da AH-FAP no plasma.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona novos polinucleótidos purificados e isolados (isto é, ADN e ARN, qualquer deles de cadeias de sentido codificador e anti-sentido) que codificam a 7% AH-FAP do plasma humano que compreende essencialmente a sequência de aminoácidos explicitada na SEQID NO:8, ou os seus fragmentos enzimaticamente activos. As sequências de ADN preferidas na presente invenção compreendem as sequências de ADNc e genómicas e também as sequências de ADN sintetizadas total ou parcialmente por via química. Também estão contempladas na presente invenção a sequência de ADN que codifica a AH-FAP que está explicitada na SEQ ID NO:7 e as sequências de ADN que hibridam com a sua cadeia não codificadora em condições convencionais rigorosas ou que poderiam hibridar se não fosse a redundância do código genético. A invenção também contempla as réplicas biológicas (isto é, cópias de sequências de ADN isoladas obtidas in vivo ou in viíro) de sequências de ADN da invenção. A invenção proporciona também os arquétipos recombinantes de replicação autónoma, tais como os vectores de ADN plasmídico e virai que incorporam sequências de AH-FAP da presente invenção e em especial os vectores em que o ADN que codifica a AH-FAP está fimcionalmente ligado a uma sequência de ADN de controlo de expressão exógena e a um terminador da transcrição.

De acordo com outro aspecto da invenção, as células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas são estavelmente transformadas com sequências de ADN da invenção, de um modo que permita exprimir nelas a desejada AH-FAP. As células hospedeiras que exprimem produtos de AH-FAP podem servir para inúmeros fins úteis. Tais células constituem uma fonte valiosa de imunogénios para o desenvolvimento de substâncias que são anticorpos especificamente imunorreactivos com a AH-FAP. As células hospedeiras da invenção são notavelmente úteis em métodos para a produção de AH-FAP em grande escala, em que as células se desenvolvem num meio de cultura adequado e os produtos polipeptídicos desejados são isolados a partir das células ou a partir do meio onde as células se desenvolvem, por exemplo, por purificação por imunoafínidade.

7£f

Um método não imunológico contemplado pela invenção para a purificação da enzima AH-FAP, constituída essencialmente pelos aminoácidos 42 a 441 da SEQ DD NO:8, a partir de plasma, compreende os passos seguintes: (a) isolar partículas de lipoproteínas de baixa densidade; (b) solubilizar as referidas partículas de lipoproteínas de baixa densidade num tampão que contenha SCHAP 10 mM (em inglês CHAPS) para se gerar uma primeira solução de enzima AH-FAP; (c) aplicar a referida primeira solução de enzima AH-FAP a uma coluna de permuta aniónica de tipo ‘DEAE’; (d) lavar a referida coluna de permuta aniónica de tipo ‘DEAE’ utilizando um tampão ao valor de pH aproximadamente igual a 7,5 e contendo SCHAP 1 mM; (e) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de permuta aniónica de tipo ‘DEAE’ em fracções, utilizando tampões ao valor de pH aproximadamente igual a 7,5 e que contenham um gradiente de NaCl entre 0 e 0,5 M; (f) juntar as fracções retiradas por eluição da referida coluna de permuta aniónica de tipo ‘DEAE’ e que possuam uma actividade enzimática AH-FAP; (g) ajustar as referidas fracções activas e reunidas, provenientes da referida coluna de permuta aniónica de tipo ‘DEAE’, até à concentração de SCHAP 10 mM para se gerar uma segunda solução de enzima AH-FAP; (h) aplicar a referida segunda solução de enzima AH-FAP a uma coluna de afinidade de ligando corante azul; (i) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de afinidade de ligando corante azul, utilizando um tampão que contenha SCHAP 10 mM e um sal caotrópico; (j) aplicar o produto da eluição, obtido a partir da referida coluna de afinidade de ligando corante azul, a uma coluna de afinidade de ligando de Cu; (k) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de afinidade de ligando de Cu, utilizando um tampão que contenha SCHAP 10 mM e imidazol; (1) submeter o produto da eluição da referida coluna de afinidade de ligando de Cu a uma operação de EGPA-DSS (em inglês SDS-PAGE); e (m) isolar a enzima

AH-FAP de aproximadamente 44 kDa a partir do gel de poliacrilamida-DSS. De preferência, o tampão do passo (b) é Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM a pH 7,5; o tampão do passo (d) é Tris 25 mM-HCl, SCHAP 1; a coluna do passo (h) é uma coluna de tipo ‘Blue Sepharose Fast Flow’; o tampão do passo (i) é Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM, KSCN 0,5 M a pH 7,5; a coluna do passo (j) é uma coluna de tipo ‘Cu Chelating Sepharose’; e o tampão do passo (k) é Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM, NaCl 0,5M, imidazol 50 mM, a um valor de pH no intervalo aproximado entre 7,5 e 8,0.

Um método previsto pela invenção para a purificação da AH-FAP enzimaticamente activa, constituída essencialmente pelos aminoácidos 42 a 441 da SEQID NO:8, a partir de E. coli produtora de AH-FAP, compreende os passos seguintes: (a) preparar um sobrenadante por centrifugação a partir de E. coli lisadas, produtoras da enzima AH-FAP; (b) aplicar o referido sobrenadante de centrifugação a uma coluna de afinidade de ligando corante azul; (c) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de afinidade de ligando corante azul, utilizando um tampão que contém SCHAP 10 mM e um sal caotrópico; (d) aplicar o referido produto da eluição proveniente da referida coluna de afinidade de ligando de corante azul a uma coluna de afinidade de ligando de Cu; e (e) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de afinidade de ligando de Cu, utilizando um tampão que contém SCHAP 10 mM e imidazol. De preferência, a coluna do passo (b) é uma coluna de tipo ‘Blue Sepharose Fast Flow’; o tampão do passo (c) é Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM, KSCN 0,5 M a pH 7,5; a coluna do passo (d) é uma coluna de tipo ‘Cu Chelating Sepharose’; e o tampão do passo (e) é Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM, NaCl 0,5M, imidazol 100 mM a pH 7,5.

Outro método previsto pela invenção para a purificação da AH-FAP enzimaticamente activa, constituída essencialmente pelos aminoácidos 42 a 441 da SEQ ID NO:8, a partir de E.

7S£ coli produtora de AH-FAP, compreende os passos seguintes: (a) preparar um sobrenadante por centrifugação a partir de E. coli Usadas, produtoras da enzima AH-FAP; (b) diluir o referido sobrenadante de centrifugação num tampão de baixo valor de pH contendo SCHAP 10 mM; (c) aplicar o referido sobrenadante de centrifugação diluído a uma coluna de permuta catiónica equilibrada para um valor de pH aproximadamente igual a 7,5; (d) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de permuta catiónica, utilizando um sal 1 M; (e) aumentar o valor do pH do referido produto de eluição, proveniente da coluna de permuta catiónica, e ajustar a concentração do sal do referido produto de eluição para o valor de cerca de 0,5 M; (f) apUcar o referido produto da eluição ajustado, proveniente da referida coluna de permuta catiónica, a uma coluna de afinidade de ligando corante azul; (g) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de afinidade ligando de corante azul, utilizando um tampão que contém um sal numa concentração entre cerca de 2 M e 3 M; e (h) efectuar a diálise do referido produto de eluição a partir da referida coluna de afinidade de ligando corante azul, utilizando um tampão que contenha Tween a cerca de 0,1%. De preferência, o tampão do passo (b) é MES 25 mM, SCHAP 10 mM, EDTA1 mM a pH 4,9; a coluna do passo (c) é uma coluna de tipo ‘S-Sepharose’ equilibrada com MES 25 mM, SCHAP 10 mM, EDTA 1 mM,

NaCl 50 mM a pH 5,5; a eluição da enzima AH-FAP é efectuada no passo (d) utilizando NaCl 1 mM; o valor do pH do produto de eluição no passo (e) é ajustado para 7,5 utilizando a base Tris 2 M; a coluna do passo (f) é uma coluna de tipo ‘Sepharose’; o tampão do passo (g) é Tris 25 mM, SCHAP 10 mM, NaCl 3 M, EDTA 1 mM a pH 7,5; e o tampão no passo (h) é Tris 25 mM, NaCl 0,5 M, ‘Tween-80’ a 0,1% e a pH 7,5.

Os produtos de AH-FAP podem ser obtidos como substâncias isoladas a partir de fontes celulares naturais ou podem ser sintetizados por via química, mas são produzidos preferencialmente por procedimentos recombinantes envolvendo as células hospedeiras procarióticas

ou eucarióticas da invenção. São aqui contemplados os produtos de AH-FAP que possuam uma parte ou a totalidade da sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:8. Está prevista a utilização de células hospedeiras de mamíferos para que possam ser realizadas modificações pós-traducionais (v.g, miristolação, glicosilação, truncamento, lipidação e fosfo-rilação da tirosina, da serina ou da treonina), conforme a venha ser necessário para conferir uma actividade biológica óptima aos produtos de expressão recombinantes da invenção. Os produtos de AH-FAP da invenção podem ser polipeptidos de comprimento completo, fragmentos ou variantes. As variantes podem conter análogos de AH-FAP em que um ou vários dos aminoácidos especificados (isto é, naturalmente codificados) sejam suprimidos ou substituídos ou em que um ou vários aminoácidos não especificados sejam acrescentados: (1) com perda de uma ou várias das actividades enzimáticas ou das características imunológicas específicas da AH-FAP; ou (2) com inutilização específica de uma actividade biológica particular da AH-FAP. Para se modular a sua actividade é possível utilizar proteínas ou outras moléculas que se hguem à AH-FAP. A presente invenção também diz respeito às substâncias que são anticorpos (v.g., anticorpos monoclonais e pohclonais, anticorpos de cadeia singular, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados em RDC (em inglês CDR e não só) e outras proteínas de bgação específicas para a AH-FAP da invenção. Como exemplos de proteínas de bgação específicas indica-se, a título ilustrativo, os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas 90G11D e 90F2D que foram depositados na Colecção Americana de Culturas Tipo [American Type Culture Collection (ATCC)], 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, a 30 de Setembro de 1994, e aos quais foram atribuídos respectivamente os números HB 11724 e HB 11725 de admissão. As proteínas ou outras moléculas (v.g., lípidos ou moléculas pequenas) que se ligam

7ί4 especificamente à AH-FAP podem ser identificadas utilizando a AH-FAP isolada a partir do plasma, a AH-FAP recombinante, variantes de AH-FAP ou células que exprimam tais produtos.

Por sua vez, as proteínas de ligação são úteis em composições para imunização e também para a purificação de AH-FAP e ainda são úteis para a detecção ou para a quantificação de AH-FAP em amostras de fluídos e tecidos, por meio de procedimentos imunológicos conhecidos. Também são aqui contemplados os anticorpos anti-idiotípicos específicos para as substâncias que são anticorpos específicos da AH-FAP. O valor científico da informação conseguida através da divulgação das sequências de ADN e de aminoácidos da presente invenção é manifesto. Como um exemplo entre vários, o conhecimento da sequência de um ADNc para a AH-FAP faz com que seja possível isolar, por hibridação de tipo ADN/ADN, sequências de ADN genómico que codificam a AH-FAP e que especificam as sequências regulativas de controlo da expressão da AH-FAP, tais como promotores, operadores e não só. Antevê-se que os procedimentos de hibridação de tipo ADN/ /ADN, realizados com sequências de ADN da invenção, em condições de rigor normalizadas na especialidade, também permitam isolar os ADN que codificam variantes alélicas de AH-FAP, outras proteínas estruturalmente congéneres que partilham uma ou várias das propriedades bioquímicas e/ou imunológicas da AH-FAP e proteínas de espécies não humanas homólogas da AH-FAP. A informação da sequência de ADN proporcionada pela presente invenção, também faz com que seja possível o desenvolvimento, por meio de estratégias de recombinação ou de “eliminação” [ver, v.g., Kapecchi, Science, 244:1288-1292 (1989)], de roedores que não sejam capazes de exprimir uma enzima funcional AH-FAP ou que exprima uma variante da enzima AH-FAP. Os polinucleótidos da invenção, quando convenientemente marcados, são úteis em ensaios de hibridação para detectar a capacidade das células para sintetizarem a 7S4 AH-FAP. Os polinucleótidos da invenção também podem ser a base de métodos de diagnóstico úteis para a identificação de uma ou várias alterações genéticas no local da AH-FAP que esteja subjacente a um ou vários estados patológicos. A invenção também faculta polinucleótidos anti-sentido relevantes para regular a expressão da AH-FAP pelas células que vulgarmente a exprimam.

Também está prevista a administração de preparações de AH-FAP da invenção aos mamíferos, em especial aos seres humanos, com a finalidade de se melhorar estados inflamatórios patológicos. Com base na implicação do envolvimento do FAP em estados inflamatórios patológicos, a administração de AH-FAP é aconselhada, por exemplo, no tratamento da asma [Miwa et ai, J. Clin. Invest., 82:1983-1991 (1988); Hsieh et al., J. Allergy Clin. Immunol., 91:650-657 (1993); e Yamashita et al., Allergy, 49:60-63 (1994)], anafilaxia [Venable et ai, supra], choque [Venable et al, supra], lesões por reperfúsão e isquémia do sistema nervoso central [Lindsberg et al. (1991), supra], artrite induzida por antigénios [Zarco et ai, Clin. Exp. Immunol., 88:318-323 (1992)], aterogénese [Handley et ai, DrugDev. Res., 7:361-375 (1986)], doença de Crohn [Denizot et ai, Digestive Diseases and Sciences, 37(3): 432-437 (1992)], necrose intestinal isquémica/enterocolite necrotizante [Denizot et al., supra e Caplan et ai, Acta Paediatr., Suppl. 396: 11-17 (1994)], colite ulcerativa (Denizot et ai, supra), choque isquémico [Satoh et ai, Stroke, 23: 1090-1092 (1992)], lesões cerebrais isquémicas [Lindsberg et ai, Stroke, 21: 1452-1457 (1990) e Lindsberg et ai (1991), supra], lúpus eritematoso sistémico [Matsuzaki et ai, Clinica ChimicaActa, 210: 139-144 (1992)], pancreatite aguda [Kald et ai, Pancreas, 8(4): 440-442 (1993)], septicémia (Kald et ai, supra), glomenilonefrite aguda pós--estreptocócica [Mezzano et ai, J. Am. Soc. Nephrol., 4: 235-242 (1993)], edema pulmonar resultante da terapia com a EL-2 [Rabinovici et ai, J. Clin Invest., 89: 1669-1673 (1992)], inflamação alérgica [Watanabe et al, Br. J. Pharmacol., 111:123-130 (1994)], insuficiência renal isquémica [Grino et al., Armais of Internai Medicine, 121(5): 345-347 (1994)]; parto interrompido [Hofíman et ai, Am. J. Obstei Gynecol., 162(2): 525-528 (1990) e Maki et al, Proc. Natl Acad Sei. USA, 85: 728-732 (1988)]; e síndroma das dificuldades respiratórias dos adultos [Rabinovici et al, J. Appl. Physiol, 7-/(4): 1791-1802 (1993); Matsumoto et al, Clin. Exp. Pharmacol Physiol, 19:509-515 (1992) e Rodriguez-Roisin et al, J. Clin Invest., 93: 188-194(1994)].

Foram já descritos na especialidade modelos com animais para muitos dos estados patológicos supramencionados. Por exemplo, no exemplo 16 subsequente está descrito um modelo de murganho para a asma, a rinite e o eczema; Zarco et al, supra descrevem um modelo de coelho para a artrite; há modelos com ratos para a necrose intestinal isquémica/enterocolite necrotizante, descritos por Furukawa et al em Ped. Res., 34 (2): 237-241 (1993) e por Caplan et al., supra', há um modelo com coelho para a apoplexia, descrito por Lindsberg et al. (1990), supra', há um modelo com murganho para o lúpus, descrito por Matsuzaki et al, supra; há um modelo com rato para a pancreatite aguda, descrito por Kald et al., supra; há um modelo com rato para o edema pulmonar resultante da terapia com a LL-2, descrito por Rabinovici et al, supra; há um modelo com rato para a inflamação alérgica, descrito por Watanabe et al., supra; há um modelo com cães para o enxerto renal, descrito por Watson et al. em Trcmsplantation, 56(4): 1047-1049 (1993); e há um modelo com rato para a síndroma das dificuldades respiratórias dos adultos, descrito por Rabinovici et al, supra. A presente invenção contempla especificamente composições de AH-FAP utilizáveis em métodos para o tratamento de mamíferos sensíveis a estados patológicos mediados pelo FAP ou que padeçam de tais doenças, os quais consistem em administrar a AH-FAP da invenção ao mamífero numa quantidade suficiente para suprir a actividade da AH-FAP endógena e para inactivar quantidades patológicas de FAP no mamífero.

As composições terapêuticas previstas pela invenção contêm a AH-FAP da invenção e um diluente ou um veículo fisiologicamente aceitável e também podem conter outros agentes que possuam efeitos anti-inflamatórios. As quantidades de dosagem indicadas devem ser suficientes para suprir a actividade de AH-FAP endógena e para inactivar as quantidades patológicas de FAP. Para uma apreciação geral sobre regimes de dosagem leia-se ‘Remmington ’s Pharmaceutical Sciences’, 18a edição, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). As doses irão estar compreendidas entre cerca de 0,1 pg e cerca de 1000 mg de AH-FAP/kg de peso corporal. As composições terapêuticas da invenção podem ser administradas por diversas vias, consoante o estado patológico que se pretenda tratar. Por exemplo, a administração pode ser feita pelas vias intravenosa, subcutânea, oral, rectal e/ou pulmonar.

No caso das doenças pulmonares, a administração da AH-FAP por via pulmonar é particularmente recomendada. Para a administração pulmonar há uma grande variedade de dispositivos de administração, incluindo, por exemplo, os nebulizadores, os inaladores de doses calibradas e os inaladores de pó, todos eles de conhecimento vulgarizado na especialidade. A administração de diversas proteínas aos pulmões e ao sistema circulatório por inalação de formulações em aerossol encontra-se descrita nas obras de Adjei et ai, ‘Pharm. Res.\ 7(6): 565-569 (1990) (acetato de leuprólido); Braquet et ai, ‘J. Cardio. Pharm. ’, /3(Sup. 5): s. 143-146 (1989) (endotelina-1); Hubbard et al., ‘Armais of Inetmal Medicine', /7/(3): 206-212 (1989) (antitripsina al); Smith et ai, 'J. Clin Invest.', 84: 1145-1146 (1989) (inibidor daproteinase α-l); Debs et ai, V. ImmunoU, 140: 3482-3488 (1933) (interferão γ recombinante e factor α da necrose tumoral); pedido de patente de invenção internacional n° WO 94/20069, ao abrigo do Tratado de Cooperação sobre Patentes (TCP), publicado a 15 de Setembro de 1994 (factor estimulador de colónias de granulócitos, recombinante e PEGilado).

DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS Há muitos outros aspectos e vantagens da presente invenção que se tomarão evidentes tendo em consideração a memória descritiva minuciosa subsequente e tomando como referência os desenhos em que: a figura 1 é uma fotografia de uma membrana de PFVD (em inglês PVDF) que contém AH-FAP purificada a partir de plasma humano; a figura 2 é um gráfico que ilustra a actividade enzimática da AH-FAP recombinante do plasma humano; a figura 3 é uma ilustração esquemática que representa fragmentos de AH-FAP recombinante e a sua actividade catalítica; a figura 4 é um gráfico de barras que ilustra o bloqueio do edema das patas do rato, induzido pelo FAP, mediante a administração local de AH-FAP recombinante da invenção; a figura 5 é um gráfico de barras que ilustra o bloqueio do edema das patas do rato, induzido pelo FAP, mediante a administração intravenosa de AH-FAP recombinante da invenção; a figura 6 é um gráfico de barras que mostra que a AH-FAP bloqueia o edema induzido pelo FAP mas não bloqueia o edema induzido pelo zimosano A; as figuras 7A e 7B traduzem os resultados de tipo dose-resposta respeitantes à actividade anti-inflamatória da AH-FAP no edema das patas do rato; as figuras 8A e 8B traduzem os resultados que indicam a eficácia in vivo de uma dose única de AH-FAP, ao longo do tempo; a figura 9 corresponde a uma curva que representa a farmacocinética da AH-FAP em circulação no rato; a figura 10 é um gráfico de barras que ilustra os efeitos anti-inflamatórios da AH-FAP em comparação com os efeitos menores dos antagonistas de FAP no edema das patas do rato.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA

Os exemplos seguintes ilustram a invenção. O exemplo 1 descreve um método novo para a purificação de AH-FAP a partir de plasma humano. O exemplo 2 descreve a microssequenciação de aminoácidos da AH-FAP purificada, proveniente do plasma humano. A clonagem de um ADNc de comprimento completo, que codifica a AH-FAP do plasma humano, está descrita no exemplo 3. A identificação de uma variante putativa por junção, do gene da AH-FAP do plasma humano, está descrita no exemplo 4. A clonagem de sequências genómicas, que codificam a AH-FAP do plasma humano, está descrita no exemplo 5. O exemplo 6 descreve a clonagem dos ADNc de caninos, murinos, roedores e macacos, homólogos do ADNc da AH-FAP do plasma humano. O exemplo 7 apresenta resultados de uma experiência que evidencia a actividade enzimática da AH-FAP recombinante, expressa de forma transiente em células COS 7. O exemplo 8 descreve a expressão de AH-FAP humana em E. coli e S. cerevisae. O exemplo 9 descreve um protocolo para a purificação de AH-FAP humana a partir de E. coli e descreve as análises que confirmam a sua actividade enzimática. O exemplo 10 descreve diversos produtos de AH-FAP recombinante, incluindo os análogos de substituição de aminoácidos e os produtos truncados nos terminais amino e carboxi. No exemplo 11 estão os resultados de um ensaio de autorradiografia à Northern para a expressão de ARN de AH-FAP do plasma humano em diversos tecidos e linhagens celulares e no exemplo 12 estão os resultados da hibridação in situ. O exemplo 13 descreve o desenvolvimento de anticorpos monoclonais específicos para a AH-FAP do plasma humano. Os exemplos 14, 15 e 16 descrevem os efeitos terapêuticos, in vivo, da administração de produtos de AH-FAP recombinante da invenção, respectivamente sobre a inflamação aguda, a pleurisia e a asma nos ratos. O exemplo 17 apresenta os resultados de imunoensaios feitos com o soro de pacientes humanos que manifestam uma deficiência na actividade da AH-FAP e descreve a identificação de uma lesão genética nesses pacientes, a qual é aparentemente responsável pela deficiência.

Exemplo 1

Purificou-se AH-FAP a partir de plasma humano com a finalidade de se obter material para a sequenciação dos aminoácidos. A. Optimização das condições de purificação

Inicialmente fez-se precipitar partículas de lipoproteínas de baixa densidade (LBD, em inglês LDL) a partir de plasma com fosfotungstato, tendo sido solubilizadas em ‘Tween 20’ a 0,1% e sujeitas a cromatografia numa coluna de DEAE (Pharmacia, Uppsala, Suécia) de acordo com o método de Stafforini et al. (1987), supra, mas uma eluição inconsistente da actividade de AH-FAP a partir da coluna de DEAE impôs a reavaliação da solubilização e das condições subsequentes de purificação.

Fez-se a avaliação do ‘Tween 20’, do SCHAP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) e do octil-glucósido por centrifugação e por cromatografia de filtração através de gel, para se pesquisar a sua capacidade para solubilizarem partículas de LBD. Com o SCHAP conseguiu-se uma recuperação da actividade solubilizada 25% superior à conseguida com ‘Tween 20’ e 300% superior à recuperação obtida com o octil-glucósido. O precipitado de LBD, solubilizado com SCHAP 10 mM, foi então fraccionado numa coluna de tipo ‘DEAE Sepharose Fast Flow’ (é uma coluna de permuta aniónica; Pharmacia) com um tampão que continha SCHAP 1 mM para se obter uma mistura abundante de AH-FAP parcialmente purificada (“a mistura DEAE”) para avaliação de outras colunas. A “mistura DEAE” foi utilizada como material de partida para se testar diversas colunas de cromatografia para se pesquisar a sua utilidade para purificar ainda mais a actividade de AH-FAP. As colunas testadas foram: ‘Blue Sepharose Fast Flow’ (Pharmacia), que é uma coluna de afinidade de um ligando corante; ‘S-Sepharose Fast Flow’ (Pharmacia), que é uma coluna de permuta catiónica; ‘Cu Chelating Sepharose’ (Pharmacia), que é uma coluna de afinidade de um ligando metálico; ‘Fractogel S’ (EM Separations, Gibbstown, NJ), que é uma coluna de permuta catiónica; e ‘Sephacryl-200’ (Pharmacia), que é uma coluna de filtração em gel. Todos estes procedimentos cromalográficos proporcionaram níveis diminutos e insatisfatórios de purificação quando se trabalhou com SCHAP 1 mM. A subsequente cromatografia de filtração em gel, na coluna de ‘Sephacryl-200’ com SCHAP 1 mM, gerou uma ffacção enzimaticamente activa cuja eluição teve lugar num intervalo maior do que o correspondente ao tamanho aproximado previsto de 44 kDa. Considerados em conjunto, estes resultados indicam que as proteínas LBD se agregaram em solução.

Houve então diferentes amostras de LBD que foram avaliadas por cromatografia analítica de filtração em gel para se pesquisar a agregação da actividade de AH-FAP. As amostras retiradas da ‘mistura DEAE’ e do precipitado de LBD recém-solubilizado foram analisadas em coluna de ‘Superose 12’ (Pharmacia) equilibrada em tampão com SCHAP 1 mM. A eluição das duas amostras teve lugar num intervalo bastante largo de pesos moleculares, tendo a eluição da maior parte da actividade ocorrido acima de 150 kDa. Quando as amostras

7Κ foram analisadas depois em coluna de ‘Superose 12’ equilibrada com SCHAP 10 mM, a eluição da maior parte da actividade teve lugar próximo de 44 kDa, conforme previsto para a actividade de AH-FAP. No entanto, as amostras continham alguma actividade de AH-FAP na região de elevado peso molecular correspondente aos agregados.

Noutras amostras a eluição de actividade de AH-FAP ocorreu exclusivamente na vizinhança aproximada dos 44 kDa, ao serrem testadas subsequentemente por filtração através de gel. Estas amostras eram um precipitado de LBD solubilizado em SCHAP 10 mM na presença de NaCl 0,5 M e de ‘mistura DEAE’ recente que se ajustou para um valor de 10 mM de SCHAP após a eluição a partir da coluna de DEAE. Estes dados indicam que são necessários pelo menos 10 mM de SCHAP para manter a AH-FAP não agregada. O aumento da concentração de SCHAP desde 1 mM até 10 mM, após a cromatografia sobre DEAE, mas antes dos passos cromatográficos subsequentes, teve como consequência diferenças extraordinárias na purificação. Por exemplo, o grau de purificação da AH-FAP na coluna de ‘S-Sepharose Fast Flow’ aumentou de 2 vezes para 10 vezes. A actividade de AH-FAP liga-se à coluna de ‘Blue Sepharose Fast Flow’ de forma irreversível em SCHAP 1 mM, mas a coluna gera o mais elevado nível de purificação em SCHAP 10 mM. A cromatografia em DEAE não melhorou com a adição prévia de SCHAP 10 mM. A cromatografia sobre ‘Cu Chelating Sepharose’ a seguir à coluna de ‘Blue Sepharose Fast Flow’ concentrou a actividade da AH-FAP 15 vezes. Também foi determinado que a actividade de AH-FAP poderia ser recuperada a partir de um gel de poliacrilamida com DSS reduzido, desde que as amostras não atingissem o ponto de ebulição. A actividade do material resultante da eluição a partir da coluna de ‘Cu Chelating Sepharose’, quando submetido a electroforese em gel de poliacrilamida com DSS, coincidiu com a actividade de uma banda de uma proteína principal quando o gel foi contrastado com prata.

Β. Protocolo de purificação da AH-FAP O novo protocolo utilizado para purificar a AH-FAP para sequenciação dos aminoácidos é pois constituído pelos passos a seguir indicados que foram executados a 4°C. Dividiu-se plasma humano em aliquotas de 900 mL em garrafas de Nalgene de 1 L e ajustou-se o pH para 8,6. Depois fez-se precipitar as partículas de LBD por adição de 90 mL de fosfotungstato de sódio a 3,85% a que se seguiu a adição de 23 mL de MgCÍ2 2 Μ. A seguir centrifugou-se o plasma durante 15 minutos a 3600 g. Com a massa obtida preparou-se nova suspensão em 800 mL de citrato de sódio a 0,2%. Fez-se precipitar novamente as LBD por adição de 10 g de NaCl e de 24 mL de MgCl2 2 M. As partículas de LBD foram reunidas por centrifugação durante 15 minutos a 3600 x g Este procedimento de lavagem foi repetido 2 vezes. A seguir congelou-se a mistura obtida para -20°C. Com as partículas de LBD obtidas a partir de 5 L de plasma preparou-se nova suspensão em 5 L de tampão A (Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM a pH 7,5) e manteve-se sob agitação de um dia para o outro. As partículas de LBD solubilizadas foram então centrifugadas a 3600 x g durante 1,5 horas. Combinou-se os sobrenadantes e filtrou-se através de papel de filtro ‘Whatman 113’ para se remover todos os sólidos restantes. Com o sobrenadante das LBD solubilizadas carregou-se uma coluna de tipo ‘DEAE Sepharose Fast Flow’ (11 cm x 10 cm; volume de resina igual a 1 L; 80 mL/minuto) equilibrada em tampão B (Tris 25 mM-HCl, SCHAP 1 mM a pH 7,5). Lavou-se a coluna com tampão B até a absorvência ter regressado ao seu valor de referência. Efectuou-se a eluição da proteína com 8 L, em gradiente NaCl a variar entre 0 M e 0,5 M, tendo sido colhidas fracções de 480 mL. Este passo foi necessário para se conseguir a ligação à coluna de ‘Blue Sepharose Fast Flow’, conforme a seguir se descreve. Efectuou-se uma análise das fracções para pesquisa da actividade da acetil-hidrolase, essencialmente em conformidade com o método descrito no exemplo 4. 7S£

Juntou-se as fracções activas e acrescentou-se uma quantidade suficiente de SCHAP para ajustar o valor da mistura para a concentração de SCHAP 10 mM. Com a ‘mistura DEAE’ carregou-se, de um dia para o outro, à razão de 4 mL/minuto, uma coluna ‘Blue Sepharose Fast Flow’ (5 cm x 10 cm; volume do leito igual a 200 mL) equilibrada em tampão A que continha NaCl 0,5 M. Lavou-se a coluna com o tampão de equilíbrio, à razão de 16 mL/minuto, até a absorvência ter regressado ao valor de referência. Neste passo teve lugar a eluição da actividade de AH-FAP com tampão A que continha KSCN 0,5 M (um sal caotrópico), à razão de 16 mL/minuto, tendo sido recolhida em fracções de 50 mL. Este passo proporcionou uma purificação superior a 1000 vezes. Juntou-se as fracções activas e ajustou-se a mistura para o valor de pH igual a 8,0 com Tris 1 M-HC1 a pH 8,0. Com a mistura activa, proveniente da cromatografia da coluna de ‘Blue Sepharose Fast Flow’, carregou-se uma coluna de ‘Cu Chelating Sepharose’ (2,5 cm x 2 cm; volume do leito igual a 10 mL; 4 mL/minuto) equilibrada em tampão C [Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM, NaCl 0,5 M a pH 8,0 (também funcionou com pH igual a 7,5)] e depois lavou-se a coluna com 50 mL de tampão C. A eluição da actividade da AH-FAP foi feita com 100 mL de imidazol 50 mM em tampão C, tendo sido recolhida em fracções de 10 mL. Juntou-se as fracções que continham a actividade de AH-FAP e efectuou-se a sua diálise em presença de tampão A. Para além de proporcionar uma concentração 15 vezes superior da actividade da AH-FAP, a coluna de ‘Cu Chelating Sepharose’ permitiu obter uma pequena purificação. A mistura proveniente da coluna de ‘Cu Chelating Sepharose’ foi reduzida em DTT 50 mM durante 15 minutos a 37°C e depois foi carregada sobre gel de poliacrilamida a 7,5% com uma espessura de 0,75 mm. Efectuou-se o corte de fatias de gel em cada 0,5 cm, tendo sido colocadas em tubos de microcentrifugação descartáveis que continham 200 pL de Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM e NaCl 150 mM. Efectuou-se a trituração dessas fatias e o produto obtido ficou a incubar de um dia para o outro a 4°C. A seguir efectuou-se uma pesquisa ?}£ ao sobrenadante de cada fatia de gel, à procura de actividade de AH-FAP, para se determinar qual a banda proteínica na EGPA-DSS que continha a actividade de AH-FAP. A actividade de AH-FAP foi encontrada numa banda que tinha aproximadamente 44 kDa. Efectuou-se a electrotransferência da proteína, proveniente de um gel em duplicado, para uma membrana de PFVD (hnmobilon-P, Millipore) e contrastou-se com o corante azul-de-coomassie. A figura 1 apresenta uma fotografia da membrana de PFVD.

Conforme consta do quadro 1 subsequente, houve aproximadamente 200 pg de AH-FAP que foram purificados 2 x 106 vezes a partir de 5 L de plasma humano. Em comparação, há uma purificação de 3 x 104 vezes da actividade de AH-FAP, que foi descrita por Stafforini et al. (1987), supra.

Quadro 1

Amostra Vol (mL) Actividade (q?mx 106) Actividade total (qtmxlO9) Ccnc ProL (rngmL) Actividade específica (cpmxlO6) Recuperarão de actividade Aumoto de purificação (n° de vezes) Passo Cum. Passo Cum. Plasma 5000 23 116 62 037 100 ιοο 1 1 LBD 4500 22 97 1,76 12 84 84 33 33 ‘DEAE’ 4200 49 207 1,08 46 212 178 3,7 124 ‘Blue’ 165 881 14 0,02 54200 70 126 1190 1,5x10* ‘Or 12 12700 152 0,15 82200 104 131 1,5 23x10* EGPA-DSS _ _ _ _ ~10 22x1o6

Dito de forma abreviada, os passos seguintes foram exclusivos e críticos para se purificar com êxito a AH-FAP do plasma para microssequenciação: (1) solubilização e cromatografia em SCHAP 10 mM, (2) cromatografia numa coluna de afinidade de ligando azul, tal como uma coluna de ‘Blue Sepharose Fast Flow’, (3) cromatografia numa coluna de afinidade de ligando de Cu, tal como uma coluna de ‘Cu Chelating Sepharose’ e (4) eluição da AH-FAP por EGPA-DSS.

Exemplo 2

Para a sequenciação dos aminoácidos excisou-se a banda proteínica que tinha aproxi-madamente 44 kDa, a partir de uma membrana de PFVD que continha a AH-FAP descrita no exemplo 1, e efectuou-se a sequenciação utilizando para tal um sequenciador de proteínas de modelo 473A da “Applied Biosystems” A análise da sequência do terminal N da banda proteínica de ~44 kDa, correspondente à actividade da AH-FAP, indicou que a banda continha duas sequências principais e duas sequências secundárias. A proporção entre as duas sequências principais era de 1:1 e por tal motivo foi difícil interpretar os dados das sequências.

Para se distinguir as sequências das duas proteínas principais que tinham sido resolvidas no gel de DSS, cortou-se ao meio uma membrana duplicada de PFVD que continha a banda de aproximadamente 44 kDa, de tal modo que a parte superior e a parte inferior da membrana foram sujeitas a sequenciação separadamente. A sequência do terminal N da metade inferior da membrana foi: SEQID NO: 1 FKDLGEENFKALVLIAF.

Uma pesquisa efectuada em bancos de dados sobre proteínas revelou que esta sequência era um fragmento da albumina do soro humano. A metade superior da mesma membrana de PFVD também foi sequenciada e a sequência de aminoácidos do terminal N obtida foi: SEQ ED NO:2 IQVLMAAASFGQTKIP.

Esta sequência não condiz com nenhuma proteína dos bancos de dados pesquisados e era diferente da sequência de aminoácidos do terminal N: SEQ ID NO:3

MKPLVVFVLGG que havia sido indicada para a AH-FAP do citoplasma dos eritrócitos por Stafforini et al. (1993), supra. A nova sequência (SEQ ID NO:2) foi utilizada para clonagem de AH-FAP do plasma humano, a partir de ADNc, conforme adiante descrito no exemplo 3.

Exemplo 3 A partir de um banco de dados de ADNc de macrófagos isolou-se um clone de comprimento completo que codifica a AH-FAP do plasma humano. A. Construção de um banco de ADNc de macrófagos

Recolheu-se ARN de poli A+ a partir de macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico. Gerou-se ADNc de cordão duplo e de extremidades a condizer utilizando para tal um estojo ‘Invitrogen Copy’ (San Diego, CA) e os adaptadores BstXl foram ligados ao ADNc antes da inserção no vector de expressão de mamífero, o pRc/CMV (Invitrogen). Os plasmídeos resultantes foram introduzidos na estirpe ‘XL-l Blue’ de E. coli por electroporação. As bactérias transformadas foram aplicadas, com uma densidade aproximada de 3000 clones por cada placa de gelose, sobre um total de 978 placas. O ADN plasmídico preparado separadamente a partir de cada placa foi conservado em misturas individuais e também foi combinado em misturas maiores representando cada uma delas 300 000 clones.

B. Pesquisa do banco de dados por RCP

Pesquisou-se o banco de macrófagos por reacção em cadeia com polimerase, utilizando um iniciador de RCP oligonucleotídico degenerado anti-sentido, baseado na nova sequência de aminoácidos do terminal N descrita no exemplo 2. A sequência do iniciador está identificada a seguir em nomenclatura da ‘RJPAC’, em que Τ’ designa inosina. SEQ ED NO:4 5’ AC AT GAATTCGGLAT C YTTIGT YT GICCRAA 3’.

Foram utilizadas as tabelas de escolha de codões de Wada et al., Nuc. Acids Res., J9S: 1981-1986 (1991), para seleccionar os nucleótidos na terceira posição de cada codão do iniciador. O iniciador foi utilizado em combinação com um iniciador específico para qualquer das sequências dos promotores SP6 ou T7, flanqueando ambas o local de clonagem de pRc/CMV, para pesquisar misturas de bancos de macrófagos de 300 000 clones. Todas as misturas de RCP continham 100 ng de uma matriz de ADNc, 1 pg de cada iniciador, 0,125 mM de cada dNTP, Tris 10 mM-HCl a pH 8,4, MgCl2 50 mM e 2,5 unidades de polimerase de Taq. A uma passo inicial de desnaturação de 94°C durante 4 minutos seguiu-se um conjunto de 30 ciclos de amplificação de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C e 2 minutos a 72°C. O produto de RCP resultante foi clonado no vector ‘pBluescript SK ‘ (Stratagene, La Jolla, CA) e a sua sequência de nucleótidos foi determinada pelo método didesoxi de terminação das cadeias. O produto da RCP continha a sequência prevista pela nova sequência peptídica e corresponde aos nucleótidos 1 a 331 da SEQID NO:7.

Para identificação de um clone de comprimento completo foram então concebidos os iniciadores de RCP adiante indicados, que são específicos para o fragmento de RCP clonado descrito supra.

Iniciador de sentido codificador (SEQ DD NO:5) 5’ TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG 3’

Iniciador anti-sentido (SEQ ID NO:6) 5’ CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC 3’.

As reacçóes em cadeia com polimerase (RCP), utilizando os iniciadores, foram realizadas conforme descrito antes, para se pesquisar em primeiro lugar as misturas de ADNc de 300 000 clones e depois para se pesquisar o subconjunto adequado de misturas mais pequenas de 3000 7S6 clones. Para transformar as bactérias foram então utilizadas três misturas de 3000 clones que deram origem a um produto de RCP com o tamanho previsto. C. Pesquisa do banco por hibridacão O ADN de bactérias transformadas foi depois pesquisado por hibridação utilizando como sonda o fragmento original clonado da RCP. Efectuou-se a transferência das colónias para membranas de nitrocelulose, tendo sido pré-hibridadas e hibridadas em formamida a 50%, cloreto de sódio 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M, fosfato de sódio 0,05 M a pH 6,5, poUvinil-pirrolidina a 1%, Ficoll a 1%, albumina de soro de bovino a 1% e ADN de esperma de salmão, tratado com ultra-sons, na concentração de 50 ng/mL. Marcou-se a sonda de hibridação por meio de uma estimulação hexamérica aleatória. Após a hibridação de um dia para o outro a 42°C efectuou-se uma lavagem exaustiva das formações de transferência em cloreto de sódio 0,03 M, citrato de sódio 3 mM, DSS a 0,1% e a 42°C. Determinou-se a sequência de nucleótidos de 10 clones hibridantes. Um dos clones, o clone sAH 406-3, continha a sequência, prevista pela sequência peptídica original, da actividade de AH-FAP purificada a partir de plasma humano. A sequência de ADN e a sequência deduzida de aminoácidos da AH-FA do plasma humano estão identificadas respectivamente por SEQID NO:7 e SEQID NO:8. O clone sAH 406-3 contém um fragmento intercalar de 1,52 kb com um bloco de leitura ininterrupta que codifica uma proteína prevista de 441 aminoácidos. No terminal amino há um segmento relativamente hidrofóbico de 41 resíduos que precede o aminoácido do terminal N (a isoleucina na posição 42 da SEQ ID NO:8) identificado pela microssequenciação de proteínas. Assim, a proteína codificada pode ter quer uma sequência de sinal comprida quer uma sequência de sinal mais um péptido adicional que é clivado para dar origem à enzima funcional perfeitamente desenvolvida (madura). A presença de uma sequência de 7$4 sinal é uma das características das proteínas segregadas. Além disso, a proteína codificada pelo clone sAH 406-3 contém o motivo de consenso GxSxG (aminoácidos 271-275 da SEQ ID NO:8) sobre o qual se presume que contém a serina do local activo de todas as lipases conhecidas de mamíferos, das lipases microbianas e das proteases da serina. Ver Chapus et ai, Biochimie, 70: 1223-1224 (1988) e Brenner, Nature, 334:528-530 (1988). O quadro 2 subsequente compara a composição de aminoácidos da AH-FAP do plasma humano da presente invenção, conforme prevista a partir da SEQ ID NO:8, e a composição de aminoácidos do material substancialmente purificado descrito por Stafforini et al. (1987), supra.

Quadro 2 Clone sAH 406-3 Stafforini et al. Ala 26 24 Aspe Asn 48 37 Cis 5 14 Glu e Gin 36 42 Phe 22 12 Gli 29 58 His 13 24 De 31 17 Lis 26 50 Leu 40 26 Met 10 7 Pro 15 11 Arg 18 16 Ser 27 36 Thr 20 15 Vai 13 14 Trp 7 Não determinado Tir 14 13

A composição de aminoácidos da forma madura de AH-FAP do plasma humano da presente invenção e a composição de aminoácidos do material anteriormente purificado, que era supostamente a AH-FAP do plasma humano, são claramente distintas.

Ao experimentar fazer o alinhamento, segundo Hattori et al, do nucleótido identificado supra e das sequências de aminoácidos deduzidas da AH-FAP citoplásmica do cérebro dos bovinos, com o nucleótido e as sequências de aminoácidos da AH-FAP do plasma humano da presente invenção, não foi observada nas sequências nenhuma semelhança estrutural significativa.

Exemplo 4

Detectou-se uma variante putativa de junção, do gene da AH-FAP humana, ao executar uma RCP com ADNc de macrófagos, estimulado por PBMC, utilizando iniciadores que hibridaram com a região não traduzida de 5’ (nucleótidos 31 a 52 da SEQID NO:7) e com a região que abrange o codão de terminação da tradução na extremidade 3’ do ADNc da AH-FAP (nucleótidos 1465 a 1487 da SEQ ID NO:7). As RCP geraram duas brandas sobre um gel, uma correspondente ao tamanho previsto do ADNc da AH-FAP do exemplo 3 e a outra com um comprimento cerca de 100 pb mais curto. A sequenciação das duas bandas revelou que a banda maior era o ADNc da AH-FAP do exemplo 3, ao passo que à banda mais curta lhe faltava o exão 2 (exemplo 5 subsequente) da sequência da AH-FAP que codifica o sinal putativo e as sequências propeptídicas da AH-FAP do plasma. A tríade catalítica prevista e todas as cisternas estavam presentes no clone mais curto, pelo que é provável que a actividade bioquímica da proteína codifica pelo clone se adeqúe à da enzima do plasma.

Exemplo 5

Foram também isoladas sequências genómicas de AH-FAP do plasma humano. Determinou-se a estrutura do gene de AH-FAP isolando os clones dos bacteriófagos lambda e PI que contêm ADN genómico humano, mediante hibridação de ADN em condições de elevado rigor. Os fragmentos dos clones dos bacteriófagos foram subclonados e sequenciados utilizando para tal os iniciadores concebidos para a recombinação a intervalos regulares por todo o clone de ADNc designado por sAH 406-3. Além disso, foram utilizados novos iniciadores de sequenciação, concebidos para a recombinação com regiões de intrões que flanqueiam os exões, para sequenciar outra vez através das fronteiras entre exões/intrões para confirmar as sequências. As fronteiras entre exões/intrões foram definidas como sendo os pontos onde divergiam as sequências genómicas e as de ADNc. Estas análises revelaram que o gene da AH-FAP é constituído por 12 exões.

Os exões 1,2,3,4,5,6 e parte do 7 foram isolados a partir de um banco placentário de um feto masculino construído em ‘lambda ΠΧ’ (Stratagene). A partir das placas de bacteriófagos efectuou-se a transferência para nitrocelulose e fez-se uma pré-hibridação e uma hibridação em formamida a 50%, cloreto de sódio 0,75 M, citrato de sódio 75 mM, fosfato de sódio 50 mM (pH 6,5), pohvinil-pinolidina a 1%, ‘Ficoll’ a 1%, albumina de soro de bovino a 1% e ADN de esperma de salmão, tratado com ultra-sons, na concentração de 50 ng/mL. A sonda de hibridação, utilizada para identificar um clone de bacteriófagos contendo os exões 2 a 6 e parte do 7, era constituída pela totalidade do clone de ADNc do sAH 406-3. Identificou-se um clone que continha o exão 1, utilizando um fragmento obtido a partir da extremidade 5’ do clone de ADNc (nucleótidos 1 a 312 da SEQ ED NO:7). Ambas as sondas foram marcadas com 32P por estimulação hexamérica aleatória. Após a hibridação de um dia para o outro a 7í4 42°C efectuou-se a lavagem das formações obtidas, exaustivamente em cloreto de sódio 30 mM, citrato de sódio 3 mM, DSS a 0,1% e à temperatura de 42C. As sequências de ADN dos exões 1, 2, 3, 4, 5 e 6 conjuntamente com as sequências parciais dos intrões adjacentes estão identificadas respectivamente nas SEQID NOs:9,10,11,12, 13 e 14. A parte restante do exão 7 e também os exões 8, 9, 10, 11 e 12 foram subclonados a partir de um clone Pl isolado a partir de um banco genómico de PI humano. As placas do bacteriófago Pl foram transferidas para nitrocelulose e pré-hibridadas e hibridadas em cloreto de sódio 0,75 M, fosfato de sódio 50 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, pohvinil-pirrolidina a 1%, ‘FicolT a 1%, albumina de soro de bovino a 1%, DSS a 0,5% e ADN humano total na concentração de 0,1 mg/mL. A sonda de hibridação, marcada com 32P por estimulação hexamérica aleatória, era constituída por um fragmento de ADN genómico de 2,6 kb obtido com EcoRI, proveniente da extremidade 3’ de um clone lambda isolado supra. Este fragmento continha o exão 6 e a parte do exão 7 presente no clone do bacteriófago. Após a hibridação de um dia para o outro a 56°C, as formações obtidas por transferência foram lavadas conforme descrito antes. As sequências de ADN dos exões 7, 8, 9, 10, 11 e 12 conjuntamente com as sequências parciais do intrão adjacente estão identificadas respectivamente nas SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19 e 20.

Exemplo 6

Foram isolados clones de ADNc de AH-FAP do plasma, de comprimento completo, a partir de bancos de ADNc do baço de murganhos e de cães e isolou-se também um clone parcial de roedor a partir de um banco de ADNc do timo do rato. Os clones foram identificados por hibridação em condições de fraco rigor (as condições de hibridação eram iguais às descritas para os exões 1 a 6 no exemplo 5 anterior, com a excepção de se ter utilizado formamida a 20% em vez de formamida a 50%). Como sonda hibridante utilizou-se um fragmento de 1 kb obtido com HindTTT a partir do clone de ADNc do sAH 406-3 de AH-FAP (nucleótidos 309 a 1322 da SEQ ED NO: 7). Além disso, isolou-se um clone parcial de macaco a partir de ADNc do cérebro de macaco por RCP utilizando iniciadores baseados nos nucleótidos 285 a 303 e 851 a 867 da SEQ ID NO:7. As sequências de nucleótidos e as sequências deduzidas de aminoácidos dos clones de ADNc de murganho, cão, rato e macaco estão identificadas respectivamente nas SEQ ID NOs:21,22,23 e 24.

Uma comparação das sequências deduzidas de aminoácidos dos clones de ADNc com o clone de ADNc humano permitiu obter os valores percentuais respeitantes à identidade entre aminoácidos, conforme consta do quadro 3 subsequente.

Quadro 3 Cão Ser humano 80 Cão Murganho Murganho 66 64 Macaco 92 82 69 Rato 74 69 82

Exemplo 7

Para se determinar se o clone sAH 406-3 de ADNc da AH-FAP do plasma humano (exemplo 3) codifica uma proteína que possui actividade de AH-FAP, exprimiu-se de forma transitória em células COS 7 o arquétipo de expressão pRc/CMV. Três dias após a transfecçào por um método com ‘DEAE Dextrano’, testou-se os meios das células COS para pesquisar a actividade de AH-FAP.

As células foram aplicadas como inoculo segundo uma densidade de 300 000 células por cada prato de cultura de tecidos de 60 mm. No dia seguinte as células foram incubadas em MEMD (em inglês DMEM) contendo ΌΕΑΕ Dextrano’ na concentração de 0,5 mg/mL, cloroquina 0,1 mM e 5-10 pg de ADN plasmídico, durante 2 horas. As células foram então tratadas com DMSO a 10% em soluto salino tamponado com fosfato durante 1 minuto e depois foram lavadas com os meios e incubadas em MEMD que continha 10% de soro fetal de vitelo previamente tratado com fluorofosfato de diisopropilo (FPD, em inglês DFP) para inactivar a AH-FAP endógena do soro de bovino. Ao fim de três dias de incubação os meios onde estavam as células transfectadas foram testados para se pesquisar a actividade de AH-FAP. As experiências foram realizadas na presença e na ausência quer de EDTA 10 mM quer de FPD 1 mM para se determinar se a enzima recombinante era independente do cálcio e se era inibida pelo FPD, enquanto inibidor da esterase da serina, conforme anteriormente descrito para a AH-FAP na obra de Stafforini et al. (1987), supra. As contraprovas negativas eram constituídas por células transfectadas com pRc/CMV às quais lhes faltava um segmento intercalar ou então continham o segmento intercalar sAH 406-3 em orientação inversa. A actividade de AH-FAP nos sobrenadantes transfectantes foi determinada pelo método de Stafforini et al. (1990), supra, com as modificações a seguir indicadas. Dito de forma abreviada, determinou-se a actividade de AH-FAP medindo a hidrólise do 3H-acetato a partir de [acetil-3H]-FAP (New England Nuclear, Boston, MA). Separou-se o 3H-acetato livre aquoso retirando-o do substrato marcado, por cromatografia em coluna de fase inversa, sobre cargas de gel de sílica octadecílica (Baker Research Products, Phillipsburg, PA). As experiências foram efectuadas utilizando 10 pL de sobrenadante transfectante em tampão Hepes 0,1 M a pH 7,2 num volume de reacção de 50 pL. Utilizou-se um total de 50 pmol de substrato para cada ^¾7 reacção, com uma proporção entre FAP marcado:não marcado igual a 1:5. As misturas de reacção foram incubadas durante 30 minutos a 37°C, tendo as reacções sido interrompidas por adição de 40 pL de ácido acético 10 M. Depois lavou-se a solução através de cargas de gel de sílica octadecílica e a seguir efectuou-se o enxaguamento com acetato de sódio 0,1 M. Recolheu-se o eluído aquoso de cada amostra e fez-se uma contagem num contador de cintilação em meio líquido durante 1 minuto. A actividade enzimática foi expressa em unidades de contagem por minuto.

Conforme ilustrado na figura 2, os meios provenientes das células transfectadas com sAH 406-3 continham actividade de AH-FAP em níveis 4 vezes superiores aos espontâneos. Esta actividade não foi afectada pela presença de EDTA mas foi suprimida com FPD 1 mM. Estas observações demonstram que o clone sAH 406-3 codifica uma actividade consistente com a enzima AH-FAP do plasma humano.

Exemplo 8

Utilizou-se uma RCP para gerar um fragmento de ADNc de AH-FAP do plasma humano, codificador de uma proteína, obtido a partir do clone sAH 406-3 que foi fácil de submeter a uma subclonagem dentro de um vector de expressão de E. coli. O segmento subclonado começava na extremidade 5’ do gene humano com o codão que codifica fle42 (SEQ ID NO:8), o resíduo do terminal N da enzima purificada a partir de plasma humano. A parte restante do gene de uma extremidade à outra do codão natural de terminação estava contida no arquétipo. O iniciador de RCP de sentido codificador em 5 ’ que foi utilizado era: SEQTDN0.25 5’ TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG 3’ 7jrf e continha um local de clonagem Xbal e também um codão de início da tradução (sublinhado). O iniciador anti-sentido em 3’ utilizado foi: SEQ Π) N0.26 5’ ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG 3’ e abrangia o codão de terminação de sAH 406-3 e continha um local de clonagem EcoRV. As RCP foram realizadas essencialmente conforme descrito no exemplo 3. O produto resultante da RCP foi digerido com Xba\ e /TcoRV e suclonado dentro de um vector pBR322 que continha o promotor Trp [deBoer et ai, PNAS, 80: 21-25 (1983)] imediatamente a montante do local de clonagem. Transformou-se a estirpe "XL-1 Blue’ de E. coli com o arquétipo de expressão e criou--se em cultura em caldo L que continha carbenicilina na concentração de 100 pg/mL. Os transformantes provenientes de culturas efectuadas de um dia para o outro foram reunidos e novamente colocados em suspensão em tampão de Use que continha Tris 50 mM-HCl a pH 7,5, NaCl 50 mM, SCHAP 10 mM, EDTA 1 mM, lisozima na concentração de 100 pg/mL e 0,05 unidades inibidoras da tripsina (UIT)/mL de aprotinina. Ao fim de 1 hora de incubação sobre gelo e após tratamento com ultra-sons durante 2 minutos efectuou-se uma análise dos Usados para se pesquisar a actividade de AH-FAP pelo método descrito no exemplo 4. A estirpe de E. coli transformada com o arquétipo de expressão (designado por ‘trp AH’) gerou um produto com actividade de AH-FAP. Ver o quadro 6 no exemplo 9.

Também foram utilizados arquétipos que continham mais três promotores, o promotor tacR (deBoer, supra), o promotor da arabinose (ara) B obtido a partir de Salmonella typhimurium [Horwitz et al, Gene, 14: 309-319 (1981)] e o promotor do bacteriófago T7, para comandar a expressão das sequências da AH-FAP humana em E. coli. Os arquétipos que continham o promotor Trp (pUC trp AH), o promotor tacU (pUC tac AH) e o promotor ardB (pUC ara AH) Μ foram montados no pUC 19 plasmídico (New England Biolabs, MA), ao passo que o arquétipo que continha o promotor de T7 (pET AH) foi montado no pET15B plasmídico (Novagen, Madison, WI). Também se montou em pET15B um arquétipo que continha um promotor híbrido, o pHAB/PH, constituído pelo promotor de araB fundido com os locais de ligação ribossómicos da região do promotor de T7. Todos os arquétipos de E. coli produziram actividade de AH-FAP num intervalo entre 20 e 50 U/mL/DOôoo· Esta actividade correspondeu a uma massa proteínica recombinante total > 1% da proteína celular total. A AH-FAP humana recombinante também foi expressa em Saccharomyces cerevisae. Utilizou-se o promotor de levedura ADH2 para comandar a expressão de AH-FAPr, tendo sido produzidas 7 U/mL/DOéoo (ver o quadro 4 subsequente).

Quadro 4 Arquétipo Estirpe pUC tac AH tac E. coli W3110 pUCtrpAH trp e. coli m no pUC ara AH araB E. coli W3110 pETAH T7 E. coli BL21 (DE3) (‘Novagen’) aráBÍTl E. coli XL-1 pHAB/PH pYep ADH2 AH ADH2 Levedura BJ2.28

Actividade enzimática (U/mL/DO) 30 40 20 50 34 7

Fez-se também a avaliação de diversos arquétipos de expressão de E. coli que produziram AH-FAP com terminais amino prolongados. O terminal N da AH-FAP do plasma natural foi identificado como sendo De42 por sequenciação dos aminoácidos (exemplo 2). No entanto, a sequência imediatamente a montante de Ile42 não está em conformidade com os aminoácidos 75& encontrados nos locais de clivagem da sequência de sinal [isto é, a “regra -3-1” não foi satisfeita, uma vez que não foi encontrada nenhuma lisina na posição -1; ver a obra de von Heijne, Nuc. Acids,. Res., 14: 4683-4690 (1986)]. Presumivelmente há uma sequência de sinal mais clássica (Mj -An) que é reconhecida pelo sistema de secreção celular, seguida pela clivagem endo-proteolítica. A sequência codificadora completa da AH-FAP, a começar no resíduo metionina de iniciação (nucleótidos 162 a 1487 da SEQ ID NO:7), foi congeminada para expressão em E. coli, utilizando o promotor trp. Conforme ilustrado no quadro 5, este arquétipo activou a AH--FAP, mas a expressão foi aproximadamente igual a um cinquentavo do nível do valor observado com o arquétipo original a começar em ne42. O outro arquétipo de expressão, a começar em Val18 (nucleótidos 213 a 1487 da SEQ ID NO:7), produziu a AH-FAP activa com cerca de um terço do nível observado no arquétipo original. Estes resultados sugerem que os prolongamentos na extremidade do terminal amino não são críticos ou não são necessários para a actividade da AH-FAP recombinante produzida em E. coli.

ArauétiDO Quadro 5 Actividade de AH-FAP (U/mL/DCW) Lisado Meio pUCtrpAH 177,7 0,030 pUC tip AH Meti 3,1 0,003 pUCtrpAH Vai,g 54,6 0,033 Exemplo 9

Purificou-se AH-FAP recombinante do plasma humano (a começar em fle42), expressa em E. coli, até se obter uma banda única contrastada com corante de Coomassie, por EGPA-DSS, utilizando para tal vários métodos, e pesquisou-se à procura das actividades manifestadas pela enzima AH-FAP natural. A. Purificação da AH-FAP recombinante O primeiro procedimento de purificação utilizado é semelhante ao descrito no exemplo 1 para a AH-FAP natural. Os passos a seguir descritos foram executados a 4°C. As misturas obtidas a partir de 50 mL de E. coli (transformada com o arquétipo de expressão ‘trp AH’), produtora de AH-FAP, foram Usadas conforme descrito no exemplo 8. Efectuou-se a remoção dos sóUdos por centrifugação a 10 000 x g durante 20 minutos. Com o sobrenadante carregou-se uma coluna de tipo ‘Blue Sepharose Fast Flow’, a trabalhar com um caudal de 0,8 mL/minuto (coluna de 2,5 cm x 4 cm; volume do leito igual a 20 mL), equihbrada com tampão D (Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM, NaCl 0,5 M a pH 7,5). Lavou-se a coluna com 100 mL de tampão D e fez-se a eluição com 100 mL de tampão A que continha KSCN 0,5 M, com um caudal de 3,2 mL/minuto. Carregou-se uma fracção activa de 15 mL numa coluna de 1 mL de tipo ‘Cu Chelating Sepharose’ equihbrada em tampão D. Lavou-se a coluna com 5 mL de tampão D e depois efectuou-se a eluição com 5 mL de tampão D que continha imidazol 100 mM, com escoamento gravítico. As fracções que continham actividade de AH-FAP foram analisadas por EGPA-DSS.

Os resultados da purificação estão agrupados no quadro 6, em que uma unidade é igual à hidróhse de 1 jjmol de FAP por hora. O produto de purificação obtido a 4°C surgiu na EGPA-DSS como uma banda intensa única abaixo do marcador de 43 kDa, com alguma contrastação difusa directamente acima e abaixo desse marcador. O material recombinante é significativamente mais puro e revela possuir maior actividade específica quando comparado com as preparações de AH-FAP obtidas a partir de plasma, conforme descrito no exemplo 1. 7½

Quadro 6

Amoara Volume Actividade Actividade total CcncJVoL Actividade OTeafica % derecneacãode AumalodaDurificado (mL) (urodadesmL) (utidadesx IO3) fmEftnL) fumdadesâng) actividade (n°dew2is) Passo Cum. Passo Cum Lisado 4,5 989 4451 15.6 63 100 100 1 1 Hue’ 15 64 960 0,07 914 22 22 14,4 14,4 ‘Cu’ 1 2128 2128 055 3869 220 48 42 61

Quando o mesmo protocolo de purificação foi executado à temperatura ambiente, para além da banda abaixo do marcador de 43 kDa, houve um grupo de bandas abaixo do marcador de 29 kDa, correlacionadas com a actividade de AH-FAP das lamelas de gel experimentadas. Estas bandas de peso molecular mais baixo podem ser eventualmente fragmentos proteolíticos da AH-FAP que conservem a actividade enzimática.

Foi também executado um procedimento de purificação diferente, à temperatura ambiente. Com as massas (100 g) de E. coli produtora de AH-FAP (estirpe transformada com o arquétipo de expressão pUC trp AH) preparou-se nova suspensão em 200 mL de tampão de lise (Tris 25 mM, SCHAP 20 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, benzamidina na concentração de 50 pg/mL a pH 7,5) e efectuou-se a lise por passagem três vezes através de um microfluidificador a 15 000 psi. Efectuou-se a remoção dos sólidos por centrifugação a 14 300 x g durante 1 hora. Diluiu--se o sobrenadante 10 vezes em tampão de diluição [MES 25 mM (ácido 2-[N-morfolino]--etano-sulfónico), SCHAP 10 mM, EDTA 1 mM a pH 4,9] e carregou-se, à razão de 25 mL/ minuto, numa coluna de tipo ‘S-Sepharose Fast Flow’ (200 mL) (é uma coluna de permuta catiónica) equilibrada em tampão E (MES 25 mM, SCHAP 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM a pH 5,5). Lavou-se a coluna com 1 L de tampão E, efectuou-se a eluição com NaCl 1 M e recolheu-se o produto de eluição em fracções de 50 mL ajustadas para pH 7,5 com 0,5 mL de base Tris 2 M. Juntou-se as fracções que continham a actividade de AH-FAP e ajustou-se para NaCl 0,5 M. Com a mistura ‘S’ carregou-se uma coluna ‘Blue Sepharose Fast Flow’, à razão de 1 mL/minuto (coluna de 2,5 cm x 4 cm; 20 mL), equilibrada em tampão F (Tris 25 mM, SCHAP 10 mM, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM a pH 7,5). Lavou-se a coluna com 100 mL de tampão F e efectuou-se a eluição com 100 mL de tampão F que continha NaCl 3 M, à razão de 4 mL/minuto. Repetiu-se o passo de cromatografia em coluna de tipo ‘Blue Sepharose Fast Flow’ para se reduzir os níveis de endotoxinas na amostra.

Juntou-se as fracções que continham actividade de AH-FAP e efectuou-se a sua diálise em presença de tampão G (Tris 25 mM a pH 7,5, NaCl 0,5 M, Tween 80 a 0,01% e EDTA 1 mM).

Os resultados da purificação estão agrupados no quadro 7, em que uma unidade é igual à hidrólise de 1 pmol de FAP por hora.

Quadro 7

.Amoeda Volume Actividade Actividade total ConcProL (mU (umdadesmLl (unidades x IO3! (maitiU

Usado 200 5640 1128 57.46 •s· 111 5742 637 3.69 ‘Blue’ 100 3944 394 0.84

Actividade earedfica % deiecuDoacãode Aumatfo da ourificacâo (unidadestno) actividade Wdevsas) Passo Cum. Paso Cum 98 100 100 1 I 1557 57 56 1$ 16 4676 35 62 3 48 O produto da purificação obtido apareceu na EGPA-DSS sob a forma de uma banda intensa única abaixo do marcador de 43 kDa, com alguma contrastação difusa directamente acima e abaixo desse marcador. O material recombinante é significativamente mais puro e revela possuir maior actividade específica quando comparado com as preparações de AH-FAP obtidas a partir do plasma, conforme descrito no exemplo 1. Há ainda outro procedimento de purificação, previsto na presente invenção, que compreende os passos a seguir descritos de lise celular, clarificação e passagem por uma primeira 7% coluna. As células sào diluídas a 1:1 em tampão de lise (Tris 25 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 80 a 1% e EDTA 2 mM). Efectua-se a lise num microfluidificador fortemente arrefecido, a uma pressão entre 15000-20000 psi, com três passagens do material para se conseguir um desmembramento celular superior a 99%. Dilui-se o lisado a 1:20 em tampão de diluição (Tris 25 mM a pH 8,5, EDTA 1 mM) e aplica-se a uma coluna carregada com meios croma-tográficos ‘Q-Sepharose Big Bead’ (Pharmacia) e equilibrada em Tris 25 mM a pH 8,5, EDTA 1 mM e ‘Tween 80’ a 0,015%. Dilui-se o produto de eluição a 1:10 em MES 25 mM a pH 5,5, sulfato de amónio 1,2 M, EDTA 1 mM e aplica-se a uma coluna com meios cromatográficos ‘Butyl Sepharose’ (Pharmacia) equilibrada no mesmo tampão. A eluição da actividade de AH-FAP tem lugar em MES a 25 mM a pH 5,5, ‘Tween 80’ a 0,1% e EDTA 1 mM. B. Actividade da AH-FAP recombinante

A mais notável propriedade da acetil-hidrolase de FAP é a sua especificidade notável para substratos com um resíduo curto na posição sn-2 do substrato. Esta especificidade estrita distingue a acetil-hidrolase de FAP de outras formas de PLA2. Assim, para se determinar se a AH-FAP recombinante degrada os fosfolípidos com ácidos gordos de cadeia longa na posição sn-2, experimentou-se a hidrólise de l-paImitoíl-2-araquidonoíl-s7i-glicero-3-fosfocolina (araquidonoílPC), uma vez que este é o substrato preferido para a forma bem caracterizada de PLA2. Conforme previsto por estudos anteriores efectuados com a AH-FAP natural, este fosfo-lípido não foi hidrolisado quando incubado com a AH-FAP recombinante. Noutras experiências complementares, incluiu-se o araquidonoílPC num ensaio convencional de hidrólise de FAP em concentrações variáveis entre 0 e 125 μΜ para se determinar se inibia a hidrólise do FAP pela AH-FAP recombinante. Não houve inibição da hidrólise de FAP, mesmo à concentração mais elevada de AH-FAP, que foi 5 vezes superior à concentração e FAP. Assim, a AH-FAP ?id recombinante exibe para com o substrato a mesma selectividade da enzima natural; os substratos de cadeia comprida não são reconhecidos. Além disso, a enzima AH-FAP recombinante degradou rapidamente um fosfolípido oxidado (glutaroílPC) que tinha sido objecto de uma clivagem oxidativa do ácido gordo em sn-2. A AH-FAP do plasma natural tem ainda outras propriedades que a distinguem de outras fosfolipases, incluindo-se entre elas a independência do cálcio e a resistência aos compostos que modificam os grupos sulfídrilo ou que destroem os dissulfuretos.

Qualquer das enzimas AH-FAP do plasma, naturais ou recombinantes, é sensível ao FPD, indicando que uma serina compreende parte dos seus locais activos. Uma particularidade invulgar da acetil-hidrolase de FAP do plasma natural é o facto de estar estreitamente associada às lipoproteínas em circulação e o facto de a sua eficiência catalítica ser influenciada pelo ambiente lipoproteínico. Quando a AH-FAP recombinante da invenção foi incubada com plasma humano (previamente tratado com FPD para suprimir a actividade enzimática endógena), associou-se com lipoproteínas de alta e baixa densidade de forma idêntica à da actividade natural. Este resultado é significativo uma vez que há provas bastantes de que a modificação das lipoproteínas de baixa densidade é essencial para a deposição de colesterol, observada nos ateromas, e de que a oxidação dos lípidos é um factor iniciador neste processo. A AH-FAP protege as lipoproteínas de baixa densidade contra modificações em condições oxidantes in vitro e pode ter o mesmo papel in vivo. Por tal motivo, a administração de AH-FAP é indicada para a supressão de oxidação de lipoproteínas em placas ateroscleróticas e também para resolver inflamações.

Todos estes resultados confirmam que o clone sAH 406-3 de ADNc codifica uma proteína com as actividades da acetil-hidrolase de FAP do plasma humano.

Exemplo 10 Há vários outros produtos de AH-FAP recombinantes que foram expressos em E. coli. Estes produtos compreendem os análogos de AH-FAP, que possuem mutações de um só aminoácido, e fragmentos de AH-FAP.

A. Produtos de substituição de aminoácidos da AH-FAP A AH-FAP é uma lipase porque hidrolisa o fosfolípido FAP. Embora não haja nenhuma semelhança global entre a AH-FAP e outras lipases já caracterizadas, foram encontrados resíduos conservados em comparações de lipases caracterizadas estruturalmente. Foi identificado um resíduo serina como membro de um local activo. A serina, em conjunto com um resíduo aspartato e um resíduo histidina, forma uma tríade catalítica que representa o local activo da lipase. Os três resíduos não estão adjacentes na sequência proteínica primária, mas estudos estruturais vieram demonstrar que os três resíduos estão adjacentes no espaço tridimensional. Comparações de estruturas de Upases de mamíferos sugerem que o resíduo Asp se encontra geralmente a 24 aminoácidos do terminal C, relativamente à serina do local activo. Além disso, a histidina está geralmente 109 a 111 aminoácidos do terminal C, relativamente à serina do local activo.

Por mutagénese dirigida ao local e por RCP efectuou-se a modificação de codões individuais na sequência codificadora da AH-FAP humana para codificar resíduos alanina, tendo sido expressos em E. coli. Conforme se observa no quadro 8 subsequente, por exemplo, a abreviatura “S108A” indica que o resíduo serina na posição 273 foi trocado por um resíduo alanina e que as mutações pontuais de Ser^, Asp2% ou H1S351 destroem completamente a actividade da AH-FAP. As distâncias entre os resíduos do local activo são semelhantes para a AH-FAP (Ser por Asp, 23 aminoácidos; Ser por His, 78 aminoácidos) e para outras lipases.

Estas experiências demonstram que os resíduos Ser^, Asps* ou H1S351 são críticos para a actividade e por tal motivo são candidatos possíveis como resíduos da tríade catalítica. Os resíduos cisteína são frequentemente críticos para a integridade funcional das proteínas, devido à sua capacidade para formarem pontes dissulfureto. A enzima AH-FAP do plasma contém cinco resíduos cisteína. Para se determinar se algum dos cinco resíduos cisteína é crítico para a actividade da enzima, efectuou-se a mutação de cada resíduo cisteína por troca com um resíduo serina e os mutantes resultantes foram expressos em E. coli. Conforme se observa no quadro 8 seguinte, obteve-se uma perda significativa, mas não total, de actividade da AH-FAP pela conversão de qualquer dos resíduos CÍS229 ou C1S291 por troca com serina. Assim sendo, parece que estes resíduos cisteína são necessários para a actividade completa da AH-FAP. Houve outras mutações pontuais que tiveram um diminuto ou mesmo nenhum efeito sobre a actividade catalítica da AH-FAP. No quadro 8 a simbologia “ ι h t-” representa a actividade da AH-FAP de tipo natural genuíno correspondente a cerca de 40-60 U/mL/DOôoo, “+++” representa uma actividade de cerca de 20-40 U/mL/DOóoo, “++” representa uma actividade de cerca de 10-20 U/mL/DOóoo, “+” representa uma actividade de cerca de 1-10 U/mL/DOeoo e indica uma actividade < 1 U/mL/D06oo·

Quadro 8

Mutação Actividade de AH-FAP

Tipo natural ++++ S108A -H-H-

S273A

D296A D338A ++++

H351A

Quadro 8 (cont.)

Mutação Actividade de AH-FAP H395A, H399A ++++ C67S +++ C229S + C291S + C334S ++++ C407S +++

B. Produtos de fragmentos de AH-FAP

Foram obtidas supressões no terminal C fazendo digerir a extremidade 3’ da sequência codificadora de AH-FAP com a exonuclease ΠΙ durante diversos intervalos de tempo e ligando depois a sequência codificadora encurtada ao ADN plasmídico codificador dos codões de paragem na totalidade dos três blocos de leitura Houve 10 arquétipos por supressão diferentes que foram caracterizados por análise da sequência do ADN, pela expressão proteínica e pela actividade da AH-FAP. A remoção de 21 a 30 aminoácidos do terminal C reduziu imenso a actividade catalítica e a remoção de 52 resíduos destruiu completamente a actividade. Ver a figura 3.

Foram produzidas supressões idênticas na extremidade do terminal amino da AH-FAP. Efectuou-se a preparação de fusões de AH-FAP com tiorredoxina de E. coli no terminal N para facilitar uma expressão consistente de nível elevado de actividade de AH-FAP [LaVallie et ai, Bio/technology, 77: 187-193 (1993)]. A remoção de 19 aminoácidos a partir do terminal N transformado naturalmente (He42) destruiu completamente a actividade enzimática na proteína de fusão. Ver a figura 3.

Exemplo 11

Pela metodologia de hibridação com formações (manchas) à Northern efectuou-se uma análise preliminar de padrões de expressão do ARNm da AH-FAP do plasma humano em tecidos humanos.

Preparou-se o ARN a partir de tecidos humanos retirados do córtex cerebral, coração, rim, placenta, timo e amígdalas, utilizando para tal ‘RNA STat 60’ (Tel-Test “B”, Friendswod, TX). Além disso, preparou-se ARN a partir de uma linhagem celular humana de tipo precursor hematopoiético, designada por THP-1 (ATCC TIB 202), que foi induzida a diferenciar-se num fenótipo de tipo macrófago, utilizando o éster de foibol, minstil-acetato de forbol (PMA). Utilizou-se ARN tecidual e ARN preparado a partir da linhagem celular THP-1 premielocítica para ensaios electroforéticos realizados antes e realizados também 1 a 3 dias depois da indução, tendo a electroforese sido realizada através de formaldeído em gelose a 1,2%, com transferência subsequente para uma membrana de nitrocelulose. O clone sAH 406-3 de ADNc de AH-FAP do plasma humano, de comprimento completo, foi marcado por estimulação aleatória e foi hibridado com a membrana em condições idênticas às descritas no exemplo 3 a propósito da pesquisa do banco de ADNc. Os resultado iniciais indicam que a sonda de AH-FAP hibridou com uma banda de 1,8 kb no ARN do timo, das amígdalas e em menor intensidade da placenta.

Examinou-se também a expressão do ARN de AH-FAP em monócitos isolados a partir de sangue humano, durante a sua diferenciação espontânea em macrófagos em cultura. Detectou-se muito pouco ou mesmo nenhum ARN nos monócitos recentes, mas a expressão foi induzida e mantida durante a diferenciação em macrófagos. Houve uma acumulação concomitante da actividade de AH-FAP no meio de cultura das células em diferenciação. A expressão do transcrito de AH-FAP do plasma humano também foi observada no ARN das células THP-1 no Γ dia mas não ao 3o dia a seguir à indução. As células THP-1 não exprimiram o ARNm para a AH-FAP no estado basal.

Exemplo 12

Examinou-se por hibridação in sita a expressão da AH-FAP em tecidos de seres humanos e de murganhos.

Os tecidos humanos foram obtidos nas instituições ‘National Disease Research Interchange’ e ‘Cooperative Human Tissue NetWork’. Recolheu-se tecido cerebral e medula espinal de murganhos normais e recolheu-se também as medulas espinais de murganhos em fase 3 de EAE, a partir de murganhos da estirpe S/JLJ. Os embriões dos murganhos normais da estirpe S/JLJ foram obtidos entre o 1 Io e 18° dias após a fertilização.

As secções de tecidos foram colocadas em criomoldes de modelo ‘Tissue Tek Π’ (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL), com uma pequena quantidade de composto OCT (Miles Inc., Elkhart, IN). Essas secções foram centradas nos criomoldes e estes foram preenchidos com o composto OCT, tendo depois os criomoldes sido colocados num recipiente com 2-metil--butano [C2H5CH(CH3)2, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI] e tendo então esse recipiente sido colocado em azoto líquido. Depois de o tecido e o composto OCT terem sido colocados no criomolde, foram congelados e os blocos foram guardados a -80°C até ao momento de preparação das secções. Os blocos de tecido foram seccionados em secções com uma espessura de 6 μιη e foram colados a lamelas recobertas com ‘Vectabond’ (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), tendo estas sido guardadas a -70°C e colocadas depois a 50°C durante cerca de 5 minutos para serem aquecidas para se lhes remover a condensação, e depois foram então fixadas em paraformaldeído a 4% durante 20 minutos a 4°C, desidratadas (etanol a 70%, a 95% e a 100%) durante 1 minuto a 4°C para cada qualidade de etanol e a seguir deixou-se que secassem ao ar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Efectuou-se a desnaturação das secções durante 2 minutos a 70°C em formamida a 70%/SSC 2x, enxaguou-se duas vezes em SSC 2x, desidratou-se e depois secou-se ao ar durante 30 minutos. Os tecidos foram hibridados in situ com ARNm de cadeia simples marcado radioactivamente, gerado a partir de ADN proveniente do fragmento interno de 1 kb do gene de AH-FAP obtido com HindUI (nucleótidos 308 a 1323 da SEQID NO:7) por incorporação de 35S-UTP (Amersham) na transcrição do ARN in vitro. Foram utilizadas sondas com comprimentos variáveis a partir de 250-500 pb. Efectuou-se a hibridação de um dia para o outro (12-16 horas) a 50°C; ao tampão de hibridação juntou-se as ribossondas marcadas com 35S (6 x IO5 cpm/secção), ARNt (0,5 pg/secção) e água tratada com pirocarbonato de dietilo (pede) para se conseguir uma concentração final de formamida a 50%, NaCl 0,3 M, Tris 20 mM a pH 7,5, sulfato de dextrano a 10%, solução de Denhardt lx, ditiotreitol 100 mM (DTT) e EDTA 5 mM. Após a hibridação efectuou-se a lavagem das secções durante 1 hora à temperatura ambiente em SSC 4x/DTT 10 mM e depois durante 40 minutos a 60°C em formamida a ÓOWSSC lx/DTT 10 mM, durante 30 minutos à temperatura ambiente em SSC 2x e durante 30 minutos à temperatura ambiente em SSC 0,lx. As secções foram desidratadas, secas ao ar durante 2 horas, recobertas com emulsão fotográfica NTB2 da ‘Kodak’, secas ao ar durante 2 horas, reveladas (após armazenagem a 4°C em obscuridade absoluta) e contrastadas com hematoxilina/eosina. A. Cérebro

Cerebelo. Tanto no cérebro dos murganhos como no cérebro de seres humanos foi observado um sinal forte na camada de células de Purkinje do cerebelo e bem assim nos corpos celulares neuronais individuais no núcleo dentado (um dos quatro núcleos profundos do cerebelo). Além disso, foi observado um sinal nas células individuais nas camadas granulares e moleculares da matéria cinzenta.

Hipocampo. Na secção de hipocampo de seres humanos as células individuais por toda a secção, que pareciam ser corpos celulares neuronais, revelaram um sinal forte.

Tronco cerebral. Tanto nas secções de tronco cerebral de seres humanos como nas de murganhos foi observado um sinal forte nas células individuais na matéria cinzenta. Córtex. Nas secções de córtices humanos obtidas a partir de córtices cerebrais, occipitais e temporais e nas secções de cérebro inteiro de murganho, as células individuais por todo o córtice revelaram um sinal forte. Parece não haver diferenciação no padrão de expressão nas diferentes camadas do córtice. Estes resultados de hibridação in situ são diferentes dos resultados obtidos com o córtex cerebral pela metodologia da hibridação à Northern. A diferença resulta provavelmente da maior sensibilidade da hibridação in situ, comparativamente com a da hibridação à Northern.

Pituitária. Foi observado um sinal algo fraco nas células individuais disseminadas no pars distalis da secção de tecido humano. B. Cólon humano

Os cólons, tanto normais como os que têm doença de Crohn, apresentam um sinal nas agregações linfáticas existentes na mucosa das secções, sendo o nível do sinal ligeiramente mais elevado na secção do paciente com doença de Crohn. O cólon com doença de Crohn também tinha um sinal forte na lamina própria. De igual modo, foi observado um nível elevado de sinal mifrta secção de apêndice doente, ao passo que o apêndice normal manifestou um sinal menor, mas mesmo assim detectável. As secções do paciente com colite ulcerativa não manifestaram nenhum sinal evidente, nem nas agregações linfáticas nem na lamina própria. C. Amígdalas e timo de seres humanos

Foi observado um sinal forte em grupos dispersos de células individuais no interior dos centros germinais das amígdalas e no interior do timo. D. Nodo linfático humano

Foi observado um sinal forte na secção de nodo linfático obtida a partir de um dador normal, tendo sido observado um sinal algo fraco nos nódulos linfáticos da secção obtida a partir de um dador com choque séptico. E. Intestino delgado humano

Em intestinos delgados, tanto normais como com a doença de Crohn, foram observados sinais fracos nos esparadrapos de Peyer e lamina própria nas secções, sendo o sinal do tecido patológico ligeiramente mais elevado. F. Baco e pulmão humanos Não foi observado nenhum sinal nos tecidos do baço (secções de baço normal e secções de abcessos esplénicos) nem nos tecidos pulmonares (secções de pulmão normal e de pulmão com enfisema). G. Medula espinal do murganho

Nas medulas espinais, quer normais quer de fase 3 de EAE foi observado um sinal forte na matéria cinzenta das medulas espinais, sendo a expressão ligeiramente superior na medula espinal de fase 3 de EAE. Na medula espinal de fase 3 de EAE as células da matéria branca e 7Η dos canhões perivasculares, provavelmente macrófagos e/ou outros leucócitos infiltrantes, revelaram um sinal que não existia na medula espinal normal. H. Embriões de murganho

Ao 11° dia, o sinal do embrião era evidente no sistema nervoso central no quarto ventrículo, tendo permanecido constante durante o período de desenvolvimento do embrião em cerebelo e tronco cerebral. Há medida que os embriões se foram desenvolvendo, o sinal tomou-se evidente no sistema nervoso central na medula espinal (12° dia), no córtex primário e no gânglio de Gasseri (14° dia) e na hipófise (16° dia). O sinal foi observado no sistema nervoso periférico (a começar ao 14° ou ao 15° dias), nos nervos que saem da medula espinal, e ao 17° dia surgiu um sinal forte em tomo dos bigodes do embrião. Também foi observada a expressão no fígado e nos pulmões ao 14° dia, no intestino (a começar ao 15° dia) e na parte posterior da boca/garganta (a começar ao 16° dia). Ao 18° dia o padrão de expressão tinha-se diferenciado em sinal no córtex, parte posterior do cérebro (cerebelo e tronco cerebral), nervos que saem da região lombar da medula espinal, na arte posterior da boca/garganta, no fígado, no rim e um possível sinal fraco no pulmão e no intestino. I. Resumo A expressão do ARNm da AH-FAP nas amígdalas, no timo, nos nodos linfáticos, nas placas de Peyer, no apêndice e nos agregados linfáticos do cólon é consistente com as conclusões de que a fonte provável de AH-FAP predominante in vivo são os macrófagos, uma vez que estes tecidos são todos povoados por macrófagos de tecidos que fímcionam como células fagocíticas e de elaboração de antigénios. A expressão de AH-FAP em tecidos inflamados é presumivelmente consistente com a hipótese de que uma das funções dos macrófagos derivados de monócitos é a de resolverem a Z&f inflamação. Antevê-se que a AH-FAP possa inactivar o FAP e os fosfolípidos pró-inflamatórios, diminuindo assim endogenamente a cascata inflamatória de fenómenos iniciados por esses mediadores. O FAP foi já detectado em tecido cerebral intacto e é segregado pelas células dos grânulos cerebelares do rato, criadas em cultura. Experiências efectuadas in vitro e in vivo vieram demonstrar que o FAP se liga a um receptor específico em tecidos neurais e que induz alterações funcionais e fenotípicas, tais como a mobilização do cálcio, o aumento exógeno dos genes activadores da transcrição e a diferenciação da linhagem celular dos percursores neurais, designada por PC 12. Estas observações sugeriram a existência de uma função fisiológica do FAP no cérebro e consistentemente com isto foram realizadas experiências recentes com culturas de secções de tecidos do hipocampo e com antagonistas e análogos do FAP que sugeriram que o FAP estava implicado, enquanto mensageiro retrógrado importante, na potenciação do hipocampo a longo prazo. Por tal motivo, para além do seu efeito patológico na inflamação, presume-se que o FAP participe em processos de rotina de emissão de sinais neuronais. A expressão da AH-FAP no cérebro pode servir para regular a duração e a amplitude da emissão de sinais mediados pelo FAP.

Exemplo 13

Foram gerados anticorpos monoclonais, específicos para a AH-FAP recombinante do plasma humano, utilizando como imunogénio a AH-FAP produzida por E. coli.

Injectou-se o murganho n° 1342 no dia 0, ao 19° dia e ao 40° dia, com AH-FAP recombinante. Para o estímulo de reforço da pré-fusão, injectou-se o murganho com o imunogénio em STP (em inglês PBS), decorridos mais 4 dias sacrificou-se o murganho e removeu-se-lhe o baço de forma estéril e colocou-se em 10 mL de meio RPMI 1640 isento de soro. Formou-se uma suspensão de células de um só tipo, esmagando o baço entre as extremidades congeladas de duas lamelas de vidro para microscópio submersas em meio RPMI 1640 isento de soro e enriquecido com L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, penicilina à razão de 100 unidades/ /mL e estreptomicina à razão de 100 pg/mL (RPMI) (Gibco, Canadá). Filtrou-se a suspensão celular através de um filtro de células de modelo ‘Nitex’ estéril de malha 70 (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) e efectuou-se a lavagem duas vezes por centrifugação a 200 x g durante 5 minutos, colocando a massa obtida novamente em suspensão em 20 mL de meio RPMI isento de soro. Preparou-se, de forma idêntica, os timócitos retirados de 3 murganhos genuínos da estirpe Balb/c. As células do mieloma NS-1, mantidas em fase logarítmica em meio RPMI com 11% de soro fetal de bovino (SFB) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) durante 3 dias antes da fusão, foram centrifiigadas a 200 x g durante 5 minutos e a massa obtida foi lavada duas vezes, conforme descrito no parágrafo anterior.

Combinou-se 1 x 108 esplenócitos com 2,0 x 107 células de NS-1, centrifugou-se e aspirou-se o sobrenadante. Efectuou-se a remoção da massa celular batendo suavemente com o tubo e acrescentou-se 1 mL de PEG 1500 a 37°C (50% em Hepes 75 mM a pH 8,0) (Boehringer Mannheim) com agitação durante 1 minuto, seguindo-se a adição de 7 mL de meio RPMI isento de soro ao longo de 7 minutos. Acrescentou-se mais 8 mL de meio RPMI e efectuou-se a centrifugação das células a 200 x g durante 10 minutos. Depois de se ter deitado fora o sobrenadante, com a massas obtida preparou-se nova suspensão em 200 mL de meio RPMI que continha 15% de SFB, hipoxantina sódica 100 μΜ, aminopterina 0,4 μΜ, timidina 16 μΜ (HAT) (Gibco), IL-6 à razão de 25 unidades/mL (Boehringer Mannheim) e 1,5 x 106 timócitos/ /mL e fez-se a sua aplicação em 10 placas de cultura de tecidos de 96 cavidades de fundo plano, de tipo Corning (Corning, Corning New York).

Aos 2o, 4o e 6o dias após a fusão efectuou-se a remoção de 100 pL de meio para fora das cavidades das placas de fusão e substituiu-se por meio recente. Ao 8o dia efectuou-se uma pesquisa da fusão pelo protocolo de EISLE (em inglês ELISA) para se pesquisar a presença de IgG de murganho que se liga à AH-FAP recombinante. Revestiu-se 4 placas de tipo ‘Immulon’ (Dynatech, Cambridge, MA) durante 2 horas a 37°C com AH-FAP recombinante à razão de 100 ng/cavidade, com a enzima diluída em Tris 25 mM a pH 7,5. Aspirou-se a solução de revestimento, acrescentou-se solução de bloqueio à razão de 200 pL/cavidade [gelatina da pele de peixe a 0,5% (Sigma) diluída em CMF-STP (em inglês CMF-PBS] e manteve-se a incubar durante 30 minutos a 37°C. Efectuou-se a lavagem das placas três vezes com STP contendo Tween 20 a 0,05% (STPT, em inglês PBST) e acrescentou-se 50 pL do sobrenadante da cultura. Após a incubação a 37°C durante 30 minutos e a seguir à lavagem conforme descrito antes, acrescentou-se 50 pL de anti-IgG(fc) de murganho conjugada na cabra com peroxidase de Armoracia rusticana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) com diluição a 1:3500 em STPT. Efectuou-se a incubação das placas conforme descrito antes, lavou-se quatro vezes com STPT e juntou-se 100 pL de substrato constituído por O-fenileno-diamina na concentração de 1 mg/mL (Sigma) e H2O a 30% na concentração de 0,1 pL/mL em citrato 100 mM a pH 4,5. Interrompeu-se a reacção de cor ao fim de 5 minutos com a adição de 50 }rL de H2SO4 a 15%. Efectuou-se a leitura do valor A490 num leitor de placas (Dynatech).

As cavidades de fusão escolhidas foram clonadas duas vezes por diluição em placas de 96 cavidades e fez-se uma avaliação visual do número de colónias/cavidade ao fim de 5 dias. Os hibridomas clonados foram 90D1E, 90E3A, 90G11D (ATCC HB 11724) e 90F2D (ATCCHB 11725). υ

Os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas foram isotipificados utilizando o sistema ‘Isostrip’ (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Os resultados comprovaram que os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas a partir da fusão 90 eram todos IgGi.

Exemplo 14

Foram realizados estudos experimentais para se avaliar os efeitos terapêuticos in vivo da AH-FAP recombinante da invenção sobre a inflamação aguda, utilizando um modelo de edema da pala do rato [Henriques et al, Br. J. Pharmacol., 106: 579-582 (1992)]. Os resultados destes estudos comprovaram que a AH-FAP bloqueia o edema induzido pelo FAP. Foram realizados estudos paralelos para se comparar a eficiência da AH-FAP com a de dois antagonistas de FAP comercialmente disponíveis.

A. Preparação de AH-FAP

Num microfluidificador efectuou-se a lise de E. coli transformada com o vector puc trp AH de expressão da AH-FAP, centrifugou-se os sólidos para os remover e com os sobre-nadantes das células carregou-se uma coluna de ‘S-Sepharose’ (Pharmacia). Lavou-se a coluna exaustivamente com solução tampão constituída por NaCl 50 mM, SCHAP 10 mM, MES 25 mM e EDTA 1 mM a pH 5,5. Efectuou-se a eluição da AH-FAP aumentando a concentração de NaCl na solução tampão até ao valor 1 M. Como passo de purificação complementar praticou-se uma cromatografia de afinidade, utilizando uma coluna de tipo ‘Blu Sepharose’ (Pharmacia). Antes de se carregar a preparação de AH-FAP na coluna de tipo ‘Blue Sepharose’, diluiu-se a amostra à razão de 1:2 para se reduzir a concentração de NaCl para 0,5 M e ajustou-se o valor do pH para 7,5. Depois de se ter lavado a coluna de tipo ‘Blue Sepharose’ exaustivamente com solução tampão constituída por NaCL 0,5 M, Tris 25 mM, SCHAP 10 mM e EDTA 1 mM a pH 7,5, efectuou-se a eluição da AH-FAP aumentando a concentração de NaCl até 3,0 M. A pureza da AH-FAP assim isolada era geralmente de 95%, conforme avaliado pelo protocolo de EGPA-DSS, com actividade no intervalo entre 5000 - 10 000 unidades/mL. Foram realizados outros ensaios de qualidade com cada preparação de AH-FAP, entre os quais se salienta a determinação dos níveis de endotoxina e a actividade de hemólise sobre eritrócitos de rato recentemente obtidos. Como meio de armazenagem da enzima e também como veículo para efeitos de administração utilizou-se uma solução tampão que continha Tris 25 mM, SCHAP 10 mM e NaCl 0,5 M a pH 7,5. As doses utilizadas nas experiências tiveram por base os ensaios sobre actividade enzimática realizados imediatamente antes das experiências. B. Indução de edema

Em todas as experiências foram utilizadas fêmeas de rato com idades entre 6 e 8 semanas, da estirpe Long Evans (CHarles River, Wilmington, MA), pesando entre 120 g e 200 g. Antes das manipulações experimentais os animais foram anestesiados com uma mistura de anestésicos ‘Ketaset’ (Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA), ‘Rompun’ (Miles, Shawnee Mission, KS) e ‘Ace Promazme’ (Aveco, Fort Dodge, IA) administrados por via subcutânea, com os valores aproximados respectivos de 2,5 mg para o ‘Ketaset’, 1,6 mg para o ‘Rompun’ e 0,2 mg para o ‘Ace Promazine’, por cada animal e por dose. O edema foi induzido na pata por administração quer de FAP quer de zimozano, conforme a seguir se descreve. O FAP (Sigma #P-1402) foi preparado de propósito para cada experiência a partir de uma solução de reserva 19,1 M guardada em clorofórmio/metanol (9:1) à temperatura de -20°C. Os volumes necessários foram submetidos a uma operação de secagem sob uma atmosfera de N2 e diluídos à razão de 1:1000 numa solução tampão que continha NaCl 150 mM, Tris 10 mM a ?S4 pH 7,5 e ASB a 0,25% e foram tratados com ultra-sons durante 5 minutos. Os animais receberam 50 pL de FAP (dose final de 0,96 nmol) por via subcutânea entre as almofadas das patas traseiras e a avaliação do edema foi feita decorrida 1 hora e novamente ao fim de 2 horas em algumas experiências. O zimozano A (Sigma #A-8800) foi preparado de propósito para cada experiência, sob a forma de uma suspensão em STP na concentração de 10 mg/mL. Os animais receberam 50 pL de zimozano (dose final de 500 pg) por via subcutânea entre as almofadas das patas traseiras e o edema foi avaliado ao fim de 2 horas.

Quantificou-se o edema medindo o volume da pala imediatamente antes da administração de FAP ou de zimozano no momento indicado após o estímulo com FAP ou com zimozano. Exprimiu-se o edema como sendo o aumento do volume da pata, em mL. Foram efectuadas medições de deslocamento do volume nos animais anestesiados utilizando um pletismómetro (UGO Basile, modelo #7150) que mede o volume de água deslocado na pata submersa. Para se garantir que a imersão da pata era comparável entre momentos consecutivos, efectuou-se a marcação das patas traseiras com tinta indelével no local onde a linha do pelo se junta ao calcanhar. Medições repetidas efectuadas com a mesma pata, utilizando esta técnica, permitiram garantir uma precisão a menos de 5%.

C. Vias e regimes de dosagem de administração da AH-FAP

Injectou-se AH-FAP localmente entre as almofadas das patas ou por via sistémica por injecção IV na veia caudal. No caso da administração local, os ratos receberam 100 pL de AH-FAP (4000-6000 U/mL) por via subcutânea entre as almofadas das patas direitas traseiras. As patas esquerdas foram utilizadas como contraprova, por administração de 100 pL de veículo (solução salina tamponada). No caso da administração sistémica de AH-FAP, os ratos receberam as unidades indicadas de AH-FAP em 300 pL de veículo administrado por via IV na veia caudal. Os animais de contraprova receberam o volume adequado de veículo por via IV na veia caudal.

D. Administração local de AH-FAP

Foram injectados ratos (N=4) com 100 pL de AH-FAP (4000-6000 U/mL) por via subcutânea entre as almofadas das patas direitas. As patas esquerdas foram injectadas com 100 pL de veículo (solução salina tamponada). Foram utilizados mais 4 ratos aos quais se injectou apenas veículo. Todos os ratos foram imediatamente estimulados com o FAP por injecção subcutânea nas patas e os volumes das patas foram avaliados 1 hora após o estímulo. A figura 4, em que o edema é expresso como o aumento médio do volume das patas (mL) ± D.P. para cada grupo de tratamento, ilustra que o edema das patas induzido pelo FAP é bloqueado pela administração local de AH-FAP. O grupo que recebeu tratamento local com AH-FAP, antes do estímulo com FAP, revelou uma inflamação reduzida, comparativamente com o grupo de contraprova injectado. Foi observado um aumento do volume das patas igual a 0,08 mL ± 0,08 (D.P.) no grupo tratado com AH-FAP, comparativamente com o valor de 0,63 mL ± 0,14 (D.P.) observado nos animais de contraprova tratados só com veículo. O aumento do volume das patas foi um resultado directo da injecção de FAP, uma vez que os animais injectados nas patas apenas com o veículo não manifestaram nenhum aumento do volume das patas.

E. Administração intravenosa de AH-FAP

Efectuou-se o tratamento prévio de ratos (N=4 por grupo) por via IV quer com AH-FAP (2000 unidades em 300 pL de veículo) quer apenas com veículo, 15 minutos antes do estímulo com FAP. Avaliou-se o edema decorridas 1 e 2 horas após o estímulo com FAP. A figura 5, em que o edema é expresso pelo aumento médio em volume (mL) ± D.P. para cada grupo de 7i4 tratamento, ilustra que a administração de AH-FAP por via IV bloqueou o edema das patas induzido pelo FAP, decorridas 1 e 2 horas após o estímulo. O grupo que recebeu 2000 unidades de AH-FAP por via IV revelou uma redução da inflamação no período de 2 horas decorrido. O aumento médio do volume no grupo tratado com AH-FAP ao fim de 2 horas foi de 0,10 mL ± 0,8 (D.P.), comparativamente com o valor de 0,56 mL ± 0,11 mL para os animais de contraprova tratados apenas com veículo. F. Comparação da proteccão conferida pela AH-FAP no edema induzido pelo FAP ou pelo zimozano

Efectuou-se o tratamento prévio de ratos (Nf4 por grupo) por via IV quer com AH-FAP (2000 unidades em 300 pL de veículo) quer apenas com veículo. Decorridos 15 minutos após o tratamento, os grupos receberam quer FAP quer zimozano A e avaliou-se o volume das patas respectivamente ao fim de 1 e 2 horas. Conforme se observa na figura 6, em que o edema é expresso pelo aumento médio do volume (mL) ± D.P. para cada grupo de tratamento, a administração sistémica de AH-FAP (2000 U) foi eficaz ao reduzir o edema das patas induzido pelo FAP, mas foi incapaz de bloquear o edema induzido pelo zimozano. Foi observado um aumento médio do volume igual a 0,08 ± 0,02 no grupo tratado com FAP, comparativamente com o valor de 0,49 mL ± 0,03 observado no grupo de contraprova.

G. Titulação da dose eficaz de protecção com AH-FAP

Em duas experiências independentes, os grupos de ratos (N = 3 ou 4 por grupo) foram previamente tratados por via IV quer com diluições sequenciais de AH-FAP quer utilizando veículo nos animais de contraprova num volume de 300 pL, 15 minutos antes do estímulo com o FAP. As duas patas foram estimuladas com o FAP (conforme descrito antes) e fez-se a avaliação do edema decorrida 1 hora. A figura 7, em que o edema é expresso pelo aumento médio do volume (mL) ± D.P. para cada grupo de tratamento, ilustra o aumento de protecção contra o edema induzido pelo FAP nos ratos injectados com doses crescentes de AH-FAP. Nas experiências comprovou-se que o valor DI50 da AH-FAP administrada por via IV estava compreendido entre 40 e 80 U por rato. H. Eficácia in vivo da AH-FAP em firncão do tempo após a administração

Em duas experiências independentes efectuou-se o tratamento prévio de grupos de ratos (N = 3 ou 4 por grupo) por via IV quer com AH-FAP (2000 U em 300 jjL de veículo) quer apenas com veículo. Após a administração os grupos receberam FAP em momentos compreendidos entre 15 minutos e 47 horas após a administração de AH-FAP. Avaliou-se então o edema decorrida 1 hora após o estímulo com o FAP. Conforme se observa na figura 8, em que o edema é expresso pelo aumento médio em volume (mL) ± D.P. para cada grupo de tratamento, a administração de 2000 U de AH-FAP protege os ratos contra o edema induzido pelo FAP, pelo menos durante 24 horas.

I. Farmacocinética da AH-FAP

Foram utilizados quatro ratos que receberam 2000 unidades de AH-FAP por injecção IV num volume de 300 μι. Efectuou-se a colheita de plasma em diversos momentos e guardou-se à temperatura de 4°C e determinou-se as concentrações de AH-FAP no plasma recorrendo a um protocolo de EISLE, utilizando um ensaio duplo de captura de AcM (em inglês mAb). Dito de forma abreviada, diluiu-se o anticorpo monoclonal 90G11D (exemplo 13) em tampão carbonato 50 mM a pH 9,6 à razão de 100 ng/mL e imobilizou-se em quatro placas de ‘Immunolon’ pelo protocolo de EISLE, de um dia para o outro a 4°C. Após uma lavagem exaustiva com STP contendo 0,05% de Tween 20, as placas foram bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente com gelatina de pele de peixe a 0,5% (Sigma) diluída em STP. Acrescentou-se em duplicado amostras de soro diluídas em STP com SCHAP 15 mM à placa lavada pelo protocolo de EISLE e efectuou-se a incubação durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a lavagem acrescentou-se às cavidades um conjugado biotinado de anticorpo monoclonal 90F2D (exemplo 13), segundo uma concentração de 5 pg/mL, diluído em STP, e manteve-se a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. A seguir à lavagem acrescentou-se às cavidades 50 pL de uma diluição a 1:1000 de ‘ExtraAvidin’ (Sigma) e manteve-se a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois da lavagem, as cavidades foram reveladas utilizando como substrato OPD e efectuou-se a sua quantificação. Calculou-se então a actividade enzimática a partir de uma curva padrão. A figura 9, em que os pontos correspondentes aos dados obtidos representam valores médios ± D.P., demonstra que ao fim de 1 hora os níveis de enzima no plasma estavam próximos da concentração prevista com base num volume de 5-6 mL de plasma para os ratos de 180-200 g; média = 374 U/mL ± 58,2. Para além do período de 1 hora, os níveis no plasma diminuíram linearmente, chegando a uma concentração média no plasma igual a 19,3 U/mL ± 3,4 ao fim de 24 horas, o que é ainda um valor consideravelmente mais elevado do que os níveis de AH-FAP endógena no rato, para os quais se havia comprovado serem aproximadamente iguais a 4 U/mL por meio de ensaios enzimáticos.

J. Eficácia da AH-FAP comparativamente com antagonistas de FAP

Efectuou-se o tratamento prévio de grupos de ratos (N=4 por grupo) com um de três anti-inflamatóríos potenciais: o antagonista de FAP conhecido por CV3988 (Biomol #L-103) administrado por via IP (2 mg em 200 pL de EtOH), o antagonista de FAP conhecido por

Alprazolam (Sigma #A-8800) administrado por via IP (2 mg em 200 jiL de EtOH) ou AH-FAP (2000 U) administrada por via IV. Os ratos de contraprova foram injectados por via IV com um volume de 300 pL de veículo. Os antagonistas de FAP foram administrados por via BP, uma vez que são solubilizados em etanol. Os ratos injectados quer com CV3988 quer com Alprazolam foram estimulados com o FAP decorridos 30 minutos após a administração do antagonista de FAP para permitir que o antagonista de FAP entrasse na circulação, ao passo que os ratos tratados com a AH-FAP e os ratos tratados com o veículo foram estimulados 15 minutos após a administração da enzima. Os ratos injectados com AH-FAP manifestaram uma redução do edema induzido pelo FAP superior à conferida pelos antagonistas de FAP consagrados, o CV3988 e o Alprazolam. Ver a figura 10 em que o edema é expresso pelo aumento médio de volume (mL) ± D.P. para cada grupo de tratamento.

Dito de forma abreviada, a AH-FAP é eficaz para bloquear o edema induzido pelo FAP in vivo. A administração da AH-FAP pode ser local ou sistémica por injecção IV. Em estudos de doseamento, concluiu-se que as injecções por via IV, no domínio compreendido entre 160-2000 U/rato, reduziram extraordinariamente a inflamação induzida pelo FAP, concluindo-se que o valor de doseamento DI50 está compreendido no intervalo entre 40-80 U/rato. Cálculos efectuados com base no volume do plasma, para ratos de 180-200 g, permitem antever que uma concentração no plasma no intervalo entre 25-40 U/mL deve bloquear 0 edema induzido pelo FAP. Estes resultados previsionais são fundamentados por estudos farmacocinéticos preliminares. Concluiu-se que uma dose de 2000 unidades de AH-FAP era eficaz para bloquear o edema induzido pelo FAP, pelo menos durante 24 horas. Ao fim de 24 horas a seguir à administração da AH-FAP, concluiu-se que as concentrações da enzima no plasma eram aproximadamente iguais a 25 U/mL. Concluiu-se que a AH-FAP bloqueia o edema induzido pelo FAP mais eficientemente do que os dois antagonistas de FAP conhecidos que foram testados.

No seu conjunto estes resultados demonstram que a AH-FAP bloqueia eficientemente a inflamação induzida pelo FAP e que pode ter valor terapêutico em doenças em que o FAP seja o mediador principal.

Exemplo 15 A AH-FAP recombinante da invenção foi testada num segundo modelo in vivo, a pleurisia induzida pelo FAP. Demonstrou-se previamente que o FAP induz derramamentos vasculares quando introduzido no espaço pleural [Henriques et ai, supra\. Foram utilizadas fêmeas de ratos (Charles River, 180-200 g) cujas veias caudais foram injectadas com 200 jíL de corante azul de Evans a 1% diluído para 0,9% com 300 μι de AH-FAP recombinante (1500 pmol/mL/hora, preparado conforme descrito no exemplo 14) ou com um volume equivalente de solução tampão de contraprova. Decorridos 15 minutos, os ratos receberam uma injecção de 100 pL de FAP (2,0 nmol) no espaço pleural. Decorrida 1 hora após o estimulo com FAP, os ratos foram sacrificados e recolheu-se o fluído pleural enxaguando a cavidade com 3 mL de soluto salino heparinizado e tamponado com fosfato. Determinou-se o grau de derramamento vascular pela quantidade de corante azul de Evans no espaço pleural que foi quantificado pela absorvência a 620 nm. Concluiu-se que os ratos previamente tratados com a AH-FAP tinham derramamentos vasculares muito menores do que os animais de contraprova (representando mais de 80% de redução na inflamação).

Os resultados anteriores servem para fundamentar o tratamento de pacientes que padeçam de pleurisia, utilizando para tal a enzima AH-FAP recombinante da invenção.

Exemplo 16

Testou-se também a eficácia da enzima AH-FAP recombinante da invenção num modelo de mobilização de eosinófilos induzidos por antigénios. A acumulação de eosinófilos nas vias aéreas é uma particularidade característica da fase derradeira de respostas imunitárias que ocorrem nos casos de asma, rinite e eczema. Foram sensibilizados murganhos da estirpe Balb/c (Charles River) por meio de duas injecções intraperitoneais constituídas por 1 pg de ovalbumina (OVA) em 4 mg de hidróxido de alumínio (‘Imject alum\ Pierce Laboratories, Rockford, IL), administradas com um intervalo de 2 semanas. Decorridos 14 dias após a segunda imunização, os murganhos sensibilizados foram estimulados quer com OVA sob a forma de aerossol quer com soluto salino como contraprova.

Antes do estímulo, os murganhos foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos, com quatro murganhos/grupo. Os murganhos dos grupos 1 e 3 foram previamente tratados com 140 pL de solução tampão de contraprova constituída por Tris 25 mM, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM e ‘Tween 80’ a 0,1%, administrada por injecção intravenosa. Os murganhos dos grupos 2 e 4 foram previamente tratados com 750 unidades de AH-FAP (activiadde igual a 5500 unidades/mL, administrada em 140 pL de tampão de AH-FAP). Decorridos 30 minutos após a administração de AH-FAP ou de tampão, os murganhos dos grupos 1 e 2 foram expostos ao STP sob a forma de aerossol, conforme adiante se descreve, ao passo que os murganhos dos grupos 3 e 4 foram expostos à OVA sob a forma de aerossol. Decorridas mais 24 horas, os murganhos foram tratados uma segunda vez quer com 140 pL de tampão (grupos 1 e 3) quer com 700 unidades de AH-FAP em 140 pL de tampão (grupos 2 e 4), com administração por injecção intravenosa. A infiltração dos eosinófilos da traqueia foi induzida nos murganhos sensibilizados expondo os animais à OVA sob a forma de aerossol. Os murganhos sensibilizados foram 7ϋ colocados em tubos cónicos de centrifugação de 50 mL (Corning) e foram obrigados a respirar a OVA sob a foram de aerossol (50 mg/mL) dissolvida em soluto salino a 0,9% durante 20 minutos, utilizando um nebulizador (modelo 646, DeVilbiss Corp., Somerset, PA). Os murganhos de contraprova foram tratados de forma idêntica, com a excepção de se ter utilizado soluto salino a 0,9% no nebulizador. Decorridas 48 horas após a exposição à OVA ou ao soluto salino, qualquer deles sob a forma de aerossol, os murganhos foram sacrificados e as suas traqueias excisadas. As traqueias de cada grupo foram mergulhadas em OCT e guardadas a -70°C, até serem cortadas secções.

Para se avaliar a infiltração dos eosinófílos da traqueia, foram preparadas secções de tecidos dos quatro grupos de murganhos que foram contrastadas quer com solução de Luna e solução de hematoxilina-eosina quer com peroxidase. Para cada grupo de murganhos foram cortadas 12 secções com a espessura de 6 pm e foram numeradas correspondentemente. As secções com os números ímpares foram contrastadas com corante de Luna, conforme a seguir se indica. As secções foram fixadas em formal-álcool durante 5 minutos à temperatura ambiente, foram enxaguadas com três mudanças de água potável durante 2 minutos à temperatura ambiente e depois foram enxaguadas com duas mudas de dH20 durante 1 minuto à temperatura ambiente. As secções de tecidos foram contrastadas com corante de Luna durante 5 minutos à temperatura ambiente (o corante de Luna é constituído por 90 mL de hematoxilina de ferro de Weigert e 10 mL de ‘Biebrich Scarlet’ a 1%). As lamelas contrastadas foram mergulhadas seis vezes em solução alcoólica acídica a 1%, enxaguadas com água potável durante 1 minuto à temperatura ambiente, mergulhadas em solução de carbonato de lítio a 05,% cinco vezes e enxaguadas com água potável corrente durante 2 minutos à temperatura ambiente. As lamelas foram desidratadas por tratamento com etanol a 70%-95%-100% durante 1 minuto para cada

caso, à temperatura ambiente, e depois foram limpas com duas mudas de xileno durante 1 minuto à temperatura ambiente e montadas em ‘Cytoseal 60’.

No caso do contraste com peroxidase, as secções com os números pares foram fixadas em acetona a 4°C durante 10 minutos e a seguir ficaram a secar ao ar. Acrescentou-se 200 pL de solução de DAB a cada secção e deixou-se em repouso durante 5 minutos à temperatura ambiente. As lamelas foram enxaguadas com água potável durante 5 minutos à temperatura ambiente e aplicou-se a cada secção 2 gotas de ácido ósmico a 1% durante 3-5 segundos. As lamelas foram enxaguadas com água potável durante 5 minutos à temperatura ambiente e foram contrastadas com hematoxilina de Mayers a 25°C, que era a temperatura ambiente. As lamelas foram depois enxaguadas com água potável corrente durante 5 minutos e foram desidratadas por tratamento com etanol a 70%-95%-100%, durante 1 minuto em cada caso, à temperatura ambiente. Efectuou-se a limpeza das lamelas com duas mudas de xileno durante 1 minuto, cada uma à temperatura ambiente, e foram montadas em ‘Cytoseal 60’.

Avaliou-se o número de eosinófilos no tecido submucosal da traqueia. Concluiu-se que as traqueias dos murganhos dos grupos 1 e 2 tinham muito poucos eosinófilos dispersos pelo tecido submucosal. Conforme previsto, as traqueias dos murganhos do grupo 3, que haviam sido previamente tratados com tampão e expostos à OVA nebulizada, tinham números elevados de eosinófilos em todo o tecido submucosal. Pelo contrário, as traqueias dos murganhos do grupo 4, que haviam sido previamente tratados com a AH-FAP e expostos à OVA nebulizada, tinham muito poucos eosinófilos no tecido submucosal, comparativamente com os valores observados nos dois grupos de contraprova, os grupos 1 e 2.

Assim sendo, é indicado o tratamento terapêutico, com a AH-FAP, de pacientes que manifestem uma resposta imunitária de fase derradeira envolvendo a acumulação de eosinófilos nas vias aéreas, tal como sucede nos casos de asma, rinite e eczema.

Exemplo 17

Quase 4% da população japonesa possui níveis exíguos ou indetectáveis de actividade de AH-FAP nos seus plasmas. Esta deficiência está correlacionada com os graves sintomas respiratórios das crianças asmáticas [Miwa et al., J. CLirt. Invest., 82: 1983-1991 (1988)] que se presume tenham herdado a deficiência de uma forma recessiva autossómica.

Para se determinar se a deficiência provém de uma enzima inactiva, mas presente, ou da incapacidade para sintetizar a AH-FAP, testou-se o plasma de diversos pacientes com uma actividade de AH-FAP deficiente, quer para se pesquisar a actividade de AH-FAP (pelo método descrito no exemplo 10 para os transfectantes) quer para se pesquisar a presença de AH-FAP, utilizando os anticorpos monoclonais 90G11D e 90F2D (exemplo 13) num protocolo de EISLE em sanduíche, conforme a seguir se descreve. Foram utilizadas 4 placas de fundo plano ‘hnmulon’ (Dynatech, Chantilly, VA) que foram recobertas com o anticorpo monoclonal 90G11D à razão de 100 nG/cavidade, tendo sido guardadas de um dia para o outro. As placas foram bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente com gelatina de pele de peixe a 0,5% (Sigma) diluída em CMF-STP e depois foram lavadas três vezes. O plasma dos pacientes foi diluído em STP contendo SCHAP 15 mM e foi acrescentado a cada cavidade das placas (50 pL/cavidade). As placas ficaram a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente e foram lavadas 4 vezes. Acrescentou-se a cada cavidade 50 |jL de anticorpo monoclonal 90F2D na concentração de 5 μ§/ηιΕ, o qual havia sido biotinilado por métodos convencionais e diluído em STPT e depois as placas ficaram a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente e a seguir foram lavadas três vezes. A seguir acrescentou-se a cada cavidade 50 pJL de ‘ExtraAvidra’ (Sigma) diluída a 1:1000 em CMF-STPT, tendo então as placas ficado a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente antes da revelação.

Observou-se a existência de uma correlação directa entre a actividade de AH-FAP e os níveis enzimáticos. Uma ausência de actividade no soro de um paciente reflectiu-se pela ausência de enzima detectável. De modo semelhante, as amostras de plasma com metade da actividade normal continham metade dos níveis normais de AH-FAP. Estas observações permitiram concluir que a deficiência de actividade da AH-FAP era devida a uma incapacidade para a síntese da enzima ou era devida a uma enzima inactiva que os anticorpos monoclonais não reconheceram.

Foram realizadas outras experiências que revelaram que a deficiência era devida a uma lesão genética no gene da AH-FAP do plasma humano. Isolou-se ADN genómico de indivíduos deficientes em AH-FAP e utilizou-se como matriz para as reacções em cadeia com polimerase (RCP) em que foram utilizados iniciadores específicos do gene de AH-FAP. Cada um dos exões da sequência codificadora foi amplificado inicialmente e sequenciado, a partir de um indivíduo. Foi observada uma única alteração nucleotídica dentro do exão 9 (uma troca de T por G na posição 996 da SEQID NO:7). A alteração nucleotídica resulta de uma substituição de um aminoácido correspondente a uma troca de valina por fenilalanina na posição 279 da sequência da AH-FAP (V279F). O exão 9 foi amplificado a partir de ADN genómico proveniente de mais 11 indivíduos deficientes em AH-FAP, para os quais se descobriu que tinham a mesma mutação pontual.

Para se testar se esta mutação alterava a enzima, gerou-se um arquétipo de expressão de E. coli contendo a mutação, recorrendo a métodos semelhantes ao descrito no exemplo 10. Quando introduzido em E. coli, o arquétipo de expressão não gerou nenhuma actividade de AH-FAP, ao passo que o arquétipo de contraprova ao qual faltava a mutação foi totalmente activo. Esta substituição do aminoácido tem como resultado presumivelmente uma modificação 7Sé estrutural que determina a deficiência observada de actividade e a falta de imunorreactividade com os anticorpos de AH-FAP da invenção.

Os anticorpos específicos de AH-FAP da invenção podem pois ser utilizados em métodos de diagnóstico para a detecção de níveis anormais de AH-FAP no soro (os níveis normais são de cerca de 1 a 5 unidades/mL) e também podem ser utilizados para acompanhar a evolução do tratamento de estados patológicos com AH-FAP. Além disso, a identificação de uma lesão genética no gene da AH-FAP permite a pesquisa genética da deficiência de AH-FAP manifestada pelos pacientes japoneses. A mutação faz com que seja adquirido um local de endonucleases de restrição (Mae Π) e por tal motivo permite a aplicação do método simples de análise conhecido por Polimorfismo do Comprimento do Fragmento de Restrição (PCFR, em inglês RFLP) para permitir distinguir entre alelos activos e mutantes. Ver Lewin, págs. 136-141 em Genes V, Oxford University Press, Nova Iorque, Nova Iorque (1994).

Efectuou-se a pesquisa de ADN genómico proveniente de 12 pacientes deficientes em AH-FAP, fazendo digerir o ADN com MaelI, pelo método de transferência de Southern e por hibridação com uma sonda de exão 9 (nucleótidos 1-396 da SEQ Π) NO: 17). Concluiu-se que todos os pacientes tinham PCFR consistente com o alelo mutante.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em termos de casos específicos, faz-se observar que podem ocorrer aos especialistas na matéria diversas variações e modificações. Assim sendo, apenas devem ser consideradas as limitações exaradas nas reivindicações anexas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: ICOS Corporation (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Acetil-hidrolase do factor activador das plaquetas” (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 26 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Marshall, 0’Toole, Gertein, Murray & Borun (B) RUA: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) CIDADE: Chicago (D) ESTADO: Illinois (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 60606 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO. (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO. (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/133 803 (B) DATA DE DEPÓSITO: 6-OUT-1993

(viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Noland, Greta E. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 35 302 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: 32205 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (312) 474-6300 (B) TELEFAX: (312) 474-0448 (C) TELEX: 25-3658 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Phe lis Asp Leu GH Giu Giu Asi Phe Lis Ala Lai Vai Leu He Ala 15 10 15

Phe (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

De Gn Vai Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gli Gin Thr lis DePro 1 5 10 15 7% (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Met lis Pro Leu Vai Vai Phe Vai Leu GH Gli 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO. local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: grupo (13, 2, 27) (C) OUTRAS INFORMAÇÕES: /nota: “O nucleótido em cada uma destas posições é uma inosina”

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: ACATGAATTC GGNATCYTTG NGTYTGNCCR AA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO. 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases 32

(B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples

(D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: TATTTCTAGA AGTGTGGTGG AACTCGCTGG 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: CGATGAATTC AGCTTGCAGC AGCCATCAGT AC 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1520 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 162 .1484 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: GCTGGTCGGA GGCTCGCAGT GCTGTCGGCG AGAAGCAGTC GGGTTTGGAG CGCTTGGGTC 60 GCGTTGGTGC GCGGTGGAAC GCGCCCAGGG ACCCCAGITC CCGCGAGCAG CTCCGCGCCG 120 CGCCTGAGAG ACTAAGCTGA AACTGCTGCT CAGCTCCCAAG ATO GIG OCA COC 175 Met 1 Vai Pro Pro AAA TTC CAT GIG CTT TTC TOC crc TOC GGC TOC CIG GCT GIG GTT ΤΑΓ 221 Lis Leu His Vai Leu Phe Os Leu Cis Gli Cis Leu Ala Vai Vai Tir 5 10 15 20 cxr τη HAC TOG CAA TAC ATA AAT CCT GTT GGC CAT ATO AAA TCA TCA 269 Pro Phe Asp Tip Gin Tir De Asn Pro Vai Ala His Met Lis Ser Ser 25 30 35 GCA TOG GIC AAC AAA ATA CAA GTA CIG ATO GCT GCT GCA AGC TTT GGC 317 Ala Tip Vai Asn Lis De Gin Vai Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gfi 40 45 50 CAA ACT AAA ATO COC GGG GGA AAT GGG CCT ΤΑΓ TOC GTT GGT TCT ACA 365 Gin Thr Lis De Piro Aig Gli Asn Gli Pro Tir Ser Vai Gli Cis Thr 55 60 65 GAC ΤΓΑ ATO TTT GAT CAC ACT AAT AAG GGC AOC TTC TTC CGT TTA ΤΑΓ 413 Asp Leu Met Phe Asp His Thr Asn Lis Gli Thr Phe Leu Aig Leu Tir 70 75 80 ΤΑΓ OCA ICC CAA GAT ΑΑΓ GAT 00C CTT GAC AOC CTT TOG ATO OCA AAT 461 Tir Pro Ser Gin Asp Asn Asp Aig Leu Asp Thr Leu Tip De Pro Asn 85 90 95 100 AAA GAA ΤΑΓ TTT TOG GGT CTT AOC AAA TTT CIT GGA ACA CAC TOG CTT 509 Lis Ou Tir Phe Tip Qi Leu Ser Tis Phe Leu Gli Thr His Tip Leu 105 110 115 ATO QOC AAC ATT TTC AGG TTA CTO ITT GGT TOA ATO ACA ACT OCT GCA 557 Met α Asn De Leu Aig Leu Leu Phe Gli Ser Met Thr Thr Pro Ala 120 125 130 AAC TOG ΑΑΓ TOC GCT CIG AGG CCT GGT GAA AAA ΤΑΓ OCA CTT GTT GIT 605 Asn Trp Asn Ser Pro Leu Arg Pro Gli Ou Lis Tn- Pro Leu Vai Vai 135 140 145 Tir TCT CAT GGT crr GGG GCA TTC AGG ACA CTT ΤΑΓ TCT GCT ATT GGC 653 Phe Ser His Gfi Leu Gli Ala Phe Arg Thr Leu Tir Ser Ala De Gli 150 155 160 ATT GAC CIG GCA TCT CAT GGG TTT ATA GTT GCT GCT GTA GAA CAC AGA 701 De Asp Leu Ala Ser His Gli Phe De Vai Ala Ala Vai Ou His Aig 165 170 175 180 GAT AGA ΤΠΓ GCA TCT GCA ACT TAC ΤΑΓ TTC AAG GAC CAA TCT GCT GCA 749 Asp Aig Ser Ala Ser Ala Thr Tir Tir Phe Lis Asp Gin Ser Ala Ala 1S5 190 195

GAA ATA GGG GAC AAG TCT TOG crc TAC Ou De Gli Asp Lis Ser Tip Leu Tír 200 205 GAG GAG ACA CAT ATA CGA ΑΑΓ GAG CAG Qu Ou Thr His De Aig Asn Glu Gin 215 220 TCT TOC CAA GCT CIO AGT CIG ATT crr Cis Ser On Ala Leu Ser Leu Be Leu 230 235 GIG AAG ΑΑΓ GCA TTA GAT TTA AAG TTT Vai Lis Asn Ala Leu Asp Leu lis Phe 245 250 TCT ATT GAT AGG GAA AAA ATA GCA GTA Ser Se Asp Alg Ou Lis Be Ala Vai 256 GCA ACG GTT ATT CAG ACT CTT AGT GAA Ala Thr Vai Be Gin Thr Leu Ser Glu 280 285 ATT GOC CIG GAT GCA TOG AIG TTT OCA De Ala Leu Asp Ala Tip Met Phe Pro 295 300 AGA ΑΓΓ ocr CAG CCC CIC TTT TTT AIC Aig Be Pro Gin Pro Leu Phe Phe Be 310 315 ocr GCT ΑΑΓ AIC AEA AAA AIG AAA AAA Pro Ala Asn Be Be Lis Met Lis Lis 325 330 AGA AAG AIG ATT ACA AIC AGG GGT TCA Alg Lis Met Be Thr Be Alg Gli Ser 345 TIC ACT ΤΓΓ GCA ACT GGC AAA ATA ATT Phe Thr Phe Ala Thr Gli lis Be Be 360 365 GGA GAC ATA GAT TCA ΑΑΓ GTA GCT ATT Qi Asp Be Asp Ser Asn Vai Ala Be 375 380 TTA GCA TIC TTA CAA AAG CAT TTA GGA Leu Ala Phe Leu Gin lis His Leu Qi 390 395 TOG GAC TOC TIG ATT GAA GGA GAT GAT Tip Asp Cis Leu Be Ou Gfi Asp Asp 405 410 crr AiGA AOC CIG AAA GAA GAG 797 Leu Aig Thr Leu Lis Qn Qu 210 GTA GGG CAA AGA GCA AAA GAA 845 Vai Arg Qn Aig Ala Lis Qu 225 GAC ATT GAT CAT GGA AAG CCA 893 Asp Be Asp His Gfi Lis Pro 240 GAT AIG GAA CAA CIG AAG GAC 941 Asp Met Qu Qn Leu Lis Asp 255 260 ATT GGA CAT TCT TTT GGT GGA 989 Be Gli His Ser Phe Gfi Gfi 270 275 GAT CAG AGA TIC AGA TCT GGT 1037 Asp On Aig Phe Alg Cis Gli 290 CIG GGT GAT GAA GTA TAT TOC 1085 Leu Qi Asp Qu Vai Tír Ser 305 AAC TCT GAA TAT TIC GAA TAT 1133 Asn Ser Qu Tír Phe Qn Tir 320 TOC TAC TCA ocr GAT AAA GAA 1181 Os Tff Se· Pro Asp lis Qu 335 340 GIC CAC CAG ΑΑΓ TTT GCT GAC 1229 Vai His Qn Asn Phe Ala Asp 350 355 GGA CAC AIG CIC AAA TTA AAG 1277 Qi His Met Leu Lis Leu Lis 370 GAT CTT AGC AAC AAA GCT TCA 1325 Asp Leu Ser Asn Lis Ala Ser 385 CTT CAT AAA GAT TTT GAT CAG 1373 Leu His Lis Asp Phe Asp Qn 400 GAG ΑΑΓ CTT ATT OCA GGG AGC 1421 Qu Asn Leu Be Pro Gli Thr 415 420 7£f

AfiC ATT AAC ACA ACC ΑΑΓ CAA CPC ATC AK3 TTA OC AM2 TCT TCA OGA 1469

Asn De Asn Thr Thr Asn Gin His De Met Leu <3n Asn Ser Ser Gfi 425 430 435 ATA GAG AAA TAC ΑΑΓ TAGGATTAAA ATAGGTITTT TAAAAAAAAA AAAAAA 1520

De Qu Lis Tir Asn (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 441 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA:

Met Vai Pro Pro Lis Leu His Val 1 5 Ala Vai Vai Tir Pro Phe Asp Trp 20 Met Lis Ser Ser Ala Trp Val Asn 35 40 Ala Ser Phe α Gti Thr T is De 50 55 Vai Gli Cis Thr Asp Leu Met Phe 65 70 Leu Aig Leu Tir Tn- Pro Ser Gh 85 Tip De Pro Asn Tis Ou Tr Phe 100 Thr His Trp Leu Met gs Asn De 115 120 Thr Thr Pro Ala Asn Tip Asn Ser 130 135 Pro Leu Val Val Phe Ser His Gli 145 150 Ser Ala De Gfi De Asp Leu Ala SEQ ID NO: 8:

Leu Phe Cis Leu Cis Gli Cis Leu 10 15 Gin Trr De Asn Pro Val Ala His 25 30 Tis De Gin Val Leu Met Ala Ala 45 Pro Arg Gli Asn Gfi Pro Tr Ser 60 Asp His Thr Asn Lis Gfi Thr Phe 75 80 Asp Asn Asp Arg Leu Asp Thr Leu 90 95 Trp Gfi Leu Ser Lis Phe Leu Gfi 105 110 Leu Arg Leu Leu Phe Gfi Ser Met 125 Pro Leu Arg Pro Gli Glu Lis Trr 140 Leu Gfi Ala Phe Arg Thr Leu Trr 155 160 Ser His Gli Phe De Val Ala Ala 170 175 165

Vai Glu His Arg Αφ Aig Ser Ala Ser Ala Thr Tir Tir Phe lis Αφ 180 185 190 Gn Ser Ala Ala Gu Be Gfi Αφ Lis Ser Τφ Leu Tir Leu Aig Thr 195 200 205 Leu Lis Gin Gu Gu Gu Thr His Be Arg Asn Gu Gn Vai Arg Gn 210 215 220 Arg Ala Lis Gu Cis Ser Gn Ala Leu Ser Leu Be Leu Αφ Be Αφ 225 230 235 240 His Gfi Lis Pro Vai Lis Asn Ala Leu Αφ Leu Lis Phe Αφ Met Gu 245 250 255 Gin Leu lis Αφ Ser Be Αφ Arg Gu lis Be Ala Vai Be Gfi His 260 256 270 Ser Phe Gfi Gfi Ala Thr Vai Be Gn Thr Leu Ser Gu Αφ Gn Aig 275 280 285 Phe Arg Cis Gfi Be Ala Leu Αφ Ala Tip Met Phe Pro Leu Gfi Αφ 290 295 300 Qu Vai Tir Ser Arg Be Pro Gn Pro Leu Phe Phe Be Asn Ser Gu 305 310 315 320 Tir Phe Gn Tir Pro Ala Asn Be Be T is Met Lis Lis Cis Tir Ser 325 330 335 Pro Αφ Lis Gu Aig Lis Met Be Thr Be Aig Gfi Ser Vai His Gn 340 345 350 Asn Phe Ala Αφ Phe Thr Phe Ala Thr Gfi Lis Be Be Gfi His Met 355 360 365 Leu Lis Leu Lis Gfi Αφ Be Αφ Ser Asn Vai Ala Be Αφ Leu Ser 370 375 380 Asn Tis Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gn Lis His Leu Gfi Leu His T is 385 390 395 400 Asp Phe Αφ Gn Trp Αφ Cis Leu Be Gu Gfi Αφ Αφ Gu Asn Leu 405 410 415 Be Pro Gfi Thr Asn Be Asn Thr Thr Asn Gn His Be Met Leu Gn 420 425 430 Asn Ser Ser Gfi Be Gu Lis Tir Asn 435 440 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO.9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 504 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 185.311 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO. 9: GCGCGCTCTA GTAGAGCCGG GCCACACACG CTCCTCCCCG TACCTCCTCC AGCATCACCG 60 AGGGGAAGGA GAGGGTCGGG CCACAAGGCG CGCTAGGCGG ACCCAGGACA CAGCCCGCGC 120 GCAGCCCACC CGCCCGGCCG CCTGCCAGGA GCTGCTGCGG CCGCGCAGCC AGGGGGACAG 180 GCGGGCTGGT CGGAGGCTCG CAGTGCTGTC GGCGAGAAGC AGTCGGGTTT GGAGCGCTTG 240 GGTCGCGTTG GTGCGCGGTG GAACGCGCCC AGGGACCCCA GTTCCCGCGA GCAGCTCCGC 300 GCCGCGCCTG AGTGAGGAGG GGCCCCGGGG GCGAGGCGGG AGTGGGAGGA AGGGCACGGT 360 CGCCGCGCTG GAGGTCGGGA CCCCGGAGCG CGACCGGCCG GGGTGGGCTC GCTGAGTCGC 430 ACCCGCTCTG CTGGCCGGAC CTGGGCTCAC AGTCCTGCAG CCCTCGGAAA CAGCGCTAGG 480 ATCCTTCGGG AGAGGAGAGA TGAC 504 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 417 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 145. 287 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ED NO: 10.

GTACCAATCT AAAACCCAGC ACAGAAAAAT ACATGTTTTA TTTTTTCCAA GTGTTACTAG 60 TACCTCAGCC TTTCTTGATT TGTCAGCTTA TTTAAGGCCT CTTCATTGCA TACTTCTTTT 120 ΤΤαΤΤΤΑΑΤ CATCTGCTTC GAAGGAGACT AAGCTGAAAC TGCTGCTCAG CTCCCAAGAT 180 GGTGCCACCC AAATTGCATG TGCTTTTCTG CCTCTGCGGC TGCCIGGCIG TGGTTTATCC 240 mTGACTGG CAATACATAA ATCCTGTTGC CCATATGAAA TCATCAGGTA AGAGGTGTAT 300 TTGTTCAAGG TCTTGAGCAA CTGATCTGTC GCCATACTTC AAGTGGGCCC CAAGAAGTTG 360 CACATCIGCA CATCTAAACA AGTCCTATTT AAAGGCTTAT GGAGATCCTG TATTCTC 417 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 498 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 251.3 72 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: CATTAGGAGG TAACAGTCCA AGGCAGCTGA GAGAAAGGCT ATGTCTACTT TCATCTCTTT 60 ACCCTCCAAA ACCCCTACAC AGTGTITCAA ACAGAGAGAC CCTCAATAAT TGCATATCTT 120 ACTTGTTAGG TTGAGAAAGA AAGAAGGCCA GAAACTATGG GAAGTAACTT GATTCCGTTG 180 GAATTCTTTT GCATAATAAA ATCTGATATG TAATGGATGA CAAATGAGAT AATATTTACC 240 TGTI TITCAG CATGGGTCAA CAAAATACAA GTACTGATGG CTGCIGCAAC GTTTGGCCAA 300 ACTAAAATCC CCCGGGGAAA TGGGCCTTAT TCCGTTGGTT GTACAGACTT AATGTTTGAT 360 CACACTAATA AGGTAATGCT TTGATTTATA CAACTTATCC TGATACTCTA ATATTGTCTG 430 TCGCTATGGA CCACFAGAAG GTGTTCAAAT GTGACCTTGC CCTCACCTGA GAATGACTCA 480 TTTTCGAATT TGTATTGT 498 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 7íê (A) COMPRIMENTO: 433 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 130.274 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 12: CAGCAGCCTA AAGTCTTAGA CTTTGTGAAC ACAGAGGTAT TGAGTCCCAC TAATTAATAT 60 CGAAAATAGC TGCTGGAATA TGTTTGAGAC ACAACTTCTC TAAAAGTGCA TTAATTTCTT 120 TCTTAACAGG GCACCT1CT1 GCGTTTATAT TATCCATCCC AAGATAATGA TCACCTTGAC 180 ACCCTTTGGA TCCCAAATAA AGAATATTTT TGGGGTCTTA GCAAATTTCT TGGAACACAC 240 TGGCTTATGG GCAACATTTT GAGGTTACTC TTTGGTAAGA TTTCTGTTGA TCCTTCTTTG 300 TAGGCTCTTG CATGTATGAA AACCTTGAAA ACAACAAGAA CTTCAAGTAG TTAAGACCAA 360 AGTAGATTTT TCTTCAGTCC AAATAGCTCC TAAAATGATA AGGAAAGTAT TTCTTTAAAG 420 CCCAGGCAAC TAC 433 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 486 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 164.257 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: ?}£ TTGGTCGCTA TCTAGTAGCA GTC1T1'11'AA TGAATCTACT ATTCATCCAT AAAAAAGTAG 60 ATATAAATCA GATGGGTCTG CATTTTATGC TAATGAGATA TGAATTAAAT TCACTAGCAA 120 CACTCAGAGA AAACCTTAAC TATAACCTTC CATTGTTGTC TAGGTTCAAT GACAACTCCT 180 GCAAACTGGA ATTCCCCTCT GAGGCCTGGT GAAAAATATC CACTTGTTGT ÍTI I IOCAT 240 GGTCTTGGGG CATTCAGGTA ATGTTTGAGA GGTTGAACAA TTTTGGCTTC CAGGAATAAA 300 TGACAATTTT TTTATTCAAG AAAGAAATAG CAGAGTTTGG AATGTCATGC AGGCCCTTGT 360 CTGGAGGAGT TGGGGTTCCT CAATAATTGG CTGTGGGTCT ATTOATCAGT CCTAGACCTG 420 TCTGGTCAAG TAGTTTTTTC CCTACTATCA GCTCATTGGG ATTAGCCTCA CAGCAGAGAA 480 GAAAGG 486 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 363 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 113..181 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: CCCCAGGCTC TACTACAGGG TGTAATGGCC TCCATGTTCC CAGTTTTATT AGTGACTCAG 60 CCTTGTAATT CATGACTGGT AGTTGTAATT CTTCCCTCTT TTTGTTTTGA AGGACACTTT 120 ATTCTGCTAT TGGCATTGAC CTGGCATCTC ATGGGTTTAT AGTTGCTGCT GTAGAACACA 180 GGTATGTTAC CTGATATAAT TGGGCTCTTT GGCCAACTAC AGGGAATGTC AATGCTCATA 240 ACTATGTTTC TAATTTTCAT AAAGTTTAT TTAAAATGTT GATGGAACTT TCAAGTATGG 300 TAACATCATG AGCAAAAAAG GAGATTGAGT TTTATCGACT TAAAAGACTT AAAAGCACCT 360 AAC 363 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ED NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 441 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO exão (B) LOCALIZAÇÃO: 68..191 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: GAACTGAGAA ACATGGTCAG ATGAGGAAGG GAAGGAGCAT GCATAAATAA TTTTGCTTGT 60 ATTATAGAGA TAGATCTGCA TCTGCAACTT ACTATTTCAA GGACCAATCT GCTGCAGAAA 120 TAGGGGACAA GTCTTGGCTC TACCTTAGAA CCCTGAAACA AGAGGAGGAG ACACATATAC 180 GAAATGAGCA GGTACATTGC AGTGAAAGGA GAGGTGGTTG GTGACCTAAA AGCATGTACA 240 AAAGGATGAC ATTTGTTAAT TTAATTTTAC ACCTGGCAAG TTATGCTCCT AGCTCTCCTA 300 TTTCCCATTC CCAAAAGATC TGTCAATAGA TTCCTGGAGC AGTAAAATTC CCTTAATGGA 360 ATATCTAGTT CATAGTAAAA ACAAAGGCAA ATACAAAAT TTGGGAGATG ACAGTGAATA 420 TTCAGAATTC CTCGAGCCGG G 441 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA DD NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 577 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 245 .358 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: 60

GGTTAAGTAA ATCGTCTGAA GTCACATAGT AGGTAAGGCA AAACAGAGCC AGGATTTGGA CTAAGGCTAT ACCTATGTGC AAAGCTGGGG CCTGTGTCAT TATGGTAGCA AGTAATAGTC ACTAATCAGA TTTCCAGTTr ATAACTGACC AACGATTTTT CCCAAATACA GCTTCTACCT AAACTTTAAA ATAAGTGTTA TAAC1THTA CTTTGTCATT TCCITCTTCr AATAATTATA TTAGGTACGG CAAAGAGCAA AAGAATGTTC CCAAGCTCT AGTCTGATTC TTGACATTGA TCATGGAAAG CCAGTGAAGA ATGCATTAGA TTTAAAGTTT GATATGGAAC AACTGAAGGT AAGCTATAAA AAGTAATTTT TCTCTTGTCC TACAGTTCTT TATTGTIT1T TGTCATTTAA TTTTCTGCCT ATATTGCAAG GTACAATATG ATAAAGGGCT GCAACCAGCC CCTCCCCAAT GCGCACACAC AGACACACAA AGCAGTACAG GTAAAGTATT GCAGCAATGA AGAATGCATT ATCTTGGACT AGATATGAAT GCAAAGTTAG TCAGTTT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 396 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 108.199 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ CD NO: 17:

ATCAATGTAT TTACCATCCC CATGAAATGA ACAATTATAT GATTGACAAA TCATTTCTTC TAACACCACG AAATAGCTAT ΑΑΑΤΤΓΑΤΑΤ CATGCTTTTT CAAATAGGAC TCTATTGATA GGGAAAAAAT AGCAGTAATT GGACATTCTT TTGGTGGAGC AACGGTTATT CAGACTCTTA GTGAAGATCA GAGATTCAGG TAAGAAAATA AGATAGTAAA GCAAGAGAAT AGTAAATTAT TGGAAGAAAT TATATTGTGA GATATAATTT TTATTCAAAT TCTTAGTGAA GGAAGGGGAT CTCTTGGAGT TTATAAGGCT ATTCTTTTCGC CCCCATAAAA TACTCTATAT ACATTTTCCT AGGCTAAAAC ATCTCCTCTC CTGCTATTAA AATCTC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 18: 120 180 240 300 360 420 480 540 577

60 120 180 240 300 360 396 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 519 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO exão (B) LOCALIZAÇÃO: 181. 351 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: CTTACAAAGT TAATCATATC CCTTTCCCAC ATTGAAGTAT GATACCTCTT TATTCCAATC 60 AFATAACCCA TAATAAACTG GTATGGTGCG TGTCCACCAA TCCTAGCA7T ATTAGGATGT 120 CCTCAATGTT GGCTAGTATG TAACCAGTTT AATTTCATCA TTGTCAACAA ATATCTACAG 180 ATGTGGTATT GCCCTGGATG CATGGATGTT TCCACTGGGT GATGAAGTAT ATTCCAGAAT 240 CCTCAGCCC CTCTT1TTA TCAACTCTGA ATATTTCCAA TATCCTGCTA ATATCATAAAT 300 AATGAAAAAA TGCTACTCAC CTGATAAAGA AAGAAAGATG ATTACAATCA GGTAAGTATT 360 AGTGACTTAT TTCATTATGT GAAACAAACT TGAAGCTTGG GTAAATATCA ATCGATATCA 420 TTTGGTAACT ATTAAAGAAT TGCTGAATTG GTTGTTTAGA CTTTCAATAA GGAGAGAATT 480 AGATAATCTC AGTTTCTAAG TACATTTAGT CTACTCITT 519 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 569 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 156..304 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 19: TGAAACACAT CTAAGTAGAT CAAATTACAA GTTTTATTTC TTCTTTGGTT TTCAGTAAAC 60 AGACCAACAA GACCAGTACC TTTCCTTACA CTCTAACTAA AAAAATAATA ATTTTATCAA 120 ACAATGTGAC TTTTAAATGT CTTGTTCTCT TTAGGGGTT CAGTCCACCA GAATTTTGCT 180 GACTTCACTT TTGCAACTGG CAAAATAATT GGACACATGC TCAAATTAAA GGGAGACATA 240 GATTCAAATG TAGCTATTGA TCTTAGCAAC AAAGCITCAT TAGCATTCTT ACAAAAGCAT 300 TTAGGTAAGA AACTATTTTT TTCATGACCT AAACCGAGAT GAATCTCGAG GACAAAGCTG 360 TCTATCTTAA TACAGCTTTA GTACTATTTA AACTATITCC AGTTGGTTTA CAATGGAACA 420 AAGCAGTATA TCAATTTGAA AACAGAAATT TGAGAAAGTC AATTTTGCTG CTTTACATCT 480 CTATATCATA GAAAGCAAAT CAACTGTTAA AGGTAATATT CTTTGTAGTGA GCTAGAGTGA 540 CTCATGTGAG GATATCGAAC GACGGTGCT 569 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 469 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO, simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: exão (B) LOCALIZAÇÃO: 137.253 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.20. GATACAGAGG CACATCGTCT CTACCATCCT AACGGAACTT GTGTAATTTG TAAATCTTTA 60 TTGCCACCTA GGGGCATCCA AACTGTTTAA TGCTCTCAAA AGTTTAATAT GTTGATTAAC 120 ACTTTATATT TTATAGGACT TCATAAAGAT TT7GATCAGT GGGACTGCTT GATTGAAGGA 180 GATGATGAGA ATCTTATTCC AGGGACCAAC ATTAACACAA CCAATCAACA CATCATGTTA 240 CAGAACTCTT CAGGAATAGA GAAATACAAT TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAGTCTT 300 GTTTCAAAAC TGTCTAAAAT TATGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG AGAGAGAGAG 360 AGAGAGAGAG AGAGAGAATT TTAATGTATT TTCCCAAAGG ACTCATATTT TAAAATGTAG 420 GCTATACTGT AATCGTGATT GAAGCTTGGA CTAAGAATTT TTTCCCTTT 469

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1494 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 117 .1436 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) N0 21: GGCACGAGCT AGGTCTGAC TCGCTCTGGT GGCATTGCTG CGCTCAGGGT TCTGGGTATC 60 CGGGAGTCAG TGCAGTGACC AGAACATCAA ACTGAAGCCA CTGCTCAGCT CCTAAG 116 ATG GTA OCA CIO AAA CIG CAG GCG crr TIO TGC CIO CIO TGC TGC CIO 164 Met Vai Pro Leu Lis Leu Gin Ala Leu Phe Cis Leu Leu Cis Cis Leu 1 5 10 15 OCA TGG GIC CAT ccr τη CAC TGG CAA GAC ACA ΤΟΓ TCT TTT GAC TIO 212 Pro Tip Vai His Pro Phe His Tip Gin Asp Thr Ser Ser Phe Asp Phe 20 25 30 AGG OOG TOA GTA AIG rrr CAC AAG CIO CAA TOG GIG AIG TCT GCT GOC 260 Aig Pro Ser Vai Met Phe His Lis Leu Gb Ser Vai Met Ser Ala Ala 35 40 45 GOC TCT GOC CAT AGT AAA AIO OX AAA GGA ΑΑΓ GGA TGG TAC OOC GIC 308 Gli Ser Gli His Ser Lis De Pro Lis α Asn GS Ser Tr Pro Vai 50 55 60 GGT TGT ACA GAT CIG AIG TIO GGT ΤΑΓ OOG ΑΑΓ GAG AGC GIC ΊΠΟ GIG 356 Gli Cis Thr Asp Leu Met Phe GH Tir Gli Asn Ou Ser Vai Phe Vai 65 70 75 80 OGT TTG TAC TAC OCA GCT CAA GAT CAA GGT OGC CIO GAC act GTT TGG 404 Aig Leu Tir Tir Pro Ala Gin Asp Gin Gli Aig Leu Asp Thr Vai Tip 85 90 95 APC OCA AAC AAA GAA ΤΑΓ ΤΤΓ TIG GGT crr AGT ATA TTT crr GGA ACA 452 De Pro Asn Lis G3u Tir Phe Leu Gli Leu Ser De Phe Leu Gfi Thr 100 105 110 OOC AGT ATT GTA GOC ΑΑΓ ATT TTA CAC CIO TTA TAT GGT Ter CIG ACA 500 Pro Ser De Vai Gli Asn De Leu His Leu Leu Tir Gli Ser Leu Thr 115 120 125 ACT ccr GCA AGC TOG ΑΑΓ TCT OCT ΤΓΑ AGG ACT GGA GM AM TAC COG 548 Thr Pno Ala Ser Ttp Asn Ser Pro Leu Aig Thr Gfi Gb Lis Tr Pro 130 135 140 CIC ATT GIG ΊΓΓΤ TCT CAT GGT CIC GGA G0C TIC AGG AGG ATT ΤΑΓ TCT 596 Lai De Vai Phe Ser His Gfi Leu Gfi Ala Phe Arg Thr De Tr Sa 145 150 155 160 ocr ATT GGC ATT GGC TIG GCA TCT MT GOG TTT ATA GIG GOC ACT GIC 614 Ala De Gfi De Gfi Leu Ala Ser Asn Gfi Phe De Vai Ala Thr Vai 165 170 175 GAA CAC AGA GAC AGA TCT GCA TOG GCA ACT TAC TTT TTT GM GAC CAG 692 Gb His Arg Asp Arg Ser Ala Sa Ala Thr Tr Phe Phe Gb Asp Gb 180 185 190 GIG GCT GCA AM GIG GM AAC AGG TCT TOG CTT TAC CIG AGA AM GTA 740 Vai Ala Ala lis Vai Gb Asn Arg Ser Τφ Leu Tr Leu Aig Lis Vai 195 200 205 MA CM GAG GAG TOG GM AGT GIC CGG AM GM CAG GIT CAG CM AGA 788 lis On Ou Gb Ser Gb Ser Vai Arg lis Gb Gb Vai Gb Gb Aig 210 215 220 GCA ATA GM TGT T0C CGG GCT CTC AGT GOG ATT CTT GAC ATT GM CAT 836 Ala De Gb Cis Ser Arg Ala Leu Ser Ala De Leu Asp De Gb His 225 230 235 240 GGA GAC OCA AM GAG ΑΑΓ GEA CIA GGT TOA GCT TTT GAC ATO AM GAG 884 GE Asp Pio Tis Gb Asn Vai Leu Gfi Ser Ala Phe Asp Ma Lis Gb 245 250 255 CIG AAG GAT GCT ATT GAT GAG ACT AM ATA GCT TIG ATO GGA CAT TCT 932 Leu Tis Asp Ala De Asp Gb Thr T is De Ala Leu Ma Gfi His Sa 260 265 270 TTT GGA GGA GCA ACA GIT CTT CM GGC CTT AGT GAG GAC CAG AGA TIC 980 Phe Gfi Gfi Ala Thr Vai Leu Gb Ala Leu Sa Ou Asp Gb Arg Phe 275 280 285 AGA TCT GGA GIT GCT CTT GAT OCA TOG ATO ΤΑΓ GOG GIG AAC GM GAG 1028 Aig Cis Gfi Vai Ala Leu Asp Pro Tip Ma Tr Pro Vai Asn Gb Gb 290 295 300 CIG TAC OC AGA AGC CIC CAG OCT CIC CIC TTT ATO AAC TCT GOC AM 1076 Leu Tr Ser Arg Thr Leu Gb Pro Leu Leu Phe De Asn Sa Ala Lis 305 310 315 320 TIC CAG ACT OCA AAG GAC AIC GCA AM ATO AM AAG TIC TAC CAG OCT 1124 Phe Gin Thr Pro Lis Asp De Ala Lis Ma Lis Lis Phe Tr Gb Pro 325 330 335 GAC AAG GM AGG AM ΑΑΓ GAT TAC ΑΑΓ CM GGG CIC AGG CAC CAG AAC 1172 Asp Lis Gtu Aig Lis Asn Asp Tír Asn Gb Gfi Leu Arg His Gb Asn 340 345 350 τη GAC GAC TTT ACT TTT GTA ACT GGC AAA ATA ATT GGA AAC AAG CIG 1220 Phe Asp Asp Phe Thr Phe Vai Thr Gli Us De De GB Asn Lis Leu 355 360 365 ACA CIO AAA GGA GAA ATC GAT TOC AGA GTA GGC AIC GAC CIC ACC AAC 1268 Thr Leu Lis GB Glu De Asp Ser Aig Vai Ala De Asp Leu Thr Asn 370 375 380 AAA OCT TOG AIG GCT TIC TTA CAA AAG CAT TTA GGG CTT CAG AAA GAC 1316 Lis Ala Ser Met Ala Phe Leu Gin Us His Leu GB Leu Gin Lis Asp 385 390 395 400 TFT GAT CAG TOG GAC OCT CIG GIG GAA GGA GAT GAT GAG AAC CIG ATT 1364 Phe Asp On Trp Asp Pro Leu Vai Gb GB Asp Asp Gu Asn Leu De 405 410 415 GCT OGG TCA OOC TTT GAC GCA GIC AGC CAG GGC OGG GCT CAG CAA CAC 1412 Pro GB Ser Pro Phe Asp Ala Vai Thr On Ala Pro Ala Gin Gin His 420 425 430 TCT CCA GGA TCA CAG ACC CAG ΑΑΓ TAGAAGAACT TGCITGTTAC ACAGTTGCCT 1466 Ser Pro Gli Ser Gin Thr Gin Asn 435 440 TTTAAAAGTA GAGTGACATG AGAGAGAG 1494 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ED NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2191 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 92 .1423 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22: CCGCGCGCTC CGGCCGGGGG ACCCTGGTTC CGGCGAGCGG CTCAGCGCGG CGCCCGGAAG 60 TTTAAGCTGA AACCACTGCT CAGCTTCCAA G AFG TIG OCA GGC AAA CFG CAT 112

Met Leu Pro Pro Lis Leu His 1 5 GGG CTT TIC TOC CIC TOC AGC TOC CIC ACA CIG GTT CAT OCT ATT GAC 160 Ala Leu Phe 10 Cis Leu Cis Ser Cis 15 Leu Thr Leu Vai His 20 Pro De Asp

TOG CAA GAC CTA ΑΑΓ ocr GH GOC CAT ATT AGA TCA TCA GCA TOG GOC 208 Τιρ Qn Asp Leu Asn Pro Vai Ala His He Arg Ser Ser Ala Trp Ala 25 30 35 ΑΑΓ AAA ATA CAA GCT CIG AJG ocr GCT GCA AGT ATT AGG CAA AGT AGA 256 Asn Lis He Gh Ala Leu Met Ala Ala Ala Ser He Arg Qn Ser Arg 40 45 50 55 ΑΠ’ CCC AAA GGA ΑΑΓ GGA TCT ΤΑΓ TCT GIC GGT TOT ACA GAT TIG ATO 304 He Pro Lis ca Asn Gfi Ser Tir Ser Vai Gfi Cis Thr Asp Leu Met 60 65 70 ΤΤΓ GAT ΤΑΓ ACT ΑΑΓ AAG GGC AGC TTT TIG OGT TIG TAT TAT OCA TCG 352 Phe Asp Ur Thr Asn Lis GH Thr Phe Leu Aig Leu Tr Tir Pro Ser 75 80 85 CAA GAG GAT GAC CAC TCT GAC ACG CTT TOG AIC CCA AAC AAA GAA TAT 400 Qn Gtu Asp Asp His Ser Asp Thr Leu Tip He Pro Asn Lis Qu Tir 90 95 100 ΤΤΓ TTT GGT cn AGT AAA ΤΑΓ cn GGA ACA ooc TOG CTT ATG GGC AAA 448 Phe Phe C3i Leu Ser Lis Tn- Leu ca Thr Pro Trp Leu Met Gfi Tis 105 110 115 ΑΓΑ TIG AGC TIC TTT ITT GGT TCA GIG ACA ACT ocr GOG AAC TOG ΑΑΓ 496 He Leu Ser Phe Phe Phe ca Ser Vai Thr Thr Pro Ala Asn Trp Asn 120 125 130 135 TOC 0cr CIO AGG ACT GGT GAA AAA ΤΑΓ CCA CIG ATT GTT TTT TCT CAT 544 Ser Pro Leu Aig Thr ca Ou lis Tir Pro Leu He Vai Phe Ser His 140 145 150 GGT cn GGA GCA TIC GGG ACA ATT ΤΑΓ TCT GCT ATT GGC ATT GAT CTA 592 Gfi Leu ca Ala Phe Arg Thr He Tir Ser Ala He Gfi He Asp Leu 155 160 165 OCA TCA CAT GGG TIC ATC GH GCT GCT ATA GAA CAC AGA GAT GGA TOC 610 Ala Ser His ca Phe Be Vai Ala Ala He Gtu His Aig Asp Gfi Ser 170 175 180 αχ TCT GOG ACT TAC TAT TIC AAG GAC CAG cr GCT GCA GAA ATA GGG 688 Ala Ser Ala Thr Tir Tír Phe Lis Asp Qn Ser Ala Ala Gu He Gfi 185 190 195 AAC AAA TCT TOG tcr ΤΑΓ CTT CAA GAA CTA AAA OCA GGG GAT GAG GAG 736 Asn Lis Ser Trp Ser Tir Leu Gin Glu Leu Lis Pro Gfi Asp Qu Qu 200 205 210 215 ATA CAT GH GGA ΑΑΓ GAG CAG GTA CAG AAA AGG GCA AAG GAG TOC TOC 784 He His Vai Arg Asn Ou Gin Vai Gin Lis Aig Ala Lis Qu Cis Ser 220 225 230 CAA GCT CIC AAC TIG ATT CIG GAC ATT GAT CAT GGA AGG OCA ATT AAG 832 On Ala Leu Asn Leu He Leu Asp He Asp His GH Arg Pro He Lis 235 240 245

ΑΑΓ GTA CIA GAC TTA GAC TTT GAT GIG GAA CAA CIG AAG GAC TCT ATT 880 Asn Vai Leu Asp Leu Ou Phe Asp Vai Qu Qn Leu Lis Asp Ser De 250 255 260 GAC ACG GAT AAA ATA GCA GTA ATT GGA CAT TCT TTT GGT GGA GCC ACA 928 Asp Aig Asp Lis De Ala Vai De Gfi Hs Ser Phe Oi Gfi Ala Thr 265 270 275 GTT CTT CAG GCT CTT ACT GAA GAC CAG AGA TTT AGG TQC GGG ATT GGC 976 Vai Leu Qn Ala Leu Ser Ou Asp Gin Aig Phe Aig Cis Gli De Ala 280 285 290 295 TIG GAT OCA TOG AIG CTT OCA CIG GAT GAT GCA ATA ΤΑΓ TCC AGA AIC 1024 Leu Asp Ala Tip Met Leu Pro Leu Asp Asp Ala De Tir Ser Alg De 300 305 310 ocr CAG αχ CIC ΤΓΓ ΤΓΓ ATT AAC TOG GAA CGG TIC CAA τη ocr GAG 1072 Pro Gin Pro Leu Phe Phe De Asn Ser Qu Aig Phe Qn Phe Pro Qu 315 320 325 ΑΑΓ AIC AAA AAA AIG AAA AAA TQC TAC CA ocr GAC AAA GAA AGA AAA 1120 Asn De Lis Lis Met Lis Lis Cis Tir Ser Pro Asp lis Qu Alg Lis 330 335 340 ATO ΑΓΓ ACA AIC AGG GGT TCA GIC CAT CAG AAC TTT GCT GAT TIC ACT 1168 Met Se Thr De Aig Gfi Ser Vai His Qn Asn Phe Ala Asp Phe Thr 345 350 355 ΤΤΓ ACA ACT GGC AAA ATA GTT GGA TAC ATA TIC ACA TTA AAA GGA GAT 1216 Phe Thr Thr Gli Lis De Vai Gli Tir De Phe Thr Leu lis Gli Asp 360 365 370 375 AEA GAT TCA ΑΑΓ GTA GCA ATT GAT CTT TQC AAC AAA GCT TCA TIG GCA 1264 Se Asp Ser Asn Vai Ala De Asp Leu Cis Asn lis Ala Ser Leu Ala 380 385 390 τη TTA CAA AAG CAT TTA GGA CIG CGG AAA GAT TTT GAT CAG TGG GAT 1312 Phe Leu Qn Lis His Leu Gli Leu Aig Lis Asp Phe Asp Qn Tip Asp 395 400 405 TCT TIG ATT GAA GGA AAA GAC GAA ΑΑΓ CTT AIG OCA GGG ACC AAC ATT 1360 Ser Leu Se Ou Gfi Lis Asp Qu Asn Leu Met Pro Gfi Thr Asn De 410 415 420 AAC AIC ACC AAC GAA CAT GAC ACT CTA CAG AAC TCT OCA GAA GCA GAG 1408 Asn De Thr Asn Ou Hs Asp Thr Leu Qn Asn Ser Pro Qu Ala Qu 425 430 435 AAA TOG ΑΑΓ ΤΓΑ GAT TAAAAGCACT TTTTTAAAGA TCTTGTTTAA AAACTGTCAA 1463

Lis Ser Asn Leu Asp 440 1523 1583

AAAATGTGTG TATGACTTTT AATATATTTT CTCAAATAAC TCATATTGGA AAATGTAGGC TATCCCATAA AAGTGATTGA AGCTTGGACT AGGAGGTTTT TTTCTTTAAA GAAAGATTGG 7S$ TGTCTATCGA AATCATGCCA GCCTAAATTT TAATTTTACT AAAATGATGC TGTGTCAAAA 168 TTAATAACTA CTTTTACATT CTTTAATGGA CAAGTATAAC AGGCACAAGG CTAATGAAAA 1X3 CGTGTTGCAA TGACATAACA ATCCCTAAAA ATACAGATGT TCTTGCCTCT TTTTTCTATT 1763 ATAATTGAGT TTTAGCAACA TGTTATGCTA GGTAGAATTT GGAAGCACTT CCCTTTGACT 1823 TTTGGTCATG ATAAGAAAAA TTAGATCAAG CAAATGATAA AAGCAGTGTT TTACCAAGGA 1883 TTAGGGATAC TGAACAATTT CACTATGGTA ACTGAATGGG GAGTGACCAA GGGTAAAAAT 198 ATTAAAGCCA AGGCAAAGGC AGCAGATTAG AATGGATTAA AGAGAGTTTA TAATTTGTTT 2003 GCATTTACTT GATGGTTTAT CTCATGGATT CATGAGTCAA GAAAGGTGCG TAGGACAGGC 2063 CAGGGATTCC AGTTATAACA CATTATTCAC CCAAAGGGTT CTTTAATTCT GTATGAGTAT 2123 TGGGAGTGGA TTAGCACAAT AGAGGCATAT GTTGCnTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2183 AAAAAAAA 2191 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA DD NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:. (A) COMPRIMENTO: 517 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 2..514 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:23: G GGG CAT TCT TTT GGA GGA GCA ACA GIT TTT CAA GOC CTA AGT GAA 46 GS Hs Ser Phe Gfi Gfi Ala Thr Vai Phe Gin Ala Leu Ser Glu 1 5 10 15 GAC CAG AGA TIC AGA TGT GGG ATT GOC crr GAT CCG TOG ATO TTT OGC 94 Asp Gin Aig Phe Aig Cis ca De Ala Leu Asp Pro Trp Met Phe Pro 20 25 30 GIG AGT GAG GAG CIG TAC ICC AGA GTT CCT CAG 0cr CIC TIC TTT ATO 142 Vai Ser Glu Ou Leu Tir Ser Aig Vai Pro Gin Pro Leu Phe Phe De 35 40 45 AAC TCT GCC GAA TIC CAG ACT OCA AAG GAC ATT GCA AAA ATO AAA AAC 190 Asn Ser Ala Glu Phe Gin Thr Pro Lis Asp De Ala Lis Met I is Asn 50 55 60 7Sd TIC TAC CAG GCT GAC AAG GAA AGG AAA ATG ATT ACG AOC AAG GGC TCA 238 Phe Tir Gn Pro Asp Lis Gkt Aig Lis Met De Thr De Lis Gfi Ser 65 70 75 GTG QC CAG ΑΑΓ TTT GCT GAC GGG ACT TTT GTA ACT GGC AAA ATA ATT 286 Vai His Gin Asn Phe Ala Asp GE Thr Phe Vai Thr Gfi Lis De De 80 85 90 95 GGA AAC AAG CIO TCA CIG AAA GGA GAC ATA GAC ICC AGA GTT OOC ATA 334 GE Asn lis Leu Ser Leu Lis GE Asp De Asp Ser Aig Vai Ala De 100 105 110 GAC CIC AOC AAC AAG GCT ICC TIG GCT TIC ΤΓΑ CAA AAA CAT ΤΓΑ GGA 382 Asp Leu Thr Asn Lis Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gn Lis His Leu Gfi 115 120 125 CTT CAT AAA GAC τη GAT CAG TOG GAC TGT CIG GIG GAG GGA GAG AAC 430 Leu His Lis Asp Phe Asp Gin Trp Asp Cis Leu Vai Glu Gfi Gti Asn 130 135 140 GAG AAC CIC AOC C0G GGG TCA OOC TTT GAT GTA GIC AOC CAG ICC GOG 478 Glu Asn Leu De PTO GE Ser Pro Phe Asp Vai Vai Thr Gin Ser Pro 145 150 155 GCT CIO CAG AGT TCΓ OOC GGA TCA CAC AAC CAG ΑΑΓ TAG 517 Ala Leu Gin Ser Ser Pro GE Ser His Asn Gin Asn 160 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA DD NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 580 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.580 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24: CAA GTA CIG AJG GCT GCT GCA AGC TTT GGC GAA CGT AAA AOC GCT AAG Gin Vai Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gfi Glu Arg Lis De Pro Lis 1 5 10 15 GGA ΑΑΓ GGG GCT ΤΑΓ ICC GTT GGT TGT ACA GAC TTA ATG TTT GAT TAC Gfi Asn Gfi Pro Tir Ser Vai Gfi Cis Thr Asp Leu Met Phe Asp Tir 20 25 30 7kf act AAA AAG GGC AGC TIC TTG CGT TTA TAT TAT OCA TOC CAA GAT GAT 144 Thr Lis Lis Gli Thr Phe Leu Aig Leu Ttr Trr Pro Ser Gb Asp Asp 35 40 45 GAT CGC crr GAC AGC CTT TGG ATC OCA AAT AAG GAG TAT TTT TOG GGT 192 Asp Arg Leu Asp Thr Leu Trp De Pro Asn Lis Gb Ttr Phe Trp Oi 50 55 60 crr AGC AAG TAT CTT GGA AAA CAC TOG CTT A3G GGC AAC ATT TTC AGT 240 Leu Ser Lis Trr Leu GE Lis His Trp Leu Met GE Asn De Leu Ser 65 70 75 80 7TA CIC TTT GGT TCA GIG ACA ACT OCT GCA AAC TOG AAT TOC OCT CTG 288 Leu Leu Phe Gli Ser Vai Thr Thr Pro Ala Asn Trp Asn Ser Pro Leu 85 90 95 AGG OCT GGT GAA AAA TAC OCA CTT GTT GTT TTT TCT CAT GGT CTT GGA 336 Arg Pro Gli Glu Lis Trr Pro Leu Vai Vai Phe Ser His GE Leu GE 100 105 110 GCA TTC AGG ACA ATT TAT TCT GCT ATT GGC ATT GAC CTG GCA TCT CAT 384 Ala Phe Arg Thr De Trr Ser Ala De Gli De Asp Leu Ala Ser His 115 120 125 GGG ΊΠΤ ATA GTT GCT GCT GTA GAA CAC AGA GAT AGA TCT GCA TCT GCA 432 GE Phe De Vai Ala Ala Vai Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala 130 135 140 ACT TAC TAT TIC AAG AAC CAA TCT GCT GCA GAA ATA GGG AAA AAG TCT 480 Thr Tir Trr Phe Lis Asn Gin Ser Ala Ala Glu De GE Lis Lis Ser 145 150 155 160 TOG CIC TAC crr AGA AGC CIO AAA GAA GAG GAG GAG ATA CAT ATA OGA 528 Tip Leu Trr Leu Aig Thr Leu Lis Ou Glu Ou Gb De His De Arg 165 170 175 AAT AAG CAG GTA CGA CAA AGA GCA AAA GAA TCT ICC CAA GCT CIC AGT 576 Asn Lis Gb Vai Arg Gin Aig Ala Lis Glu Gs Ser Gb Ala Leu Ser 180 185 190 CTG A 580

Leu (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear 92 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0 25: 41

TATTCTAGAA TTATGATACA AGTATTAATG GCTGCTGCAA G (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(u) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26: ATTGATATCC TAATTGTATT TCTCTATTCC TG 32

Lisboa, 10 de Agosto de 2001

O Agente Oficial da Propriedade Industrial

A.O.P.I. Rua do Salitre, 195, r/c-Drt. 1269-063 LISBOA

Claims (45)

1. Reivindicações 1. Polinucleótido purificado e isolado que codifica a AH-FAP do plasma, constituído essencialmente pela sequência de aminoácidos explicitada na SEQID NO:8.
2. 2. ADN de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. ADN de acordo com a reivindicação 2, o qual é um ADNc ou uma sua réplica biológica
4. 4. ADN de acordo com a reivindicação 2, o qual possui a sequência explicitada na SEQ ED NO:7 que codifica a AH-FAP do plasma humano.
5. 5. ADN de acordo com a reivindicação 2, o qual codifica os aminoácidos 42 a 441 da SEQ EDNO:8.
6. 6. ADN de acordo com a reivindicação 2, o qual é um ADN genómico ou uma sua réplica biológica.
7. 7. Transcrito de ARN do ADN genómico da reivindicação 6.
8. 8. ADN de acordo com a reivindicação 2, o qual é um ADN total ou parcialmente sintetizado por via química ou uma sua réplica biológica.
9. 9. ADN de comprimento completo que codifica a AH-FAP, seleccionado entre o conjunto constituído por: 75d (a) um ADN que possui a sequência explicitada na SEQID NO:7; (b) um ADN que hibrida em condições rigorosas com o cordão não codificador do ADN de (a); e (c) um ADN que vai hibridar, a não ser pela redundância do código genético, em condições rigorosas, com o cordão não codificador da sequência de ADN de (a) ou (b).
10. 10. ADN purificado e isolado que possui a sequência explicitada na SEQ DD NO:21 e que codifica a AH-FAP do plasma dos murinos.
11. 11. ADN purificado e isolado que possui a sequência explicitada na SEQ DD NO:21 e que codifica a AH-FAP do plasma dos caninos.
12. 12. Polinucleótido anti-sentido específico de um polinucleótido de acordo com a reivindicação 4.
13. 13. ADN de acordo com a reivindicação 6, o qual compreende também uma sequência de ADN de controlo de expressão endógena.
14. 14. Vector de ADN que compreende um ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 6 ou 8 a 13.
15. 15. Vector de acordo com a reivindicação 14, em que o referido ADN está funcionalmente ligado a uma sequência de ADN de controlo da expressão.
16. 16. Célula hospedeira estavelmente transformada ou transfectada com um ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 6 ou 8 a 13, de uma forma que permite 7% exprimir na referida célula hospedeira a AH-FAP ou uma sua variante que possua uma actividade enzimática ou uma propriedade imunológica específica da AH-FAP.
17. 17. Método para a produção de AH-FAP, consistindo esse método em deixar crescer uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 16 num meio nutriente adequado e em isolar a AH-FAP ou uma sua variante a partir da referida célula ou do meio onde teve lugar o seu desenvolvimento.
18. 18. Polipeptido de AH-FAP purificado e isolado, constituído essencialmente pela sequência de aminoácidos da AH-FAP do plasma humano, explicitada na SEQID NO:8.
19. 19. Polipeptido de AH-FAP purificado e isolado, constituído essencialmente pelos aminoácidos 42 a 441 da SEQ ID NO:8.
20. 20. Fragmento do polipeptido de AH-FAP da reivindicação 19, ao qual lhe faltam até 19 aminoácidos do terminal N.
21. 21. Fragmento do polipeptido de AH-FAP da reivindicação 19, ao qual lhe faltam até 30 aminoácidos do terminal C.
22. 22. Variante do polipeptido de AH-FAP da reivindicação 19, o qual é uma variante por substituição de aminoácidos, em que teve lugar uma substituição de aminoácidos na sequência explicitada na SEQ ID NO:8, seleccionado entre o conjunto constituído por: (a) S 108 A; (b) S 273 A;

    (C) D 296 A; (d) D 338 A; (e) H 351 A; (f) H 395 A; (g) H 399 A; (h) C 67 S; (i) C 229 S; (j) C 291 S; (k) C 334 S; e (1) C 407 S.
23. 23. Fragmento do polipeptido de AH-FAP, sua variante ou fiagmento da variante que hidrolisa o 3H-acetato a partir de [acetil-3H]-FAP, produzido deixando crescer uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um ADN e isolando o referido fiagmento do polipeptido de AH-FAP, sua variante ou fragmento da variante a partir da referida célula hospedeira ou do meio onde teve lugar o seu desenvolvimento, em que o referido ADN é seleccionado entre o conjunto constituído por: (a) um ADN que possui a sequência explicitada na SEQID NO: 7; (b) um ADN que hibrida em condições rigorosas com o cordão não codificador do ADN de (a); e (c) um ADN que vai hibridar, a não ser pela redundância do código genético, em condições rigorosas, com o cordão não codificador da sequência de ADN de (a) ou (b).
24. 24. Anticorpo monoclonal específico da AH-FAP da reivindicação 18 ou 19.
25. 25. Anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma 90G11D (ATCC HB 11724).
26. 26. Anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma 90F2D (ATCC HB 11725).
27. 27. Linhagem de células de hibridoma, produtora de um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 24.
28. 28. Linhagem de células de hibridoma 90G11D (ATCC HB 11724).
29. 29. Linhagem de células de hibridoma 90F2D (ATCC HB 11725).
30. 30. Substância que é um anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 24.
31. 31. Método para a purificação da enzima AH-FAP, constituída essencialmente pelos amino-ácidos 42 a 441 da SEQ ED NO:8, a partir de plasma, compreendendo esse método os passos seguintes: (a) isolar partículas de lipoproteínas de baixa densidade; (b) solubilizar as referidas partículas de lipoproteínas de baixa densidade numa solução tampão constituída por SCHAP 10 mM para se gerar uma primeira solução de enzima AH-FAP; (c) aplicar a referida primeira solução de enzima AH-FAP a uma coluna de permuta aniónica de tipo ‘DEAE’; (d) lavar a referida coluna de permuta aniónica de tipo ‘DEAE’, utilizando um tampão aproximadamente a pH 7,5 constituído por SCHAP 1 mM; (e) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de permuta aniónica de tipo ΌΕΑΕ’ em fracções, utilizando tampões ao valor aproximado de pH 7,5, constituídos por um gradiente de NaCl variando entre 0 e 0,5 M; (£) juntar as fracções, provenientes da eluição da referida coluna de permuta aniónica de tipo ‘DEAE’, que possuam actividade enzimática de AH-FAP; (g) ajustar a referida mistura de fracções activas provenientes da referida coluna de permuta aniónica de tipo ‘DEAE’ para SCHAP 10 mM para se gerar uma segunda solução de enzima AH-FAP; (h) aplicar a referida segunda solução de enzima AH-FAP a uma coluna de afinidade de ligando corante azul; (i) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de afinidade de ligando corante azul, utilizando um tampão constituído por SCHAP 10 mM e um sal caotrópico; (j) aplicar o produto da eluição proveniente da referida coluna de afinidade de ligando corante azul a uma coluna de afinidade de ligando de Cu; (k) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de afinidade de ligando de Cu, utilizando um tampão constituído por SCHAP 10 mM e imidazol; (l) submeter o produto da eluição da referida coluna de afinidade de ligando de Cu a um protocolo de EGPA-DSS; e (m) isolar a enzima AH-FAP, aproximadamente com 44 kDa, a partir do gel de poli-acrilamida com DSS.
32. 32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o tampão do passo (b) é constituído por Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM a pH 7,5; o tampão do passo (d) é constituído por Tris 25 mM-HCl, SCHAP 1 mM; a coluna do passo (h) é uma coluna de tipo ‘Blue 7í& Sepharose Fast Flow’; o tampão do passo (i) é constituído por Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM, KSCN 0,5 M a pH 7,5; a coluna do passo (j) é uma coluna de tipo ‘Cu Chelating Sepharose’; e o tampão do passo (k) é constituído por Tris 25 mM-HCl, SCHAP 10 mM, NaCl 0,5 M e imidazol 50 mM a pH 8,0.
33. 33. Método para purificar a enzima AH-FAP activa, constituída essencialmente pelos amino-ácidos 42 a 441 da SEQ ID NO:8, produzida por E. coli, compreendendo esse método os passos seguintes: (a) preparar um sobrenadante de centrifugação proveniente de E. coli Usadas, produtoras da enzima AH-FAP; (b) apficar o referido sobrenadante de centrifugação a uma coluna de afinidade de Ugando corante azul; (c) efectuar a eluição da enzima AH-FAP proveniente da referida coluna de afinidade de Ugando corante azul, utilizando um tampão constituído por SCHAP 10 mM e um sal caotrópico; (d) aplicar o referido produto de eluição proveniente da referida coluna de afinidade de Ugando corante azul a uma coluna de afinidade de Ugando de Cu; e (e) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de afinidade de Ugando de Cu, utilizando um tampão constituído por SCHAP 10 mM e imidazol.
34. 34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a coluna do passo (b) é uma coluna de tipo ‘Blue Sepharose Fast Flow’; o tampão do passo (c) é constituído por Tris 25 mM--HC1, SCHAP 10 mM, KSCN 0,5 M, a pH 7,5; a coluna do passo (d) é uma coluna de tipo ‘Cu Chelating Sepharose’; e o tampão do passo (e) é constituído por Tris 25 mM--HC1, SCHAP 10 mM, NaCl 0,5M, imidazol 100 mM a pH 7,5.
35. 35. Método para a purificação da enzima AH-FAP activa, constituída essencialmente pelos aminoácidos 42 a 441 da SEQ DD NO: 8, produzida por E. coli, compreendendo esse método os passos seguintes: (a) preparar um sobrenadante por centrifugação a partir de E. coli lisadas, produtoras da enzima AH-FAP; (b) diluir o referido sobrenadante de centrifugação num tampão de baixo valor de pH constituído por SCHAP 10 mM; (c) aplicar o referido sobrenadante de centrifugação diluído a uma coluna de permuta catiónica equilibrada ao valor aproximado de pH 7,5; (d) efectuar a eluição da enzima AH-FAP a partir da referida coluna de permuta catiónica, utilizando um sal 1 M; (e) elevar o valor do pH do referido produto de eluição proveniente da referida coluna de permuta catiónica e ajustar a concentração do sal do referido produto de eluição para um valor de cerca de 0,5 M; (f) aplicar o referido produto da eluição ajustado, proveniente da referida coluna de permuta catiónica, a uma coluna de afinidade de ligando corante azul; e (g) efectuar a eluição da enzima AH-FAP proveniente da referida coluna de afinidade de ligando corante azul, utilizando um tampão constituído pelo sal numa concentração entre cerca de 2 M e 3 M; e (h) efectuar a diálise do referido produto de eluição proveniente da referida coluna de afinidade de ligando corante azul, utilizando um tampão constituído por ‘Tween’ a
36. 36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o tampão do passo (b) é constituído por MES 25 mM, SCHAP 10 mM, EDTA 1 mM a pH 4,9; a coluna do passo (c) é uma coluna de tipo ‘S-Sepharose’ equilibrada com MES 25 mM, SCHAP 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM a pH 5,5; a eluição da enzima AH-FAP é efectuada no passo (d) utilizando NaCl 1 mM; o valor do pH do produto de eluição no passo (e) é ajustado para 7,5 utilizando a base Tris 2 M; a coluna do passo (f) é uma coluna de tipo ‘Sepharose’; o tampão do passo (g) é constituído por Tris 25 mM, SCHAP 10 mM, NaCl 3 M, EDTA 1 mM a pH 7,5; e o tampão no passo (h) é constituído por Tris 25 mM, NaCl 0,5 M, ‘Tween-80’ a 0,1%, apH 7,5.
37. 37. Método para a detecção da enzima AH-FAP no soro, o qual compreende o passo que consiste em fazer contactar soro com um ou vários anticorpos monoclonais específicos da AH-FAP, de acordo com uma qualquer das reivindicações 24 a 26, e em quantificar a quantidade de enzima AH-FAP ligada a esses anticorpos.
38. 38. Composição terapêutica que compreende a AH-FAP da reivindicação 19 e um diluente ou veículo fisiologicamente aceitável e facultativamente um outro agente anti-inflamatório.
39. 39. Enzima AH-FAP de acordo com a reivindicação 19, utilizável para melhorar estados inflamatórios patológicos, em especial para tratar um mamífero sensível ou que padeça de uma patologia mediada pelo FAP, mediante a administração da referida AH-FAP ao referido mamífero numa quantidade suficiente para complementar a actividade da AH-FAP endógena e para inactivar as quantidades patológicas de FAP no referido mamífero, e mais especificamente para tratar um mamífero sensível ou que padeça de pleurisia. asma, rinite ou eczema, mediante a administração da referida AH-FAP ao referido mamífero numa quantidade suficiente para complementar a actividade da AH-FAP endógena e para inactivar as quantidades patológicas de FAP no referido mamífero.
40. 40. Utilização da AH-FAP de acordo com a reivindicação 19, para a produção de um medicamento para tratar um mamífero sensível ou que padeça de uma patologia mediada pelo FAP, mediante a administração da referida AH-FAP ao referido mamífero numa quantidade suficiente para complementar a actividade da AH-FAP endógena e para inactivar as quantidades patológicas de FAP no referido mamífero.
41. 41. Utilização da AH-FAP de acordo com a reivindicação 19, para a produção de um medicamento para tratar um mamífero sensível ou que padeça de pleurisia, mediante a administração da referida AH-FAP ao referido mamífero numa quantidade suficiente para complementar a actividade da AH-FAP endógena e para inactivar as quantidades patológicas de FAP no referido mamífero.
42. 42. Utilização da AH-FAP de acordo com a reivindicação 19, para a produção de um medicamento para tratar um mamífero sensível ou que padeça de asma, mediante a administração da referida AH-FAP ao referido mamífero numa quantidade suficiente para complementar a actividade da AH-FAP endógena e para inactivar as quantidades patológicas de FAP no referido mamífero.
43. 43. Utilização da AH-FAP de acordo com a reivindicação 19, para a produção de um medicamento para tratar um mamífero sensível ou que padeça de rinite, mediante a 11 administração da referida AH-FAP ao referido mamífero numa quantidade suficiente para complementar a actividade da AH-FAP endógena e para inactivar as quantidades patológicas de FAP no referido mamífero.
44. 44. Utilização da AH-FAP de acordo com a reivindicação 19, para a produção de um medicamento para tratar um mamífero sensível ou que padeça de eczema, mediante a administração da referida AH-FAP ao referido mamífero numa quantidade suficiente para complementar a actividade da AH-FAP endógena e para inactivar as quantidades patológicas de FAP no referido mamífero.
45. 45. Método para a detecção de uma lesão genética no gene da AH-FAP humana, resultante de uma substituição de um resíduo valina por um resíduo fenilalanina no aminoácido 279 da enzima AH-FAP do plasma humano, constituído essencialmente pelos aminoácidos 42 a 441 da SEQ ED NO:8, o qual consiste em utilizar a análise do Polimorfismo do Comprimento do Fragmento de Restrição para diferenciar entre os alelos de tipo natural e os mutantes. Lisboa, 10 de Agosto de 2001