PT939821E

PT939821E - Fosfatidilinositol-3' -quinase regulada por g-beta-gama

Info

Publication number: PT939821E
Application number: PT97931459T
Authority: PT
Inventors: Sylvia Braselmann; Len Stephens; Phillip T Hawkins
Original assignee: Onyx Pharma Inc
Priority date: 1996-06-27
Filing date: 1997-06-26
Publication date: 2007-02-28
Also published as: CA2259143C; JP2000511062A; AU3508397A; EP1676918A2; EP0939821A2; EP0939821B1; CN1306576A; US5874273A; WO1997049818A2; US5859201A; AU722324B2; US5856132A; DE69736983T2; WO1997049818A3; US6017763A; EP1676918A3; ATE346154T1; DE69736983D1; CA2259143A1; US5869271A

Description

ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ DESCRIÇÃO "Fosfatidilinositol-3'-quinase regulada por G-beta-gama"

1. INTRODUÇÃO 0 presente invento refere-se a uma nova subunidade de uma enzima fosfoinositideo-30H-quinase regulada por proteína G isolada de células de linhagem hematopoiética que estão envolvidas nas vias de transdução de sinal celulares e à utilização desta nova subunidade no tratamento e diagnóstico de doença.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

As fosfoinositídeo-30H-quinases (PI3K) são uma vasta família de enzimas capazes de 3-fosforilação de pelo menos um dos fosfoinositídeos celulares (Whitman et al., 1988, Nature 332:644-646; Auger et al. r 1989, Cell 57:167-175). Encontram-se fosfoinositídeos 3-fosforilados em todas as células eucarióticas superiores. Um crescente corpo de evidências implica as PI3K e um produto lipídico desta enzima, fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifosfato (doravante "Ptdlns(3,4,5)P3") , como parte de um sistema de segundo mensageiro novo e importante em transdução de sinal celular. As componentes deste novo sistema de sinalização baseado em Ptdlns(3,4,5)P3 parecem ser independentes da via de sinalização previamente caracterizada baseada em fosfolípidos de inositol, na qual uma fosfoinositidase C (PIC) hidrolisa Ptdlns(4,5)P2 para libertar os mensageiros secundários estruturalmente distintos inositol-(1,4,5)-trifosfato (Ins(1,4,5)P3) e diacilglicerol.

Determinados agonistas extracelulares e factores de crescimento estimularão a actividade de PI3K intracelular e causam a acumulação intracelular rápida e transitória de Ptdlns(3,4,5)P3. Surpreendentemente, a estimulação de uma variedade de diferentes tipos de receptores de superfície celular, incluindo tirosina-quinases receptoras, receptores associados com a família src de tirosina-quinases não receptoras, factores de crescimento de citoquinas e receptores acoplados a proteína G, todos activarão membros da família 2 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ ΡΙ3Κ. (Revisto em Stephens et ai., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1179:27-75). Por exemplo, os receptores tirosina-quinase que, quando activados, resultam em acumulação aumentada de Ptdlns(3,4,5)P3 são o receptor de PDGF, o receptor de EGF, membros da família de receptores de FGF, o receptor de CSF-1, o receptor de insulina, o receptor de IGF-1 e o receptor de NGF. Os receptores associados à família src de tirosina-quinases não receptoras que estimulam acumulação de Ptdlns(3,4,5)P3 são o receptor de 11-2, o receptor de 11-3, o receptor de mlgM, o receptor de CD4, o receptor de CD2 e o receptor celular de CD3/T. Adicionalmente, o receptor de citoquina 11-4 e o receptor de trombina ligado a proteína G, o receptor de ATP e o receptor de fMLP, todos estimulam a actividade de uma PI3K, resultando em subsequente acumulação de Ptdlns(3,4,5)P3. Assim, parece que Ptdlns(3,4,5)P3 é um segundo mensageiro em vias de sinalização extremamente diversas. 0 suporte para a proposta para a actividade de PI3K e produção de Ptdlns(3,4,5)P3 ser uma via de transdução de sinal fisiologicamente relevante para estes diversos receptores provém, entre outros, de duas linhas diferentes de evidências experimentais: inibição da actividade de PI3K por metabolitos fúngicos e observações de associações directas da proteína. A wortmanina, um metabolito fúngico, inibe irreversivelmente a actividade de PI3K através de ligação covalente ao domínio catalítico desta enzima. A inibição da actividade de PI3K pela wortmanina elimina a resposta celular subsequente ao factor extracelular. Por exemplo, neutrófilos respondem à quimioquina fMet-Leu-Phe (fMLP) por estimulação de PI3K e sintetizando Ptdlns(3,4,5)P3. A síntese correlaciona-se com a activação da explosão respiratória ("respiratory burst") envolvida na destruição de neutrófilos de microrganismos invasores. 0 tratamento de neutrófilos com wortmanina evita a resposta de explosão respiratória induzida por fMLP. Thelen et ai., 1994, PNAS, USA 91:4960-4964. De facto, estas experiências com wortmanina, bem como outras evidências experimentais, demonstram que a actividade de PI3K em células de linhagem hematopoiética, particularmente neutrófilos, monócitos e outros tipos de leucócitos, está envolvida em muitas das respostas imunitárias sem memória associadas a inflamação aguda e crónica. 3 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

As enzimas ΡΙ3Κ interactuam directamente e podem ser co-purifiçadas com formas activadas de várias tirosina-quinases receptoras. Quando purificada, verificou-se que a PI3K associada a tirosina-quinase receptora consiste em heterodímeros de 170-200 kD (Otsu et al., 1991, Cell 65:91 — 104, Pons et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15:4453-4465, Inukai et al. , 1996, J. Biol. Chem. 2 71:5317-532 0) incluindo uma subunidade catalítica e uma unidade adaptadora (ou reguladora).

Descreveram-se e clonaram-se dois homólogos diferentes da subunidade catalítica, pllOa e ρΙΙΟβ. A subunidade catalítica, que liga wortmanina irreversivelmente, associa-se fortemente a um ou outro membros de uma pequena família de subunidades reguladora altamente relacionadas, ρ55α, ρ55Ρ1Κ, p85a e ρ85β, para formar os heterodímeros de 170-200 kD. As subunidades reguladoras conhecidas contêm uma vasta colecção de domínios de interacção proteína:proteína, incluindo dois domínios SH2 (Cantley et al., 1991, Cell 64:281-302).

Pensa-se que a presença de domínios SH2 é responsável pela ligação e estimulação de heterodímeros de PI3K a tirosina-quinases receptoras activadas. Os receptores activados são fosforilados em resíduos de tirosina chave dentro de sequências consensuais locais preferidas pelos domínios SH2 presentes nos adaptadores PI3K de 55-87 kD (Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778). Uma vez que o heterodímero de PI3K se ligue, activa directamente a subunidade catalítica PI3K (embora este efeito seja relativamente pequeno in vitro, Carpenter et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:9478-9483, Backer et al., 1992, EMBO J. 11:3469-3479) e transloca a PI3K citosólica para uma fonte do seu substrato fosfolípido. A combinação destes factores leva a um pico na produção de Ptdlns(3,4,5)P3. Evidentemente, estas isoformas de PI3K (ρ100α/ρ110β/ρ55α, p55PIK) parecem adaptadas estruturalmente para funcionar como transdutores de sinal dedicados a jusante de tirosina-quinases reguladas por receptor, de modo muito semelhante ao modo como a família τ de PI-PLC é regulada por tirosina-quinases sensíveis a receptor (Lee e Rhee, 1995, Current Biol. 7:193-189). 4 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

No entanto, a subfamília ρ110/ρ85 de ΡΙ3Κ não parece estar envolvida na produção de Ptdlns(3,4,5)P3 que pode ocorrer como um resultado de activação de receptores de superfície celular que utiliza GTPases heterotriméricas para transduzir os seus sinais (por exemplo, fMLP, PAF, ATP e trombina) . Estes tipos de receptores de superfície celular foram principalmente descritos em células de origem hematopoiética cuja activação está envolvida em respostas inflamatórias do sistema imunitário. Evidências recentes sugeriram que se encontra presente uma forma cromatograficamente distinta de PI3K sensível a wortmanina em células U937 e neutrófilos que possuem uma massa molecular relativa nativa de cerca de 220 kD (Stephens et ai., 1994, Cell 77:83-93). Esta actividade de PI3K pode ser estimulada especificamente por subunidades Θβγ, mas não por subunidades Ga-GTP. Foi também descrita uma actividade de PI3K semelhante numa linha celular de osteossarcoma (Morris et al. , 1995, Mol. Pharm. 48:532-539).

As plaquetas também contêm uma PI3K sensível a GPy, embora não seja claro se é um membro da família p85/pll0 PI3K (Thomason et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:16525-16528). Parece provável que esta PI3K sensível a 6βγ fracamente caracterizada possa ser responsável pela produção de Ptdlns(3,4,5)P3 em resposta a agonistas como ATP, fMLP etc.

Stoyanov et al., (1995) publicaram recentemente a clonagem e expressão de uma PI3K selectiva Ptdlns(4,5)P2 sensível a wortmanina, denominada ρΙΙΟγ, a partir de uma biblioteca de ADNc de medula óssea humana. ρΙΙΟγ foi amplificada por PCR utilizando iniciadores concebidos para terem como alvo PI3K potenciais, bem como centros catalíticos de Ptdlns4-quinase. É claramente diferente de pllOa e ρΙΙΟβ, dado que não contem, por exemplo, um domínio de ligação no terminal amino para um membro da família de adaptadores p85. Especulou-se que ρΙΙΟγ seja a actividade de PI3K a jusante dos receptores ligados a GTPase heterotrimérica, com base na sua sensibilidade tanto a subunidades Ga-GTP, como ΰβγ in vitro e na sua expressão em células derivadas de mielóide. No entanto, esta hipótese deixou várias questões por resolver relativas a evidências bioquímicas anteriores que indicaram que a PI3K que responde a 6βγ não foi estimulada por subunidades Ga-GTP e que possuía uma massa molecular muito maior, de cerca de 220 kD. 5 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Foi sugerido que os efeitos de subunidades ΰβγ em ρΙΙΟγ são mediados através de um possível domínio de homologia "pleckstrin" (PH) no terminal NH2. No entanto, com a descrição de um número crescente de efectores regulados por 6βγ, evidências crescentes sugerem que os domínios PH não representam um domínio de ligação Θβγ vastamente utilizado. Trabalho recente, utilizando um painel de péptidos relativamente pequenos com base nas sequências de domínios que se encontram apenas nas adenilato-ciclases activadas por Οβγ (AC 2 e 4) que bloqueiam especificamente activação de Θβγ ou inibição de vários efectores, sugeriu que pode haver alguns motivos para acreditar que as subunidades Θβγ contêm um domínio de activação de efector largamente utilizado. Além disso, as regiões em efectores diferentes que interactuam com este domínio de activação de efector apresentam similaridades de sequência significativas. Assim, um motivo (Gln-X-X-Glu-Arg) dentro do domínio em AC2 salientado por estes estudos de péptidos também aparece em regiões em canais de potássio e β-ARK já implicados na regulação por subunidades ΰβγ (Chen et al., 1995, Science 268:1166-1169). Contudo, este motivo não é replicado em todas as proteínas que se sabe serem reguladas pelas subunidades ΰβγ e consequentemente a análise de sequência não pode actualmente prever se a proteína será regulada por subunidades 6βγ.

Falta a identificação do mecanismo pelo qual a actividade de PI3K é activada por agonistas celulares que transduzem os seus sinais através de receptores ligados a proteína G. É importante salientar que a grande maioria dos agonistas que activam a explosão respiratória ("respiratory burst") de neutrófilos envolvidos na resposta inflamatória ligar-se-ão preferencialmente a receptores acoplados a proteína G, em vez de tirosina-quinases receptoras. Assim, é provável que o mecanismo pelo qual PI3K é regulada em resposta a este tipo de quimioquinas seja muito diferente da regulação por factores de crescimento que sinalizam através de tirosina-quinases. 0 presente invento dirige-se à resolução deste problema através da identificação, purificação e clonagem de uma forma de PI3K nova e específica que é activada pelas subunidades βγ de proteínas G triméricas. 6 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

3. RESUMO DO INVENTO Ο presente invento refere-se à determinação, identificação, purificação e clonagem de nucleótidos que codificam a subunidade plOl de PI3K regulada por proteína G trimérica, uma nova proteína que produz acumulação do segundo mensageiro Ptdlns(3,4,5)P3 em resposta a activação de receptores ligados a proteína G. Esta nova PI3K regulada por proteína G é constituída por uma subunidade catalítica, pl20, e uma subunidade reguladora, plOl. A subunidade catalítica pl20 partilha homologia de sequência de aminoácidos parcial com as subunidades catalíticas de PI3K, pllOa, ρΙΙΟβ e ρΙΙΟγ. Por outro lado, plOl é uma proteína completamente nova sem homologia identificável com qualquer outra sequência previamente disponível. Na ausência da subunidade reguladora plOl, as subunidades de proteína G activada induzem uma estimulação moderada de actividade catalítica pela subunidade catalítica pl20. No entanto, na presença da subunidade plOl, a actividade de PI3K da subunidade catalítica é estimulada mais de 100 vezes por proteínas G activadas.

Os ADNc que codificam plOl e p!20 porcinas e plOl e p!20 humanas foram clonados e sequenciados e são aqui descritos. Os ADNc de plOl e p!20 porcinos codificam proteínas de cerca de S77 aminoácidos e cerca de 1102 aminoácidos, respectivamente (figura 2 e figura 4) , enquanto que os ADNc de plOl e p!20 humanos codificam proteínas de cerca de 880 aminoácidos e cerca de 1102 aminoácidos, respectivamente (figura 11 e figura 13). Embora as sequências de aminoácidos das proteínas pl20 sejam homólogas às de outras subunidades catalíticas de PI3K conhecidas, os ADNc de pl20 aqui descritos diferem dos ADNc que codificam as subunidades catalíticas de PI3K conhecidas, particularmente, por exemplo, no terminal carboxilo (resíduos de aminoácidos 1075 a 1102). O produto de transcrição plOl encontra-se principalmente em células de linhagem hematopoiética. pl20 e outras proteínas de subunidade catalítica de PI3K parecem ter uma distribuição de tipo de tecido e célula bastante mais alargada. Notoriamente, a presença de uma actividade de PI3K sensível a proteína G trimérica só foi encontrada num número limitado de células de linhagem hematopoiética (por exemplo, neutrófilos, 7 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ plaquetas, etc.). Assim, a capacidade de activar enzimas PI3K em resposta a estimulação de receptores ligados a proteína G trimérica parece largamente dependente da presença da subunidade plOl. O invento abrange os seguintes nucleótidos, células hospedeiras que expressam tais nucleótidos e os produtos de expressão de tais nucleótidos: (a) nucleótidos que codificam proteínas plOl de mamífero, incluindo a plOl porcina e a plOl humana e os produtos génicos plOl, incluindo os produtos génicos porcino e humano; (b) nucleótidos que codificam porções de plOl que correspondem aos seus domínios funcionais e os produtos de polipéptido especificados por tais sequências de nucleótidos, incluindo entre outros os nucleótidos de plOl que codificam, por exemplo, o domínio de interacção Θβγ de plOl ou o domínio de associação de subunidade catalítica ou os resíduos de aminoácidos de plOl porcina que se estendem de cerca de 1 a 160, 80-120, 161 a 263, 264 a 414, 415 a 565, 566 a 706, 707-832 e/ou 833 a 877 ou os resíduos de aminoácidos de plOl humana que se estendem de cerca de 1 a 160, 80-120, 161 a 263, 264 a 416, 417 a 567, 568 a 709, 710-835 e/ou 836 a 880; (c) nucleótidos que codificam mutantes de plOl no qual todo ou parte de um dos domínios é eliminado ou alterado e os produtos de polipéptido especificados por tais sequências de nucleótidos, incluindo entre outros os mutantes de plOl em que os nucleótidos que codificam o domínio de interacção de proteína G ou o domínio de associação da subunidade catalítica ou os resíduos de aminoácidos de cerca de 1 a 160, 80-120, 161 a 263, 264 a 414, 415 a 565, 566 a 706, 707-832, e/ou 833 a 877 são eliminados; (d) nucleótidos que codificam proteínas de fusão contendo a proteína plOl ou um dos seus domínios (por exemplo, o domínio de interacção GPy ou o domínio de associação da subunidade catalítica ou os domínios descritos pelos resíduos de aminoácidos de cerca de I a 160, 80-120, 161 a 263, 264 a 414, 415 a 565, 566 a 706, 707-832 e/ou 833 a 877) fundidos a outro polipéptido.

Também são aqui descritos agonistas e antagonistas de PI3K regulada por proteína G, incluindo moléculas pequenas, moléculas grandes, proteínas plOl mutantes que competem com plOl nativa e anticorpos, bem como sequências de nucleótidos que podem ser utilizadas para inibir a expressão do gene pl01 8 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ (por exemplo, moléculas anti-sentido e ribozima e construções de substituição de gene ou de sequência reguladora) ou para aumentar a expressão de gene plOl (por exemplo, construções de expressão que colocam o gene plOl sob o controlo de um sistema de promotor forte) e células e animais transgénicos que expressam um transgene pl01 ou células e animais eliminados que não expressam plOl.

Além disso, o presente invento abrange métodos e composições para a avaliação de diagnóstico, tipagem e prognóstico de doenças do sistema imunitário, incluindo inflamação, e para a identificação de indivíduos com uma predisposição para tais doenças. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico de pl01 do invento podem ser utilizadas como sondas de hibridação de diagnóstico ou como iniciadores para a análise por PCR para diagnóstico para a identificação de mutações do gene pl01, variações alélicas e defeitos de regulação no gene pl01. 0 presente invento proporciona adicionalmente kits de diagnóstico para a prática de tais métodos.

Adicionalmente, o presente invento também se refere a métodos para a utilização dos produtos do gene plOl para a identificação de compostos que modulam, ou seja actuam como agonistas ou antagonistas, a expressão do gene de PI3K regulada por proteína G e ou a actividade do produto do gene pl01. Tais compostos podem ser utilizados como agentes para controlar doenças do sistema imunitário e nomeadamente como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças inflamatórias tais como artrite, choque séptico, síndrome da dificuldade respiratória aguda em adultos (ARDS), pneumonia, asma, alergias, lesão de reperfusão, aterosclerose, doença de Alzheimer e cancro.

Também são aqui descritos métodos e composições para o tratamento de doenças inflamatórias tais como artrite, choque séptico, síndrome da dificuldade respiratória aguda em adultos (ARDS), pneumonia, asma, alergias, lesão de reperfusão, aterosclerose, doença de Alzheimer e cancro. Tais métodos e composições são capazes de modular o nível de expressão do gene plOl e/ou o nível da actividade de produto do gene plOl. 9 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Este invento baseia-se, em parte, na revelação surpreendente de uma actividade de PI3K estimulada por proteína G em neutrófilos isolados; a purificação e caracterização desta actividade como uma proteína PI3K heterodimérica incluindo uma subunidade plOl e uma subunidade pl20; a identificação e clonagem de ADNc de plOl de bibliotecas preparadas de ARNm de neutrófilos porcinos, ARNm de monócitos humanos e ARNm de leucócitos humanos; a identificação e clonagem de ADNc de p!20 de bibliotecas preparadas de ARNm de neutrófilos porcinos e ARNm de leucócitos humanos; caracterização das novas sequências; e estudos de proteína plOl e pl20 expressas de modo recombinante isoladas em células de insectos, células U937 e células Cos-7.

3.1 DEFINIÇÕES

Tal como aqui utilizadas, as seguintes expressões, utilizadas quer no singular, quer no plural, terão os significados indicados: PI3K regulada por proteína G: refere-se a uma enzima PI3K cuja actividade é estimulada por proteínas G triméricas activadas tais como subunidades ΰβγ e/ou subunidades Ga-GTP. plOl: significa a subunidade reguladora da PI3K regulada por proteína G, também denominada subunidade adaptadora. plOl inclui moléculas que são homólogas a plOl ou que se ligam a pl20 e estimulam a actividade catalítica de PI3K em resposta a activação de proteínas G triméricas. As proteínas de fusão de plOl contendo um marcador Glu no terminal N (especificamente MEEEEFMPMPMEF) são aqui denominadas como proteínas de fusão (EE)101, enquanto que as proteínas de fusão plOl com um marcador epitópico myc no terminal N são aqui denominadas proteínas de fusão myclOl.

Nucleótidos ou sequências de codificação plOl: significa sequências de nucleótidos que codificam a proteína de subunidade reguladora plOl, polipéptido ou fragmentos de péptido de proteína plOl ou proteínas de fusão de plOl. As sequências de nucleótidos de plOl abrangem ADN, incluindo ADN genómico (por exemplo o gene plOl) ou ADNc ou ARN. 10 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ ρ120: significa a subunidade catalítica da PI3K regulada por proteína G. Os polipéptidos ou fragmentos de péptido de proteína pl20 são denominados polipéptidos pl20 ou péptidos pl20. As fusões de pl20 ou de polipéptidos ou fragmentos de péptido pl20 com uma proteína não relacionada são aqui denominadas proteínas de fusão de pl20. As proteínas de fusão (EE)120 têm um marcador glu MEEEEFMPMEFSS no terminal N. Equivalentes funcionais de pl20 referem-se a uma proteína de subunidade catalítica de PI3K que se liga à subunidade reguladora plOl com elevada afinidade in vivo ou in vitro. Outros equivalentes funcionais de pl20 são subunidades catalíticas homólogas de uma PI3K regulada por proteína G, tal como pll7.

Nucleótidos ou sequências de codificação de p!20: significam sequências de nucleótidos que codificam a proteína de subunidade catalítica pl20, polipéptidos ou fragmentos de péptidos de proteína pl20 ou proteínas de fusão de pl20. As sequências de nucleótidos de p!20 abrangem ADN, incluindo ADN genómico (por exemplo o gene pl20) ou ADNc ou ARN.

4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figuras ΙΑ, 1B, 1C e 1D. Sequência de nucleótidos da subunidade adaptadora de pl01 porcino. (SEQ ID NO:l)

Figura 2. Sequência de aminoácidos de plOl porcina deduzida. (SEQ ID NO:2) Os péptidos trípticos identificados por sequenciação de proteína encontram-se sublinhados com linha contínua.

Figuras 3A, 3B e 3C. Sequência de nucleótidos de subunidade catalítica p!20 porcina. (SEQ ID NO:3)

Figura 4. Sequência de subunidade catalítica pl20 porcina deduzida. (SEQ ID NO:4) Os péptidos trípticos identificados por sequenciação de proteína encontram-se sublinhados com linha contínua. A região de divergência da sequência de aminoácidos publicada de ρΙΙΟγ encontra-se sublinhada a tracejado. 11 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Figura 5. ΡΙ3Κ sensível a Θβγ em citosol de neutrófilos é diferente de PI3K p85/pll0. As alíquotas de cada uma das fracções derivadas de um perfil cromatográfico de Q-sepharose foram quer sujeitas a hibridação de "Western" e sondadas com anticorpos monoclonais αρ85α ou αρ85β e visualizadas com um segundo anticorpo ligado a HRP (painel superior na figura 5), quer incubadas com [3H]-17-hidroxi-wortmanina 100 nM, resolvidas por SDS-PAGE (acrilamida a 6% e fluorografadas (painel inferior na figura 5) . Eluiu-se actividade de PI3K sensível a Θβγ nas fracções 20-24.

Figura 6. O pico B após purificação com coluna Mini Q final contem uma actividade de PI3K sensível a Θβγ. O produto de purificação final da actividade de pico B foi analisado após isolamento de uma coluna Mini Q na presença e ausência de subunidades Θβγ (βγ) activadas, um péptido fosforilado na tirosina (péptido YP) , wortmanina e/ou subunidades Gai-GDP (oíí-GDP) .

Figura 7. Propriedades farmacológicas e de regulação de pl20 livre e PI3K pl01/pl20 expressas de modo recombinante em células Sf9. Os ensaios contendo quer pl01/pl20 7 nM, quer pl20 36 nM sozinha (concentrações finais) que foram incubadas com vários reagentes; NaF 10 mM e A1C13 30 μΜ (A/F) ; subunidades 6βγ (βγ) 1 μΜ; Ga-GDP 2 μΜ; wortmanina (W) 100 nM ou péptido fosforilado na tirosina (PY) 50 μΜ durante um total de 15 minutos (a 0°C) antes de iniciar os ensaios por adição de [γ32Ρ] -ATP; Quantificou-se [32P] incorporado em [32p] — Ptdlns(3,4,5)P3. Os dados apresentados são médias (n = 2).

Figura 8. plOl pode associar-se com uma actividade de PI3K estimulada por 6βγ em células U937. Transfectaram-se transitoriamente células U937 com vectores de expressão de mamífero que codificam (EE)120 ou (EE)101, co-transfectadas em combinação com vectores de expressão de mamífero que codificam myclOl, mycl20 ou uma proteína de fusão myc de controlo irrelevante, tal como indicado. Utilizou-se um total de 40 pg de ADN vector. Após co-transfecção, lisaram-se as células, pré-lavaram-se e imunoprecipitaram-se com proteína G-Sepharose reticulada covalentemente com anticorpo monoclonal oí-(EE), tal como descrito mais detalhadamente nos presentes exemplos. Os imunoprecipitados resultantes foram lavados e ensaiou-se a 12 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ actividade de ΡΙ3Κ activada por Θβγ (1 μΜ, concentração final). A actividade de PI3K detectada em imunoprecipitados de células transfectadas com proteína marcada (EE) irrelevante, que com ou sem Θβγ, foi subtraída dos dados apresentados (estes são médias de 1896 dpm e 2862 dpm na ausência e na presença de ΰβγ, respectivamente). Transfecções paralelas marcadas com [35S]-metionina demonstraram que a quantidade de [35S]-pl01 e [35S]-pl20 nos imunoprecipitados diminuiu 40% quando estas foram co-transfectadas (dados não apresentados).

Figura 9. Regulação de pl01/pl20 por Θβγ in vivo. Tranfectaram-se células Cos-7 com vectores de expressão de mamífero que codificam a subunidade Θβγ ("βιγ2Μ), plOl ("101") e/ou pl20 ("120"), tal como indicado. Após 48 horas de expressão transitória, sujeitaram-se as células de cada transfecção quer a hibridação de "Western" para determinar a "Expressão Relativa", quer ensaiadas para a acumulação de Ptdlns(3,4,5)P3 (barras sombreadas). Para a hibridação de "Western", sondaram-se as amostras com um anticorpo monoclonal a-(myc) para quantificar a expressão das várias proteínas marcadas (myc). Os resultados apresentam-se relativamente à expressão obtida na presença de todos os 4 vectores chave; os níveis absolutos de (myc)-pl20 e (myc)-plOl foram muito similares e cerca de lOx maiores do que o de (myc)-Y2. Marcaram-se lotes paralelos de células com [32P]-Pi; após 90 minutos, extraíram-se os lípidos, desacilaram-se e resolveram-se os grupos de cabeça solúveis em água por HPLC de permuta aniónica e quantificaram-se por contagem de cintilações em líquido. Os dados apresentados são médias (n=2) +/- gamas. Os dados para [32P]-Ptdlns(3,4,5)P3 são superiores ao controlo de ADN irrelevante (972 ± 41 dpm).

Figuras 10A e 10B. Sequência de nucleótidos da subunidade adaptadora de plOl humana. (SEQ ID NO:11)

Figura 11. Sequência de aminoácidos de plOl humana deduzida. (SEQ ID NO:12)

Figuras 12A e 12B. Sequência de nucleótidos da subunidade catalítica pl20 humana. (SEQ ID NO:13) 13 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Figura 13. Sequência da subunidade catalítica pl20 humana deduzida. (SEQ ID NO:14)

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento refere-se à identificação, purificação e clonagem de uma subunidade plOl de uma forma específica de PI3K que é activada pelas subunidades βγ de proteínas G triméricas. plOl, aqui descrita pela primeira vez, é uma nova subunidade de PI3K regulada por proteína G. Descreve-se aqui também a identificação, clonagem e sequência correcta de pl20, a subunidade catalítica de PI3K regulada por proteína G trimérica.

As PI3K são enzimas que fosforilam fosfatidilinositóis na posição 3d para gerar a molécula de sinalização intracelular Ptdlns(3,4,5)P3. Embora se tenha demonstrado que as PI3K são induzidas em vários tipos de células por estimulação de receptores de tirosina-quinase, as PI3K que são activadas por receptores ligados a proteína G trimérica só foram detectadas num número limitado de células de linhagem hematopoiética tais como plaquetas, monócitos e leucócitos. Curiosamente, a acumulação de Ptdlns(3,4,5)P3 nestas células está associada a muitas respostas imunitárias envolvidas em inflamação aguda e crónica. Por exemplo, os neutrófilos são activados pela quimioquina fMLP, entre outros, que é libertada em resposta a infecção por microrganismos. Este agonista liga-se a um receptor associado a proteína G sensível a toxina de pertussis e activa a explosão respiratória de neutrófilos, resultando na produção de superóxido e citotoxicidade. A resposta de explosão respiratória correlaciona-se com um aumento rápido e transitório da actividade intracelular de PI3K.

Estudos em neutrófilos demonstram que a wortmanina, que inibe selectivamente a componente catalítica de PI3K, causa uma paragem da produção de superóxido. Dado que a grande maioria dos agonistas que activam esta explosão respiratória se ligam a receptores ligados a proteína G, a actividade de PI3K regulada por proteína G representa um candidato para uma via efectora dominante cuja inibição reduzirá os efeitos celulares destrutivos de inflamação. Contudo, wortmanina não é um inibidor clinicamente adequado desta via, dado que 14 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ wortmanina inibe todas as actividades catalíticas de PI3K, incluindo as envolvidas noutras vias celulares, tais como factores de crescimento.

Relata-se aqui a constatação que a PI3K regulada por proteína G é composta por duas subunidades: a subunidade catalítica (ρΙΙΟγ, pll7 ou pl20); e a subunidade reguladora plOl. A capacidade de PI3K responder a receptores de superfície celular que estimulam a libertação de subunidades Θβγ de proteínas G triméricas activadas é largamente dependente da presença da subunidade reguladora plOl. Embora as subunidades catalíticas apresentem uma pequena estimulação (aproximadamente 1,7 vezes) de actividade de PI3K in vitro na presença de subunidades ΰβγ, a adição de proteínas plOl aumentará a estimulação ΰβγ de actividade de PI3K 100 vezes. A neutralização de plOl, remoção de plOl ou interferência da ligação de plOl com os seus parceiros de ligação tornará as células incapazes de gerar níveis altamente aumentados do sinal intracelular Ptdlns(3,4,5)P3 em resposta a subunidades 6βγ activadas. Assim, a distribuição limitada da subunidade plOl em células derivadas de medula óssea parece ser o factor crítico na especificidade de tipo celular desta resposta. Além disso, plOl não apresenta homologias significativas com quaisquer outras sequências identificadas. Esta constatação torna plOl e o complexo pl01/pl20, o alvo de escolha para inibir, activar ou modular PI3K activada por proteína G com efeitos não específicos mínimos. O presente pedido também descreve a utilização de nucleótidos de plOl e nucleótidos de pl20. Proteínas e péptidos plOl e pl20, bem como anticorpos para plOl e pl20 (que podem, por exemplo, actuar como agonistas ou antagonistas de plOl ou pl20), antagonistas que inibem a actividade ou expressão de PI3K activada por proteína G ou agonistas que activam actividade de PI3K activada por proteína G ou aumentam a sua expressão no tratamento de doenças de activação de células de linhagem hematopoiética, incluindo, entre outras, respostas imunitárias associadas a inflamação aguda e crónica em animais, tais como seres humanos. Por exemplo, os antagonistas de PI3K activada por 6βγ serão úteis no tratamento de artrite, incluindo artrite reumatóide, choque séptico, síndrome da dificuldade respiratória do adulto (ARDS) 15 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ aguda, pneumonia, asma e outras doenças pulmonares, alergias, lesão de reperfusão, aterosclerose e outras doenças cardiovasculares, doença de Alzheimer e cancro, para citar apenas algumas doenças inflamatórias. Além disso, os nucleótidos de plOl e as subunidades reguladoras plOl, bem como os nucleótidos de p!20 e as subunidades catalíticas pl20, são úteis para a identificação de compostos eficazes no tratamento de doenças de activação celular de linhagem hematopoiética envolvendo PI3K activadas por proteína G.

Adicionalmente, o invento abrange a utilização de nucleótidos de plOl, proteínas e péptidos plOl, bem como anticorpos para plOl no diagnóstico de doenças de activação de células de linhagem hematopoiética. 0 diagnóstico de uma anomalia da subunidade reguladora plOl num doente ou uma anomalia na via de transdução de sinal de PI3K activada por proteína G também auxiliará na concepção de um tratamento ou regime terapêutico adequado.

Nomeadamente, o invento descrito nas subsecções infra, abrange a subunidade reguladora plOl, polipéptidos ou péptidos correspondentes aos domínios funcionais da subunidade reguladora plOl (por exemplo, o domínio de associação da subunidade catalítica ou o domínio que interactua com as proteínas G activadas), subunidades reguladoras plOl mutadas, truncadas ou eliminadas (por exemplo, uma subunidade reguladora plOl com um ou mais domínios funcionais ou suas porções eliminados), proteínas de fusão de subunidade reguladora plOl (por exemplo, uma subunidade reguladora plOl ou um domínio funcional de subunidade reguladora plOl, fundida a uma proteína ou péptido não relacionado, tal como um marcador epitópico, ou seja o epítopo myc), sequências de nucleótidos que codificam tais produtos e sistemas de expressão de células hospedeiras que podem produzir tais produtos de subunidade reguladora plOl.

Adicionalmente, o presente pedido descreve proteínas de subunidade catalítica pl20, polipéptidos, domínios funcionais da subunidade pl20 (por exemplo, o domínio catalítico), proteínas de subunidade pl20 mutadas, truncadas ou eliminadas, proteínas de fusão de pl20, sequências de nucleótidos que codificam tais produtos e sistemas de expressão de células 16 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ hospedeiras que podem produzir tais produtos de subunidade catalítica pl20. O invento também abrange anticorpos e anticorpos anti-idiotípicos (incluindo fragmentos Fab) , antagonistas e agonistas da PI3K activada por proteína G, bem como compostos ou construções de nucleótidos que inibem a expressão do gene plOl (inibidores de factor de transcrição, moléculas anti-sentido e de ribozima ou gene ou construções de substituição de sequência reguladora) ou promovem expressão de subunidade reguladora plOl (por exemplo, construções de expressão nas quais as sequências de codificação de plOl estão associadas operacionalmente com elementos de controlo de expressão tais como promotores, promotor/facilitadores, etc.)· 0 invento também se refere a células hospedeiras e animais geneticamente modificados para expressar a subunidade reguladora plOl humana (ou seus mutantes) ou para inibir ou eliminar a expressão da subunidade reguladora plOl endógena do animal.

Adicionalmente, o invento abrange particularmente antagonistas que evitam a associação das subunidades reguladoras plOl com os seus parceiros de ligação, incluindo pl20 e outras proteínas de subunidade catalítica PI3K, tais como pll7 e ρΙΙΟγ, bem como proteínas G triméricas activadas, incluindo subunidades 6βγ.

As proteínas ou péptidos de subunidade reguladora plOl, proteínas de fusão de subunidade reguladora plOl, sequências de nucleótidos de plOl, anticorpos, antagonistas e agonistas podem ser úteis para a detecção de subunidades reguladoras plOl mutantes ou subunidades reguladoras plOl expressas de modo inadequado, para o diagnóstico de doenças imunitárias. As proteínas ou péptidos de subunidade plOl e pl20, proteínas de fusão de subunidade plOl e pl20, sequências de nucleótidos de pl01 e p!20, sistemas de expressão de células hospedeiras, anticorpos, antagonistas, agonistas e células e animais geneticamente modificados podem ser utilizados para rastreio de fármacos eficazes no tratamento de tais doenças imunitárias. A utilização de células e/ou animais hospedeiros geneticamente modificados pode proporcionar uma vantagem, dado que tais sistemas permitem não só a identificação de compostos que se ligam à subunidade reguladora plOl, mas também podem 17 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ identificar compostos que afectam o sinal transduzido pela subunidade reguladora plOl activada, especificamente, a produção da molécula de sinalização intracelular Ptdlns (3,4, 5) P3 .

Finalmente, os produtos de proteína e os produtos de proteína de fusão de subunidade reguladora plOl, anticorpos e anticorpos anti-idiotípicos (incluindo fragmentos Fab) , antagonistas ou agonistas (incluindo compostos que modulam transdução de sinal que podem actuar em alvos a jusante na via de transdução de sinal da subunidade reguladora plOl) podem ser utilizados para terapia de tais doenças. Por exemplo, construções de nucleótidos que codificam subunidades reguladoras plOl funcionais, subunidades reguladoras plOl mutantes, bem como moléculas anti-sentido e de ribozima podem ser utilizadas em abordagens de "terapia génica" para a modulação da expressão e/ou actividade da subunidade reguladora plOl, no tratamento de doenças de activação de células de linhagem hematopoiética. Assim, o invento também abrange formulações e métodos farmacêuticos para o tratamento de doenças de activação de células de linhagem hematopoiética. 0 invento baseia-se, em parte, na revelação surpreendente de novas enzimas PI3K em neutrófilos porcinos. Tal como outras proteínas PI3K, estas enzimas 3-fosforilam substratos Ptdlns, PtdIns4P e Ptdlns(4,5)P2 e foram completamente inibidas por wortmanina 100 nM. No entanto, contrariamente aos complexos de proteína p85/pl01 de PI3K previamente descritos, a actividade de PI3K foi estimulada mais de 100 vezes por incubação com as subunidades Θβγ. A adição de subunidades Ga-GDP poderia inibir esta activação 6βγ. Além disso, a actividade de PI3K não foi estimulada por péptidos fosforilados em tirosina. Quando purificados, foram identificados dois complexos de proteína heterodimérica diferentes: um complexo pll7/pl01 e um complexo pl20/pl01. A sequenciação de péptido revelou que a proteína plOl era idêntica em cada complexo. As proteínas pl20 e pll7 eram homólogas excepto no terminal amino (consultar os exemplos infra). Clonaram-se então ADNc de plOl e p!20 porcinas utilizando sondas degeneradas com base na sequência de péptido para rastrear uma biblioteca de expressão de ADNc sintetizada de ARN de neutrófilo porcino. Clonaram-se plOl e p!20 humanos utilizando sondas derivadas de sequências de ADNc 18 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ porcino para rastrear bibliotecas de ADNc de monócitos e leucócitos humanos. Enquanto que a análise de sequências das subunidades humanas e porcinas revelou que as proteínas pl20 são homólogas a subunidades catalíticas PI3K previamente clonadas (embora difiram significativamente na extremidade do terminal carboxilo), as proteínas plOl não estão relacionadas com qualquer sequência nas bases de dados. A comparação das sequências de aminoácidos dos homólogos porcino e humano de pl 01 e p!20 revela um alto grau de conservação entre as duas espécies. Este alto grau de conservação entre as duas espécies de mamíferos sugere que provavelmente existe um grau de conservação semelhante entre espécies de mamíferos em geral. Da mesma forma que as sequências porcinas foram utilizadas para clonar os seus homólogos humanos, um perito na arte pode clonar homólogos de pl01 e p!20 de outras espécies de mamíferos utilizando as sequências humanas e/ou porcinas reveladas e os métodos descritos neste fascículo.

As experiências aqui descritas que expressam proteínas de fusão de plOl e/ou pl20 em células de insecto demonstraram que plOl se liga fortemente a pl20 numa estequiometria molar 1:1. A pl20 livre purificada apresenta actividade de PI3K que foi insensível à presença de subunidades Ga e péptidos com tirosina fosforilada e apenas moderadamente estimulada por subunidades Οβγ. Contudo, quando ligada a plOl, a actividade de PI3K de pl20 foi estimulada 100 vezes pela presença de subunidades ΰβγ. Quando plOl foi expressa sozinha em células de insecto, plOl não apresentou actividade de PI3K.

Ocorreu um resultado interessante quando plOl foi expressa como uma proteína de fusão marcada em células U937 humanas. Quando esta plOl porcina expressa de modo recombinante foi imunoprecipitada através do marcador de proteína de fusão, estes imunoprecipitados não continham actividade de PI3K regulada por proteína G. A co-expressão de pl20 com plOl diminuiu ligeiramente a quantidade de actividade de PI3K que podia ser imunoprecipitada. Estes resultados indicaram que as células U937 humanas continham uma subunidade catalítica PI3K que pode ligar-se e ser activada pela subunidade reguladora plOl porcina. Estes resultados demonstram que conjuntamente 19 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ com as suas sequências de aminoácidos altamente conservadas, os homólogos de diferentes espécies de mamíferos se assemelham entre si funcional e estruturalmente.

Adicionalmente, efectuaram-se transfecções transitórias em células Cos-7, que normalmente não estimulam actividade de PI3K em resposta a proteínas G activadas, com construções que codificam subunidades plOl, pl20 e/ou ΰβγ. A transfecção de uma construção que expressa pl20 apenas produziu aumentos significativos nos níveis de Ptdlns(3,4,5)P3 celular de uma forma dependente de ΰβγ quando co-expressa na presença de plOl.

Descrevem-se vários aspectos do invento em maior detalhe nas subsecções infra. 5.1 OS GENES plOl E p!20 A sequência de ADNc (SEQ ID NO:l) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO:2) da subunidade reguladora plOl porcina apresentam-se nas figuras 1 e 2, respectivamente. Ocorre uma variação alélica relativamente comum no resíduo de aminoácido 483 no quadro de leitura aberto; uma serina pode ser substituída por uma glicina nesta posição. A sequência de ADNc (SEQ ID NO: 11) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO:12) da subunidade de regulação plOl humana apresentam-se nas figuras 10 e 11, respectivamente.

Pensa-se que a sequência de nucleótidos que codifica os primeiros 733 aminoácidos da subunidade reguladora plOl porcina, correspondente aos primeiros 736 aminoácidos da subunidade humana, é suficiente para ligar a subunidade catalítica. Contudo, sem os 145 aminoácidos do terminal carboxilo, esta plOl truncada ligada a pl20 não estimulará actividade de PI3K em resposta a subunidades ΰβγ. Assim, pensa-se que o domínio de associação de subunidade catalítica está contido dentro dos primeiros 732 aminoácidos (735 para a humana) e os aminoácidos do terminal carboxilo 733 a 877 (736 a 880 para a humana) poderão estar envolvidos na resposta a subunidades ΰβγ. 20 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Outros domínios de plOl porcina são descritos pelos resíduos de aminoácidos de cerca de 1 a 160, 80-120, 161 a 263, 264 a 414, 415 a 565, 566 a 706, 707-832 e/ou 833 a 877. Os domínios correspondentes de plOl humana são descritos pelos resíduos de aminoácidos de cerca de 1 a 160, 80-120, 161 a 263, 264 a 416, 417 a 567, 568 a 709, 710-835 e/ou 836 a 880. As sequências de nucleótidos que codificam os resíduos de aminoácido de cerca de 161 a 263 definem um domínio de homologia "pleckstrin" ("PH") (PROSITE: PS5 0 0 03) . Os domínios PH podem estar envolvidos na ligação de proteínas a subunidades ΰβγ (Touhara et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:10217) e a fosfolípidos membranares (consultar Shaw, 1996, Bioessays 18:35-46). Assim, o domínio PH de plOl pode estar envolvido em ambos estes eventos.

As sequências de nucleótidos que codificam os aminoácidos 1 a 160 de plOl podem ser responsáveis pela ligação à subunidade catalítica pl20. Quando se analisa esta região da proteína plOl relativamente à estrutura secundária, prevê-se que tenha uma estrutura em hélice α/folha β alternada auto-contida. Dentro desta estrutura verifica-se homologia com um "domínio WW" (Staub et al., 1996, Structure 4:495-499 e TIBS 21:161-163). Este domínio WW pode ligar-se a um domínio rico em prolina encontrado no terminal N da proteína pl20 (resíduos 310 a 315) . Assim, o domínio WW de plOl pode estar envolvido na mediação da interacção entre a subunidade reguladora e a subunidade catalítica. A sequência de ADNc (SEQ ID NO: 3) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO:4) de pl20 porcina apresentam-se nas figuras 3 e 4, respectivamente. A sequência de ADNc (SEQ ID NO: 13) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO:14) de pl20 humana apresentam-se nas figuras 12 e 13, respectivamente. Encontra-se presente um local de clivagem de trombina críptico após aproximadamente os primeiros 40 resíduos de aminoácidos. A proteína pl20 truncada que não contém estes aproximadamente 40 resíduos do terminal amino é ainda capaz de ligar plOl, mas a actividade de PI3K é diminuída aproximadamente 20 a 30%. Por outras palavras, uma proteína contendo a sequência de aminoácidos da secção de SEQ ID NO: 4 (sequência de aminoácidos deduzida de pl20 porcina) que se estende desde cerca do resíduo de aminoácido 41 ao 21 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ resíduo 1102 mantém a funcionalidade de pl20 completa. Com base no alto grau de homologia de sequência entre pl20 porcina e humana, uma proteína apresentando a sequência de aminoácidos da secção de SEQ ID NO:14 (sequência de aminoácidos deduzida de pl20 humana) que se estende desde cerca do resíduo desde cerca do aminoácido 41 ao resíduo 1102 manteria também a funcionalidade de pl20 completa. Embora a proteína pl20 seja altamente homóloga à proteína ρΙΙΟγ previamente clonada relatada por Stoyanov et ai. (1995), a extremidade do terminal C de pl20 difere da proteína ρΙΙΟγ relatada no resíduo de aminoácido 1075; assim, os últimos 28 resíduos de aminoácidos de pl20 não foram publicados em relatos de qualquer proteína homóloga. Tal como supramencionado, os nucleótidos que codificam uma região rica em prolina, incluindo os resíduos de pl20 310 a 315, podem estar envolvidos na interacção entre pl20 e plOl. Adicionalmente, os nucleótidos que codificam os resíduos de aminoácidos de pl20 desde cerca de 173 a 302 definem um domínio PH fraco que pode ser um candidato para ligação a membrana e/ou interacção da subunidade Οβγ do complexo pl01/pl20.

Os dados apresentados nos exemplos de trabalho infra, demonstram que o ADNc de p!20 codifica a subunidade catalítica de PI3K activada por Θβγ· O ADNc de plOl codifica uma nova proteína de subunidade reguladora que se liga à subunidade pl20. Este heterodímero 3-fosforila Ptdlns, PtdIns4P e Ptdlns(4,5)P2 em resposta a activação de receptores ligados a proteína G trimérica.

As sequências de nucleótidos de plOl do invento incluem: (a) a sequência de ADN apresentada na figura 1 ou figura 10 ou contida no clone de ADNc pCMV3mycpl01, tal como depositado em American Type Culture Collection (ATCC) sob o número de acesso 97636; (b) sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na figura 2 ou figura 11 ou a sequência de aminoácidos da subunidade reguladora plOl codificada pelo clone de ADNc pCMV3mycpl01, tal como depositado em ATCC; (c) qualquer sequência de nucleótidos que híbrida com o complementar da sequência de ADN apresentada na figura 1 ou figura 10 ou contida no clone de ADNc pCMV3mycpl01, tal como depositado em ATCC em condições altamente rigorosas, por exemplo, hibridação a ADN ligado ao 22 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ filtro em NaHP04 0,5 Μ, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 7%, EDTA 1 mM, a 65°C e lavagem com 0, lx SSC/SDS a 0,1% a 68°C (Ausubel F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., e John Wiley & sons, Inc., Nova Iorque, em p. 2.10.3) e codifica um produto génico funcionalmente equivalente; e (d) qualquer sequência de nucleótidos que hibrida com o complementar das sequências de ADN que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na figura 1 ou figura 10 ou contida no clone de ADNc pCMV3mycpl01, tal como depositado em ATCC, em condições menos rigorosas, tais como condições de rigor moderado, por exemplo, lavagem em 0,2x SSC/SDS a 0,1%, a 42°C (Ausubel et al., 1989, supra), codificam porém ainda um produto génico de plOl equivalente funcionalmente. Os equivalentes funcionais da subunidade reguladora plOl incluem subunidade reguladora plOl de ocorrência natural presentes em outras espécies e subunidades reguladoras plOl mutantes, quer de ocorrência natural ou geneticamente modificadas que mantêm pelo menos algumas das actividades funcionais de plOl (ou seja, a ligação à subunidade catalítica pl20 ou pll7, estimulação de actividade catalítica em resposta a subunidades GPy e/ou interacção com subunidades GPy) . 0 invento inclui também variantes degeneradas das sequências (a) a (d). O invento também inclui moléculas de ácido nucleico, de preferência moléculas de ADN, que hibridam, e portanto são complementares, com sequências de nucleótidos (a) a (d) do parágrafo anterior. Tais condições de hibridação podem ser altamente rigorosas ou de menor rigor, tal como descrito supra. Nos casos em que as moléculas de ácido nucleico são desoxioligonucleótidos ("oligos"), as condições altamente rigorosas podem referir-se, por exemplo, a lavagem com 6x SSC/pirofosfato de sódio a 0,05%, a 37°C (para oligos de 14 bases), 48°C (para oligos de 17 bases), 55°C (para oligos de 20 bases) e 60°C (para oligos de 23 bases). Estas moléculas de ácido nucleico podem codificar ou actuar como moléculas anti-sentido de pl01 úteis, por exemplo, na regulação do gene pl01 (para e/ou como iniciadores anti-sentido em reacções de amplificação de sequências de ácido nucleico do gene pl01). Relativamente a regulação do gene pl01, tais técnicas podem ser utilizadas para regular, por exemplo, respostas imunitárias inflamatórias. Além disso, tais sequências podem 23 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ ser utilizadas como parte de ribozima e/ou sequências em hélice tripla, também úteis para regulação do gene plOl. Ainda adicionalmente, tais moléculas podem ser utilizadas como componentes de métodos de diagnóstico em que, por exemplo, a presença de um determinado alelo de plOl responsável por causar uma resposta inflamatória, tal como artrite, pode ser detectada.

Além das sequências de nucleótidos de plOl descritas supra, podem ser identificados e facilmente isolados ADNc ou sequências de gene plOl completos presentes nas mesmas espécies e/ou homólogos do gene plOl presentes noutras espécies, sem experiências desnecessárias, através de técnicas de biologia molecular bem conhecidas na arte. As evidências experimentais aqui descritas indicam que as proteínas plOl são conservadas em diferentes espécies de mamíferos. Por exemplo, clonou-se plOl humano de bibliotecas de monócitos e leucócitos utilizando sondas derivadas da sequência de ADNc de plOl porcino e verificou-se que as sequências de aminoácidos deduzidas humana e porcina eram altamente conservadas. A similaridade estrutural e funcional dos dois homólogos é evidenciada por experiências que demonstram que quando se expressou plOl porcino em células U937, a plOl porcina se liga a um homólogo humano da subunidade catalítica. Adicionalmente, os membros da família de proteínas PI3K reguladas por tirosina-quinase, por exemplo a PI3K pll0/p85, são também conservadas entre diferentes espécies de mamíferos. Assim, podem isolar-se homólogos de pl01 e p!20 de várias células de mamífero que se saiba ou suspeite que contenham uma PI3K regulada por proteína G trimérica, particularmente células de origem hematopoiética, e mais particularmente plaquetas, monócitos, leucócitos, osteoclastos e neutrófilos. A identificação de homólogos de plOl em espécies relacionadas pode ser útil para desenvolver sistemas modelo animais mais estreitamente relacionados com humanos, com objectivos de encontrar novos fármacos. Por exemplo, podem rastrear-se bibliotecas de expressão de ADNc sintetizadas de ARNm de neutrófilos derivados do organismo de interesse utilizando subunidade catalítica marcada derivada dessa espécie, por exemplo, uma proteína de fusão de subunidade catalítica pl20, pll7 ou ρΙΙΟγ. Alternativamente, tais 24 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ bibliotecas de ADNc ou bibliotecas de ADN genómico derivadas do organismo de interesse podem ser rastreadas por hibridação utilizando os nucleótidos aqui descritos como sondas de hibridação ou amplificação. Além disso, podem também identificar-se através de técnicas semelhantes genes noutros locais genéticos dentro do genoma que codificam proteínas que apresentam elevada homologia com um ou mais domínios do produto génico de plOl. No caso de bibliotecas de ADNc, tais técnicas de rastreio podem identificar clones derivados de produtos de transcrição com splicing alternativo na mesma espécie ou em espécies diferentes. 0 rastreio pode ser por hibridação em filtro, utilizando filtros em duplicado. A sonda marcada pode conter pelo menos 15-30 pares de bases da sequência de nucleótidos de plOl humana ou porcina, tal como apresentada nas figuras 1 e 10, respectivamente. As condições de lavagem de hibridação utilizadas devem ser de baixo rigor quando a biblioteca de ADNc é derivada de um organismo diferente do tipo de organismo do qual se derivou a sequência marcada. Relativamente à clonagem de um homólogo de pl01 de mamífero, utilizando sondas de plOl porcinas e/ou humanas, por exemplo, a hibridação pode, por exemplo, ser efectuada a 65°C durante a noite num tampão de Church (SDS a 7%, NaHP04 250 mM, EDTA 2 μΜ, BSA a 1%). As lavagens podem ser efectuadas com 2X SSC, SDS a 0,1% a 65°C e seguidamente 0,1X SSC, SDS a 0,1% a 65°C.

As condições de baixo rigor são bem conhecidas dos peritos na arte e variarão de forma previsível dependendo dos organismos específicos dos quais derivam a biblioteca e as sequências marcadas. Para orientação sobre tais condições consultar, por exemplo, Sambrook et al. , 1989, Molecular

Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; e Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular

Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.

Alternativamente, a sonda nucleotídica de pl 01 marcada pode ser utilizada para rastrear uma biblioteca genómica derivada do organismo de interesse, uma vez mais utilizando condições de rigor adequadas. A identificação e caracterização de clones genómicos humanos são úteis para conceber ensaios de 25 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ diagnóstico e protocolos clínicos para o tratamento de doenças de activação de células de linhagem hematopoiética em doentes humanos. Por exemplo, podem utilizar-se sequências derivadas de regiões adjacentes aos limites de intrão/exão do gene humano para conceber iniciadores para utilização em ensaios de amplificação para detectar mutações dentro dos exões, intrões, locais de splicing (por exemplo locais de aceitador e/ou dador de splicing), etc., que podem ser utilizados em diagnóstico.

Além disso, pode isolar-se um homólogo do gene pl 01 a partir do ácido nucleico do organismo de interesse efectuando PCR utilizando dois conjuntos de oligonucleótidos iniciadores degenerados concebidos com base nas sequências de aminoácidos dentro do produto génico de plOl, aqui revelado. 0 molde para a reacção pode ser ADNc obtido por transcrição reversa de ARNm preparado de, por exemplo, linhas celulares ou tipos de células humanas ou não humanas, tais como neutrófilos, que se sabe ou suspeita que expressam um alelo do gene plOl. 0 produto de PCR pode ser subclonado e sequenciado para assegurar que as sequências amplificadas representam as sequências de um gene plOl. 0 fragmento de PCR pode então ser utilizado para isolar um clone de ADNc completo por vários métodos. Por exemplo, o fragmento amplificado pode ser marcado e utilizado para rastrear uma biblioteca de ADNc, tal como uma biblioteca de ADNc de bacteriófago. Alternativamente, o fragmento marcado pode ser utilizado para isolar clones genómicos através do rastreio de uma biblioteca genómica.

Pode também ser utilizada tecnologia de PCR para isolar sequências de ADNc completas. Por exemplo, pode isolar-se ARN, seguindo procedimentos padrão, a partir de uma fonte celular adequada (ou seja, que se sabe ou suspeita que expressa o gene plOl, tal como, por exemplo, neutrófilos ou outros tipos de leucócitos). Pode efectuar-se uma reacção de transcrição reversa no ARN utilizando um oligonucleótido iniciador específico para a maior parte da extremidade 5' do fragmento amplificado para início da síntese da primeira cadeia. Ao híbrido ARN/ADN resultante pode então acrescentar-se uma "cauda" de guaninas utilizando uma reacção de transferase terminal padrão, o híbrido pode ser digerido com ARNase H e pode então iniciar-se a síntese da segunda cadeia com um 26 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ iniciador poli-C. Assim, as sequências de ADNc a montante do fragmento amplificado podem ser facilmente isoladas. Para uma revisão de estratégias de clonagem que podem ser utilizadas, consultar por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra.

As sequências do gene plOl podem ser utilizadas adicionalmente para isolar alelos de gene plOl mutantes. Tais alelos mutantes podem ser isolados de indivíduos que se saiba ou se suponha que contêm um genótipo que contribui para os sintomas de doenças de activação de células de linhagem hematopoiética, tais como inflamação. Os alelos mutantes e os produtos de alelo mutante podem então ser utilizados nos sistemas terapêuticos e de diagnóstico descritos infra. Adicionalmente, tais sequências de gene plOl podem ser utilizadas para detectar defeitos de regulação de gene plOl (por exemplo, promotor ou promotor/facilitador) que podem afectar a activação de células de linhagem hematopoiética.

Pode isolar-se um ADNc de um gene pl01 mutante, por exemplo, utilizando PCR, uma técnica que é bem conhecida dos peritos na arte. Neste caso, a primeira cadeia de ADNc pode ser sintetizada por hibridação de um oligonucleótido oligo-dT a ARNm isolado de células que se sabe ou suspeita que seja expresso num indivíduo supostamente transportando o alelo de pl01 mutante e por extensão da nova cadeia com transcriptase reversa. A segunda cadeia do ADNc é então sintetizada utilizando um oligonucleótido que híbrida especificamente com a extremidade 5' do gene normal. Utilizando estes dois iniciadores, o produto é então amplificado por PCR, clonado para um vector adequado e sujeito a análise de sequências de ADN através de métodos bem conhecidos dos peritos na arte. Por comparação da sequência de ADN do alelo de plOl mutante com a do alelo de plOl normal, pode(m) ser determinada (s) a(s) mutação(ões) responsável(eis) pela perda ou alteração de função do produto génico de plOl mutante.

Alternativamente, pode construir-se uma biblioteca genómica utilizando ADN obtido de um indivíduo que se suspeita ou se sabe que transporta o alelo de pl 01 mutante ou pode construir-se uma biblioteca de ADNc utilizando ARN de um tipo de célula que se sabe ou suspeita que expressa o alelo de plOl mutante. 0 gene pl01 normal ou qualquer seu fragmento adequado 27 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ pode então ser marcado e utilizado como uma sonda para identificar o alelo de plOl mutante correspondente em tais bibliotecas. Podem então purificar-se clones contendo as sequências de gene plOl mutante e sujeitar-se a análise de sequência, de acordo com métodos bem conhecidos dos peritos na arte.

Adicionalmente, pode construir-se uma biblioteca de expressão utilizando ADNc sintetizado de, por exemplo, ARN isolado de um tipo celular que se sabe ou suspeita que expressa um alelo de pl01 mutante, num indivíduo que se suspeita ou sabe que transporta tal alelo mutante. Desta forma, os produtos génicos feitos pelo tipo celular supostamente mutante podem ser expressos e rastreados utilizando técnicas de rastreio de anticorpo padrão, conjuntamente com anticorpos desenvolvidos contra o produto génico de pl01 normal, tal como descrito infra, na secção 5.3. (para técnicas de rastreio consultar, por exemplo, Harlow, E. e Lane, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.) Adicionalmente, o rastreio pode ser efectuado por rastreio com proteínas de fusão marcadas, tais como, por exemplo, as proteínas de fusão (EE)120 ou mycl20. Nos casos em que a mutação de plOl resulta num produto génico expresso com função alterada (por exemplo, como resultado de uma mutação sem sentido ou de uma deslocação de quadro de leitura) é provável que um conjunto policlonal de anticorpos para a subunidade reguladora plOl sofram reacção cruzada com o produto génico da subunidade reguladora plOl mutante. Os clones da biblioteca detectados através da sua reacção com tais anticorpos marcados podem ser purificados e sujeitos a análise de sequência, de acordo com os métodos bem conhecidos dos peritos na arte. O invento também abrange sequências de nucleótidos que codificam subunidades reguladoras plOl mutantes, fragmentos de péptido da subunidade reguladora plOl, subunidades reguladoras plOl truncadas e proteínas de fusão de subunidade reguladora plOl. Tais incluem, entre outros, sequências de nucleótidos que codificam subunidades reguladoras plOl mutantes descritas na secção 5.2 infra; polipéptidos ou péptidos correspondentes aos domínios de ligação catalítica ou de ligação de subunidade Θβγ da subunidade reguladora plOl ou porções destes domínios; 28 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ subunidades reguladoras plOl truncadas nas quais se eliminaram um ou dois dos dominios ou uma subunidade reguladora plOl truncada, não funcional. Os nucleótidos que codificam proteínas de fusão podem incluir, entre outras, subunidade reguladora plOl completa, subunidade reguladora plOl truncada ou fragmentos de péptido da subunidade reguladora plOl fundidos a uma proteina ou péptido não relacionado, tais como por exemplo, um marcador epitópico que auxilia na purificação ou detecção da proteina de fusão resultante; ou uma enzima, proteina fluorescente, proteina luminescente que possa ser utilizada como um marcador. 0 invento também abrange (a) vectores de ADN que contêm qualquer das sequências de codificação da subunidade reguladora plOl anteriores e/ou os seus complementares (ou seja, anti-sentido); (b) vectores de expressão de ADN que contêm qualquer das sequências de codificação da subunidade reguladora plOl anteriores associadas operacionalmente a um elemento de regulação que dirige a expressão das sequências de codificação: e (c) células hospedeiras geneticamente modificadas que contêm qualquer das sequências de codificação da subunidade reguladora plOl anteriores associadas operacionalmente a um elemento de regulação que dirige a expressão das sequências de codificação na célula hospedeira. Tal como aqui utilizado, os elementos de regulação incluem, entre outros, promotores, facilitadores, operadores indutíveis e não indutíveis e outros elementos conhecidos dos peritos na arte que dirigem e regulam expressão. Tais elementos de regulação incluem, entre outros, o promotor de baculovírus, promotor precoce imediato do gene hCMV de citomegalovírus, os promotores precoces ou tardios do adenovírus SV40, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TRC, as regiões de operador principal e promotor de fago A, as regiões de controlo da proteína de envelope fd, o promotor para 3-fosfoglicerato-quinase, os promotores de fosfatase ácida e os promotores dos factores de acasalamento a de levedura.

Finalmente, o presente pedido também descreve nucleótidos que codificam proteínas de subunidade pl20, incluindo o terminal carboxilo descrito pela primeira vez desta subunidade catalítica, variantes de deleção das proteínas de subunidade pl20, nucleótidos que hibridam com estes nucleótidos sob 29 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ condições altamente rigorosas e que codificam produtos funcionalmente equivalentes, incluindo o clone de ADNc pCMV3mycpl20 depositado em ATCC com o número de acesso 97637, variantes alélicas de pl20 (por exemplo, alelos mutantes ou os alelos de ocorrência natural, tal como a variação alélica no resíduo de aminoácido 483) e nucleótidos de p!20 equivalentes de organismos diferentes isolados tal como descrito supra para os nucleótidos de plOl do invento. Adicionalmente, descrevem-se aqui vectores de expressão e células hospedeiras para a produção recombinante de pl20. 5.2 PROTEÍNAS E POLIPÉPTIDOS plOl E p!20 A subunidade reguladora plOl e a subunidade catalítica pl20, polipéptidos e fragmentos peptídicos, formas mutadas, truncadas ou com deleções da subunidade reguladora plOl e/ou proteínas de fusão da subunidade reguladora plOl e da subunidade catalítica pl20 e/ou proteínas de fusão da subunidade catalítica pl20, podem ser preparadas para várias utilizações, incluindo, entre outras, gerar anticorpos, como reagentes em ensaios de diagnóstico, identificação de outros produtos génicos celulares envolvidos na regulação da activação de células de linhagem hematopoiética, como reagentes em ensaios para rastreio de compostos que podem ser utilizados no tratamento de doenças de activação de células de linhagem hematopoiética e como reagentes farmacêuticos úteis no tratamento de doenças de activação de células de linhagem hematopoiética relacionadas com PI3K activada por Θβγ.

As figuras 2 e 11 apresentam as sequências de aminoácidos das proteínas da subunidade reguladora plOl porcina e humana, respectivamente. As figuras 4 e 13 apresentam as sequências de aminoácidos das proteínas de subunidade catalítica pl20 porcina e humana, respectivamente. A linha a tracejado na figura 4 sublinha a região de pl20 que difere das sequências publicadas das subunidades catalíticas de PI3K ρΙΙΟα, ρΙΙΟβ e ρΙΙΟγ. A sequência da subunidade reguladora plOl inicia-se com uma metionina num contexto de sequência de ADN consistente com um local de iniciação de tradução. A massa molecular prevista 30 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ de ambas as subunidades reguladoras plOl porcina e humana é de 97 kD.

As sequências de aminoácidos da subunidade reguladora plOl do invento incluem as sequências de aminoácidos apresentadas na figura 2 (SEQ ID NO:2) ou figura 4 (SEQ ID NO:12) ou a sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADNc pCMV3mycpl01, tal como depositado em ATCC. Adicionalmente, abrangem-se no invento subunidades reguladoras plOl de outras espécies. De facto, qualquer proteína de subunidade reguladora plOl codificada pelas sequências de nucleótidos de pl01 descritas supra, encontram-se abrangidas pelo âmbito do invento.

As sequências de aminoácidos da subunidade catalítica pl20 do invento incluem o clone de ADNc pCMV3mycpl20, tal como depositado em ATCC. O presente pedido também descreve subunidades catalíticas pl20 de outras espécies e as proteínas pl20 codificadas pelas sequências de nucleótidos de p!20 descritas supra na secção anterior. O invento abrange também proteínas que são funcionalmente equivalentes à subunidade reguladora plOl codificada pelas sequências de nucleótidos descritas supra, tal como avaliado por qualquer de vários critérios, incluindo entre outros a capacidade de ligar a subunidade catalítica, a afinidade de ligação para a subunidade catalítica, a capacidade de estimular actividade de PI3K da subunidade catalítica em resposta a proteínas G triméricas activadas, o efeito biológico resultante da ligação da subunidade catalítica e a resposta a activação de proteínas G triméricas, por exemplo, transdução de sinal, uma alteração no metabolismo celular (por exemplo, geração de Ptdlns(3,4,5)P3) ou alteração de fenótipo quando o equivalente da subunidade reguladora plOl se encontra presente num tipo celular adequado (tal como libertação de superóxido em neutrófilos). Tais proteínas funcionalmente equivalentes à subunidade reguladora plOl incluem, entre outras, adições ou substituições de resíduos de aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos codificada pelas sequências de nucleótidos de plOl descritas supra mas que resultam numa alteração silenciosa, produzindo assim um produto génico funcionalmente equivalente. As substituições de aminoácidos 31 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ podem ser feitas com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos apoiares (hidrófobos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. De igual modo, o invento também abrange equivalentes funcionais de proteína pl20, tal como descritos supra.

Embora se possam efectuar mutações aleatórias ao ADN de pl 01 (utilizando técnicas de mutagénese aleatória bem conhecidas dos peritos na arte) e as resultantes subunidades reguladoras plOl mutantes ensaiadas para actividade, podem conceber-se racionalmente mutações dirigidas ao local da sequência de codificação de pl 01 (utilizando técnicas de mutagénese dirigida ao local bem conhecidas dos peritos na arte) para gerar subunidades reguladoras plOl mutantes com função aumentada, por exemplo, maior afinidade de ligação para a subunidade catalítica e/ou maior capacidade de sinalização; ou função diminuída, por exemplo, menor afinidade de ligação para a subunidade catalítica e/ou menor capacidade de transdução de sinal.

Por exemplo, a sequência de aminoácidos de plOl porcina pode ser alinhada com a subunidade reguladora plOl humana. Podem conceber-se racionalmente subunidades reguladoras plOl mutantes, de modo a manter regiões de identidade inter-espécies, alterando os resíduos variáveis, por exemplo, por deleção ou inserção de resíduo (s) de aminoácido(s) ou por substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes. Podem conceber-se racionalmente alterações conservativas nas posições variáveis de modo a produzir uma subunidade reguladora plOl mutante que mantenha a função; por exemplo, afinidade de ligação à subunidade catalítica ou capacidade de transdução de proteína G activada ou ambas. Podem conceber-se racionalmente alterações não conservativas nestas posições variáveis para alterar a função, por exemplo, afinidade de 32 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ ligação à subunidade catalítica ou capacidade de transdução de sinal ou ambas. Alternativamente, quando se pretende alteração da função, podem conceber-se racionalmente alterações de deleção ou não conservativas das regiões conservadas. Um perito na arte pode ensaiar facilmente tal mutante ou subunidades reguladoras plOl com deleções, quanto a estas alterações na função, utilizando os ensinamentos aqui apresentados.

Podem efectuar-se outras mutações da sequência de codificação de pl01 para gerar subunidade reguladora plOl que são mais adequadas para expressão, aumento de escala, etc. nas células hospedeiras seleccionadas. Por exemplo, o código tripleto para cada aminoácido pode ser modificado para maior conformidade com a utilização de codão preferida da maquinaria de tradução da célula hospedeira.

Encontram-se também abrangidos pelo âmbito do invento péptidos correspondentes a um ou mais domínios (ou uma parte de um domínio) da subunidade reguladora plOl (por exemplo, o domínio de ligação a pl20, o domínio de interacção com proteína G ou os domínios definidos pelos resíduos de aminoácidos de cerca de 1 a 150, 151 a 300, 301 a 450, 451 a 600, 601-732 (porcina) ou 601-735 (humana) e 733-877 (porcina) ou 736-881 (humana)), subunidades reguladoras plOl truncadas ou com deleções (por exemplo, subunidade reguladora plOl na qual se eliminam porções de um ou mais dos domínios supra) bem como proteínas de fusão nas quais se funde a subunidade reguladora plOl completa, um péptido de subunidade reguladora plOl ou uma subunidade reguladora plOl truncada a uma proteína não relacionada e podem ser concebidas com base nos nucleótidos de plOl e nas sequências de aminoácidos da subunidade reguladora plOl reveladas nesta secção e supra. Tais proteínas de fusão incluem, entre outras, fusões com um marcador epitópico (tal como exemplificado nos exemplos infra); ou fusões com uma enzima, proteína fluorescente ou proteína luminescente que proporcionam uma função de marcação.

Embora se possam sintetizar quimicamente polipéptidos e péptidos da subunidade reguladora plOl (por exemplo, consultar Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular

Principies, W.H. Freeman & Co., N.Y.), os polipéptidos grandes 33 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ derivados da subunidade reguladora plOl e a própria subunidade reguladora plOl completa podem ser vantajosamente produzidos por tecnologia de ADN recombinante, utilizando técnicas bem conhecidas na arte para expressar ácido nucleico contendo sequências do gene e/ou sequências de codificação de pl 01. Tais métodos podem ser utilizados para construir vectores de expressão contendo as sequências de nucleótidos de pl01 descritas supra e sinais de controlo de transcrição e tradução adequados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Consultar, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et ai., 1989, supra e Ausubel et al., 1989, supra. Alternativamente, pode sintetizar-se quimicamente ARN capaz de codificar sequências de nucleótidos de pl 01 utilizando, por exemplo, sintetizadores. Consultar, por exemplo, as técnicas descritas em "Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M.J. ed., IRL Press, Oxford, que aqui se incorpora na sua globalidade por referência.

Podem ser utilizados vários sistemas hospedeiro-vector de expressão para expressar as sequências de nucleótidos de plOl do invento. Quando o péptido ou polipéptido da subunidade reguladora plOl é um derivado solúvel, o péptido ou polipéptido pode ser recuperado da cultura, ou seja, da célula hospedeira nos casos em que o péptido ou polipéptido de subunidade reguladora plOl não é excretado e do meio de cultura nos casos em que o péptido ou polipéptido de subunidade reguladora plOl é excretado pelas células. Contudo, podem utilizar-se as próprias células hospedeira concebidas racionalmente em situações em que é importante não só reter as características estruturais e funcionais da subunidade reguladora plOl, mas avaliar a actividade biológica, por exemplo, em ensaios de rastreio de fármacos.

Os sistemas de expressão que podem ser utilizados para os objectivos do invento incluem, entre outros, microrganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com vectores de expressão de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plasmídeo ou ADN de cosmídeo contendo sequências de nucleótidos de p101; leveduras (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas com vectores de expressão de levedura recombinantes contendo as sequências de 34 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ nucleótidos de ρ101; sistemas de células de insecto infectadas com vectores de expressão de virus recombinantes (por exemplo, baculovirus) contendo as sequências de p101; sistemas de células de plantas infectadas com vectores de expressão de virus recombinantes (por exemplo, virus do mosaico da couve-flor, CaMV; virus do mosaico de tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão de plasmideo recombinantes (por exemplo, plasmideo Ti) contendo sequências de nucleótidos de p101; ou sistemas de células de mamífero (por exemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3, U937) transportando construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor de vírus vaccinia de 7,5K) .

Em sistemas bacterianos, podem ser seleccionados vantajosamente vários vectores de expressão dependendo da utilização pretendida para o produto génico de pl 01 a ser expresso. Por exemplo, quando se pretende produzir uma quantidade elevada de tal proteína, para a produção de composições farmacêuticas de proteína de subunidade reguladora plOl ou para desenvolver anticorpos para a proteína de subunidade reguladora plOl, por exemplo, podem ser desejáveis vectores que dirigem a expressão de níveis elevados de produtos de proteína de fusão que são facilmente purificados. Tais vectores incluem, entre outros, o vector de expressão pUR2 78 de E. coli (Ruther et al., 19 83, EMBO J. 2:1791), no qual se pode ligar individualmente a sequência de codificação de plOl no vector em quadro com a região de codificação lacZ de modo a produzir uma proteína de fusão; vectores pIN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke e Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); e semelhantes. Podem também ser utilizados vectores pGEX para expressar polipéptidos heterólogos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Se a sequência inserida codificar um polipéptido relativamente pequeno (menos de 25 kD) , tais proteínas de fusão são geralmente solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir das células lisadas, por adsorção a pérolas de glutationa-agarose seguido de eluição na presença de glutationa livre. Os vectores pGEX são concebidos para incluir locais de clivagem de protease trombina ou de 35 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ factor Xa de modo que o produto génico alvo clonado pode ser libertado da porção GST. Alternativamente, se a proteína de fusão resultante for insolúvel e formar corpos de inclusão na célula hospedeira, os corpos de inclusão podem ser purificados e a proteína recombinante solubilizada utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na arte.

Num sistema de insecto, pode utilizar-se vírus de poli-hidrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) como um vector para expressar genes heterólogos. (Por exemplo, consultar Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, Patente U.S. N° 4 215 051). Numa concretização específica descrita infra, infectam-se células de insecto Sf9 com vectores de baculovírus que expressam quer uma construção de pl20 marcada com 6x HIS, quer uma construção de plOl marcada com (EE) .

Em células hospedeiras de mamífero podem ser utilizados vários sistemas de expressão baseados em vírus. Concretizações específicas descritas mais detalhadamente infra expressam sequências de ADN de plOl ou pl20 marcadas utilizando um promotor CMV para expressar transitoriamente proteína recombinante em células U937 ou em células Cos-7. Alternativamente, podem ser utilizados sistemas de vector retrovirais, bem conhecidos na arte, para inserir a construção de expressão recombinante nas células hospedeiras. Por exemplo, descrevem-se sistemas de vectores retrovirais para transdução em células hematopoiéticas em pedidos PCT publicados WO 96/09400 e WO 94/29438.

Nos casos em que se utiliza um adenovírus como um vector de expressão, a sequência de nucleótidos de plOl de interesse pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico podem ser então inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplo, região EI ou E3) resultará num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar o produto génico de plOl em hospedeiros infectados. (Por exemplo, consultar Logan e Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3655-3659). Podem também ser necessários sinais de 36 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ iniciação específicos para tradução eficaz de sequências de nucleótidos de pl01 inseridas. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Nos casos em que se insere o gene ou ADNc de plOl completos, incluindo o seu próprio codão de iniciação e sequências adjacentes, no vector de expressão adequado, podem não ser necessários quaisquer sinais de controlo de tradução adicionais. No entanto, nos casos em que se insere apenas uma porção da sequência de codificação de pl01, devem proporcionar-se sinais de controlo de tradução exógenos incluindo talvez o codão de iniciação ATG. Adicionalmente, o codão de iniciação deve estar em fase com o quadro de leitura da sequência de codificação pretendida para assegurar tradução da inserção completa. Estes sinais de controlo de tradução e codões de iniciação exógenos podem ter várias origens, tanto naturais como sintéticas. A eficácia de expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos facilitadores de transcrição, terminadores de transcrição, etc. adequados (Consultar Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).

Alem disso, pode seleccionar-se uma estirpe de célula hospedeira que module a expressão das sequências inseridas ou modifique e processe o produto génico na forma específica pretendida. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importante para a função da proteína. As diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento e modificação pós-tradução de proteínas e produtos génicos. Podem ser seleccionadas linhas celulares ou sistemas hospedeiros adequados para assegurar a modificação e processamento correctos da proteína heteróloga expressa. Para este fim, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento adequado do produto de transcrição primária. Tais células hospedeiras de mamífero incluem, entre outras, células CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 e U937.

Para produção das proteínas recombinantes de longo duração e de elevado rendimento prefere-se expressão estável. Por exemplo, podem ser concebidas racionalmente linhas celulares que expressam estavelmente as sequências de plOl descritas 37 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ supra. Em vez de utilizar vectores de expressão que contêm origens de replicação virais, podem transformar-se células hospedeiras com ADN controlado por elementos de controlo de expressão adequados (por exemplo, promotor, sequências de facilitador, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e um marcador seleccionável. Após a introdução do ADN heterólogo, podem deixar-se as células concebidas racionalmente crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido e seguidamente mudam-se para um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo nos seus cromossomas e cresçam para formar focos que podem, por seu turno, ser clonados e expandidos para linhas celulares. Este método pode ser utilizado vantajosamente para conceber racionalmente linhas celulares que expressam o produto génico de pl01. Tais linhas celulares concebidas racionalmente podem ser particularmente úteis no rastreio e avaliação de compostos que afectam a actividade endógena do produto génico de pl01.

Podem ser utilizados vários sistemas de selecção, incluindo, entre outros, os genes de timidina quinase de vírus herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (Szybalska e

Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:2026) e adenina-fosforribosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) que podem ser utilizados em células tk~, hgprt" ou aprt~, respectivamente. Igualmente, pode utilizar-se resistência anti-metabolito como base de selecção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sei. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan e Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072); neo, que confere resistência a aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147).

Os produtos génicos de plOl também podem ser expressos em animais transgénicos. Podem utilizar-se animais de qualquer espécie incluindo, entre outras, ratinhos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, porcos, micro-porcos, cabras e primatas 38 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ não humanos, por exemplo, babuínos, macacos e chimpanzés para gerar animais transgénicos pl01.

Pode utilizar-se qualquer técnica conhecida na arte para introduzir o transgene pl01 em animais não humanos para produzir as linhas fundadoras de animais transgénicos não humanos. Tais técnicas incluem, entre outras, micro-injecção pronuclear (Hoppe, P.C. e Wagner, T.E., 1989, Pat. U.S. N° 4 873 191); transferência de genes mediada por retrovírus para linhas germinais (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 82:6148-6152); localização de gene alvo em células estaminais embrionárias não humanas (Thompson et al., 1989, Cell 56:313-321); electroporação de embriões (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814); e transferência de gene mediada por esperma (Lavitrano et ai., 1989, Cell 57:717-723); etc. Para uma revisão de tais técnicas, consultar Gordon, 1989, "Transgenic Animais", Intl. Rev. Cytol. 115:171-229. O presente invento proporciona animais transgénicos não humanos que transportam o transgene plOl em todas as suas células, bem como animais que transportam o transgene em algumas, mas nem todas as suas células, ou seja, animais mosaico. O transgene pode ser integrado como um transgene único ou em concatâmeros, por exemplo, tandens cabeça-com-cabeça ou tandens cabeça-com-cauda. O transgene pode também ser introduzido selectivamente e activado num determinado tipo celular seguindo, por exemplo, os ensinamentos de Lasko et al. (Lasko, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 6232-6236). As sequências reguladoras necessárias para tal activação específica de célula dependerão do tipo de célula de interesse específica e será aparente aos peritos na arte. Quando se pretende que o transgene do gene pl01 seja integrado no local cromossómico do gene pl01 endógeno, prefere-se localização do gene alvo. Sucintamente, quando se utiliza tal técnica, concebem-se vectores contendo algumas sequências de nucleótidos homólogas ao gene plOl endógeno com o objectivo de integrar, através de recombinação homóloga com sequências cromossómicas na sequência de nucleótidos do gene plOl homólogo e destruindo a sua função. Desta forma, a expressão do gene plOl endógeno pode ser também eliminada por inserção de sequências não funcionais no gene endógeno. O transgene pode também ser introduzido selectivamente num determinado 39 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ tipo de célula, inactivando assim o gene plOl endógeno somente nesse tipo de célula, seguindo, por exemplo, os ensinamentos de Gu et al. (Gu et al., 1994. Science 265: 103-106) . As sequências reguladoras necessárias para tal inactivação específica de tipo de célula dependerão do tipo de célula de interesse específica e serão óbvias para os peritos na arte.

Uma vez gerados os animais transgénicos, a expressão do gene pl01 recombinante pode ser ensaiada utilizando técnicas padrão. O rastreio inicial pode ser efectuado por análise de hibridação de "Southern" ou técnicas de PCR para analisar tecidos animais, para ensaiar se a integração do transgene ocorreu. O nível de expressão de ARNm do transgene nos tecidos dos animais transgénicos pode também ser avaliado utilizando técnicas que incluem, entre outras, análise de hibridação de "Northern" de amostras do tipo de célula obtidas do animal, análise de hibridação in situ e RT-PCR. Podem também avaliar-se amostras de tecido que expressa o gene plOl imunocitoquimicamente utilizando anticorpos específicos para o produto do transgene plOl, tal como descrito infra. 5.3 ANTICORPOS PARA PROTEÍNAS plOl E p!20

Encontram-se igualmente abrangidos pelo invento anticorpos que reconhecem especificamente um ou mais epítopos da subunidade reguladora plOl ou epítopos de variantes conservadas da subunidade reguladora plOl ou fragmentos de péptido da subunidade reguladora plOl. Também se descrevem aqui anticorpos que reconhecem um ou mais epítopos da proteína pl20, nomeadamente o novo terminal carboxilo. Tais anticorpos incluem, entre outros, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAb), anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer dos supracitados.

Os anticorpos do invento podem ser utilizados, por exemplo, na detecção da subunidade reguladora plOl ou pl20 numa amostra biológica e podem assim ser utilizados como parte de uma técnica de diagnóstico ou prognóstico em que os doentes podem ser ensaiados para quantidades anómalas destas 40 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ proteínas. Tais anticorpos podem também ser utilizados em conjunção com, por exemplo, esquemas de rastreio de compostos, tal como descrito infra na secção 5.5, para a avaliação do efeito de compostos de ensaio na expressão e/ou actividade de produtos génicos plOl ou p!20. Adicionalmente, tais anticorpos podem ser utilizados conjuntamente com as técnicas de terapia génica descritas infra na secção 5.6 para, por exemplo, avaliar as células que expressam subunidade reguladora plOl normal e/ou concebida racionalmente antes da sua introdução no doente. Tais anticorpos podem ser utilizados adicionalmente como um método para a inibição de actividade anómala da subunidade reguladora plOl ou pl20. Assim, tais anticorpos podem consequentemente ser utilizados como parte de métodos de tratamento de doença inflamatória.

Para a produção de anticorpos, podem imunizar-se vários animais hospedeiros por injecção com a subunidade reguladora plOl, um péptido de subunidade reguladora plOl, polipéptidos de subunidade reguladora plOl truncada, equivalentes funcionais da subunidade reguladora plOl ou mutantes da subunidade da regulação plOl. Adicionalmente, os animais hospedeiros podem ser imunizados por injecção com subunidade catalítica pl20 ou péptidos da subunidade pl20. Tais animais hospedeiros podem incluir, entre outros, coelhos, ratinhos e ratos, para citar apenas alguns. Podem ser utilizados vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo, entre outros, Freund (completo e incompleto) , géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensioactivas, tais como lisolecitina, polióis Pluronics, polianiões, péptidos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa gigante, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Os anticorpos policlonais são populações heterogéneas de moléculas de anticorpo derivadas dos soros dos animais imunizados. e Patente U.S.

Os anticorpos monoclonais, que são populações homogéneas de anticorpos para um determinado antigénio, podem ser obtidos por qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares contínuas em cultura. Estas incluem, entre outras, a técnica do hibridoma de Kohler e Milstein, (1975, Nature 256:495-497; e Patente U.S. N° 41 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 4 376 110), a técnica do hibridoma de células B humanas (Kosbor et al. , 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:2026-2030) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96). Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer das suas subclasses. O hibridoma que produz o mAb deste invento pode ser cultivado in vitro ou in vivo. A produção de títulos elevados de mAb in vivo torna este método de produção o método actualmente preferido.

Além disso, podem ser utilizadas as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855; Neuberger et ai., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et ai., 1985, Nature, 314:452-454) por splicing dos genes de uma molécula de anticorpo de ratinho, de especificidade de antigénio adequada, conjuntamente com genes de uma molécula de anticorpo humano de actividade biológica adequada. Um anticorpo quimérico é uma molécula em que derivam porções diferentes de diferentes espécies animais, tais como as que têm uma região variável derivada de um mAb porcino e uma região constante de imunoglobulina humana.

Alternativamente, podem ser adaptadas técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Patente U.S. 4 946 778; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston et ai., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; e Ward et ai., 1989, Nature 334:544-546) para produzir anticorpos em cadeia simples contra produtos génicos de pl01. Os anticorpos em cadeia simples são formados por ligação dos fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv através de uma ponte de aminoácido, resultando num polipéptido em cadeia simples.

Podem ser gerados por técnicas conhecidas fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos. Por exemplo, tais fragmentos incluem, entre outros: os fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão da molécula de anticorpo com pepsina e os fragmentos Fab que podem ser gerados por redução das pontes dissulfureto dos fragmentos F(ab')2· Alternativamente, podem construir-se bibliotecas de expressão Fab (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281) para permitir 42 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade pretendida.

Os anticorpos para a subunidade reguladora plOl ou para a subunidade catalítica pl20 podem por seu lado ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipo que "mimetizam" a subunidade reguladora plOl ou subunidade pl20, respectivamente, utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na arte. (Consultar, por exemplo, Greenspan e Bona, 1993, FASEB J 7(5):437-444; e Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438). Por exemplo, os anticorpos que se ligam à subunidade reguladora plOl e inibem competitivamente a ligação da subunidade catalítica à subunidade reguladora plOl podem ser utilizados para gerar anti-idiotipos que "mimetizam" a subunidade reguladora plOl e consequentemente ligam e neutralizam a subunidade catalítica. Tais anti-idiotipos neutralizantes ou fragmentos Fab de tais anti-idiotipos podem ser utilizados em regimes terapêuticos para neutralizar a subunidade catalítica e reduzir inflamação.

5.4 DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS DE ACTIVAÇÃO DE CÉLULAS HEMATOPOIÉTICAS

Podem ser utilizados vários métodos para a avaliação de diagnóstico e prognóstico de doenças de activação de células de linhagem hematopoiética, incluindo doenças inflamatórias, e para a identificação de indivíduos com uma predisposição para tais doenças.

Tais métodos podem, por exemplo, utilizar reagentes tais como as sequências de nucleótidos de plOl e p!20 descritas supra e anticorpos para a subunidade reguladora plOl e pl20, tal como descrito na secção 5.3. Especificamente, tais reagentes podem ser utilizados, por exemplo, para: (1) a detecção da presença de mutações do gene plOl ou p!20 ou a detecção de sobre-expressão ou sub-expressão de ARNm de plOl ou p!20 relativamente a um estado de não doença de activação de células de linhagem hematopoiética; (2) a detecção de sobre-abundância ou sub-abundância do produto génico de plOl ou p!20 relativamente ao estado de não doença de activação de células de linhagem hematopoiética; e (3) a detecção de perturbações ou anomalias na via de transdução de sinal 43 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ mediada pela subunidade reguladora plOl e subunidade catalítica pl20.

Os métodos aqui descritos podem ser efectuados, por exemplo, por utilização de kits de diagnóstico pré-embalados contendo pelo menos uma sequência de nucleótidos de plOl ou p!20 específica ou reagente de anticorpo de subunidade reguladora plOl ou pl20 aqui descrito, que pode ser utilizado convenientemente, por exemplo, em ambientes clínicos para diagnosticar doentes que exibem anomalias de doença de activação de células de linhagem hematopoiética.

Para a detecção de mutações de plOl ou p!20, pode ser utilizada qualquer célula nucleada como uma fonte inicial para ácido nucleico genómico. Para a detecção de expressão de gene plOl ou p!20 ou produtos de expressão génica de plOl ou p!20, pode ser utilizada qualquer tipo de célula ou tecido no qual o gene plOl ou p!20 é expresso, tais como, por exemplo, células de neutrófilos.

Descrevem-se técnicas de detecção baseadas em ácido nucleico infra na secção 5.4.1. Descrevem-se técnicas de detecção de péptido infra na secção 5.4.2.

5.4.1 DETECÇÃO DO GENE plOl E PRODUTOS DE TRANSCRIÇÃO

As mutações dentro dos genes pl01 ou p!20 podem ser detectadas utilizando várias técnicas. Pode ser utilizado ácido nucleico de qualquer célula nucleada como ponto de partida de tais técnicas de ensaio e pode ser isolado de acordo com procedimentos de preparação de ácido nucleico padrão que são bem conhecidos dos peritos na arte.

Pode ser utilizado ADN em ensaios de hibridação ou amplificação de amostras biológicas para detectar anomalias que envolvem estrutura do gene, incluindo mutações pontuais, inserções, deleções e rearranjos cromossómicos. Tais ensaios podem incluir, entre outros, análises de "Southern", análises de polimorfismo conformacional em cadeia simples (SSCP) e análises por PCR. 44 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Tais métodos de diagnóstico para a detecção de mutações especificas de gene plOl ou p!20 podem envolver, por exemplo, pôr em contacto e incubar ácidos nucleicos incluindo moléculas de ADN recombinante, genes clonados ou suas variantes degeneradas, obtidas de uma amostra, por exemplo, derivadas de uma amostra de um doente ou de outra fonte celular adeguada, com um ou mais reagentes de ácido nucleico marcados incluindo moléculas de ADN recombinante, genes clonados ou suas variantes degeneradas, tal como descrito supra, em condições favoráveis para hibridação especifica destes reagentes com as suas seguências complementares dentro do gene plOl ou p!20. De preferência, os comprimentos destes reagentes de ácido nucleico são pelo menos 15 a 30 nucleótidos. Após incubação, removem-se todos os ácidos nucleicos não hibridados do híbrido de molécula de ácido nucleico. A presença de ácidos nucleicos gue tenham hibridado, caso existam tais moléculas, é então detectada. Utilizando tal esguema de detecção, o ácido nucleico do tipo celular ou tecido de interesse pode ser imobilizado, por exemplo, a um suporte sólido, tal como uma membrana, ou uma superfície de plástico, tal como numa placa de microtitulação, ou pérolas de poliestireno. Neste caso, após incubação, são facilmente removidos reagentes de ácido nucleico marcados não hibridados do tipo descrito supra. A detecção dos reagentes de ácido nucleico de pl 01 ou p!20 marcados hibridados remanescentes é efectuada utilizando técnicas padrão bem conhecidas dos peritos na arte. As sequências de gene pl 01 ou p!20 às quais se hibridaram os reagentes de ácido nucleico podem ser comparadas com o padrão de hibridação esperado para uma sequência de gene normal, de modo a determinar se está presente uma mutação do gene. Métodos de diagnóstico alternativos para a detecção de moléculas de ácido nucleico específicas de gene pl01 ou p!20, em amostras de doentes ou outras fontes celulares adequadas, podem envolver a sua amplificação, por exemplo, por PCR (a concretização experimental apresentada em Mullis, K.B., 1987, Patente U.S. N° 4 683 202), seguida por detecção das moléculas amplificadas utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na arte. As sequências amplificadas resultantes podem ser comparadas com as que seriam esperadas se o ácido nucleico a ser amplificado contivesse apenas cópias normais do gene plOl ou p!20 de modo a determinar se existe uma mutaçao de gene. 45 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Adicionalmente, podem efectuar-se técnicas de genotipagem bem conhecidas para identificar indivíduos que transportam mutações de gene plOl ou p!20. Tais técnicas incluem, por exemplo, a utilização de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), que envolve variações de sequência num dos locais de reconhecimento para a enzima de restrição específica utilizada. 0 nível de expressão de pl 01 ou p!20 pode também ser ensaiado por detecção e medição do produto de transcrição de pl01 ou p!20. Por exemplo, pode isolar-se e ensaiar-se, utilizando técnicas de hibridação ou de PCR tais como descritas supra, ARN de um tipo celular ou tecido que se sabe ou suspeita que expressa o gene pl01 ou p!20, tais como células de linhagem hematopoiéticas, especialmente células mielóides e plaquetas. As células isoladas podem ser derivadas de cultura celular ou de um doente. A análise de células obtidas de cultura pode ser uma etapa necessária na avaliação de células a serem utilizadas como parte de uma técnica de terapia génica baseada em células ou, alternativamente, para ensaiar o efeito de compostos na expressão do gene plOl ou p!20. Tais análises podem revelar tanto aspectos quantitativos, como qualitativos do padrão de expressão do gene plOl ou p!20, incluindo activação ou inactivação de expressão de gene plOl ou p!20. 5.4.2 DETECÇÃO DOS PRODUTOS DO GENE plOl

Os anticorpos dirigidos contra produtos de gene plOl ou p!20 de tipo selvagem ou mutante ou variantes conservadas ou seus fragmentos de péptido, que são discutidos supra na secção 5.3, podem também ser utilizados como diagnósticos e prognósticos de doença de activação de células de linhagem hematopoiética, tal como aqui descrito. Tais métodos de diagnóstico podem ser utilizados para detectar anomalias no nível de expressão de gene plOl ou p!20 ou anomalias na estrutura e/ou localização temporal, tecidular, celular ou subcelular da subunidade reguladora plOl e podem ser efectuados in vivo ou in vitro, tal como, por exemplo, em tecido de biopsia. 46 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ Ο tecido ou tipo celular a ser analisado incluirá em geral os que se sabe ou suspeita que contenham células que expressam o gene plOl ou p!20, tal como, por exemplo, células de neutrófilos que se infiltraram em tecido inflamado. Os métodos de isolamento de proteína aqui utilizados podem, por exemplo, ser tal como os descritos em Harlow e Lane (Harlow, E. e Lane, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque) , que é aqui incorporada por referência na sua globalidade. As células isoladas podem ser derivadas de cultura celular ou de um doente. A análise de células obtidas de cultura pode ser uma etapa necessária na avaliação de células que podem ser utilizadas como parte de uma técnica de terapia génica baseada em células ou, alternativamente, para ensaiar o efeito de compostos na expressão do gene plOl ou p!20.

Por exemplo, podem ser utilizados anticorpos ou fragmentos de anticorpos, tais como os descritos supra na secção 5.3, úteis no presente invento para detectar quantitativa ou qualitativamente a presença de produtos do gene plOl ou p!20 ou variantes conservadas ou seus fragmentos de péptido. Tal pode ser conseguido, por exemplo, por técnicas de imunofluorescência utilizando um anticorpo com marcação fluorescente (consultar infra, esta secção) acoplado com detecção em microscópio óptico, citometria de fluxo ou fluorimetria.

Os anticorpos (ou seus fragmentos) ou proteínas de fusão ou conjugadas úteis no presente invento podem adicionalmente ser utilizadas histologicamente, tal como em ensaios de imunofluorescência, microscopia imunoelectrónica ou ensaios não imunológicos, para a detecção in situ de produtos de gene pl01 ou p!20 ou variantes conservadas ou seus fragmentos de péptido ou para ligação a subunidade catalítica (no caso de proteína de fusão de subunidade catalítica marcada). A detecção in situ pode ser efectuada por remoção de um espécime histológico de um doente e aplicação a este de um anticorpo ou proteína de fusão marcados do presente invento. 0 anticorpo (ou fragmento) ou proteína de fusão é de preferência aplicado por sobreposição do anticorpo marcado (ou fragmento) numa amostra biológica. Através da utilização de tal 47 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ procedimento, é possível determinar não só a presença do produto de gene pl 01 ou pl 2 0 ou variantes conservadas ou fragmentos de péptido, mas também a sua distribuição no tecido examinado. Utilizando o presente invento, os peritos na arte entenderão facilmente que podem ser modificados uma vasta gama de métodos histológicos (tais como procedimentos de coloração) de modo a conseguir tal detecção in situ.

Os imunoensaios e ensaios não imunológicos para produtos de gene pl01 ou pl2 0 ou variantes conservadas ou seus fragmentos de péptido incluirão tipicamente a incubação de uma amostra, tal como um fluido biológico, um extracto de tecido, células recolhidas recentemente ou lisados de células que foram incubadas em cultura celular, na presença de um anticorpo marcado detectável capaz de identificar os produtos de gene plOl ou p!20 ou variantes conservadas ou seus fragmentos de péptido e detecção do anticorpo marcado por qualquer de várias técnicas bem conhecidas na arte. A amostra biológica pode ser posta em contacto e imobilizada num suporte ou transportador de fase sólida, tal como nitrocelulose ou outro suporte sólido que seja capaz de imobilizar células, partículas de células ou proteínas solúveis. 0 suporte pode ser então lavado com tampões adequados, seguido por tratamento com o anticorpo ou proteína de fusão de subunidade reguladora plOl ou subunidade pl20 marcados. 0 suporte de fase sólida pode ser então lavado com o tampão uma segunda vez para remover anticorpo ou proteína de fusão não ligados. A quantidade de marcador ligado ao suporte sólido pode ser então detectada por meios convencionais.

Pretende-se que "suporte ou transportador de fase sólida" abranja qualquer suporte capaz de ligar um antigénio ou um anticorpo. Constituem suportes ou transportadores bem conhecidos, entre outros, vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetite. A natureza do transportador pode ser solúvel em alguma extensão ou insolúvel para os objectivos do presente invento. 0 material de suporte pode ter virtualmente qualquer configuração estrutural possível, desde que a molécula acoplada seja capaz de se ligar a um antigénio ou anticorpo. Assim, a configuração 48 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ do suporte pode ser esférica, tal como numa pérola, ou cilíndrica, tal como na superfície interna de um tubo de ensaio ou a superfície externa de uma vareta.

Alternativamente, a superfície pode ser lisa como uma folha, fita de ensaio, etc. Os suportes preferidos incluem pérolas de poliestireno. Os peritos na arte conhecerão muitos outros transportadores adequados para ligação de anticorpo ou antigénio ou serão capazes de o avaliar por utilização de experiências de rotina. A actividade de ligação de um determinado lote de anticorpo ou proteína de fusão de subunidade reguladora plOl ou subunidade pl20 pode ser determinada de acordo com métodos bem conhecidos. Os peritos na arte serão capazes de determinar as condições de ensaio operacionais e óptimas para cada determinação por utilização de experiências de rotina.

Relativamente a anticorpos, uma das formas pela quais se pode marcar detectavelmente o anticorpo é por ligação deste a uma enzima e utilização num imunoensaio enzimático (EIA) (Voller, "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2:1-1, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Maryland); Voller et al., 1978, J. Clin. Pathol. 3JL:507-520; Butler, 1981, Meth. Enzymol. 7_3:482-523; Maggio (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Florida,; Ishikawa et al., (ed.), 1981,

Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tóquio). A enzima que está ligada ao anticorpo reagirá com um substrato adequado, de preferência um substrato cromogénico, de maneira a produzir uma porção química que possa ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. As enzimas que podem ser utilizadas para marcar detectavelmente o anticorpo incluem, entre outras, malato-desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-5-esteróide-isomerase, álcool-desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato-desidrogenase, triose-fosfato-isomerase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, asparaginase, glucose-oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato- desidrogenase, glucoamilase e acetilcolinesterase. A detecção pode ser efectuada por métodos colorimétricos que utilizam um substrato cromogénico para a enzima. A detecção pode ser também efectuada por comparação visual da extensão da reacção 49 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ enzimática de um substrato em comparação com padrões preparados de modo similar. A detecção também pode ser conseguida utilizando vários outros imunoensaios. Por exemplo, por marcação radioactiva de anticorpos ou fragmentos de anticorpo, é possível detectar subunidade reguladora plOl através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) (consultar, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março, 1986, que é aqui incorporado por referência). 0 isótopo radioactivo pode ser detectado por tais meios como a utilização de um contador gama ou um contador de cintilação ou por autorradiografia. É também possível marcar o anticorpo com um composto fluorescente. Quando o anticorpo marcado de modo fluorescente é exposto a luz de comprimento de onda adequado, a sua presença pode ser então detectada devido a fluorescência. Entre os compostos de marcação fluorescentes mais vulgarmente utilizados encontram-se o isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina e fluorescarnina. 0 anticorpo pode também ser marcado detectavelmente utilizando metais emissores de fluorescência, tais como 152Eu ou outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem ser ligados ao anticorpo utilizando grupos de quelação de metais, tais como ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA). 0 anticorpo pode também ser marcado detectavelmente por acoplamento a um composto quimioluminescente. Determina-se então a presença do anticorpo marcado de modo quimioluminescente por detecção da presença de luminescência que aparece durante o decorrer de uma reacção química. Constituem exemplos de composto de marcação quimioluminescentes particularmente úteis luminol, isoluminol, éster teromático de acridínio, imidazole, sal de acridínio e éster de oxalato. 50 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

De igual forma, pode ser utilizado um composto bioluminescente para marcar o anticorpo do presente invento. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrada em sistemas biológicos, nos quais uma proteína catalítica aumenta a eficácia da reacção quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada por detecção da presença de luminescência. Para os objectivos de marcação, constituem compostos bioluminescentes importantes luciferina, luciferase e aequorina.

5.5 ENSAIOS DE RASTREIO PARA COMPOSTOS QUE MODULAM A EXPRESSÃO OU ACTIVIDADE DE PI3K ACTIVADA POR PROTEÍNA G

Os seguintes ensaios foram concebidos para identificar compostos que interactuam (por exemplo, ligam-se) com a subunidade reguladora plOl ou a subunidade catalítica pl20, compostos que interactuam (por exemplo, ligam-se) com proteínas intracelulares que interactuam com subunidade reguladora plOl e/ou a subunidade catalítica pl20, compostos que interferem com a interacção de subunidade reguladora plOl com a subunidade catalítica pl20 ou com outras proteínas intracelulares envolvidas em transdução de sinal mediada por PI3K estimulada por proteína G e para compostos que modulam a actividade de gene pl01 ou p!20 (ou seja, modulam o nível de expressão do gene pl01 ou p!20) ou modulam o nível de plOl ou pl20. Podem ser adicionalmente utilizados ensaios para identificar compostos que se ligam a sequências reguladoras de gene pl01 ou p!20 (por exemplo, sequências de promotor) e que podem modular a expressão de gene plOl ou p!20. Consultar, por exemplo, Platt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. 269:28558-28562.

Os compostos que podem ser rastreados de acordo com o invento incluem, entre outros, péptidos, anticorpos e seus fragmentos, prostaglandinas, lípidos e outros compostos orgânicos (por exemplo, terpinas, miméticos de péptidos) que se ligam à subunidade reguladora plOl ou subunidade catalítica pl20 e que mimetizam a actividade desencadeada pelo ligando natural (ou seja, agonistas) ou inibem a actividade desencadeada pelo ligando natural (ou seja, antagonistas); bem como péptidos, anticorpos ou seus fragmentos e outros compostos orgânicos que mimetizam a subunidade reguladora plOl 51 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ ou a subunidade catalítica ρ120 (ou uma sua porção) e se ligam e "neutralizam" o ligando natural.

Tais compostos podem incluir, entre outros, péptidos tais como, por exemplo, péptidos solúveis, incluindo entre outros membros de bibliotecas de péptidos aleatórios (consultar, por exemplo, Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354:82-84; Houghten, R. et al., 1991, Nature 354:84-86) e péptidos de biblioteca molecular derivada por guímica combinatória consistindo de aminoácidos com configuração D e/ou L, fosfopéptidos (incluindo, entre outros, membros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos aleatórios ou parcialmente degenerados; consultar, por exemplo, Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72:767-778); anticorpos (incluindo, entre outros, anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, anti-idiotípicos, guiméricos ou em cadeia simples e fragmentos de bibliotecas de expressão FAb, F(ab'>2 e Fab e seus fragmentos de ligação de epítopo); e moléculas peguenas orgânicas ou inorgânicas.

Outros compostos gue podem ser ensaiados de acordo com o invento incluem, entre outros, moléculas pequenas orgânicas que são capazes de entrar numa célula adequada (por exemplo, no neutrófilo) e afectar a expressão do gene plOl ou p!20 ou algum outro gene envolvido na via de transdução de sinal da subunidade reguladora plOl (por exemplo, por interacção com a região reguladora ou factores de transcrição envolvidos em expressão génica); ou compostos tais que afectam a actividade da subunidade reguladora plOl, por exemplo, por inibição ou aumento da ligação de plOl à subunidade catalítica da PI3K ou a ligação de plOl a algum outro factor intracelular envolvido na via de transdução de sinal de subunidade reguladora plOl, tal como, por exemplo, Θβγ. A modelação computacional e as tecnologias de busca permitem a identificação de compostos, ou o melhoramento de compostos já identificados, que podem modular a expressão ou actividade de subunidade reguladora plOl ou subunidade catalítica pl20. Após identificação de tal composto ou composição, identificam-se os locais ou regiões activos. Tais locais activos podem ser tipicamente os locais de ligação de parceiro, tal como, por exemplo, os domínios de interacção da 52 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ subunidade catalítica ρ120 com a própria subunidade reguladora plOl. O local activo pode ser identificado utilizando métodos conhecidos na arte incluindo, por exemplo, a partir das sequências de aminoácidos de péptidos, a partir de sequências de nucleótidos de ácidos nucleicos ou do estudo de complexos do composto ou composição relevantes com o seu ligando natural. Neste último caso, podem ser utilizados métodos químicos ou de cristalografia de raios-x para detectar o local activo, detectando o local onde se encontra o ligando complexado no factor.

Seguidamente, determina-se a estrutura geométrica tridimensional do local activo. Tal pode ser efectuado por métodos conhecidos, incluindo cristalografia de raios-x, que pode determinar uma estrutura molecular completa. Por outro lado, pode utilizar-se RMN de fase sólida ou líquida para determinar determinadas distâncias intramoleculares. Pode ser utilizado qualquer outro método experimental de determinação de estruturas para obter estruturas geométricas parciais ou completas. As estruturas geométricas podem ser medidas com um ligando complexado, natural ou artificial, que pode aumentar a exactidão da estrutura do local activo determinada.

Caso se determine uma estrutura incompleta ou com uma exactidão insuficiente, podem ser utilizados métodos de modelação numérica baseados em computador para completar a estrutura ou melhorar a sua exactidão. Pode ser utilizado qualquer método de modelação reconhecido, incluindo modelos parametrizados específicos para determinados biopolímeros, tais como proteínas ou ácidos nucleicos, modelos de dinâmica molecular baseados em computação do movimento molecular, modelos de mecânica estatística com base em conjuntos térmicos ou modelos combinados. Para a maioria dos tipos de modelos, são necessários campos de força molecular padrão, representando as forças entre átomos e grupos constituintes e podem ser seleccionados dos campos de força conhecidos em química-física. As estruturas experimentais incompletas ou de menor exactidão podem servir como restrições para as estruturas completas ou mais exactas por estes métodos de modelação. 53 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Finalmente, tendo determinado a estrutura do local activo, experimentalmente ou por modelação ou por uma combinação, podem identificar-se compostos moduladores candidatos por busca de bases de dados contendo compostos juntamente com informação da sua estrutura molecular. Tal busca procura compostos com estruturas que são compatíveis com a estrutura determinada do local activo e que interactuam com os grupos que definem o local activo. Tal busca pode ser manual, mas de preferência é assistida por computador. Estes compostos encontrados nesta busca são potencialmente compostos que modulam PI3K activada por proteína G.

Alternativamente, estes métodos podem ser utilizados para identificar compostos de modulação melhorados a partir de composto ou ligando de modulação já conhecidos. A composição do composto conhecido pode ser modificada e os efeitos estruturais de modificação podem ser determinados utilizando os métodos experimentais e de modelação computacional descritos supra aplicados à nova composição. A estrutura alterada é então comparada com a estrutura do local activo do composto para determinar se resulta num encaixe ou interacção melhorados. Desta forma, podem ser rapidamente avaliadas variações sistemáticas da composição, tal como por variação dos grupos laterais, para obter compostos ou ligandos de modulação modificados com especificidade ou actividade melhoradas.

Serão aparentes aos peritos na arte métodos experimentais e de modelação computacional adicionais úteis para identificar compostos de modelação com base na identificação dos locais activos da subunidade catalítica pl20, subunidade reguladora plOl e factores de transdução e transcrição relacionados.

Constituem exemplos de sistemas de modelação molecular os programas CHARMm e QUANTA (Polygen Corporation, Waltham, Massachusetts). CHARMm efectua minimização de energia e funções de dinâmica molecular. QUANTA efectua a construção, modelação gráfica e análise de estrutura molecular. QUANTA permite a construção, modificação, visualização e análise interactiva do comportamento de moléculas entre si. 54 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ Vários artigos revêem modelação computacional de fármacos que interactuam com proteínas específicas, tais como Rotivinen et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (16 de Junho de 1988); McKinaly e Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122; Perry e Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity

Relationships in Drug Design p. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis e Dean, 1989, Proc. R. Soc. Lond. 236:125-140 e 141-162; e relativamente a um receptor modelo para componentes de ácido nucleico, Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090. Estão disponíveis outros programas de computador que rastreiam e representam graficamente compostos químicos em companhias, tais como BioDesign, Inc. (Pasadena, Califórnia), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canadá) e Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontário). Embora estes sejam primariamente concebidos para aplicação a fármacos específicos de determinadas proteínas, eles podem ser adaptados para conceber fármacos específicos para regiões de ADN ou ARN, uma vez identificada esta região.

Embora descrito supra com referência à concepção e geração de compostos que podem alterar ligação, podem igualmente rastrear-se bibliotecas de compostos conhecidos, incluindo produtos naturais ou produtos químicos sintéticos e materiais activos biologicamente, incluindo proteínas, para compostos que são inibidores ou activadores.

Os compostos identificados através de ensaios tais como os aqui descritos podem ser úteis, por exemplo, na elaboração da função biológica do produto génico de plOl ou p!20 e para melhorar doenças de activação de células de linhagem hematopoiética. Discutem-se infra na secção 5.5.4 ensaios para testar a eficácia de compostos identificados, por exemplo, por técnicas tais como as descritas na secção 5.5.1 a 5.5.3. 5.5.1 ENSAIOS DE RASTREIO in vitro PARA COMPOSTOS QUE SE LIGAM A SUBUNIDADE REGULADORA plOl

Podem conceber-se sistemas in vitro para identificar compostos capazes de interactuar (por exemplo, ligar-se a) com a subunidade reguladora plOl ou subunidade catalítica pl20. Os compostos identificados podem ser úteis, por exemplo, na 55 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ modulação da actividade de produtos génicos de plOl ou p!20 de tipo selvagem e/ou mutantes; podem ser utilizados em rastreios para identificar compostos que destroem as interacções normais subunidade reguladora plOl/subunidade catalítica; ou podem em si próprios destruir tais interacções. 0 princípio dos ensaios utilizados para identificar compostos que se ligam à subunidade reguladora plOl envolve a preparação de uma mistura reaccional da subunidade reguladora plOl e do composto de ensaio, em condições e durante um período de tempo suficiente para permitir a interacção e ligação entre as duas componentes, formando assim um complexo que podem ser removido e/ou detectado na mistura reaccional. A espécie de subunidade reguladora plOl utilizada pode variar dependendo do objectivo do ensaio de rastreio. Por exemplo, quando se procuram agonistas do ligando natural, pode ser utilizada a subunidade reguladora plOl completa ou uma proteína de fusão contendo a subunidade reguladora plOl fundida a uma proteína ou polipéptido que proporciona vantagens no sistema de ensaio (por exemplo, marcação, isolamento do complexo resultante, etc.).

Podem efectuar-se ensaios de rastreio de várias formas. Por exemplo, um método para efectuar tal ensaio envolverá ancoragem da proteína, polipéptido, péptido ou proteína de fusão da subunidade reguladora plOl ou da substância de ensaio a uma fase sólida e detecção dos complexos subunidade reguladora plOl/composto de ensaio ancorados à fase sólida no final da reacção. Numa concretização de tal método, os reagentes de subunidade reguladora plOl podem ser ancorados a uma superfície sólida e o composto de ensaio que não está ancorado pode ser marcado, directa ou indirectamente. Noutra concretização do método, complexa-se uma proteína de subunidade reguladora plOl ancorada na fase sólida com subunidade catalítica, tal como pl20, marcada. Seguidamente, pode ensaiar-se um composto de ensaio relativamente à sua capacidade para destruir a associação do complexo pl01/pl20.

Na prática, podem ser convenientemente utilizadas placas de microtitulação como fase sólida. A componente ancorada pode ser imobilizada por ligações não covalentes ou covalentes. A ligação não covalente pode ser conseguida simplesmente 56 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ revestindo a superfície sólida com uma solução da proteína e secagem. Alternativamente, pode ser utilizado um anticorpo imobilizado, de preferência um anticorpo monoclonal, específico para a proteína a ser imobilizada, para ancorar a proteína à superfície sólida. As superfícies podem ser preparadas antecipadamente e armazenadas.

De modo a efectuar o ensaio, adiciona-se a componente não imobilizada à superfície revestida contendo a componente ancorada. Após completar a reacção, removem-se as componentes que não reagiram (por exemplo, por lavagem) em condições tais que quaisquer complexos formados permanecerão imobilizados na superfície sólida. A detecção de complexos ancorados na superfície sólida pode ser efectuada de várias formas. Quando a componente que não é previamente imobilizada é pré-marcada, a detecção do marcador imobilizado na superfície indica que os complexos se formaram. Quando a componente que não é imobilizada previamente não é pré-marcada, pode utilizar-se um marcador indirecto para detectar complexos ancorados na superfície; por exemplo, utilizando um anticorpo marcado específico para a componente não imobilizada previamente (o anticorpo, por seu lado, pode ser marcado directamente ou marcado indirectamente com um anticorpo anti-Ig marcado).

Alternativamente, pode efectuar-se uma reacção numa fase líquida, os produtos reaccionais separam-se das componentes que não reagiram e detectam-se os complexos; por exemplo, utilizando um anticorpo imobilizado específico para a proteína, polipéptido, péptido ou proteína de fusão de subunidade reguladora plOl ou de proteína ou proteína de fusão de subunidade catalítica ou o composto de ensaio para ancorar quaisquer complexos formados em solução e um anticorpo marcado específico para a outra componente do possível complexo para detectar complexos ancorados. 5.5.2 ENSAIOS PARA PROTEÍNAS INTRACELULARES QUE INTERACTUAM COM AS PROTEÍNAS plOl OU p!20

Pode ser utilizado qualquer método adequado para detectar interacções proteína-proteína para identificar proteínas intracelulares que interactuam com a subunidade reguladora plOl e/ou a subunidade catalítica p!20. Entre os métodos 57 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ tradicionais que podem ser utilizados encontram-se a co-imunoprecipitação, reticulação e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas de lisados celulares ou proteínas obtidas de lisados celulares e a subunidade reguladora plOl para identificar proteínas no lisado que interactuam com a subunidade reguladora plOl. Para estes ensaios, a componente de subunidade reguladora plOl utilizada pode ser uma subunidade reguladora plOl completa ou um péptido truncado. De igual forma, a componente pode ser uma subunidade catalítica pl20 ou um complexo da subunidade reguladora plOl com a subunidade catalítica pl20. Uma vez isolada, tal proteína intracelular pode ser identificada e pode, por seu lado, ser utilizada, conjuntamente com técnicas padrão, para identificar proteínas com as quais interactua. Por exemplo, pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de uma proteína intracelular que interactua com a subunidade reguladora plOl, PI3K (complexo pl01/pl20), ou a subunidade catalítica pl20, pode ser elucidada utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na arte, tal como através da técnica de degradação de Edman. (Consultar, por exemplo, Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principies". W.H. Freeman & Co., N.Y., p. 34-49). A sequência de aminoácidos obtida pode ser utilizada como um guia para a geração de misturas de oligonucleótidos, que podem ser utilizadas para rastrear sequências de genes que codificam tais proteínas intracelulares. 0 rastreio pode ser efectuado, por exemplo, por técnicas de hibridação ou de PCR padrão. São bem conhecidas técnicas para a geração de misturas de oligonucleótidos e rastreio. (Consultar, por exemplo, Ausubel, supra., e PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M. et al., eds. Academic Press, Inc., Nova Iorque).

Adicionalmente, podem ser utilizados métodos que resultam na identificação simultânea de genes que codificam as proteínas intracelulares que interactuam com a subunidade reguladora plOl e/ou a subunidade catalítica pl20 e/ou a PI3K. Estes métodos incluem, por exemplo, sondagem de expressão, bibliotecas e um modo semelhante à técnica bem conhecida de sondagem com anticorpo de bibliotecas Xgtll, utilizando proteína de subunidade reguladora plOl marcada ou um polipéptido, péptido ou proteína de fusão de subunidade 58 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ reguladora plOl, por exemplo, um polipéptido de subunidade reguladora plOl ou um domínio de subunidade reguladora plOl fundido com um marcador (por exemplo, uma enzima, proteína fluorescente, luminescente ou corante) ou um domínio Ig-Fc.

Descreve-se em detalhe, somente a título ilustrativo e não limitativo, um método gue detecta interacções de proteínas in vivo, o sistema de dois híbridos. Foi descrita uma versão deste sistema (Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:9578-9582) e encontra-se disponível comercialmente em Clontech (Paio Alto, Califórnia).

Sucintamente, utilizando tal sistema, constroem-se plasmídeos gue codificam proteínas de dois híbridos: um plasmídeo consiste em nucleótidos que codificam o domínio de ligação de ADN de uma proteína activadora de transcrição, fundida a uma sequência de nucleótidos de plOl que codifica a subunidade reguladora plOl, um polipéptido, péptido ou proteína de fusão de subunidade reguladora plOl e o outro plasmídeo consiste em nucleótidos que codificam o domínio de activação da proteína de activação de transcrição, fundido a um ADNc que codifica uma proteína desconhecida que foi recombinada com este plasmídeo como parte de uma biblioteca de ADNc. 0 plasmídeo de fusão de domínio de ligação de ADN e a biblioteca de ADNc são transformados para uma estirpe da levedura Saccharomyces cerevisiae que contém um gene repórter (por exemplo, HBS ou lacZ) cuja região reguladora contém o local de ligação do activador de transcrição. Nenhuma das proteínas híbridas por si só pode activar transcrição do gene repórter; o híbrido de domínio de ligação de ADN não pode porque não proporciona função de activação e o híbrido de domínio de activação não pode porque não consegue localizar os locais de ligação do activador. A interaeção das duas proteínas híbridas reconstitui a proteína activadora funcional e resulta em expressão do gene repórter, que é detectado por um ensaio para o produto do gene repórter. 0 sistema de dois híbridos, ou metodologia relacionada, pode ser utilizado para rastrear bibliotecas de domínio de activação para proteínas que interactuam com o produto de gene "isco". A título ilustrativo e não limitativo, pode utilizar-se a subunidade reguladora plOl como o produto génico isco. As 59 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ sequências genómicas ou de ADNc totais são fundidas com o ADN que codifica um domínio de activação. Esta biblioteca e um plasmídeo que codifica um híbrido de um produto génico de plOl isco fundido a um domínio de ligação de ADN são co-transformados para uma estirpe repórter de levedura e rastreiam-se os transformantes resultantes relativamente aos que expressam o gene repórter. Por exemplo, e a título não limitativo, podem clonar-se uma sequência de gene plOl isco, tal como o quadro de leitura aberta de pl01 (ou um domínio de pl01), tal como apresentado na figura 1, para um vector de tal forma a ficar fundido para a tradução ao ADN que codifica o domínio de ligação de ADN da proteína GALA. Estas colónias são purificadas e isolam-se os plasmídeos da biblioteca responsáveis por expressão do gene repórter. Utiliza-se então sequenciação de ADN para identificar as proteínas codificadas pelos plasmídeos de biblioteca.

Pode preparar-se uma biblioteca de ADNc da linha celular da qual serão detectadas as proteínas que interactuam com o produto génico de pl 01 isco, utilizando métodos postos em prática rotineiramente na arte. De acordo com o sistema particular aqui descrito, por exemplo, os fragmentos de ADNc podem ser inseridos num vector, de modo a ficarem fundidos para tradução ao domínio de activação de transcrição de GAL4. Esta biblioteca pode ser co-transfectada juntamente com o plasmídeo de fusão gene plOl isco-GAL4 para uma estirpe de levedura que contém um gene lacZ, dirigido por um promotor que contém a sequência de activação GAL4. Uma proteína de codificação de ADNc, fundida a domínio de activação de transcrição GAL4, que interactua com o produto génico de plOl isco reconstituirá uma proteína GAL4 activa, dirigindo consequentemente a expressão do gene HIS3. As colónias que expressam HIS3 podem ser detectadas pelo seu crescimento em placas de Petri contendo meio baseado em ágar-ágar semi-sólido isento de histidina. 0 ADNc pode então ser purificado destas estirpes e utilizado para produzir e isolar a proteína de interacção com o gene plOl isco utilizando técnicas levadas à prática rotineiramente na arte. 60

ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 5.5.3 ENSAIOS PARA COMPOSTOS QUE INTERFEREM COM A INTERACÇÃO SUBUNIDADE REGULADORA pl01/MACROMOLÉCULA INTRACELULAR

As macromoléculas que interactuam com a subunidade reguladora plOl são denominadas, para os objectivos desta discussão, como "parceiros de ligação". Estes parceiros de ligação estão provavelmente envolvidos na via de transdução de sinal da subunidade reguladora plOl e consequentemente, no papel da subunidade reguladora plOl na regulação da activação da linhagem celular hematopoiética. Constituem parceiros de ligação conhecidos subunidades catalíticas da PI3K quinase tal como pl20, pll7 e talvez certas proteínas pllO. É provável que outros parceiros de ligação sejam proteínas G triméricas tais como subunidades Θβγ e/ou lípidos. Assim, é desejável identificar compostos que interferem ou que destroem a interacção de tais parceiros de ligação com plOl que podem ser úteis para a regulação da actividade da subunidade reguladora plOl e assim controlar doenças de activação de linhagem celular hematopoiética associadas com a actividade da subunidade reguladora plOl. O princípio básico dos sistemas de ensaio utilizados para identificar compostos que interferem com a interacção entre a subunidade reguladora plOl e o(s) seu(s) parceiro(s) de ligação envolve preparar uma mistura reaccional contendo proteína, polipéptido, péptido ou proteína de fusão de subunidade reguladora plOl tal como descrito nas secções 5.5.1 e 5.5.2 supra e o parceiro de ligação sob condições e durante um período de tempo suficiente para permitir que ambas interajam e se liguem formando assim um complexo. De modo a ensaiar um composto para actividade de inibição, prepara-se a mistura reaccional na presença e ausência do composto de ensaio. O composto de ensaio pode ser inicialmente incluído na mistura reaccional ou pode ser adicionado num ponto temporal subsequente à adição da porção de subunidade reguladora plOl e do seu parceiro de ligação. Incubam-se misturas reaccionais de controlo sem o composto de ensaio ou com um placebo. A formação de quaisquer complexos entre a porção de subunidade reguladora plOl e o parceiro de ligação é então detectada. A formação de um complexo na reacção de controlo, mas não na mistura reaccional contendo o composto de ensaio, indica que o composto interfere com a interacção da subunidade reguladora 61 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ plOl com ο parceiro de ligação com o qual interage. Além disso, a formação de complexo nas misturas reaccionais contendo o composto de ensaio e proteína de subunidade reguladora plOl normal pode também ser comparada com a formação de complexo nas misturas reaccionais contendo o composto de ensaio e uma subunidade reguladora plOl mutante. Esta comparação pode ser importante nos casos em que se pretende identificar compostos que destroem as interacções de subunidades reguladoras plOl mutantes e não de subunidades reguladoras plOl normais. O ensaio para compostos que interferem com a interacção da subunidade reguladora plOl e parceiros de ligação pode ser conduzido num formato heterogéneo ou homogéneo. Os ensaios heterogéneos envolvem ancoragem quer do produto de parte subunidade reguladora plOl quer do parceiro de ligação numa fase sólida e detecção de complexos ancorados na fase sólida no final da reacção. Em ensaios homogéneos, a reacção completa é efectuada numa fase líquida. Em qualquer das abordagens, a ordem de adição dos reagentes pode ser variada para obter informação diferente sobre os compostos a serem ensaiados. Por exemplo, podem identificar-se compostos de ensaio que interferem com a interacção por competição efectuando a reacção na presença de uma substância de ensaio; ou seja, adicionando a substância de ensaio à mistura reaccional antes ou concomitantemente com a porção de subunidade reguladora plOl e parceiro de ligação de interacção. Alternativamente, compostos de ensaio que destroem complexos pré-formados, por exemplo, compostos com constantes de ligação mais elevadas que deslocam uma das componentes do complexo, podem ser ensaiados por adição do composto de ensaio à mistura reaccional após a formação de complexos. Descrevem-se sucintamente infra os diferentes formatos.

Num sistema de ensaio heterogéneo, quer a porção de subunidade reguladora plOl quer o parceiro de ligação de interacção são ancoradas numa superfície sólida, enquanto que a espécie não ancorada é marcada quer directa quer indirectamente. Na prática, utilizam-se convenientemente placas de microtitulação. A espécie ancorada pode ser imobilizada por ligações não covalentes ou covalentes. A ligação não covalente pode ser obtida simplesmente por 62 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ revestimento da superfície sólida com uma solução do produto génico de pl01 ou p!20 ou parceiro de ligação e secagem. Alternativamente, pode utilizar-se um anticorpo imobilizado específico para a espécie a ser ancorada para ancorar a espécie à superfície sólida. Podem preparar-se antecipadamente as superfícies e armazenarem-se.

De modo a efectuar o ensaio, expõe-se o parceiro da espécie imobilizada à superfície revestida com ou sem o composto de ensaio. Após finalização da reacção, removem-se as componentes não reagidas (por exemplo, por lavagem) e quaisquer complexos formados permanecerão imobilizados na superfície sólida. A detecção de complexos ancorados na superfície sólida pode ser efectuada de vários modos. Quando a espécie não imobilizada está pré-marcada, a detecção de marcador imobilizado na superfície indica que se formaram complexos. Quando a espécie não imobilizada não é pré-marcada, pode utilizar-se um marcador indirecto para detectar complexos ancorados na superfície; por exemplo, utilizando um anticorpo marcado específico para a espécie inicialmente não imobilizada (o anticorpo, por sua vez, pode ser directamente marcado ou indirectamente marcado com um anticorpo anti-Ig marcado). Dependendo da ordem de adição das componentes reaccionais, podem detectar-se compostos de ensaio que inibem formação de complexo ou que destroem complexos pré-formados.

Alternativamente, a reacção pode ser efectuada numa fase líquida na presença ou ausência do composto de ensaio, os produtos de reacção separados das componentes não reagidas e os complexos detectados; por exemplo, utilizando um anticorpo imobilizado específico para uma das componentes de ligação para ancorar quaisquer complexos formados em solução e um anticorpo marcado específico para o outro parceiro para detectar complexos ancorados. Mais uma vez, dependendo da ordem de adição dos reagentes à fase líquida, podem identificar-se compostos de ensaio que inibem o complexo ou que destroem complexos pré-formados.

Numa concretização alternativa do invento pode utilizar-se um ensaio homogéneo. Nesta abordagem, prepara-se um complexo pré-formados da porção de subunidade reguladora plOl e o parceiro de ligação de interacção em que quer a subunidade 63 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ reguladora plOl quer os seus parceiros de ligação estão marcados, mas o sinal gerado pelo marcador é extinto devido à formação do complexo (consultar, por exemplo, Patente U.S. n° 4 109 496 por Rubenstein que utiliza esta abordagem para imunoensaios). A adição de uma substância de ensaio que compete com uma das espécies dos complexos pré-formados e que a desloca resultará na geração de um sinal acima da linha de base. Deste modo, podem identificar-se substâncias de ensaio que destroem a interacção subunidade reguladora pl01/parceiro de ligação intracelular.

Numa concretização particular, pode preparar-se para imobilização uma fusão de subunidade reguladora plOl. Por exemplo, a subunidade reguladora plOl ou um fragmento de péptido, por exemplo, correspondente ao CD, pode ser fundido a um gene de glutationa-S-transferase (GST) utilizando um vector de fusão tal como pGEX-5X-l, de tal modo que a sua actividade de ligação se mantém na proteína de fusão resultante. O parceiro de ligação de interacção pode ser purificado e utilizando para desenvolver um anticorpo monoclonal utilizando métodos praticados rotineiramente na arte e descritos supra na secção 5.3. Este anticorpo pode ser marcado com o isótopo radioactivo 125I, por exemplo, por métodos praticados rotineiramente na arte. Num ensaio heterogéneo, por exemplo, a proteína de fusão GST-subunidade reguladora plOl pode ser ancorada a pérolas de glutationa-agarose. O parceiro de ligação de interacção pode ser então adicionado na presença ou ausência do composto de ensaio de um modo que permite a ocorrência de interacção e ligação. No final do período de reacção, pode remover-se material não ligado por lavagem e o anticorpo monoclonal marcado pode ser adicionado ao sistema e permitir ligação às componentes complexadas. A interacção entre o produto génico de pl01 ou p!20 e o parceiro de ligação de interacção pode ser detectada por medição da quantidade de radioactividade que permanece associada às pérolas de glutationa-agarose. Uma inibição bem sucedida da interacção pelo composto de ensaio resultará numa diminuição da radioactividade medida.

Alternativamente, a proteína de fusão GST-subunidade reguladora plOl e o parceiro de ligação de interacção podem ser misturadas conjuntamente em líquido na ausência de pérolas 64 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ sólidas de glutationa-agarose. Ο composto de ensaio pode ser adicionado durante ou após se deixarem interactuar as espécies. Esta mistura pode então ser adicionada às pérolas de glutationa-agarose e remove-se o material não ligado por lavagem. Mais uma vez pode detectar-se a extensão da inibição da interacção da subunidade reguladora pl01/parceiro de ligação por adição do anticorpo marcado e medição da radioactividade associada com as pérolas.

Noutra concretização do invento, estas mesmas técnicas pode ser utilizadas utilizando fragmentos de péptido que correspondem aos domínios de ligação da subunidade reguladora plOl e/ou parceiro de ligação ou de interacção (nos casos em que o parceiro de ligação é uma proteína) , em vez de uma ou ambas as proteínas completas. Podem utilizar-se quaisquer de entre vários métodos levados à prática rotineiramente na arte para identificar e isolar os locais de ligação. Estes métodos incluem, entre outros, mutagénese do gene que codifica uma das proteínas e rastreio para destruição de ligação num ensaio de co-imunoprecipitação. Podem então seleccionar-se mutações de compensação no gene que codifica a segunda espécie no complexo. A análise de sequência dos genes que codificam as respectivas proteínas revelará as mutações que correspondem à região da proteína envolvida na ligação de interacção. Alternativamente, pode ancorar-se uma proteína a uma superfície sólida utilizando métodos descritos supra e deixada interactuar e ligar-se ao seu parceiro de ligação marcado, que foi tratado com uma enzima proteolítica tal como tripsina. Após lavagem, pode permanecer associado ao material sólido um péptido marcado curto incluindo o domínio de ligação, que pode ser isolado e identificado por sequenciação de aminoácidos. Igualmente, uma vez obtido o gene que codifica para o parceiro de ligação intracelular podem conceber-se racionalmente segmentos génicos curtos para expressarem fragmentos de péptido da proteína, que podem ser então ensaiados para actividade de ligação e purificados ou sintetizados.

Por exemplo, sem qualquer intenção limitativa, pode ancorar-se um produto génico de pl01 a um material sólido como descrito supra, produzindo uma proteína de fusão GST-subunidade reguladora plOl e deixando que se ligue às pérolas de glutationa agarose. 0 parceiro de ligação de interacção 65 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ pode ser marcado com um isótopo radioactivo, tal como 35S e clivado com uma enzima proteolítica tal como tripsina. Os produtos de clivagem podem então ser adicionados à proteína de fusão ancorada GST-plOl e deixam-se ligar. Após remoção por lavagem dos péptidos não ligados, o material ligado marcado que representa o domínio de ligação do parceiro de ligação intracelular pode ser eluído, purificado e analisado relativamente a sequência de aminoácidos por métodos bem conhecidos. Os péptidos assim identificados podem ser produzidos sinteticamente ou fundidos com proteínas

facilitadoras adequadas utilizando tecnologia de ADN recombinante.

5.5.4 ENSAIOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS QUE MELHORAM AS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS

Podem ensaiar-se compostos, incluindo entre outros a ligação de compostos identificados através de técnicas de ensaio tal como as descritas supra nas secções 5.5.1 até 5.5.3, relativamente à capacidade de melhorar os sintomas de doenças do sistema imunitário, incluindo inflamação. Os ensaios descritos supra podem identificar compostos que afectam a actividade da subunidade reguladora plOl (por exemplo, compostos que se ligam à subunidade reguladora plOl, inibem a ligação dos ligandos naturais e que activam transdução de sinal (agonistas) ou bloqueiam activação (antagonistas) e compostos que se ligam a um ligando natural da subunidade reguladora plOl e neutralizam a actividade do ligando); ou compostos que afectam actividade génica de plOl ou p!20 (afectando expressão génica de plOl ou p!20, incluindo moléculas, por exemplo, proteínas ou moléculas orgânicas pequenas que afectam ou interferem com eventos de splicing de modo que a expressão da forma completa ou truncada da subunidade reguladora plOl pode ser modulada). Contudo, deve notar-se que os ensaios descritos aqui podem também identificar compostos que modulam transdução de sinal da subunidade reguladora plOl (por exemplo, compostos que afectam eventos de sinalização a jusante tais como inibidores ou facilitadores de actividades que participam na transdução do sinal Ptdlns(4,5)P3 que é gerado por ligação da subunidade catalítica à subunidade reguladora plOl). Encontram-se abrangidas pelo âmbito do invento, a identificação e 66 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ utilização de tais compostos que afectam outra etapa na via de transdução de sinal da subunidade reguladora plOl na qual está envolvido o gene plOl ou p!20 e/ou o produto génico de plOl ou p!20 e afectando esta mesma via, pode modular o efeito da subunidade reguladora plOl sobre o desenvolvimento de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética. Tais compostos podem ser utilizados como parte de um método terapêutico para tratamento de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética. 0 invento abrange ensaios baseados em células e baseados em modelos animais para a identificação de compostos apresentado uma tal capacidade para melhorar sintomas de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética. Tais sistemas de ensaio baseados em células podem também ser utilizados como um padrão para ensaiar para pureza e potência do ligando natural, subunidade catalítica, incluindo subunidade catalítica e mutantes de subunidade catalítica produzidos de modo recombinante ou sintético.

Podem utilizar-se sistemas baseados em células para identificar compostos que podem actuar para melhorar sintomas de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética. Tais sistemas de células podem incluir, por exemplo, células recombinantes ou não recombinantes, tal como linhas celulares, que expressam os genes plOl e/ou p!20. Por exemplo, podem utilizar-se células de leucócitos ou linhas celulares derivadas de células de leucócitos. Adicionalmente, podem utilizar-se como um ponto final do ensaio células hospedeiras de expressão (por exemplo, células COS, células CHO, fibroblastos, células Sf9) geneticamente modificadas para expressar um pl01/pl20 PI3K funcional e responder à activação pelas subunidades Θβγ do ligando natural, por exemplo, como medida por uma alteração química ou fenotípica, indução de outro gene da célula hospedeira, alteração dos níveis de mensageiro intracelular (por exemplo, Ptdlns(3,4,5)P3, etc.).

Ao utilizar tais sistemas celulares, podem expor-se células a um composto que se suspeita apresentar uma capacidade de melhorar sintomas de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética a uma concentração e durante um intervalo de tempo suficiente para desencadear tal melhoria 67 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ de sintomas de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética nas células expostas. Após exposição, as células podem ser ensaiadas para medir alterações na expressão do gene plOl ou p!20, por exemplo, por ensaio de lisados celulares para produtos de transcrição de ARNm de plOl ou p!20 (por exemplo, por análise de "Northern") ou para proteína plOl ou p!20 expressa na célula; os compostos que regulam ou modulam a expressão do gene plOl ou p!20 são candidatos valiosos como agentes terapêuticos. Alternativamente, as células são analisadas para determinar se um ou mais dos fenótipos celulares do tipo de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética foi alterado de modo a se assemelhar a um fenótipo mais normal ou mais do tipo selvagem ou a um fenótipo com maior probabilidade de produzir uma incidência ou gravidade menores dos sintomas da doença. Ainda adicionalmente, podem ensaiar-se a expressão e/ou actividade das componentes da via de transdução de sinal da qual faz parte a subunidade reguladora plOl, ou a actividade da própria via de transdução de sinal da subunidade reguladora plOl.

Por exemplo, após exposição das células podem ensaiar-se lisados celulares para a presença de níveis aumentados do segundo mensageiro Ptdlns(3,4,5)P3 comparativamente com lisados derivados de células de controlo não expostas. A capacidade de um composto de ensaio inibir a produção de um segundo mensageiro nestes sistemas indicam que o composto de ensaio inibe a transdução de sinal iniciada pela activação da subunidade reguladora plOl. Os lisados celulares podem ser facilmente ensaiado utilizando HPLC de permuta aniónica. Alternativamente, podem ensaiar-se níveis de produção de superóxido ou O2 por monitorização de quimioluminescência de oxidação de luminol catalisada pela peroxidase de rábano como descrito em Wymann et ai., 1987, Anal. Biochem. 165:371-378. Finalmente, pode ensaiar-se uma alteração na adesão celular de células intactas utilizando técnicas bem conhecidas pelos peritos na arte.

Adicionalmente, podem utilizar-se sistemas de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética baseados em animais, que podem incluir, por exemplo, ratinhos para identificar compostos capazes de melhorar sintomas do tipo de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética. Tais 68 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ modelos animais podem ser utilizados como sistemas de ensaio para a identificação de fármacos, produtos farmacêuticos, terapias e intervenções que podem ser eficazes para o tratamento de tais doenças. Por exemplo, podem expor-se modelos animais a um composto que se suspeita apresentar a capacidade de melhorar sintomas de doenças de activação de linhaqem celular hematopoiética a uma concentração suficiente e durante um intervalo de tempo suficiente para desencadear tal melhoria de sintomas de doenças de activação de linhaqem celular hematopoiética nos animais expostos. A resposta dos animais à exposição pode ser monitorizada por avaliação da reqressão das doenças associadas com doenças de activação de linhagem celular hematopoiética tal como inflamação. Relativamente à intervenção, quaisquer tratamentos que façam regredir qualquer aspecto de sintomas do tipo de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética devem ser considerados como candidatos para intervenção terapêutica de doença de activação de linhagem celular hematopoiética humana. As dosagens de agentes de ensaio podem ser determinadas por derivação de curvas dose-resposta, como discutido infra.

5.6 0 TRATAMENTO DE DOENÇAS ASSOCIADAS COM ESTIMULAÇÃO DE PI3K ACTIVADO POR PROTEÍNA G, INCLUINDO DOENÇAS INFLAMATÓRIAS 0 invento também abrange métodos e composições para modificar activação de linhagem celular hematopoiética e tratar doenças de activação de linhagem celular hematopoiética, incluindo doenças inflamatórias. Por exemplo, por diminuição do nível de expressão do gene plOl e/ou actividade do gene da subunidade reguladora plOl e/ou regular negativamente a actividade da via da subunidade reguladora plOl (por exemplo, por interferência com a interacção da subunidade reguladora plOl com a subunidade catalítica pl20 ou tomando como alvo eventos de sinalização a jusante), a resposta de células de leucócito a factores que activam os receptores associados à proteína G trimérica, tais como citoquinas pode ser diminuída e os sintomas de doenças de inflamação crónica podem ser melhorados. Inversamente, a resposta de células de leucócito à activação de receptores associados a proteína G pode ser aumentada por aumento da actividade da subunidade reguladora plOl. Por exemplo, tal aumento pode servir para reforçar a resposta do sistema 69 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ imunitário a infecções. Discutem-se infra abordagem diferentes.

5.6.1 INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DO ADAPTADOR DE plOl OU ACTIVIDADE DO ADAPTADOR DE plOl PARA REDUZIR ACTIVIDADE DE PI3K ACTIVADA POR PROTEÍNA G E REDUZIR A INFLAMAÇÃO

Qualquer método que neutralize a subunidade catalítica ou que iniba a expressão do gene pl01 ou p!20 (quer transcrição quer tradução) pode ser utilizado para reduzir a resposta inflamatória. Tais abordagens podem ser utilizada para tratar doenças de resposta inflamatória tais como artrite, incluindo artrite reumatóide, choque séptico, síndrome da dificuldade respiratória aguda em adultos (ARDS), pneumonia, asma e outras condições pulmonares, alergias, lesão de reperfusão, aterosclerose e outras doenças cardiovasculares, doença de Alzheimer e cancro, sendo estas apenas algumas doenças inflamatórias.

Numa concretização, a terapia imunitária pode ser concebida para reduzir o nível de expressão génica de plOl ou p!20 endógena, por exemplo, utilizando abordagens anti-sentido ou de ribozima para inibir ou evitar tradução de produtos de transcrição de ARNm de plOl ou p!20; abordagens de hélice tripla para inibir transcrição do gene plOl ou p!20; ou recombinação homóloga como alvo para inactivar ou eliminar o gene plOl ou p!2Q ou o seu promotor endógeno.

As abordagens anti-sentido envolvem a concepção de oligonucleótidos (quer ADN quer ARN) que são complementares ao ARNm da subunidade reguladora de plOl ou pl20. Os oligonucleótidos anti-sentido ligar-se-ão aos produtos de transcrição de ARNm de plOl ou p!20 complementares e evitam a tradução. Apesar de preferida a complementaridade absoluta não é necessária. Uma sequência "complementar" a uma porção de um ARN, tal como aqui referida, significa uma sequência que apresenta complementaridade suficiente para ser capaz de hibridar com o ARN formando uma cadeia dupla estável. No caso de ácidos nucleicos anti-sentido em cadeia dupla apenas pode ser assim ensaiada uma cadeia simples do ADN em cadeia dupla ou pode ensaiar-se a formação de cadeia tripla. A capacidade de hibridar dependerá tanto do grau de complementaridade como 70 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ do comprimento do ácido nucleico anti-sentido. De um modo geral, quanto maior o ácido nucleico que híbrida mais erros de emparelhamento de bases com um ARN pode conter e apesar disso formar uma cadeia dupla estável (ou cadeia tripla, conforme o caso) . O perito na arte poderá avaliar um grau tolerável de erros de emparelhamento utilizando procedimentos padrão para determinar o ponto de fusão do complexo hibridado.

Os oligonucleótidos que são complementares à extremidade 5' da mensagem, por exemplo, a sequência não traduzida a 5' até ao codão de iniciação AUG, inclusive, devem funcionar de modo muito eficaz para inibir a tradução. Contudo, provou-se recentemente que sequências complementares a sequências não traduzidas da extremidade 3' de ARNm são igualmente eficazes para inibir a tradução de ARNm. Consultar de um modo geral, Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335. Assim, oligonucleótidos complementares às regiões não traduzidas e não codificantes de plOl ou p!20 quer a 5' quer a 3', apresentadas na figura 1 e na figura 3 poderiam ser utilizados numa abordagem anti-sentido para inibir tradução de ARNm endógeno de pl01 ou p!20. Os oligonucleótidos complementares à região não traduzida a 5' do ARNm deveriam incluir o complementar do codão de iniciação AUG. Os oligonucleótidos anti-sentido complementares às regiões de codificação de ARNm são inibidores menos eficazes de tradução mas podem ser utilizados de acordo com o invento. Quer sejam concebidos para hibridar com a região 5', com a região 3', ou com a região de codificação da subunidade reguladora do ARNm de plOl, os ácido nucleicos anti-sentido devem ter um comprimento de pelo menos seis nucleótidos e são de preferência oligonucleótidos variando na gama desde 6 a cerca de 50 nucleótidos de comprimento. Em aspectos específicos, o oligonucleótido tem um comprimento de pelo menos 10 nucleótidos, pelo menos 17 nucleótidos, pelo menos 25 nucleótidos ou pelo menos 50 nucleótidos.

Independentemente da escolha da sequência alvo, prefere-se que os estudos in vitro sejam primeiramente efectuados para quantificar a capacidade do oligonucleótido anti-sentido inibir expressão génica. Prefere-se que estes estudos utilizem controlos que distinguem entre inibição génica anti-sentido e efeitos biológicos não específicos de oligonucleótidos. 71 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Prefere-se também que estes estudos comparem níveis do ARN ou proteína alvo com os de um ARN ou proteína de controlo interno. Além disso, pretende-se que os resultados obtidos utilizando o oligonucleótido anti-sentido sejam comparados com os resultados obtidos utilizando um oligonucleótido de controlo. Prefere-se que o oligonucleótido de controlo tenha aproximadamente o mesmo comprimento que o oligonucleótido de ensaio e que a sequência de nucleótidos do oligonucleótido difira da sequência anti-sentido em não mais que o necessário para evitar hibridação específica com a sequência alvo.

Os oligonucleótidos podem ser ADN ou ARN ou misturas ou derivados quiméricos ou suas versões modificadas em cadeia simples ou em cadeia dupla. 0 oligonucleótido pode ser modificado na porção de base, na porção de açúcar ou no esqueleto de fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, a hibridação, etc. 0 oligonucleótido pode incluir outros grupos anexos tais como péptidos (por exemplo, para ter como alvo receptores de célula hospedeira in vivo), ou agentes que facilitem o transporte através da

membrana celular (consultar, por exemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. 84:648-652; publicação PCT n° W088/09810, publicada a 15 de Dezembro de 1988) ou agentes de clivagem desencadeados por hibridação. (Consultar, por exemplo, Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958-976) ou agentes de intercalação. (Consultar, por exemplo, Zon. 1988, Pharm. Res. 5:539-549). Com este objectivo, o oligonucleótido pode ser conjugado com outra molécula, por exemplo, um péptido, agente de reticulação desencadeado por hibridação, agente de transporte, agente de clivagem desencadeado por hibridação, etc. 0 oligonucleótido anti-sentido pode incluir pelo menos uma porção de base modificada que é seleccionada do grupo que inclui, entre outros, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxi-hidroxilmetil)uracilo, 5-carboxi-metilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, di-hidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 72 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracilo-5-oxiacético(v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4- tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico do ácido uracilo- 5- oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético(v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w e 2,6-diaminopurina. 0 oligonucleótido anti-sentido pode também incluir pelo menos uma porção de açúcar modificada seleccionada do grupo incluindo, entre outros, arabinose, 2-fluoroarabinose, xilulose e hexose.

Noutra concretização, o oligonucleótido anti-sentido inclui pelo menos um esqueleto de fosfato modificado seleccionado do grupo que consiste em um fosforotiolato, um fosforoditiolato, um fosforoamidotiolato, um fosforoamidato, um fosforodiamidato, um metilfosfonato, um alquilfosfotriéster e um formacetal ou um seu análogo.

Ainda noutra concretização, o oligonucleótido anti-sentido é um oligonucleótido anomérico a. Um oligonucleótido anomérico α forma híbridos de cadeia dupla específicos com ARN complementar no qual, contrariamente às unidades β habituais, as cadeias são paralelas entre si (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641). 0 oligonucleótido é um 2' -0- metilrribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148) ou um análogo quimérico ARN-ADN (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

Os oligonucleótidos do invento podem ser sintetizados por métodos padrão conhecidos na arte, por exemplo utilizando um sintetizador automático de ADN (tal como os comercialmente disponíveis de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como exemplos, podem sintetizar-se oligonucleótidos fosforotiolato pelo método de Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16:3209. Podem preparar-se oligonucleótidos metilfosfonato utilizando suportes de polímero de vidro de poro controlado (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:7448-7451). 73 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Apesar de se poderem utilizar nucleótidos anti-sentido complementares à sequência da região de codificação de plOl ou p!20, os nucleótidos complementares à região não traduzida transcrita são os mais preferidos.

As moléculas anti-sentido devem ser entregues a células que expressam a subunidade reguladora plOl in vivo, por exemplo, células de origem hematopoiética tal como plaquetas e neutrófilos e outros leucócitos. Têm sido desenvolvidos vários métodos para entregar ADN ou ARN anti-sentido a células; por exemplo, podem injectar-se moléculas anti-sentido directamente no local de derivação do tecido ou célula, ou podem administrar-se sistemicamente moléculas anti-sentido modificadas concebidas para ter como alvo as células pretendidas (por exemplo, anti-sentido ligado a péptidos ou anticorpos que se ligam especificamente a receptores ou antigénios expressos à superfície da célula alvo).

Contudo, é muitas vezes difícil obter concentrações intracelulares do anti-sentido suficientes para suprimir tradução de ARNm endógenos. Consequentemente, uma abordagem preferida utiliza uma construção de ADN recombinante na qual o oligonucleótido anti-sentido é colocado sob o controlo de um promotor forte pol III ou pol II. A utilização de tal construção para transfectar células alvo num doente resultará na transcrição de quantidades suficientes de ARN em cadeia simples que formarão pares de bases complementares com os produtos de transcrição de pl 01 ou p!20 endógenos e assim evitarão tradução do ARNm de plOl ou p!20. Por exemplo, pode introduzir-se um vector in vivo de modo a ser absorvido por uma célula e dirigir a transcrição de um ARN anti-sentido. Tal vector pode permanecer no epissoma ou pode integrar-se no cromossoma, desde que possa ser transcrito para produzir o ARN anti-sentido pretendido. Tais vectores podem ser construídos por métodos padrão na arte de tecnologia de ADN recombinante. Os vectores podem ser plasmídeos, virais ou outros conhecidos na arte utilizados para replicação e expressão em células de mamífero. A expressão da sequência que codifica o ARN anti-sentido pode ser por qualquer promotor conhecido na arte para funcionar em células de mamífero, de preferência humanas. Tais promotores podem ser induzidos ou constitutivos. Tais promotores incluem, entre outros: a região de promotor precoce 74 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ SV40 (Bernoist e Chambon, 1981, Nature 290:304-310), ο promotor contido na sequência longa terminal repetitiva a 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), o promotor da timidina quinase de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:1441-1445), as sequências reguladoras do gene de metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), etc. Qualquer tipo de plasmídeo, cosmídeo, YAC ou vector virai pode ser utilizado para preparar a construção de ADN recombinante que pode ser introduzida directamente no local de derivação do tecido ou célula; por exemplo, a medula óssea. Alternativamente, podem ser utilizados vectores virais que infectam selectivamente o tipo de tecido ou célula pretendido; (por exemplo, vírus que infectam células de linhagem hematopoiética) caso em que a administração pode ser obtida por outra via (por exemplo, sistemicamente).

Podem também ser utilizadas moléculas de ribozima concebidas para clivar cataliticamente produtos de transcrição de ARNm de pl01 ou p!20 para evitar tradução de ARNm de plOl ou p!20 e expressão da subunidade reguladora plOl. (Consultar, por exemplo, publicação internacional PCT WO90/11364, publicada a 4 de Outubro de 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Apesar das ribozimas que clivam o ARNm em sequências de reconhecimento específicas do local poderem ser utilizadas para destruir ARNm de pl01 ou p!20, é preferida a utilização de ribozimas com estrutura em cabeça de martelo. As ribozimas com estrutura em cabeça de martelo clivam ARNm em localizações ditadas pelas regiões flanqueadoras que formam pares de bases complementares com o ARNm alvo. O único requisito é que o ARNm alvo tenha a seguinte sequência de duas bases: 5'-UG-3'. A construção e produção de ribozimas com estrutura em cabeça de martelo é bem conhecida na arte e é descrita em maior detalhe em Haseloff e Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591. Existem centenas de locais de clivagem potenciais de ribozima com estrutura em cabeça de martelo no interior da sequência de nucleótidos de ADNc de pl 01 ou p!20 humano (figura 3). De preferência, a ribozima é concebida racionalmente de modo a que o local de reconhecimento de clivagem se localize perto da extremidade 5' do ARNm de pl01 ou p!20; ou seja, para aumentar a eficácia e minimizar a 75 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ acumulação intracelular de produtos de transcrição de ARNm não funcionais.

As ribozimas do presente invento incluem também endorribonucleases de ARN (doravante "ribozimas do tipo Cech") tal como a que ocorre naturalmente em Tetrahymena Thermophila (conhecida como a IVS ou ARN L-19 IVS) e que foi descrita extensivamente por Thomas Cech e colaboradores (Zaug et al., 1984, Science, 224:574-578; Zaug e Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug et al., 1986, Nature, 324:429-433; pedido de patente internacional publicado n° WO 88/04300 por University Patents Inc.; Been e Cech, 1986, Cell, 47:207-216). As ribozimas do tipo Cech apresentam um local activo com oito pares de bases que hibridam com uma sequência de ARN alvo onde seguidamente ocorre clivagem do ARN alvo. O invento abrange essas ribozimas do tipo Cech que têm como alvo sequências de local activo com oito pares de bases que estão presentes em pl01 ou p!20.

Tal como na abordagem anti-sentido, as ribozimas podem ser compostas por oligonucleótidos modificados (por exemplo para estabilidade melhorada, dirigir ao alvo, etc.) e devem ser entregues às células que expressam a subunidade reguladora plOl in vivo, por exemplo, neutrófilos. Um método preferido de entrega envolve a utilização de uma construção de ADN "que codifica" uma ribozima sob o controlo de um promotor constitutivo forte pol III ou pol II, de modo que as células transfectadas produzirão quantidades suficientes da ribozima para destruir mensagens de plOl ou p!20 endógenas e inibir a tradução. Devido às ribozimas serem catalíticas, contrariamente às moléculas anti-sentido, a concentração intracelular necessária para a mesma eficácia é menor. A expressão do gene plOl ou p!20 endógeno pode também ser reduzida por inactivação ou eliminação do gene plOl ou p!20 ou do seu promotor utilizando recombinação homóloga dirigida ao alvo. (Por exemplo, consultar Smithies et al., 1985, Nature 317:230-234; Thomas e Capecchi, 1987, Cell 51:503-512; Thompson et al., 1989 Cell 5:313-321; cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Por exemplo, pode utilizar-se uma subunidade reguladora plOl mutante e não funcional (ou uma sequência de ADN completamente não 76 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ relacionada) flanqueada por ADN homólogo ao gene plOl ou p!20 endógeno (quer as regiões de codificação, quer as regiões reguladoras do gene plOl ou p!20) , com ou sem um marcador seleccionável e/ou um marcador de selecção negativa para transfectar células que expressam subunidade reguladora plOl in vivo. A inserção da construção de ADN, através de recombinação homóloga dirigida ao alvo, resulta em inactivação do gene plOl ou p!20. Tais abordagens são particularmente adequadas no campo agrícola no qual se podem utilizar modificações das células ES (estaminais embrionárias) para gerar uma descendência animal com uma subunidade reguladora plOl inactiva (por exemplo, consultar Thomas e Capecchi 1987 e Thompson 1989, supra). Contudo esta abordagem pode ser adaptada para utilização em humanos desde que as construções de ADN recombinante sejam administradas directamente ou dirigidas ao alvo para o local requerido in vivo utilizando vectores virais adequados.

Alternativamente, a expressão endógena do gene plOl ou p!20 pode ser reduzida dirigindo ao alvo sequências de desoxirribonucleótidos complementares à região reguladora do gene pl01 ou p!20 (ou seja, o promotor e/ou facilitadores de pl01 ou p!20) para formar estruturas de hélice tripla que evitam transcrição do gene plOl ou p!20 em células alvo no corpo. (Consultar de um modo geral, Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C. et ai., 1992, Ann, N.Y. Acad. Sei., 660:27-36; e Maher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807-15).

Ainda noutra concretização do invento, a actividade da subunidade reguladora plOl pode ser reduzida utilizando uma abordagem "dominante negativa" para interferir com a activação de PI3K com a proteína G trimérica. Com este objectivo, podem utilizar-se construções que codificam subunidades reguladoras plOl deficientes em abordagens de terapia génica para diminuir a actividade da subunidade reguladora plOl em células alvo adequadas. Por exemplo, podem introduzir-se em células hematopoiéticas (por métodos de terapia génica quer in vivo quer ex vivo, descritos supra) sequências de nucleótidos que dirigem expressão na célula hospedeira de subunidades reguladoras plOl nas quais o domínio de interaeção de Θβγ está eliminado ou mutado. Alternativamente, podem utilizar-se 77 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ sequências de nucleótidos que codificam apenas um domínio funcional de plOl como um inibidor de interacções nativas pl01/pl20. Alternativamente, pode utilizar-se recombinação homóloga dirigida ao alvo para introduzir tais deleções ou mutações no gene plOl ou p!20 endógeno na medula óssea do indivíduo. As células concebidas racionalmente expressarão receptores não funcionais (ou seja, uma subunidade reguladora que é capaz de ligar a subunidade catalítica mas que é incapaz de estimular a actividade catalítica em resposta a activação por proteína G). Tais células concebidas racionalmente, ou seja neutrófilos ou outras linhas de leucócitos, devem demonstrar uma resposta diminuída relativamente a activação de receptores ligados a proteína G a quimioquinas extracelulares, resultando na redução do fenótipo inflamatório.

5.6.2 RESTAURAÇÃO OU AUMENTO DA EXPRESSÃO OU ACTIVIDADE DA SUBUNIDADE REGULADORA plOl PARA PROMOVER ACTIVAÇÃO DO SISTEMA IMUNITÁRIO

Relativamente a um aumento do nível de expressão génica normal de pl01 ou p!20 e/ou de actividade do produto génico da subunidade reguladora plOl, podem utilizar-se sequências de ácido nucleico de plOl ou p!20 para o tratamento de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética, incluindo respostas reduzidas do sistema imunitário a quimioquinas. Nos casos em que a causa de disfunção do sistema imunitário é uma subunidade reguladora plOl deficiente, o tratamento pode ser administrado, por exemplo, sob a forma de terapia de substituição génica. Especificamente, uma ou mais cópias de um gene plOl normal ou de uma porção de um gene plOl que dirige a produção de um produto génico de plOl que apresenta função normal, podem ser inseridas nas células apropriadas num indivíduo doente ou animal utilizando vectores que incluem, entre outros, vectores de adenovírus, de vírus adeno-associados, de retrovírus e de vírus herpes, além de outras partículas que introduzem ADN em células tais como lipossomas.

Devido ao gene pl 01 ou p!20 ser expresso em linhagens celulares hematopoiéticas incluindo os neutrófilos e outros leucócitos, tais técnicas de terapia de substituição génica devem ser capazes de entregar sequências de gene plOl ou p!20 a esses tipos de células nos doentes. Alternativamente, pode 78 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ utilizar-se recombinação homóloga dirigida ao alvo para corrigir o gene deficiente endógeno plOl ou p!20 no tipo de célula apropriado; por exemplo, células de medula óssea ou neutrófilos e/ou outros leucócitos. Em animais, pode utilizar-se recombinação homóloga dirigida ao alvo para corrigir a deficiência em células ES de modo a gerar descendência com um traço corrigido.

Finalmente, podem utilizar-se compostos identificados nos ensaios descritos supra gue estimulam, aumentam ou modificam o sinal transduzido pela subunidade reguladora plOl activada, por exemplo, por activação da sinalização de proteínas a jusante na cascata de subunidade reguladora plOl e assim evitando a subunidade reguladora plOl deficiente, para obter estimulação do sistema imunitário. A formulação e modo de administração dependerá das propriedades fisico-guimicas do composto.

5.7 PREPARAÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO

Os compostos que se determine afectarem a expressão génica de plOl ou p!20 ou a actividade da subunidade reguladora plOl ou a interacção de plOl com qualquer um dos seus parceiros de ligação incluindo, entre outros, a subunidade catalítica, podem ser administrados a um doente em doses terapeuticamente eficazes para tratar ou melhorar doenças de activação de células hematopoiéticas, incluindo doenças de resposta inflamatória tais como artrite, incluindo artrite reumatóide, choque séptico, síndrome da dificuldade respiratória aguda em adultos (ARDS), pneumonia, asma e outras condições pulmonares, alergias, lesão de reperfusão, aterosclerose e outras doenças cardiovasculares, doença de Alzheimer e cancro. Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade de composto que é suficiente para resultar numa melhoria dos sintomas de doenças de activação de linhagem celular hematopoiética.

5.7.1 DOSE EFICAZ A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos pode ser determinada por procedimento farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 79 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode expressar-se como a razão LD5o/ED5o. Os compostos que apresentam índices terapêuticos elevados são preferidos. Apesar de se poder utilizar compostos que apresentam efeitos secundários tóxicos, devem ser tomadas precauções no sentido de conceber um sistema de entrega que dirija tais compostos ao local do tecido afectado de modo a minimizar os danos potenciais a células não infectadas e assim reduzir efeitos secundários.

Os dados obtidos dos ensaios de cultura de células e estudos de animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem para utilização em humanos. A dosagem de tais compostos situa-se de preferência numa gama de concentrações em circulação que inclui a ED5o com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método do invento, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma gama de concentração no plasma em circulação que inclui a IC50 (ou seja, a concentração de composto de ensaio que leva a uma inibição de sintomas com metade do valor máximo) tal como determinado em cultura de células. Tal informação pode ser utilizada para determinar de modo mais exacto doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de elevada resolução.

5.7.2 FORMULAÇÕES E UTILIZAÇÃO

Podem formular-se composições farmacêuticas para utilização de acordo com o presente invento de modo convencional utilizando um ou mais transportadores ou excipientes fisiologicamente aceitáveis.

Assim, os compostos e os seus sais e produtos de solvatação fisiologicamente aceitáveis podem ser formulados para administração por inalação ou insuflagem (quer através da boca quer através do nariz) ou administração oral, bucal, parentérica ou rectal. 80 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Para administração oral, as composições farmacêuticas podem ter a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparados por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose); agentes de enchimento (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido de sódio); ou agentes molhantes (por exemplo, laurilsulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na arte. As preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões ou podem apresentar-se como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes de utilizar. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras alimentares hidrogenadas); agentes emulsionantes (por exemplo, lecitina ou goma arábica); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fraccionados); e conservantes (por exemplo, metil-p-hidroxibenzoatos ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais de tampões, agentes aromatizantes, corantes e edulcorantes como adequado.

As preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para proporcionar libertação controlada do composto activo.

As composições para administração bucal podem tomar a forma de comprimidos ou rebuçados formulados de modo convencional.

Para administração por inalação, os compostos para utilização de acordo com o presente invento são convenientemente entregues sob a forma de apresentação de um aerossol em pacotes pressurizados ou de um nebulizador com a utilização de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás 81 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para entregar uma quantidade medida. Podem formular-se cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para utilização num inalador ou insuflador contendo uma mistura em pó do composto e uma base de pó adequada tal como lactose ou amido.

Podem formular-se os compostos para administração parentérica por injecção, por exemplo, por injecção de bolus ou infusão continua. As formulações de injecção podem apresentar-se em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multi-dose com um conservante adicionado. As composições pode tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veiculos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente activo pode encontrar-se sob a forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril e isenta de pirogénios, antes de utilizar.

Os compostos podem também ser formulados em composições rectais tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases de supositórios convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Além das formulações previamente descritas, os compostos podem também ser formulados como preparação de depósito. Tais formulações de acção prolongada podem ser administradas por implante (por exemplo subcutâneo ou intramuscular) ou por injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (por exemplo como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal fracamente solúvel.

As composições podem, caso pretendido, apresentar-se num pacote ou dispositivo distribuidor que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente activo. 0 pacote pode, por exemplo, incluir folha metálica ou de plástico, tal como um pacote de tipo "bllster". 0 pacote ou dispositivo distribuidor pode ser acompanhado de instruções para administração. 82 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Apresentam-se os seguintes exemplos para ilustrar o presente invento e para auxiliar o perito na arte na produção e utilização do mesmo. Não se pretende que os exemplos limitem de qualquer outro modo o âmbito da revelação ou a protecção aqui proporcionada pelo titulo de patente. 6. EXEMPLO: Purificação e caracterização de actividades PI3K porcinas activadas por ΰβγ

6.1 MATERIAIS E MÉTODOS

6.1.1 ENSAIOS PI3K

Diluiram-se aliquotas purificadas de PI3K derivado de Sf9 ou derivado de citosol de neutrófilo de porco em NaCl 0,12 M, HEPES 25 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, BSA a 1 mg.ml-1, betaina a 1%, Tween-20 a 0,02% p/v, pH 7,4, gelado a 0°C em extensão adequada e seguidamente armazenaram-se aliquotas de 5 μΐ em gelo até serem ensaiadas. Quando os ensaios de PI3K foram efectuados em imunoprecipitados de células U937 (consultar os exemplos seguintes), então ο PI3K foi imobilizado em 10 μΐ de pérolas empacotadas de proteína G Sepharose num tampão gelado definido supra. Adicionou-se 30 μΐ de uma mistura de fosfolípidos com ou sem ΰβγ e/ou Ga (quer ligados a GDP quer activados) às fracções de 5 μΐ ou 10 μΐ de pérolas e misturou-se. Após 10 minutos em gelo, adicionou-se e misturou-se 5-10 μΐ do tampão da lavagem final suplementado com MgCl2 para dar uma concentração final no presente volume de ensaio de 3,5 mM. Seis minutos depois, adicionou-se 5 μΐ do tampão da lavagem final (para proporcionar um volume de ensaio final de 50 μΐ) contendo [γ32Ρ]-ΑΤΡ (tipicamente 10 pCi ensaio-1, Amersham, PB10168) e MgCl2 3,5 mM, misturaram-se os tubos e transferiram-se para um banho de água a 30°C. Pararam-se os ensaios após 15 minutos com 500 μΐ de clorofórmio:metanol:H20 (29:54:13,1, v/v/v). Adicionaram-se subsequentemente um μΐ de ATP 100 mM, 103 μΐ de HC1 2,4 e 434 μΐ de clorofórmio para originar uma distribuição de solventes Folch em duas fases. Após agitação e centrifugação removeram-se as fases inferiores e transferiram-se para tubos lavados contendo 424 μΐ de "fase superior" fresca (metanol :HC1 1M: clorofórmio; 48:47:3, v/v/v). Após mistura e centrifugação removeu-se a fase inferior para um tubo fresco (durante a 83 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ purificação de ΡΙ3Κ de neutrófilo porcino, quantificou-se produto lipidico [32P] nesta altura do protocolo com um contador geiger), secou-se sob vácuo, desacilou-se e resolveu-se por TLC em placas PEI (com HC1 0,6 M; Ptdlns(3,4,5)P3 apresenta um Rf de 0,47) (Stephens et al., 1994, Cell 77:83-93). Nalgumas experiências redissolveu-se o lipido seco em clorofórmio:metanol/2:1, v/v), aplicou-se a um placa de TLC impregnada com oxalato de potássio e resolveu-se numa mistura de clorofórmio: acetona: metanol: ácido acético: H2O (40: 15: 13: 12: 8, v/v/v/v/v; Traynor-Kaplan et al., 1988) .

Prepararam-se as misturas lipido/subunidade de proteína G do seguinte modo: secaram-se Ptdlns(4,5)P2 (que foi preparada a partir de fracções fosfoinositídeo Folch utilizando 2 ciclos de cromatografia em neomicina imobilizada) e PtdEtn (Sigma) sob vácuo (quantidade suficiente para fornecer concentrações finais no ensaio de 50 μΜ e 0,5 mM, respectivamente). Nalgumas experiências incluíram-se PtdIns4P (preparados de modo

semelhante a Ptdlns(4,5)P2) e/ou Ptdlns (Sigma). O lipido seco foi tratado com ultra-sons num banho (à temperatura ambiente) em tampão da lavagem final (supra) suplementado com coleato de sódio a 0,1%. Após arrefecer em gelo, misturaram-se porções desta solução-mãe de lipido disperso com uma mistura para um total de 1 μΐ ensaio-1, tampão de armazenagem de Θβγ (coleato a 1%; HEPES 50 mM, pH 7,5, 4°C, NaCl 0,1 M; DTT 1 mM; EDTA 0,5 mM) , Θβγ activa ou um volume equivalente de Θβγ fervida a partir de soluções-mãe 3-7 mg.ml-1 em tampão de armazenagem. Nalgumas experiências o 1 μΐ incluiria subunidades Ga ou o seu tampão de armazenagem, caso em que as ΰβγ foram pré-misturadas com as subunidades Ga (quer ligada a GDP quer activada; consultar infra) durante 10 minutos em gelo.

Activaram-se subunidades Ga (uma mistura equimolar de Ga: o, i, i2 e i3 preparada como descrito em, e armazenadas no mesmo tampão que as subunidades 6βγ com excepção de suplemento com GDP 10 μΜ) por incubação em gelo com NaF 10 mM, AICI3 30 μΜ (A/F) durante 10 minutos; os ensaios para os quais se diluíram estas subunidades também continham A/F. 84 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ a) Purificação de proteína

Recolheu-se sangue de porco (42 lotes) directamente para anti-coagulante em 21 recipientes. 40 minutos após a recolha misturou-se o sangue/anti-coagulante com polivinilpirrolidona (PVP, 360 kD) a 3% (p/v) em solução salina isotónica (4,2 de mistura de sangue: 0,8 de PVP). Após 35 minutos em repouso (em 25 recipientes) sedimentaram-se adequadamente os eritrócitos para permitir extracção do sobrenadante pelo sistema de sifão e centrifugação (8 minutos, 1000 xg) em recipientes de 1 litro. Recuperaram-se aproximadamente 28 litros deste sobrenadante primário. Ressuspenderam-se as células sedimentadas em solução salina de Hank de modo a que o volume final acumulado ficasse contido em dois frascos de centrifugação de 1 litro. Sedimentaram-se as células por centrifugação (8 minutos a 1000 xg) . Aspiraram-se os sobrenadantes e submeteu-se o sedimento de células a choque hipotónico (para lisar quaisquer eritrócitos contaminantes residuais) por adição de 70 ml de H20 gelada. Após 25-30 segundos de agitação, adicionou-se 77 ml de solução salina de Hank lOx (sem cálcio). Após uma lavagem com solução salina de Hank combinaram-se as células num frasco de centrífuga, sedimentaram-se e ressupenderam-se em 500 ml de solução gelada de TRIS 40 mM, pH 7,5, 4°C; NaCl 0,12 M; MgCl2 2,5 mM.

Adicionou-se fluorofosfato de di-isopropilo (concentração final de 0,5 mM) , após 5 minutos em gelo sedimentaram-se as células (aproximadamente 80-90 ml de volume empacotado) e ressuspenderam-se em 300 ml de solução gelada de TRIS 40 mM, pH 7,5; NaCl 0,1 M; MgCl2 2,5 mM; EGTA 1 mM; EDTA 0,2 mM e antiproteases I. Tratou-se com ultra-sons a suspensão de células (aparelho de ultra-sons Heat Systems Probe, regulado a 9,25, 4 x 15 segundos com 1 minuto de mistura, em gelo, entre cada impulso) e seguidamente centrifugou-se (2000 x g 10 min) para sedimentar células não partidas e núcleos (menos de 5% das células permaneceram intactas). Centrifugou-se o sobrenadante (a 100000 xg, 60 min, 4°C) e decantaram-se os sobrenadantes, juntaram-se, misturaram-se com EDTA, betaína e DTT (concentrações finais de 5 mM, 1% e 1 mM; respectivamente) e finalmente congelaram-se em azoto líquido e armazenaram-se a -80°C. As fracções citosólicas preparadas deste modo apresentavam tipicamente uma concentração de proteína de 8 a 9 mg.ml-1 (cerca de 2,5 g de proteína por preparação). Uma vez 85 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ recolhido ο citosol do equivalente a 750 litros de sangue (18 a 42 preparações, 9 x 1012 células, 40 g de proteína) e armazenado a -80°C, descongelou-se em três lotes separados por 5 horas. A partir deste ponto todos os procedimentos foram efectuados a 2-4°C. O citosol recém-descongelado foi suplementado com Tween-20 (a 0,05%, p/v, concentração final), centrifugado (20 000 xg durante 30 min, 2°C) filtrado (nitrato de celulose 5 pm, 4.5 cm de diâmetro; Whatman) diluído aproximadamente 2,5 x com tampão K (consultar infra) para uma condutividade final de 200 pS (a 4°C) e seguidamente carregado (12,5 ml.min-1 com uma bomba peristáltica) numa coluna de 800 ml (5 cm de diâmetro) de Q Sepharose de caudal rápido equilibrada com tampão K. O volume total de citosol diluído foi de aproximadamente 15.5 litros. Uma vez carregada, a coluna foi lavada com 1 litro de tampão K e seguidamente eluída com um gradiente linear de 4,5 litros de NaCl de 0,1 a 0,6 M em tampão K a 8 ml. min-1. Recolheram-se cinquenta fracções de 1 ml. A condutividade e absorvância (a 280 nm) do eluído da coluna foram monitorizadas continuamente (e em todas as etapas subsequentes). O tampão K tinha a seguinte composição: TRIS/H1 40 mM, EGTA 1 mM, EDTA 0,2 mM, betaína a 1%; Tween 20 a 0,05% p/v, β-glicerofosfato 5 mM, pH 7,5 a 4°C, β-mercaptoetanol 15 mM com 4 pgml-1 de cada um de antipaína, leupeptina, bestatina, pepstatina A e aprotinina e PMSF 0,1 mM ("antiproteases II") . Esta solução, assim como as seguintes foram filtradas por 0,2 pm.

Uma vez identificadas as fracções relevantes por ensaios PI3K, estas foram juntas e imediatamente carregadas (10 ml.min-1) numa coluna de 1,8 1 (5 cm de diâmetro) de Sephadex-G25 fina, que tinha sido pré-equilibrada com 18 1 de tampão L (apenas os últimos 2 litros com antiproteases II), (o tampão L continha: β-glicerofosfato 5 mM, KC1 20 mM, Tween 20 a 0,05% p/v, betaína a 1%, EDTA 0,1 mM, fosfato de potássio 10 mM, pH 7,0 a 4°C, β-mercaptoetanol 15 mM mais antiproteases II). A mistura dessalinizada de Sepharose Q foi imediatamente carregada (5 ml. min-1) em 8 0 ml de hidroxilapatite (2,6 cm de diâmetro; Macroprep-ceramic, BioRad) equilibrada com 1 litro de tampão M (β-glicerofosfato 5 mM; fosfato de potássio 10 mM, pH 7,0, 4°C, Tween 20 a 86 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 0,05% p/v, betaína a 1%, β-mercaptoetanol 15 mM) a um caudal de 10 ml.min-1 e seguidamente com 100 ml de tampão N (constituído por tampão M suplementado com EDTA 0,1 mM e antiproteases I) imediatamente antes de carregar a amostra. Após carga, lavou-se a coluna com 100 ml de tampão N e eluíu-se com 100 ml de uma gradiente linear desde 0,05 a 0,35 M de fosfato de potássio em tampão N (4 ml.min-1). Recolheram-se fracções de 25 ml e ensaiaram-se relativamente para PI3K estimulada por Θβγ.

Juntaram-se as fracções relevantes (tipicamente um total de 100 ml) , diluíram-se 3 x com tampão O (para uma condutividade de 250 pS, 4°C) e carregaram-se (1,1 ml.min-1) em Heparina-Sepharose HR (coluna de 1,6 cm de diâmetro que tinha sido pré-equilibrada com 150 ml de tampão O (consultar infra, a 2 ml.min-1). Após carga, lavou-se a coluna com tampão 0 (30 ml) e eluíu-se com 140 ml de um gradiente linear de KC1 0,1-0,7 M em tampão O (caudal de 1 ml.min-1), recolheu-se o

eluato em fracções de 5 ml. O tampão O foi: HEPES 20 mM, EGTA 1 mM, EDTA 0,2, Tween 20 a 0,05% p/v, butano a 1,0%,

β-glicerofosfato 1 mM, pH 7,2, 4°C, β-mercaptoetanol 15 MM mais antiproteases II.

A actividade de PI3K estimulada por Θβγ eluíu de Heparina-Sepharose HR em dois picos, designados como picos A e B. Tanto A como B foram purificados adicionalmente por utilização sequencial da mesma combinação de colunas. 0 pico A estava em 15 ml (KC1 0,4 M) e foi diluído 8 vezes em tampão P (consultar infra) para uma condutividade final de 200 pS, 4°C), o pico B estava em 15 ml (KC1 0,6 M) e foi diluído lOx em tampão P (para uma condutividade final de 200 pS, 4°C). A diluição foi imediatamente antes de carregar a 1 ml.min-1 numa coluna Mono Q 5/5 HR pré-equilibrada com 20 ml de tampão P. Após carga, lavou-se a coluna com 5 ml de tampão P. Recolheu-se o eluido em fracções de 0,5 ml. O tampão P continha: Tris 10 mM, EGTA 1 mM, EDTA 0,2, Tween 20 a 0,05% p/v, betaína a 1%, β-glicerofosfato 1 mM, pH 7,1, 4°C, β-mercaptoetanol 15 mM mais antiproteases II.

Juntaram-se independentemente as fracções relevantes de Mono Q (A) e (B) (ambas tinham um volume total de 3 ml), concentraram-se com uma unidade de ultrafiltração (corte a 87 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 50 kD pré-lavada com tampão P) até 0,8 ml, centrifugaram-se (10000 xg durante 10 minutos, 0°C) e carregaram-se (0,25 ml.min"1) directamente numa coluna de exclusão de tamanho de cromatografia de elevada resolução (V. 72 ml, V, 172 ml) pré-equilibrada com tampão Q (consultar infra; 2 litros sem antiproteases II, seguidamente 150 ml com antiproteases II) e recolheram-se fracções de 1,5 ml imediatamente antes de V. 0 tampão Q continha: KC1 0,17 M, betaína a 1%, Tween 20 a 0, 05% p/v, β-glicerofosfato 1 mM, EGTA 1 mM, EDTA 0,2 mM, fosfato de potássio 1,5 mM, HEPES 40 mM, pH 6,9 a 4°C, β-mercaptoetanol 15 mM.

Juntaram-se independentemente fracções relevantes de A e B (ambas tinham um volume total de 6 ml) diluídas com tampão R até 24 ml (condutividade final 250 yS, 4°C) e carregaram-se (0,8 ml.min-1) numa coluna de HPLC de permuta catiónica baseada em acrílico (2,5 ml de volume, BioRad) e eluíram-se com um gradiente linear de 25 ml de KC1 (0,1 a 0,6 M) em tampão R. Recolheu-se o eluído em fracções de 1 ml. O tampão R continha: betaína a 1%, Tween 20 a 0,05% p/v, EGTA 1 mM, EDTA 0,2 mM, HEPES 20 mM, pH 6,8 a 4°C, β-mercaptoetanol 15 mM mais antiproteases II.

Juntaram-se fracções relevantes (3 ml para (A), 2 ml para (B) ) , diluíram-se 7 x com tampão S (condutividade final de 180 yS, 4°C) e carregaram-se (0,15 ml.min-1); numa coluna Mini Q (0,24 ml, operada num sistema Pharmacia Smart™). Lavou-se a coluna com 1 ml de tampão S e eluíu-se com um gradiente linear de NaCl (0,1 a 0,5 M de NaCl) em tampão S a 0,1 ml.min"1. Recolheu-se o eluído em fracções de 75 yl. O tampão S continha: betaína a 1%, Tween 20 a 0,05% p/v, EGTA 1 mM, EDTA 0,2 mM, β-glicerof osf ato 2 mM, TRIS 10 mM, pH 7,7, 4°C, DTT 1 mM (sem antiproteases).

As concentrações de proteína ao longo da purificação foram estimadas de quatro modos: (a) com um corante de ligação a proteína (BioRad; este modo foi apenas utilizado em fracções de lisados, de citosol e de Q-Sepharose); (b) por integração das áreas dos picos de Abs 280 nm (este modo foi calibrado por utilização do ensaio de ligação de corante); (c) as proteínas em filtros foram coradas com Ponceau S e comparadas com a intensidade de corante de alíquotas definidas de um padrão 88 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ imobilizado semelhante; e (d) as proteínas resolvidas por SDS-PAGE e coradas com Coomassie R250 foram comparadas com alíquotas de proteínas de concentração conhecida aplicadas no mesmo gel. A preparação final de PI3K (ou material purificado da primeira etapa) foi incubada com [3H]-17-hidroxi-wortmanina (17,7 Ci mrnol-1, Amersham, feito por encomenda) 100 nM, resolvido por SDS-PAGE, corado com azul de Coomassie e fotografado. O [ H] foi então detectado fluorograficamente.

6.2 RESULTADOS A análise de citosol de neutrófilo porcino por uma cromatografia de permuta iónica revelou que este continha actividade de PI3K activada por ΰβγ com propriedades semelhantes às já descritas em células U937 e de osteossarcoma. A utilização de [3H]-17-hidroxi-wortmanina como sonda identificou um dupleto de proteínas com tamanho aparente 117 kD e 120 kD que eluíram nas fracções contendo actividade de PI3K activada por 6βγ e adicionalmente que estas estavam a 2-4% dos níveis de [3H]-17-hidroxi-wortmanina ligada por pllOa e/ou ρΙΙΟβ (consultar figuras 5). Este pico de actividade de PI3K activada por ΰβγ foi adicionalmente purificado (todas as figuras e tabelas detalham a purificação das preparações de PI3K que foram sequenciadas no final). Durante este procedimento, separou-se em dois picos (A e B) apresentando ambos massas moleculares aparentes, nativas e relativas de 220 kD. Após essencialmente pura tal como avaliado por géis de SDS-PAGE corados com Coomassie, tornou-se claro que ambas as actividades co-migraram com duas proteínas: (A) com proteínas de 117 kD (que ligam especificamente [3H]-17-hidroxi- wortmanina e assumiu-se consequentemente que era a subunidade catalítica) e 101 kD; e (B) com proteínas de 120 kD (que também ligam [3H]-17-hidroxi-wortmanina) e 101 kD. Este resultado indicou que as actividades PI3K eram heterodímeros pll7/pl01 e pl20/pl01 no seu estado nativo. Nas suas formas finais os PI3K A e B foram purificados aproximadamente 180 000 x e 380 000 x a partir de lisados de neutrófilo (1 000 000 000 x a partir de sangue) com uma recuperação total de actividade de 5,5%. A tabela 1 define as recuperações de proteína e actividade de PI3K ao longo de cada etapa). 89 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ TABELA 1

Purificação de PI3K activados por subunidade βγ de proteína G de leucócitos de porco Conjunto de actividade Proteína total nos conjuntos Volume do conjunto Actividade total nos conjuntos Factor de purificação (n° de vezes) Citosol 40 g 151 100% 1 Q-Sepharose (dessalinizado) 1,5 g (1,5 g) 40 ml (450 ml) 90% (124%) 24 Hidroxilapatite 162 mg 100 ml 125% 309 Heparina-Sepharose Pico A 19 mg 15 ml 46% 970 Pico B 12 mg 15 ml 53% 1769 Conjunto Mono Q A 5, 4 mg 3 ml 16% 1187 B 1,4 mg 3 ml 15% 4291 Exclusão de A tamanho (aplicados 850 μΐ) 0,722 mg 6 ml 16% 8902 B 0,2 mg 6 ml 15, 5% 51038 Permuta catiónica A 0,13 mg 3 ml 6% 18489 B 0,014 mg 2 ml 9,5% 271761 Conjunto de Mini Q de A 15 pg 0,225 ml 2,2% 58754 de B 10 pg 0,225 ml 3, 1% 174151

Estas extensões de enriquecimento são consistentes com as quantidades de [ 3H]-17-hidroxi-wortmanina ligada por estas proteínas comparativamente com membros da família p85/pll0. Todas estas proteínas são assim consideradas como sendo de baixa abundância.

As preparações purificadas de PI3K A e B foram indistinguíveis com base nas suas actividades de lípido quinase. Ambas as preparações foram (a) activadas mais de lOOx por subunidades Θβγ de um modo sensível a Ga-GDP, (b) completamente inibidas por wortmanina 100 nM (com ATP 5 μΜ nos ensaios), (c) insensíveis, quer na presença quer na ausência de ΰβγ, a péptidos com tirosina fosforilada que activam a família p85/pll0 de PI3K cinco vezes (consultar figura 6) e (d) são capazes de 3-fosforilar Ptdlns, PtdIns4P e Ptdlns(4,5)P2 (a identidade dos produtos foi estabelecida por desacilação e desgliceração sequenciais seguidas por análise de HPLC de permuta aniónica de produtos marcados com [ P] e solúveis em água com padrões internos marcados com [ H] ) . Alem disso, as preparações purificadas de PI3K A e B apresentaram o 90 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ menor Km aparente para o último substrato (8 e 10 μΜ para A e B, respectivamente) utilizando o fosfato γ de ATP como o fosfato doador (resultados não apresentados). 7. EXEMPLO: SEQUENCIAÇÃO DE PÉPTIDOS DE PI3K PORCINOS A E B ACTIVADOS POR GBy

Neste exemplo, ambas as proteínas PI3K porcinas foram analisadas por sequenciação de aminoácidos. Os PI3K A e B purificados a partir do equivalente a 40 g de proteína citosólica foram sujeitos a hibridação de "Western" para nitrocelulose, corados com Ponceau S, excisaram-se as bandas correspondentes a todas as quatro subunidades, trataram-se com tripsina e processaram-se para análise de sequência interna de aminoácidos.

7.1 MATERIAIS E MÉTODOS

Geração de péptidos e sequenciação de péptidos. Submeteram-se alíquotas de proteína para sequenciação a hibridação de "Western" (num dispositivo de hibridação húmida) para nitrocelulose (dimensão de poro de 0,45 pm BA85; Schleicher e Schuell). O tampão de transferência continha glicina 192 mM, TRIS 25 mM e metanol a 10% v/v. Antes da montagem da unidade final de transferência, humedeceram-se os apoios do papel de filtro Whatman n° I do lado (-) da sanduíche gel/filtro e o gel (1 mm de espessura) durante 2-3 min em tampão de transferência contendo SDS a 0,0005% (p/v). A transferência foi durante 16 h a 35 V fixos (0,25 a 0,35 Amp, a 5°C) . Coraram-se os filtros com Ponceau S a 0,1% em ácido acético a 1% durante 1 min e seguidamente descoraram-se durante 1 minuto em ácido acético a 1%. Recuperaram-se no filtro aproximadamente 85-90% da proteína carregada no gel. Excisaram-se as bandas de interesse da nitrocelulose e processaram-se para análise de sequência interna de aminoácidos como descrito (Tempst et al., 1990, Electrophoresis 11:537-552), com modificações (Lui et al., 1996). Sucintamente, efectuou-se clivagem proteolítica in situ utilizando 0,5 pg de tripsina (Promega, Madison, Wisconsin) em 25 pl de NH4HCO3 100 mM (suplementado com Zwittergent 3-16 a 1%) a 37°C durante 2 horas. A mistura de péptido resultante foi reduzida e S-alquilada com, respectivamente 91 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ β-mercaptoetanol a 0,1% (BioRad, Richmond, Califórnia) e 4-vinilpiridina a 0,3% (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) e fraccionada por HPLC de fase reversa. Efectuou-se um branco de enzima numa faixa de nitrocelulose com as mesmas dimensões.

Os solventes de HPLC e a configuração do sistema foram como descrito (Elicone et al., 1994), excepto que se utilizou uma coluna de 2,1 mm 214 TP54 Vydac C4 (Separations Group, Hesperia, Califórnia) com gradiente de eluição a um caudal de 100 μΐ/min. A identificação de péptidos contendo Trp foi efectuada por análise manual da razão de absorvâncias a 297 e a 277 nm, monitorizadas em tempo real utilizando um detector de conjunto de díodos Applied Biosystems (Foster City, Califórnia) modelo 1000S (Erdjument-Bromage et al., 1994).

Recolheram-se fracções manualmente, mantiveram-se em gelo durante o decorrer do ensaio e seguidamente armazenaram-se a -70°C antes da análise.

Analisaram-se péptidos purificados utilizando uma combinação de degradação de Edman automática e espectrometria de massa de ionização por desadsorção com laser assistida por matriz - tempo de voo (MALDI-TOF); os detalhes sobre esta abordagem combinada, incluindo rotinas após sequenciação química auxiliadas por massa podem ser consultadas noutros documentos (Geromanos et al., 1994, Techniques in Protein

Chemistry V 143-150; Elicone et al. , 1994, J. Chromatogr. 676:121-137; Erdjument-Bromage et al., 1994, Protein Sei. 3:2435-2446). Após armazenamento, as fracções de coluna foram suplementadas com TPA limpo (para proporcionar uma concentração final de 10%) antes de carregar nos discos de sequenciação e no alvo de espectrometria de massa. A análise de massa (em alíquotas de 2%) foi efectuada utilizando um instrumento de MALDI-TOF modelo Voyager RP (Vestec/PerSeptive, Framingham, Massachusetts) num modo linear com um laser de azoto de saída a 33 7 nm, um tubo de voo de 1,3 m e ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico (solução pré-preparada obtida de Linear Sei., Reno, Nevada) como matriz. Utilizaram-se voltagem de aceleração de ião de 30 kV (voltagem de grelha a 70%, voltagem de condutor guia a 0,1 %) e voltagem do multiplicador a -2,0 kV. Ajustaram-se a fluência do laser e o número de aquisições de modo a obter deflecções óptimas de máximos específicos, utilizando um osciloscópio digitalizador TDS 520 92 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Tektronix (Beaverton, Oregon). Geraram-se espectros Mz (massa sobre carga) a partir dos ficheiros de tempo de voo utilizando o utilitário de análise de dados GRAMS (Galactic Ind., Salem, New Hampshire) . Cada amostra foi analisada duas vezes na presença e na ausência de dois calibradores (APID e P8930, 25 femtomoles cada), tal como descrito (Geromanos et al., 1994). A sequenciação química foi efectuada (em 95% da amostra) utilizando um instrumento modelo 477A de Applied Biosystems (AB) . Identificaram-se PTH-aminoácidos libertados por etapas utilizando um sistema de HPLC 120A "em linha" (AB) equipado com uma coluna PTH C18 (2/1 x 220 mm; 5 micra de tamanho de partícula) (AB). Os instrumentos e os procedimentos foram optimizados para análise de aminoácidos de fenilti-hidantoína ao nível da femtomole como descrito (Erdjument-Bromage et al., 1994, Protein Sei. 3:2435-2446; Tempst et al., 1994, Methods CompanionMeth. Enzymol. 6:284-261).

As massas isotópicas médias dos péptidos foram somadas a partir dos resíduos identificados (incluindo os resíduos presumíveis) utilizando o utilitário ProComp versão 1.2 (obtido do Dr. P.C. Andrews, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan).

Um péptido com fosforilação dupla na tirosina (18 resíduos) com base na sequência da vizinhança das tirosinas 740 e 751 na PR de PDGF foi preparado pelos serviços de microquímica do Babraham Institute.

7.2 RESULTADOS

Os dados de sequência de péptidos resolveram imediatamente várias questões relativas às relações entre estas proteínas. As plOl derivadas de ambas as PI3K A e B foram idênticas e identificou-se adicionalmente uma variante alélica relativamente comum a 483 no ORF (indicado na figura 4) de modo que uma serina foi substituída por uma glicina. pll7 e pl20 apresentavam perfis trípticos por HPLC praticamente idênticos e todos os péptidos aparentemente comuns que se sequenciaram de ambas as espécies foram idênticos com excepção de um péptido de pll7 com o terminal amino bloqueado (consultar infra). A informação de sequência de péptido foi 93 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ então utilizada para conceber sondas para recuperar a sequência de nucleótidos que codifica essas proteínas. 8. EXEMPLO: Clonagem dos ADNc que codificam p!20 e plOl porcinas

Utilizaram-se sondas de oligonucleótido degeneradas com base na sequência de um péptido de pl20 porcina e um péptido de plOl porcina, para rastrear uma biblioteca de ADNc iniciada por oligo-dT e amplificada (produzida a partir de ARN de neutrófilo de porco seleccionado com poli-A). Descreve-se infra a clonagem e caracterização dos ADNc que codificam ambas as proteínas plOl e pl20.

8.1 MATERIAIS E MÉTODOS

Preparámos 0,7 mg de ARN total de 4,2 x 109 neutrófilos de porco (Chomczynski e Sacchi, 1987, Anal. Biochemistry 162:156-159). Este ARN foi utilizado por Stratagene (San Diego, Califórnia) para produzir ARNm seleccionado com poliA a partir do qual Stratagene preparou bibliotecas de ADNc iniciadas aleatoriamente por oligo-dT em λΖΑΡΙΙ (aproximadamente 5,4 x IO-6 e 3,2 x 106 p.f.u. primárias, respectivamente). Construíram-se bibliotecas amplificadas a partir de aproximadamente 2 x 106 recombinantes originais e estes foram utilizados para rastrear ADNc de pl20 e plOl através de procedimentos padrão.

Rastrearam-se 2,5 x 106 placas derivadas da biblioteca de ADNc iniciada por oligo-dT utilizando um oligo marcado com [32P] baseado na sequência peptídica de pl20 [CA(T/C) GA(T/C) TT(T/C) ACI CA(A/G) CA(A/G) GTI CA(A/G) GTI AT(T/C/A) GA(T/C) ATG] (SEQ ID NO:5). Identificaram-se doze clones positivos isolados como plasmídeos baseados em Bluescript™ e sequenciaram-se ambas as cadeias DBA (utilizando o serviço de sequenciação automática ABI em Babraham Institute). As inserções desses plasmídeos representaram uma série de clones sobrepostos em que dois clones definiam um ORF completo que codifica todas as sequências de péptido derivadas das digestões trípticas de pll7/pl20 (figura 4). 94 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Rastrearam-se 0,9 χ ΙΟ6 placas derivadas da biblioteca de ADNc iniciada por oligo-dT utilizando um oligo marcado com [32P] baseado na sequência peptídica de plOl [GCITA(T/C)ATGGA(A/G)GA(T/C)ATIGA(A/G)GA] (SEQ ID NO:6). Foi identificado, isolado e sequenciado 1 clone positivo. A extremidade 5' deste clone (Dll) representava parte da sequência para um dos péptidos trípticos identificando-o assim como um clone parcial. Rastrearam-se 0,6 χ 106 placas adicionais derivadas da biblioteca iniciada por oligo-dT utilizando um fragmento de restrição Cla-1 marcado com [32P] derivado de Dll. Identificaram-se sessenta e seis clones positivos, 49 dos quais foram isolados e alguns parcialmente sequenciados. Estes representaram uma série de clones sobrepostos contendo todos a sequência Dll mas sendo todos menores do que o próprio Dll. Rastrearam-se então 3,5 χ 106 placas da biblioteca iniciada aleatoriamente utilizando um fragmento de restrição Apa-1 marcado com [32P] derivado de Dll. Identificaram-se noventa e oito clones positivos. Estes clones foram novamente rastreados (no estágio de isolados de placa primários) através de uma abordagem baseada em PCR utilizando iniciadores concebidos contra o vector Bluescript™ (iniciadores quer "directos" quer “inversos") e sequenciação interna de Dll. Tal permitiu-nos identificar (independentemente da orientação) as extensões de terminal N potenciais mais longas que codificam a sequência de plOl. Os 3 clones que proporcionaram o maior fragmento de PCR foram isolados e sequenciados. Estes representaram clones sobrepostos que, conjuntamente com Dll, definiram um ORF completo que codifica todas as sequências de péptido derivadas da digestão tríptica de plOl (figura 1 e figura 2)

8.2 RESULTADOS

Dois clones definiram um ORF completo que codifica todos os péptidos trípticos pll7/pl20 (consultar figuras 1-4). Das três metioninas de iniciação potenciais, a central foi identificado como activa (contrariamente ao assumido por Stoyanov et al., 1995, Science 269:690-693) com base na igualdade exacta entre a massa medida de um péptido derivado de pl20 com o terminal amino bloqueado e as massa teóricas dos péptidos de terminal amino que se derivariam em resultado da iniciação de tradução em cada uma das três metioninas. Como 95 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ tal, ρ120 tem um tamanho teórico de 126 kD. A comparação da massa do péptido com o terminal amino bloqueado produzido a partir de pll7 com as regiões relevantes da extremidade do terminal amino de pl20 não indica quaisquer igualdades exactas (permitindo o bloqueio habitual do terminal amino). Assim, é pouco provável que pll7 seja a forma modificada por proteólise ou pós-tradução de pl20 nem é provável que resulte da utilização de um segundo ponto de iniciação de tradução no interior da mensagem de pl20. Contudo, ainda não foi isolado um ADNc com um ORF que codifique pll7.

As sequências de proteína e ADN que definem pl20 foram utilizadas para efectuar buscas de estruturas semelhantes em bases de dados. Identificaram-se semelhanças com todos as PI3K anteriormente clonadas. Contudo, a sequência foi quase idêntica, salvo diferenças entre espécies, a ρΙΙΟγ (Stoyanov et al. , 1995) . A única discrepância significativa entre a nossa sequência e a de Stoyanov et al. encontra-se na extremidade do terminal COOH. Apenas com base na estrutura primária, a identificação de um domínio de homologia "pleckstrin" no terminal COOH de pl20 não pôde ser confirmada.

Utilizando vários fragmentos sobrepostos derivados tanto de bibliotecas de ADNc iniciadas por oligo-dT como iniciadas aleatoriamente derivadas de neutrófilos de porco, definiu-se um ORF completo que codifica todas as sequências de péptidos derivadas de plOl. Identificou-se um péptido com terminal amino bloqueado derivado de plOl; a sua massa era precisamente equivalente à prevista para uma versão acetilada no terminal amino dos primeiros 12 resíduos definidos pelo início previsto na ORF descrita. A massa molecular relativa prevista de plOl é 9 7 kD. Apesar de se efectuarem buscas nas bases de dados de sequências de proteína e ADN relativamente a estruturas ou subestruturas semelhantes, não se identificaram quaisquer igualdades significativas. 9 EXEMPLO: Clonagem de ADNc que codificam p!20 e plOl humanas

Utilizaram-se com sucesso produtos de PCR marcados radioactivamente derivados de sequências de ADNc de plOl e pl20 porcinas para rastrear bibliotecas de ADNc humano para os 96 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ seus homólogos humanos. Descreve-se infra a clonagem e caracterização de ADNc que codificam plOl e pl20 humanas. 9.1 pi 01 humana

Rastreou-se uma biblioteca de ADNc de monócitos humanos (Clontech, Paio Alto, Califórnia; fonte de ARNm: linha celular U937 tratada com PMA a 50 ng/ml durante 3,5 dias) com um produto de PCR marcado radioactivamente correspondente aos pb 887-1287 da sequência de ADNc de P101 porcina. Plaquearam-se fagos Xgtll contendo a biblioteca de ADNc humano, como descrito em Clontech Lambda Library Protocol Handbook e transferiram-se para filtros de nylon. O ADN ligado ao filtro foi desnaturado por autoclavagem dos filtros durante um minuto, após o que se pré-hibridaram os filtros durante 2 horas a 42°C em formaldeido a 50%, 5x Denhardts, 5x SSC, ADN de esperma de salmão a 0,05 mg/ml, NaP04 0,05 M a pH 6,8, pirofosfato de sódio 1 mM e SDS a 1%. A sonda de PCR marcada radioactivamente foi desnaturada por ebulição durante 5 minutos, arrefecida em gelo durante 15 minutos e seguidamente adicionada aos filtros na tampão de hibridação para uma concentração final de 1 milhão cpm/ml. A hibridação prosseguiu durante a noite a 42°C com agitação constante.

Lavaram-se então os filtros uma vez com 2x SSC, SDS a 1% à temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido por uma lavagem em 2x SSC, SDS a 1% a 42°C durante vinte minutos e finalmente uma lavagem em 0,2x SSC, SDS a 1% a 42°C durante 20 minutos. Após autorradiografia, isolaram-se clones positivos de acordo com Clontech Library Handbook por recolha da área do clone positivo e em redor desta e eluição do fago para tampão de diluição de fago. Tornaram-se então a plaquear os fagos numa densidade que permitiu isolamento de placas de fago individuais, cresceu-se durante a noite e transferiu-se para filtros de nylon. Hibridaram-se os filtros com a mesma sonda radioactiva de PCR referida supra, lavaram-se e submeteram-se a autorradiografia. Recolheram-se placas de fago únicas, puras e positivas e eluiu-se o fago para tampão de diluição de fago e seguidamente tornou-se a plaquear para proporcionar uma camada confluente. A camada de fagos purificados em placa foi eluida para tampão de fago e isolou-se ADN de fago lambda de acordo com o protocolo em Clontech Library Protocol Handbook. 97 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Cortou-se ο ADN de lambda purificado com a enzima de restrição EcoRI, separou-se num gel de agarose e isolou-se e tornou-se a clonar a inserção de ADN EcoRI para Bluescript KS+ linearizado por EcoRI. Os plasmideos Bluescript contendo estas inserções de ADN foram então sequenciados. Cinco dos clones de ADNc isolados independentemente continham sequências homólogas à sequência de ADNc de plOl porcina entre o nucleótido 1137 e o codão de terminação no nucleótido 3021. Relativamente à sequência de plOl porcina, os clones humanos isolados continham a 3' uma sequência não traduzida adicional de 544 pb.

Dado a sequência porcina ser muito rica em GC na extremidade 5', a probabilidade de encontrar um clone completo numa biblioteca iniciada com oligo-dT é baixa.

Consequentemente, decidimos utilizar uma biblioteca iniciada simultaneamente por oligo-dT e aleatoriamente de modo a aumentar a probabilidade de encontrar um clone que contivesse a extremidade 5' rica em GC. Utilizando o mesmo produto de PCR marcado radioactivamente da sequência de plOl porcina e os mesmos métodos descritos supra, rastreamos uma biblioteca de ADNc de leucócitos humanos 5'-Stretch Plus (Clontech; fonte de ARNm: leucócitos de sangue periférico normal) e isolaram-se vários clones um dos quais continha a extremidade 5' da sequência de plOl humana. Este clone incluia aproximadamente 300 pb a montante da sequência de codificação e os primeiros 1612 pb da sequência de codificação. Construiu-se então um clone de ADNc completo contendo a região de codificação completa da sequência de plOl humana por fusão da extremidade 5' do clone de leucócito (desde um local HindIII 77 pb a montante do codão de iniciação até um local Saci na posição 1262) com o clone de monócito (desde o local Saci até um local Xbal na posição 3014, 305 pb a jusante do codão de terminação). Determinou-se a sequência completa do clone de ADNc completo e deduziu-se a sequência de aminoácidos codificada.

Dado que este clone completo foi derivado de dois clones diferentes de duas bibliotecas diferentes, verificou-se a existência da extremidade 3' do clone de plOl na biblioteca de leucócitos. Utilizando cinco conjuntos diferentes de iniciadores de PCR, demonstrámos que a extremidade 3' de plOl, 98 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ que foi clonada a partir de uma biblioteca de monócitos, estava presente tanto na biblioteca de monócitos como na de leucócitos. 9.2 p!20 humana 0 homólogo humano de pl20 porcina foi clonado por rastreio de uma biblioteca de ADNc de leucócitos (Clontech; fonte de ARNm: leucócitos de sangue periférico normal) com um fragmento de PCR marcado radioactivamnente da sequência porcina desde 875 a 1315 pb de acordo com o protocolo descrito supra para a clonagem de plOl humana. Isolámos independentemente dois clones contendo a extremidade 5' de pl20 humana, correspondente a 6 a 2414 pb na sequência porcina como relatada por Stephens et al. A sequência humana contém um local EcoRI a 2408 pb e dado que a biblioteca de ADNc foi construída com ligantes EcoRI, a sequência humana completa tinha que estar contida em dois clones independentes, um contendo o fragmento EcoRI 5' e outro contendo o fragmento EcoRI 3' . Tornou-se assim a rastrear a biblioteca sob as mesmas condições supra com um fragmento de PCR marcado radioactivamente na extremidade 3' (2801 a 3395 pb) da sequência de pl20 porcina. Isolámos independentemente dois clones contendo a sequência da extremidade 3' desde a posição 2408 (sequência humana) até ao início da cauda poli A na posição 5128. As inserções de ADN dos dois fagos contendo os fragmentos EcoRI 5' e 3' foram isoladas e fundidas no local EcoRI para proporcionar um clone de ADNc completo (1-5128) contendo a região de codificação total (84 a 3390) do homólogo de pl20 humana. Determinou-se a sequência completa do clone de ADNc completo e deduziu-se a sequência de aminoácidos codificada. 10. EXEMPLO; Expressão de p!20 e plOl porcinas em células de insecto

Prepararam-se baculovírus recombinantes (rbv) clonais apresentando quer um ADNc de pl20 marcado com 6x HIS no terminal amino (pAcHLT pl20) ou ADNc de plOl marcado com (EE) no terminal amino (pAcO-Gl) e utilizaram-se para dirigir produção das proteínas supra em células de insecto (Sf 9) . 99 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

10.1 MATERIAIS Ε MÉTODOS

10.1.1 CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO A utilização de PCR de terminal N e locais de restrição apropriados permitiu a manipulação dos ORF de pl20 e plOl porcinas para uma forma sob a qual podiam ser inseridos em quadro de leitura em vários vectores de expressão. Em cada caso, o primeiro aminoácido codificado após o marcador do terminal N foi a metionina de iniciação. A reqião não traduzida a 3' do ADNc de pl20 foi completamente utilizada e a do ADNc de plOl foi truncada num local BamHI (nucleótido 192, figura 1). Os vectores utilizados para expressão dirigida por baculovirus em células Sf9 foram pAcHLT (que codifica um "marcador 6x His" no terminal N seguido de um local de clivagem para trombina, Pharminogen; o ORF de pl20 foi inserido nos locais Xhol-EcoRI) e pAcO-Gl (que codifica um "marcador EE" no terminal N, ONYX Pharmaceuticals; o ORF de plOl foi inserido nos locais EcoRI-Notl). Todos os vectores foram submetidos a sequenciação de terminal N antes de utilização. 10.1.2 Transfecções de células Sf9 e produção de proteínas recombinantes

Cresceram-se células Sf9 em TNM FH com HI-FBS a 11% num balão de rotação e mantiveram-se entre cerca de 0,5 e 2 x 106 células ml-1. Transfectaram-se células Sf9 com lipossomas de Insectin™ (Invitrogen) com ADN baculo-gold linearizado (Pharminogen) e vectores de transferência de baculovirus relevantes como recomendado (Invitrogen). Purificaram-se em placa os baculovirus resultantes e amplificaram-se para proporcionar reservas virais com título elevado. Determinaram-se as diluições óptimas (para produção de proteína) para cada reserva de título elevado. Deixaram-se os vírus pAcO-Gl plOl infectar células Sf9 aderentes durante

2,2 dias a 27°C; deixaram-se os vírus pAcHLT pl20 infectar uma cultura com rotação (habitualmente) durante 1,9 dias a 27°C. Recolheram-se as células em KC1 a 0,41%; sacarose a 2,66%; MgCl2 20 mM; NaH2P04 8 mM, pH 6,2, 25°C, gelado; trataram-se com di-isopropilfluorofosfato 1 mM (5 minutos em gelo) e lavaram-se uma vez na solução de recolha. Congelaram-se em N 100 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ líquido alíquotas de células empacotadas por centrifugação e armazenaram-se a -80°C. 10.1.3 Purificação de proteínas derivadas de Sf9

Purificou-se pl20 porcina utilizando uma coluna de quelação de ião metálico (Talon, Clontech). Descongelaram-se os sedimentos celulares em NaCl 0,10 M; fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, 4°C; Tris.HCl 10 mM, pH 8,0, 4°C; MgCl2 1 mM e antiproteases I (consultar supra) a uma razão de 1 litro de cultura de células Sf9 infectadas para 50 ml de tampão de ultra-sons, tratou-se com ultra-sons com sonda (4 impulsos x 15 segundos em gelo) e centrifugou-se (120 000 xg durante 40 minutos, 4°C). Removeu-se o sobrenadante e juntou-se (o sobrenadante turvo do topo do tubo foi removido separadamente, filtrado através de um filtro de 0,45 μΜ com baixa ligação de proteína e seguidamente adicionado ao restante). A fracção citosólica foi suplementada com Tween-20 e betaína (0,05%, p/v e 1%, respectivamente) e seguidamente bombeada para uma coluna de resina Talon equilibrada em tampão equivalente (1,2 ml de resina por litro de cultura Sf9 infectada originalmente a uma velocidade de caudal linear de 20 cm.hr^1) . Tanto este como todos os passos subsequentes foram efectuados a 4°C. A coluna foi lavada sequencialmente (mesmo caudal) com 20 volumes de coluna de cada um dos seguintes tampões: tampão A, fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, 4°C; Tris/HCl 10 mM, pH 8,0, 4°C; NaCl 0,15 M; betaína a 1%; Tween-20 a 0,05%, p/v; tampão B, Triton X-100 a 1%, p/v; NaCl 0,15 M; fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, 4°C; Tris 10 mM, pH 8,0, 4°C; betaína a 1%, Tween-20 a 0,05%, p/v; tampão C, NaCl 0,15 M; fosfato de sódio 50 mM, pH 7,1, 4°C; betaína a 1%; Tween-20 a 0,05%, p/v; tampão D;

NaCl 0,15 M; Tris 30 mM, pH 7,5, 4°C, betaína a 1%, Tween-20 a 0,02%, p/v; etilenoglicol a 10%, v/v; MgCl2 1 mM; e seguidamente 8 volumes de coluna de tampão E que é constituído por tampão D suplementado com imidazole 10 MM (pH 7,5). Durante a lavagem com tampão E recolheram-se fracções de 2 ml. Finalmente, para um caudal de metade do anteriormente utilizado, lavou-se a coluna com tampão F, constituído por tampão D suplementado com imidazole 70 mM (pH 7,5; concentração final). Tipicamente recolheram-se fracções de 1 ml. Quando se adquiriu mais experiência, as fracções foram juntas com base no registo de Abs 280 nm (registada 101 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ continuamente) e imediatamente suplementadas com DTT 1 mM e EGTA 1 mM (concentrações final). Tipicamente este processo proporcionou 4 mg de pl20 por litro de cultura Sf9. A pl20 preparada deste modo apresentava habitualmente um grau de pureza maior que 90%. O conjunto final de pl20 foi dessalinizado com uma coluna de 15 ml de G-25 superfina equilibrada em tampão G, constituído por tampão D suplementado com DTT 1 mM e EGTA 1 mM (concentrações finais) . As preparações "branco de pl20" utilizadas nalgumas experiências foram preparadas de modo rigorosamente semelhante a preparações normais de pl20 com a excepção das células de partida terem sido quer infectadas com baculovírus do tipo selvagem quer não infectadas. As fracções finais derivadas dessas preparações em "branco" foram juntas com base em "volumes iguais" devido a não conterem praticamente qualquer proteína. A pl20 com marcador de 6x HIS continha motivo de reconhecimento de clivagem por trombina. A titulação cuidadosa com trombina e análise em géis de poliacrilamida SDS a 6% revelou dois locais de trombina com sensibilidades semelhantes à trombina, ambos perto do terminal amino (porque um anticorpo contra o terminal aCOOH ainda imunoprecipitou a pl20 duplamente cortada). Um local estava na localização esperada para o local concebido racionalmente no marcador; o outro local estava a aproximadamente 40 resíduos de distância do terminal amino (numa região sem quaisquer sequências de reconhecimento de trombina favoráveis). Em condições optimizadas (trombina a 2 U ml-1; pl20 a 0,2 mg.ml-1; 4 horas, 4°C, com EGTA 1 mM e MgCl2 1 mM) foi possível gerar preparações de pl20 clivada com trombina que continham 15% de pl20 não cortada e 50% de pl20 cortada no local de trombina do terminal amino autêntico e 35% com aproximadamente 40 resíduos adicionalmente clivados. Nestas experiências a acção da trombina foi terminada por adição de ácido N-acetil-D-Phe-Pro-2-amido-5-guanidinobutanoborónico 100 nM; um inibidor potente da trombina (Sigma). Ao longo deste trabalho, utilizaram-se preparações de pl20 parcialmente clivada em paralelo com pl20 totalmente não clivada. Tornou-se evidente que: (A) todos as três pl20 ligam-se a plOl com afinidade muito semelhante, (B) plOl ligada à mistura pl20 foi activada por 6βγ numa extensão semelhante a plOl ligada a pl20 não clivada e, (C) tanto a 102 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ ρ120 não clivada como a pl20 parcialmente clivada foram virtualmente insensíveis a subunidades de Θβγ na ausência de plOl (apesar da clivagem completa pela trombina tender a reduzir a actividade catalítica global de pl20 em 20-30% e aumentar a activação aparente de 1,7 vezes por Θβγ na ausência de plOl para cerca de 2,5 vezes). A (EE)-plOl porcina foi purificada a partir de sedimentos congelados de células Sf9 como se segue. Trataram-se com ultra-sons células de 2 litros de cultura de Sf9 infectada em 50 ml de NaCl 0,12 M; MgCl2 1 mM; HEPES 25 mM, pH 7,4, 4°C; EGTA 1 mM mais antiproteases I tal como descrito supra. Após centrifugação (120 000 xg, 4°C, 40 minutos) removeu-se o sobrenadante (como descrito supra), suplementou-se com Triton X—100 a 1% p/v, coleato de sódio a 0,4%, NaCl 0,4 M (concentrações finais) e misturou-se com 2 ml de proteína G-Sepharose empacotada e reticulada covalentemente a um anticorpo monoclonal a-(myc) irrelevante (lavado numa solução equivalente). Após 30 minutos de mistura a 4°C sedimentaram-se as pérolas, removeu-se o sobrenadante e misturou-se com 1 ml de proteína G Sepharose reticulada covalentemente a um anticorpo monoclonal a-(EE) (equilibrada numa solução equivalente) . Após 2 horas de mistura a 4°C lavaram-se as pérolas como descrito infra para imunoprecipitações de a-(EE) em células U937 com excepção que (a) as lavagens foram numa tubo de centrífuga de 20 ml e (b) as pérolas foram lavadas no final 3x com tampão H, constituído por tampão G com Triton X-100 a 1%, p/v. As preparações de "branco de plOl" (plOlC) utilizadas nalgumas experiências foram preparadas a partir de células quer infectadas por baculovírus de tipo selvagem quer não infectadas exactamente como descrito supra.

Purificaram-se heterodímeros pl01/pl20 formados in vivo por co-infecção de células Sf9 com ambas as formas de baculovírus recombinante tal como descrito para (EE)-plOl com excepção que os imunoprecipitados foram lavados 4x com tampão I, Triton X-100 a 1%, p/v; NaCl 0,15 M; HEPES 20 mM, pH 7,4, 4°C; EGTA 1 mM; 2x com tampão J, constituído por tampão I suplementado com NaCl 0,4 M (concentração final) e seguidamente 3x com tampão G antes de serem eluídos com 1 volume de leito de (EE)-péptido a 150 pg.ml'1 (concentração final) em tampão G. O (EE)-péptido, EYMPTD acetilado no 103 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ terminal amino, tem uma afinidade muito elevada para o anticorpo monoclonal a-(EE). Após incubação das pérolas com (EE)-péptido, em gelo, durante 40 minutos, removeu-se o sobrenadante. Diluíram-se alíquotas das proteínas eluídas e ensaiaram-se para actividade de PI3K (consultar supra) ou misturaram-se directamente com tampão de amostra com SDS.

Em experiências de reconstituição in vitro, misturaram-se preparações de pl20 em tampão G suplementado com Triton X-100 a 1%, p/v (agora equivalente a tampão H) com (EE)-plOl (10:1 de razão molar de proteína) ainda ligado à matriz de proteína G, misturou-se durante 2 horas (tudo efectuado a 4°C) e seguidamente lavou-se e eluíu-se com (EE)-péptido como descrito para a purificação de pl01/pl20-Pl3K reconstituído in vivo no exemplo infra.

10.2 RESULTADOS

Purificações de etapa única utilizando os marcadores proporcionaram preparações de proteína purificada tal como avaliado coloração com Coomassie; os seus tamanhos aparentes estiveram de acordo com o esperado. Além disso, ambos foram correctamente reconhecidos em hibridações de "Western" por soros policlonais de coelho anti-péptido específicos e dirigidos para o terminal COOH e para a sequência interna (não apresentado) o que é indicativo da sua autenticidade. A pl20 ligou-se fortemente e com uma estequiometria molar 1:1 a plOl tanto (a) in vitro, quando ambas as proteínas tinham sido purificadas independentemente, misturadas (com plOl ainda associada à matriz de proteína G utilizada para a isolar) e seguidamente lavada em condições rigorosas antes de ser eluída com (EE)-péptido ou, (b) in vivo, quando células Sf9 foram co-inf ectadas com ambas as formas de rbv e as proteínas foram purificadas através do marcador plOl (dados não apresentados). A pl20 livre e purificada foi uma PI3K selectiva para Ptdlns(4,5) P2 e sensível à wortmanina. Os Οβγ tiveram um efeito pequeno e bimodal sobre a actividade de PI3K de pl20 livre. Uma mistura equimolar (concentração total final de 2 μΜ) de Ga, o, ii, i2 e i3 ligadas a GDP e na presença de 104 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ fluoreto de alumínio não apresentou qualquer efeito significativo sobre a actividade de PI3K de pl20 livre (esta foi uma preparação de Ga que, quando adicionada num excesso molar de 1,5 vezes, podia inibir completamente os efeitos dos Θβγ sobre ο PI3K). Os péptidos com tirosina fosforilada capazes de activar os membros da família p85/pllO-Pl3K não apresentaram igualmente qualquer efeito detectável sobre a actividade de PI3K de pl20. Quando liqado a plOl (quer in vivo, quer in vitro) a actividade de PI3K das pl20 poderia ser activada mais que lOOx pelas subunidades ΰβγ. Péptidos com tirosina fosforilada e Ga-GDP/fluoreto de alumínio não apresentaram qualquer efeito sobre actividade de PI3K de pl01/pl20 activada por ΰβγ ou basal. Na ausência de ΰβγ a actividade específica de pl20 num complexo pl01/pl20 é menor que a actividade específica de pl20 livre mas é aumentada mais de 50x na sua presença (consultar figura 7). A comparação das actividades catalíticas específicas de PI3K derivada de neutrófilos de porco (B) e heterodímeros pl01/pl20 derivados de Sf9, sob condições de ensaio idênticas e estimuladas por ΰβγ, mostrou que o material derivado de Sf9 tem uma actividade 2x mais elevada por mg de proteína. Este resultado não é inconsistente com a provável "idade de ensaio" numa preparação de PI3K derivada de neutrófilos em circulação através de um protocolo de purificação de 4 dias e indica que a maior parte de PI3K recombinante está correctamente enrolada e que devem estar a ocorrer quaisquer modificações críticas pós-tradução. 11. EXEMPLO: Expressão de plOl e p!20 porcinas em células de mamífero

Construiu-se uma família de vectores de expressão de mamífero que permitiram expressão transitória de formas de epítopo marcado no terminal amino (quer (myc), quer (EE)) de plOl e pl20 porcinas. Este exemplo descreve a produção de proteínas de fusão de plOl e pl20 recombinantes purificadas a partir de células de mamífero e análise subsequente das suas propriedades. 105 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

11.1 MATERIAIS Ε MÉTODOS

11.1.1 CULTURA DE CÉLULAS

Cresceram-se células U937 em RPMI 1640 com (HI)-FBS a 10%, v/v, inactivado pelo calor e diluíram-se 4 vezes de 2 em 2 dias. Cresceram-se células Cos-7 em DMEM com HI-FBS a 10%.

11.1.2 CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO A utilização de PCR de terminal N e locais de restrição apropriados permitiu a manipulação dos ORF de pl20 e plOl porcinas para uma forma em que puderam ser inseridos em quadro de leitura em vários vectores de expressão (nesse caso, o primeiro aminoácido codificado após o marcador do terminal N foi a metionina de iniciação. A região não traduzida a 3' do ADNc de pl20 foi completamente utilizada e a do ADNc de plOl truncada num local BamHI (nucleótido 192, figura 1). Os vectores utilizados para expressão dirigida por citomegalovírus (CMV) em células de mamífero foram (A) pCMV(EE) (codificando um MEEEEFMPMPMEF no terminal N (SEQ ID NO:7) ou MEEEEFMPMEF S S (SEQ ID NO:8) "marcador EE" para expressão de plOl ou pl20, respectivamente) e (B) pCMV (myc) (codificando um MEQKLISEEDLEF no terminal N (SEQ ID NO:9) ou MEQKLISEEDLEFSS (SEQ ID NO:10) "marcador myc" para expressão de plOl ou pl20, respect ivamente) . Todos os vectores foram submetidos a sequenciação do terminal N antes de utilização. 11.1.3 PROTOCOLOS DE TRANSFECÇÃO DE U937

Lavaram-se células U937 em crescimento exponencial (diluídas 12 horas antes) 2x com PBS e ressuspenderam-se em meio de electroporação estéril (EM) contendo; NaCl 30 mM, KC1 0,12 M, Na2HP04 8,1 mM, KH2P04 1, 46 mM e MgCl2 5 mM, à temperatura ambiente. Adicionou-se ADN plasmídico circular em lx EM às células para produzir um volume final de 0,5 ml contendo 1,4 x 107 células e 40 pg de ADN total (habitualmente tornado 40 pg com um plasmídeo de expressão com o mesmo promotor e expressando uma proteína irrelevante mas com o mesmo marcador) e transferiu-se para uma cuvete (fenda de 0,4 cm, BioRad). Após 15 minutos em repouso à temperatura ambiente electroporaram-se as células (1 impulso a 280 V e 106 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 960 pF, com um gerador de impulsos BioRad Gene; as constantes de tempo foram tipicamente de 18 ms) e seguidamente colocaram-se em gelo durante 8 minutos adicionais antes de serem diluídas para 5 ml de RPMI, HI-FBS a 10%. Após repouso durante 5 minutos para permitir que as células mortas se agregassem, diluíram-se as células com 35 ml de RPMI, HI-FBS a 10%, suplementado com penicilina e estreptomicina e seguidamente adicionou-se TPA e ZnCl2 (ambos amplificam substancialmente a expressão de promotores CMV em células U937) para concentrações finais de 5 x 10“8 M e 200 μΜ, respectivamente. Se as células se destinassem a marcação com [35S]-metionina (marcador em trans, ICN) o RPMI utilizado após a electroporação estava isento de metionina e de leucina e continha NaHCC>3 2 mM e HEPES 25 mM e HI-FBS a 10% dialisado e ressuspendiam-se as células num volume final de 10 ml com [35S]-metionina/leucina a 20 pCi/ml (mais TPA e ZnCl2, como supra) . Após 12 horas (seja com ou sem [35S]) misturaram-se as suspensões de células com di-isopropilfluorofosfato (concentração final de 1 mM) , deixaram-se repousar durante 5 minutos e seguidamente recolheram-se por centrifugação, lavaram-se lx com PBS e lisaram-se para imunoprecipitação. Imunoprecipitaram-se proteínas marcadas com (EE)-epítopo a partir de lisados de células U937 como se segue. Lisaram-se células de 1 electroporação com 1,25 ml de tampão de lise contendo Triton X-100 a 1%, p/v, HEPES 25 mM, pH 7,4, 4°C; EGTA 1 mM; MgCl2 1 mM; NaCl 0,15 m e PMSF 0,1 mM, leupeptina a 10 pgml-1, aprotinina a 10 pgml-1, antipaína a 10 pgml-1, pepstatina A a 10 pgml-1 e bestatina a 10 pgml-1 (doravante referida como antiproteases I). Centrifugaram-se os lisados (12 000 rpm, 0°C, 15 minutos) . Removeram-se os sobrenadantes resultantes e misturaram-se com NaCl 4 M (0,1 ml), coleato de sódio a 20% (25 μΐ) e proteína G-Sepharose (40 μΐ de volume empacotado) acoplada covalentemente com um anticorpo monoclonal de ratinho irrelevante de isotipo igual (a aproximadamente 5-10 mg.ml-1 de Sepharose). Misturaram-se os sobrenadantes um sobre o outro durante 20 minutos e seguidamente as pérolas foram sedimentadas e o sobrenadante transferido para outro tubo com pérolas de proteína G-Sepharose (10 μΐ, empacotado) reticulado covalentemente com um anticorpo monoclonal α-(EE)-ratinho (a aproximadamente 5-10 mg.ml-1 de Sepharose) . Após 2 horas de mistura a 4°C lavaram-se os imunoprecipitados 5x com 107 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Triton Χ-100 a 1,0%, ρ/ν; coleato a 0,4%; SDS a 0,004%; NaCl 0,4 M; EGTA 1 mM; HEPES 25 mM, pH 7,4, a 0°C; lx com LiCl 0,5 M, Tris 0,1 M, pH 8,0, 4°C; 2x com NaCl 0,12 M; EGTA 1 mM; HEPES 25 mM, pH 7,4, a 0°C. A última lavagem com tampão foi suplementada com DTT 1 mM (tampão da lavagem final). Quando os imunoprecipitados foram preparados a partir de células marcadas com [35S]-metionina a última lavagem foi omitida e as pérolas foram fervidas em tampão de amostra de SDS. Caso contrário, as amostras foram ensaiadas relativamente a actividade de PI3K como descrito infra. 11.1.4 TRANSFECÇÕES COM CÉLULAS COS-7

Digeriram-se com tripsina células Cos-7 em crescimento exponencial e tornaram-se a plaquear a uma confluência de cerca de 50-70% 3 horas antes da transfecção. Na altura da transfecção as células foram novamente digeridas com tripsina, diluídas para DMEM com FBS a 10%, contadas, lavadas 2x em PBS e ressuspensas em EM (1 x 107 por cuvete) misturadas com ADN plasmídico circular (40 pg total por cuvete, constituído por combinações de 10 pg de ΕΧν-(ΕΕ)-β1, 10 pg de EXV- (myc) -τ2, 10 pg de pCMV-(myc)-pl20 ou 10-40 pg de um vector de expressão irrelevante de mamífero), para proporcionar um volume final de 500 pl e seguidamente transferidas para uma cuvete de electroporação (fenda de 0,4 cm, BioRad). Após 10 minutos à temperatura ambiente electroporaram-se as células (250 V, 960 pF), colocaram-se em gelo durante 8 minutos e seguidamente diluíram-se para DMEM com FBS a 10%. Deixaram-se sedimentar as células agregadas e evitaram-se à medida que se retiravam alíquotas de células para placas de 6 cm (quatro de cada cuvete).

Após 48 horas, lavaram-se as quatro placas de cada tratamento para DMEM tamponado com HEPES contendo NaHCCq 1 mM e BSA isento de ácidos gordos a 0,2%. Após 10 horas recolheram-se duas placas em replicado para hibridação de "Western" (com anticorpo monoclonal a-(myc) como o Io reagente de detecção, α-ratinho-HRP como o 2o sistema de detecção e quantificação por ECL e digitalização por densitometria). Lavaram-se duas placas para DMEM isento de fosfato com NaHCCp 1 mM e BSA isento de ácidos gordos a 0,2% e seguidamente incubaram-se durante 90 minutos adicionais a 37°C com [ P]-Pi 108 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ a 300 μϋί por placa (em 4 ml). Aspirou-se o meio e adicionou-se 1 ml de HC1 1 M gelado. Rasparam-se as células, removeram-se e lavaram-se as placas com 1,33 ml de metanol.

Juntaram-se as lavagens de HC1 e de metanol com 2,66 ml de clorofórmio (para proporcionar uma distribuição de solventes de duas fases Folch) misturaram-se e centrifugaram-se. Removeram-se as fases inferiores e misturaram-se com 1,95 ml de fase superior fresca (consultar supra) contendo EDTA 0,5 mM e sulfato de tetrabutilamónio 1 mM. Após mistura e centrifugação, removeram-se as fases inferiores, secaram-se, desacilaram-se e prepararam-se para análise por HPLC de permuta aniónica (Stephens et al., 1991, Nature. Lond. 351:33-39) .

11.2 RESULTADOS

Quando expressas transitoriamente em células U937, (EE)-plOl e (EE)-pl20 puderam ser especificamente imunoprecipitadas a partir de células marcadas com [35S]-metionina em quantidades aproximadamente iguais (tendo em consideração a sua composição relativa em metioninas; 8:25 respectivamente, dados não apresentados). Os imunoprecipitados de cx-(EE)-pl01 lavados em condições rigorosas apresentavam uma actividade de PI3K sensível a wortmanina, selectiva para

Ptdlns(4,5)P2 e sensível a Θβγ, que se encontrava ausente em controlos utilizando quer um anticorpo monoclonal irrelevante para a imunoprecipitação quer um ADNc que codifica uma proteína irrelevante marcada com (EE) que foi expressa, tal como determinado por marcação com [35 S]-metionina, a níveis semelhantes a (EE)-plOl. A activação por Θβγτ pode ser bloqueada por pré-incubação com um excesso molar de 2 vezes de Ga-GDP. Além disso, a actividade de PI3K nestes imunoprecipitados de plOl foi

insensível a Ga-GDP/fluoreto de alumínio. A co-transfecção de (myc)-pl20 com (EE)-plOl não aumentou a actividade de PI3K especificamente recuperada em imunoprecipitados a-(EE). De facto, ocorreu um decréscimo provavelmente devido à expressão de (EE)-plOl ter sido relativamente inferior na presença de vectores de expressão (myc)-pl20. Contrariamente, células transfectadas com (EE)-pl20 e imunoprecipitados a-(EE) apresentavam actividade de PI3K quase indetectável na presença 109 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ ou ausência de Θβγ. Estas células continham quantidades molares comparáveis de pl20 marcado com [35 S]-metionina relativamente a (EE)-plOl em imunoprecipitados oí-(EE) de células transfectadas com (EE)-plOl. A co-transfecção com (myc)-plOl resultou num aumento substancial, especificamente, da actividade de PI3K estimulada por Θβγτ que pôde ser recuperada apesar da queda na expressão de (EE)-pl20 (tal como avaliado por marcação com [35S]-metionina) (consultar figura 8). Estes dados indicam que células U937 (humanas) contendo uma subunidade catalítica PI3K endógena que se pode ligar a uma plOl expressa transitoriamente (porco). Quando ligada a plOl (porco) essa subunidade catalítica endógena apresenta regulação substancial por Θβγ porque toda a pl20 presente nos imunoprecipitados está ligada a plOl.

Contrariamente, em imunoprecipitados a-(EE) de células transfectadas com (EE)-pl20 muita da pl20 não está associada com plOl e consequentemente encontra-se relativamente inactiva (comparativamente com a que se encontra ligada a plOl e na presença de Θβγ) . Contudo, esta actividade de PI3K quando ensaiada na presença de ΰβγ é substancialmente amplificada por co-transfecção com (myc)-plOl. A explicação alternativa para estes dados - que pl20 é "desnaturada" (apesar de ser solúvel e capaz de sofrer imunoprecipitação) a não ser que seja expressa na presença de plOl - é pouco provável tendo em conta os dados obtidos com proteínas derivadas de Sf9 purificadas independentemente. A fim de ensaiar se a pl01/pl20 PI3K poderia ser activada por Θβγ e produzir Ptdlns(3,4,5)P3 in vivo, expressámos transitoriamente várias combinações de (myc)-Y2, (EE)— β1, (myc)-plOl e (myc)-pl20 em células Cos-7 e medimos os seus efeitos sobre os níveis de [35P]-fosfoinositídeos em células 48 horas após transfecção (consultar figura 9). A pl20 apenas produziu aumentos significativos em Ptdlns(3,4,5)P3 e Ptdlns (3, 4) P2 de um modo dependente de βιγ2 na presença de plOl. Este padrão de resultados não poderia ser explicado por alterações na expressão relativa dos diferentes ADNc quando introduzido em combinações (consultar figura 9). 110

ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 12. DEPÓSITO DE CLONES

Os seguintes microorganismos ou clones foram depositados em American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville, Maryland, nas datas indicadas e foram-lhes atribuídos os números de acesso indicados:

Clone N° de acesso ATCC Data do depósito pCMV3mycpl01 97636 27/6/96 pCMV3mycpl20 97637 27/6/96 O presente invento não deve ver o seu âmbito limitado pelas concretizações específicas aqui descritas, que se pretende que sejam apenas ilustrações de aspectos individuais do invento e os métodos e componentes funcionalmente equivalentes encontram-se abrangidos pelo âmbito do invento. De facto, várias modificações do invento adicionalmente às aqui apresentadas e descritas tornar-se-ão óbvias para os peritos na arte a partir da descrição supra e esquemas anexos. Pretende-se que tais modificações estejam abrangidas pelo âmbito das reivindicações anexas. 111 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Len Stephens,

Phillip T.Hawkins,

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: FOSFATIDILINOSITOL-3'-QUINASE

REGULADA POR G-BETA GAMA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 14 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Pennie & Edmonds (B) RUA: 1155 Avenue of The Américas (C) CIDADE: New York

(D) ESTADO: NY

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 10036-2811 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ Versão 2.0 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: PCT/US97/11219 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 26-JUN-1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 08/672,211 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 27-JUN-1996 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Jon R. Stark, (B) NÚMERO DE REGISTRO: 30,111 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 8549-006-228 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 650-493-4935 (B) TELEFAX: 650-493-5556

(C) TELEX: 66141 PENNIE (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4692 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: CCGTGCGCCC CTCAAGACTA ATGGACCCCC GGCTCAGGAA TCGCACGAGG CAGGCTCACA 60 120

CCCGAGGCCC ATGGAAGTTC CCAGGCCAGG GGTCAAGTTG GAACCGAAGC TGCTGCCAGC 112 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ TTACACCACA GCCACAGCAA CTTGGGATCT GAGCTGCATC TGTGACCTAC ACCACAGCTC 180 ACGGCAATGC TGGATTCCCA ACACACCAAG TGGGGCCAGG GATCGAACCC GCATCCTCTT 240 GGACAGTAGT CAGATTCATT ACCACTGAGC CATTGACAGG AACTCCAGGG GCAGGGGGGA 300 GTCTCTTGTT TTTGGCTCCT CCCGAGACCT GGTGAAATGG ACCAGCGCAG GCACCCCTTT 360 CCAGTGGCTG TCCCAGGCGA TGACTCAGGA TGCAGCCAGG GGCCACGACG TGCACGGAGG 420 ACCG^ATCCA GCACGCCGTG αηηΓΠΓΤΓίΓΤ ΤΛΓβΓΛΓίΓίΓΤ ΓΑΛΓΓΤΓΛΠΓ rarrarTcra. 480 CCTCCTGGTC AGCTGGGCTG TGTCTAAACT GTTGGAGCCT GCAGGAGCTG GTCAGCAGGG 540 ATCCGGGCCA CTTCCTTATC CTCCTGGAGC AGATCCTGCA GAAAACCCGA GAGGTCCAAG 600 AGAAGGGCAC CTATGACCTC CTCGCGCCCC TGGCCCTGCT CTTCTATTCT ACTGTCCTCT 660 GTACGCCACA CTTCCCGCCA GACTCAGATC TCCTTCTGAA AGCAGCCAGA ACCTACCACC 720 GATTCCTGAC CTGGCCGGTT CCGTACTGCA GCATCTGCCA GGAACTGCTC ACCTTCATCG 780 ATGCTGAGCT GAAGGCCCCA GGAATCTCCT ACCAGCGACT GGTGAGGGCG GAGCAGGGCC 840 TGTCCACAAG GAGTCACCGC AGCTCCACCG TCACGGTGCT CTTGGTGAAC CCCGTGGAGG 900 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Met 1 Gin Pro Gly Ala 5 Thr Thr Cys Thr Glu 10 Asp Arg Ile Gin His 15 Ala Leu Glu Arg Cys 20 Leu Hls Gly Leu Ser 25 Leu Ser Arg Arg Ser 30 Thr Ser Trp Ser Ala 35 Gly Leu Cys Leu Asn 40 Cys Trp Ser Leu Gin 45 Glu Leu Val Ser Arg 50 Asp Pro Gly His Phe 55 Leu Ile Leu Leu Glu 60 Gin Ile Leu Gin Lys 65 Thr Arg Glu Vai Gin 70 Glu Lys Gly Thr Tyr 75 Asp Leu Leu Ala Pro 80 Leu Ala Leu Leu Phe 85 Tyr Ser Thr Vai Leu 90 Cys Thr Pro Hls Phe 95 Pro Pro Asp Ser Asp 100 Leu Leu Leu Lys Ala 105 Ala Arg Thr Tyr Hls 110 Arg Phe Leu Thr Trp 115 Pro Vai Pro Tyr Cys 120 Ser Ile Cys Gin Glu 125 Leu Leu Thr Phe ile 130 Asp Ala Glu Leu Lys 135 Ala Pro Gly Ile Ser 140 Tyr Gin Arg Leu Vai 145 Arg Ala Glu Gin Gly 150 Leu Ser Thr Arg Ser 155 Hls Arg Ser Ser Thr 160 Vai Thr Vai Leu Leu 165 Vai Asn Pro Vai Glu 170 Val Gin Ala Glu Phe 175 Leu Asp Vai Ala Asp 180 Lys Leu Ser Thr Pro 185 Gly Pro Ser Pro Hls 190 Ser Ala 115 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Tyr Ile Thr 195 Leu Leu Leu His Ala 200 Phe Gin Ala Thr Phe 205 Gly Ala His Cys Asp 210 Leu Ser Gly Leu His 215 Arg Arg Leu Gin Ser 220 Lys Thr Leu Ala Glu 225 Leu Glu Ala Ile Phe 230 Thr Glu Thr Ala Glu 235 Ala Gin Glu Leu Ala 240 Ser Gly Ile Gly Asp Ala 245 Ala Glu Ala Arg Gin 250 Trp Leu Arg Thr 255 Lys Leu Gin Ala Vai Gly Glu 260 Lys Ala Gly 265 Phe Pro Gly Val Leu 270 Asp Thr Ala Lys Pro 275 Gly Lys Leu Arg Thr 280 Ile Pro Ile Pro Val 285 Ala Arg Cys Tyr Thr 290 Tyr Ser Trp Asn Gin 295 Asp Ser Phe Asp Ile 300 Leu Gin Glu Ile Leu 305 Leu Lys Glu Gin Glu 310 Leu Leu Gin Pro Glu 315 Ile Leu Asp Asp Glu 320 Glu Asp Glu Asp Glu Glu 325 Asp Glu Glu Glu 330 Asp Leu Asp Ala Asp 335 Gly Hls Cys Ala Glu Arg Asp 340 Ser Val Leu 345 Ser Thr Gly Ser Ala 350 Ala Ser His Ala Ser 355 Thr Leu Ser Leu Ala 360 Ser Ser Gin Ala Ser 365 Gly Pro Thr Leu Ser 370 Arg Gin Leu Leu Thr 375 Ser Phe Val Ser Gly 380 Leu Ser Asp Gly Vai 385 Asp Ser Gly Tyr Met 390 Glu Asp Ile Glu Glu 395 Ser Ala Tyr Glu Arg 400 Pro Arg Arg pro Gly Gly 405 His Glu Arg Arg Gly 410 His Arg Arg Pro 415 Gly Gin Lys Phe Asn Arg Ile 420 Tyr Lys Leu 425 Phe Lys Ser Thr Ser 430 Gin Met Vai Leu Arg 435 Arg Asp Ser Arg Ser 440 Leu Glu Gly Ser Pro 445 Asp Ser Gly Pro Pro 450 Leu Arg Arg Ala Gly 455 Ser Leu Cys Ser Pro 460 Leu Asp Ser Pro Thr 465 Leu Pro Pro Ser Arg 470 Ala Gin Gly Ser Arg 475 Ser Leu Pro Gin Pro 480 Lys Leu Ser Pro Gin Leu 485 Pro Gly Trp Leu 490 Leu Ala Pro Ala Ser Arg 495 Hls Gin Arg Arg Arg Pro 500 Phe Leu Ser 505 Gly Asp Glu Asp Pro 510 Lys Ala Ser Thr Leu 515 Arg val vai val Phe 520 Gly Ser Asp Arg Ile 525 Ser Gly Lys

Vai Vai Arg Ala Tyr Ser Asn Leu Arg· Arg Leu Glu Asn Asn Arg Pro 530 535 540 116 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Leu S45 Leu Thr Arg Phe Phe 550 Lys Leu Gin Phe Phe 555 Tyr Vai Pro Vai Lys 560 Arg Ser Arg Gly Thr 565 Gly Thr Pro Thr Ser 570 Pro Ala Pro Arg Ser 575 Gin Thr Pro Pro Leu 580 Pro Thr Asp Ala Pro 585 Arg His Pro Gly Pro 590 Ala Glu Leu Gly Ala 595 Ala Pro Trp Glu Glu 600 Ser Thr Asn Asp Ile 605 Ser His Tyr Leu Gly 610 Met Leu Asp Pro Trp 615 Tyr Glu Arg Asn Vai 620 Leu Gly Leu Met His 625 Leu Pro Pro Glu Vai 630 Leu Cys Gin Ser Leu 635 Lys Ala Glu Pro Arg 640 Pro Leu Glu Gly Ser 645 Pro Ala Gin Leu Pro 650 Ile Leu Ala Asp Met 655 Leu Leu Tyr Tyr Cys 660 Arg Phe Ala Ala Arg 665 Pro Vai Leu Leu Gin 670 Vai Tyr Gin Thr Glu 675 Leu Thr Phe Ile Thr 680 Gly Glu Lys Thr Thr 685 Glu Ile Phe Ile His 690 Ser Leu Glu Leu Gly 695 His Ser Ala Ala Thr 700 Arg Ala Ile Lys Ala 705 Ser Gly Pro Gly Ser 710 Lys Arg Leu Gly Ile 715 Asp Gly Asp Arg Glu 720 Ala Vai Pro Leu Thr 725 Leu Gin Ile Ile Tyr 730 Ser Lys Gly Ala Ile 735 Ser Gly Arg Ser Arg 740 Trp Ser Asn Met Glu 745 Lys Leu Cys Thr Ser 750 Vai Asn Leu Ser Lys 755 Ala Cys Arg Gin Gin 760 Glu Glu Leu Asp Ser 765 Ser Thr Glu Ala Leu 770 Thr Leu Asn Leu Thr 775 Glu Vai Vai Lys Arg 780 Gin Thr Pro Lys Ser 785 Lys Lys Gly Phe Asn 790 Gin Ile Ser Thr Ser 795 Gin Ile Lys Vai Asp 800 Lys Vai Gin Ile Ile 805 Gly Ser Asn Ser Cys 810 Pro Phe Ala Vai Cys 815 Leu Asp Gin Asp Glu 820 Arg Lys Ile Leu Gin 825 Ser Vai Ile Arg Cys 830 Glu Vai Ser Pro Cys 835 Tyr Lys Pro Glu Lys 840 Ser Ser Leu Cys Pro 845 Pro Pro Gin Arg Pro 850 Ser Tyr Pro Pro Ala 855 Pro Ala Thr Pro Asp 860 Leu Cys Ser Leu Leu 865 Cys Leu Pro Ile Met 870 Thr Phe Ser Gly Ala 875 Leu Pro (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3808 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 117 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ (χί) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO : 3 : GGCACGAGGA ATTTGTTTTG TTTTCAGAAA TTAAACAAAT GATCCTTCAG CATCATCACC 60 TCCGCTGCTT TATCAGGTCG CATAGGGCAT GGAGCTGGAG 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Met 1 Glu Leu Glu Asn 5 Tyr Glu Gin Pro Vai 10 Val Leu Arg Glu Asp 15 Asn Arg Arg Arg Arg 20 Arg Arg Met Lys Pro 25 Arg Ser Thr Ala Ala 30 Ser Leu Ser Ser Met 35 Glu Leu Ile Pro Ile 40 Glu Phe Val Leu Ala 45 Thr Ser Gin Arg Asn 50 Thr Lys Thr Pro Glu 55 Thr Ala Leu Leu His 60 Val Ala Gly His Gly 65 Asn Vai Glu Lys Met 70 Lys Ala Gin Vai Leu 75 Leu Arg Ala Leu Glu 80 Thr Ser Vai Ser Trp 85 Asp Phe Tyr His Arg 90 Phe Gly Pro Asp His 95 Phe Leu Leu Vai Phe 100 Gin Lys Lys Gly Glu 105 Trp Tyr Glu Ile Tyr 110 Asp Lys Tyr Gin Vai 115 Vai Gin Thr Leu Asp 120 Cys Leu Arg Tyr Trp 125 Glu Val Leu His Arg 130 Ser Pro Gly Gin Ile 135 HÍS vai Val Gin Arg 140 His Ala Pro Ser Glu 145 Glu Thr Leu Ala Phe 150 Gin Arg Gin Leu Asn 155 Ala Leu Ile Gly Tyr 160 Asp Vai Thr Asp Vai 165 Ser Asn Vai His Asp 170 Asp Glu Leu Glu Phe 175 Thr Arg Arg Arg Leu 180 Vai Thr Pro Arg Met 185 Ala Glu Val Ala Gly 190 Arg Asp Pro Lys Leu 195 Tyr Ala Met His Pro 200 Trp Val Thr Ser Lys 205 Pro Leu Pro Glu Tyr 210 Leu Leu Lys Lys Ile 215 Thr Asn Asn Cys Val 220 Phe ile Val Ile His 225 Arg Ser Thr Thr Ser 230 Gin Thr Ile Lys Val 235 Ser Ala Asp Asp Thr 240 Pro Gly Thr Ile Leu 245 Gin Ser Phe Phe Thr 250 Lys Met Ala Lys Lys 255 Lys 120 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Ser Leu Met Asp 250 Ile Pro Glu Ser Gin 265 Asn Glu Arg Asp Phe 270 Val Leu Arg Vai Cys 275 Gly Arg Asp Glu Tyr 280 Leu Val Gly Glu Thr 285 Pro Ile Lys Asn Phe 290 Gin Trp Val Arg Gin 295 Cys Leu Lys Asn Gly 300 Glu Glu Ile His Leu 305 Vai Leu Asp Thr Pro 310 Pro Asp Pro Ala Leu 315 Asp Glu Val Arg Lys 320 Glu Glu Trp Pro Leu 325 Val Asp Asp Cys Thr Gly 330 Val Thr Gly Tyr 335 His Glu Gin Leu Thr 340 Ile His Gly Lys Asp 345 His Glu Ser Val Phe 350 Thr Val Ser Leu Trp 355 Asp Cys Asp Arg Lys 360 Phe Arg Val Lys Ile 365 Arg Gly Ile Asp Ile 370 Pro Vai Leu Pro Arg 375 Thr Ala Asp Leu Thr 380 Val Phe Val Glu Ala 385 Asn Ile Gin Tyr Gly 390 Gin Gin Val Leu Cys 395 Gin Arg Arg Thr Ser 400 Pro Lys Pro Phe Thr 405 GlU Glu Val Leu Trp Asn 410 Val Trp Leu Glu 415 Phe Ser Ile Lys Ile 420 Lys Asp Leu Pro Lys 425 Gly Ala Leu Leu Asn 430 Leu Gin Ile Tyr Cys 435 Gly Lys Ala Pro Ala 440 Leu Ser Gly Lys Thr 445 Ser Ala Glu Met Pro 450 Ser Pro Glu Ser Lys 455 Gly Lys Ala Gin Leu 460 Leu Tyr Tyr Val Asn 465 Leu Leu Leu Ile Asp 470 Hls Arg Phe Leu Leu 475 Arg His Gly Glu Tyr 480 Vai Leu Hls Met Trp 485 Gin Leu Ser Gly Lys Gly 490 Glu Asp Gin Gly 495 Ser Phe Asn Ala Asp 500 Lys Leu Thr Ser Gly 505 Thr Asn Pro Asp Lys 510 Glu Asp Ser Met Ser 515 Ile Ser Ile Leu Leu 520 Asp Asn Tyr Cys His 525 Pro Ile Ala Leu Pro 530 Lys His Arg Pro Thr 535 Pro Asp Pro Glu Gly 540 Asp Arg Val Arg Ala 545 Glu Met Pro Asn Gin 550 Leu Arg Lys Gin Leu 555 Glu Ala Ile Ile Ala 560 Thr Asp Pro Leu Asn 565 Pro Leu Thr Ala Glu 570 Asp Lys GlU Leu Leu 575 Trp Hls Phe Arg Tyr 580 Glu Ser Leu Lys Asp 585 Pro Lys Ala Tyr Pro 590 Lys Leu Phe Ser Ser 595 Vai Lys Trp Gly Gin 600 Gin Glu Ile Val Ala 605 Lys Thr Tyr 121 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Gin Leu 610 Leu Ala Lys Arg Glu 615 Val Trp Asp Gin Ser 620 Ala Leu Asp Val Gly 625 Leu Thr Met Gin Leu 630 Leu Asp Cys Asn Phe 635 Ser Asp Glu Asn Val 640 Arg Ala Ile Ala Val 645 Gin Lys Leu Glu Ser 650 Leu Glu Asp Asp Asp 655 Val Leu His Tyr Leu 660 Leu Gin Leu Val Gin 665 Ala val Lys Phe Glu 670 Pro Tyr His Asp Ser 675 Ala Leu Ala Arg Phe 680 Leu Leu Lys Arg Gly 685 Leu Arg Asn Lys Arg 690 Ile Gly His Phe Leu 695 Phe Trp Phe Leu Arg 700 Ser Glu Ile Ala Gin 705 Ser Arg His Tyr Gin 710 Gin Arg Phe Ala Val 715 Ile Leu Glu Ala Tyr 720 Leu Arg Gly Cys Gly 725 Thr Ala Met Leu His 730 Asp Phe Thr Gin Gin 735 Val Gin Val Ile Asp 740 Met Leu Gin Lys Val 745 Thr Ile Asp Ile Lys 750 Ser Leu Ser Ala Glu 755 Lys Tyr Asp Val Ser 760 Ser Gin Val Ile Ser 765 Gin Leu Lys Gin Lys 770 Leu Glu Asn Leu Gin 775 Asn Leu Asn Leu Pro 780 Gin Ser Phe Arg Vai 785 Pro Tyr Asp Pro Gly 790 Leu Lys Ala Gly Ala 795 Leu Val Ile Glu Lys 800 Cys Lys Val Met Ala 805 Ser Lys Lys Lys Pro 810 Leu Trp Leu Glu Phe 815 Lys Cys Ala Asp Pro 820 Thr Ala Leu Ser Asn 825 Glu Thr Ile Gly Ile 830 Ile Phe Lya His Gly 835 Asp Asp Leu Arg Gin 840 Asp Met Leu Ile Leu 845 Gin Ile Leu Arg Ile 850 Met Glu Ser Ile Trp 855 Glu Thr Glu Ser Leu 860 Asp Leu Cys Leu Leu 865 Pro Tyr Gly Cys Ile 870 Ser Thr Gly Asp Lys 875 Ile Gly Met Ile Glu 880 Ile Val Lys Asp Ala 885 Thr Thr Ile Ala Lys 890 Ile Gin Gin Ser Thr 895 Val Gly Asn Thr Gly 900 Ala Phe Lys Asp Glu 905 Val Leu Ser His Trp 910 Leu Lys Glu Lys Cys 915 Pro Ile Glu Glu Lys 920 Phe Gin Ala Ala Val 925 Glu Arg Phe Vai Tyr 930 Ser Cys Ala Gly Tyr 935 Cys Val Ala Thr Phe 940 Val Leu Gly Ile Gly 945 Asp Arg His Asn Asp 950 Asn Ile Met Ile Ser 955 Glu Thr Gly Asn Leu 960 122 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Phe His Ile Asp Phe Gly His Ile Leu Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Leu 965 970 975 Glv Ile Asn Lys Glu Arg Vai Pro Phe Vai Leu Thr Pro Asp Phe Leu 980 985 990 Phe Vai Met Gly Thr Ser Gly Lys Lys Thr Ser Leu His Phe Gin Lys 995 1000 1005 Phe Gin Asp Vai Cys Vai Lys Ala Tyr Leu Ala Leu Arg His His Thr 1010 1015 1020 Asn Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ser Met Met Leu Met Thr Gly Met Pro 1025 1030 1035 1040 Gin Leu Thr Ser Lys Glu Asp Ile Glu Tyr Ile Arg Asp Ala Leu Thr 1045 1050 1055 Vai Gly Lys Ser Glu Glu Asp Ala Lys Lys Tyr Phe Leu Asp Gin Ile 1060 1065 1070 Glu Vai Cys Arg Asp Lys Gly Trp Thr Vai Gin Phe Asn Trp Phe Leu 1075 1080 1085 His Leu Vai Leu Gly Ile Lys Gin Gly Glu Lys His Pro Ala 1090 1095 1100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_ feature (B) LOCALIZAÇÃO: 12.. .0 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: "N é inosina" (A) NOME/CHAVE: misc_ feature (B) LOCALIZAÇÃO: 21.. .0 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: "N é inosina" (A) NOME/CHAVE: misc_ feature (B) LOCALIZAÇÃO: 27.. .0 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: "N é inosina" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: CAYGAYTTYA CNCARCARGT NCARGTNATH GAYATG 36 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico 123 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (Β) LOCALIZAÇÃO: 3...0 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: "Ν é inosina. (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 18...0 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: "N é inosina" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6 GCNTAYATGG ARGAYATNGA RGA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7 Met Glu Glu Glu Glu Phe Met Pro Met Pro Met Glu Phe 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8

Met Glu Glu Glu Glu Phe Met Pro Met Glu Phe Ser Ser 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9

Met Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Glu Phe 15 10 124 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: Met Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Glu Phe Ser Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3255 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11: AAGCTTACTC AGCGCATCTG CTACAGCATT TTATCTTCCC AAGAGCCCCA TGAGGCGATG 60 ACCCAGGATG CAGCCAGGGG CCACGACATG CACGGAGGAC CGCATCCAGC ATGCCCTGGA 120 ACGCTGCCTG CATGGACTCA GCCTCAGCCG CCGCTCCACC TCCTGGTCAG CTGGGCTGTG 180 TCTGAACTGC TGGAGCCTGC AGGAGCTGGT CAGCAGGGAC CCGGGCCACT TCCTTATCCT 240 CCTTGAGCAG ATCCTGCAGA AGACCCGAGA GGTCCAGGAG AAGGGCACCT ACGACCTGCT 300 CACCCCGCTG GCCCTGCTCT TCTATTCCAC TGTTCTTTGT ACACCACACT TCCCACCAGA 360 CTCGGATCTC CTTCTGAAGG CAGCCAGCAC CTACCACCGG TTCCTGACCT GGCCTGTTCC 420 TTACTGCAGC ATCTGCCAGG AGCTGCTCAC CTTCATTGAT GCTGAACTCA AGGCCCCAGG 480 GATCTCCTAC CAGAGACTGG TGAGGGCTGA GCAGGGCCTG CCCATCAGGA GTCACCGCAG 540 CTCCACCGTC ACCGTGCTGC TGCTGAACCC AGTGGAAGTG CAGGCCGAGT TCCTTGCTGT 600 AGCCAATAAG CTGAGTACGC CCGGACACTC GCCTCACAGT GCCTACACCA CCCTGCTCCT 660 GCACGCCTTC CAGGCCACCT TTGGGGCCCA CTGTGACGTC CCGGGCCTGC ACTGCAGGCT 720 ACAGGCCAAG ACCCTGGCAG AGCTTGAGGA CATCTTCACG GAGACCGCAG AGGCACAGGA 780 GCTGGCATCT GGCATCGGGG ATGCTGCAGA GGCCCGGCGG TGGCTCAGGA CCAAGCTGCA 840 GGCGGTGGGA GAAAAAGCTG GCTTCCCTGG GGTGTTAGAC ACTGCAAAAC CAGGGAAGCT 900 CCACACCATC CCCATCCCTG TCGCCAGGTG CTACACCTAC AGCTGGAGCC AGGACAGCTT 960 TGACATCCTG CAGGAAATCC TGCTCAAGGA ACAGGAGCTA CTCCAGCCAG GGATCCTGGG 1020 AGATGATGAA GAGGAGGAAG AGGAGGAGGA GGAGGTGGAG GAGGACTTGG AAACTGACGG 1080 GCACTGTGCC GAGAGAGATT CCCTGCTCTC CACCAGCTCT TTGGCGTCCC ATGACTCCAC 1140 CTTGTCCCTT GCATCCTCCC AGGCCTCGGG GCCGGCCCTC TCGCGCCATC TGCTGACTTC 1200 CTTTGTCTCA GGCCTCTCTG ATGGCATGGA CAGCGGCTAC GTGGAGGACA GCGAGGAGAG 1260 CTCCTCCGAG TGGCCTTGGA GGCGTGGCAG CCAGGAACGC CGAGGCCACC GCAGGCCTGG 1320 GCAGAAGTTC ATCAGGATCT ATAAACTCTT CAAGAGCACC AGCCAGCTGG TACTGCGGAG 1380 GGACTCTCGG AGCCTGGAGG GCAGCTCGGA CACGGCCCTG CCCCTGAGGC GGGCAGGGAG 1440 CCTCTGCAGC CCCCTGGACG AACCAGTATC ACCCCCTTCC CGGGCCCAGC GCTCCCGCTC 1500 CCTGCCCCAG CCCAAACTCG GTACCCAGCT GCCCAGCTGG CTTCTGGCCC CTGCTTCACG 1560 CCCCCAGCGC CGCCGCCCCT TCCTGAGTGG AGATGAGGAT CCCAAGGCTT CCACGCTACG 1620 TGTTGTGGTC TTTGGCTCCG ATCGGATTTC AGGGAAGGTG GCTCGGGCGT ACAGCAACCT 1680 TCGGCGGCTG GAGAACAATC GCCCACTCCT CACACGGTTC TTCAAACTTC AGTTCTTCTA 1740 CGTGCCTGTG AAGCGAAGTC ATGGGACCAG CCCTGGTGCC TGTCCACCCC CTCGGAGCCA 1800 GACGCCCTCA CCCCCGACAG ACTCCCCTAG GCACGCCAGC CCTG6AGAGC TGGGCACCAC 1860 CCCATGGGAG GAGAGCACCA ATGACATCTC CCACTACCTC GGCATGCTGG ACCCCTGGTA 1920 TGAGCGCAAT GTACTGGGCC TCATGCACCT GCCCCCTGAA GTCCTGTGCC AGCAGTCCCT 1980 GAAGGCTGAA GCCCAGGCCC TGGAGGGCTC CCCAACCCAG CTGCCCATCC TGGCTGACAT 2040 GCTACTCTAC TACTGCCGCT TTGCCGCCAG ACCGGTGCTG CTGCAACTCT ATCAGACCGA 2100 GCTGACCTTC ATCACTGGGG AGAAGACGAC AGAGATCTTC ATCCACTCCT TGGAGCTGGG 2160 TCACTCCGCT GCCACACGTG CCATCAAGGC GTCAGGTCCT GGCAGCAAGC GGCTGGGCAT 2220 CGATGGCGAC CGGGAGGCTG TTCCTCTAAC ACTACAGATT ATTTACAGCA AGGGGGCCAT 2280 CAGTGGACGA AGTCGCTGGA GCAACCTGGA GAAGGTCTGT ACCTCCGTGA ACCTCAACAA 2340 GGCCTGCCGG AAGCAGGAGG AGCTGGATTC CAGCATGGAG GCCCTGACGC TAAACCTGAC 2400 AGAAGTGGTG AAAAGGCAGA ACTCCAAATC CAAGAAGG3C TTTAACCAGA TTAGCACATC 2460 GCAGATCAAA GTGGACAAGG TGCAGATCAT CGGCTCCAAC AGCTGCCCCT TTGCTGTGTG 2520 CCTGGACCAG GATGAGAGAA AGATCCTGCA GAGTGTAGTC AGATGTGAGG TCTCACCGTG 2580 CTACAAGCCA GAGAAGAGCG ACCTCTCCTC ACCACCCCAG ACGCCTCCTG ACCTGCCGGC 2640 CCAGGCCGCA CCTGATCTCT GCTCCCTTCT CTGCCTGCCC ATCATGACTT TCAGTGGAGC 2700 125 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3255

TCTGCCCTAG TGTGGGCCCA GCGCCAGACT GGACAGAAGC CCTGGGGCAA CCTCCTCGGC CACCCCTCCA GGACAGTCCC TCTCTGTGGA GAACTGAATG GCCCTGTGCA GAGCCATAGT CCCACTGTGG GTCCTGCAAT GAGCAGGGGC TGGGAGTAGA GGGTTTCTGG GGCCTCAGGG TTCTGGGAAA GCAACAGCTA TCAGAGAGAG AAGGGCCAGA CCCCATAGCC TCTTAGATTC CTGGCAGTAG AAGGAGAAGG ATGGGTAAAT TGACCTCTGA AGTCCCTGAC CATTAGCATG GTCTAGGATC CTTTCTAGAA GGAAGATCTG AGGCTCTGGT GCTCAGGGGG ATGGCTTGGG CCTTTTCTCT CAACCTTGGC TGAGCCTACC CCTTACTTTG CCAAAGACTT GAGGACCCTG TATGTCTGGA GTTCAGTCCC CTCCTCTGTG GGGCTCAGGT GATTGAAATG TGGATGAAAC ATTTCTCTAC TTCAAGACCA CCTCTCCCTG CAAACACCAC ACACACATGG CATGCATGTA CGCACATGCG CACCG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 880 aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:

Met 1 Gin Pro Gly Ala 5 Thr Thr Cys Thr Glu 10 Asp Arg Ile Gin His 15 Ala Leu Glu Arg Cys 20 Leu His Gly Leu Ser 25 Leu Ser Arg Arg Ser 30 Thr Ser Trp Ser Ala 35 Gly Leu Cys Leu Asn 40 Cys Trp Ser Leu Gin 45 Glu Leu val Ser Arg 50 Asp Pro Gly His Phe 55 Leu Ile Leu Leu Glu 60 Gin Ile Leu Gin Lys 65 Thr Arg Glu Vai Gin 70 Glu Lys Gly Thr Tyr 75 Asp Leu Leu Thr Pro 80 Leu Ala Leu Leu Phe 85 Tyr Ser Thr Vai Leu 90 Cys Thr Pro His Phe 95 Pro Pro Asp Ser Asp 100 Leu Leu Leu Lys Ala 105 Ala Ser Thr Tyr His 110 Arg Phe Leu Thr Trp 115 Pro Vai Pro Tyr Cys 120 Ser Ile Cys Gin Glu 125 Leu Leu Thr Phe Ile 130 Asp Ala Glu Leu Lys 135 Ala Pro Gly Ile Ser 140 Tyr Gin Arg Leu Vai 145 Arg Ala Glu Gin Gly 150 Leu Pro Ile Arg Ser 155 His Arg Ser Ser Thr 160 Vai Thr Vai Leu Leu 165 Leu Asn Pro Vai Glu 170 Val Gin Ala Glu Phe 175 Leu Ala Vai Ala Asn 180 Lys Leu Ser Thr Pro 185 Gly His Ser Pro His 190 Ser Ala Tyr Thr Thr 195 Leu Leu Leu His Ala 200 Phe Gin Ala Thr Phe 205 Gly Ala His Cys Asp 210 Vai Pro Gly Leu His 215 Cys Arg Leu Gin Ala 220 Lys Thr Leu Ala Glu 225 Leu Glu Asp Ile Phe 230 Thr Glu Thr Ala Glu 235 Ala Gin Glu Leu Ala 240 Ser Gly Ile Gly Asp 245 Ala Ala Glu Ala Arg 250 Arg Trp Leu Arg Thr 255 Lys Leu Gin Ala Vai 260 Gly Glu Lys Ala Gly 265 Phe Pro Gly Val Leu 270 Asp Thr Ala Lys Pro 275 Gly Lys Leu His Thr 280 Ile Pro Ile Pro Val 285 Ala Arg Cys Tyr Thr 290 Tyr Ser Trp Ser Gin 295 Asp Ser Phe Asp Ile 300 Leu Gin Glu Ile Leu 305 Leu Lys Glu Gin Glu 310 Leu Leu Gin Pro Gly 315 Ile Leu Gly Asp Asp 320 GlU Glu Glu Glu Glu 325 Glu Glu Glu Glu val 330 Glu Glu Asp Leu Glu 335 Thr Asp Gly His Cys 340 Ala Glu Arg Asp Ser 345 Leu Leu Ser Thr Ser 350 Ser Leu 126 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Ala Ser His 355 Asp Ser Thr Leu Ser 360 Leu Ala Ser Ser Gin 365 Ala Ser Gly Pro Ala 370 Leu Ser Arg His Leu 375 Leu Thr Ser Phe Val 380 Ser Gly Leu Ser Asp 385 Gly Met Asp Ser Gly 390 Tyr Val Glu Asp Ser 395 Glu Glu Ser Ser Ser 400 GlU Trp Pro Trp Arg 405 Arg Gly Ser Gin Glu 410 Arg Arg Gly His Arg 415 Arg Pro Gly Gin Lys 420 Phe Ile Arg Ile Tyr 425 Lys Leu Phe Lys Ser 430 Thr Ser Gin Leu Vai 435 Leu Arg Arg Asp Ser 440 Arg Ser Leu Glu Gly 445 Ser Ser Asp Thr Ala 450 Leu Pro Leu Arg Arg 455 Ala Gly Ser Leu Cys 460 Ser Pro Leu Asp Glu 465 Pro Vai Ser Pro Pro 470 Ser Arg Ala Gin Arg 475 Ser Arg Ser Leu Pro 480 Gin Pro Lys Leu Gly 485 Thr Gin Leu Pro Ser 490 Trp Leu Leu Ala Pro 495 Ala Ser Arg Pro Gin 500 Arg Arg Arg Pro Phe 505 Leu Ser Gly Asp Glu 510 Asp Pro Lys Ala Ser 515 Thr Leu Arg Vai Val 520 Val Phe Gly Ser Asp 525 Arg Ile Ser Gly Lys 530 Vai Ala Arg Ala Tyr 535 Ser Asn Leu Arg Arg 540 Leu Glu Asn Asn Arg 545 Pro Leu Leu Thr Arg 550 Phe Phe Lys Leu Gin 555 Phe Phe Tyr Val Pro 560 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TGAAGCCGCG CAGTGCTGCG GCCAGCCTGT 180 CCTCCATGGA GCTCATCCCC ATCGAGTTCG TGCTGCCCAC CAGCCAGCGC AAATGCAAGA 240 GCCCCGAAAC GGCGCTGCTG CACGTGGCCG GCCACGGCAA CGTGGAGCAG ATGAAGGCCC 300 AGGTGTGGCT GCGAGCGCTG GAGACCAGCG TGGCGGCGGA CTTCTACCAC CGGCTGGGAC 360 CGCATCACTT CCTCCTGCTC TATCAGAAGA AGGGGCAGTG GTACGAGATC TACGACAAGT 420 ACCAGGTGGT GCAGACTCTG GACTGCCTGC GCTACTGGAA GGCCACGCAC CGGAGCCCGG 480 GCCAGATCCA CCTGGTGCAG CGGCACCCGC CCTCCGAGGA GTCCCAAGCC TTCCAGCGGC 540 AGCTCACGGC GCTGATTGGC TATGACGTCA CTGACGTCAG CAACGTGCAC GACGATGAGC 600 TGGAGTTCAC GCGCCGTGGC TTGGTGACCC CGCGCATGGC GGAGGTGGCC AGCCGCGACC 660 CCAAGCTCTA CGCCATGCAC CCGTGGGTGA CGTCCAAGCC CCTCCCGGAG TACCTGTGGA 720 AGAAGATTGC CAACAACTGC ATCTTCATCG TCATTCACCG CAGCACCACC AGCCAGACCA 780 TTAAGGTCTC ACCCGACGAC ACCCCCGGCG CCATCCTGCA GAGCTTCTTC ACCAAGATGG 840 CCAAGAAGAA ATCTCTGATG GATATTCCCG AAAGCCAAAG CGAACAGGAT TTTGTGCTGC 900 GCGTCTGTGG CCGGGATGAG TACCTGGTGG GCGAAACGCC CATCAAAAAC TTCCAGTGGG 960 TGAGGCACTG CCTCAAGAAC GGAGAAGAGA TTCACGTGGT ACTGGACACG CCTCCAGACC 1020 CGGCCCTAGA CGAGGTGAGG AAGGAAGAGT GGCCGCTGGT GGACGACTGC ACGGGAGTCA 1080 CCGGCTACCA TGAGCAGCTT ACCATCCACG GCAAGGACCA CGAGAGTGTG TTCACCGTGT 1140 CCCTGTGGGA CTGCGACCGC AAGTTCAGGG TCAAGATCAG AGGCATTGAT ATCCCCGTCC 1200 TGCCTCGGAA CACCGACCTC ACAGTTTTTG TAGAGGCAAA CATCCAGCAT GGGCAACAAG 1260 TCCTTTGCCA AAGGAGAACC AGCCCCAAAC CCTTCACAGA GGAGGTGCTG TGGAATGTGT 1320 GGCTTGAGTT CAGTATCAAA ATCAAAGACT TGCCCAAAGG GGCTCTACTG AACCTCCAGA 1380 TCTACTGCGG TAAAGCTCCA GCACTGTCCA GCAAGGCCTC TGCAGAGTCC CCCAGTTCTG 1440 AGTCCAAGGG CAAAGTTCGG CTTCTCTATT ATGTGAACCT GCTGCTGATA GACCACCGTT 1500 TCCTCCTGCG CCGTGGAGAA TACGTCCTCC ACATGTGGCA GATATCTGGG AAGGGAGAAG 1560 ACCAAGGAAG CTTCAATGCT GACAAACTCA CGTCTGCAAC TAACCCAGAC AAGGAGAACT 1620 CAATGTCCAT CTCCATTCTT CTGGACAATT ACTGCCACCC GATAGCCCTG CCTAAGCATC 1680 AGCCCACCCC TGACCCGGAA GGGGACCGGG TTCGAGCAGA AATGCCCAAC CAGCTTCGCA 1740 AGCAATTGGA GGCGATCATA GCCACTGATC CACTTAACCC TCTCACAGCA GAGGACAAAG 1800 AATTGCTCTG GCATTTTAGA TACGAAAGCC TTAAGCACCC AAAAGCATAT CCTAAGCTAT 1860 TTAGTTCAGT GAAATGGGGA CAGCAAGAAA TTGTGGCCAA AACATACCAA TTGTTGGCCA 1920 GAAGGGAAGT CTGGGATCAA AGTGCTTTGG ATGTTGGGTT AACAATGCAG CTCCTGGACT 1980 GCAACTTCTC AGATGAAAAT GTAAGAGCCA TTGCAGTTCA GAAACTGGAG AGCTTGGAGG 2040 ACGATGATGT TCTGCATTAC CTTCTACAAT TGGTCCAGGC TGTGAAATTT GAACCATACC 2100 ATGATAGCGC CCTTGCCAGA TTTCTGCTGA AGCGTGGTTT AAGAAACAAA AGAATTGGTC 2160 ACTTTTTGTT TTGGTTCTTG AGAAGTGAGA TAGCCCAGTC CAGACACTAT CAGCAGAGGT 2220 TCGCTGTGAT TCTGGAAGCC TATCTGAGGG GCTGTGGCAC AGCCATGCTG CACGACTTTA 2280 CCCAACAAGT CCAAGTAATC GAGATGTTAC AAAAAGTCAC CCTTGATATT AAATCGCTCT 2340 CTGCTGAAAA GTATGACGTC AGTTCCCAAG TTATTTCACA ACTTAAACAA AAGCTTGAAA 2400 ACCTGCAGAA TTCTCAACTC CCCGAAAGCT TTAGAGTTCC ATATGATCCT GGACTGAAAG 2460 CAGGAGCGCT GGCAATTGAA AAATGTAAAG TAATGGCCTC CAAGAAAAAA CCACTATGGC 2520 TTGAGTTTAA ATGTGCCGAT CCTACAGCCC TATCAAATGA AACAATTGGA ATTATCTTTA 2580 AACATGGTGA TGATCTGCGC CAAGACATGC TTATTTTACA GATTCTACGA ATCATGGAGT 2640 CTATTTGGGA GACTGAATCT TTGGATCTAT GCCTCCTGCC ATATGGTTGC ATTTCAACTG 2700 GTGACAAAAT AGGAATGATC GAGATTGTGA AAGACGCCAC GACAATTGCC AAAATTCAGC 2760 AAAGCACAGT GGGCAACACG GGAGCATTTA AAGATGAAGT CCTGAATCAC TGGCTCAAAG 2820 AAAAATCCCC TACTGAAGAA AAGTTTCAGG CAGCAGTGGA GAGATTTGTT TATTCCTGTG 2880 CAGGCTACTG TGTGGCAACC TTTGTTCTTG GAATAGGCGA CAGACACAAT GACAATATTA 2940 TGATCACCGA GACAGGAAAC CTATTTCATA TTGACTTCGG GCACATTCTT GGGAATTACA 3000 AAAGTTTCCT GGGCATTAAT AAAGAGAGAG TGCCATTTGT GCTAACCCCT GACTTCCTCT 3060 TTGTGATGGG AACTTCTGGA AAGAAGACAA GCCCACACTT CCAGAAATTT CAGGACATCT 3120 GTGTTAAGGC TTATCTAGCC CTTCGTCATC ACACAAACCT ACTGATCATC CTGTTCTCCA 3180 TGATGCTGAT GACAGGAATG CCCCAGTTAA CAAGCAAAGA AGACATTGAA TATATCCGGG 3240 ATGCCCTCAC AGTGGGGAAA AATGAGGAGG ATGCTAAAAA GTATTTTCTT GATCAGATCG 3300 128 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ AAGTTTGCAG AGACAAAGGA TGGACTGTGC AGTTTAATTG GTTTCTACAT CTTGTTCTTG GCATCAAACA AGGAGAGAAA CATTCAGCCT AATACTTTAG GCTAGAATCA AAAACAAGTT AGTGTTCTAT GGTTTAAATT AGCATAGCAA TCATCGAACT TGGATTTCAA ATGCAATAGA CATTGTGAAA GCTGGCATTT CAGAAGTATA GCTCTTTTCC TACCTGAACT CTTCCCTGGA GAAAAGATGT TGGCATTGCT GATTGTTTGG TTAAGCAATG TCCAGTGCTA GGATTATTTG CAGGTTTGGT TTTTTCTCAT TTGTCTGTGG CATTGGAGAA TATTCTTGGT TTAAACAGAC TAATGACTTC CTTATTGTCC CTGATATTTT GACTATCTTA CTATTGAGTG CTTCTGGAAA TTCTTTGGAA TAATTGATGA CATCTATTTT CATCTGGGTT TAGTCTCAAT TTTGGTTATC TTTGTGTTCC TCAAGCTCTT TAAAGAAAAA GATGTAATCG TTGTAACCTT TGTCTCATTC CTTAAATGAT GCTTCCAAAC ATCTCCTTAG TGTCTGCAGG TGTTAGTGGT GTGCTAAAAG CAAGGAAAGC GAGTTAGTCT TTTCAGTGTC TTTTGCAATT CAATTCTTTT GTCATGTATA ACTGAGACAC ACAAACACAG CAGGAGAAAT CTAAACCGTT GTGCCTTGAC CTTCCTCTGC TGGTCTTGTT CCAGGGTTAT GAATATGAAA AAATAGAGAT GAGACTTTTT GTGTCAACTC TGTCCACAAG AGTGAGTTAT CTAGTATGAT TAGTATAGCT TTCTCCAGCA TGGCAGCAGG AAGTAACTAC AGGGCCTCTT TTATGCCTGA CATTTCTTCC CTTCCTTTTT CCCTGCCTCC CTTTTTCATC AATTGCAATG ctcccacaac tctttacaga cttgtgaaat cttcaagaac ACCTTTACTC TATAACTCAA AAATTAGTTG AAAAATAATT ACTTCTCAAG GATTATTAGA ATCTTAGGTA CTTATTTGTA AAGATGTTTA GTGACTTTTT TTTCAAGTAT CTATAAAGGA GGCAGATTCT agaaaatatg aattagtttc caaatgcctt aattttaaac tttggcctga

ACAGTTTTTT CTTTTTCTTA ATGGAAGAAG ATATTTAATA TCTTAAAAAT ATTCCAAGTT AGGAAGAACA CTACTTGCCT TATCCATTTC CCATTTAAAG GACTTTTAAA CTTTGACACA GTCCTTCAGA TTTCCTGAAA ATCCTTGAAA TATCTTACTT TAAAAATATT TTCATCTCTG AAATATCTCG TTATTTATTG GAGGTATTGT TTAACCTTAG ATAGACCATT AAATTATTTA TAAAATATTT TGTAATTACC TGTAGYTAAT ACATTACATA GAAAAAACTA TGTTAACAGT GTCTCTGTTT AAGTATAATC AGATATAAAT ATATAACTTA ATTTTTTAAT TTTAAAAATA GATACCTGTT TGACTTTGAG GTAGTCCAGA CCTTTTCTTT TTTTTTTTTT TTTTTAATGT GTGCAAAAGC CCAAAGGTTC CTAAGCCTGG CTGCAAAGAA GAATCAACAG GGACACTTTT TAAAAACACT CTTATCAGCC TGGGCAACAC AGTGAGACTC CATCTCTTAA AAAAAAAATT AGCTGGGTAT AGTGGTATGT GCCTGTAGTC CCAGGTACTC AGGAGGCTGA SGCAGGAGGA TTGCCTGAGC CCAGGAGGTG GAAACTGCAG AGAGTCATGA TCATGTCCTT ACACTCCAGC CTGGATAACA GAGCGAGACC CTGTCTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAGTCGACCG AG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1101 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14: 3350 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3950 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5162

Met 1 Glu Leu Glu Asn 5 Tyr Lys Gin Pro Vai 10 Vai Leu Arg Glu Asp 15 Asn Cys Arg Arg Arg 20 Arg Arg Met Lys Pro 25 Arg Ser Ala Ala Ser 30 Leu Ser Ser Met Glu 35 Leu Ile Pro Ile Glu 40 Phe Vai Leu Pro Thr 45 Ser Gin Arg Lys Cys 50 Lys Ser Pro Glu Thr 55 Ala Leu Leu His Vai 60 Ala Gly His Gly Asn 65 Vai Glu Gin Met Lys 70 Ala Gin Vai Trp Leu 75 Arg Ala Leu Glu Thr 80 Ser Vai Ala Ala Asp 85 Phe Tyr His Arg Leu 90 Gly Pro His His Phe 95 Leu Leu Leu Tyr Gin 100 Lys Lys Gly Gin Trp 105 Tyr Glu Ile Tyr Asp 110 Lys Tyr Gin Vai Vai 115 Gin Thr Leu Asp Cys 120 Leu Arg Tyr Trp Lys 125 Ala Thr His Arg Ser 130 Pro Gly Gin Ile His 135 Leu Vai Gin Arg His 140 Pro Pro Ser Glu Glu 145 Ser Gin Ala Phe Gin 150 Arg Gin Leu Thr Ala 155 Leu Ile Gly Tyr Asp 160 Vai Thr Asp Vai Ser 165 Asn Vai His Asp Asp 170 Glu Leu Glu Phe Thr 175 Arg 129 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ

Arg Gly Leu Val 180 Thr Lys Leu Tyr 195 Ala Met Tyr Leu 210 Trp Lys Lys Arg 225 Ser Thr Thr Ser Gly Ala Ile Leu Gin 245 Leu Met Asp Ile 260 Pro Vai Cys Gly 275 Arg Asp Phe Gin 290 Trp Val Arg Val 305 Leu Asp Thr Pro Glu Trp Pro Leu Val 325 Gin Leu Thr Ile 340 His Leu Trp Asp 355 Cys Asp Ile Pro 370 Val Leu Pro Asn 385 Ile Gin His Gly Lys Pro Phe Thr Glu 405 Ile Lys Ile Lys 420 Asp Tyr Cys Gly 435 Lys Ala Pro Ser 450 Ser Glu Ser Leu 465 Leu Leu Ile Asp Leu His Met Trp Gin 485 Asn Ala Asp Lys 500 Leu Met Ser Ile 515 Ser ile Pro Lys 530 His Gin Pro Glu 545 Met Pro Asn Gin Asp Pro Leu Asn Pro 565 Phe Arg Tyr Glu 580 Ser Ser Ser Val 595 Lys Trp Leu Leu 610 Ala ™-3 Km ™-3 Leu 625 Thr Met Gin Leu Ala Ile Ala Val Gin 645 His Tyr Leu Leu 660 Gin Asp Ser Ala 675 Leu Ala Arg Ile 690 Gly His Phe Ser Arg His Tyr Gin

Pro Arg Met Ala Glu Val His Pro Trp 185 Val Thr Ser Ile Ala 200 Asn Asn Cys Ile Gin 215 Thr Ile Lys Val Ser 230 Ser Phe Phe Thr Lys 235 Met Glu Ser Gin Ser 250 Glu Gin Glu Tyr Leu 265 Val Gly Glu His Cys 280 Leu Lys Asn Gly Pro 295 Asp Pro Ala Leu Asp 310 Asp Asp Cys Thr Gly 315 Val Gly Lys Asp His 330 Glu Ser Arg Lys Phe 345 Arg Val Lys Arg Asn 360 Thr Asp Leu Thr Gin 375 Gin Val Leu Cys Gin 390 Glu Val Leu Trp Asn 395 Val Leu Pro Lys Gly 410 Ala Leu Pro Ala Leu 425 Ser Ser Lys Lys Gly 440 Lys Val Arg Leu His 455 Arg Phe Leu Leu Arg 470 Ile Ser Gly Lys Gly 475 Glu Thr Ser Ala Thr 490 Asn Pro Leu Leu Asp 505 Asn Tyr Cys Thr Pro 520 Asp Pro Glu Gly Leu 535 Arg Lys Gin Leu Glu 550 Leu Thr Ala Glu Asp 555 Lys Leu Lys His Pro 570 Lys Ala Gly Gin Gin 585 Glu Ile Val Glu Val 600 t™ K c-rv Gin Ser ^ ^ l·· Leu 615 Asp Cys Asn Phe Ser 630 Lys Leu Glu Ser Leu 635 Glu Leu Val Gin Ala 650 Val Lys Arg Phe Leu 665 Leu Lys Arg Leu Phe 680 Trp Phe Leu Arg Gin 695 Arg Phe Ala Val Ile

Ala Ser Arg 190 Asp Pro Lys Pro 205 Leu Pro Glu Phe 220 Ile Val Ile His Pro Asp Asp Thr Pro 240 Ala Lys Lys Lys 255 Ser Asp Phe val 270 Leu Arg Thr Pro 285 Ile Lys Asn Glu 300 Glu Ile His val Glu Val Arg Lys Glu 320 Thr Gly Tyr His 335 Glu Val Phe Thr 350 Val Ser Ile Arg 365 Gly Ile Asp Val 380 Phe val Glu Ala Arg Arg Thr Ser Pro 400 Trp Leu Glu Phe 415 Ser Leu Asn Leu 430 Gin Ile Ala Ser 445 Ala Glu Ser Leu 460 Tyr Tyr Val Asn Arg Gly Glu Tyr Val 480 Asp Gin Gly Ser 495 Phe Asp Lys Glu 510 Asn Ser His Pro 525 Ile Ala Leu Asp 540 Arg Val Arg Ala Ala Ile Ile Ala Thr 560 Glu Leu Leu Trp 575 His Tyr Pro Lys 590 Leu Phe Ala Lys 605 Thr Tyr Gin Ala 620 Leu Asp Val /Π ir Asp Glu Asn Val Arg 640 Asp Asp Asp Val 655 Leu Phe Glu Pro 670 Tyr His Gly Leu 685 Arg Asn Lys Ser 700 Glu Ile Ala Gin Leu Glu Ala Tyr Leu 130 ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 705 Arg Gly Cys Gly Thr 710 Ala Met Leu His Asp 715 Phe Thr Gin Gin Val 720 Gin Vai Ile Glu Met 725 Leu Gin Lys Val Thr 730 Leu Asp Ile Lys Ser 735 Leu Ser Ala Glu Lys 740 Tyr Asp Val Ser Ser 745 Gin Val Ile Ser Gin 750 Leu Lys Gin Lys Leu 755 Glu Asn Leu Gin Asn 760 Ser Gin Leu Pro 765 Glu Ser Phe Arg Val Pro 770 Tyr Asp Pro Gly 775 Leu Lys Ala Gly Ala Leu 780 Ala Ile Glu Lys Cys 785 Lys Val Met Ala Ser 790 Lys Lys Lys Pro Leu 795 Trp Leu Glu Phe Lys 800 Cys Ala ASp Pro Thr 805 Ala Leu Ser Asn Glu 810 Thr Ile Gly Ile Ile 815 Phe Lys His Gly Asp 820 Asp Leu Arg Gin Asp 825 Met Leu Ile Leu Gin 830 Ile Leu Arg Ile Met 835 Glu Ser Ile Trp Glu 840 Thr Glu Ser Leu 845 Asp Leu Cys Leu Leu Pro 850 Tyr Gly Cys Ile 855 Ser Thr Gly Asp Lys Ile 860 Gly Met Ile Glu Ile 865 Vai Lys Asp Ala Thr 870 Thr Ile Ala Lys Ile 875 Gin Gin Ser Thr Val 880 Gly Asn Thr Gly Ala 885 Phe Lys Asp Glu Val 890 Leu Asn His Trp Leu 895 Lys Glu Lys Ser Pro 900 Thr Glu Glu Lys Phe 905 Gin Ala Ala Val Glu 910 Arg Phe Val Tyr Ser 915 Cys Ala Gly Tyr Cys 92 0 Val Ala Thr Phe 925 Val Leu Gly Ile Gly Asp 930 Arg His Asn Asp 935 Asn Ile Met Ile Thr Glu 940 Thr Gly Asn Leu Phe 945 His Ile Asp Phe Gly 950 His Ile Leu Gly Asn 955 Tyr Lys Ser Phe Leu 960 Gly Ile Asn Lys Glu 965 Arg Val Pro Phe Val 970 Leu Thr Pro Asp Phe 975 Leu Phe Val Met Gly 980 Thr Ser Gly Lys Lys 985 Thr Ser Pro His Phe 990 Gin Lys Phe Gin Asp 995 Ile Cys Val 1000 Lys Ala Tyr Leu Ala Leu 1005 Arg His His Thr Asn 1010 Leu Leu ile Ile Leu 1015 Phe Ser Met Met Leu 1020 Met Thr Gly Met Pro Gin 025 Leu Thr Ser Lys 1030 Glu Asp Ile Glu Tyr 1035 Ile Arg Asp Ala Leu 1040 Thr Val Gly Lys Asn 1045 Glu Glu Asp Ala Lys 1050 Lys Tyr Phe Leu Asp 1055 Gin Ile Glu Val Cys 1060 Arg Asp Lys Gly Trp 1065 Thr Val Gin Phe 1070 Asn Trp Phe Leu His Leu 1075 Val Leu Gly Ile 1080 Lys Gin Gly Glu Lys His 1085 Ser Ala 1090 1095 1100

Lisboa

Claims

ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma subunidade reguladora plOl de PI3K regulada por proteína G, ou um seu fragmento com pelo menos 30 nucleótidos, apresentando uma sequência de nucleótidos que: a) codifica SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc contido no clone de ADNc pCMV3mycpl01 tal como depositado em ATCC com o n° de acesso 97636; b) codifica SEQ ID NO:12; ou c) híbrida em condições rigorosas com a sequência de nucleótidos de (a) ou (b) ou com as suas complementares.
2. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, em que a molécula de ácido nucleico hibrida em condições moderadamente rigorosas com a sequência de nucleótidos de (a) ou (b) ou com as suas complementares e em que a molécula de ácido nucleico codifica um produto génico de plOl.
3. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, em que a molécula de ácido nucleico hibrida em condições altamente rigorosas com a sequência de nucleótidos de (a) ou (b) ou com as suas complementares.
4. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, em que a molécula de ácido nucleico codifica SEQ ID NO:2 ou a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc contido no clone de ADNc pCMVmycplOl tal como depositado em ATCC com o n° de acesso 97636.
5. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, em que a molécula de ácido nucleico codifica SEQ ID NO:12.
6. Molécula de ácido nucleico isolada incluindo uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 1-160 de SEQ ID NO:2, resíduos de aminoácido 161-263 de SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácido 1-732 de SEQ ID NO:2; resíduos de aminoácido 733-877 de SEQ ID NO:2; resíduos ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 2/6 de aminoácido de 1-160 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido de 161-263 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido de 1-735 de SEQ ID NO:12 e resíduos de aminoácido 736-880 de SEQ ID NO:12.
7. Sequência de nucleótidos isolada que codifica uma proteína quimérica incluindo o polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1-6 fundido com um polipéptido heterólogo.
8. Sequência de nucleótidos isolada de acordo com a reivindicação 7 na qual o polipéptido heterólogo é um marcador Glu ou um marcador epitópico myc.
9. Vector de nucleótido contendo a sequência de nucleótidos de qualquer uma das reivindicações 1-8.
10. Vector de expressão contendo a sequência de nucleótidos de qualquer uma das reivindicações 1-8 em associação operacional com uma sequência reguladora de nucleótidos que controla a expressão da sequência de nucleótidos numa célula hospedeira.
11. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 10, em que a referida sequência reguladora é seleccionada do grupo que consiste no promotor do gene precoce imediato hCMV de citomegalovírus, nos promotores precoces ou tardios do adenovírus SV40, no promotor de baculovírus, no sistema lac, no sistema trp, no sistema TAC, no sistema TRC, das regiões de operador principal e promotor do fago λ, nas regiões de controlo da proteína de envelope fd, no promotor para 3-fosfoglicerato-quinase, nos promotores de fosfatase ácida e nos promotores dos factores de acasalamento α de levedura.
12. Célula hospedeira que foi geneticamente modificada para conter o vector de qualquer uma das reivindicações 9-11.
13. Animal transgénico não humano incluindo a célula hospedeira da reivindicação 12.
14. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12, em que a célula hospedeira foi geneticamente modificada para conter o vector da reivindicação 11. ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 3/6
15. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14, em que a célula hospedeira é uma célula Sf9, uma célula de ovário de hamster chinês, uma célula COS ou uma célula U937.
16. Célula hospedeira geneticamente modificada em que a sequência genética nativa para a subunidade plOl de PI3K regulada por proteina G é destruída de modo que a expressão do produto génico de P101 nativo é inibida ou evitada, em que a sequência genética nativa codifica a sequência de nucleótidos de qualquer uma das reivindicações 1-5.
17. Subunidade reguladora plOl de PI3K regulada por proteína G, isolada, apresentando uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleótidos que: a) codifica SEQ ID NO:2 ou a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc contido no clone de ADNc pCMV3mycpl01 tal como depositado em ATCC com o n° de acesso 97636; b) codifica SEQ ID N0:12; ou c) híbrida em condições rigorosas com a sequência de nucleótidos de (a) ou (b) ou com as suas complementares, em que a referida subunidade reguladora plOl está isenta da subunidade catalítica pl20.
18. Subunidade reguladora plOl de PI3K regulada por proteína G, isolada, de acordo com a reivindicação 17, apresentando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, ou a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc contido no clone de ADNc pCMV3mycpl01 tal como depositado em ATCC com o n° de acesso 97636.
19. Subunidade reguladora plOl de PI3K regulada por proteína G, isolada, de acordo com a reivindicação 17, apresentando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12.
20. Polipéptido apresentando uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 1-160 de SEQ ID NO:2, resíduos de aminoácido 161-263 de SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácido 1-732 de SEQ ID NO:2; resíduos de aminoácido 733-877 de SEQ ID NO:2; resíduos de aminoácido 1-160 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido 161-263 de SEQ ID NO:12, resíduos de aminoácido 1- ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 4/6 735 de SEQ ID ΝΟ:12 e resíduos de aminoácido 736-880 de SEQ ID NO:12.
21. Proteína quimérica incluindo o polipéptido de qualquer uma das reivindicações 17-20 fundido com um polipéptido heteróloqo.
22. Proteína quimérica de acordo com a reivindicação 21 em que o polipéptido heterólogo é um marcador Glu ou um marcador epitópico myc.
23. Anticorpo que liga de modo imunoespecífico à subunidade reguladora plOl de PI3K regulada por proteína G de qualquer uma das reivindicações 17-20.
24. Método in vitro para diagnóstico de uma doença de resposta inflamatória num mamífero, incluindo a detecção de uma mutação génica da subunidade reguladora plOl de PI3K regulada por proteína G contida no genoma de um mamífero, em que o gene de tipo selvagem da subunidade reguladora plOl de PI3K regulada por proteína G expressa o polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 1-5.
25. Método para rastrear compostos úteis para o tratamento de doenças de resposta inflamatória, incluindo pôr em contacto um composto com uma célula hospedeira de cultura da reivindicação 12 que expressa o ácido nucleico de plOl de PI3K regulada por proteína G de qualquer uma das reivindicações 1-5, e detectar uma alteração na expressão do ácido nucleico de plOl ou uma alteração de actividade do produto do ácido nucleico de plOl expresso pela célula de cultura.
26. Método da reivindicação 25 no qual a expressão do gene plOl é detectada por medição dos produtos de transcrição de ARNm do ácido nucleico de plOl.
27. Método da reivindicação 25 no qual a expressão do ácido nucleico de plOl é detectada por medição da proteína de subunidade reguladora plOl. ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 5/6
28. Método para rastrear compostos úteis para o tratamento de doenças de resposta inflamatória, incluindo pôr em contacto um composto com a célula hospedeira de cultura da reivindicação 12 que foi geneticamente modificada para expressar o ácido nucleico de pl01 de PI3K regulada por proteína G, e detectar uma alteração na produção de um segundo mensageiro Ptdlns(3,4,5)P3, uma alteração na adesão celular ou uma alteração na produção de O2.
29. Método de acordo com a reivindicação 28 em que os níveis de Ptdlns(3,4,5)P3 na célula hospedeira são ensaiados utilizando HPLC de permuta aniónica.
30. Célula hospedeira que foi geneticamente modificada para conter o vector de qualquer uma das reivindicações 9-11 e uma molécula de ácido nucleico que codifica uma subunidade catalítica pl20 de PI3K regulada por proteína G, apresentando uma sequência de nucleótidos que: a) codifica SEQ ID NO:4 ou a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc contido no clone de ADNc pCMV3mycpl01 tal como depositado em ATCC com o n° de acesso 97637; b) codifica SEQ ID NO:14; ou c) híbrida em condições rigorosas com pelo menos a sequência de nucleótidos de (a) ou (b) que codifica os últimos 28 aminoácidos da subunidade pl20, ou com a complementar da sequência de (a) ou (b) que codifica os últimos 28 aminoácidos da subunidade pl20.
31. Animal transgénico não humano incluindo a célula hospedeira da reivindicação 30.
32. Método para tornar uma célula hospedeira capaz de expressar um produto génico plOl incluindo modificar geneticamente uma célula para conter a sequência de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-11.
33. Método para produzir uma proteína plOl, incluindo proporcionar uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 ou a reivindicação 30 e a expressão da sequência de nucleótidos de plOl e opcionalmente da sequência de nucleótidos de pl20 na referida célula. ΕΡ Ο 939 821 /ΡΤ 6/6
34. Método para produzir uma proteína plOl incluindo: a modificação genética de uma célula para conter a sequência de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-11; e a expressão da sequência de nucleótidos de plOl na referida célula.
35. Método de acordo com a reivindicação 33 ou 34, incluindo adicionalmente a recuperação do polipéptido plOl e opcionalmente do polipéptido pl20, a partir da célula hospedeira ou do meio cultura.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a célula hospedeira inclui o vector pGEX e em que a recuperação do polipéptido plOl inclui a libertação do polipéptido plOl da porção GST. Lisboa,