KR20200044321A

KR20200044321A - 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20200044321A
Application number: KR1020180124897A
Authority: KR
Inventors: 조양제; 남희진
Original assignee: 아이진 주식회사
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-04-29
Also published as: EP3868392A1; JP2022513370A; US20210353711A1; WO2020080836A1; EP3868392A4; CN112912096A

Abstract

본 발명은 우수한 항염증 효과를 갖는 약학적 조성물을 제공하여 재관류성 손상, 치주염, 관절염, 욕창 염증, 창상 염증 또는 피부염 등과 같은 염증성 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 항염증용 화장료 조성물을 제공하여 각종 염증성 피부 질환에 사용될 수 있는 화장품의 원료로 사용할 수 있다.

Description

염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING INFLAMMATORY DISEASE}

본 발명은 우수한 항염증 효과를 갖는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

염증은 외부의 물리적 자극, 각종 알레르기 유발 물질 접촉을 예로 들 수 있는 화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스와 같은 미생물의 침입 등에 의해 생체 조직이 손상되는 것을 막기 위한 생체의 방어 반응 중 하나이다.

염증 신호는 사이클로옥시게나제(COX) 경로 또는 리폭시게나제(LOX) 경로를 통하여 만들어지며, 프로스타글란딘, 트롬복산 등을 생성한다. 염증 신호가 전달되면 생체 내에서는 여러 가지 변화가 일어나는데, 그 중 하나로 염증이 필요한 부위의 혈관을 확장시켜 혈액 공급이 왕성하게 일어나도록 하여, 호중구 등 염증 반응에 필요한 혈액 세포가 집중 공급되는 현상을 들 수 있다. 그러나 이러한 생체의 방어 반응이 비정상적으로 과도하게 일어나면 여러 염증성 질환들이 발병하게 되므로, 이를 방지하고자 염증 신호 경로의 효소(예를 들어 COX-1, COX-2, 5-LOX, 12-LOX 등)를 억제하여 염증 신호 경로를 차단함으로써, 과도한 염증 반응을 억제할 수 있는 약물들이 개발되고 있다.

염증은 반응기간에 따라서 급성염증(acute inflammation, 즉각적 반응, 비특이적 반응, 수일~수주일), 만성염증(chronic inflammation, 지연된 반응, 특이성 반응, 수주일 이상), 아급성 염증(subacute inflammation, 급성과 만성염증의 중간단계, 다핵구와 단핵구의 혼합형 산출물의 특징)으로 나뉜다.

또한, 염증을 유발하는 인자에는 펩타이드성 인자 이외에 프로스타그란딘, 루코트리엔, 혈소판활성인자와 같은 지질성 인자, 염증인자 합성효소, NO(nitric oxide)와 같은 자유라디칼, 여러 종류의 세포접착분자, 면역계, 응고인자 등이 관여한다.

현재까지 알려진 염증의 기전은 외부의 생물학적인 원인(세균, 바이러스, 기생충), 물리학적인 원인(기계적인 자극, 열, 방사선, 전기), 화학적 원인 등으로 인한 세포손상으로 히스타민 및 키닌 등이 방출되어 혈관확장, 모세혈관 투과성 증가 및 염증부위로 대식세포의 집결이 일어나고, 이에 따라서 감염부위의 혈류량 증가, 부종, 면역세포 및 항체 이동, 통증, 발열 등의 현상이 일어난다.

현재 사용되고 있는 염증의 치료제에는 이부프로펜과 같은 합성의약품, 항히스타민제, 스테로이드, 코티손, 면역억제제, 면역 항진제 등이 사용되고 있으나 치료효과가 일시적이거나 단순 증상완화, 과민반응, 면역체계 악화 등의 부작용이 많이 있고 염증의 근본적인 치료가 어렵다.

따라서, 최근 효과적인 염증 완화를 위하여, 상기 염증 관련 단백질의 발현을 억제할 수 있는 물질에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나, 이러한 연구에 의해 개발된 항염물질의 경우 몇 가지 부작용이 문제되고 있다. 비스테로이드성　항염증제(NSAID)와 스테로이드성　항염증제(SAID)를 비롯한 다양한 기전의 염증 억제용 약물들이 개발되어 있으나, 이들은 적지 않은 부작용을 나타낼 뿐만 아니라, 염증 반응을 근본적으로 억제하는 것이 아니기에, 좀 더 효과적이고 안전하며 경제성이 높은 약물에 대한 요구가 여전히 존재한다. 일 예로, 급성 또는 류마티스성 관절염과 같은 만성의 염증 질환의 치료에 사용되는 비스테로이드성 소염 약물들은 COX-2 효소를 억제할 뿐만 아니라 COX-1 효소도 억제함으로써 위장관 장애와 같은 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.

한국공개특허 2016-0086864호

본 발명은 우수한 항염증 효과를 갖는 약학적 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것에 그 목적이 있다.

1. 서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 염증성 질환은 신경염증, 재관류성 손상, 치주염, 관절염, 피부염, 창상 염증, 욕창 염증, 척추염, 요도염, 방광염, 신염, 신우신염, 혈관염, 비염, 인후염, 편도염, 급성통증 및 염증성 장질환으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 것인 조성물.

3. 서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항염증용 화장료 조성물.

본 발명은 우수한 항염증 효과를 갖는 약학적 조성물을 제공하여 재관류성 손상, 치주염, 관절염 또는 피부염 등과 같은 염증성 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 항염증용 화장료 조성물을 제공하여 각종 염증성 피부 질환에 사용될 수 있는 화장품의 원료로 사용할 수 있다.

도 1은 실시예 1의 무처리 대조군, LPS만을 처리한 대조군, LPS에 본 발명 펩타이드를 함께 처리한 실험군 및 본 발명 펩타이드만을 처리한 실험군의 TNF-α의 발현량을 비교한 데이터이다.
도 2은 실시예 2의 LPS 단독 처리 대조군 및 LPS와 본 발명 펩타이드를 함께 처리한 경우의 IL-8, CXCL1 및 CXCL10의 발현량을 확인한 것이다.
도 3는 실시예 3의 immunohistochemistry (IHC)에 사용된 염색 심장조직 부위를 나타내는 모식도이다.
도 4는 실시예 3의 Group 1 내지 4의 eNOS 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 5은 실시예 3의 Group 1 내지 4의 TNF-α 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 6은 실시예 3의 Group 1 내지 4의 CD68(Macrophage) 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 7은 실시예 3의 Group 1 내지 4의 Ly-6B(Neutrophil) 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 8는 실시예 4의 결찰 후, 재관류 후 및 제작 후 사육기간 동안에 일반증상을 관찰함으로써 각 군의 생존률을 확인한 결과이다.
도 9, 10은 실시예 4의 echocardiography를 이용하여 EF와 FS 값을 측정한 결과이다.
도 11는 실시예 4의 심근 조직의 경색 크기 및 섬유화 정도를 측정한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 '치료'는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다.

상기 '예방'은 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 조성물은 초기 증상, 또는 나타나기 전에 투여할 경우 관련 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

상기 서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드는 항염증 효능이 우수하다. 예를 들면, 염증성 마커로 알려진 eNOS, TNF-α, CD68, Ly-6B(neutrophil)의 발현량을 효과적으로 감소시켜 각종 염증성 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 화학적으로 합성할 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 있으나, 이에 제한되지 않는다. (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

또한 본 발명의 폴리펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있으나, 하기의 방법에 제한되지 않는다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예를 들면, Biosearch 또는 Applied biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동 가능하게 연결되어 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 폴리펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., MolecularCloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J.Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 폴리펩타이드를 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 항염증제로서 작용함으로써, 창상 염증, 욕창 염증, 아토피 피부염을 포함하는 피부염, 신경염증, 척추염, 요도염, 방광염, 신염, 신우신염, 혈관염, 비염, 치주염, 관절염, 인후염, 편도염, 급성통증, 재관류성 손상 또는 염증성 장질환 등의 예방 및 치료에 응용될 수 있으나, 염증성 질환에 해당하는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상기 폴리펩타이드 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

상기 조성물은 상기 폴리펩타이드를 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 폴리펩타이드를 나노리포좀 내부에 함유시키면, 폴리펩타이드의 성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변형 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 폴리펩타이드로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항염증용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 항산화 또는 항염증을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품이라 함은, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 상기 폴리펩타이드를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 상기 폴리펩타이드를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 폴리펩타이드를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 상기 폴리펩타이드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 상기 폴리펩타이드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류. 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

이하, 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩타이드는 '본 발명 펩타이드'로 축약하여 표시될 수 있다.

실시예 1. TNF-α 발현 억제능의 확인

(1) 실험방법

배양 중인 THP-1 (human monocytic cell line)에 발명 펩타이드(F1701)를 선처리 30분 한 후, LPS (1 μg/mL)를 처리하여 24 시간 반응시킨다. 반응 후 배지를 수집하여 남은 cell을 제거한 뒤, Duoset® ELISA Human TNF-α(DY210-05, R&D Systems)를 이용하여 TNF-α의 발현량을 측정한다.

(2) 실험결과

도 1를 참조하면, 무처리 대조군, LPS만을 처리한 대조군, LPS에 본 발명 펩타이드를 함께 처리한 실험군 및 본 발명 펩타이드만을 처리한 실험군의 TNF-α의 발현량을 비교한 데이터를 확인할 수 있다. 이를 참조하면, 본 발명 펩타이드를 단독 처리한 경우 무처리 대조군에 비하여 TNF-α의 발현을 억제할 수 있음을 확인할 수 있고, LPS와 본 발명 펩타이드를 함께 처리한 경우 LPS만을 처리한 대조군에 비하여 TNF-α의 발현을 농도 의존적 및 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있다. 이는, 본 발명 펩타이드의 염증성 질환 마커의 발현 억제를 통한 각종 염증성 질환의 치료효과는 물론, 예방효과까지 보일 수 있는 가능성을 제시하는 의미있는 실험결과로 판단된다.

실시예 2. IL-8, CXCL1 및 CXCL10 발현량 조절능 확인

(1) 실험방법

배양 중인 THP-1 (human monocytic cell line)을 24 well plate에 1.0×10⁶/well로 seeding 하며 16 시간 배양한다. 발명 펩타이드(F1701)를 최종 농도 100 nM로 선처리 30분을 수행하며 LPS (1 μg/mL) 처리 후 24 시간 배양한다. 샘플 준비는 배양액을 수집하여 원심분리를 통해 남은 세포를 제거한 뒤 상층액만을 이용한다. 처리 전후의 cytokine들의 발현양을 Proteome Profiler Human Cytokine Array kit (R&D) system을 사용하여 비교한다.

(2) 실험결과

도 2을 참조하면, LPS 단독 처리 대조군 및 LPS와 본 발명 펩타이드를 함께 처리한 경우의 IL-8, CXCL1 및 CXCL10의 발현량을 확인할 수 있다. 이를 참조하면, 대조군 대비 본 발명 펩타이드를 처리한 경우 IL-8의 발현량이 감소함과 동시에, CXCL1과 CXCL10의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있다. 이는, 본 발명 펩타이드가 염증성 마커인 IL-8의 발현량을 감소시키고, CXCL1과 CXCL10의 발현량을 증가시킴으로서 상처를 치유하는 기전을 작동시킴을 확인할 수 있는 데이터로서, 염증성 질환의 예방 또는 치료 및 각종 상처의 치유에 효과적일 수 있음을 확인할 수 있는 의미있는 결과로 판단된다.

실시예 3. 재관류성 손상 관련 마커 유전자의 발현량 억제능 평가

(1) 실험방법

1) 시험계 및 시험군

In vivo 실험의 대상으로서 Sprague-Dawley(SD) male rat을 사용하였고, 심장조직은 176장을 사용하였는데, 이 중 IHC에 사용된 염색 심장조직 부위는 도 3의 모식도 중 2번과 3번 부위를 사용하였다.

시험군으로서 Paraffin block & slide를 제작하였고, 모든 시험군은 공통적으로 결찰 후 1회 및 재관류 후 1회(공통 2회) 본 발명 펩타이드를 처리하였다. 구체적인 시험군 정보는 하기 표 1과 같다.

Group	Dosage (μg/kg/each)	투여횟수	eNOS (마리수)	TNF-α (마리수)	Macrophage (마리수)	Neutrophil (마리수)
Sham control	0	공통 2회 투여	3	3	3	3
MI/R control	0	공통 2회 투여	10	10	10	10
Group1	150	공통 2회 투여	8	8	8	8
Group2	150	공통 2회 투여 + 추가 1회	8	8	8	8
Group3	150	공통 2회 투여 + 추가 2회	7	7	7	7
Group4	150	공통 2회 투여 + 추가 3회	8	8	8	8

2) 시험방법

심장 조직 슬라이드를 활용하여 Immunohistochemistry (IHC)를 수행하였다. 슬라이드 스캐너로 조직 이미지를 촬영하고, Leica application suite 프로그램을 이용하여 발현된 부위의 면적을 측정하여 발현비율을 분석하였다.

3) 통계분석

본 유효성 평가 결과는 시험군 간의 평균과 표준편차를 산출하여 군 간 비교하였다. 통계학적 방법은 one way ANOVA를 통하여 군 간 유의성을 나타내었다. 데이터는 mean SD 값으로 표시하였다. 시험항목의 유의성 인정은 p<0.05인 경우로 하였으며, 통계를 위한 전산 프로그램은 SPSS 23(IBM, USA)를 이용하였다.

(2) 실험결과

1) eNOS의 발현 정도 측정

도 4를 참조하면, Group 1 내지 4의 eNOS 발현 정도를 측정한 결과를 확인할 수 있는데, 대조군 대비 본 발명 펩타이드를 처리한 군에서 모두 eNOS의 발현량이 감소함을 확인할 수 있다. 특히, Group 4의 경우 eNOS의 발현량이 대조군에 비하여 절반 이상 감소하는 것을 확인할 수 있는데, 이는 본 발명 펩타이드가 심근에서의 eNOS의 발현량을 감소시켜 심근의 기능 부전을 억제함으로써, 재관류성 손상의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 보여주는 것이다.

2) TNF-α의 발현정도 측정

도 5을 참조하면, Group 1 내지 4의 TNF-α 발현 정도를 측정한 결과를 확인할 수 있는데, 대조군 대비 본 발명 펩타이드를 처리한 군에서 모두 TNF-α 발현량이 현저히 감소함을 확인할 수 있다. 특히, Group 2 내지 4의 경우 TNF-α 발현량이 대조군에 비하여 약 25% 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있는데, 이는 본 발명 펩타이드가 심근에서의 TNF-α 발현량을 감소시켜 염증성 반응으로의 진행을 막음에 따라, 재관류성 손상의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 보여주는 것이다.

3) CD68의 발현 정도 측정

도 6을 참조하면, Group 1 내지 4의 CD68(Macrophage) 발현 정도를 측정한 결과를 확인할 수 있는데, 대조군 대비 본 발명 펩타이드를 처리한 군에서 모두 CD68 발현량이 현저히 감소함을 확인할 수 있다. 특히, Group 2와 4의 경우 CD68의 발현량이 대조군에 비하여 약 25% 수준으로 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있는데, 이는 본 발명 펩타이드가 심근에서의 CD68의 발현량을 감소시켜 항염증 효과를 증가시킴에 따라, 재관류성 손상의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 보여주는 것이다.

4) Ly-6B 발현 정도 측정

도 7을 참조하면, Group 1 내지 4의 Ly-6B(Neutrophil) 발현 정도를 측정한 결과를 확인할 수 있는데, 대조군 대비 본 발명 펩타이드를 처리한 군에서 모두 Ly-6B 발현량이 현저히 감소함을 확인할 수 있다. 특히, Group 2와 4의 경우 Ly-6B의 발현량이 대조군에 비하여 약 40% 수준으로 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있는데, 이는 본 발명 펩타이드가 심근에서의 Ly-6B의 발현량을 감소시켜 항염증 효과를 증가시킴에 따라, 재관류성 손상의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 보여주는 것이다.

실시예 4. 재관류성 손상 억제에 대한 심장 기능 개선 유효성 평가

(1) 실험방법

In vivo 실험의 대상으로서, 심혈관질환 효능 평가 등에 널리 사용되고 있는 Spraque-dawley(SD) male rat(7주령, 270-320g)을 147 마리 사용하였다. MI/R 모델을 제작한 후, 하기 표 2와 같이 각 군별로 대조물질과 시험물질을 투여하였다. 결찰 직후 1회, 재관류 직후 1회, 총 2회 피하 투여(subcutaneous, S.C.)하였다. 피하 투여는 대퇴부 부위에 시행하였으며, 모델 제작 1일 경과 후부터는 목덜미로 피하 투여하였다.

Group	Information	Dosage	마리수	투여물질 (총 8회)
G1	모의대조군(No MI/R model)	18 mg/kg	10	D-mannitol
G2	실험대조군(MI/R model)	18 mg/kg	16	D-mannitol
G3	실험군(MI/R model)	50 μg/kg	15	본 발명 펩타이드
G4	실험군(MI/R model)	150 μg/kg	14	본 발명 펩타이드
G5	실험군(MI/R model)	300 μg/kg	16	본 발명 펩타이드
G6	실험군(MI/R model)	450 μg/kg	17	본 발명 펩타이드
G7	실험군(MI/R model)	600 μg/kg	17	본 발명 펩타이드

좌심실의 기능을 확인하기 위하여 MI/R 모델 제작 전, 모델 제작 후 6, 14일 째 echocardiography를 이용하여 EF와 FS 값을 측정하였으며, 모델 제작 후 14일 째에 심장 조직 슬라이드를 제작하여 IHC를 수행하였다. Ecocardiography는 모델제작 후 6일, 14일째에 Vevo-2100 (Visualsonics, CAN)장비를 활용하여 ejection fraction (EF, 박출계수)과 fractional shortening (FS, 구획단축률)을 측정하였다. IHC는 슬라이드 스캐너로 심장 조직 이미지를 촬영하고, Leica application suite 프로그램을 이용하여 발현된 부위의 면적을 측정하여 발현비율을 분석하였다. 심장 경색 면적 측정은 Modified Masson's trichrome stain kit을 사용하였으며, Leica Application Suite 프로그램(Leica, DEU)을 이용하여 심장의 면적과 MI 면적을 측정하여 MI가 차지하는 비율을 분석하였다. 유효성 평가 결과는 대조군과 실험군의 평균과 표준편차를 산출하여 군 간 비교하였다. 통계학적 방법은 일원배치 분산분석(one-way ANOVA test)을 사용하였으며, 이를 토대로 군 간 유의성을 확인하였다. 데이터는 mean±SD로 표시하였다. 허혈성 급성 심근경색 모델에서 본 발명 펩타이드의 임상 용량 확인을 위한 유효성 평가의 유의성 인정은 p<0.05인 경우로 하였으며, 통계를 위한 전산 프로그램은 SPSS 23(IBM, USA)을 이용하였다.

(2) 실험결과

1) 생존율

도 8를 참조하면, 결찰 후, 재관류 후 및 제작 후 사육기간 동안에 일반증상을 관찰함으로써 각 군의 생존률을 확인할 수 있는데, 실험기간 동안 본 발명 펩타이드를 투여한 모든 군(Group 3 내지 7)의 생존률은 Day 3까지 80% 이상으로서, Day 2에 이미 생존률이 75%까지 떨어진 실험대조군(Group 2)에 대비할 때 현저히 높음을 확인할 수 있다. 특히, Group 6의 경우 생존률이 타 군에 비해 현저히 높음을 확인할 수 있고, 이는 Day 14에 이르러도 80%를 상회하는 높은 생존률을 유지하는 것으로서, 본 발명 펩타이드를 고농도로 처리할 시 재관류성 손상 억제능이 보다 우수할 것임을 암시케 한다.

2) Echocardiography를 이용한 좌심실 기능 평가

하기 표 3를 참조하면 좌심실의 기능을 확인하기 위하여 MI/R 모델 제작 전, 모델 제작 후 6, 14일 째 echocardiography를 이용하여 EF와 FS 값을 측정한 결과를 확인할 수 있는데, 실험대조군인 Group 2에 비하여, 모든 실험군(Group 3 내지 7)에서 EF와 FS가 높은 수치를 보임을 확인할 수 있다. 특히, Group 5 내지 7에서 실험대조군 대비 현저히 높은 수치를 보임을 확인할 수 있는데, 상기 결과는 본 발명 펩타이드를 처리할 시 재관류성 손상을 억제하여 좌심실의 수축기능 손상을 매우 효과적으로 억제할 수 있음을 암시하는 결과로 판단된다. 도 9, 10은 하기 표 3의 결과를 그래프화한 것이다. (*p<0.005, **p<0.001, ***p<0.0005, ****p<0.0001 versus G1), (+p<0.005, ++p<0.001, +++p<0.0005, ++++p<0.0001 versus G2), (#p<0.05, #p<0.005 versus G3), (§p<0.05 versus G4)

Group	EF(%)			FS(%)
Group	Day 0	Day 6	Day 14	Day 0	Day 6	Day 14
G1	80.1±3.9	78.4±4.5	80.1±4.4	50.3±4.0	48.7±4.4	50.5±4.9
G2	78.3±3.6	47.9±9.0	46.3±8.8	48.6±3.6	25.1±6.0	24.2±5.9
G3	80.4±2.2	49.9±6.9	48.1±5.8	50.5±2.3	26.3±4.4	25.1±3.4
G4	79.3±3.2	51.0±10.6	53.6±8.8	49.4±3.3	27.3±7.1	28.8±5.7
G5	79.7±3.5	60.8±10.4	61.5±10.5	49.9±3.3	34.0±7.3	34.7±7.9
G6	79.2±3.1	60.5±14.4	61.8±12.9	49.3±3.1	34.3±9.9	35.2±9.5
G7	79.3±3.0	62.5±9.2	62.3±8.5	49.4±3.0	35.2±6.6	35.3±6.4

3) 경색 부위 면적 평가

하기 표 4를 참조하면, 심근 조직의 경색 크기 및 섬유화 정도를 측정하기 위하여 MI/R 모델 제작 후 14일째 심장을 적출하여 Masson's trichrome(MT) staining을 진행하여, 개체당 5개의 slide를 제작하고 좌심실의 전체 면적에 대한 경색부위가 차지하는 비율을 계산하여 평균값을 구한 것을 확인할 수 있는데, 실험대조군인 Group 2에 비하여, 모든 실험군(Group 3 내지 7)에서 평균 경색 부위 비율이 모두 낮고, 특히 Group 5 내지 7에서 그 비율이 현저히 낮음을 확인할 수 있다. 이는, 본 발명 펩타이드를 처리하는 경우, 재관류로 인한 심근 조직의 경색을 억제함으로써, 재관류성 손상의 예방 또는 치료에 현저한 효과를 가질 수 있음을 의미하는 것이다. 도 11는 하기 표 4의 결과를 그래프화한 것이다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 versus G2)

Group	Day 14 경색면적/좌심실 전체면적(%)
G2	14.3±4.5
G3	13.6±4.3
G4	11.9±6.0
G5	9.5±4.3
G6	9.1±5.1
G7	9.3±3.9

<110> EYEGENE INC. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING INFLAMMATORY DISEASE <130> 18P09078 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence 1 <400> 1 Thr Cys Gln Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Ser Asp Gly Pro Cys 1 5 10 15 Cys Gln Asn Cys Gln Leu Arg Pro Ser Gly Trp Gln Cys Arg Pro Thr 20 25 30 Arg Gly Asp Cys Asp Leu Pro Glu Phe Cys Pro Gly Asp Ser Ser Gln 35 40 45 Cys Pro Pro Asp Val Ser Leu Gly Asp Gly 50 55

Claims

서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 염증성 질환은 신경염증, 재관류성 손상, 치주염, 관절염, 피부염, 창상 염증, 욕창 염증, 척추염, 요도염, 방광염, 신염, 신우신염, 혈관염, 비염, 인후염, 편도염, 급성통증 및 염증성 장질환으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 것인 조성물.
서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항염증용 화장료 조성물.