KR20120046163A - 자가면역, 염증 및 암의 과정을 저해할 수 있는 신규한 케모카인 결합 폴리펩타이드류 - Google Patents

자가면역, 염증 및 암의 과정을 저해할 수 있는 신규한 케모카인 결합 폴리펩타이드류 Download PDF

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미셀 아브라함
오를리 아이젠버그
암논 펠레드
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바이오카인 테라퓨틱스 리미티드
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Abstract

케모카인-결합 펩타이드 및 Fc 단편물을 포함하는 신규 폴리펩타이드가 개시된다. 상기 폴리펩타이드는 특정 케모카인에 결합하여 케모카인들의 활성을 조절할 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는 염증 및 자기면역과 같은 생체내 케모카인-의존성 과정을 조절하는 데 및 관련된 상태를 치료하는 데 사용된다.

Description

자가면역, 염증 및 암의 과정을 저해할 수 있는 신규한 케모카인 결합 폴리펩타이드류{NOVEL CHEMOKINE BINDING POLYPEPTIDES CAPABLE OF INHIBITING THE COURSE OF AUTOIMMUNITY, INFLAMMATION AND CANCER}
본 발명은 케모카인류를 결합할 수 있는 신규한 폴리펩타이드를 개시하며, 더욱 상세하게는, 그러나 배타적이지는 않게, 자가면역성, 염증 및 암과 같은 케모카인-의존 과정을 조절할 후 있는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
케모카인류는 염증성 질환 과정에 연루되어 있는 많은 생물학적 인자이다. 케모카인류는 그들의 일차 구조 및 4 개 보존된 시스테인 잔기의 존재와 연관된 헤파린-결합 단백질의 군에 속하는 것으로, 작고, ~8-14 kDa, 대부분 염기성이다.
케모카인은 시험관내에서 백혈구 소집단에 대한 선택적인 화학주성인자이고 생체내에서 염증 세포의 축적을 이끌어내는 것으로 나타나는 화학주성 사이토카인이다. 주화성외에, 케모카인은 백혈구 탈과립 [Baggiolini and Dahinden, Immunol Today 1994, 15:127-133], 부착(adhesion) 수용체의 상향 조절 [Vaddi and Newton, J Immunol 1994, 153:4721-4732], 및 인간 면역결핍 바이러스 복제의 억제 [Cocchi 등, Science 1995, 270:1811-1815]를 매개한다.
케모카인들은 면역계로부터 세포를 모집하고 활성화시키는 데 필수적인 역할을 한다. 이들은 또한 면역계를 넘어, 예를 들어, 중추 신경계의 다양한 세포 [Ma 등, PNAS 1998, 95:9448-9453], 및 혈관신생 또는 혈관형성억제(angiostatic)의 결과를 낳는 내피세포 [Strieter 등, J Biol Chem 1995, 270:27348-27357] 포함하는 많은 다른 세포 유형에서 광범위한 효과를 가지고 있다. 특정 케모카인들은 혈관신생, 성장과 전이의 촉진, 및 암에 대한 면역 반응 억제를 위시한 종양에 대한 다중의 효과를 가질 수 있는 반면, 다른 케모카인류는 종양-매개 혈관신생을 저해하고 항종양 면역 반응을 촉진한다.
케모카인 수용체는 천식, 죽상동맥경화증, 이식편 거부반응, AIDS 및 자가면역성 상태 (예, 다발성 경화증, 관절염, 중증 근무력증, 루푸스)와 같은 염증 및 관련 상태의 진행에서의 중요한 역할로 인해 관심이 점증하고 있다.
국제특허 출원번호 제PCT/IL03/00155호 (WO 03/072599로 공개) 및 미국 특허번호 제7,488,717호는 케모카인을 결합하고 그들의 생물학적 기능을 조절할 수 있는 신규한 펩타이드 및 펩티도미메틱을 개시하고 있다.
WO 2007/094005 A2 (RAPPAPORT FAMILY INSTITUTE FOR RESEARCH IN THE MEDICAL SCIENCES) (2007년 08월 23일) 전체 문서 WO 2007/052173 A2 (DOCUBE SAS) (2007년 05월 10일) 예. 40-43
발명의 요약
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, Fc 도메인 또는 이의 분체(fragment)에 부착된 적어도 하나의 케모카인-결합 펩타이드를 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드 및 약학 허용 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 케모카인의 생물학적 효과를 조절하는 의약의 제조에 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드를 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 케모카인의 생물학적 효과를 조절하는 방법으로서, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 필요한 개체에 투여하여 상기 케모카인의 생물학적 효과를 조절하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한(non-optimal) 면역반응, 비정상적 세포이동, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, a 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택된 상태를 치료하는 의약의 제조에 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드를 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 비정상적 세포이동, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택되는 상태를 치료하는 방법으로서, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드를 필요한 개체에 투여하여, 상기 케모카인의 생물학적 효과를 조절하고 및/또는 저해하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 본 발명에서 설명된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서 전술한 핵산 작제물을 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서 전술한 세포를 배양하는 것과 상기 폴리펩타이드를 분리하는 것을 포함하는 폴리펩타이드 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서 수용성 중합체에 부착된 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드를 포함하는 접합체 (conjugate)를 제공한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 폴리펩타이드는 링커를 더 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 링커는 아미노산 링커이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgD Fc 도메인, IgE Fc 도메인 및 IgM Fc 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 Fc 도메인 및 이의 분체의 N 말단에 부착되어 있다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 Fc 도메인 및 이의 분체의 C 말단에 부착되어 있다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 링커는 4 내지 10 개 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 링커는 헥사펩타이드이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 링커는 서열번호 162에 설정된 펩타이드이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드을 더 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 신호 펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 N 말단에 있다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 폴리펩타이드는 하기 식을 가진다:
W-X-Y-Z
상기 식에서:
W는 신호 펩타이드이고;
X는 케모카인-결합 펩타이드이고;
Y는 링커이고; 및
Z는 Fc 도메인 및 이의 분체이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 10 내지 20개 아미노산 길이이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 12 내지 13 개 아미노산 길이이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및 RANTES으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 케모카인에 결합하는 능력을 특징으로 한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 서열번호 1-157로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 BKT-P2 (서열번호 101) 및 BKT-P46 (서열번호 76)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 서열번호 1-157로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 전술한 서열 상동성은 적어도 95%이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 신호 펩타이드는 IL-6 신호 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 161을 가진다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 신호 펩타이드는 서열번호 161에 적어도 90% 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 도메인이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 Fc 도메인 및 이의 분체는 비-글리코실화된 것이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 Fc 도메인 및 이의 분체는 서열번호 160을 가진다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 하나의 케모카인이 케모카인 수용체에 결합하는 것을 저해하는 능력을 특징으로 한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 하나의 케모카인이 케모카인 수용체에 결합하는 것을 향상시키는 능력을 특징으로 한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 약학 조성물은 포장물에 포장되며 케모카인의 생물학적 효과를 조절하는 용도에 대하여, 포장물 내 또는 포장물 상에 확인된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 약학 조성물은 포장물에 포장되며 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택된 상태를 치료하는 용도에 대하여, 상기 포장물 내 및 포장물 상에 확인된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 약학 조성물은 정맥내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 및/또는 비강내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 의약은 정맥내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 및/또는 비강내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 투여는 정맥내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 및/또는 비강내 투여를 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 조절하는 것은 저해하는 것을 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 케모카인은 I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및 RANTES로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 생물학적 효과는 염증성 효과, 세포 이동, 종양 성장, 및 암전이로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 폴리펩타이드는 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 비정상적 세포이동, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택된 상태를 치료하는 용도이다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 168 및 서열번호 169로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열을 가진다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.
별다르게 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 본 발명이 속한 기술분야의 통상적 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 비록 본 발명에서 설명된 것과 유사 또는 동일한 방법과 재료가 본 발명의 구체예를 실행하고 시험하는 데 사용될지라도, 예시적 방법 및/또는 재료는 후술 된다. 부딪히는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 조절할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예들은 예시적으로만 사용되며 필수적으로 제한하기 위한 것이 아니다.
본 발명의 특정 구체예들은 첨부 도면을 참조하여 예시적 방식으로만 설명된다. 도면을 상세히 참조하면, 나타난 특이점들은 예시적 방식으로 및 본 발명의 바람직한 구체예의 설명적 논의를 목적으로 한 것이며 및 본 발명의 원리와 개념적 관점의 가장 유용하고 용이하게 이해되는 설명이라고 믿어지는 것을 제공하기 위해 제시된다. 이와 관련하여, 도면과 함께 제시된 설명은 본 발명의 수 가지 형태가 실제적으로 어떻게 구체화되는 것인가에 대하여 당해 분야의 숙련자에게 명확하게 한다.
도면에서:
도 1A 및 1B는 본 발명의 특정 구체예에 따른 폴리펩타이드들, 즉 서열번호 158 (BKT-P2-FC; 도 1A) 및 서열번호 159 (BKT-P46-FC; 도 1B)를 암호화하는 데 사용되며, 또한 암피실린 (Amp)과 퓨로마이신 (Puro)에 대한 내성을 부여하는 유전자를 더 암호화하는 벡터들의 벡터 지도이다;
도 2는 예시적 폴리펩타이드들 서열번호 158 (레인 1 및 2)과 서열번호 159 (레인 3-5)을 생성하기 위해 유전자 조작된 HEK 293T 세포 풀에서의 IgG Fc 및 대조군 IgG Fc의 50 ng (레인 6), 100 ng (레인 7), 200 ng (레인 8) 및 300 ng (레인 9)의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏을 도면이다;
도 3A-3C는 펩타이드 BKT-P2 (서열번호 101)에 노출 전과 후에, IP-10 (도 3A), I-TAC (도 3B), 및 MIG (도 3C)에 의해 유도된 VCAM-1로의 T세포 부착을 전단 흐름의 함수로 나타낸 그래프이다(열 불활성화된 SDF-1 사이토카인 존재하에서의 T 세포 부착은 대조군으로 도시됨);
도 4A-4C는 본 발명의 특정 구체예에 따른 폴리펩타이드인 BKT-P2-FC (서열번호 158)에 노출 전과 후에, IP-10 (도 4A), I-TAC (도 4B), 및 MIG (도 4C)에 의해서 유도된 VCAM-1로의 T세포 부착을 전단 흐름의 함수로 나타낸 그래프이다(열 불활성화된 SDF-1 사이토카인 존재하에서의 T 세포 부착은 대조군으로 도시됨(den));
도 5A 및 5B는 대조군 생쥐 및 서열번호 159(BKT-P46-FC)을 가지는 예시적 폴리펩타이드로 처리된 생쥐에서, PLP (단백지질 단백질)로 면역화하여 급성 질환을 유도한 후 시간의 함수로 EAE (실험적 자가면역성 뇌척수염)에 대한 평균 임상 점수 (도 5A) 및 EAE에 대한 평균 누적 임상 점수(도 5B)를 나타낸 그래프이다;
도 6A 및 6B는 대조군 생쥐 및 서열번호 159 (BKT-P46-FC) 또는 서열번호 158 (BKT-P2-FC)을 가지는 예시적 폴리펩타이드들로 처리된 생쥐에서, PLP (단백지질 단백질)로 면역화하여 급성 질환을 유도한 후 시간의 함수로 EAE (실험적 자가면역성 뇌척수염)에 대한 평균 임상 점수 (도 6A) 및 EAE에 대한 평균 누적 임상 점수(도 6B)를 나타낸 그래프이다;
도 7은 대조군 생쥐 및 서열번호 158 (BKT-P2-FC) 또는 서열번호 159 (BKT-P46-FC)를 가지는 예시적 폴리펩타이드로 처리된 생쥐에서, MOG 펩타이드로 면역화하여 만성 질환을 유도한 후 시간의 함수로 EAE (실험적 자가면역성 뇌척수염)에 대한 평균 임상 점수를 나타낸 그래프이다;
도 8A 및 8B는 건강한 생쥐 (음성 CTRL), 관절염 생쥐 (양성 CTRL) 및 서열번호 158 (BKT-P2-FC)을 가지는 예시적 폴리펩타이드로 처리된 관절염 생쥐의 무릎 강에서 호중구 (도 8A) 및 단핵구 (도 8B)의 수준을 나타낸 그래프이다; 및
도 9는 서열번호 159 (BKT-P46-FC) 및 서열번호 158 (BKT-P2-FC)을 가지는 예시적 폴리펩타이드에 의한 지연형 과민증의 저해를 나타내는 그래프이다 (덱사메타손(Dex.)에 의한 저해가 비교물로 도시되어 있다).
본 발명은 케모카인을 결합할 수 있는 신규의 폴리펩타이드를 개시하며, 더 상세히는 그러나 배타적이지 않게, 자가면역성, 염증 및 암과 같은 케모카인-의존성 과정을 조절할 수 있는 폴리펩타이드에 관한 것이다
본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기 전, 본 발명은 하기 설명에서 설정된 또는 실시예에서 예증된 상세에 그 적용을 필수적으로 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 구체예를 할 수 있고 또는 다양한 방식으로 실행 또는 수행될 수 있다.
상기 배경 단락에서 언급되었듯이, 케모카인류에 결합되며 이들을 생물학적 기능을 조절할 수 있는 펩타이드류 및 구조적으로 관계된 화합물들 (펩티도미메틱)이 설명되어 있다 (예, 국제특허 출원번호 PCT/IL03/00155 (WO 03/072599로 공개) 및 미국 특허 번호 7,488,717). 그러한 펩타이드들의 예는 서열번호 1-157에 설정되어 있다. 케모카인 기능을 조절하는 능력으로 인해, 그러한 펩타이드류는 다양한 치료적 적용성을 가진다. 그러나, 그러한 펩타이드들의 치료적 유익은, 예를 들어, 생체내에서 펩타이드들의 짧은 반감기에 의해 일반적으로 제한된다.
향상된 특성을 가지는 케모카인-결합 펩타이드를 생성하고자, 본 발명자들은 케모카인-결합 펩타이드를 Fc 도메인 분체에 부착하였다.
하기 실시예 단락에서 증명되듯이, 본 발명을 실행하는 중에, 케모카인-결합 펩타이드 및 Fc 도메인 분체를 포함하는 폴리펩타이드는 놀랍게도 향상된 케모카인-결합 능력을 가지는 것이 발견되었다. 상기 폴리펩타이드는 다발성 경화증, 관절염 및 지연형 과민증와 같은 면역 관련질병과 질환을 치료하는 데 생체내에서 향상된 효능은 물론 장기 순환 시간을 나타내는 것이 발견되었다.
도면과 표를 참조하면, 도 1A 및 1B는 본 발명의 특정 구체예에 따라서 BKT-P2-FC (서열번호 158) 및 BKT-P46-FC (서열번호 159)로 지칭되는 예시적 폴리펩타이드를 발현하는 데 사용되는 예시적 DNA 작제물을 나타낸다. 도 2는 웨스턴 블랏으로 검출되는바, 세포 배양액에서 전술한 예시적 폴리펩타이드의 발현을 나타낸다.
"BKT-P2-FC" 및 "BKT-P46-FC"은 본 발명의 소유자가 소유한 상표명이다. BKT-P2-FC는 폴리펩타이드로서, 가출원 번호 제61/213,493호에서 또한 "IL6 신호 펩타이드-BKT-P2-스페이서-FC", "P2-Fc", "BKT-Fc-2", "BKT-Fc-P2", "IL6-P2-Fc", "IL6-P2-Fc N297A" 및 "IL6-BioPep1-Fc N297A"로 지칭되고 있다. BKT-P46-FC는 폴리펩타이드로서, 가출원번호 제61/213,493호에서 또한 "IL6 신호 펩타이드-BKT-P46-스페이서-FC", "BKT-Fc-46", BKT-FC-46", "P46-FC", IL6-P46-Fc", "IL6-P46-Fc N297A" 및 "IL6-BioPep2-Fc N297A"로 지칭되고 있다.
표 3은 다양한 케모카인류에 전술한 예시적 폴리펩타이드류의 결합에 대한 해리상수를 나타낸다.
도 4A-4C는 특정 사이토카인의 생물할성 활성 (T 세포 점착의 유도)에 대한 예시적 폴리펩타이드 (서열번호 158)의 저해를 나타낸다. 비교하기 위해, 도 3A-3C는 상기 폴리펩타이드가 바탕을 두는 케모카인-결합 펩타이드 (서열번호 101)에 의한 동일한 활성의 저해를 나타내고 있다. 표 4는 예시적 폴리펩타이드 (서열번호 158 및 서열번호 159) 및 그것들이 바탕을 두는 케모카인-결합 펩타이드들 (각각 서열번호 101 및 서열번호 76) 다양한 케모카인들의 활성을 저해하는 능력을 요약하여 나타낸다.
도 5A, 5B, 6 및 7은 생쥐에서 EAE (실험적 자가면역성 뇌척수염)의 진행에 반하는 본 발명의 특정 구체예에 따른 예시적 폴리펩타이드들의 효능을 나타낸다. 도 8A 및 8B는 생쥐에서 관절염에 반하는 예시적 폴리펩타이드의 효능을 나타낸다. 도 9는 지연형 과민증에 반하는 예시적 폴리펩타이드의 효능을 나타낸다.
표 5는 본 발명의 구체예에 따른 폴리펩타이드에 포함될 수 있는 케모카인-결합 펩타이드들을 나타낸다.
따라서, 본 발명세서 제시된 실험 결과는 본 발명의 구체예에 따른 폴리펩타이드가 케모카인들과 결합할 수 있고 (참고, 예를 들어 표 3), 상응하는 케모카인-결합 펩타이드들 보다 훨씬 더 강력한 케모카인 활성의 조절자이고 (참조, 예를 들어 표 4 및 도 3A, 3B, 4A and 4B), 및 다양한 상태를 치료하는 데 치료적으로 효과적이라는 것(참고, 예를 들어 도 5A-9)을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 항체 (e.g., IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 항체)의 Fc 도메인 또는 Fc 도메인의 분체에 부착된 적어도 하나의 케모카인-결합 펩타이드를 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다. Fc 도메인 및 이의 분체에 부착된 펩타이드를 포함하는 분자를 본 명세서에서 "펩티바디"로 지칭된다.
특정 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 단일 케모카인-결합 펩타이드를 포함한다.
대안적으로, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 케모카인-결합 펩타이드를 포함한다 (예, 2, 3, 4 또는 5 개 케모카인-결합 펩타이드들). 상기 케모카인-결합 펩타이드들은 서로 동일할 수 또는 서로 다를 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "케모카인-결합 펩타이드"는 용액에서 적어도 하나의 케모카인과 결합할 수 있는 능력을 특징으로 하는 임의의 펩타이드(예, 20 개까지의 아미노산 잔기의 펩타이드)를 지칭한다. 예시적 케모카인들은 CCL1 (여기서 CCL은 케모카인 (C-C 모티프) 리간드에 대한 약자), MCP-1 (또한 당해 분야에서 CCL2로 지칭), MIP-1 (MIP-1α 및/또는 MIP-1β을 포함), RANTES (또한 당해 분야에서 CCL5 로 지칭), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, 이오탁신 (또한 당해분야에서 CCL11로 지칭), CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1 (여기서 CXCL는 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드에 대한 약자), CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 인터루킨-8 (또한 당해 분야에서 CXCL8), MIG (또한 당해분야에서 CXCL9 로 지칭), IP-10 (또한 당해 분야에서 CXCL10로 지칭), I-TAC (또한 당해 분야에서 CXCL11 로 지칭), SDF-1 (또한 당해 분야에서 CXCL12로 지칭), BCA-1 (또한 당해 분야에서 CXCL13로 지칭), CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2 및 CX3CL1을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따라서, 상기 펩타이드들은 I-TAC (인터페론-유도성 T-세포 알파 화학주성인자), IP-10 (10 kDa 인터페론-γ-유도 단백질), MIG (감마-인터페론에 의해 유도된 모노카인), MCP-1 (단핵구 화학주성 단백질 -1), 이오탁신 및 RANTES (Regulated upon activation, normal T-cell expressed, and secreted)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 케모카인에 결합한다.
케모카인에 결합하는 것은 당해 분야의 임의의 적절한 기술 (예, ELISA)에 따라 결정될 수 있다. 조건적으로, 상기 결합은 상기 펩타이드가 케모카인에 결합하는 것에 대한 해리상수 (Kd)가 10-4 M 미만, 조건적으로 10-5 M 미만 및 조건적으로 10-6 M 미만인 그러한 것이다. 해리상스를 결정하는 적절한 기술은 숙련자에게 공지되어 있다.
본 발명의 구체예에 따라 사용될 수 있는 케모카인-결합 펩타이드는, 예를 들어, 국제특허 출원번호 PCT/IL03/00155 (WO 03/072599로 공개) 및 미국 특허 번호 7,488,717호에 설명되어 있다.
특정 구체예에서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 길이가 5 내지 50개 아미노산, 조건적으로 5 내지 40 개 아미노산, 조건적으로 5 내지 30 개 아미노산, 조건적으로 7 내지20 개 아미노산, 조건적으로 9 내지 20 개 아미노산, 및 조건적으로 10 내지 20 개 아미노산이다. 예시적 구체예에 따라서, 상기 케모카인 결합 펩타이드는 약 12 개 아미노산 길이이다.
조건적으로, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 서열번호 1 내지 157으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 적어도 2개 히스티딘 잔기의 존재 및 전체적으로 양하전 (즉, 양하전된 아미노산들의 수가 음하전된 아미노산보다 많다)을 특징으로 하고, 여기서 상기 펩타이드는 H, S, A, L, I, K, R, T 및 P로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산들로 일차적으로 구성된다 (즉, 상기 아미노산들로 구성되는 펩타이드의 적어도 40 %, 및 조건적으로 적어도 50 %).
전술한 특성을 가지는 펩타이드들의 예는 SIFAHQTPTHKN (서열번호 100), SIPSHSIHSAKA (서열번호 101), SAISDHRAHRSH (서열번호 96), SAGHIHEAHRPL (서열번호 95), ACHASLKHRC (서열번호 44), AHSLKSITNHGL (서열번호 46), ESDLTHALHWLG (서열번호 54), HSACHASLKHRC (서열번호 69), WSAHIVPYSHKP (서열번호 143), YATQHNWRLKHE (서열번호 145), CAHLSPHKC (서열번호 1), GVHKHFYSRWLG (서열번호 61), HPTTPIHMPNF (서열번호 66), SVQTRPLFHSHF (서열번호 113), and VHTSLLQKHPLP (서열번호 133)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. SIPSHSIHSAKA (서열번호 101)는 "BKT-P2"로 지칭되는 예시적 케모카인-결합 펩타이드이다.
특정 구체예에서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 적어도 두 개의 인접 히스티딘 잔기의 존재 및 전체적으로 양하전 (즉, 양하전된 아미노산들의 수가 음하전된 아미노산보다 많다)을 특징으로 하고, 여기서 상기 펩타이드는 H, P, T, L, R, W 및 F로 구성되는 군으로부터 선택되 아미노산들로 일차적으로 구성된다 (즉, 상기 아미노산들로 구성되는 펩타이드의 적어도 40 %, 및 조건적으로 적어도 50 %).
전술한 특징을 가지는 펩타이드들의 예는 GDFNSGHHTTTR (서열번호 59), HHFHLPKLRPPV (서열번호 64), HHTWDTRIWQAF (서열번호 65), LDYPIPQTVLHH (서열번호 76), LLADTTHHRPWP (서열번호 79), TRLVPSRYYHHP (서열번호 125), CHHNLSWEC (서열번호 7) and SFWHHHSPRSPL (서열번호 99)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. LDYPIPQTVLHH (서열번호 76)는 "BKT-P46"로 지칭되는 예시적 케모카인-결합 펩타이드이다.
조건적으로 상기 케모카인 결합 펩타이드는 서열번호 1 내지 157로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70 %, 적어도 80%, 적어도 90 % 서열 상동성을 보이는 아미노산 서열을 가진다 (예, 서열번호 76 및 101). 조건적으로, 상기 서열 상동성은 적어도 95 %이다. 조건적으로 상기 서열 상동성은 100 %이다.
상동성은 기본(default) 매개변수를 가지고 미국 국립 생물기술 정보 센터 (NCBI)의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 상동성은 아미노산 치환물 및 이의 생물학적 활성 폴리펩타이드 단편물을 위시한 삭제, 삽입 또는 치환 변이체를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Fc 도메인"은 중쇄의 적어도 2 개 불변 도메인 (즉, CH2 및 CH3 도메인, 이러한 용어들이 당해 분야에서 정의되는 바와 같이)를 포함하는 항체의 중쇄의 부위를 지칭한다. 상기 Fc 도메인은, 예를 들어, 파파인으로 항체를 절단함으로써 이량체의 형태로 있을 수 있다. 디설팡이트 결합으로 연결된, Fc 도메인 폴리펩타이드들의 이량체는 항체의 "꼬리" 부위를 결정한다. 당해 분야에 공지되어 있듯이, 특정 분류의 항체의 Fc 도메인들은 다량체 형태로 있을 수 있다. 따라서, Fc 도메인은 조건적으로 단량체성이고, 조건적으로 이량체성 및 조건적으로 다량체성이다. 조건적으로, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드는, Fc 이량체를 포함하면서, 이량체의 형태로 있고, 또는 Fc 다량체를 포함하면서 다량체의 형태로 있는다.
상기 Fc 도메인은 천연 Fc 도메인 (즉, 항체에서 자연적으로 발생하는 도메인)의 개질 형태, 예를 들어, 천연 Fc 도메인에 적어도 90 % 상동성, 조건적으로 적어도 95 % 상동성, 및 조건적으로 적어도 98 % 상동성을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 개질된 Fc 도메인들은 예를 들어, 국제특허 출원번호 WO 97/34631 및 WO 96/32478에 설명되어 있다.
조건적으로, 천연 Fc는 본 발명의 구체예에 필요없는 구조적 특성이나 생물학적 활성을 제공하는 부위를 제거하기 위해 개질될 수 있다. 그러한 부위의 예는 이황화 결합 형성, 선택된 숙주 세포와의 비양립성, 선택된 숙주 세포에서의 발현시 N-말단 이질성, 글리코실화, 보체와의 상호작용, Fc 수용체(선천적 Fc 수용체외의)와의 결합, 및/또는 항체-의존성 세포독성 (ADCC) 에 영향을 주거나 그에 연루된 잔기를 포함한다.
본 발명의 구체예에 따른 폴리펩타이드는 또한 Fc 도메인의 단편물을 포함할 수 있다. 조건적으로, 상기 단편물은, 상기 정의한 바와 같이, Fc 도메인의 적어도 20 %, 조건적으로 적어도 50 %, 및 조건적으로 적어도 80 %를 포함한다.
상기 Fc 도메인 및 이의 분체는 조건적으로 선천적 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합 부위를 포함한다.
하기 실시예 단락에서 예시되는 바와 같이, 본 발명의 구체예에 따른 폴리펩타이드는 혈액 순환계에서 상대적으로 긴 존속기간을 보여, 폴리펩타이드의 상당한 수준이 투여 후 혈액에서 적어도 11일간 존재한다.
일 구체예에 따라서, Fc 도메인 또는 이의 분체를 상기 케모카인-결합 펩타이드에 부착하면, 케모카인-결합 펩타이드 자체보다는 생체내에서 더 긴 존속기간을 가지는 폴리펩타이드를 결과한다. 이것은 Fc 도메인의 긴 혈액 존속기간에 기인하고 (이것은 FcRn에 결합하는 것을 통하여 Fc에 의한 도움) 및/또는 케모카인-결합 펩타이드에 비하여 상기 폴리펩타이드의 더 큰 크기에 기인하는 것으로 후자는 사구체 여과에 의한 혈액으로부터의 제거를 감소시킨다. 다른 구체예에 따라서, 상기 결과된 폴리펩타이드들은 케모카인-결합 펩타이드 자체에 비해 감소된 면역원성을 가진다.
다른 조건적 구체예에 따라서, 상기 Fc 도메인 및 이의 분체는 인간 Fc 도메인 (예, 인간 항체로부터 유도된) 또는 이의 분체이다.
예시적 구체예에 따라서, 상기 Fc 도메인 (또는 이의 분체)는 IgG (예, IgG1) Fc 도메인 (또는 이의 분체)이다. 조건적으로, 상기 Fc 도메인 또는 분체는 글리코실화되지 않는다.
예시적 구체예에 따라서, 상기 Fc 분체는 서열번호 160를 가지며, 이는 N297A 변이를 가진 인간 IgG1 Fc 분체에 해당한다.
조건적으로, 상기 Fc 도메인 (또는 이의 분체)의 N 말단은 (직접적으로 또는 링커를 통해) 케모카인-결합 펩타이드에 부착된다. 상기 N-말단은 예를 들어, 하나 이상의 케모카인-결합 펩타이드를 포함하는 서열에 부착됨으로써, 조건적으로 하나 이상의 케모카인-결합 펩타이드에 부착된다.
대안적으로 또는 추가적으로, 상기 Fc 도메인 (또는 이의 분체)의 C-말단은 직접적으로 또는 링커 (예, 아미노산 링커)를 통해 케모카인-결합 펩타이드에 부착된다. 상기 C-말단은 조건적으로 하나 이상의 케모카인-결합 펩타이드에 부착된다.
본 명세서에서 설명된 케모카인-결합 펩타이드 및 Fc 도메인 또는 분체에 더하여, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드는 하나 이상의 추가의 펩타이드 서열을 더 포함할 수 있다. 그러한 서열은, 바람직한 생물학적 활성 또는 구조적 특성, 예를 들어, 상기 폴리펩타이드의 치료적 효능을 향상시키는 또는 상기 폴리펩타이드의 생성을 용이하게 하는 활성이나 특성을 제공하기 위해 조건적으로 선택될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 이송을 지시할 수 있도록 선택된 적어도 하나의 신호 펩타이드를 조건적으로 포함한다.
조건적으로, 상기 신호 펩타이드는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포 (예, 포유동물 세포)로부터 상기 폴리펩타이드의 선택하는 것을 촉진할 수 있도록 선택된다.
조건적으로, 액포 신호 서열 (식물 감염에 의해 생성된 폴리펩타이드용)이 포함된다. 예시적 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 IL-6 신호 펩타이드에 적어도 90 % 상동성 (조건적으로 적어도 95 % 상동성)을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 IL-6 (인터루킨-6) 신호 펩타이드 (예, 서열번호 161) 또는 신호 펩타이드를 포함한다.
전술한 추가의 펩타이드 서열 (예, 신호 펩타이드)는 상기 폴리펩타이드의 N-말단, 상기 폴리펩타이드의 C-말단, 또는 상기 폴리펩타이드의 중간에 (예, Fc 도메인 또는 분체 및 케모카인-결합 펩타이드 사이에, 또는 두 개 케모카인-결합 펩타이드들 사이에) 존재할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 설명된 상기 Fc 도메인 또는 분체, 상기 케모카인-결합 펩타이드(들) 및 임의의 추가의 펩타이드(들) (존재한다면) 상기 폴리펩타이드 내에서 서로 임의의 순서로 부탁될 수 있다.
상기 Fc 도메인 또는 분체, 상기 케모카인-결합 펩타이드(들) 및 임의의 추가의 펩타이드(들) (존재한다면) 직접적으로 또는 링커 (예, 아미노산 링커)를 통해 서로 독립적으로 부착된다.
그러나, 특정 신호 펩타이드들의 활성은 폴리펩타이드 내의 특별한 위치(예, N-말단, C-말단)에 달려있다. 따라서, 특정 구체예에 따라서, 신호 펩타이드는 상기 폴리펩타이드 내의 특별 부위에 위치한다.
예시적 구체예에 따라서, 상기 신호 펩타이드 (예, IL-6 신호 펩타이드)는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 있다. N-말단에서 신호 펩타이드를 가지는 폴리펩타이드의 예는 하기 식의 폴리펩타이드들을 포함한다:
W-X-Z, W-X-Y-Z, W-Y-X-Z, W-Y-X-Y-Z, W-Z-X, W-Z-Y-X, W-Y-Z-X 및 W-Y-Z-Y-X,
상기 식에서 W는 신호 펩타이드이고, X는 케모카인-결합 펩타이드이고, Y는 링커 (예, 아미노산 링커)이고 및 Z는 Fc 도메인 또는 분체이다. 예시적 구체예에 따라서, 상기 폴리펩타이드는 전술한 식 W-X-Y-Z을 가진다.
상기 링커 (또한 "스페이서"로 지칭)는 조건적으로 아미노산, 디펩타이드, 트리펩타이드, 또는 4 개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커이다. 그러한 링커들은 융합 단백질로서 용이하게 생성될 수 있는 단일 연속 폴리펩타이드를 포함하게 한다는 점에서 유리하다. 상기 링커는 링커가 케모카인 결합 펩타이드가 그의 타겟 케모카인과의 결합을 방해하지 않게 선택된다. 조건적으로, 상기 링커는 4 내지 10 개 아미노산들로 구성된 펩타이드 (예, 헥사펩타이드)이다. 예시적 구체예에 따라서, 상기 링커는 서열번호 162에 설정된 펩타이드이다. 하나 이상의 링커를 포함하는 구체예에서, 상기 링커는 서로 동일 또는 상이할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 하나의 케모카인에 결합할 수 있다 (예, 폴리펩타이드 내의 케모카인-결합 펩타이드과 상기 케모카인과의 상호작용을 통해). 폴리펩타이드를 케모카인에 결합하는 것은 많은 경우에서 케모카인 수용체에 결합하는 케모카인 (예, I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및/또는 RANTES)의 능력에 영향을 끼칠 것이다.
따라서, 특정 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 하나의 케모카인이 케모카인 수용체에 결합하는 것을 저해하는 능력을 특징으로 한다. 조건적으로, 결합의 저해는
폴리펩타이드의 존재하에서 (상기 수용체에 대한 케모카인의 결합에 대한) 해리상수가 상기 폴리펩타이드의 부재시의 해리상수보다 적어도 10 %, 및 조건적으로 적어도 100 % 더 높은 것인 상태이다.
특정 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 하나의 케모카인이 케모카인 수용체에 결합하는 것을 향상시키는 능력을 특징으로 한다. 조건적으로, 상기 결합의 향상은 폴리펩타이드의 존재하에서 (상기 수용체에 대한 케모카인의 결합에 대한) 해리상수가 상기 폴리펩타이드의 부재시의 해리상수보다 적어도 10 %, 및 조건적으로 적어도 50 % 더 낮은 상태이다.
본 발명의 구체예에 따른 폴리펩타이드는 조건적으로 적어도 하나의 케모카인이 케모카인 수용체에 결합하는 것을 저해하며 또한 적어도 하나의 다른 케모카인이 케모카인 수용체에 결합하는 것을 향상시킬 수 있는 것이 이해되어야 한다.
용어 "폴리펩타이드"는, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 일반적인 폴리펩타이드 (예, 분해 산물, 합성된 폴리펩타이드 또는 재조합 폴리펩타이드) 및 펩티도미메틱 (합성된)은 물론, 상기 폴리펩타이드가 인체내에서 세포로 더욱 침투될 수 있게 하면서 더욱 안정하게 하는 변형을 가질 수 있는, 폴리펩타이드 유사체인, 펩티도이드 및 세미펩티도이드를 포함한다. 그러한 변형은, N' 말단 변형, C' 말단 변형, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH or CF=CH를 포함하나 이에 한정되지 않는 폴리펩타이드 결합 변형, 백본 변형 및 잔기 변형을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 펩티도미메틱 화합물을 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)에 적시되어 있다.
상기 폴리펩타이드 내의 폴리펩타이드 결합 (-CO-NH-)은, 예를 들어, N-메틸화 결합 (-N(CH3)-CO-), 에스테르 결합 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), 케토메틸렌 결합 (-CO-CH2-), R이 임의의 알킬, 예를 들어 메틸인 α-아자 결합 (-NH-N(R)-CO-), 카르바 결합 (-CH2-NH-), 하이드록시에틸렌 결합 (-CH(OH)-CH2-), 티오아미드 결합 (-CS-NH-), 올레핀성 이중 결합 (-CH=CH-), 리트로 아미드 결합 (-NH-CO-), R이 탄소원자에 천연적으로 제시된 "정상" 측쇄인 폴리펩타이드 유도체 (-N(R)-CH2-CO-)에 의해 대체될 수 있다.
이러한 변형은 상기 폴리펩타이드 사슬을 따라서 임의의 결합 위치에서 심지어 동일한 시간에 수 번 (2-3) 일어날 수 있다.
천연 방향족 아미노산, Trp, Tyr 및 Phe은 페닐글리신, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실 산 (TIC), 나프틸알라닌 (Nal), ring-메틸화 derivatives of Phe의 고리-메틸화 유도테, Phe의 할로겐화 유도체 또는 o-메틸-Tyr과 같이 합성, 비천연 산을 대신할 수 있다.
본 발명에서 설명된 천연 발생 펩타이드 및 폴리펩타이드의 아미노산 서열 (예, Fc 도메인 서열, 신호 펩타이드)은 천연 발생 단백질 내의 폴리펩타이드의 아미노산 서열이거나 보존적 또는 비보존적 치환체를 포함하는 것들 일 수 있다.
용어 "보존적 치환"은 본 발명에서 사용된 바와 같이 펩타이드 내의 천연 서열에 존재하는 아미노산을 동일한 입체 특성을 가지는 천연 또는 비천연 발생 아미노산 또는 펩티도미메틱에 의해 대체된 것을 지칭한다. 대체될 천연 아미노산의 측쇄가 극송 또는 소수성인 경우, 보존적 치환은 또한 극성이나 소수성인 (치환된 아미노산의 측쇄로서 동일한 입체적 특성을 가지는 것에 더하여) 천연 발생 아미노산, 비천연 발생 아미노산 또는 펩티도미메틱 내에서 이루어져야 한다.
천연 발생 아미노산들이 그들의 특성에 따라 분류됨에 따라, 천연 발생 아미노산에 의한 보존적 치환은 본 발명에 따라서, 하전된 아미노산을 입체적으로 유사한 비하전 아미노산으로 치환한 것은 보존적 치환으로 간주한다는 것을 염두에 두면서 용이하게 결정될 수 있다.
비천연 발생 아미노산에 의한 보존적 치환을 생성하기 위해, 당해 분야에 공지된 아미노산 유사체 (합성 아미노산)을 사용하는 것이 또한 가능하다. 천연 발생 아미노산의 펩티도미메틱은 숙련자들에게 공지된 문헌에 잘 기록되어 있다.
보존적 치환을 실행할 때, 치환 아미노산은 원래의 아미노산과 측쇄에서 동일한 또는 유사한 관능기를 가져야 한다.
용어 "비-보존적 치환"은 본 명세서에서 사용한 바와 같이, 모 서열에서 존재하는 아미노산을, 상이한 전기화학적 및 입체적 특성을 가지는 다른 천연 또는 비천연 발생 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 따라서, 치환하는 아미노산의 측쇄는 치환되는 원래 아미노산의 측쇄보다 유의하게 더 클(작을) 수 있고 및/또는 치환되는 아미노산과 유의하게 상이한 특성을 가지는 관능기를 가질 수 있다. 이러한 유형의 비-보존적 치환의 예는, 페닐알라닌 또는 사이클로헥실메틸 글리신을 알라닌에 대하여, 이소루이신을 글리신에 대하여, 또는 -NH-CH[(-CH2)5COOH]-CO-을 아스파트 산에 대해 치환하는 것을 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 그러한 비-보존적 치환은 원 펩타이드 (예, Fc 도메인 서열, 신호 펩타이드)의 활성을 가지는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 구성하는 것들일 수 있다.
본 명세서 및 하기 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산" 또는 "아미노산들"은 20개의 천연 발생 아미노산들; 예를 들어, 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌을 위시한, 생체내에서 번역 후 개질된 그러한 아미노산들; 및 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 이소데스모신, 노르-발린, 노르-루이신 및 오르니틴을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 비통상적인 아미노산들을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 용어 "아미노산"은 D- 및 L-아미노산 둘 다를 포함한다.
하기 표 1과 2는 본 발명에서 사용될 수 있는 천연 발생 아미노산들 (표 I) 및 비-일반적 또는 개질된 아미노산들(표 II)을 기재하고 있다.
아미노산 3문자 약자 1문자 상징
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파라긴 Asn N
아스파트 산 Asp D
시스테인 Cys C
글루타민 Gln Q
글루탐산 Glu E
글리신 Gly G
히스티딘 His H
이소루이신 Iie I
루이신 Leu L
라이신 Lys K
메티오닌 Met M
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
트립토판 Trp W
타이로신 Tyr Y
발린 Val V
상기한 바 임의의 아미노산 Xaa X
비-일반적 아미노산 코드 비-일반적 아미노산 Code
α- 아미노부티르 산 Abu L-N- 메틸알라닌 Nmala
α-아미노-α- 메틸부티레이트 Mgabu L-N- 메틸아르기닌 Nmarg
아미노사이클로프로판 - Cpro L-N- 메틸아스파라긴 Nmasn
카르복실레이트 L-N- 메틸아스파트 산 Nmasp
아미노이소부티르 산 Aib L-N- 메틸시스테인 Nmcys
아미노노르보닐 - Norb L-N- 메틸글루타민 Nmgin
카르복실레이트 L-N- 메틸글루탐산 Nmglu
사이클로헥실알라닌 Chexa L-N- 메틸히스티딘 Nmhis
사이틀로펜틸알라닌 Cpen L-N- 메틸이소루이신 Nmile
D-알라닌 Dal L-N- 메틸루이신 Nmleu
D-아르기닌 Darg L-N- 메틸라이신 Nmlys
D- 아스파트 산 Dasp L-N- 메틸메티오닌 Nmmet
D-시스테인 Dcys L-N- 메틸노르루이신 Nmnle
D-글루타민 Dgln L-N- 메틸노르발린 Nmnva
D-글루탐산 Dglu L-N- 메틸오르니틴 Nmorn
D-히스티딘 Dhis L-N- 메틸페닐알라닌 Nmphe
D- 이소루이신 Dile L-N- 메틸프롤린 Nmpro
D-루이신 Dleu L-N- 메틸세린 Nmser
D-라이신 Dlys L-N- 메틸트레오닌 Nmthr
D-메티오닌 Dmet L-N- 메틸트립토판 Nmtrp
D-오르니틴 Dorn L-N- 메틸타이로신 Nmtyr
D-페닐알라닌 Dphe L-N- 메틸발린 Nmval
D-프롤린 Dpro L-N- 메틸에틸글리신 Nmetg
D-세린 Dser L-N- 메틸 -t- 부틸글리신 Nmtbug
D-트레오닌 Dthr L- 노르루이신 Nle
D-트립토판 Dtrp L- 노르발린 Nva
D- 타이로신 Dtyr α- 메틸 - 아미노이소부티레이트 Maib
D-발린 Dval α- 메틸 -g- 아미노부티레이트 Mgabu
D-α- 메틸알라닌 Dmala α- 메틸사이클로헥실알라닌 Mchexa
D-α- 메틸아르기닌 Dmarg α- 메틸사이틀로펜틸알라닌 Mcpen
D-α- 메틸아스파라긴 Dmasn α- 메틸 -α- 나프틸알라닌 Manap
D-α- 메틸아스파테이트 Dmasp α- 메틸페니실아민 Mpen
D-α- 메틸시스테인 Dmcys N-(4- 아미노부틸 )글리신 Nglu
D-α- 메틸글루타민 Dmgln N-(2- 아미노에틸 )글리신 Naeg
D-α- 메틸히스티딘 Dmhis N-(3-아미노프로필)글리신 Norn
D-α- 메틸이소루이신 Dmile N-아미노-α- 메틸부티레이트 Nmaabu
D-α- 메틸루이신 Dmleu α- 나프틸알라닌 Anap
D-α- 메틸라이신 Dmlys N- 벤질글리신 Nphe
D-α- 메틸메티오닌 Dmmet N-(2- 카르바밀에틸 )글리신 Ngln
D-α- 메틸오르니틴 Dmorn N-( 카르바밀메틸 )글리신 Nasn
D-α- 메틸페닐알라닌 Dmphe N-(2- 카르복시에틸 )글리신 Nglu
D-α- 메틸프롤린 Dmpro N-( 카르복시메틸 )글리신 Nasp
D-α- 메틸세린 Dmser N- 사이클로부틸글리신 Ncbut
D-α- 메틸트레오닌 Dmthr N- 사이클로헵틸글리신 Nchep
D-α- 메틸트립토판 Dmtrp N- 사이클로헥실글리신 Nchex
D-α- 메틸타이로신 Dmty N- 사이클로데실글리신 Ncdec
D-α- 메틸발린 Dmval N- 사이클로도데실글리신 Ncdod
D-α- 메틸알라닌 Dnmala N- 사이클로옥틸글리신 Ncoct
D-α- 메틸아르기닌 Dnmarg N- 사이클로프로필글리신 Ncpro
D-α- 메틸아스파라긴 Dnmasn N- 사이클로운데실글리신 Ncund
D-α- 메틸아스파테이트 Dnmasp N-(2,2- 디페닐에틸 )글리신 Nbhm
D-α- 메틸시스테인 Dnmcys N-(3,3- 디페닐프로필 )글리신 Nbhe
D-N- 메틸루이신 Dnmleu N-(3- 인돌릴에틸 ) 글리신 Nhtrp
D-N- 메틸라이신 Dnmlys N- 메틸 -g- 아미노부티레이트 Nmgabu
N- 메틸사이클로헥실알라닌 Nmchexa D-N- 메틸메티오닌 Dnmmet
D-N- 메틸오르니틴 Dnmorn N- 메틸사이틀로펜틸알라닌 Nmcpen
N- 메틸글리신 Nala D-N- 메틸페닐알라닌 Dnmphe
N- 메틸아미노이소부티레이트 Nmaib D-N- 메틸프롤린 Dnmpro
N-(1- 메틸프로필 )글리신 Nile D-N- 메틸세린 Dnmser
N-(2- 메틸프로필 )글리신 Nile D-N- 메틸세린 Dnmser
N-(2- 메틸프로필 )글리신 Nleu D-N- 메틸트레오닌 Dnmthr
D-N- 메틸트립토판 Dnmtrp N-(1- 메틸에틸 )글리신 Nva
D-N- 메틸타이로신 Dnmtyr N- 메틸 - γ- 나프틸알라닌 Nmanap
D-N- 메틸발린 Dnmval N- 메틸페니실아민 Nmpen
g- 아미노부티르 산 Gabu N-(p-하이드록시페닐)글리신 Nhtyr
L-t-부틸글리신 Tbug N-(티오메틸)글리신 Ncys
L-에틸글리신 Etg 페니실아민 Pen
L-호모페닐알라닌 Hphe L-α-메틸알라닌 Mala
L-α-메틸아르기닌 Marg L-α-메틸아스파라긴 Masn
L-α-메틸아스파테이트 Masp L-α-메틸-t-부틸글리신 Mtbug
L-α-메틸시스테인 Mcys L-메틸에틸글리신 Metg
L-α-메틸글루타민 Mgln L-α-메틸글루타메이트 Mglu
L-α-메틸히스티딘 Mhis L-α-메틸호모 페닐알라닌 Mhphe
L-α-메틸이소루이신 Mile N-(2-메틸티오에틸)글리신 Nmet
D-N-메틸글루타민 Dnmgln N-(3-구아니디노프로필)글리신 Narg
D-N-메틸글루타메이트 Dnmglu N-(1-하이드록시에틸)글리신 Nthr
D-N-메틸히스티딘 Dnmhis N-(하이드록시에틸)글리신 Nser
D-N-메틸이소루이신 Dnmile N-(이미다졸릴에틸)글리신 Nhis
D-N-메틸루이신 Dnmleu N-(3-인돌릴에틸)글리신 Nhtrp
D-N-메틸라이신 Dnmlys N-메틸-g-아미노부티레이트 Nmgabu
N-메틸사이클로헥실알라닌 Nmchexa D-N-메틸메티오닌 Dnmmet
D-N-메틸오르니틴 Dnmorn N-메틸사이틀로펜틸알라닌 Nmcpen
N-메틸글리신 Nala D-N-메틸페닐알라닌 Dnmphe
N-메틸아미노이소부티레이트 Nmaib D-N-메틸프롤린 Dnmpro
N-(1-메틸프로필)글리신 Nile D-N-메틸세린 Dnmser
N-(2-메틸프로필)글리신 Nleu D-N-메틸트레오닌 Dnmthr
D-N-메틸트립토판 Dnmtrp N-(1-메틸에틸)글리신 Nval
D-N-메틸타이로신 Dnmtyr N-메틸a-나프틸알라닌 Nmanap
D-N-메틸발린 Dnmval N-메틸페니실아민 Nmpen
γ-아미노부티르 산 Gabu N-(p-하이드록시페닐)글리신 Nhtyr
L-t-부틸글리신 Tbug N-(티오메틸)글리신 Ncys
L-에틸글리신 Etg 페니실아민 Pen
L-호모페닐알라닌 Hphe L-α-메틸알라닌 Mala
L-α-메틸아르기닌 Marg L-α-메틸아스파라긴 Masn
L-α-메틸아스파테이트 Masp L-α-메틸-t-부틸글리신 Mtbug
L-α-메틸시스테인 Mcys L-메틸에틸글리신 Metg
L-α-메틸글루타민 Mgln L-α-메틸글루타메이트 Mglu
L-α-메틸히스티딘 Mhis L-α-메틸호모페닐알라닌 Mhphe
L-α-메틸이소루이신 Mile N-(2-메틸티오에틸)글리신 Nmet
L-α-메틸루이신 Mleu L-α-메틸라이신 Mlys
L-α-메틸메티오닌 Mmet L-α-메틸노르루이신 Mnle
L-α-메틸노르발린 Mnva L-α-메틸오르니틴 Morn
L-α-메틸페닐알라닌 Mphe L-α-메틸프롤린 Mpro
L-α-메틸세린 mser L-α-메틸트레오닌 Mthr
L-α-에틸발린 Mtrp L-α-메틸타이로신 Mtyr
L-α-메틸루이신 Mval Nnbhm L-N-메틸호모페닐알라닌 Nmhphe
N-(N-(2,2-디페닐에틸) N-(N-(3,3-di페닐프로필)
카르바밀메틸-글리신 Nnbhm 카르바밀메틸(1)글리신 Nnbhe
1-카르복시-1-(2,2-디페닐 에틸아미노)사이클로프로판 Nmbc
표 2 계속.
재조합 기술들은 상대적으로 긴 폴리펩타이드들 (예, 20 개 아미노산보다 더 긴) 및 이의 다량을 생산하는 데 더 적합하기 때문에 본 발명의 폴리펩타이드를 생성하는 데 바람직하게 사용된다. 그러한 재조합 기술은 Bitter 등, (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier 등 (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson 등 (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu 등 (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi 등 (1984) EMBO J. 3:1671-1680, Brogli 등, (1984) Science 224:838-843, Gurley 등 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 and Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463에 기술되어 있다.
재조합 기술을 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 생성하기 위해, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 핵산 발현 벡터에 결찰하여, 상기 벡터는 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩타이드들의 구성적, 조직 특이적 또는 유도성 전사를 이끌어내는 데 적합한 시스-조절 서열 (예, 프로모터 서열)의 전사적 조절하에서 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하게 되었다.
케모카인-결합 펩타이드을 발현하는 데 사용될 수 있는 분리된 폴리뉴클레오타이드의 예는 서열번호 163 및 164에 설정되어 있다. Fc 단편물을 발현시키는 데 사용될 수 있는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열의 예는 서열번호 165에 설정되어 있다. IL-6 신호 펩타이드를 발현시키는 데 사용될 수 있는 분리된 폴리뉴클레오타이드의 예는 서열번호 166에 설정된다. 링커를 발현시키는 데 사용될 수 있는 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 167에 설정되어 있다.
본 발명의 특정 구체예에 따른 폴리펩타이드를 발현하는 데 사용될 수 있는 예시적 폴리뉴클레오타이드 서열들은 서열번호 168 및 169에 설정되어 있다.
용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 RNA 서열, 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열 (cDNA), 게놈성 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 복합 폴리뉴클레오타이드 서열 (예, 상기의 조합)의 형태로 분리되고 제공된 단일 또는 이중 본쇄 핵산 서열을 지칭한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 폴리뉴클레오타이드 서열"은 역전사 효소 또는 임의의 다른 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 사용하여 메신저 RNA의 역전사의 결과로 유래된 서열을 지칭한다. 그러한 서열은 후속적으로 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 사용하여 생체내 또는 시험관내 증폭할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "게놈성 폴리뉴클레오타이드 서열"은 염색체로부터 유래(분리)된 서열을 지칭하며 따라서 염색체의 연속적 부분을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "복합 폴리뉴클레오타이드 서열"은 적어도 부분적으로 상보적이고 및 적어도 부분적으로 게놈성인 서열을 지칭한다. 복합 서열은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 데 필요한 엑손성 서열들은 물론, 그들 사이에 개재된 인트론성 서열들을 포함할 수 있다. 상기 인트론성 서열들은, 다른 유전자들을 위시한 임의의 출처에서 유래 될 수 있고, 일반적으로 보존된 스플라이싱 신호 서열을 포함한다. 그러한 인트론성 서열들은 시스-작용 발현 조절 요소를 포함할 수 있다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 구체예의 폴리뉴클레오타이드들은 폴리펩타이드의 분비를 위한 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열을(상기 논의된 바와 같은) 더 포함할 수 있다.
발현 및 분비 후, 상기 신호 펩타이드들은 상기 전구체 단백질로부터 조건적으로 제거되어 성숙 폴리펩타이드를 생성하게 된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드들은 예를 들어, 하기 실시예 1 에서 설명되는 바와 같은 PCR 기술 또는 상이한 두 개 DNA 서열들을 결찰하는 데 당해 분야에 공지된 임의의 다른 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 참고, 예를 들어, "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel 등, John Wiley & Sons, 1992.
전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 일반적으로 발현 벡터로 삽입하여 (즉, 핵산 작제물) 재조합 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 구체예의 발현 벡터는 이러한 벡터가 원핵세포, 진핵세포 또는 바람직하게는 둘 다 (예, 셔틀 벡터)에서 복제와 통합에 적절하도록 하게 만드는 추가의 서열을 포함한다. 일반적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 개시 서열 (예, 프로모터, 인핸서)와 전사 및 번역 종결자 (예, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다.
진핵세포성 프로모터들은 두 가지 유형의 인식 서열, TATA 박스 및 상위 프로모터 요소를 포함한다. TATA 박스는 전사 개시 부위의 25-30 염기쌍 상류에 위치하며, RNA 폴리머라제가 RNA 합성을 개시하게 지시하는 데 연루된다고 생각되어지고 있다. 다른 상류 프로모터 요소들은 전사가 개시되는 속도를 결정한다.
인핸서 요소는 연계된 동종 또는 이종 프로모터로부터 전사를 1,000-배까지 자극시킬 수 있다. 인핸서들은 전사 개시 부위에서 하류 또는 상류에 위치할 때 활성적이다. 바이러스로부터 유래된 많은 인핸서 요소들은 광범위한 숙주 범위를 가지며 다양한 조직에서 활성적이다. 예를 들어, SV40 초기 유전자 인핸서는 많은 세포 유형에 적절하다. 본 발명에 적절한 다른 인핸서/프로모터 조합들은 폴리오마 바이러스, 인간 또는 쥐 거대세포 바이러스 (CMV), 쥐 백혈병 바이러스로부터 유도된 것들, 쥐 또는 라우스 육종 바이러스 및 HIV와 같은 다양한 리트로바이러스로부터 유도된 장기 반복체를 포함한다. 참조, Ehnancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1983, 이 문헌은 본 명세서에서 참조문헌으로 기입된다.
발현 벡터의 제작에서, 상기 프로모터는 바람직하게는 그것의 자연적 설정에 의해 전사 개시 부위에서와 같이, 이종 전사 개시 부위에서 동일한 거리만큼 떨여져서 위치한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 그러나, 이러한 거리에서 특정 변화가 프로모터 기능의 손실 없이 허용될 수 있다.
이미 설명된 요소에 더하여, 본 발명의 발현 벡터는 클론된 핵산들의 발현 수준을 높이는 것으로 또는 재조합 DNA를 가지는 세포의 확인을 용이하게 하는 것으로 의도된 다른 특별한 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 많은 동물 바이러스들은 허용된 세포 유형에서 바이러스 게놈의 염색체외(extrachromosomal) 복제를 촉진하는 DNA 서열을 함유한다. 이러한 바이러스 리플리콘을 가지는 플라즈미드들은 적절한 인자들이 플라즈미드 상에 있거나 숙주 세포의 게놈상에 있는 유전자에 의해 제공된다면 에피좀적으로 복제될 수 있다.
상기 벡터는 진핵세포성 리플리콘을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수 있다. 진핵세포성 리플리콘이 존재한다면, 상기 벡터는 적절한 선택성 마커를 사용하여 진핵세포성 세포에서 증폭될 수 있다. 벡터가 진핵세포성 리플리콘을 포함하지 않으면, 어떠한 에포좀적 증폭도 가능하지 않다. 대신에, 재조합 DNA가 조작된 세포의 게놈으로 병합되고, 여기서 상기 프로모터가 원하는 핵산의 발현을 관장하게 된다.
본 발명의 발현 벡터는, 예를 들어, 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)와 같은 단일 mRNA로부터 수 개의 단백질의 번역을 허용하는 추가의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 프로모터-키메릭 폴리펩타이드의 게놈성 병합용 서열을 더 포함할 수 있다.
포유동물 발현 벡터의 예는 Invitrogen 제조의 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, Promega 제조의 pCI, Strategene 제조의 pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV, Clontech 제조의 pIRES, 및 다른 유도체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
리트로바이러스와 같은 진핵성 바이러스 유래의 조절 요소를 가지는 발현 벡터들을 또한 사용할 수 있다. SV40 벡터들은 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 소 파필로마 바이러스에서 유래한 벡터들은 pBV-1MTHA를 포함하고, 엡스타인 바 바이러스들로부터 유래된 바이러스는 pHEBO, 및 p2O5을 포함한다. 다른 예시적 벡터들은 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE, 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 생쥐 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서 발현에 효과적임이 나타난 다른 프로모터의 관장하에서 단백질의 발현을 허용하는 다른 벡트를 포함한다.
바이러스들은 많은 경우에서, 숙주 방어 기작을 피하도록 진화된 매우 특별화된 감염 요원들이다. 일반적으로, 바이러스들은 특정 세포 유형에서 감염하고 증식된다. 바이러스성 벡터의 타겟화 특이성은 그의 자연적인 특이성을 이용하여 소정의 세포유형을 특이적으로 목표하고 그럼으로써 재조합 유전자를 감염된 세포로 유입시킨다. 따라서, 본 발명에 의해 사용된 벡터의 유형은 형질전환된 세포의 유형에 좌우된다.
재조합 바이러스 벡터들은 그것들이 측면 감염(lateral infection)과 같은 장점을 제공하기 때문, 본 발명의 구체예의 폴리펩타이드를 발현하는 데 유용할 수 있다. 측면 감염은 예를 들어, 리트로바이러스의 생체 주기에서 원래 있는 것으로 단일 감염된 세포가 많은 후생 비리온들을 생겨나게 하고 이웃 세포를 감염시키는 과정이다. 이러한 결과는 큰 면적이 빠르게 감염되어 지는데, 이의 대부분은 원래 바이러스 입자에 의해 처음에 감염된 것이 아니다. 이것은, 감염성 요원이 후생 자손을 통해서만 확산되는 수직형 감염과는 대조되는 것이다. 수평적으로 확산될 수 없는 바이러스성 벡터는 또한 사용될 수 있다. 이러한 특징은 원하는 목적이 특정화된 유전자를 한정된 수의 목표 된 세포에만 도입하고자 할 때 유용할 수 있다.
다양한 원핵 또는 진핵 세포들을 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 숙주-발현 시스템으로서 사용할 수 있다. 이러한 것들은 폴리펩타이드 암호화 서열을 내포하고 있는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라즈미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균 (예를 들어, E. coli 균주 BL21 (DE3) plysS, BL21;(DE3)RP and BL21*를 포함하지만 이에 한정되지 않는 E. coli 및 B. 서브틸리스)과 같은 미생물; 폴리펩타이드 암호화 서열을 내포하는 재조합 효모 발현벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 의해 감염된 또는 폴리펩타이드 암호화 서열을 내포하는, Ti 플라즈미드와 같은 재조합 플라즈미드 발현 벡터로 형질전환된, 식물 세포 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다양한 방법을 사용하여 본 발명의 발현 벡터를 숙주 발현 시스템의 세포에 도입할 수 있다. 그러한 방법들은 일반적으로 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang 등, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega 등, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) and Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에 기술되어 있고, 예를 들어, 재조합 바이러스성 벡터로 안정한 또는 일시적인 감염, 리포펙션, 전기천공, 및 감염하는 것을 포함한다. 또한, 양성-음성 선택 방법에 대해서는 미국 특허 번호 5,464,764 및 5,487,992를 참조할 수 있다.
바이러스성 감염에 의한 핵산의 도입은 리포펙션 및 전기천공과 같은 다른 방법보다 몇 가지 장점을 지니는 데, 바이러스의 감염 본성으로 인해 더 높은 형질감염 효율을 얻을 수 있기 때문이다.
본 발명의 폴리펩타이드의 핵산 서열은 특정 숙주 세포에서 발현하기에 최적화될 수 있다. 그러한 서열 변형의 예는, 관심의 특정 종에서 일반적으로 발견된 것에 더 밀접하게 필적하는 변경된 G/C 함유량, 및 코돈 최적화로 통상 지칭되는, 특정 종에서 일반적이지 않게 발견되는 코돈의 제거를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "코돈 최적화"는 관심의 특정 종 내에서 코돈 사용 빈도에 필적하는, 구조 유전자 또는 이의 분체 내에서의 사용을 위해 적절한 DNA 뉴클레오타이드를 선택하는 것을 지칭한다. 그러므로, 최적화된 유전자 또는 핵산 서열은, 선택된 종 내에서 통계적으로 바람직한, 또는 통계적으로 선호되는 코돈을 이용하기 위해 천연 또는 천연발생 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 변형된 유전자를 지칭한다. 상기 뉴클레오타이드 서열을 DNA 수준에서 조사하고 종에서 발현에 최적화된 코딩 부위를 임의의 적절한 방법, 예를 들어, Sardana 등 (1996, Plant Cell Reports 15:677-681)에서 설명된 방법을 사용하여 결정한다. 이러한 방법에서, 코돈 사용의 표준 편차, 즉 코돈 사용빈도 편향의 측정치는, 선택된 종에서 고도로 발현된 유전자들의 사용 빈도에 상대하여 천연 유전자의 각 코돈의 사용빈도에서의 제곱 비례 편차 (squared proportional deviation)을 먼저 발견한 후 평균 제곱 편차를 계산함으로써 계산될 수 있다. 사용되는 식은 다음과 같다: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, 상기 식에서 Xn은 고도로 발현된 유전자에서 코돈의 사용 빈도 n을 뜻하며, Yn은 관심의 유전자에서의 코돈의 사용 빈도 n을 뜻하며 N은 관심이 유전자에서 코돈들의 총수를 뜻한다.
특정 세포 유형에 대한 바람직한 코돈 사용빈도에 따른 핵산 서열을 최적화하는 한 가지 방법은 임의의 여분의 통계 계산 없이 일본의 NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences)를 통해 온라인으로 Codon Usage Database에서 제공되는 것과 같은, 코돈 최적화 표 (www.kazusa.or.jp/codon/)를 직접 사용하는 것에 기초한다. Codon Usage Database는 많은 상이한 종에 대한 코돈 사용 빈도 표를 함유하며, 각 코돈 사용빈도 표는 Genbank에 있는 데이터에 기초하여 통계적으로 결정되었다.
상기 표들을 사용하여 특정 종에서 각 아미노산에 대한 가장 선호되거나 가장 바람직한 코돈을 결정함으로서, 관심의 단백질을 암호화하는 천연 발생 뉴클레오타이드 서열을 특정 종에 대하여 코돈 최적화할 수 있다. 이것은 특정 종에서 낮은 통계적 발생을 나타내는 코돈들을, 어떤 아미노산에 대해서, 통계적으로 더욱 선호되는 상응하는 코돈으로 치환함으로써 실행된다. 그러나, 기존의 제한 부위를 삭제하기 위해, 잠재적으로 유용한 접합부에서 새로운 것들을 창출하기 위해 (올바른 전체 길이 서열을 생성하기 위해 세그멘트들을 절단하고 스플라이스 하는 데 사용될 수 있는 내부 부위들인 신호 펩타이드 또는 종결 카세트를 첨가하기 위한 5' 및 3' 말단), 또는 mRNA 안정성 또는 발현을 부정적 효과를 주는 뉴클레오타이드 서열을 제거하기 위해 하나 이상의 덜 선소되는 코돈을 선택할 수 있다.
천연 발생 종결 뉴클레오타이드 서열은, 임의의 변경 전에, 특정 종에서, 특정 종에서 통계적으로 선호된 코돈에 상응하는 많은 코돈들을 이미 가질 수 있다. 그러므로, 천연 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화는, 천연 뉴클레오타이드 서열내에서 어떤 코돈들이 특정 종세 대하여 통계적으로 선호되지 않는 것인가를 결정하고, 상기 특정 종의 코돈 사용빈도 표에 따라서 그러한 코돈들을 변경하여 코돈 최적화된 유도체를 생성하는 것을 포함한다. 변경된 뉴클레오타이드 서열은, 변형된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질이 상응하는 천연 발생 또는 천연 유전자에 의해 암호화된 단백질보다 더 높은 수준에서 생성된다면, 특정 종에서의 코돈 사용빈도에 완전히 또는 부분적으로 최적화될 수 있다. 코돈 사용빈도를 변경함으로써 합성 유전자들을 제조하는 것은 예를 들어 PCT 특허 출원 93/07278에 설명되어 있다.
따라서, 본 발명은 전술한 핵산 서열들; 이의 단편물, 이와 하이브리드화 될 수 있는 서열들, 이와 동종상동적인 서열들, 이와 이종상동적인 서열들, 상이한 코돈 사용빈도를 가지는 유사한 폴리펩타이드를 암호화하는 서열들, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 천연발생 또는 인공유도로, 무작위적으로 또는 목표된 방식으로, 삭제, 삽입 또는 치환하는 변경에 의해 특징되는 변형된 서열을 포함한다. 숙주 세포 시스템에 관계없이, 삽입된 암호화 서열 (폴리펩타이드를 암호화하는)의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 것 외에, 본 발명의 발현 작제물은 또한 발현된 폴리펩타이드의 안정성, 생산량, 정제, 수율 또는 활성을 최적화하기 위해 조작된 서열을 또한 포함할 수 있다.
형질전환된 세포들은 많은 양의 재조합 폴리펩타이드를 발현하게 하는 효과적인 조건하에서 배양될 수 있다. 효과적인 배양 조건은, 효과적인 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 단백질 생산을 허용하는 산소조건을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 효과적인 배지는 세포가 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 생성하는 임의의 배지를 지칭한다. 그러한 배지는 일반적으로 동화될 수 있는 탄소, 질소 및 인산 원들과, 적절한 염, 미네랄, 금속 및 비타민과 같은 다른 영양소를 가지는 수용성 용액을 포함한다. 본 발명의 세포들은 통상적인 발효 생체 반응기, 진탕 플라스크, 시험관, 마이크로적정 접시 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 배양은 재조합 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함유도에서 수행될 수 있다. 그러한 배양 조건은 당해 분야의 통상의 기술자의 기술 내에 있다.
생산에 사용된 벡터와 숙주 시스템에 의존하여, 본 발명의 결과된 폴리펩타이드는 재조합 세포 내에 잔류되거나, 발효 배지로 분비되거나, E. coli의 주변세포질 공간과 같은 두 개 세포 막 사이의 공간으로 분비되거나; 또는 세포나 바이러스 막의 외부 표면상에 남겨져 있을 수 있다.
배양에서 소정의 시간 후에, 상기 재조합 폴리펩타이드를 회수한다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 폴리펩타이드를 회수하는 것"은 상기 폴리펩타이드를 함유하는 전체 발효액을 수집하는 것을 지칭하는 것으로 분리나 정제의 추가 단계를 적용할 필요는 없다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드들은 친화력 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 정제, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나발린 A 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 차등 용해법을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체예의 폴리펩타이드들은 친화력 크로마토그래피에 의해 편리하게 정제될 수 있다. 친화 리간드로서의 단백질 A의 적절성은 그 키메라에 사용된 면역글로불린 Fc 도메인의 종과 아형에 달려있다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기반한 키메라 분자를 정제할 수 있다 [Lindmark 등, J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 생쥐 아형류와 인간 γ3에 바람직하게 사용된다 [Guss 등, EMBO J., 5:1567-1575 (1986)]. 친화성 리간드가 부착된 고형 지지체는 대부분 아가로즈이나, 다른 고형 지지체 또한 이용가능하다. 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 적절한 고체 지지체는 아가로즈로 얻을 수 있는 것보다 더 빠른 유동율과 더 짧은 가공 시간을 확보하게 한다. 키메릭 분자를 단백질 A 또는 G 친화성 컬럼에 결합하기 위한 조건은 Fc 도메인의 특성; 즉, 그의 종이나 아형에 전적으로 지배된다. 일반적으로, 적절한 리간드가 선택되면, 효율적인 결합은 조건화되지 않는 배양액으로부터 직접적으로 발생한다. 본 발명의 이러한 관점의 결합된 폴리펩타이드들은 산성 pH (3.0 또는 이상)에서 또는 약한 향무질서 (chaotropic) 염을 함유하는 중성 pH 완충액에서 효과적으로 용출될 수 있다. 이러한 친화성 크로마토그래피 단계는 >95% 순도인 폴리펩타이드 제조물을 결과할 수 있다.
친화성 크로마토그래피 대신 또는 이에 더하여 당해 분야에 공지된 다른 방법들을 사용하여 본 발명의 구체예의 폴리펩타이드를 정제할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드들은 친티오성 겔 크로마토그래피에서 [Hutchens 등, Anal. Biochem., 159:217-226 (1986)] 및 부동화된 금속 킬레이트 크로마토그래피 [Al-Mashikhi 등, J. Dairy Sci., 71:1756-1763 (1988)] 항체와 유사하게 거동할 수 있다고 예상된다.
쉽게 회수하기 위해, 발현된 암호화 서열은 본 발명의 폴리펩타이드 및 융합된 절단가능 분체, 즉 히스티딘을 암호화하도록 조작될 수 있다. 그러한 융합 단백질은 상기 폴리펩타이드가 친화성 크로마토그래피에 의해서; 예, 절단가능한 분체에 특이적인 컬럼상에 부동화시킴으로써 용이하여 분리될 수 있게 고안될 수 있다.
절단 부위가 상기 폴리펩타이드 및 상기 절단 분체 사이에 설정되는 경우, 상기 폴리펩타이드는 이러한 부위에서 상기 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 적절한 효소사 제제로 처리함으로써 상기 크로마토그래피 컬럼으로부터 방출될 수 있다 [예 참조 Booth 등, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); 및 Gardella 등, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 "실질적으로 순수한" 형태로 회수된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 순수한"은 본 발명에서 설명된 적용에 상기 폴리펩타이드를 효과적으로 사용할 수 있게 하는 순도를 지칭한다.
숙주세포에서 합성될 수 있는 것에 더하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 시험과내 발현시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 방법들은 당해 분야에 공지되어 있고 그러한 시스템의 성분들은 상업적으로 판매되고 있다.
상기 폴리펩타이드는 그대로 사용되거나 더 변경될 수 있다.
예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 수용성 중합체 (예, 폴리에틸렌 글리콜)을 상기 폴리펩타이드에 부착시킴으로서 변경될 수 있다. 수용성 중합체의 그러한 부착은, 예를 들어, 상기 폴리펩타이드의 용해도를 증가시킴으로써, 상기 폴리펩타이드의 독성을 감소시킴으로써, 상기 폴리펩타이드의 순환계 반감기를 증가시킴으로써 (예, 신장 여과를 감소시킴으로써), 및/또는 상기 폴리펩타이드를 단백질 분해로부터 보호시킴으로써, 상기 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 개선시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 조건적 구체예에 따라서, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드는 수용성 중합체에 부착된다. 폴리에틸렌 글리콜은 적절한 수용성 중합체이다. 약학 투여로 의도된 폴리펩타이드에 부착하기 적절한 (예, 비독성) 추가의 수용성 중합체는 당해 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.
상기 수용성 중합체는 상기 폴리펩타이드의 임의의 부분에 부착될 수 있다 (직접 또는 링커를 통해). 조건적으로, 상기 수용성 중합체는 케모카인-결합 활성을 방해하지 않도록 케모카인-결합 펩타이드와 다른 폴리펩타이드의 일부분에 부착된다.
본 발명과 하기 실시예에서 설명된 바와 같이, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드는 수많은 유리한 치료적 용도를 가질 수 있는 케모카인의 활성을 조절하는 데 유용하다. 따라서, 케모카인 활성을 조절하고 및/또는 다양한 의학적 상태를 치료하는 신규 및 유용한 방법이 제공된다.
따라서, 본 발명의 구체예의 일 관점에서, 치료적 유효량 of 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드 (예, 설명된 개질된 또는 미개질된 폴리펩타이드)의 치료적 유효량을 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 케모카인의 생물학적 효과 (예, I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및/또는 RANTES)를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "방법"은 화학, 약학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 기술자에게 공지된 그러한 방식, 수단, 기술과 절차 또는 그러한 기술자에 의해 상기 공지된 방식, 수단, 기술과 절차로부터 용이하게 개발될 수 있는 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
하기 실시예에서 증명되는 바와 같이, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드들은 다양한 의학적 용도를 치료하는 것일 수 있다. 그러한 상태를 치료하는 것은 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드 (예, 설명된 개질 또는 미개질 폴리펩타이드)를 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법에 의해 실행된다. 본 발명의 구체예에 따라 치료될 수 있는 상태의 예는, 제한 없이, 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 비정상적 세포이동, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈를 포함한다.
조건적으로, 투여는 정맥내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 및/또는 비강내 투여르 포함한다.
본 발명에서 설명된 폴리펩타이드의 Fc 도메인 또는 분체는 케모카인-결합 펩타이드 자체의 반감기에 비해, 순환계에서 상기 폴리펩타이드의 더 긴 반감기를 결과할 수 있다고 이해된다. 더 긴 반감기로 인해, 상기 폴리펩타이드의 치료적 유효 수준은 더 낮은 빈도 투여로 생체내에서 유지될 수 있다.
따라서, 특정 구체예에 따라서, 투여는 일주일에 한 번만, 조건적으로 한달에 두 번만, 조건적으로 한달에 한 번만, 조건적으로 두 달에 한 번만, 조건적으로 세 달에 한 번만, 및 조건적으로 6 개월에 한 번만 수행된다.
대안적 구체예에서, 원하는 치료적 효과를 얻기 위해 한 번만 투여해도 충분하다.
유사하게, 본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 케모카인 (예, I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및/또는 RANTES) 의 생물학적 효과를 조절하는 (예, 전술한 바와 같은 저해 및/또는 향상) 의약의 제조에 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드 (예, 본 발명에서 설명된 개질 또는 미개질 폴리펩타이드)를 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 비정상적 세포이동, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택된 상태를 치료하는 의약의 제조에 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드 (예, 본 발명에서 설명된 개질 또는 미개질 폴리펩타이드)의 용도를 제공한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는 것"은 상태의 진행을 폐하거나, 실질적으로 저해하거나, 늦추거나 역행하는 것, 상태의 임상적 또는 미용적 증상을 실질적으로 개선시키는 것, 또는 상태의 임상적 또는 미용적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 포함한다.
치료될 개체는 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. 바람직하게는 상기 개체는 포유동물이다. 특정 구체예에서, 상기 개체는 인간이다.
폴리펩타이드를 이용한 치료는, 전술한 바와 같이, 단독으로 특정 질병을 치료하는 데 유효한 것으로 알려진 다른 제제와 같이 제동될 수 있다. 본 발명에서 설명된 의약 및 약학 조성물은 조건적으로 하나 이상의 그러한 제제를 더 포함할 수 있다.
조건적으로, 본 발명에서 설명된 의약은 정맥내, 경구, 피하, 국소 투여 및/또는 비강내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 구체예에 따라 조절될 수 있는 케모카인의 생물학적 효과의 예는 염증성 효과, 세포 이동, 종양 성장 및 암전이를 포함하나 한정되지 않는다.
설명된 본 발명의 임의의 관점에서, 생물학적 효과를 조절하는 것은 생물학적 효과를 저해하거나 향상시키는 것을 포함할 수 있다. 예시적 구체예에서, 조절하는 것은 저해하는 것을 포함한다. 조건적으로, 적어도 하나의 케모카인 생물학적 효과는 저해되고, 다른 케모카인의 생물학적 효과는 향상된다.
설명된 방법과 용도 중 임의의 것에서, 상기 폴리펩타이드가 그 자체로서 또는 바람직하게는 약학 허용 담체를 더 포함하는 약학 조성물의 일부분으로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 구체예의 일 관점에 따라서, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드 및 약학 허용 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
특정 구체예에서, 상기 조성물은 포장물에 포장되며, 및 본 발명에서 설명된 바와 같이, 케모카인(예, I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및/또는 RANTES)의 생물학적 효과를 조절하는 데 사용하는 용도가 상기 포장물 내 또는 포장물 상에 인쇄로 확인된다.
특정 구체예에서, 상기 조성물은 포장물에 포장되며, 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 비정상적 세포이동, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택된 상태의 치료에 사용하는 용도가 상기 포장물 내 또는 포장물 상에 인쇄로 확인된다.
본 발명에서 설명된 폴리펩타이드는 투여될 수 있거나, 그렇지 않으면 본 발명의 다양한 관점에서 그대로 또는 이의 약학적 허용염으로서 이용될 수 있다.
용어 "약학적 허용염"은 투여된 화합물의 생물학적 활성과 특성을 없애지 않고, 상기 모 화합물의 용해도 특성을 개질하고 및/또는 모 화합물에 의한 유기체에 대한 임의의 유의한 자극을 감소시키기 위해서 사용되는 모 화합물의 하전된 종과 그의 카운터 이온을 지칭한다.
적절한 투여 경로는, 예를 들어, 흡입, 경구, 부칼, 직장, 경점막, 경피, 내피, 경비강, 내장 및 /또는 비경구 경로; 근육내, 피하 및/또는 수내 주사 경로; 척추강내, 직접적인 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내 및 안내 주사 경로; 및/또는 개체의 조직 부위로의 직접적인 주사 경로를 포함한다. 조건적 구체예에서, 정맥내 경로, 경구 경로, 피하 경로, 국소 경로 및/또는 비강내 경로가 사용된다.
피부 질병과 질환의 경우 (예, 건선, 피부 알레르기, 피부 과민증), 예를 들어, 국소 투여용으로 제형화된 크림, 로션, 젤 또는 분말을 사용하여 국소투여가 조건적으로 사용된다.
본 발명에서 사용된 방법, 조성물 및 용도는 상기 폴리펩타이드를 치료적 유효량으로 이용할 수 있다. 치료적 유효량의 결정은 당해 분야의 숙련자의 능력 내에 있다.
본 발명의 방법과 용도에 사용되는 임의의 제조물에 대해, 상기 치료적 유효량 또는 투여량은 시험관내 시험에서 먼저 추정될 수 있다. 예를 들어, 제형을 동물 모델에서 만들고, 그러한 제형을 사용하여 인간에 있어서 유용한 더 정확한 투여량을 결정할 수 있다.
본 발명에서 설명된 활성 성분의 독성과 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 시험관내 표준 약학 과정으로 결정될 수 있다. 이러한 시험관내 및 세포 배양 시험과 동물 연구에서 얻은 데이터를 사용하여 인간에게 사용하는 투약 범위를 공식화할 수 있다. 투약량은 사용된 투약 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투약량은 환자의 상태를 고려한 개별 의사에 의해 선택될 수 있다. [참조, 예, Fingl, 등, (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1].
본 발명에서 설명된 바와 같이, 투약은 단일 투여 또는 다중 투여일 수 있다.
하나 이상의 폴리펩타이드를 함유하는 약학 조성물들은, 본 발명에서 설명된 바와 같이, 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 드래지 제조, 현탁분리(levigating), 에멀전화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조의 수간에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 구체예에 따른 용도에 사용하는 약학 조성물들은, 활성성분들이
약학적으로 사용될 수 있는 제조물로 가공되는 것을 용이하게 하는, 부형제와 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적 허용 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다.
주사의 경우, 활성 성분은 수용핵에서, 바람직하게는 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리적 염 완축액과 같은 생리적 적용 완충액에서 제형화될 수 있다.
경구 투여용으로는, 상기 화합물은 상기 활성 화합물을 약학 허용 담체와 혼합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 그러한 담체들은 본 발명의 화합물이 정제, 알약, 드래지, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등의 경구 복용용으로 제형화할 수 있게 한다. 경구용 약학 제조물은 고형 부형제를 사용하여, 조건적으로 결과된 혼합물을 마쇄하고, 필요 시 적절한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여 정제나 드래지 핵심물을 얻을 수 있다. 적절한 부형제는, 특히, 락토즈, 수크로즈, 만니톨 또는 소르비톨을 위시한 당류와 같은 충전제; 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸스, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈, 소듐 카르복시메틸셀룰로즈와 같은 셀룰로즈 제조물; 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 생리적 허용 중합체이다. 필요시, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산이나 소듐 알지네이트와 같은 염과 같은 붕해제를 첨가할 수 있다.
드래지 핵심물을 적절한 코팅이 제공된다. 이를 위해, 조건적으로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 젤, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화 티탄, 락커 용액 및 적절한 유기 용매나 용매 혼합물을 포함할 수 있는 농축된 당 용액을 사용할 수 있다. 활성 화합물 투여물의 확인용 또는 상이한 조합물들을 특성화하기 위해 염료물질 또는 색소를 첨가할 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 약학 조성물은 젤라틴으로 만들어진 압입-맞춤 캡슐은 물론 젤라틴과, 글리세롤이나 소르비톨과 같은 가소제로 만든 연질, 봉입 캡슐을 포함한다. 압입-맞춤 캡슐은 락토즈와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 탈크나 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 조건적으로 안정화제를 포함한다. 연질 캡슐에서, 상기 활성 성분들은 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수 있다. 경구 투여용의 모든 제형은 선택된 투여경로에 적절한 투약물로 있을 수 있다.
부칼 투여의 경우, 상기 조성물은 통상적인 방법으로 제형된 정제나 로젠지의 형태로 있을 수 있다.
비강 흡입용으로는, 본 발명의 용도에 따른 활성 성분들은 적절한 추진제, 예, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용하면서, 압축된 팩이나 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 통상적으로 전달된다. 압축된 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 분배기에 사용되는, 예를 들어, 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 화합물과 락토즈나 전분과 같은 적절한 분말의 분말 혼합물을 함유하는 제형으로될 수 있다.
본 발명에서 설명된 제조물들은 비경구 투여용, 예들 들어, 볼러스 주사나 연속 주입에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 안위 투약 형태, 예들 들어, 앰플이나, 조건적으로, 첨가된 방부제를 가지는 다중용량 용기에 제공될 수 있다. 상기 조성물은 오일성 또는 수성 담체의 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있고 현탁, 안정화 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제를 포함할 수 있다.
비경구 투여용 약학 조성물은 수용성 형태의 활성 성분의 수용액을 포함한다. 또한, 상기 활성 성분의 현탁액은 적절한 오일 또는 물 기반 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 용매나 담체들은 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레이트과 같은 합성 산 에스테르류, 트리글리세라이드 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은, 소듐 카르복시메틸 셀룰로즈, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이, 현탁액의 점도를 높이는 물질을 포함할 수 있다. 조건적으로, 상기 현탁액은 활성 성분의 용해도를 높여 고농축 용액을 제조할 수 있게 하는 적절한 안정화제나 제제를 또한 포함할 수 있다.
대안적으로, 상기 활성 성분은 사용전에 적절한 담체, 예들 들어, 멸균, 무발열성 수 기반 용액과 구성되기 위한 분말 형태로 있을 수 있다.
본 발명의 구체예에 따른 제조물은 코코아 버터나 다른 글레세라이드와 같은 통상적인 좌약 기제를 사용하여 좌약이나 정체 관장약과 같은 직장 조성물로 제형될 수 있다.
투여될 조성물의 양은, 물론, 치료될 개체, 질환의 정도, 투여 방식, 주치의의 판단 등에 달려있다.
본 발명의 조성물은, 필요 시, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투약 형태를 포함하는, FDA 승인 키트와 같은 팩이나 분배 장치로 제공될 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 블리스터 팩과 같은 유리, 플라스틱 호일을 포함한다. 상기 팩이나 분배장치는 투여 지침서가 동반될 수 있다. 상기 팩이나 분배기는 또한 약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태로 있는 용기와 결부된 주의문이 동반될 수 있고 상기 주의문은 인간 또는 가축 투여용도의 조성물을 당국이 승인한 것을 나타내게 된다. 그러한 주의문은, 예를 들어, 처방 약물에 대한 미국 식품의약청에 의해 승인된 라벨 또는 승인된 생산품 간지일 수 있다.
본 발명에서 설명된 폴리펩타이드는 케모카인과 결합할 수 있고, 따라서 적어도 특정 케모카인류의 구조에 상보적인 구조를 가진다. 케모카인 수용체들이 또한 케모카인류에 상보적인 구조를 가짐에 따라, 본 발명에서 설명된 적어도 특정 폴리펩타이드들의 구조가 케모카인 수용체의 구조체와 상당이 닮은 꼴을 가지는 것이 예상된다. 상기 폴리펩타이드는 따라서 특정 적용에서는 예를 들어, 케모카인 수용체에 결합할 수 있는 항체를 생성할 때, 케모카인 수용체에 대한 치환물로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 관점에서, 케모카인 수용체의 적어도 일부분을 인지할 수 있는 항체가 제공된다. 상기 항체는 조건적으로 항체 생성에 표준적인 기술을 사용하여 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드에 대한 항체를 생성함으로써 생성될 수 있다.
자가 항체를 생성하기 위한, 본 발명에서 설명된 폴리펩타이드를 포함하는 백신이 또한 제공된다. 상기 백신은 상기 폴리펩타이드에 대하여 개체에서 항체를 생성하기 위해 고안된 것으로, 상기 항체는 상기 개체에서 적어도 하나의 케모카인 수용체의 적어도 일부분을 인지하고 결합하게 된다. 상기 백신은 조건적으로 어주반트, 담체등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 선택될 수 있는 적절한 백신 담체를 포함한다.
면역원성 또는 백신 조성물을 제조하는 일반적인 방법은 Remington's Pharmaceutical Science; Mack Publishing Company Easton, Pa. (최신판)에 설명되어 있다. 면역원성을 높이기 위해, 본 발명의 폴리펩타이드들은 라텍스나 금 비드와 같은 비드, ISCOM 등에 흡수되거나 연결될 수 있다. 면역원성 조성물은 면역원 또는 백신 조성물에 첨가되어 면역원성 분체의 면역-자극 특성을 향상시킬 수 있는 물질인 어주반트를 포함할 수 있다. 리포좀 또한 어주반트로 고려된다 (Gregoriades, G. 등, Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, New York, 1989). 폴리펩타이드성 면역원의 효율에 더할 수 있는 어주반트나 제제의 예는 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 알루미늄 포타슘 설페이트 (alum), 황산 베릴륨, 실리카, 카올린, 탄소, 유중수 에멀젼, 및 수중유 에멀젼을 포함한다. 어주반트의 바람직한 유형은 무라밀 디펩타이드 (MDP) 및 다양한 MDP 유도체와 제형, 예를 들어, N-아세틸-D-글루코사미닐-(β-1-4)-N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (GMDP) (Hornung, R L 등 Ther Immunol 1995 2:7-14) 또는 ISAF-1 (5 % 스쿠알렌, 2.5 % 플루로닉 L121, 0.2 % 트윈 80을 함유한 인산 완충액으로 0.4 mg의 트레오닐-무라밀 디펩타이드가 첨가된; 참고 Kwak, L W 등 (1992) N. Engl. J. Med., 327:1209-1238)이다. 다른 유용한 어주반트들은, 콜레라 독소, 세균성 내독소, 용액 X, 프로피오노박테리움 액크네스 (Propionobacterium acnes) 또는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)의 전체 유기체나 소세포 단편물, 폴리리보뉴클레오타이드, 소듐 알긴산, 라놀린, 리소레시틴, 비타민 A, 사포닌 및 QS21 (White, A. C. 등 (1991) Adv. Exp. Med. Biol., 303:207-210)과 같은 사포닌 유도체로 현재 임상에 사용되는 것 (Helling, F 등 (1995) Cancer Res., 55:2783-2788; Davis, T A 등 (1997) Blood, 90: 509), 레바미솔, DEAE-덱스트란, 블록화된 공중합체나 다른 삽성 어주반트이거나 이에 기반한 것들이다. 많은 어주반트들이 여러 출처로부터 상업적으로 이용가능하며, 예를 들어, Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) 또는 프로인트의 불완전 어주반트와 완전 어주반트 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), 암피젠 (수중유), 알하이드로젤 (수산화 알루미늄), 또는 암피젠과 알하이드로젤의 혼합물이다. 알루미늄은 인간 사용에 승인되었다.
본 명세서에서 사용된 바, "약"은 ± 10 %를 뜻한다.
용어 "포함한다", "포함하는", "내포하다", "내포하는", "가지고 있는"및 이들의 연관어들은 "포함하지만 그에 한정되지 않는"을 의미한다.
용어 "구성되는"은 "포함하지만 그에 한정되지 않는"을 의미한다.
용어 "예시적"은 "예, 보기 또는 설명으로서 작용하는"의 뜻이다. "예시적"으로서 설명된 임의의 구체예는 다른 구체예보다 바람직하거나 유리한 것으로 및/또는 다른 구체예의 특징을 포함하는 것을 배제하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
용어 "조건적으로"는 "특정 구체예에서 제공되며 다른 구체예에서는 제공되지 않는"것을 의미한다. 본 발명의 임의의 특정 구체예는 그러한 특징들이 반복되지 않는 한 복수의 "조건적" 특징을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된바, "하나" 및 "상기"는 맥락이 명백하게 다르게 지적하지 않는 하 복수의 참조물을 포함한다. 예를 들어, 용어 "하나의 화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 복수의 화합물 및 이의 혼합물을 포함한다.
본 출원서를 통틀어, 본 발명의 다양한 구체예가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식내의 설명은 단순히 편의와 간편성을 위한 것임을 이해해야 하며 본 발명의 범위 상에서 불변의 한계로서 해석되어서는 안 된다. 따라서, 범위의 제시는 특별히 개시된 모든 가능한 부차 범위는 물론 그 범위 내의 개별적 수치를 가지는 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 내용은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 특별히 개시된 부차범위는 물론 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 가지는 것으로 고려되어야 한다. 이것은 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
수치 범위가 제시될 때마다, 이는 제시된 범위 내에서 인용된 임의의 수치를 포함하는 것을 의미한다. 용어 제1 지정 수와 제 2 지정 수"간의 범위로 있는/범위인" 및 제1 지정 수 "내지" 제2 지정수 "범위로 있는/범위인"은 상호교환적으로 사용되며 제1 및 제2 지정 숫자를 포함하고 그 사이의 모든 수치를 포함하는 것을 뜻한다.
명확성을 위해 개별 구체예의 맥락으로 설명된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 구체예에서 조합적으로 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 역으로, 단순성을 위해 단일 구체예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적절한 부차조합물로 또는 본 발명의 임의의 다른 설명된 구체예에서 적절한 것으로서 제공될 수 있다. 다양한 구체예의 맥락에서 설명된 특정 특징은, 상기 구체예가 그러한 요소 없이 실행되지 않지 않는 한 그러한 구체예의 본질적 특징으로서 고려되지 않는다.
전술한 바과 같이 및 하기 청구범위 단락에서 청구되는 바와 같은 본 발명의 다양한 구체예 및 관점에 대하여 하기 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
실시예
상기 설명과 함께 본 발명의 특정 구체예를 비제한적 방식으로 설명하는 하기 실시예를 참조한다.
재료 및 방법
재료:
증폭 완충액 (X10)은 Invitrogen에서 수득됨;
덱스트란 T-500은 Pharmacosmos A/S (Denmark) 에서 수득됨;
둘베코의 개질 이글 배지 (DMEM)는 Biological Industries (Beit Haemek, Israel)에서 수득됨;
ECL 용액은 Amersham Biosciences에서 수득됨;
EcoRI은 New England Biolabs에서 수득됨;
인핸서 용액(X10)은 Invitrogen에서 수득됨;
이오탁신 (인간)은 PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 에서 수득됨;
EX-CELL® 293 배지는 SAFC Biosciences에서 수득됨;
우태아 혈청(FCS)은 Biological Industries (Beit Haemek, Israel)에서 수득됨;
Ficoll 1077는 Sigma에서 수득됨;
프로인트 완전 어주반트는 Sigma나 Difco에서 수득됨;
FuGENE® 6은 Roche에서 수득됨;
IP-10 (인간)은 PeproTech에서 수득됨;
IL-8 (인간)은 PeproTech에서 수득됨;
I-TAC (인간)은 PeproTech에서 수득됨;
MCP-1 (인간)은 was obtained from PeproTech에서 수득됨;
메틸화 우혈청 알부민 (mBSA)은 Sigma에서 수득됨;
MIG (인간)은 PeproTech에서 수득됨;
NotI은 New England Biolabs에서 수득됨;
NuPAGE® 비스 트리스 젤은 Invitrogen에서 수득됨;
pIRESpuro3 벡터는 BD Biosciences Clontech에서 수득됨;
단백질 A-Sepharose® 비드는 Amersham에서 수득됨;
RANTES (인간) was obtained from PeproTech에서 수득됨;
RPMI 배지는 Biological Industries (Beit Haemek, Israel) 에서 수득됨;
SDF-1α (인간)는 PeproTech에서 수득됨;
Taq 폴리머라제 (Platinum® Pfx DNA 폴리머라제)는 Invitrogen에서 수득됨; 및
VCAM-1 (인간)는R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)에서 수득됨.
모든 케모카인류는 공급자의 추천사항에 따라 제조되었다.
IL6-BKT 펩타이드 DNA 단편물을 얻는 이단계 PCR:
첫째 PCR 단계에서, IL6 신호 펩타이드 DNA 서열 (서열번호 166)을 각 BKT 펩타이드의 처음 9 개 아미노산들에 상응하는 DNA 서열에 첨가하였다. 이러한 PCR 반응 산물을 두 번째 PCR 단계에서 주형으로 사용하여 상기 BKT 펩타이드의 잔류된 3 개 아미노산들에 상응하는 DNA 서열, 스페이서 서열 (서열번호 167), 및 3' 말단에 BstBI 제한 부위를 첨가하였다.
IL6-Fc pIRES puro DNA는 첫번 PCR 단계의 모든 세 가지 PCR 반응에 대한 DNA 주형으로서 사용된다. 세 가지 모든 PCR 반응은 동일한 순방향 프라이머 (T7 프라이머; 서열번호 170)를 사용하여 수행되었다. 보편적인 T7 프라이머를 사용하면 5' 말단에서, 나중에 서브클로닝에 사용되는 NheI 부위를 위시한 다중 클로닝 부위를 함유하는 PCR 산물을 산출하였다. 역방향 프라이머들은 각 펩타이드에 특이적이다; 서열번호 171은 BKT-P2에 및 서열번호 172은 BKT-P46에 사용하였다.
상기 PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 20 ng DNA 주형; 5 μl 증폭 X10 완충액; 0.2 mM 각 데옥시리보뉴클레오타이드 (dNTP); 0.5 mM MgSO4; 5 μl 인핸서 용액X10 ; 0.2 μM 각 프라이머; 2.5 유닛 Taq 폴리머라제; 총 반응 부피 50 μl이 되게 물 첨가.
증폭은 94 ℃에서 3분간 초기 변성 단계 후, 94 ℃에서 30 초, 52 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초간 30 회를 수행한 다음 10 분간 72 ℃에서 열처리하여 수행되었다.
PCR 증폭 끝에서, 각 반응 혼합물 5 μl를 에티디움 브로마이드로 염색된 2% 아가로즈 겔상에서 분석하고 UV 광으로 가시화시켰다.
상기 수득한 PCR 산물을 제 2 PCR 단계에 대한 주형으로서 사용하였다. 전술한 T7 프라이머를 모든 세 가지 반응에서 순방향 프라이머로서 사용하였고, 역방향 프라이머들은 각 펩타이드들에게 특이적이었다; 서열번호 173는 BKT-P2에 대하여 및 서열번호 174는 BKT-P46에 대해 사용하였다. 각 역방향 프라이머는 아미노산 10-12개의 원하는 펩타이드 및 헥사펩타이드 스페이서 서열 (서열번호 162)를 암호화하였고, BstB1 제한부위를 포함하였다.
PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 0.5 μl DNA 주형; 5 μl 증폭 완충액X10; 0.2 mM 각 dNTP; 0.5 μM MgSO4; 5 μl 인핸서 용액 X10; 0.2 μM 각 프라이머; 2.5 유닛 Taq 폴리머라제; 총 반응부피 50 μl되도록 물 첨가.
제1 PCR 단계에 대한 PCR 산물의 증폭 및 분석을 실시하였다. PCR 반응물을 QiaQuick™ 젤 추출 키트 (Qiagen™)를 사용하여 젤로부터 추출하였다.
IL6-BKT 펩타이드 DNA 단편물과 Fc 서열의 결찰:
추출된 IL6-BKT 펩타이드 DNA 산물을 NheI 및 BstBI로 자르고 전술한바와 같이 아가로즈 겔로부터 정제한 후, 동일한 효소로 미리 처리한 Fc N297A pIRESpuro3에 결찰시켰다. 서열번호 158 및 159를 암호화하는 벡터의 지도가 각각 도 1A와 1B에 도시되어 있다. 상기 결찰 혼합물을 DH5a 수용성(competent) 세포로 형질전환시켰다. 암피실린-내성 형질전환체를 검사하고 양성 클론을 콜로니 PCR로 더 분석하였다.
암피실린-내성 콜로니로부터 DNA를 추출하고 EcoRI 및 NotI 제한효소로37 ℃에서 두 시간동안 절단하였다. 반응물을 아가로즈 젤에 두었다. 양성 콜로니는 5123 bp 및 868 bp 두 개의 밴드를 산출하는 것으로 예상되었다. 양성 콜로니들은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
웨스턴 블랏:
세포 샘플로부터 얻은 배지를 수집하고 원심분리하였다 (분당 1000 회전, 7 분). 상기 세포가 제거된 배지 1 ml을 50 μl 단백질 A-Sepharose® 비드와 함께 45 분간 실온에서 배양하였다. 배양 후, 100 mM 시트레이트 포스페이트 완충액 (pH 3.5) 및 10 mM DTT (디티올트레이톨)을 함유하는 50 μl 샘플 완충액을 사용하여 상기 비드로부터 단백질을 용출하였다. 상기 샘플들을 3 분간 끓이고, 다음, 샘플 25 μl를 12 % NuPAGE® Bis Tris 젤에 놓았다. 단백질들을 니트로셀룰로즈 막으로 옮기고 10 % 저지방 밀크를 함유한 PBST (PBS, 0.05 % Tween-20이 첨가된) 용액으로 차단하였다. 다음, 상기 막을 1 시간동안 인간 항-IgG Fc 단편물 항체로 1 시간동안 얼룩되게 한 후, HRP (고추냉이 페록시다제)가 접합된 염소 항-인간 항체를 블록킹 용액에서 1:40,000의 농도로 실온에서 처리하였다. ECL 용액으로 처리 후, 막을 필름에 노출시켰다.
표면 플라즈몬 공명 (SPR):
카르복시메틸덱스트란으로 덮힌 챔버내에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 라이신 잔기의 아민기 또는 N-말단을 통해 상기 챔버와 공유결합적으로 결합시켰다. 상기 케모카인을 챔버를 통해 증가되는 농도로 주입하였다.
표면으로부터 반사되는 광에서의 변화는 결합된 단백질의 양과 비례하고 이를 검출기로 검출한다.
결합된 단백질의 양을 케모카인의 상이한 농도에서 좌표화하여 해리 계수을 계산하였다.
신선 혈로부터 T-세포 정제:
피 50 ml를 Dextran T-500 (6 % w/v)을 함유한 PBS (인산염 완충액 식염수) 용액 10 ml 및 시트레이트 완충액 (25 그람 시트레이트, 8 그람 시트르 산을 함유한 500 ml PBS) 7 ml에 첨가하였다. 용액을 30 분간 25 ℃에서 항온처리하였다. 10 ml의 Ficoll 1077을 상기 튜브의 바닥에 놓았다. 다음, 튜브를 2,000 rpm에서 30 분간 18 ℃에서 원심분리하였다 (원심분리의 브레이크 모드는 오프시킴). 중간상을 수집하고 5 % FCS (우태아혈청)을 함유한 8 ml PBS로 두 번 세척한 후, 1,400 rpm에서 5 분간 18 ℃에서 원심분리하였다. 상기 세포를 5 % FCS를 함유한 PBS에서 108 /ml 미만의 농도로 재현탁하였다. 상기 세포 용액2 ml을 PBS-5 % FCS가 미리 적셔진 폴리(메틸 메타크릴레이트) 나일론 울 컬럼에 적용한 다음 45 분간 25 ℃에서 항온처리하였다. 각 컬럼을 8 ml PBS-5 % FCS로 세척하고 상기 세포 (T-세포 및 적혈구)를 5 mM EDTA (에틸렌디아민테트라아세트 산)을 함유한 PBS 50 ml로 용출하였다. 1,400 rpm에서 5 분간 4 ℃에서 원심분리하여 (브레이크 모드 켜고)적색 펠렛을 얻었다.
적혈구의 용혈을 수행하기 위해, 적색 펠렛을 5 ml의 용혈 완충액 (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, X0.1 PBS)에 4 분간 재현탁한 후, 즉시 EDTA를 함유한 PBS 50 ml를 첨가하였다. 1,400 rpm으로 5 분간 4 ℃에서 원심분리 후, 펠렛을 50 ml PBS-EDTA로 다시 세척하고 동일한 조건에서 재원심분리하였다. 백색 펠렛을 얻었고 10 % FCS, L-글루타민, 소듐 파이루베이트 및 항체를 함유한 RPMI 배지에 3x106 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 세포를 2 시간동안 37 ℃에서 배양한 후, 비부착 세포를 수집하다. 세포를 37 ℃에서 밤새 배양한 후 실험에 사용하였다.
시험관내 T 세포 부착 분석법:
10 μg/ml 인간 VCAM-1 및 2 μg/ml 케모카인 (온전한 MIG, IP-10, I-TAC, MCP-1, RANTES, SDF-1 (기질 세포-유도 인자-1), BCA-1 (B 림프구 주화인자-1), IL-8 (인터루킨-8) 또는 이오탁신, 또는 대조군으로서 열-불활성화 SDF-1)을 20 mM 중탄산염 (pH 8.5)과 완충된 PBS에 용해하고, 폴리스티렌 플레이트에서 밤새 4 ℃에서 배양하였다. 대안적으로, 10 μg/ml 케모카인을 사용하였고, 상기 플레이트를 30분간 실온에서 배양하였다. 다음, 상기 플레이트를 세 번 세척하고 20mg/ml 인간 혈청 알부민을 함유한 PBS에서 2 시간동안 37 ℃에서 처리으로써 차단하였다.
다음, 상기 플레이트를 평행 벽 유동 챔버의 하부 벽으로서 모아놓고 역상 현미경 대에 놓았다. 처리되는 펩타이드 10 μg/ml을 기질-코팅된 챔버 벽에 10분간 37 ℃에서 자리 잡게 하고 세척하였다. T 세포를 전술한 바와 같이 신선혈로부터 정제하고 (5x106 /ml, 순도 >98 %) 결합 완충액에 현탁하고, 상기 챔버에 관류하고, 및 상기 기질-코팅된 챔버 벽에 1 분 동안 37 ℃에서 정착시켰다. 유동을 개시하고 5초마다 2 내지 2.5 배 증분으로 증가시켜, 상기 벽 상에 조절된 전단 스트레스를 발생시켰다. 세포를 20x 대물렌즈를 가진 역-위상차 Diaphot 현미경 (Nikon)으로 관찰하고, AG-6730 S-VHS 비디오 레코더 (Panasonic)에 연결된 긴 통합 LIS-700 CCD 비디오 카메라 (Applitech; Israel)로 사진 찍었다. 증가된 전단력에 의한 탈착에 저항하는 부착된 세포의 수를, 비디오테이프상의 세포 영상의 분석에 의한 각각의 간격 후에 결정하였고, 원래 정착된 세포의 백분율로 표시하였다. 모든 부착 실험은 다중 시험 시계상에서 적어도 세 번 수행되었다.
실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE):
EAE은 암컷 SJL 및 C57BL/6 생쥐에서 유도되었다. 생쥐를 옆구리에 100 μg PLP139-151 펩타이드 또는 250 μg MOG35-55 펩타이드로 피하로 주입하였다 (0 일째). PLP 및 MOG 펩타이드는 800 μg 마이코박테리움 튜베르큘로시스 H37RA (Difco, Detroit, MI)를 함유하는 동일 부피의 완전 프로인트의 어주반트 (CFA)에 에멀젼화하였다. 생쥐를 또한 일 0 및 2일째에 300 ng 백일해 독소로 복강내 주사하였다.
생쥐에게 면역 후 9일째에 BKT-P2-FC 또는 BKT-P46-FC (50 μg/생쥐)를 정맥내 주사하였다. 특정 실험에서, 생쥐에게 BKT-P2-FC 또는 BKT-P46-FC로 정맥내 주사할 때, 질병 유도 14일 후에, 질병의 절정기에서 상기 생쥐를 치료하였다.
질병 유도 30일 후에 척수 조직 샘플을 수집하고, 4 % 파라포름알데히드에 고정시키고, 및 탈수시키고 및 파라핀에 매립하였다. 척수 부위를 6 μm로 절단하고 해마톡실린과 에오신 (H&E)으로 염색하여 조직학적 분석을 위한 가공을 해서 면역 세포 침윤을 평가하고 및 룩솔 패스트 블루로 염색하여 탈수초 부위를 표시하였다.
혈액 샘플을 면역후 30일 째에 수집하였고 혈청을 추출하여 사이토카인 분석하였다. 사이토카인 수준을 생쥐 Th1/Th2 사이토카인 키트 - BD 세포측정 비드 어레이 (CBA)를 제작사 지침에 따라서 사용하여 측정하였다.
BKT-P2-FC 및 BKT-P46-FC 폴리펩타이드들의 효과는 동물 개체에서 EAE 임상 점수를 모니터링함으로써 결정되었다. EAE에 대한 임상적 점수는 하기 기준에 따라 결정되었다: 0 - 무 질병; 1 - 감소된 꼬리 상태; 2 - 뒷다리 약화 또는 부분적 마비; 3 - 완전 뒷다리 마비; 4 - 앞 및 뒷다리 마비; 5 - 빈사 상태. 축적되는 점수는 실험을 끝에 실험군에서의 모든 동물에 대해 모든 결과를 총합함으로써 계산되었다.
모든 EAE 실험에 대하여, 군당 10 내지 12 마리 배당되었다.
실시예 1
폴리펩타이드의 제조
BKT-P2 펩타이드 (서열번호 101) 및 BKT-P46 펩타이드 (서열번호 76) (여기서는 "BKT 펩타이드류"로 지칭)을 분비된 비글리코실화 인간 IgG1 Fc (Fc N297A)의 N'-말단에 융합된 BKT 펩타이드를 가지는 폴리펩타이드를 제조하는 기본으로서 사용하였다.
DNA 클로닝을 하기 위해, BKT-P2 및 BKT-P46 펩타이드 서열을 DNA 서열들로 역번역하였다 (back-translated). 포유동물 시스템에서 단백질 분비를 하기 위해, 각 BKT 펩타이드 서열을 인간 IL6 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열과 융합하였다. 이러한 과정은 전술한 바와 같이, 이단계 PCR로 수행되었다. 전술한 방법을 사용하여 PCR로 수득한 IL6-BKT 펩타이드 DNA 단편물들을 절단하고 비글리코실화된 Fc 서열 (포인트 변이 N297A를 함유하는)의 프레임 내로 결찰하여 IL6-P2-Fc N297A (서열번호 168) 및 IL6-P46-Fc N297A (서열번호 169)로 명명된 단편물들을 생성하였다.
다음, IL6-BKT 펩타이드-Fc DNA 작제물들을 FuGENE® 6 형질감염 시약을 사용하여 HEK-293T 세포로 형질감염시켰다. 각 작제물은 6-웰 플레이트의 두 개 플레이트에서 형질감염하였다. 하나의 웰은 웨스턴 블랏 (WB) 분석용이고 두번째 웰은 안정한 풀을 확립하기 위한 것이었다. 상기 세포들을 6-웰 플레이트에 웰당500,000 세포의 농도로 분주하였다. 하루 후, 상기 세포들을 6 μl의 FuGENE 및 2 μg DNA (3:1 비율)로 형질감염시켰다.
WB 분석용 웰에서, 24시간 후에 상기 배지를 무혈청 배지와 교환하고 배지를 48시간 후에 수집하였다. 일시적으로 형질감염된 세포를 항-Fc 항체를 사용하는 웨스턴 블랏으로 분석하였고 및 소정의 폴리펩타이드, BKT-P2-FC (서열번호 158) 및 BKT-P46-FC (서열번호 159)로 지칭된 폴리펩타이드를 발현하는 것으로 밝혀졌다 (데이터 미도시).
나머지 다른 웰에서, 24시간 후에, 상기 배지를 10 % FCS (우태아혈청)을 함유하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) 48 시간 후에, 세포를 트립신처리하고 적절한 클론들을 얻기 위한 선택 배지 (DMEM, 10 % FCS 및 5 μg/ml 퓨로마이신을 함유)를 가진 T75 플라스크로 옮겼다.
생존된 퓨로마이신 선택 세포 집단 (적절한 풀)을 증식하고, 상기 세포 집단의 배지를 전술한 바와 같이 웨스턴 블랏으로 분석하여, 원하는 폴리펩타이드의 발현을 확인하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 소정의 BKT-P2-FC 및 BKT-P46-FC 폴리펩타이드들은 모든 시험된 세포 배양액에서 발현되었다.
또한, 전술한 풀로부터 얻은 상청액을 Fc 단편물로 지향된 ELISA로 시험하였고 그 결과는 시험된 배양액 모두에서, 소정의 BKT-P2-FC 또는 BKT-P46-FC 폴리펩타이드가 발현된 것을 나타내었다 (데이터 미도시).
세포의 정체를 확인하기 위해, 게놈 PCR을 수행하였고, 그 결과 정확한 서열이 세포 게놈에 통합된 것이 나타났다 (데이터 미도시)
소정의 폴리펩타이드를 발현하는 각 풀의 수 개 분획물을 액체 질소에 냉동보관하였다. 세포 생존성을 확인하기 위해, 수일 후, 각 스탁으로부터 하나 앰플을 해동하였다.
다음, BKT-P2-FC (서열번호 158) 및 BKT-P46-FC (서열번호 159) 폴리펩타이드들을 현탁액으로 성장된 포유동물 배양액에서 생성하였다. 형질감염된 세포의 하나의 T175 플라스크를 10 % 혈청 보충된, 선택 항생제 (5 μg/ml 퓨로마이신)를 함유한 배지에서 유지하였고 5 % CO2 37 ℃에서 배양하였다. 트립신 처리 후, 세포를 4 mM 글루타민과 선택 항생제 (1 μg/ml 퓨로마이신)를 함유한 무혈청 배지 (EX-CELL® 293 배지)로 옮기고, 5 % CO2 37 ℃의 플라스크에서 더 배양하였다. 3일 후, 상기 세포를 진탕 플라스크로 옮기고 37 ℃에서 125 rpm으로 진탕배양하였다. 세포 밀도가 2.0-3.5 x 106 세포/ml에 도달하면, 배양액 부피를 두 개 스피너 플라스크에서 단계적 희석으로 4 리터까지 증가시켰다. 배양액 200 ml를 함유하는 진탕 플라스크를 백업용으로 보관하였다.
4 일간의 생산 단계 후, 상기 두 개 스피너 플라스크의 배양액은 91 % 생존율을 가지고 3.7 x 106 세포/ml 및 92% 생존율의 4.0 x 106 세포/ml을 각각 포함하였다. 상기 두 개 스피너 플라스크로부터 얻은 배지 및 상기 진탕 플라스크로부터 얻은 200 ml를 원심분리 (5000 rpm, 15 분)하여 수확하였다. 총 3.5 리터를 수집하고, 0.22 μm 필터를 통해 여과하고 -80 ℃에서 보관하였다 (두 개 1.5 ml 샘플을 취하였다). 상기 폴리펩타이드 (서열번호 158 또는 서열번호 159)를 단백질 A 컬럼상에서 더 정제하였다.
실시예 2
폴리펩타이드의 케모카인에 대한 친화도
케모카인에 대한 실시예 1에 설명된 폴리펩타이드들의 친화도를 재료 및 방법 단락에서 설명한 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)으로 결정하였다. 결과를 하기 표 3에 요약하였다.
표 3에 나타난 바와 같이, 상기 폴리펩타이드들은 케모카인인 I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및 RANTES 각각에 적합한 정도로 결합되었다.
케모카인에 대한 폴리펩타이드의 결합의 해리상수(Kd)
케모카인 BKT-P2-FC
서열번호 158		 BKT-P46-FC
서열번호 159
해리상수 (Kd) (M) Chi2 해리상수 (Kd) (M) Chi2
I-TAC 8.3 x 10-8 0.51 3.7 x 10-7 0.76
IP-10 3.8 x 10-8 1.05 6.3 x 10-9 0.99
MIG 1.3 x 10-7 1.05 1.8 x 10-8 0.61
MCP-1 6.5 x 10-6 0.65 4.6 x 10-8 0.75
이오탁신 2.7 x 10-5 1.2 5 x 10-6 0.51
RANTES 1.8 x 10-8 0.6 미결정 미결정
실시예 3
폴리펩타이드의 시험관내 활성
전술한 시험관내 부착 분석법을 사용하여 T 세포의 VCAM-1로의 부착에 대한 케모카인 결합 펩타이드들인 BKT-P2 (서열번호 101) 및 BKT-P46 (서열번호 76)의 효과를 전술한 케모카인 결합 펩타이드 서열들 중 하나를 포함하는 실시예 1에서 설명된 폴리펩타이드들과 비교하였다. T 세포가 VCAM-1에 부착하는 것을 저해하는 전술한 펩타이드들과 폴리펩타이드들의 능력이 하기 표 4에 요약되어 있다.
케모카인-의존성 T 세포 부착에 대한 펩타이드의 저해
펩타이드
(서열번호)		 케모카인
IP-10 I-TAC MIG MCP-1 RANTES 이오탁신 SDF-1 BCA-1 IL-8
BKT-P2 (101) ++ ++ - ++ ++ ++ - - N.D.
BKT-P2-FC (158) ++ ++ ++ ++ ++ ++ N.D. N.D. N.D.
BKT-P46 (76) - ++ ++ ++ ++ - - N.D. -
BKT-P46-FC (159) - ++ ++ ++ ++ ++ - - N.D.
++ = 100 % 저해
- = 무저해 N.D. = 미결정
표 4 및 3A, 3B와 3C에 나타난 바와 같이, 상기 펩타이드 BKT-P2는 IP-10, I-TAC, MCP-1, RANTES 및 이오탁신에 의해 유도된 T 세포 부착을 저해하였으나, MIG에 의해 유도된 부착은 저해하지 않았다.
표 4 및 도 4A, 4B와 4C에 나타난 바와 같이, 폴리펩타이드 BKT-P2-FC는 MIG에 의해 유도된 T 세포 부착은 물론 IP-10, I-TAC, MCP-1, RANTES 및 이오탁신에 의해 유도된 부착도 저해하였다.
표 4에 또한 나타난 바와 같이, 펩타이드 BKT-P46는 I-TAC, MIG, MCP-1 및 RANTES에 의해 유도된 T 세포 부착을 저해하였으나, 이오탁신에 의해 유도된 부착은 저해하지 않은 반면, 폴리펩타이드 BKT-P46-FC는 이오탁신은 물론 I-TAC, MIG, MCP-1과 RANTES에 의해 유도된 T 세포 부착을 저해하였다.
상기 결과는 상기 폴리펩타이드들이 케모카인 활성을 조절하는 상응하는 케모카인-결합 펩타이드들의 능력보다 케모카인 활성을 조절하는 향상된 능력을 가진다는 것을 나타낸다. 이것은 상기 펩타이드들에 비해서 상기 폴리펩타이드들의 연장된 생존시간 및 향상된 안정성의 결과 및/또는 그들의 삼차 구조의 변화 때문일 수 있다.
실시예 4
폴리펩타이드의 실험적 자가면역성 뇌척수염 ( EAE )에 대한 생체내 효과
뇌 염증에 대한 실시예 1에서 설명한 BKT-P2-FC 및 BKT-P46-FC 폴리펩타이드들의 효과를 생체내 실험적 자가면역성 뇌척수염 모델을 사용하여 재료 및 방법 단락에서 설명한 바와 같이, 시험하고 및 점수를 매겼다.
도 5A 및 5B에 나타난 바와 같이, BKT-P46-FC 폴리펩타이드는 실험 기간동안 (55일째) PLP-유도된 EAE의 평균 임상점수 및 누적 임상점수를 상당히 낮추었다.
실험 37 일째, 13 마리 대조군 생쥐 중 6 마리는 적어도 2 점의
EAE 임상 점수를 가진 반면 BKT-P46-FC 폴리펩타이드가 투여된 모든 10 마리 생쥐는 0 점의 EAE 임상 점수를 가졌다.
또한, 도 6A 및 6B에 도시된 바와 같이, BKT-P46-FC 및 BKT-P2-FC 폴리펩타이드 둘 다는 실험 기간동안 (33일째), PLP-유도 EAE의 평균 임상 점수 및 누적 임상 점수를 감소시켰다.
실험 27일째, 10마리 대조군 생쥐 중 8 마리는 적어도 2 점의 EAE 임상 점수를 가진 반면 BKT-P2-FC 폴리펩타이드를 투여한 10 마리 생쥐 중 9 마리 및 BKT-P46-FC 폴리펩타이드가 투여된 10 마리 생쥐 중 8마리가 0 점의 EAE 임상 점수를 가졌다.
유사하게도, 도 7에 나타난 바와 같이, BKT-P46-FC 및 BKT-P2-FC 폴리펩타이드 둘 다는 실험 기간동안 (55일째), MOG-유도 EAE의 평균 임상 점수를 감소시켰다.
이러한 결과들은 상기 폴리펩타이드들이 다발성 경화증의 모델인 EAE의 것과 같이, 생쥐의 뇌에서의 염증 반응을 저해하는 데 효과적이라는 것을 가리킨다.
실시예 5
폴리펩타이드들의 관절염에 대한 생체내 효과
관절염에 대한 실시예 1에서 설명된 BKT-P2-FC 폴리펩타이드의 효과를 관절염이 유도된 생체내 생쥐 모델을 사용하여 시험하였다. 분석은 Coelho 등 [관절염 Rheum 2008, 58:2329-2337], Grespan 등 [Arthritis Rheum 2008, 58:2030-2040] 및 Lemos 등 [PNAS 2009, 106:5954-5959]에 의해 설명된 바와 같이 수행되었다.
0 일째, 상기 생쥐를 500 μg 메틸화 우혈청알부민 (mBSA)을 함유한 식염수 에멀젼 100 μl 및 동일한 부피의 프로인트 완전 어주반트 (CFA)를 꼬리 끝에 내피적으로 주사하였다. 11일째, 상기 BKT-P2-FC 폴리펩타이드를 2 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 24 시간 후에, 항원을 상기 생쥐에 투여하였다. 각 생쥐의 왼쪽 무릎 관절에 10 μg mBSA (10 μl 멸균 식염수에 함유)로 주사하였다. 상기 폴리펩타이드 투여48 시간 후, 생쥐들을 죽이고, 무릎 강을 PBS로 세척하고 조직내 백혈구 수를 형광활성 세포 분류기(FACS)를 사용하여 백혈구를 계수함으로써 결정하였다.
도 8A 및 8B에 나타난 바와 같이, BKT-P2-FC 폴리펩타이드는 관절염성 무릎강에서 호중구 및 단핵구의 수를 상당히 감소시켰다.
이러한 결과들은 상기 폴리펩타이드들이 류마티스 관절염의 것과 같은 염증성 반응을 저해하는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.
실시예 6
폴리펩타이드 s on 지연형 과민증 ( DTH )에 대한 폴리펩타이드들의 생체내 효과
실시예 1에서 설명된 BKT-P2-FC 및 BKT-P46-FC 폴리펩타이드의 면역 반응에 대한 효과를 생체내 지연형 과민증 생쥐 모델을 사용하여 또한 시험하였다.
상기 생쥐 (8- 내지 10-주령 수컷 C57BL/6 생쥐)를 500 μg 메틸화 우혈청 알부민 (mBSA)을 함유한 100 μl 식염수 에멀전 및 동일 부피의 프로인트 완전 어주반트를 0일째에 꼬리 끝에 내피적으로 주사하였다. 12일 후에, 항원을 주입하였다. 각 생쥐의 왼쪽 무릎 관절에 10 μg mBSA (10 μl 멸균 식염수에 함유)를, Coelho 등 [Arthritis Rheum 2008, 58:2329-2337] 및 Healy 등 [J Immunol 2006, 177:1886-1893]에서 설명된 바와 같이 주사하였다. 특정 생쥐에서는, 상기 항원 주입 24시간 전에, BKT-P2-FC (50 μg/생쥐)를 정맥내 주사하였다. 시험된 적이 없는 (naive) 생쥐를 PBS로 모조 면역화하고 대조군으로 사용하였다. 항원 처리 24시간 후에, 생쥐를 죽였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 전술한 폴리펩타이드들 둘 다는 지연형 과민증을 저해하였고 BKT-P2-FC가 BKT-P46-FC보다 더 강력하였다.
이러한 결과들은 상기 폴리펩타이드들이 지연형 과민증 염증 반응을 저해하는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.
실시예 7
폴리펩타이드들의 약리동태학
생쥐에서의 상기 폴리펩타이드들의 약리동태학을 BKT-P46-FC (서열번호 159) 또는 BKT-P2-FC (서열번호 158) 폴리펩타이드를 50 μg/생쥐 양으로 피하 주사한 C57BL/6 생쥐에서 결정하였다.
상기 생쥐들을 주사한 지 2 시간, 24 시간, 5일 및 11일 후에, 출혈시키고, 혈청을 추출하였다. 혈청내에서의 폴리펩타이드의 양을 인간 총괄 IgG ELISA 키트(ICL)를 제작사의 지침에 따라 사용하여 결정하였다.
상기 폴리펩타이드들을 주사한 지 심지어 11일 후에도 검출되었다.
이러한 결과들은 상기 폴리펩타이드들이 생체내에서 상당한 안정성을 가진다는 것은 나타낸다.
비록 본 발명이 이의 특정 구체예와 연계하여 설명되었지만, 많은 대안, 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 따라서 그러한 대안, 변형 및 변화는 첨부된 청구범위의 사상과 넓은 범위 내에 속하는 것으로 포함하는 것이 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원서들은 각 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원서가 특별히 그리고 개별적으로 참조문헌에 본 명세서에 병합되는 것 정도만큼 본 명세서에 참조됨으로써 전체가 병합된다. 또한, 이러한 출원서에서 임의의 참조문헌의 인용 또는 확인은 승인으로서 해석되어서는 안 되며 그러한 참조문헌은 본 발명에 대한 선행기술로서 이용가능하다. 단락의 표제가 사용되는 정도로, 그것들은 필수적인 제한물로서 해석되어서는 안 된다.
케모카인-결합 펩타이드류
케모카인 -결합 펩타이드 명 서열번호 펩타이드의 서열
BKT - P50 1 CAHLSPHKC
BKT - P10 2 CDIPWRNEC
BKT - P17 3 CDPLRQHSC
BKT - P58 4 CDSLGHWLC
BKT - P15 5 CDYTTRHSC
BKT - P59 6 CHGTLNPEC
BKT - P56 7 CHHNLSWEC
BKT - P60 8 CHIWTLASC
BKT - P61 9 CHNTFSPRC
BKT - P62 10 CIPLHASLC
BKT - P63 11 CITTTSLSC
BKT - P64 12 CKLTTCKDC
BKT - P65 13 CKNHTTFWC
BKT - P66 14 CLKLLSRSC
BKT - P67 15 CLLKAHPSC
BKT - P68 16 CLNQLKQAC
BKT - P69 17 CMNFPSPHC
BKT - P70 18 CPQSPTYTC
BKT - P57 19 CPSSAIHTC
BKT - P71 20 CPTSTARIC
BKT - P72 21 CQASSFPSC
BKT - P73 22 CQPYFWYRC
BKT - P14 23 CQTLTPSIC
BKT - P74 24 CSKLGHLWC
BKT - P75 25 CSKTPERIX
BKT - P76 26 CSNNNRMTC
BKT - P77 27 CSPILSLSC
BKT - P16 28 CSPTNFTRC
BKT - P78 29 CSRPAMNVC
BKT - P79 30 CSTKAYPNC
BKT - P80 31 CSTSSCGSC
BKT - P81 32 CSYWGHRDC
BKT - P13 33 CTAHDANAC
BKT - P82 34 CTANSEKTC
BKT - P83 35 CTHPKASMC
BKT - P84 36 CTKTINGKC
BKT - P85 37 CTNMQSPLC
BKT - P86 38 CTPFTKLPC
BKT - P87 39 CTPTTDSIC
BKT - P88 40 CTQQNGHPC
BKT - P12 41 ACTTPSKHQC
BKT - P89 42 CTYNVAKPC
BKT - P90 43 ACAPLMFSQC
BKT - P48 44 ACHASLKHRC
BKT - P91 45 AHFSPNLLLGG
BKT - P44 46 AHSLKSITNHGL
BKT - P92 47 AKTLMPSPFPRT
BKT - P93 48 ASAVGSLSIRWQ /L/G
BKT - P94 49 ASWVDSRQPSAA
BKT - P95 50 CPQLTVGQHRT
BKT - P8 51 DLPPTLHTTGSP
BKT - P96 52 DSSNPIFWRPSS
BKT - P97 53 EFLGVPASLVNP
BKT - P51 54 ESDLTHALHWLG
BKT - P98 55 EVHSTDRYRSIP
BKT - P99 56 FGLQPTGDIARR
BKT - P9 57 FSMDDPERVRSP
BKT - P100 58 FSPLHTSTYRPS
BKT - P27 59 GDFNSGHHTTTR
BKT - P28 60 GPSNNLPWSNTP
BKT - P33 61 GVHKHFYSRWLG
BKT - P101 62 HAPLTRSPAPNL
BKT - P102 63 HGSLTTLF / LRYEP
BKT - P45 64 HHFHLPKLRPPV
BKT - P55 65 HHTWDTRIWQAF
BKT - P54 66 HPTTPFIHMPNF
BKT - P103 67 HRDPXS (P)PSAA/ GRP
BKT - P104 68 HNVTTRTQRLMP
BKT - P49 69 HSACHASLKHRC
BKT - P105 70 HSACKLTTCKDG
BKT - P6 71 HSACLSTKTNIC
BKT - P106 72 IAHVPETRLAQM
BKT - P107 73 IFSMGTALARPL
BKT - P108 74 INKHPQQVSTLL
BKT - P7 75 ISPSHSQAQADL
BKT - P46 76 LDYPIPQTVLHH
BKT -21 77 LFAAVPSTQFFR
BKT - P22 /38 78 LGFDPTSTRFYT
BKT - P37 79 LLADTTHHRPWP
BKT - P109 80 LPWAPNLPDSTA
BKT - P110 81 LQPSQPQRFAPT
BKT - P111 82 LSPPMQLQPTYS
BKT - P112 83 MHNVSDSNDSAI
BKT - P113 84 NSSMLGMLPSSF
BKT - P114 85 NTSSSQGTQRLG
BKT - P42 86 PGQWPSSLTLYK
BKT - P23 87 QIPQMRILHPYG
BKT - P24 88 QIQKPPRTPPSL
BKT - P115 89 QLTQTMWKDTTL
BKT - P116 90 QNLPPERYSEAT
BKT - P117 91 QSLSFAGPPAWQ
BKT - P118 92 QTTMTPLWPSFS
BKT - P119 93 RCMSEVISFNCP
BKT - P120 94 RSPYYNKWSSKF
BKT - P39 95 SAGHIHEAHRPL
BKT - P40 96 SAISDHRAHRSH
BKT - P121 97 SEPTYWRPNMSG
BKT - P32 98 SFAPDIKYPVPS
BKT - P31 99 SFWHHHSPRSPL
BKT - P3 100 SIFAHQTPTHKN
BKT - P2 101 SIPSHSIHSAKA
BKT - P122 102 SIRTSMNPPNLL
BKT - P123 103 SLPHYIDNPFRQ
BKT - P29 104 SLSKANILHLYG
BKT - P124 105 SLVTADASFTPS
BKT - P125 106 SMVYGNRLPSAL
BKT - P126 107 SPSLMARSSPYW
BKT - P127 108 SPNLPWSKLSAY
BKT - P1 109 SQTLPYSNAPSP
BKT - P128 110 SSTQAHPFAPQL
BKT - P129 111 STPNSYSLPQAR
BKT - P4 112 STVVMQPPPRPA
BKT - P34 113 SVQTRPLFHSHF
BKT - P130 114 SVSVGMKPSPRP
BKT - P131 115 SYIDSMVPSTQT
BKT - P132 116 SYKTTDSDTSPL
BKT - P133 117 TAAASNLRAVPP
BKT - P5 118 TAPLSHPPRPGA
BKT - P134 119 TGLLPNSSGAGI
BKT - P135 120 TGPPSRQPAPLH
BKT - P30 121 TLSNGHRYLELL
BKT - P25 122 TPSPKLLQVFQA
BKT - P136 123 TPSTGLGMSPAV
BKT - P137 124 TPVYSLKLGPWP
BKT - P47 125 TRLVPSRYYHHP
BKT - P138 126 TSPIPQMRTVPP
BKT - P139 127 TTNSSMTMQLQR
BKT - P140 128 TTTLPVQPTLRN
BKT - P141 129 TTTWTTTARWPL
BKT - P142 130 TVAQMPPHWQLT
BKT - P143 131 TWNSNSTQYGNR
BKT - P144 132 TWTLPAMHPRPA
BKT - P26 133 VHTSLLQKHPLP
BKT - P35 134 VLPNIYMTLSA
BKT - P145 135 VMDFASPAHVLP
BKT - P146 136 VNQEYWFFPRRP
BKT - P147 137 VYSSPLSQLPR
BKT - P148 138 VPPIS (R) TFLF (L) ST (K)S
BKT - P149 139 VPPLHPALSRXN
BKT - P43 140 VSPFLSPTPLLF
BKT - P150 141 VSRLGTPSMHPS
BKT - P151 142 WPFNHFPWWNVP
BKT - P52 143 WSAHIVPYSHKP
BKT - P152 144 WWPNSLNWVPRP
BKT - P53 145 YATQHNWRLKHE
BKT - P153 146 YCPMRLCTDC
BKT - P154 149 YGKGFSPYFHVT
BKT - P155 148 YPHYSLPGSSTL
BKT - P156 149 YPSLLKMQPQFS
BKT - P157 150 YQPRPFVTTSPM
BKT - P158 151 YSAPLARSNVVM
BKT - P36 152 YTRLSHNPYTLS
BKT - P41 153 YTTHVLPFAPSS
BKT - P159 154 YTWQTIREQYEM
BKT - P6 155 CLSTKTNIC
BKT - P16 156 ACLSTKTNIC
BKT - P11 157 CTTPSKHQC
SEQUENCE LISTING <110> Biokine Therapeutics Ltd. Abraham, Michal Eizenberg, Orly Peled, Amnon <120> NOVEL CHEMOKINE BINDING POLYPEPTIDES CAPABLE OF INHIBITING THE COURSE OF AUTOIMMUNITY, INFLAMMATION AND CANCER <130> 49065 <150> US 61/213,493 <151> 2009-06-15 <160> 174 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Cys Ala His Leu Ser Pro His Lys Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Cys Asp Ile Pro Trp Arg Asn Glu Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Cys Asp Pro Leu Arg Gln His Ser Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Cys Asp Ser Leu Gly His Trp Leu Cys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Cys Asp Tyr Thr Thr Arg His Ser Cys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Cys His Gly Thr Leu Asn Pro Glu Cys 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 7 Cys His His Asn Leu Ser Trp Glu Cys 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Cys His Ile Trp Thr Leu Ala Ser Cys 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Cys His Asn Thr Phe Ser Pro Arg Cys 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Cys Ile Pro Leu His Ala Ser Leu Cys 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 11 Cys Ile Thr Thr Thr Ser Leu Ser Cys 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Cys Lys Leu Thr Thr Cys Lys Asp Cys 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Cys Lys Asn His Thr Thr Phe Trp Cys 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Cys Leu Lys Leu Leu Ser Arg Ser Cys 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 Cys Leu Leu Lys Ala His Pro Ser Cys 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 16 Cys Leu Asn Gln Leu Lys Gln Ala Cys 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 17 Cys Met Asn Phe Pro Ser Pro His Cys 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 18 Cys Pro Gln Ser Pro Thr Tyr Thr Cys 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 19 Cys Pro Ser Ser Ala Ile His Thr Cys 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 20 Cys Pro Thr Ser Thr Ala Arg Ile Cys 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 21 Cys Gln Ala Ser Ser Phe Pro Ser Cys 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 22 Cys Gln Pro Tyr Phe Trp Tyr Arg Cys 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 23 Cys Gln Thr Leu Thr Pro Ser Ile Cys 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 24 Cys Ser Lys Leu Gly His Leu Trp Cys 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Any amino acid <400> 25 Cys Ser Lys Thr Pro Glu Arg Ile Xaa 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 26 Cys Ser Asn Asn Asn Arg Met Thr Cys 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Cys Ser Pro Ile Leu Ser Leu Ser Cys 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Cys Ser Pro Thr Asn Phe Thr Arg Cys 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Cys Ser Arg Pro Ala Met Asn Val Cys 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Cys Ser Thr Lys Ala Tyr Pro Asn Cys 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 31 Cys Ser Thr Ser Ser Cys Gly Ser Cys 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 32 Cys Ser Tyr Trp Gly His Arg Asp Cys 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 33 Cys Thr Ala His Asp Ala Asn Ala Cys 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Cys Thr Ala Asn Ser Glu Lys Thr Cys 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 35 Cys Thr His Pro Lys Ala Ser Met Cys 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Cys Thr Lys Thr Ile Asn Gly Lys Cys 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 37 Cys Thr Asn Met Gln Ser Pro Leu Cys 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Cys Thr Pro Phe Thr Lys Leu Pro Cys 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Cys Thr Pro Thr Thr Asp Ser Ile Cys 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 40 Cys Thr Gln Gln Asn Gly His Pro Cys 1 5 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 41 Ala Cys Thr Thr Pro Ser Lys His Gln Cys 1 5 10 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 42 Cys Thr Tyr Asn Val Ala Lys Pro Cys 1 5 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 43 Ala Cys Ala Pro Leu Met Phe Ser Gln Cys 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 44 Ala Cys His Ala Ser Leu Lys His Arg Cys 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 45 Ala His Phe Ser Pro Asn Leu Leu Leu Gly Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 46 Ala His Ser Leu Lys Ser Ile Thr Asn His Gly Leu 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 47 Ala Lys Thr Leu Met Pro Ser Pro Phe Pro Arg Thr 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Gln, Leu or Gly <400> 48 Ala Ser Ala Val Gly Ser Leu Ser Ile Arg Trp Xaa 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 49 Ala Ser Trp Val Asp Ser Arg Gln Pro Ser Ala Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 50 Cys Pro Gln Leu Thr Val Gly Gln His Arg Thr 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 51 Asp Leu Pro Pro Thr Leu His Thr Thr Gly Ser Pro 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 52 Asp Ser Ser Asn Pro Ile Phe Trp Arg Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 53 Glu Phe Leu Gly Val Pro Ala Ser Leu Val Asn Pro 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 54 Glu Ser Asp Leu Thr His Ala Leu His Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 55 Glu Val His Ser Thr Asp Arg Tyr Arg Ser Ile Pro 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 56 Phe Gly Leu Gln Pro Thr Gly Asp Ile Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> 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Tyr Gly Lys Gly Phe Ser Pro Tyr Phe His Val Thr 1 5 10 <210> 148 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 148 Tyr Pro His Tyr Ser Leu Pro Gly Ser Ser Thr Leu 1 5 10 <210> 149 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 149 Tyr Pro Ser Leu Leu Lys Met Gln Pro Gln Phe Ser 1 5 10 <210> 150 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 150 Tyr Gln Pro Arg Pro Phe Val Thr Thr Ser Pro Met 1 5 10 <210> 151 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 151 Tyr Ser Ala Pro Leu Ala Arg Ser Asn Val Val Met 1 5 10 <210> 152 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 152 Tyr Thr Arg Leu Ser His Asn Pro Tyr Thr Leu Ser 1 5 10 <210> 153 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 153 Tyr Thr Thr His Val Leu Pro Phe Ala Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 154 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 154 Tyr Thr Trp Gln Thr Ile Arg Glu Gln Tyr Glu Met 1 5 10 <210> 155 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 155 Cys Leu Ser Thr Lys Thr Asn Ile Cys 1 5 <210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 156 Ala Cys Leu Ser Thr Lys Thr Asn Ile Cys 1 5 10 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 157 Cys Thr Thr Pro Ser Lys His Gln Cys 1 5 <210> 158 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BKT-P2-FC polypeptide <400> 158 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Ser Ile Pro Ser His Ser Ile His Ser Ala Lys Ala Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Lys Gly Phe Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 50 55 60 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 65 70 75 80 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 85 90 95 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 100 105 110 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 115 120 125 Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 130 135 140 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 145 150 155 160 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 165 170 175 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 180 185 190 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 195 200 205 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 210 215 220 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 225 230 235 240 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 245 250 255 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 260 265 270 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 <210> 159 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> BKT-P46-FC polypeptide <400> 159 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Leu Asp Tyr Pro Ile Pro Gln Thr Val Leu His His Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Lys Gly Phe Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 50 55 60 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 65 70 75 80 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 85 90 95 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 100 105 110 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 115 120 125 Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 130 135 140 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 145 150 155 160 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 165 170 175 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 180 185 190 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 195 200 205 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 210 215 220 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 225 230 235 240 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 245 250 255 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 260 265 270 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 <210> 160 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human IgG1 Fc (Fc N297A) <400> 160 Phe Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 161 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL6 signal peptide <400> 161 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 <210> 162 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hexapeptide spacer sequence <400> 162 Gly Gly Gly Ser Lys Gly 1 5 <210> 163 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> BKT-P2 peptide DNA coding sequence <400> 163 agcatcccca gccacagcat ccacagcgcc aaggcc 36 <210> 164 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> BKT-P46 peptide DNA coding sequence <400> 164 ctggactacc ctatccctca gaccgtgctg caccac 36 <210> 165 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human IgG1 Fc (Fc N297A) DNA coding sequence <400> 165 ttcgaaccca agagctgtga caagacccac acctgccccc cttgccctgc ccctgagctg 60 ctgggcggac ccagcgtgtt cctgttccct cccaagccta aggacaccct gatgatcagc 120 agaacccccg aggtgacctg tgtggtggtg gatgtgagcc acgaggaccc tgaggtgaag 180 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaatgcca agaccaagcc cagggaggag 240 cagtacgcca gcacctaccg ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg 300 aacggcaagg aatacaagtg taaggtgtcc aacaaggccc tgcctgcccc tatcgagaaa 360 accatcagca aggccaaggg ccagcctagg gagccccagg tgtacaccct gccccctagc 420 agagatgagc tgaccaagaa tcaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 480 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 540 ccccctgtgc tggacagcga tggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggataag 600 agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat 660 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cctggcaagt ga 702 <210> 166 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL6 signal peptide DNA coding sequence <400> 166 atgaacagct tcagcaccag cgccttcggc cccgtggcct tcagcctggg cctgctgctg 60 gtgctgcctg ccgccttccc tgcccccgtg cccccc 96 <210> 167 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spacer DNA coding sequence <400> 167 ggcggcggca gcaagggc 18 <210> 168 <211> 852 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL6-P2-Fc N297A DNA coding sequence <400> 168 atgaacagct tcagcaccag cgccttcggc cccgtggcct tcagcctggg cctgctgctg 60 gtgctgcctg ccgccttccc tgcccccgtg ccccccagca tccccagcca cagcatccac 120 agcgccaagg ccggcggcgg cagcaagggc ttcgaaccca agagctgtga caagacccac 180 acctgccccc cttgccctgc ccctgagctg ctgggcggac ccagcgtgtt cctgttccct 240 cccaagccta aggacaccct gatgatcagc agaacccccg aggtgacctg tgtggtggtg 300 gatgtgagcc acgaggaccc tgaggtgaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 360 cacaatgcca agaccaagcc cagggaggag cagtacgcca gcacctaccg ggtggtgtcc 420 gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaagg aatacaagtg taaggtgtcc 480 aacaaggccc tgcctgcccc tatcgagaaa accatcagca aggccaaggg ccagcctagg 540 gagccccagg tgtacaccct gccccctagc agagatgagc tgaccaagaa tcaggtgtcc 600 ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 660 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccctgtgc tggacagcga tggcagcttc 720 ttcctgtaca gcaagctgac cgtggataag agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc 780 tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc 840 cctggcaagt ga 852 <210> 169 <211> 852 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL6-P46-Fc N297A DNA coding sequence <400> 169 atgaacagct tcagcaccag cgccttcggc cccgtggcct tcagcctggg cctgctgctg 60 gtgctgcctg ccgccttccc tgcccccgtg ccccccctgg actaccctat ccctcagacc 120 gtgctgcacc acggcggcgg cagcaagggc ttcgaaccca agagctgtga caagacccac 180 acctgccccc cttgccctgc ccctgagctg ctgggcggac ccagcgtgtt cctgttccct 240 cccaagccta aggacaccct gatgatcagc agaacccccg aggtgacctg tgtggtggtg 300 gatgtgagcc acgaggaccc tgaggtgaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 360 cacaatgcca agaccaagcc cagggaggag cagtacgcca gcacctaccg ggtggtgtcc 420 gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaagg aatacaagtg taaggtgtcc 480 aacaaggccc tgcctgcccc tatcgagaaa accatcagca aggccaaggg ccagcctagg 540 gagccccagg tgtacaccct gccccctagc agagatgagc tgaccaagaa tcaggtgtcc 600 ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 660 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccctgtgc tggacagcga tggcagcttc 720 ttcctgtaca gcaagctgac cgtggataag agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc 780 tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc 840 cctggcaagt ga 852 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 170 taatacgact cactataggg 20 <210> 171 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 171 ctgtggatgc tgtggctggg gatgctgggg ggcacggggg caggg 45 <210> 172 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 172 cacggtctga gggatagggt agtccagggg gggcacgggg gcagg 45 <210> 173 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 173 cgcttcgaag cccttgctgc cgccgccggc cttggcgctg tggatgctgt ggctgg 56 <210> 174 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 174 cgcttcgaag cccttgctgc cgccgccgtg gtgcagcacg gtctgaggga taggg 55

Claims (53)

  1. 적어도 하나의 케모카인-결합 Fc 도메인 및 이의 분체에 부착된 펩타이드를 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 링커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 링커는 아미노산 링커인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgD Fc 도메인, IgE Fc 도메인 및 IgM Fc 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 상기 Fc 도메인 및 이의 분체의 N 말단에 부착되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 상기 Fc 도메인 및 이의 분체의 C 말단에 부착되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩타이드.
  7. 제2항에 있어서, 상기 링커는 4 개 내지10 개 아미노산들로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 링커는 헥사펩타이드인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  9. 제7항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 162으로 설정된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 9항 중 임의의 한 항에 있어서, 신호 펩타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  12. 제10항에 있어서, 하기 식을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드:
    W-X-Y-Z
    상기 식에서:
    W는 신호 펩타이드이고;
    X는 상기 케모카인-결합 펩타이드이고;
    Y는 상기 링커이고; 및
    Z는 상기 Fc 도메인 및 이의 분체이다.
  13. 제1항 내지 12항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 길이가 10 내지 20 개 아미노산인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 길이가 12 내지 13 개 아미노산인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 14항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및 RANTES로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 케모카인에 결합할 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 12항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 서열번호 1-157로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 케모카인-결합 펩타이드는 BKT-P2 (서열번호 101) 및 BKT-P46 (서열번호 76)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 12항 중 임의의 한 항에 있어서, 케모카인-결합 펩타이드는 서열번호 1-157로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 서열 상동성은 적어도 95%인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  20. 제10항 내지 12항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 IL-6 신호 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 161을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  22. 제20항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 161에 적어도 90% 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  23. 제1항 내지 22항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  24. 제1항 내지 23항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  25. 제24항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  26. 제1항 내지 25항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인 및 이의 분체는 글리코실화되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 Fc 도메인 및 이의 분체는 서열번호 160을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 27항 중 임의의 한 항에 있어서, 적어도 하나의 케모카인이 케모카인 수용체 결합하는 것을 저해하는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  29. 제1항 내지 27항 중 임의의 한 항에 있어서, 적어도 하나의 케모카인이 케모카인 수용체에 결합하는 것을 향상시키는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  30. 제28항 및 29항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 케모카인은 I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및 RANTES으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  31. 제1항 내지 30항 중 임의의 한 항의 폴리펩타이드, 및 약학 허용 담체를 포함하는 약학조성물.
  32. 제31항에 있어서, 포장물에 포장되어 있고, 및 상기 포장물 내 또는 포장물 상에 케모카인의 생물학적 효과를 조절하는 용도가 확인되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  33. 제31항에 있어서, 포장물에 포장되어 있고, 및 상기 포장물 내 또는 포장물 상에, 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택된 상태를 치료하는 용도가 확인된 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  34. 제31항 내지 33항 중 임의의 한 항에 있어서, 정맥내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 및/또는 비강내 투여용으로 제형화 된 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  35. 케모카인의 생물학적 효과를 조절하는 의약의 제조에 사용하는 제1항 내지 30항 중 임의의 한 항의 폴리펩타이드의 용도.
  36. 제35항에 있어서, 상기 의약은 정맥내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 및/또는 비강내 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 용도.
  37. 제1항 내지 30항 중 임의의 한 항의 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 필요한 개체에 투여하여 케모카인의 생물학적 효과를 조절하는 것을 포함하는, 케모카인의 생물학적 효과를 조절하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 및/또는 비강내 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제32 및 35항 내지 37항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 조절하는 것은 저해하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물, 폴리펩타이드, 용도 또는 방법.
  40. 제32항 및 35항 내지 39항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 케모카인은 I-TAC, IP-10, MIG, MCP-1, 이오탁신 및 RANTES로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물, 폴리펩타이드, 용도 또는 방법.
  41. 제32항 및 35항 내지 40항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 생물학적 효과는 염증성 효과, 세포 이동, 종양 성장, 및 암전이로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물, 폴리펩타이드, 용도 또는 방법.
  42. 제1항 내지 30항 중 임의의 한 항에 있어서, 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 비정상적 세포이동, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택되는 상태를 치료하는 용도의 폴리펩타이드.
  43. 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 비정상적 세포이동, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택되는 상태를 치료하는 의약의 제조에 사용되는 것을 특징으로하는 제1항 내지 30항 중 임의의 한 항의 폴리펩타이드의 용도.
  44. 제43항에 있어서, 상기 의약은 정맥내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 및/또는 비강내 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 용도.
  45. 염증, 알레르기, 지연형 과민증, 비적절한 면역반응, 비정상적 세포이동, 자가면역 반응, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 패혈증, 암, 악성세포 성장, 세균성 감염, 바이러스성 감염, 관절염, 대장염, 건선, 죽상동맥경화증, 고혈압, 중증 근무력증 및 재관류 허혈로 구성되는 군으로부터 선택된 상태를 치료하는 방법에 있어서, 제1항 내지 30항 중 임의의 한 항의 필요한 개체에 투여하고, 그럼으로써 상기 케모카인의 생물학적 효과를 조절 및/또는 저해하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 국소 투여 및/또는 비강내 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제1항 내지 30항 중 임의의 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  48. 제47항에 있어서, 서열번호 168 및 서열번호 169로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  49. 제47항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물.
  50. 제49항의 핵산 작제물을 포함하는 세포.
  51. 제50항의 세포를 배양하는 단계 및 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 생성하는 방법.
  52. 수용성 중합체에 부착된 제1항 내지 30항 중 임의의 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 접합체 (conjugate).
  53. 제52항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 접합체.
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