JP6621741B2

JP6621741B2 - Ｃｔｌａ−４に対する親和性が改善したｃｄ８６バリアント

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Inventors: エルマーク，ピーター; フレブリング，クリスティーナ; ダフレン，エバ
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Description

本発明は、ＣＴＬＡ−４、特にヒトＣＴＬＡ−４に特異的に結合するポリペプチドに関する。

癌は、先進国世界における早死の主要な原因である。癌の免疫療法の目的は、腫瘍に対する身体による有効な免疫応答を開始することである。長期持続性抗腫瘍免疫応答の重要なエフェクター細胞は、活性化腫瘍特異的エフェクターＴ細胞である。癌患者は、通常は、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞を有するが、これらＴ細胞の活性は多くの場合、腫瘍微小環境における阻害因子および経路により抑制される。したがって、Ｔ細胞抗腫瘍応答を増強する、癌を予防または治療するための方法が必要とされている。

Ｔ細胞抗腫瘍応答は、Ｔ細胞活性化を増加させることにより増強されうる。Ｔ細胞活性化は、ＭＨＣ複合体により提示される抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体により誘発される。このとき、Ｔ細胞活性化を調節するいくつかのチェックポイントが存在する。たとえば、Ｔ細胞受容体ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の負の調節因子として役立ち、初期活性化後にＴ細胞表面上で上方制御される。ＣＴＬＡ−４受容体のリガンドは、Ｂ７タンパク質（Ｂ７−１およびＢ７−２）であり、これらは抗原提示細胞により発現される。Ｔ細胞活性化の上方制御の原因である対応する受容体は、ＣＤ２８であり、これはＢ７タンパク質への結合についてＣＴＬＡ−４と競合する。したがって、Ｂ７タンパク質とＣＴＬＡ−４の相互作用を遮断するが、Ｂ７タンパク質とＣＤ２８の相互作用を遮断しないことにより、免疫応答の通常のチェックポイントのうちの１つが除去されうるのであり、抗腫瘍Ｔ細胞応答の増強をもたらす。

本発明者らは、ヒトＢ７−２ポリペプチド（ＣＤ８６）の細胞外ドメインに由来する新規ポリペプチドを製造および単離した。ヒトＣＤ８６の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列（シグナル配列なし）を配列番号３に示す。この野生型配列は、位置２４および２５のＮ末端のアラニンおよびプロリンを任意選択で欠いていてもよい。これらのアミノ酸はそれぞれ、本明細書においてＡ２４およびＰ２５と呼ばれうる。シグナル配列を含む、ヒトＣＤ８６の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列を配列番号４に示す。全長ヒトＣＤ８６の野生型アミノ酸配列を配列番号４４に示す。

本発明は、配列番号３のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドであって、野生型ＣＤ８６よりも高い親和性でＣＴＬＡ−４に結合するポリペプチドを提供する。

本発明のポリペプチドは、野生型ヒトＣＤ８６の対応する結合強度比よりも高い、ＣＴＬＡ−４対ＣＤ２８の結合強度比を有していてもよい。ポリペプチドは、任意選択で、野生型ヒトＣＤ８６よりも低い親和性でヒトＣＤ２８に結合してもよい。

個体における疾患または状態を治療または予防するための方法における使用のための本発明のポリペプチドがさらに提供される。

個体における疾患または状態を治療する方法であって、前記個体に本発明によるポリペプチドを投与し、それにより疾患または状態を治療することを含む方法がさらに提供される。

個体における疾患または状態を治療するための医薬の製造における使用のための本発明のポリペプチドがさらに提供される。

ＣＴＬＡ−４、任意選択でヒトまたはマウスＣＴＬＡ−４を発現する細胞の活性化を増加させる方法であって、前記細胞に本発明のポリペプチドを投与することを含み、任意選択で前記細胞はＴ細胞である方法がさらに提供される。

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むベクターまたは細胞がさらに提供される。本発明のポリペプチドを製造する方法であって、細胞において前記ポリヌクレオチドを発現させることを含む方法がさらに提供される。

ＣＴＬＡ−４結合ポリペプチドの同定方法であって、候補ポリペプチドがＣＴＬＡ−４、任意選択でヒトまたはマウスＣＴＬＡ−４への結合について、本発明のポリペプチドと競合するかどうかを決定することを含み、候補ポリペプチドが、配列番号３と同一であるアミノ酸配列を含まない方法がさらに提供される。

配列表の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ００６９８．１に対応する）。
配列番号２は、ヒトＣＤ２８のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５１９４４．１に対応する）。
配列番号３は、Ｎ末端から２３個のアミノ酸のシグナル配列を除く、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４は、Ｎ末端シグナル配列を含む、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外および膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。本明細書におけるアミノ酸位置のすべてのナンバリングは、Ｎ末端から始まる配列番号４における位置に基づく。したがって、配列番号３のＮ末端のアラニンは２４とナンバリングされる。
配列番号５は、Peach et al (Journal of Biological Chemistry 1995, vol 270(36), 21181-21187)に開示のヒトＣＤ８６の細胞外ドメインの変異体形態のアミノ酸配列である。野生型配列の位置７９のＨは、配列番号５の配列の対応する位置において、Ａで置換される。この変化は、本明細書においてＨ７９Ａと呼ばれる。本明細書において参照される他のアミノ酸置換全体を通じて、同じ命名法が使用される。位置のナンバリングは、上述のとおり配列番号４に基づく。
配列番号６から２４は、本発明の特定のタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２５から４３はそれぞれ、配列番号６から２４のそれぞれのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４４は、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＫ４１９３１．１に対応する）。
配列番号４５は、マウスＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列である（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９７９３．１に対応する）。
配列番号４６は、マウスＣＤ２８のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３７３９５．１に対応する）。

ＥＬＩＳＡ結合アッセイにより決定した、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合特性を示す図である。ＥＬＩＳＡ阻害アッセイにより決定した、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合特性を示す図である。本発明の例示的ポリペプチドの抗腫瘍活性を示す図である。ポリペプチドは、対照と比較して有意な抗腫瘍効果を示した（^＊ｐ＜０．０５）。本明細書に開示のヒト野生型ＣＤ８６アミノ酸配列のスキーム図を提供する図である。Ａは、Ｎ末端シグナル配列なしのヒトＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列であり（配列番号３）、Ｂは、Ｎ末端シグナル配列を含む、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外および膜貫通ドメインのアミノ酸配列であり（配列番号４）、Ｃは、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列である（ＧｅｎｂａｎｋＡＢＫ４１９３１．１、配列番号４４）。Ａの配列は、太字で示す位置２４および２５のＮ末端のアラニンおよびプロリンを任意選択で欠いていてもよい。ＢおよびＣにおけるシグナル配列を下線で示す。アミノ酸位置のナンバリングは、Ｎ末端から始まる配列番号４および４４に基づく。本発明のポリペプチドがヒトおよびマウスＣＴＬＡ−４の両方について類似した強度の結合親和性を有することを実証する、阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

本開示の生成物および方法の異なる用途が、当技術分野における特定のニーズに合わせて調整されうることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、本発明の特定の実施形態を記述することのみを目的とし、限定を意図していないこともまた理解されるべきである。

加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に内容上明示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、たとえば、「阻害因子（an inhibitor）」への言及は、２つ以上のかかる阻害因子を含む、または、「オリゴヌクレオチド（an oligonucleotide）」への言及は、２つ以上のかかるオリゴヌクレオチドを含む、等といったことになる。

「ポリペプチド」は、本明細書においてその最も広い意味で使用され、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、または他のペプチド模倣物の化合物を指す。したがって、「ポリペプチド」という用語は、短いペプチド配列ならびにより長いポリペプチドおよびタンパク質も含む。本明細書において使用される「アミノ酸」という用語は、ＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を指す。

本明細書において上または下のいずれであっても引用される刊行物、特許および特許出願は、ここにそれらの全体が参照により組み込まれる。

ヒトＣＤ８６（Ｂ７−２）ポリペプチド
Ｂ７タンパク質、ＣＤ８０およびＣＤ８６（Ｂ７−１およびＢ７−２）は、抗原提示細胞の表面上に発現し、Ｔ細胞受容体ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用する。ＣＤ２８へのＢ７分子の結合は、Ｔ細胞活性化を促進する一方で、ＣＴＬＡ−４へのＢ７分子の結合は、Ｔ細胞の活性化のスイッチをオフにする。Ｂ７タンパク質とＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４との間の相互作用は、免疫活性化および調節において重要な役割を果たす共刺激シグナル伝達経路を構成する。したがって、Ｂ７分子は、経路の一部であり、免疫阻害を解き、それにより患者における免疫を増強するための操作が可能である。

ＣＤ８６タンパク質は単量体であり、２つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインからなる。ＣＤ８６の受容体結合性ドメインは、典型的なＩｇＶセット構造を有しており、一方で膜近接ドメインは、Ｃ１セット様構造を有する。ＣＤ８０およびＣＤ８６の構造は、それら自体で、またはＣＴＬＡ−４との複合体において決定されてきた。ＣＤ８０およびＣＤ８６分子上の接触残基は、可溶性細胞外ドメインにあり、ほとんどがベータシートに位置し、（ＣＤＲ様）ループには位置しない。ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３として提供される。この野生型配列は、位置２４および２５のＮ末端のアラニンおよびプロリンを任意選択で欠いていてもよい。これらのアミノ酸はそれぞれ、本明細書においてＡ２４およびＰ２５と呼ばれうる。

本発明のポリペプチド
本発明は、ＣＴＬＡ−４に結合し、ＣＤ２８にもまた結合しうるポリペプチドに関する。本明細書において使用されるＣＴＬＡ−４という用語は、典型的にはヒトＣＴＬＡ−４を指し、本明細書において使用されるＣＤ２８という用語は、典型的にはヒトＣＤ２８を指すが、他の哺乳動物に由来するＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８、たとえば霊長類またはマウスＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８を指してもよい。ヒトＣＴＬＡ−４およびヒトＣＤ２８の配列はそれぞれ、配列番号１および２に記載されている。マウスＣＴＬＡ−４およびマウスＣＤ２８の配列はそれぞれ、配列番号４５および４６に記載されている。本発明のポリペプチドは、他の哺乳動物に由来するＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８、たとえば霊長類またはマウスＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８に対して、一定の結合親和性を有していてもよい。

本発明のポリペプチドは、その自然状態でＣＴＬＡ−４、特に細胞の表面上に局在するＣＴＬＡ−４に結合する能力を有する。「細胞の表面上に局在する」によって、ＣＴＬＡ−４の１つまたは複数の領域が細胞表面の外面上に存在するように、ＣＴＬＡ−４が細胞と関連付けられることが意図される。たとえば、ＣＴＬＡ−４は、細胞原形質膜内に挿入（すなわち、膜貫通タンパク質として適応）され、１つまたは複数の領域が細胞外表面上に存在してもよい。これは、細胞によるＣＴＬＡ−４の発現の過程で生じうる。したがって、一実施形態において、「細胞の表面上に局在する」は、「細胞の表面上に発現する」を意味することもある。あるいは、ＣＴＬＡ−４は、細胞の外側にあって、共有結合性および／またはイオン性相互作用がそれを細胞表面の特定の領域（複数可）に局在させてもよい。

本発明のポリペプチドは、ヒト野生型ＣＤ８６と比較して異なる特性を有する。具体的には、本発明のポリペプチドは、ヒト野生型ＣＤ８６の標的結合特性と比較して異なる標的結合特性を有する。かかる特性を比較する目的のため、「ヒト野生型ＣＤ８６」は典型的には、前のセクションに記載したとおり、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインを指す。

ヒト野生型ＣＤ８６は、２つの標的、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８に特異的に結合する。したがって、本明細書に記載のポリペプチドの結合特性は、これら標的のそれぞれに結合するポリペプチドの能力の個別の測定値として表すこともできる。たとえば、本発明のポリペプチドは、好ましくは、野生型ヒトＣＤ８６のＣＴＬＡ−４に対する結合親和性よりも高い結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合する。本発明のポリペプチドはまた、任意選択で、野生型ヒトＣＤ８６のＣＤ２８に対する結合親和性よりも低い結合親和性でＣＤ２８に結合してもよい。

リガンドの標的に対する結合能力を評価するための標準的アッセイが当技術分野においてよく知られており、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー解析が含まれる。ポリペプチドの結合動態（たとえば結合親和性）もまた、当技術分野において知られている標準的アッセイ、たとえば表面プラズモン共鳴解析（ＳＰＲ）により評価できる。

「結合活性」および「結合親和性」という用語は、ポリペプチド分子の、標的に結合するまたは結合しない傾向性を指すことが意図されている。結合親和性は、ポリペプチドおよびその標的について解離定数（Ｋｄ）を決定することにより定量できる。より低いＫｄは、標的に対するより高い親和性を示す。同様に、ポリペプチドの、その標的に対する結合の特異性は、ポリペプチドおよび別の非標的分子に関する解離定数と比較した、ポリペプチドのその標的に対する比較解離定数（Ｋｄ）の観点から定義できる。

解離定数Ｋｄの値は、よく知られている方法により直接的に決定でき、Caceci et al. (Byte 9:340-362, 1984)に記載の方法等により、複雑な混合物についてさえも計算できる。たとえば、Ｋｄは、二重フィルターニトロセルロースろ過結合アッセイ、たとえばWong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)により開示のものを使用して確立できる。ポリペプチドの標的に対する結合が、その標的の別の既知のリガンド、たとえば別のポリペプチドによる標的への結合と比較される、競合結合アッセイを実施できる。この場合、野生型ヒトＣＤ８６の可溶性細胞外ドメイン（任意選択で、ＮまたはＣ末端で検出可能ドメイン、たとえばＦｃドメインまたはＩｇドメインに連結している）は、好適な代替リガンドである。５０％阻害が生じる濃度はＫｉとして知られている。理想的条件下で、ＫｉはＫｄと等しい。Ｋｉ値は、Ｋｄより低くなることは決してなく、したがって、Ｋｉの測定は、Ｋｄの上限を与えるために都合よく代替される。

結合親和性の代替的測定値には、ＥＣ５０またはＩＣ５０が含まれる。この文脈において、ＥＣ５０は、ポリペプチドが固定量の標的に対してその最大結合の５０％を達成する濃度を示す。ＩＣ５０は、ポリペプチドが固定量の標的に対する固定量の競合物の最大結合の５０％を阻害する濃度を示す。両方の場合において、より低いレベルのＥＣ５０またはＩＣ５０は、標的に対するより高い親和性を示す。リガンドのその標的に対するＥＣ５０およびＩＣ５０の値は両方とも、よく知られている方法、たとえばＥＬＩＳＡにより決定できる。本発明のポリペプチドのＥＣ５０およびＩＣ５０を評価するのに好適なアッセイは、実施例に記載されている。

本発明は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するポリペプチドに関する。すなわち、本発明のポリペプチドは、好ましくは、それが別の分子に結合するよりも大きな結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合すると考えられる。ポリペプチドは、好ましくは、野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ−４に対する結合親和性よりも高い結合親和性で、ＣＴＬＡ−４に結合する。

好ましくは、ポリペプチドのヒトＣＴＬＡ−４に対するＫｄは、野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ−４に関するＫｄの２分の１以下、２．５分の１以下、３分の１以下、３．５分の１以下、４分の１以下、４．５分の１以下、５分の１以下、５．５分の１以下、８分の１以下または１０分の１以下である。最も好ましくは、ポリペプチドのヒトＣＴＬＡ−４に関するＫｄは、野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ−４に関するＫｄの５分の１以下または１０分の１以下であると考えられる。本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４に関するＫｄを決定するための好ましい方法は、たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ解析である。本発明のポリペプチドのＳＰＲ解析に好適なプロトコルは、実施例に記載されている。

好ましくは、本発明のポリペプチドのヒトＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０は、同条件下の野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ−４に関するＥＣ５０の３分の２以下、２分の１以下、３分の１以下、５分の１以下、１０分の１以下、１２分の１以下、１４分の１以下、１５分の１以下、１７分の１以下、２０分の１以下、２５分の１以下または５０分の１以下である。最も好ましくは、ポリペプチドのヒトＣＴＬＡ−４に関するＥＣ５０は、同条件下の野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ−４に関するＥＣ５０の１０分の１以下または２５分の１以下である。本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４に関するＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介する。本発明のポリペプチドのＥＣ５０の評価における使用のために好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載されている。

好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４との結合について野生型ヒトＣＤ８６と競合するとき、本発明のポリペプチドのヒトＣＴＬＡ−４に関するＩＣ５０は、同条件下の野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０の２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、１０分の１以下、１３分の１以下、１５分の１以下、５０分の１以下、１００分の１以下、または３００分の１以下である。最も好ましくは、ポリペプチドのＩＣ５０は、同条件下の野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０の１０分の１以下または３００分の１以下である。本発明のポリペプチドのＩＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介する。本発明のポリペプチドのＩＣ５０の評価における使用のために好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載されている。

ポリペプチドはまた、ＣＤ２８と特異的に結合してもよい。すなわち、本発明のポリペプチドは、それがＣＴＬＡ−４以外の別の分子に結合するよりも大きな結合親和性でＣＤ２８に結合してもよい。ポリペプチドは、野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＤ２８に対する親和性よりも低い親和性でヒトＣＤ２８に結合してもよい。好ましくは、ポリペプチドのヒトＣＤ２８に関するＫｄは、野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＤ２８に関するＫｄよりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍高い。

本明細書に記載のポリペプチドの結合特性はまた、２つの標的、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８に結合するポリペプチドの能力の相対的測定値として表することもできる。すなわち、ポリペプチドの結合特性は、ＣＴＬＡ−４に結合するポリペプチドの能力に対する、ＣＤ２８に結合するその能力の相対的測定値として表することもできる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４に対してＣＤ２８に結合するヒト野生型ＣＤ８６の相対的能力と比較して、ＣＴＬＡ−４に対してＣＤ２８に結合する相対的能力が増加する。

同じパラメータ（たとえばＫｄ、ＥＣ５０）を使用して、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の両方に対するポリペプチドの結合親和性が評価されるとき、各標的に対するポリペプチドの相対的結合能力は、各標的についてのパラメータの値の単純な比としてすることもできる。この比は、ポリペプチドの結合比または結合強度比と呼ばれうる。結合親和性を評価するために使用される多くのパラメータ（たとえばＫｄ、ＥＣ５０）について、より低い値がより高い親和性を示す。この場合には、ＣＴＬＡ−４に対するＣＤ２８の結合親和性の比は、好ましくは、以下の式により算出される単一の数値として表される。
結合比＝［ＣＤ２８に対する結合親和性］÷［ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性］
あるいは、より高い値がより高い親和性を示すパラメータを使用して結合親和性が評価される場合、上の式の逆数が好ましい。いずれの文脈においても、本発明のポリペプチドは、好ましくは、ヒト野生型ＣＤ８６よりも高い結合比を有する。所定のポリペプチドの結合比と別のポリペプチドの結合比との直接的な比較は、典型的には、結合親和性を評価して両方のポリペプチドの結合比を算出するために、同じパラメータが使用されることが必要であることが認められる。

好ましくは、ポリペプチドの結合比は、ポリペプチドの各標的に対するＫｄを決定し、次に式［ＣＤ２８に対するＫｄ］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＫｄ］により比を算出することにより算出される。この比は、ポリペプチドのＫｄ結合比と呼ばれうる。ポリペプチドの標的に対するＫｄを決定するための好ましい方法は、たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ解析である。本発明のポリペプチドのＳＰＲ解析のための好適なプロトコルは、実施例に記載されている。この方法により算出される本発明のポリペプチドの結合比は、好ましくは、同じ方法により算出される野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも少なくとも２倍または少なくとも４倍高い。

あるいは、ポリペプチドの結合比は、ポリペプチドの各標的に対するＥＣ５０を決定し、次に式［ＣＤ２８に対するＥＣ５０］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０］により比を算出することにより算出されてもよい。この比は、ポリペプチドのＥＣ５０結合比と呼ばれうる。ポリペプチドの標的に対するＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介する。本発明のポリペプチドのＥＣ５０の評価における使用のための好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載されている。この方法により算出される本発明のポリペプチドの結合比は、同じ方法により算出される野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍高い。

本発明のポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４に結合するための本発明の別のポリペプチドと交差競合する（cross-compete）する能力を有する。たとえば、本発明のポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４に結合するための配列番号６から２４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドと交差競合してもよい。かかる交差競合ポリペプチドは、標準的な結合アッセイにおいて同定されてもよい。たとえば、交差競合を実証するために、ＳＰＲ解析（たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたもの）、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーを使用できる。かかるアッセイを、他のＣＴＬＡ−４結合ポリペプチドを同定するために使用できる。かかるアッセイにおける候補は、好ましくは、配列番号３と同一であるアミノ酸配列を含まない。

上の機能特性に加えて、本発明のポリペプチドは、一定の好ましい構造特性を有する。本発明のポリペプチドは、ヒト野生型ＣＤ８６のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列、具体的には、任意選択でＡ２４およびＰ２５を欠く、ヒト野生型ＣＤ８６の可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）を含む。特に、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を含む。「変化している」により、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して少なくとも１つのアミノ酸が欠失しているか、挿入されているか、または置換されていることが意図されている。「欠失している」により、アミノ酸配列が１アミノ酸短くなるように、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）に存在する少なくとも１つのアミノ酸が除去されていることが意図されている。「挿入されている」により、アミノ酸配列が１アミノ酸長くなるように、少なくとも１つの追加のアミノ酸が配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）中に導入されていることが意図されている。「置換されている」により、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）の少なくとも１つのアミノ酸が、代替アミノ酸に置き換えられていることが意図されている。

本明細書におけるアミノ酸は、下に記載するように、完全名、３文字の略号または１文字の略号で呼ばれうる。

典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸が変化している。典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、２個または１個以下のアミノ酸が変化している。任意のこれらの下限が、任意のこれらの上限と組み合わされて、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して許容される変化の数の範囲を定義してもよいことが認められる。したがって、たとえば、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して許容されるアミノ酸変化の数が、２から３、２から４、２から５、２から６、２から７、２から８、２から９、２から１０、３から４、３から５、３から６等の範囲である、アミノ酸配列を含んでいてもよい。

配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、少なくとも２個のアミノ酸が変化していることが特に好ましい。好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して許容されるアミノ酸変化の数は、２から９、２から８または２から７の範囲である。

上述の数および範囲は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較した欠失、挿入または置換の任意の組合せで達成できる。たとえば、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、欠失のみ、挿入のみ、もしくは置換のみ、または欠失、挿入もしくは置換の任意の混合があってもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、すべての変化が置換であるアミノ酸配列を含む。すなわち、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、アミノ酸が欠失も挿入もされていない配列である。好ましい本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個のアミノ酸が置換されており、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、アミノ酸が欠失も挿入もされていない。

好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較した変化は、配列番号３のＦＧループ領域（位置１１４から１２１）および／またはベータシート領域にある。ベータシート領域の鎖は、配列番号３に以下の位置を有する。すなわち、Ａ：２７〜３１、Ｂ：３６〜３７、Ｃ：５４〜５８、Ｃ’：６４〜６９、Ｃ’’：７２〜７４、Ｄ：８６〜８８、Ｅ：９５〜９７、Ｆ：１０７〜１１３、Ｇ：１２２〜１３３。

最も好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較した変化は、３２、４８、４９、５４、７４、７７、７９、１０３、１０７、１１１、１１８、１２０、１２１、１２２、１２５、１２７または１３４から選択される１つまたは複数の位置にある。本明細書におけるアミノ酸位置のすべてのナンバリングは、配列番号４においてＮ末端から始めてアミノ酸を数えることに基づく。したがって、配列番号３のＮ末端の最初の位置は２４とナンバリングされる（図４のスキーム図を参照のこと）。

特に好ましい挿入には、位置１１６と１１７との間に挿入される単一の追加アミノ酸、および／または、位置１１８と１１９との間に挿入される単一の追加アミノ酸が含まれる。挿入されるアミノ酸は、好ましくは、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である。

特に好ましい置換は、位置１２２においてであり、これはアルギニン（Ｒ）である。本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、位置１２２が置換されているアミノ酸配列を含む。位置１２２における最も好ましい置換は、アルギニン（Ｒ）を、リジン（Ｋ）またはアスパラギン（Ｎ）と置き換えるものであり、好ましい順に並べている。この置換は、Ｒ１２２Ｋ／Ｎと呼ばれうる。

他の好ましい置換は、位置１０７、１２１および１２５におけるものであり、これらはそれぞれ、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）およびグルタミン酸（Ｑ）である。位置１２２における置換に加えて、本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、位置１０７、１２１および１２５におけるアミノ酸のうちの少なくとも１つもまた置換されているアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列はまた、位置３２、４８、４９、５４、６４、７４、７７、７９、１０３、１１１、１１８、１２０、１２７および１３４のうちの１つまたは複数において置換されていてもよい。

位置１０７における最も好ましい置換は、ロイシン（Ｌ）を、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはアルギニン（Ｒ）と置き換えるものであり、好ましい順に並べている。この置換は、Ｌ１０７Ｉ／Ｆ／Ｒと呼ばれうる。類似の表示法が本明細書に記載の他の置換のために使用される。位置１２１における最も好ましい置換は、イソロイシン（Ｉ）を、バリン（Ｖ）と置き換えるものである。この置換は、Ｉ１２１Ｖと呼ばれうる。位置１２５における最も好ましい置換は、グルタミン（Ｑ）を、グルタミン酸（Ｅ）と置き換えるものである。この置換は、Ｑ１２５Ｅと呼ばれうる。

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において好ましくありうる他の置換は、以下を含む。すなわち、Ｆ３２Ｉ、Ｑ４８Ｌ、Ｓ４９Ｔ、Ｖ５４Ｉ、Ｖ６４Ｉ、Ｋ７４Ｉ／Ｒ、Ｓ７７Ａ、Ｈ７９Ｄ／Ｓ／Ａ、Ｋ１０３Ｅ、Ｉ１１１Ｖ、Ｔ１１８Ｓ、Ｍ１２０Ｌ、Ｎ１２７Ｓ／ＤおよびＡ１３４Ｔ。

特に好ましい本発明のポリペプチドは、配列番号６から２４の以下のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれからなる。

配列番号６から１４に示すアミノ酸配列は、追加の残基ＡＰをＮ末端に任意選択で含んでいてもよい。配列番号１５から２４に示すアミノ酸配列は、残基ＡＰをＮ末端に任意選択で欠いていてもよい。いずれかの場合において、これらの残基は、配列番号３のＡ２４およびＰ２５に相当する。

本発明のポリペプチドは、任意の好適な手段により調製できる。たとえば、ポリペプチドは、下でより詳細に説明するとおり、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む細胞により発現されうる。あるいは、ポリペプチドを、任意の好適な方法により新規合成できる。

本発明のポリペプチドは、単離または実質的に単離された形態で提供できる。実質的に単離されていることにより、任意の周囲の媒体からの、完全ではないが実質的なポリペプチドの単離がありうることが意図されている。ポリペプチドは、それらの意図された使用に干渉しない担体または希釈剤と混合されていてもよく、それでも実質的に単離されているとみなされる。

本発明のポリペプチドは、別の分子に（直接的または間接的に）結合できる。他の分子は、ポリペプチド、たとえば本発明のポリペプチドのＮまたはＣ末端に結合されたＦｃドメインまたはＩｇドメインであってもよい。本発明のポリペプチドは、アルブミンまたはアルブミン結合モジュールに結合でき、あるいはＰＥＧに結合できる。特定の実施形態において、他の分子は、治療剤または検出可能な標識であってもよい。好適な治療剤には、細胞傷害性部分または薬物が含まれる。

他の分子は、たとえば化学的コンジュゲーションにより、本発明のポリペプチドと直接的に結合されてもよい。他の分子がポリペプチドである場合、本発明のポリペプチドおよび他のポリペプチドは、たとえば融合タンパク質として、ペプチド結合により連結されていてもよい。分子をポリペプチドに結合するための他の方法は、当技術分野において知られている。たとえば、カルボジイミド結合（Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159）を、ドキソルビシンを含む様々な薬剤を、抗体またはペプチドに結合するために使用できる。水溶性カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が、機能的部分を結合部分に結合するために特に有用である。さらなる例として、結合は、過ヨウ素酸ナトリウム酸化とそれに続く適切な反応物の還元的アルキル化により、またはグルタルアルデヒド架橋により達成できる。しかしながら、どの方法が選択されるかにかかわらず、本発明のポリペプチドがその標的結合特性を保持するかどうかの決定がなされなくてはならないことが認められる。

ＣＴＬＡ−４への結合の機能効果
本発明のポリペプチドは、たとえばＣＴＬＡ−４を発現する細胞、たとえばＴ細胞に投与されるとき、ＣＴＬＡ−４からのシグナル伝達を調節してもよい。好ましくは、結合性ドメインは、前記シグナル伝達を減少させ、すなわちそれを阻害または遮断し、それにより前記細胞の活性化を増加させる。薬剤（たとえば本発明のポリペプチド）の投与の結果としてのＣＴＬＡ−４シグナル伝達および細胞活性化における変化は、任意の好適な方法により決定されてもよい。好適な方法には、薬剤の存在下または好適な対照の存在下で、Ｔ細胞の表面上に発現するＣＴＬＡ−４に結合し、それを通じてシグナル伝達する（たとえばラージ細胞上の）膜結合性ＣＤ８６の能力のアッセイが含まれる。対照の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生のレベルおよび／またはＴ細胞増殖に対する、薬剤の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生のレベルの増加またはＴ細胞増殖の増加は、ＣＴＬＡ−４を通じたシグナル伝達の減少および細胞活性化の増加を示す。このタイプの典型的なアッセイは、ＵＳ２００８０２３３１２２の実施例９に開示されている。

ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のポリペプチドをコードしていてもよい。「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さの核酸の重合体形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、単離または実質的に単離された形態で提供できる。実質的に単離されていることにより、任意の周囲の媒体からの、完全ではないが実質的なポリペプチドの単離がありうることが意図されている。ポリヌクレオチドは、それらの意図された使用に干渉しない担体または希釈剤と混合されていてもよく、それでも実質的に単離されているとみなされる。

選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な調節配列の制御下に置かれたときに、インビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。本発明の目的のため、かかる核酸配列には、ウイルス、原核生物または真核生物ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡまたはＲＮＡに由来するゲノム配列、および合成ＤＮＡまでもが含まれうるが、これに限定されるものではない。転写終結配列は、コーディング配列の３’側に位置する。

一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、下に記載の配列番号２５から４３のうちのいずれか１つを含む。

あるいは、好適なポリヌクレオチド配列は、これらの特定のポリヌクレオチド配列のうちの１つのバリアントであってもよい。たとえば、バリアントは、任意の上の核酸配列の置換、欠失または付加バリアントであってもよい。バリアントポリヌクレオチドは、配列表に記載した配列からの１個、２個、３個、４個、５個、１０個まで、２０個まで、３０個まで、４０個まで、５０個まで、７５個までまたはそれを超える核酸置換および／または欠失を含んでいてもよい。

好適なバリアントは、本明細書に開示の核酸配列のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドと少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％それと相同であってもよい。好ましくは、これらのレベルの相同性および同一性が、少なくともポリヌクレオチドのコーディング領域に関して存在する。相同性の測定方法は、当技術分野においてよく知られており、本発明の文脈において、相同性は核酸同一性に基づき算出されることが当業者により理解される。かかる相同性は、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば少なくとも４０個、６０個、１００個、２００個またはそれを超える連続ヌクレオチドの領域にわたって存在していてもよい。かかる相同性は、未修飾ポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在していてもよい。

ポリヌクレオチド相同性または同一性の測定方法は、当技術分野において知られている。たとえば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（たとえばそのデフォルト設定で使用される）（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。

ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムもまた、相同性またはラインアップ配列（line up sequences）を算出するために（典型的にはそれらのデフォルト設定で）、たとえばAltschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり使用できる。

ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて誰でも入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列の同じ長さのワードとアラインしたときに、いくつかの正の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、問い合わせ配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（neighbourhood word score threshold）（Altschul et al、上に記載）と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含有するＨＳＰを見つけるためのサーチを開始するためのシードとして働く。ワードヒットは、蓄積アラインメントスコアが増加しうる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向のワードヒットの伸長は、１つまたは複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積により、蓄積アラインメントスコアが０以下になるとき、またはいずれかの配列の末端に到達するときに、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは１１のワード長（w）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（E）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計的解析を実施する。たとえば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の尺度の１つは、最小和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然で生じる確率の指標を提供する。たとえば、配列が別の配列に類似するとみなされるのは、第１の配列を第２の配列と比較した最小和確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合である。

ホモログは、関係するポリヌクレオチドにおける配列と、３個、５個、１０個、１５個、２０個またはそれを超えるよりも少ない変異（そのそれぞれが、置換、欠失または挿入であってもよい）で異なっていてもよい。これらの変異は、ホモログの、少なくとも３０個、たとえば少なくとも４０個、６０個または１００個を超える連続ヌクレオチドの領域にわたって測定されてもよい。

一実施形態において、バリアント配列は、遺伝コードの冗長性ゆえに、配列表に記載の特定の配列から変化してもよい。ＤＮＡコードは、４つの主な核酸残基（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）を有し、これらを、生物の遺伝子にコードされたアミノ酸、タンパク質を表す３文字のコドンを「つづる」ために使用する。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直線配列は、それらの遺伝子によりコードされたタンパク質におけるアミノ酸の直線配列に翻訳される。コードは高度に縮重しており、２０の天然アミノ酸をコードする６１個のコドンおよび「終止」シグナルを表す３つのコドンがある。したがって、ほとんどのアミノ酸が、２つ以上のコドンによりコードされており、実際のところいくつかは、４つ以上の異なるコドンによりコードされている。したがって、本発明のバリアントポリヌクレオチドは、同じポリペプチド配列を本発明の別のポリヌクレオチドとしてコードしうるが、同じアミノ酸をコードする異なるコドンの使用により、異なる核酸配列を有しうる。

したがって、本発明のポリペプチドは、それをコードし、発現可能なポリヌクレオチドから製造できるか、またはその形態で送達できる。

本発明のポリヌクレオチドは、例としてSambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)に記載のとおり、当技術分野においてよく知られている方法により合成できる。

本発明の核酸分子は、挿入配列に作動可能に連結されている制御配列を含み、それゆえインビボでの本発明のポリペプチドの発現を可能にする、発現カセットの形態で提供できる。これらの発現カセットは今度は、典型的には、ベクター（たとえば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター）内に提供される。かかる発現カセットは、宿主対象に直接投与できる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主対象に投与できる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して調製および／または投与される。好適なベクターは、十分量の遺伝情報を運搬可能であり、本発明のポリペプチドの発現を可能にする任意のベクターでありうる。

したがって、本発明は、かかるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。かかる発現ベクターは、分子生物学の分野における常法により構築され、たとえば、プラスミドＤＮＡおよび適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素、たとえば必要でありうるポリアデニル化シグナルの使用を伴いうるのであり、これらは、本発明のペプチドの発現を可能にするために正しい方向で配置される。他の好適なベクターは、当業者にとって明らかである。

本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するように改変された細胞を含む。かかる細胞は、一過性の、または好ましくは安定的な高等真核細胞株、たとえば哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞、下等真核細胞、たとえば酵母菌、または原核細胞、たとえば細菌細胞を含む。本発明のポリペプチドをコードするベクターまたは発現カセットの挿入により改変できる細胞の特定の例には、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＳ０およびＣＯＳ細胞が含まれる。好ましくは、選択される細胞株は、安定的であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化および細胞表面発現を可能にするものである。

本発明のかかる細胞株は、本発明のポリペプチドを製造するために常法を使用して培養でき、本発明の抗体を対象に送達するために治療的または予防的に使用できる。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターを、エクスビボで対象に由来する細胞に投与し、その後細胞を対象の身体に戻すことができる。

医薬製剤、治療的および他の使用、および患者群
別の一態様において、本発明は、本明細書に記載の本発明の分子、たとえばポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞を含む組成物を提供する。たとえば、本発明は、１つまたは複数の本発明の分子、たとえば１つまたは複数の本発明のポリペプチドと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。

本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性である、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、非経口、たとえば静脈内、筋内または皮下投与（たとえば注射または注入による）に好適である。投与経路に応じて、ポリペプチドを物質で被覆して、ポリペプチドを不活性化または変性させうる酸および他の自然条件の作用からポリペプチドを保護できる。

好ましい薬学的に許容される担体には、水性担体または希釈剤が含まれる。本発明の組成物において用いることのできる好適な水性担体の例には、水、緩衝水および生理食塩水が含まれる。他の担体の例には、エタノール、ポリオール、（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物、植物油、たとえばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、たとえばオレイン酸エチルが含まれる。たとえば、被覆剤、たとえばレシチンの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持できる。多くの場合、組成物中に等張剤、たとえば、糖、多価アルコール、たとえばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。

本発明の組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤をさらに含んでいてもよい。これらの組成物は、補助剤、たとえば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤をさらに含有していてもよい。微生物の存在の防止は、上の滅菌手順、ならびに、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の含有の両方により確保できる。等張剤、たとえば糖、塩化ナトリウム等を組成物中に含むこともまた所望されてもよい。加えて、吸収を遅らせる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの含有により、注射可能な医薬形態の持続的吸収がもたらされうる。

治療組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で滅菌され、安定的でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬物濃度に好適な他の秩序立った構造として製剤化できる。

滅菌注射可能溶液は、活性物質（たとえばポリペプチド）を必要な量で、上に挙げた成分の１つまたは組合せとともに適切な溶媒中に組み込むことにより調製でき、必要であれば、続けて滅菌精密ろ過できる。一般に、分散液は、基本の分散媒体および上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体中に活性物質を組み込むことにより調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好適な調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それらは、活性物質と任意の追加の所望の成分との粉末を、以前に滅菌ろ過したそれらの溶液からもたらす。

特に好ましい組成物は、全身投与または局所投与のために製剤化される。局所投与は、腫瘍の部位においてであっても、腫瘍流入領域リンパ節内にであってもよい。組成物は、好ましくは、一定期間にわたる徐放のために製剤化できる。したがって、組成物は、マトリクス促進徐放において、またはその一部として提供できる。好ましい徐放マトリクスは、モンタニドまたはγ−ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）ナノ粒子を含んでいてもよい。任意選択で持続的な期間にわたる本発明のポリペプチドの局所放出は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの投与と関連付けられる潜在的な自己免疫副作用を減少させうる。

本発明の組成物は、本発明のポリペプチドとともに追加の活性成分を含んでいてもよい。上述のとおり、本発明の組成物は、１つまたは複数の本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。本発明の組成物は、追加の治療剤または予防剤をさらに含んでいてもよい。

ポリペプチドまたは他の本発明の組成物および使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、１つまたは複数の追加の試薬、たとえば上で論じた追加の治療剤または予防剤をさらに含んでいてもよい。

本発明によるポリペプチドは、治療または予防において使用されてもよい。治療用途において、ポリペプチドまたは組成物は、障害または状態にすでに罹患している対象に、状態または１つもしくは複数のその症状を治癒、緩和または部分的抑止するのに十分な量で投与される。かかる治療処置は、疾患症状の重症度の減少、または症状のない期間の頻度もしくは持続性の増加をもたらしうる。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。予防用途において、ポリペプチドまたは組成物は、まだ障害または状態の症状を示していない対象に、症状の発症を予防するか、または遅滞させるのに十分な量で投与される。かかる量は、「予防有効量」として定義される。対象は、任意の好適な手段により、疾患または状態を発症するリスクのあるものとして同定されてもよい。

所定の目的のための有効量は、対象の体重および一般的状態とともに、障害または状態の性質および重症度に依存する。本明細書において使用される「対象」という用語は、任意のヒトを含む。

特に、本発明のポリペプチドは、癌の治療または予防において有用でありうる。したがって、本発明は、癌の治療または予防における使用のための本発明のポリペプチドを提供する。本発明はまた、個体に本発明のポリペプチドを投与することを含む、癌を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、癌を治療または予防するための医薬の製造における使用のための本発明のポリペプチドを提供する。

癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頚癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫またはグリア芽腫であってもよい。

本発明のポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む組成物は、１つまたは複数の投与経路を介して、当技術分野において知られている１つまたは複数の多様な方法を使用して投与できる。当業者により認められているとおり、投与の経路および／または方式は、所望の結果に応じて変化する。全身投与または局所投与が好ましい。局所投与は、腫瘍の部位においてであっても、腫瘍流入領域リンパ節内にであってもよい。本発明のポリペプチドまたは組成物のための好ましい投与方式には、注射または注入による、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与方法が含まれる。本明細書において使用される「非経口投与」という文言は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与方式を意味する。あるいは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、非経口でない方式、たとえば局所、表皮または粘膜投与方式を介して投与できる。

本発明のポリペプチドの好適な用量は、熟練の医師により決定できる。本発明の医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与方式について、患者に対して毒性を有することなしに、所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変化しうる。選択される用量レベルは、用いられる特定のポリペプチドの活性、投与経路、投与時間、ポリペプチドの排出率、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態および以前の病歴等、医療分野でよく知られている要因を含む、多様な薬物動態学的要因に依存すると考えられる。

本発明のポリペプチドの好適な用量は、たとえば、治療される患者の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから約１００ｍｇの範囲であってもよい。たとえば、好適な用量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１μｇから約１０ｍｇ、または１日当たり体重１ｋｇ当たり約１０ｇから約５ｍｇであってもよい。

投与計画は、最適な所望の反応（たとえば、治療反応）を提供するために調整されてもよい。たとえば、単回ボーラスを投与でき、複数回に分けられた用量を経時的に投与でき、または治療状況の要求に示されるとおり用量を比例的に減少または増加させることができる。投与の簡便性および用量の均一性のために、非経口組成物を用量単位形態で製剤することがとりわけ有利である。本明細書において使用される用量単位形態は、治療される対象のための単回用量に合わせて物理的に区分された単位を指し、各単位は、必要な医薬担体とともに所望の治療効果をもたらすよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。

ポリペプチドを、単回投与または複数回投与で投与できる。複数回投与は、同じまたは異なる経路を介して、同じまたは異なる部位に投与できる。あるいは、ポリペプチドは、上述の徐放製剤として投与でき、この場合には、より低い頻度の投与が必要である。用量および頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期および所望の治療期間に応じて変化しうる。投与の用量および頻度はまた、処置が予防的か治療的かどうかに応じて変化しうる。予防的用途においては、相対的に低い用量を、相対的に低い頻度の間隔で長期間にわたり投与できる。治療的用途においては、相対的に高い用量を、たとえば患者が疾患の症状の部分または完全寛解を示すまで投与できる。

２種以上の薬剤の併用投与が、数多くの異なる仕方で達成できる。一実施形態において、ポリペプチドおよび他の薬剤を単一の組成物において一緒に投与できる。別の一実施形態において、ポリペプチドおよび他の薬剤を、別々の組成物において併用療法の一部として投与できる。たとえば、調節因子を、他の薬剤の前、後、またはそれと同時に投与できる。

本発明のポリペプチドまたは組成物は、ヒトＣＴＬＡ−４を発現する細胞の活性化を増加させる方法であって、前記細胞に、本発明のポリペプチドまたは組成物を、前記細胞と本発明のポリペプチドとの間の相互作用を許容するのに好適な条件下で投与することを含む方法においても使用されうる。細胞は、典型的には、Ｔ細胞である。この方法は、典型的には、エクスビボで実施される。

本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらはさらに限定するものと解釈されるべきではない。本出願において引用されるすべての図およびすべての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
実施例

第１選択
イントロダクション
本発明のポリペプチドの製造のための出発物質は、ヒトＣＤ８６の単量体可溶性細胞外結合性ドメインであった。すなわち、ヒトＣＤ８６のＣＴＬＡ−４結合性ドメインである。このドメインのアミノ酸配列およびＣＴＬＡ−４と複合したＣＤ８６の構造モデル（Schwartz et al; Nature 2001; 410(6828) p604-608）を、候補ポリペプチドの４つの異なる出発ファージディスプレイライブラリーを設計するために使用した。すなわち、ＡＬ−１０１４−０１、ＡＬ−１０１４−０２、ＡＬ−１０１４−０３およびＡＬ−１０１４−０４である。標準的プロトコルを使用し、候補ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用して、ファージディスプレイライブラリーを製造した。候補ポリペプチドのアミノ酸配列は、下に記載のとおり設計した。

ライブラリー設計
ライブラリーＡＬ−１０１４−０１の設計の主目的は、ＣＴＬＡ−４との相互作用のための、ＣＤ８６の結合性ドメインの結合表面の増加を提供することであった。この目的のため、ＣＤ８６のＦＧループ（位置１１４から１２１、図４におけるナンバリング）における様々な残基を変異のため選択した。ＦＧループの伸長を可能にする２つの挿入もまた導入した。ＣＤ８６の野生型配列に対する位置および導入変異を、下の表１に要約した。各位置において許容される可変性が示される。表１に示すすべての可能な変異の組合せから生じるすべての可能なポリペプチドをコードするヌクレオチドを設計し、ＡＬ−１０１４−０１ファージディスプレイライブラリーを標準的プロトコルにより製造するために使用した。

ライブラリーＡＬ−１０１４−０２において、ＣＴＬＡ−４に面するＣＤ８６の結合表面におけるアミノ酸位置が、野生型アミノ酸と非常に限定された数の相同残基との間で変化することを可能にし、ＣＤ８６のベータシート表面に最小限の構造摂動を導入した。ライブラリーＡＬ−１０１４−０２の位置および導入変異を、表２に示す。位置７９の変異は、ＣＤ８６のＣＴＬＡ−４に対する結合に好ましく寄与することが報告されており（Peach et al; Journal of Biological Chemistry 1995; 270 p21181-21187）、この位置もまたライブラリーにおいて変化することを可能にした。各位置において許容される可変性が示される。表２に示すすべての可能な変異の組合せから生じるすべての可能なポリペプチドをコードするヌクレオチドを設計し、ＡＬ−１０１４−０２ファージディスプレイライブラリーを標準的プロトコルにより製造するために使用した。表２はまた、対応するヌクレオチド配列において示された変異を表すのに使用されたＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコードを示す。ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコードは、典型的には、所定の位置における複数のヌクレオチドの可能性を定義するために使用され、ヌクレオチド配列において不完全に特定されている塩基のために認められている命名規則のセットに基づく（Biochem. J., 1985, 229, 281-286；Eur. J. Biochem., 1985, 150, 1-5; J. Biol. Chem., 1986, 261, 13-17；Mol. Biol. Evol., 1986, 3, 99-108；Nucl. Acids Res., 1985, 13, 3021-3030；Proc. Nat. Acad. Sci. (U. S.), 1986, 83, 4-8；およびBiochemical Nomenclature and Related Documents 2nd edition, Portland Press, 1992, pp 122-126を参照のこと）。これらの実験において使用されたＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコードを下の表２に要約する。

さらに２つのライブラリーを設計した。これら２つのライブラリーにおいて、ＣＤ８６のＩｇＧＶドメイン全体が、野生型ＣＤ８６をコードするヌクレオチド配列を取り上げ、変異バイアスを最小化するためにエラープローンＰＣＲ法セットアップを使用することにより、ランダム化された。得られた変異体ヌクレオチド配列を、ファージディスプレイライブラリーを標準的プロトコルにより製造するために使用した。

３つの異なるランダム変異誘発ライブラリーを生成し、そのうち２つを選択した。ランダム化ラウンド２からＡＬ−１０１４−０３を取り上げ、ランダム化ラウンド３はＡＬ−１０１４−０４を提供した。

ＡＬ−１０１４−１、ＡＬ−１０１４−２、ＡＬ−１０１４−３およびＡＬ−１０１４−０４を、ファージミドベクターへとクローニングすることにより製造し、標準的プロトコルによりファージストックを生成した。

選択方略
本実施例において適用した選択方略は、６回のラウンド（Ｒ１からＲ６）からなり、これを表３に要約する。

選択の第１ラウンド（Ｒ１）は、出発ライブラリーＡＬ−１０１４−０１、ＡＬ−１０１４−０２、ＡＬ−１０１４−０３およびＡＬ−１０１４−０４のメンバーを、ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃγ（５０ｎＭ）へのバインダーのために富化した。機能的バインダーのための富化をシークエンシングにより確認した。

Ｒ１からのアウトプットは、機能的バインダーのために富化された、各出発ライブラリーからのファージクローンのプールであった。ライブラリーＡＬ−１０１４−０３およびＡＬ−１０１４−０４からのアウトプットを、その後組み合わせて新しいライブラリーＡＬ−１０１４−０５とした。ライブラリーＡＬ−１０１４−０１、ＡＬ−１０１４−０２およびＡＬ−１０１４−０４からのアウトプットを、組み合わせて新しいライブラリーＡＬ−１０１４−０６とした。次に、ライブラリーＡＬ−１０１４−０５およびＡＬ−１０１４−０６のメンバーを、５回の追加スクリーニングラウンド（Ｒ２からＲ６）にかけて、ＣＴＬＡ−４への結合の増加およびＣＤ２８への結合の減少について選択した。

追加の５回の選択ラウンドのための方略は、親和性、オンレート、オフレート、選択性、多量体化およびエピトープ維持の特性の改善を特に目的とした選択圧を適用するというものであった。

親和性の増加についての選択は、各ラウンドの抗原濃度を下げることにより達成した。選択は、５０ｎＭＣＴＬＡ−４で始まり、５ｎＭに下げてこれをラウンドＲ２、Ｒ４およびＲ５で維持し、その後最終ラウンド（Ｒ６）でＣＴＬＡ−４濃度は２ｎＭであった。オンレートの増加についての選択は、ビオチン化ＣＴＬＡ−４でのインキュベーション時間を短縮することにより達成した。オフレートの減少についての選択は、洗浄ステップ中のストリンジェンシーを増加させることにより達成した。ＣＴＬＡ−４の選択性の増加（およびＣＤ２８への結合親和性の減少）についての選択は、過量の非ビオチン化ＣＤ２８−Ｆｃ中でインキュベートすることにより達成した（Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６において）。マウスＣＴＬＡ−４への結合親和性の維持は、選択抗原としてビオチン化マウスＣＴＬＡ−４をヒトＣＴＬＡ−４の代わりに使用したラウンド（Ｒ３）を含めることにより確保した。マウスＣＴＬＡ−４への親和性が維持されて、マウスモデルにおける概念実証実験を可能にすることを保証するために、このステップを含めた。結合力効果について選択することは、非ビオチン化ＣＴＬＡ−４を、ビオチン化ＣＴＬＡ−４でのインキュベーション開始の５分後に導入することにより回避した（Ｒ５およびＲ６において）。選択緩衝液への非ビオチン化Ｆｃγ（ＩｇＧ）の添加を、ＣＴＬＡ−４抗原のＦｃ融合部分へのバインダーを選択するのを回避するために実施した。

温度感受性の減少および融点の潜在的増加が、増加した温度（６０℃）で選択ステップを導入することにより得られた（Ｒ４）。低ｐＨでの親和性の増加に、より低いｐＨでの選択ラウンドを導入することにより対処した（Ｒ６）。

選択ラウンド後、Ｒ５およびＲ６からの個々のファージクローンを、従来の親和性ＥＬＩＳＡアッセイにおけるハイスループットスクリーニングにより解析した。アッセイは、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８のいずれかに対するファージの結合を測定するサンドイッチＥＬＩＳＡであった。簡潔に述べると、９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を、一晩４℃でインキュベートすることにより、ＣＴＬＡ４−Ｆｃγ（Ｏｒｅｎｃｉａ、Ａｐｏｔｅｋｅｔ）またはＣＤ２８−Ｆｃγ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ３４２−ＣＤ）のいずれかでコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％粉乳（Ｓｅｍｐｅｒ）中でブロッキングした。プレートを再び洗浄し、試料または対照をウェルに添加した。試料を１時間室温でインキュベートし、次に洗浄した。検出抗体、マウス抗Ｍ１３−ＨＲＰ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２７−９４２１−０１）を添加し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。

選択されたポリペプチドの発現およびリクローニング
実施例１から選択されたファージクローンを、標準的プロトコルにより、融合タンパク質フォーマット内にリクローニングし、各クローンをγ２／γ４Ｆｃに融合した。融合タンパク質をＨＥＫ２９３細胞内で発現させた。細胞の培養上清を回収し、下に記載の方法によりＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ（商標）の両方を使用して発現した融合タンパク質をアッセイした。結果を表４に示し、これはまた各クローンに存在する変異を示す。ＥＬＩＳＡアッセイ（９０７）で最も性能の良いクローンは、野生型タンパク質ＣＤ８６よりもほぼ１０倍高いＥＣ５０結合比を有していた。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ（９０４）で最も性能の良いクローンは、野生型タンパク質ＣＤ８６よりも４倍超高いＫｄ結合比を有していた。

結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を、一晩４℃でインキュベートすることにより、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ３４２−ＣＤ）のいずれかでコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。プレートを再び洗浄し、試料または対照（１／５に連続希釈２００〜０．００１μｇ／ｍｌ）をウェルに添加した。試料を１時間室温でインキュベートし、次に洗浄した。検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９−０３５−０９８）を添加し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。ＥＣ５０値をＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の両方について算出した。結合比（ＥＣ５０結合比＝［ＣＤ２８に対するＥＣ５０］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０］）を、各ポリペプチドについて算出し、表４に示した。

Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）
ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ３４２−ＣＤ）を、従来のアミン結合を使用してＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーチップ、ＣＭ５に固定化した。ＣＤ８６変異体分子および対照（１／２に連続希釈１００〜１．５ｎＭ）を、ＨＢｓ−Ｐ（ＧＥ、ＢＲ−１００３−６９）における結合について流速３０μｌ／ｍｌで解析した。会合が３分間、解離が１０分間続いた。５ｍＭＮａＯＨを３０秒間使用して再生を２度実施した。動態パラメータおよび親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアを使用して算出した。結合比（Ｋｄ結合比＝［ＣＤ２８に対するＫｄ］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＫｄ］）を、各ポリペプチドについて算出し、表４に示した。

表５は、選択されたクローンのそれぞれにおける変異および位置を要約する。クローン９００、９０１、９０４、９０６、９０７、９０８、９１０、９１５および９３８についての完全アミノ酸配列をそれぞれ、配列番号６から１４として提供する。

拡張されたライブラリー多様性および反復選択およびスクリーニング。
ライブラリー製造
２つのさらなるライブラリーＡＬ−１０１４−１１およびＡＬ−１０１４−１２の出発物質は、実施例１および２において同定された６つのクローン、すなわち、９０１、９０４、９０６、９０７、９０８、９１５であった。リアセンブリＰＣＲステップ（reassembly PCR step）に含まれる変異オリゴでのエラープローンＰＣＲにより、ＷＯ２００２０４８３５１、ＷＯ２００３０９７３４、およびＷＯ２００７０５７６８２に記載のプロトコルに従い追加の多様性を生じた。適用されたオリゴは、ＣＤ８６分子のホットスポット領域における変異を含んでいた。各ライブラリーからおよそ２０個のクローンをシークエンシングした。２つのライブラリーは、組換えクローン、エラープローンＰＣＲ生成クローン、および変異オリゴの導入により製造されたクローンを含有していた。各クローンは、ＣＤ８６の野生型配列と比較して平均して３個〜１１個の変異を含有していた。

選択方略
実施例１に記載の選択ラウンドＲ２からＲ６を、ライブラリーＡＬ−１０１４−１１およびＡＬ−１０１４−１２の両方に適用した。最後の２回のラウンドにおいて選択されたクローンをシークエンシングし、組換えおよび新規変異が得られたことを確認した。

選択されたクローンの評価
最後の２回の選択ラウンドからのおよそ１２５０個のクローンを、ファージストックとして発現させ、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８との結合について、実施例１に記載の同じハイスループットスクリーニングＥＬＩＳＡにより解析した（データは示さず）。クローンをそれらのＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８との結合に基づき順位付けした。上位１０個のクローンを、ＣＴＬＡ−４への高い結合性およびＣＤ２８への低い結合性の基準に基づき選択した。これらクローンの配列を決定し、それぞれをＨＥＫ２９３細胞からガンマ２／ガンマ４融合として、実施例２に記載のとおり発現させた。

表６は、上位１０個のクローンのそれぞれにおける変異および位置を要約する。クローン１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６および１０４７についての完全アミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１５から２４として提供する。

上位１０個のポリペプチドのさらなる評価
実施例３において選択された１０個のクローンそれぞれからのポリペプチドを、さらに以下のとおり特徴付けた。

発現および精製
各クローンをコードするプラスミドを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３−Ｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に標準的プロトコルによりトランスフェクトし、上清を６日目に回収した。ポリペプチドおよび対照を、プロテインＡカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ＃１７−０４０２−０１）を使用して親和性精製した。

結合ＥＬＩＳＡ
実施例２に記載のプロトコルと同様に、９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を、４℃で一晩インキュベートすることにより、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（ＳｉｍｏｎＤａｖｉｓ、オクスフォード大学の好意により提供）のいずれかでコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。プレートを再び洗浄し、試料または対照（１／３に連続希釈５００００〜０００１ｎＭ）をウェルに添加した。試料を１時間室温でインキュベートし、次に洗浄した。検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９−０３５−０９８）を添加し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。

ＣＴＬＡ−４結合ＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。ＥＣ５０値を算出し、表７に示す。すべての分子は、野生型およびＨ７９Ａの両方よりも良好なＥＣ５０値を示し、２から６７倍の間の改善であった。ＣＤ２８の結合性は低すぎてこのアッセイによって検出できなかった（データは示さず）。

阻害ＥＬＩＳＡ
９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を４℃で一晩インキュベートすることにより、野生型ＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ＃７６２５−Ｂ２）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。試料（ＣＤ８６変異体または野生型タンパク質、１／４に連続希釈３００００から０．３ｎｇ／ｍｌ）をビオチン化ＣＴＬＡ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）で、室温で１時間インキュベートし、次に混合物をＥＬＩＳＡプレートのブロッキングされたウェルに添加した。検出をストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ＃２１１２６）で実施し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。結果を表２に示す。ＩＣ５０値を算出し、表８に示す。すべての分子は、野生型およびＨ７９Ａの両方よりも良好なＩＣ５０値を示し、最良の変異体ＣＤ８６分子のＩＣは、野生型と比較して１００倍超改善した。

Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）
実施例２におけるように、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（ＳｉｍｏｎＤａｖｉｓ、オクスフォード大学の好意により提供）のいずれかを、従来のアミン結合を使用してＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーチップ、ＣＭ５に固定化した。ＣＤ８６変異体分子および対照（１／３に連続希釈１０００〜４ｎＭ）を、ＨＢｓ−Ｐ（ＧＥ、ＢＲ−１００３−６９）における結合について流速３０μｌ／ｍｌで解析した。会合が３分間、解離が１０分間続いた。５ｍＭＮａＯＨを３０秒間使用して再生を２度実施した。動態パラメータおよび親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアを使用して算出した。

ＣＴＬＡ−４に対するそれぞれの選択されたクローンおよび野生型ＣＤ８６のＣＴＬＡ−４の結果を表９に要約する。各クローンに存在する変異もまた示す。Peach et al (Journal of Biological Chemistry 1995, vol 270(36), 21181-21187)からのＨ７９Ａ変異のみを含むクローンもまた、比較のために含めた。ＣＤ２８の結果は示さない。なぜなら、ほとんどの場合、ＣＤ２８に対する親和性は弱すぎてこのプロトコルにより決定できなかったからである。しかしながら、それが決定できた場合には、選択されたＣＤ８６クローンのＣＤ２８に対する親和性は、ＣＴＬＡ−４に関するものの１００分の１以下である。

選択されたクローンがマウスＣＴＬＡ−４にも結合することもまた決定した（データは示さず）。

クローン９０４に由来する例示的ポリペプチドの抗腫瘍活性
本発明の例示的変異体ＣＤ８６分子、９０４の抗腫瘍活性を、マウス膀胱癌細胞を接種したＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて研究した。簡潔に述べると、２．５×１０^５個のマウス膀胱癌細胞、ＭＢ４９を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部内に皮下注射した（１群あたりｎ＝８）。７日目、１０日目および１３日目に、本発明の変異体ＣＤ８６分子（９０４）、またはアイソタイプ対照を、１００μｌ用量で原発腫瘍への腫瘍周囲（ｐ．ｔ．）注射により動物に投与した。実験を通じて、キャリパーを使用して腫瘍成長および生存をモニタリングし、楕円体積式：＝４／３^＊π^＊ａ（長さの半径）^＊ｂ（幅の半径）^＊ｃ（深さの半径）により腫瘍サイズを算出した。腫瘍が１ｃｍ^３を超えた場合または潰瘍が生じた場合、マウスを屠殺した。結果を図３に示す。倫理的考慮から第１のマウスを屠殺した２３日目の腫瘍体積データを示す。変異体ＣＤ８６分子は、対照と比較して有意な腫瘍効果を示した（^＊ｐ＜０．０５）。

クローン１０４０に由来する例示的ポリペプチドのマウスＣＴＬＡ−４に対する交差反応性
本発明の例示的変異体ＣＤ８６分子、１０４０のマウスおよびヒトＣＴＬＡ−４に対する相対親和性を、阻害ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して調査した。これら実験において使用された１０４０分子は、二重特異性分子の一部として抗ＣＤ４０抗体にコンジュゲートしている。ＣＤ８６分子のＣＴＬＡ−４結合特性は、このコンジュゲーションによる影響を受けない（データは示さず）。

簡潔に述べると、９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を４℃で一晩インキュベートし、ヒトＣＴＬＡ−４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。

試料（例示的ＣＤ８６変異体）を、室温で１時間、異なる濃度（１／４に連続希釈３００００から０．３ｎｇ／ｍｌ）の可溶性ビオチン化ヒトＣＴＬＡ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）または可溶性マウスＣＴＬＡ−４（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）で事前インキュベートした。

次に、混合物をＥＬＩＳＡプレート中のブロッキングされたウェルに添加した。検出をストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ＃２１１２６）で実施し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＰｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。結果を図５に示す。マウスおよびヒトＣＴＬＡ−４で観察された阻害曲線は、２つの形態のＣＴＬＡ−４に対する例示的ＣＤ８６変異体（１０４０）の結合親和性が類似した強度であることを実証する。

Claims

配列番号６から２４のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でＣＴＬＡ−４に結合する、ポリペプチド。
免疫グロブリンＦｃ領域、Ｉｇドメイン、アルブミン、アルブミン結合モジュール、ＰＥＧ、または治療剤もしくは検出可能な標識から選択される分子に結合される、請求項１に記載のポリペプチド。
個体における疾患または状態を治療または予防するための方法における使用のための、請求項１または２に記載のポリペプチド。
前記疾患または状態が癌である、請求項３に記載のポリペプチド。
前記癌が、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頚癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫またはグリア芽腫である、請求項４に記載のポリペプチド。
請求項１または２に記載のポリペプチドおよび少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む組成物。
ＣＴＬＡ−４を発現する細胞の活性化を増加させるために使用するための、請求項１または２に記載のポリペプチド。
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
ＣＴＬＡ−４結合ポリペプチドを同定する方法であって、候補ポリペプチドが、ＣＴＬＡ−４への結合について、請求項１または２に記載のポリペプチドと競合するかどうかを決定することを含み、前記候補ポリペプチドが、配列番号３と同一であるアミノ酸配列を含まない、方法。