MX2013011216A

MX2013011216A - Metodo para tratar trastornos inmunitarios con anticuerpos de dominio sencillo contra tnf-alfa.

Info

Publication number: MX2013011216A
Application number: MX2013011216A
Authority: MX
Inventors: Martin Hegen; Gail Comer; Amarnath Sharma; Kathy Shields
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2011-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2013-10-17
Also published as: CN106039306A; AU2012237287A1; WO2012131053A1; JP2014511844A; CN103547592A; JP6130350B2; MX361242B; KR20140018299A; AU2012237287B2

Abstract

La invención se refiere a la molécula de enlace a TNFX ozoralizumab (ATN-103), métodos de uso de esta molécula para tratar trastornos inmunitarios, incluyendo artritis reumatoide, y regímenes específicos de dosificación para el tratamiento de artritis reumatoide.

Description

METODOS PARA TRATAR TRASTORNOS INMUNITARIOS CON ANTICUERPOS DE DOMINIO SENCILLO CONTRA TNF-ALFA CAMPO DE LA INVENCIÓN La . presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden moléculas · enlazadas al antigeno de dominio sencillo .(SDAB) contra el factor alfa, de la necrosis' del tumor (TNFa) y métodos para usar .moléculas SDAB para tratar trastornos inmunitarios tales como artritis reumatoide.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las SDABs contra TNFa se describen en, por ejemplo, publicaciones PCT WO 04/041862 y WO 06/122786. Estas SDABs anti-TNFa pueden usarse para la prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con y/o mediados por TNFa, tales como, inflamación, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, coliti& ulcerativa, síndrome inflamatorio del intestino, esclerosis múltiple,. enfermedad de Addison, hepatitis . autoinmunitaria, parotitis ·. autoinmunitaria , diabetes tipo 1, epididimitis, glomerulonefrit.is , enfermedad de Graves, síndrome . de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, infertilidad masculina, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigos, psoriasis, fiebre reumática, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías , tiroiditis, y vasculitis.

La implementación de terapéuticos anti-TNF en el régimen de tratamiento' ha. mejorado' la carga de la enfermedad . y calidad de vida para pacientes con afecciones inflamatorias, pero muchas de estas terapias requieren .inyecciones regulares, por ejemplo' semanalmente, de los fármacos por un profesional de la. salud. Las visitas frecuentes al consultorio y las inyecciones plantean una carga importante al sistema de salud, pacientes y sus cuidadores. Reduciendo estas visitas y proporcionando a los pacientes y cuidadores una opción auto-administrada podrían resultar en beneficios económicos y personales importantes. No todo el terapéutico anti-TNF será un candidato para frecuencia de tratamiento reducida o auto-inyecciones, y- por l.ov tanto existe una necesidad para terapéuticos anti-TNF novedosos que sean eficaces cuando se administran durante intervalos más grandes (por ejemplo mensualmente hasta bi-mensualmente) y/o como auto-inyección.

Los pacientes' que reciben fármacos con factor de necrosis anti-tumoral : (TNF) están en¦ riesgo de infecciones serias (SI) debido a los patógenos bacterianos, micobacterianos , hongos, víricos, parasitarios, y otros patógenos oportunistas. Estas infecciones . pueden referirse a cualquiera de la enfermedad subyacente o a medicamentos tomados como tratamiento.' Las infecciones serias (SI, por sus siglas en inglés) resultan en hospitalización o muerte- o requieren medicamento tal como antibióticos. En consecuencia, existe una necesidad para minimizar infecciones serias, mientras que mantienen la eficacia del fármaco.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a : una ' o más de las necesidades mencionadas arriba. El tratamiento de sujetos humanos que sufren de artritis reumatoide con ciertos regímenes de dosificación' de un polipéptido que comprende una SDAB anti-TNFa ... resulta en mejoras estadísticamente importantes en el . estado de la enfermedad del sujeto. En consecuencia, en. álgunas modalidades,- la invención comprende un método para tratar un trastorno inmunitario en un humano que necesita del mismo, que . comprende administrar al humano múltiples dosis de 30-200 mg de un polipéptido que comprende dos SDABs anti-TNFa y un SDAB de albúmina de suero anti-humano (HSA) , en donde las dosis se separan en tiempo por al menos alrededor de cuatro semanas. El modelado indica que el polipéptido que comprende' una SDAB anti-TNFa fue eficaz sobre intervalos prolongados de tiempo cuando incrementa la dosis, sin efectos adversos incrementados clínicamente significativos. El modelado comparativo. con inhibidores anti-. TNF contemporáneo revela además que- el polipéptido que comprende una . SDAB anti-TNFa combina una. eficacia favorable sin impacto en el perfil de riesgo de los efectos SI. En consecuencia, en . algunas .modalidades, la invención comprende un método para tratar un trastorno inmunitario en un humano que necesita del mismo', que comprende administrar al humano múltiples dosis de 30-400 mg de un polipéptido ' que comprende dos SDABs anti-TNFa y. un SDAB de albúmina de suero anti- humano (HSA) , en donde las dosis se separan en tiempo por al menos alrededor de . cuatro semanas, tal como alrededor de 8 semanas o 2 meses. En' algunas modalidades, la' presente invención comprende un polipéptido. que comprende dos SDABs del factor alfa de la necrosis anti-tumor (TNFa) y un SDAB de albúmina de suero anti-humano (HSA) para uso. al tratar un trastorno inmunitario en un humano que necesita del mismo, al administrar al humano múltiples dosis de 30-400 mg del polipéptido, en donde, las dosis son. al menos alrededor de cada cuatro semanas aparte.

En algunas modalidades, la SDAB anti-TNFa comprende 3 regiones que determinan la complementariedad (CD1, CDR2, y • CDR3) en donde . (a) CDR1 comprende (i) la secuencia de aminoácidos DYWMY (SEQ ID NO:22); . (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con DYWMY (SEQ ID NO:22); o (iii) . una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 1 diferencia, de aminoácido de DYWMY (SEQ ID ; O:22); (b) CDR2 comprende (i) la secuencia de aminoácidos EINTNGLIT YPDSVKG (SEQ ID NO: 23) ; (ii)¦ una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, .90%, o ' 95% de identidad de secuencia con EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO: 23); o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o 1 diferencias de aminoácido .de EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO: 23) ; y (c) CD3 comprende. (i) la secuencia de aminoácidos SPSGFN (SEQ ID NO : 24 ) ; '·/ (ii) una secuencia de aminoácidos . que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SPSGFN (SEQ ID NO:24); o (iii) urta secuencia de aminoácidos que tiene 1 diferencia' de aminoácido de SPSGFN (SEQ ID NO:24).

E algunas . modalidades, el SDAB anti-HSA comprende 3 CDRs (CDR1, CDR2, y. CDR3 ) en donde (a) CDR1 comprende (i) la secuencia de aminoácidos SFGMS (SEQ ID NO: 25); (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SFGMS (SEQ ID NO:25); o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 1 diferencia de aminoácido de SFGMS (SEQ ID NO:25); (b) CDR2 comprende (i-) la secuencia de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 26) ; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, 90%, o 95% de identidad de secuencia con SISGSGSDTLYADSVKG. (SEQ ID NO: 26); o · (iü) una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o 1 diferencias de aminoácido de SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 26) ; y (c) CDR3 comprende (i) la secuencia de aminoácidos GGSLSR (SEQ ID NO:27) ; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 8.0% de identidad de secuencia con 10 GGSLSR (SEQ I D NO : 27 ) ; o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene 1 diferencia de aminoácido de GGSLSR (SEQ ID NO : 27 ) . .

En modalidades particulares, al menos una de las SDABs anti-TNFa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 8.0%, 90%, 95%,. o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 (TNF30) . En modalidades particulares, el SDAB anti-HSA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, 90%, 95%, o 95% de identidad de secuencia, con la SEQ ID N0:5 (ALB8) . En modalidades particulares, el polipéptido comprende la secuencia' de aminoácidos; de la SEQ ID N0:1 (ozoraiizumab.) . En modalidades particulares, al menos una de las SDABs está humanizada.

En algunas modalidades, cada una de las dos SDABs anti-TNFa y SDAB anti-HSA se ligan por medio de ligaduras. Las ligaduras pueden ser secuencias de aminoácido, que pueden seleccionarse del grupo que consiste de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7.

Las dosis de la invención pueden separarse en tiempo por al menos alrededor' de 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, o 2 meses.

Las dosis de la invención pueden comprender 10, 30, 80, 100, 120, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 320, 350, 375 o 400 mg de la molécula SDAB y pueden administrarse intravenosamente, subcutáneamente, oralmente, peritonealmente , nasalmente, o sublingualmente .

Las moléculas SDAB de la invención pueden formularse en una formulación farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la formulación comprende (a) una molécula SDAB en una concentración de alrededor de 1 mg/ml hasta 250 mg/ml, tal como alrededor de 10 mg/ml hasta 250 mg/ml; . . (b.) un lioprotector elegido de sacarosa, sorbitol, o trehalosa en una concentración . de alrededor de 5% hasta alrededor de 10%; (c) un tensoactivo elegido de polisorbato-80 o poloxámero-188 en una concentración de alrededor de 0.01% hasta 0.6% ; y (d) una solución amortiguadora elegida de solución amortiguadora de histidina en una concentración de alrededor de 10 hasta 20 mM o una solución amortiguadora Tris en una concentración de alrededor de 20 mM de manera que el pH de la formulación es alrededor de 5.0 hasta 7.5..

En algunas modalidades, la formulación comprende 1 mg/ml, 10 mg/ml, 30 mg/ml, 80 mg/ml, 100 mg/ml, 160 mg/ml 180 mg/ml, 200 mg/ml, o- aún 250 mg/ml de un polipéptido, histidina 20 mM, sacarosa al 10% (p/v), y polisorbato-80 al 0.02% en pH 6.0.

En algunas modalidades, la formulación comprende 1 mg mi, 10 mg/ml, 30 mg/ml, 80 mg/ml, 100 mg/ml, 160 mg/ml 180 mg/ml, 200 mg/ml,. ; o. aún 250 mg/ml de un polipéptido, histidina 20 mM, sacarosa al 7.5% (p/v), y polisorbato-80 al 0.01%. en pH 6.0.

Las moléculas SDAB de la invención pueden administrarse para tratar . un trastorno inmunitario' y/o los polipéptidos de la invención pueden · usarse . para tratar un trastorno inmunitario, en donde el trastorno inmunitario se selecciona del grupo que consiste, de: inflamación, . artritis, incluyendo artritis reumatoide, artritis psoriática, espondilitis anquilosante, artritis y os.teoartritis idiopática juvenil, COPD, asma., enfermedades inflamatorias del intestino ' incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, esclerosis múltiple, enfermedad ' de Addison, hepatitis autoinmunitaria, parotitis autoinmunitaria, Diabetes tipo I, Epididimitis , Glomerulonefritis , enfermedad de Graves, Síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, Anemia hemolítica, Lupus eritematoso sistémico, Infertilidad ¦masculina, Esclerosis múltiple, Miastenia gravis, Pénfigos, Psoriasis, . Hidradenitis supurativa, ..¦ Fiebre reumática, Sarcoidosis, Escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías , Tiroiditis, y vasculitis.

Los humanos tratados con las moléculas SDAB de la invención pueden tratarse concurrentemente con metotrexato.

En una modalidad particular, la invención contempla un método, para tratar artritis reumatoide en un humano que necesita del mismo, que comprende administrar al humano 80 mg de . un polipéptido .que. comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l alrededor de una vez cada cuatro semanas, en donde el. humano se trata concurrentemente con metotrexato.

En una modalidad particular adicional, la invención contempla un método para tratar artritis reumatoide en un humano . que necesita ' del mismo, que comprende administrar al humano .160, 200, 320 o 400 mg de . un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l alrededor de una vez cada cuatro semanas, y opcionalmente en donde el humano se trata concurrentemente con metotrexato.

En otra modalidad particular, la invención contempla un método para tratar . artritis reumatoide en un humano que necesita del mismo, que comprende administrar al humano 320' o 400 mg de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la. SEQ ID NO:l alrededor de una vez cada ocho semanas, o una. vez cada mes, y opcionalmente en donde el humano se trata concurrentemente con metotrexato.

En una modalidad adicional, la nvención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1 para uso al tratar artritis reumatoide en un humano que necesita del mismo, al administrar al humano 80 mg de un polipéptido alrededor de cada cuatro semanas, en donde el humano se trata concurrentemente con metotrexato.

En una modalidad adicional, la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SÉQ ID N0:1 para uso al tratar artritis reumatoide en un humano que necesita del mismo, al administrar al humano 160, 200, 320 o 400. mg de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 1 alrededor de una vez cada cuatro semanas, y opcionalmente . en donde el humano se trata concurrentemente con metotrexato.

En otra modalidad; particular, la invención contempla un polipéptido que . omprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1 para uso al tratar artritis reumatoide en un humano que necesita del mismo, al administrar al humano 320 o 400 mg de un polipéptido que . comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1 alrededor de una vez cada ocho semanas o una. vez cada mes, y opcionalmente en donde él humano se trata concurrentemente con metotrexato.

En una modalidad adicional, la invención se refiere a un polipéptido para uso al tratar' un trastorno inmunitario en un humano que necesita del mismo., en donde el polipéptido compite con el polipéptido que comprende la. secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l (ozoralizumab) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGUR4AS La Figura 1 muestra el porcentaje de pacientes en cada uno de los 6 grupos de tratamiento dosificados con ozoralizumab alcanzando los criterios ACR-20, 50, y 70 para tratamiento de artritis reumatoide en 8 y 16 semanas . En el régimen . de dosificación de cada 4 semanas, los sujetos se dosificaron en el día 1, semana 4, 8, y 12 con ya sea ozoralizumab o placebo. En el régimen de cada 8 semanas, los sujetos se dosificaron en el. dia 1 y semana 8 con ozoralizumab y placebo se. administró en la semana 4 y 12.

La Figura 2 muestra la tasa de respuesta ACR 20 con .él paso del tiempo por el 'grupo de tratamiento (LOCF) .

La Figura 3 muestra la tasa de respuesta · DAS28 con el paso del tiempo por el grupo de tratamiento (LOCF.) .

La Figura 4 muestra la respuesta de ACR20 de dosis corregida por placebo' media (95% PI) de ATN-103. Las lineas punteadas muestran las respuestas simuladas medias del tratamiento comparador indicado.

La Figura 5 muestra respuesta DAS simulada media (95% PI) de ATN-103. Las lineas, punteadas muestran' la respuesta media del tratamiento comparador indicado.

La Figura 6 muestra la utilidad por fármaco en términos de %ACR20 y %SI. Cada burbuja cubre el 95% de PI de respuestas simuladas para cada fármaco en su régimen de dosificación indicado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos se . definen primero. Las definiciones adicionales se establecen a lo. - largo de la descripción detallada.

Como se usa en la presente, . los artículos "un" y "uno" se refieren a uno , o a más de uno. (por ejemplo, a al menos uno) del objeto gramático del artículo.

El término "o" se usa en la presente para significar, y se usa intercambiablemente con, el término "y/o," a menos que el contexto claramente indique lo contrario.

Los términos "proteínas" y - "polipéptidos" se usan intercambiablemente en la presente, y abarca las moléculas SDAB de la invención.

"Alrededor" y . "aproximadamente" generalmente deberán significar un grado aceptable de error para la cantidad medida dada en la naturaleza o precisión de las mediciones. Los . grados ejemplares de error están dentro de 20 por ciento (%), típicamente, dentro de 10%, y más típicamente, dentro de 5% de un valor dado o intervalo de valores.

Cuando un término modificado tal como "alrededor," "aproximadamente," "al. menos," o "como mucho" precede una lista de artículos., . el término se pretende para modificar cada uno de los artículos de la lista. Por ejemplo, la frase "al menos alrededor de 10% o 20%" debe interpretarse como "al menos alrededor de 10%. o. al menos alrededor de 20%." En el contexto de la secuencia de nucleótidos, el término . "sustancialmente idéntico" se usa en la presente para referirse a una primera secuencia de ácido nucleico que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácido nucleico de manera que la primera y segunda secuencias de nucleótido codifican un polipéptido que tiene actividad funcional común, o codifican un dominio de polipéptido estructural común o una actividad de polipéptido funcional común, por ejemplo, secuencias de nucleótido qúe tienen al menos alrededor de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, .98% o . 99% de identidad a una secuencia de referencia.

También . se. incluyen en . la invención- fragmentos, derivados, análogos, o variantes de polipéptidos de la invención, y cualquier combinación de los mismos. .Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se. refieren a proteínas de la presente invención incluyen cualquiera de los polipéptidos que mantienen al menos algunas de las propiedades funcionales de la molécula SDAB nativa correspondiente. Los fragmentos de polipéptidos de la presente invención incluyen fragmentos de' eliminación y proteolíticos , además de los fragmentos enlazados al ántígeno específicos discutidos en cualquier lugar en la presente. Las variantes de los : polipéptidos de la presente invención incluyen fragmentos como se describe arriba, y también polipéptidos con secuencias de aminoácido, alterados debido a las. sustituciones, , eliminaciones,, o inserciones de . los aminoácidos. Las. variantes pueden presentarse naturalmente o no presentarse naturalmente. Las variantes que no se presentan naturalmente pueden producirse usando, técnicas de mutagénesis conocidas en el arte. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, eliminaciones, o adiciones de los aminoácidos conservadores o no conservadores. Los derivados de los fragmentos de la' presente invención son polipéptidos que ' · se han alterado a fin de exhibir características adicionales sin encontrarse en el polipéptido nativo. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también pueden referirse en la presente como "análogos de polipéptido." Como se usa en la presente, un "derivado" de un polipéptido se refiere a un polipéptido objeto que tiene uno o más residuos químicamente derivados por reacción de un grupo lateral funcional. También se incluyen como "derivados" aquellos polipéptidos que contienen 'uno o m s derivados de . aminoácido que se presentan naturalmente de los veinte aminoácidos estándares.

Por ejemplo, 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; .3-metilhistidina ¦ puede, sustituirse por histidina; homoserina puede sustituirse por serina; y ornitina puede sustituirse por lisina.

El término "variante funcional" se refiere a polipéptidos . que . tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntico a la secuencia que se presenta naturalmente, o se codifican por una secuencia de nucleótido sustancialmente idéntica, y son capaces de tener una o más actividades de la secuencia que se presenta naturalmente.

Los cálculos de homología o identidad de secuencia entre las secuencias (los términos se ' usan intercambiablemente en la presente) se realizan como sigue.

Para determinar la identidad de porcentaje de dos secuencias de . aminoácido, o de dos secuencias . de ácido nucleico, las secuencias se alinean, para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, los espacios pueden introducirse en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico o aminoácido para alineación óptima y las secuencias no homologas pueden ignorarse para propósitos de comparación) . En una¦ modalidad, típica, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos 30%, .40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% de la longitud de la secuencia de referencia.

Los nucleótidos o residuos de aminoácido en posiciones de nucleótido o posiciones de aminoácido correspondientes luego se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo nucleótido o residuo de aminoácido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, luego las moléculas son idénticas en tal posición (como .se usa en la presente "identidad" de ácido nucleico o aminoácido es equivalente a la "homología" del ácido nucleico o aminoácido) .

La identidad dé porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada . espacio, que necesita para¦ introducirse para alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y determinación de identidad de porcentaj e ' entre dos secuencias puede realizarse usando un algoritmo matemático. ' En. una' modalidad, -la identidad de porcéntaje entre dos secuencias de aminoácido se determina usando el algoritmo descrito en Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)., que . se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software . GCG (disponible en la internet en gcg . com) ,. usando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio ..de 16, .14, 12, 10, 8, 6, o y un peso de longitud de 1, 2, .3,: 4, 5, o 6. Aún en otra modalidad, la identidad de porcentaje entre dos secuencias de núcleótido se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en la internet en gcg.com), usando una matriz NWSgapdna . CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60,- 70, o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Un conjunto típico de parámetros (y uno que debería usarse a menos que se especifique de otra manera) son una matriz de registro . Blossum 62 con una penalización de espacio de 12, una. penalización extendida- de espacio de 4, y una . penalización de espacio con cambio de estructura de 5.

La identidad de porcentaje entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido puede determinarse usando el algoritmo descrito- en E. eyers y W." Miller CABIO, 4:11-17(198.9) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una ' tabla de residuo de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4.

Las secuencias de proteína y . ácido nucleico descritas en la presente pueden usarse como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia, o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. J.. Mol. Biol. 215:403-10(1990). Las búsquedas de nucleótido BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de. palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótido homologas a las moléculas de ácido nucleico caracterizadas en la invención. Las búsquedas de proteína BLAST -pueden realizarse con el programa XBLAST, registro=50 , longitud de p.alabra=3 para obtener secuencias de aminoácido hómologas a una molécula de proteina (SEQ ID NO: 1) caracterizada en la invención. Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, Gapped BLAST puede utilizarse como se describe en Altschul et al . , Nucleic Acids Res. 25:3389-25 3402(1997). Cuando se utilizan programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros · por omisión . de los- programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).

Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la cual . el residuo.de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena, lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido . que tienen cadenas laterales similares se han definido en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina)-, cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ¦ ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares · no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, . glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleuciná, prolina, fenilalanina, metionina, tripto.fano) , cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina,¦ isoleuciná) y cadena laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) .

El término "SDAB". se refiere' a una molécula enlazada al antigeno de dominio sencillo como se describe en WO04/041862 y WO 067122786.. El término : "molécula SDAB" se refiere a un polipéptido u otra molécula que comprende una o más SDABs. Los términos . "SDAB" y "molécula SDAB" pueden usarse intercambiablemente para referir a una unidad enlazada al antigeno de. dominio- sencillo (por ejemplo, TNF30 o ALB8 ) o dominios enlazados al antigeno de dominio sencillo multivalente (por . ejemplo, TNF55, TNF56,. u ozoralizumab) .

. Una "CDR" de un dominio variable son residuos de aminoácido' dentro'.de la. región hipervariable que se identifican de acuerdo con las definiciones del Kabat, Chothia, la acumulación de tanto Kabat como Chothia, AbM, contacto, y/o definiciones conforma'cionales o cualquier método de determinación CDR- bien conocido en el arte. Las CDRs de anticuerpo pueden identificarse como las regiones hipervariable originalmente definidas por Kabat et al... Ver, por ejemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed.., Public Health Service,. NIH, Washington D.C. Las posiciones, de .las CDRs también pueden identificarse como las estructuras de rizo estructurales originalmente descritas por Chothia and others. Ver, por ejemplo, Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883. Otros enfoques para identificación CDR incluyen la "definición' AbM, " que es un compromiso entre Kabat y Chothia y se deriva usando software de modelado de anticuerpo AbM Oxford Molecular' s .(ahora Accelrys®) , o la "definición de contacto" de CDRs con base en contactos de antigeno observados, establecidos en MacCallum et al., 1996.,. J. Mol. Biol . , 262:732-745. En otro enfoque, referido en la presente como la "definición conformacional" de las CDRs, las posiciones de las CDRs pueden identificarse como los residuos que hacen contribuciones entalpicas para enlace al antigeno. Ver, por ejemplo, Makabe et al., 2008 , \ Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Todavía otras definiciones de límite CDR no pueden estrictamente seguir uno de los enfoques de arriba, pero no obstante se traslaparán con al menos una porción de las Kabat CDRs, aunque, pueden acortarse o alargarse en luz de la predicción o hallazgos experimentales que los residuos particulares o grupos de residuos o aún CDRs enteras no impactan significativamente el enlace al antígeno. Como se usa en la presente, una CDR puede referirse a CDRs. · definidas por cualquier enfoque conocido en el arte, incluyendo combinaciones de enfoques. Los métodos usados en la presente pueden utilizar CDRs definidas de acuerdo a cualquiera de estos enfoques. Para, cualquier modalidad dada que contiene más de una CDR, las CDRs pueden definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones Kabat, Chothia, .. extendida, AbM, de contacto, y/o conformacionales .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Moléculas Enlazadas al Antlgeno de Dominio-, Sencillo (SDAB) Las moléculas enlazadas al antígeno de dominio sencillo (SDAB) incluyen moléculas cuyas regiones que determinan la complementariedad son parte de un polipéptido de dominio sencillo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, dominios variables de cadena pesada, moléculas enlazadas naturalmente desprovistas de cadenas. ligeras, dominios sencillos derivados ' de anticuerpos de cadena' 4 convencionales, dominios preparados por ingeniería y andamios de dominio sencillo diferentes de aquellos derivados de los anticuerpos. Las moléculas SDAB pueden ser cualquiera del arte, o cualquiera de las moléculas . de dominio sencillo futuras. Las moléculas SDAB pueden derivarse de cualquier especia incluyendo, pero no limitado a ratón, humano, camello, llama, pescado, tiburón, cabra, conejo, y bovino.

De acuerdo, con un aspecto de la invención, una molécula SDAB es una molécula enlazada al antígeno de dominio sencillo que se presenta naturalmente conocida como cadena pesada desprovista de cadenas ligeras. Tales: moléculas de dominio sencillo se describen, . por ejemplo, en WO 94/04678 y Haraers-Casterman et al. Nature 363:446-448 (1993). Para razones de claridad, este' dominio variable derivado de una molécula de cadena pesada naturalmente, desprovisto de cadena ligera puede describirse como .; una VHH para distinguirse del VH convencional de cuatro inmunoglobulinas de cadena. Tal molécula VHH puede derivarse.de la- especie Camelidae, p.or ejemplo en camello, llama, dromedario, alpaca, y guanaco. Otra especie además de Camelidae puede producir moléculas de cadena pesada naturalmente desprovistas de cadena ligera; tales VHHs están dentro del alcance de la invención.

Las moléculas . SDAB pueden ser recombinantes , injertadas por CDR, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas y/o generadas in vitro (por ejemplo, seleccionadas por despliegue de fagos), como se describe en más detalle a continuación.

El término "enlazado al antigeno" se pretende para incluir la parte de un polipéptido, por ejemplo, una molécula de dominio sencillo descrita en la présente, que comprende determinantes que forman una int.erfaz que enlaza a un antigeno objetivo, o un epitopo del mismo. Con respecto a las proteínas (o imitadores de proteína), el sitio enlazado al antígeno típicamente incluye uno o más' rizos '. (de al menos cuatro aminoácidos o imitaciones de aminoácido) que forman una interfaz que enlaza al antígeno objetivo. Típicamente, el sitio enlazado" al antígeno del polipéptido, por ejemplo, la molécula de anticuerpo de dominio sencillo, incluye al menos una o dos CDRs, o más típicamente al menos tres, cuatro, cinco, o seis CDRs.

El término "dominio variable . de inmunoglobulina" se entiende frecuentemente en el arte como que es idéntico o süstancialmente idéntico a un dominio VL o uno . VH de origen humano o animal. Deberá reconocerse que los · dominios variables de inmunoglobulina han podido evolucionar en ciertas especies,. por ejemplo, tiburones y llama, para diferir en secuencia de aminoácidos de VL o VH humano o mamífero .

Sin embargo, estos dominios todavía se involucran principalmente en el enlace al. antígeno. El término 20 "dominio variable de inmunoglobulina" típicamente incluye al menos una o dos CDRs, o más típicamente al menos tres CDRs.

Un "dominio de inmunoglobulina constante" o "región constante" se pretende para incluir un dominio de inmunoglobulina que es idéntico a o süstancialmente similar. a un dominio CL, CH1., CH2, CH.3, o CH4 de origen humano o animal. Ver por ejemplo Hasemann y Capra, Immunoglobulins : Structure and Function, in William E. Paul, ed. , Fundamental Immunology,. Segunda Edición, 209, 210-218 (1989). El término "región Fe" se refiere a .la porción Fe del dominio de inmunoglobulina constante que incluye dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 o dominios de inmunoglobulina süstancialmente similares a estos.

En ciertas modalidades, la molécula SDAB es una molécula monovalente, o. una multiespecífica (por ejemplo, una molécula bivalente, trivalente, o tetravalente) . En otras modalidades, la molécula SDAB . es una molécula monoespecífica, biespecifica, triéspecifica, o tetraespecífica . Si una molécula es ya sea "monoespecífica" o "multiespecífica," por ejemplo, "biespecifica, " se refiere al número de epítopps diferentes con el cual un polipéptido de enlace reacciona. Las moléculas multiespecíficas pueden ser específicas para epítopos diferentes de un polipéptido objetivo descrito en la presente o puede ser específico para un polipéptido objetivo así como para un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido'.

Como se usa en la presente el término "valencia" se refiere al número, de dominios de. enlace potenciales, por ejemplo, dominios enlazados al antígeno, presentes en una molécula SDAB. Cada dominio de enlace específicamente enlaza un epítopo. Cuando una molécula. SDAB comprende más de un dominio de- enlace, cada dominio de enlace puede enlazar específicamente el mismo epítopo, para un anticuerpo con dos dominios de enlace, nombrados "monoespecífico bivalente, " o para epítopos¦ diferentes, para una molécula SDAB con dos dominios de enlace, nombrados "biespecificos bivalentes." Una molécula SDAB también puede ser biespecifica o bivalente para cada especificidad (nombradas "moléculas tetravalentes biespecíficas" ) . Las moléculas bivalentes biespecificas , y métodos para ' hacerlos, se describen, por ejemplo en las Patentes de E.U.A. Nos. .5, 731, 168; 5, 807, 706; 5'., 821, 333; , y Publicaciones ?:?·3; E.U.A: Nos. 2003/0.20734 y 20C:;/ 155 37 , las descripciones de. todas las cuales se incorporan como referencia en. la presente. Las moléculas tetravalentes biespecificas y. métodos para hacerlas se describen, por ejemplo, en O 02/096948 y WO00/44788., las descripciones de ambas las cuales, se incorporan como referencia en la totalidad. Los ejemplos adicionales de moléculas nvultiespecíficas y multivalentes se proporcionan en la WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Patentes de E.U.A... Nos.' 4,4' ,893; 4,714,681; 4, 925,648; '5,573,920; .y 5,601,819; Tu;.-, ti al, J. Inimunol .. 1 -í 7 : 60- (59 ( 1¦->93 ) .· y Kostelny et al, J. Immunol. 148: 1547-1553. (1992).

En ciertas : modalidades, la molécula . SDAB es un polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende una o más moléculas de dominio sencillo desprovistas de un dominio variable complementario o una constante de inmunoglobulina, por ejemplo, región Fe, que enlaza a uno o más antigenos objetivos. Un antigeno objetivo ejemplar reconocido por los enlazados al antigeno incluye factor alfa, de la necrosis del tumor (TNFa) .. En ciertas modalidades, la molécula de domini.o sencillo enla z¿¡ 3.'·. al aritigeno n L a za a un i prot.cí na dr sue r o , por ejemplo, las proteínas de suero humano elegidas de una o más de albúmina de- suero (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA) ) o transferina.

TNFa El factor i f ..i de la necrosis del tumor .(THFd) se conoce en el arte para lo asociado con trastornos inflamatorios tales como artritis . réumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, , y esclero-sis múltiple. Tantos TNFa como sus receptores (CD120a y CD120b) se han estudiado a- .gran detalle. TNFa -en su forma bioactiva .es un trímero. Diversas estrategias, para antagonizar la acción de TNFa usando anticuerpos anti-TNFa se han desarrollado y están hoy en día comercialmente disponibles, tales como , Remicade®. ' y Humira®. Numerosos ejemp os de. moléculas enlazadas al antígeno de dominio senci.l L ¦¦ enlazadas a TNFa se describen en WO 04/041862, WO 04/041865,. y WO06/122786, los contenidos de todos los cuales se incorporan como, referencia en la presente ¦ en su totalidad.. '¦ Los ejemplos adicionales de moléculas enlazadas al antígeno de dominio sencillo se describen en US2006/286066, US2008/0260757, . WO 06/003388, US2005/0271663, y US2006/0106203, los contenidos de todos los cuales se incorporan como referencia en la presente en sus totalidades.

En modalidades particulares, las moléculas SDAB de la invención incluyen SDABs que comprenden una secuencia de aminoácidos, de la Tabla 1, o una secuencia de aminoácidos con alrededor de 80%, 85%, 90%., 95%, o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de la Tabla 1. En modalidades alternativas, las,, moléculas SDAB de la invención pueden comprender una' ;· cuencia de ami noáci dos- . coa 1, ?.-, 3, ? , 5, , 7, 8, 9, 10, 11,. o. 12 diferencias de aminoácido de una secuencia de la Tabla 1.

En otras modalidades, se. contemplan los anticuerpos. de dominio sencillo mono, bi, tri y otros muiti-específicos contra TNFa y una' proteina de suero, por ejemplo, HSA.. Numerosos ejemplos de polipéptidos enlazados- a HSA y TNFa multiespecificos se describen, en WO 06/122786, los contenidos de los cuales se incorporan como referencia en la presente. Los polipéptidos multiespecificos de la invención pueden comprender una secuencia d<- aminoácidos de la Tabla 1, o un:a síicunncia de aminoácidos con alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de identidad de secuencia¦ con una secuencia de la Tabla 1. . En modalidades alternativas,¦ las moléculas SDAB multiespecificas de la invención pueden. comprender una secuencia de aminoácidos con 1, 2, 3, 4,. 5, 6, 7, 8, 9, 10,. 11, o 12 diferencias de aminoácido de una secuencia de la Tabla 1.

En ' modalidades especificas, la molécula SDAB enlazada a TNFa comprende una o más de las: SDABs descritas en WO 0.6/122786. Por' ejemplo, la molécula SDAB enlazada a TNFa puede ser un polipéptido enlazado . a TNFa. monovalente bivalente, o trivalente descrito en WO 06/122786.

Las SDABs enlazadas a TNFa ejemplares descritas en la WO 06/122786 incluyen, pero no se limitan a, TNF1, TNF2, TNF3, y formas humanizadas de las mismas (por ejemplo, TNF29, TNF30, TNF31, . TNF32 , NF.33) .. Los ejemplos adi cionales do SDABs enlazadas a ??1·ß tronovalentes so d scriben en La Tabla 8 de la WO 2006/122786. Las moléculas SDAB enlazadas a TNFa bivalentes ejemplares incluyen, pero. no se limitan a, TNF55 y TNF56, . las cuales comprenden dos SDABs TNF30 ligadas por medio de una ligadura de péptido para formar un polipéptido de fusión sencillo (descritas en WO 06/122786). Los ejemplos adicionales de moléculas SDAB enlazadas a TNFa bivalentes se describen en la Tabla 19 de WO 06/122786 como TNF , · TNF5, TNF6, TNF7 , TNF8) En modali(ia<ie:;. particulares, la . SDAB anti-TNFa comprende 3 regiones que -t rminaii la complementa rredad (CDR1, CDR2, y CDR3) en donde: CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY (SEQ ID NO: 22) ; una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%' de .identidad de secuencia con DYWMY (SEQ ID NO:22); o una. secuencia de aminoácidos que .tiene sólo 1 diferencia de aminoácido de DYWMY (SEQ' ID 25 NO:22); CDR2 comprende la secuencia de. aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO:23); una '. ouencia de; am noácidos que tiene al menos 80%, 90%, o :95% de identidad de secuencia con EINTNGLITKYPDSVKG ' ¦ (SEQ ID NO:23); ' o una ... secuencia de aminoácidos que tiene 2 o 1 diferencias de aminoácido de EINTNGLITKYPDSVKG¦ (SEQ ID NO: 23); y CDR3 "comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN (SEQ ID NO:24); una secuencia de aminoácidos que tiene al menos .80% de identidad de secuencia con SPSGFN (SEQ ID NO:24); o una secuencia de aminoácidos que tiene 1 diferencia de aminoácido de SPSGFN (SEQ ID NO: 24) .

En alguna» i-.odalidades, la SDAB enlajada a H:.'A comprende una secuencia de aminoácidos de la Tabla 1, o una secuencia de aminoácidos con alrededor de 80%, 85%, 90%, . 5%, p 99% de identidad de secuencia, con una secuencia de la Tabla 1. En modalidades alternativas, el SDAB anti-HSA de la invención pueden comprender una secuencia de aminoácidos con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 diferencias de aminoácido de una secuencia de la Tabla 1. , En otras modalidades, la molécula SDAB enlazada a HSA comprende una o más de. las SDABs descritas en- WO 06/122786. Por ejemplo, 1« ¦ molécula SDAB enlazada a HSA puede ser una molécula SDAB. enlazada al HSA monovalente, bivalente, trivalente descrita en WO 06/122786. En . otras modalidades, la molécula SDAB" enlazada a HSA puede ser una molécula monoespecífica o una multiespecifica que tiene, al menos una de las especificidades de enlace, enlazadas a HSA. Las SDABs enlazadas a. HSA ejemplares incluyen,, pero no se limitan a, ALB1 y formas . t.v..nanizadas de las mismas .(por ejempl , ALBC, ALB7 , ALB8, ALB9 ,¦ .ALB1.0 ) , descritas én- WO. 06/122786.

En modalidades particulares, el SDAB anti-HSA . comprende 3 CDRs.. (CDR1, . CDR2 , y CDR3 ) en donde CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SFGMS (.SEQ ID ' NO: 25) ; una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SFGMS (SEQ ID NO:25); o una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 1 diferencia de aminoácido de SFGMS (SEQ ID NO:25); CDR2 comprende, la secuencia de aminoácidos . SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ. ID NO:26); una secuencia de aminoácido:; que tiene al menos .80 ' , 90'?, o 951 de identidad de secuencia con SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 26).; o una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o 1 diferencias de aminoácido -de SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:26); y CDR3 comprende la secuencia: de aminoácidos GGSLSR (SEQ ID NO:27); una secuencia de . aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con GGSLSR (SEQ ID NO:27);- o una secuencia de aminoácidos ' que tiene 1 diferencia de aminoácido de GGSLSR (SEQ ID NO: 27)..

En otras modalidades, dos o -más de las moléculas de dominio sencillo de. las moléculas SDAB se fusionan, con o sin un grupo de ligadura, como una : fusión genética o un polipéptido. El grupo de ligadura puede ser cualquier grupo de ligadura aparente para aquellos de experiencia en el arte. Por ejemplo, el grupo de ligadura puede ser un polímero bipcompatible con una longitud de 1 hasta 100 átomos. En una modalidad, . L ·????? .de ligadura incluye o consiste de residuos de . poliglicina, poliserina, .· polilisina, poliglutamato, poliisoleucina, o . ppliarginina, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, las ¦ ligaduras de poliglicina. o ' poliserina pueden incluir al '.menos cinco, siete, . ocho, nueve, diez, doce, quince, veinte,: treinta, treinta y cinco y cuarenta residuos de glicina y serina. Las ligaduras ejemplares que pueden usarse incluyen repeticiones Gly-Ser, por ejemplo, (Gly) 4-Ser (SEQ ID . O: 19) repeticiones de una', dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más repeticiones. E' ri algunas modalidades,' la . ligadura tiene las siguientes secuencias: (Gly) 4-Ser- (Gly ) 3-Ser (SEQ ID NO: 20) o ( (Gly) 4-Ser)n (SEQ ID NO: 21), donde n' es 4, 5, o 6. En algunas modalidades., la. ligadura comprende SEQ ID NO: 6 (GS9) o SEQ ID NO: 7 (GS30) . :' En una modalidad' ejemplar, las moléculas SDAB de la invención pueden estar compuestas de una' fusión de polipéptido de cadena sencilla de dos dominios SDAB. (por. ejemplo, dos regiones, variables de camélido) que enlazan a un antigeno objetivo, por ejemplo, · TNFa, y una molécula de anticuerpo de dominio sencillo (por ejemplo, una región variable de camélido) que enlaza a una proteina de suero, por ejemplo, HSA.

Un polipéptido referido en la presente como "ozoralizumab" es una proteina de fusión que inhibe TNFa humanizado, trivalente, biespecífico. Esta proteína-, de fusión se deriva de c mi':! i.dos . y tiene un grado alto, de homología de secuencia ' y est i íc'tural para dominios VH de . inmunogl obulina humana. Su cadena de polipéptido sencillo está compuesta de dos . dominios- enlazados a TNFa y uno a HSA, con' dos ligaduras G-S dé nueve aminoácidos que conectan los dominios. Una descripción detallada de ozoralizumab . se proporciona en O 06/122786 (donde se refiere a un TNF60) , los contenidos de los cuales se incorporan como referencia en la presente.

Tabla 1 Preparación de. moléculas SDAB Las moléculas' SDAB de la invención pueden comprender una o más moléculas de; dominio sencillo (por ejemplo,.- SDABs) que son- recombinantes, injertadas por CDR, humanizadas, camelizadas, cl> ¡^inmunizadas, y/o generadas . in vitro (por ejemplo, seleccionadas por despliegue de fagos) . Las técnicas para generar anticuerpos y moléculas SDAB, y modificarlos recombinantemente . se conocen en el arte y se. describen en détalle a continuáción .

Numerosos métodos conocidos para aquellos experimentados en el :arte están, disponibles para obtener anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse por generación de hibridomas de acuerdo con métodos conocidos. Los hibridomas- formados dé esta manera luego se seleccionan usando métodos estándares, tales como ensayo inmunosorbent e ligado por enzima¦ (ELISA) y análisis de resonancia de plasmón de ¦ .. superficie . (BIACORE™) , . para identificar uno o más hibridomas que producen un SDAB que específicamente se enlaza con un antígeno especificado. Cualquier forma . del antígeno especificado puede usarse como el inmunógeno, por ejemplo, antígeno' recombinante, formas que se presentan naturalmente, cualquiera de las variantes o fragmentos de los mismos, así como péptido antigénico , de los mismos.' ' Un método, t:j mplar para hacer anticuerpos y moléculas SDAB incluye seleccionar bibliotecas de expresión de proteina, por ejemplo,, bibliotecas de despliegue de fagos o ribosoma. Se describe el despliegue de fagos, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 5,223,409; Smith Science 228: 1315-1317(1985); WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/156-79; WO 93/01288; WO 92/01047; WO92/09690; y .WO 90/02809.

. Además del uso de bibliotecas de despliegue, el antigeno especificado puede usarse para inmunizar, un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un. ratón, hámster, o rata. En una modalidad, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible preparar por ingeniería las cepas de ratones deficientes, en producción de anticuerpo de ratón con fragmentos grandes de los loci de . Ig . humana. Usando la tecnología de¦ h ¡ bridoma , pueden . p3:oducirse y seleccionarse anticuerpos monoel onales específicos de antígeno derivados de los .genes con la especificidad deseada. Ver, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green et al Nature Genetics 7:13-21 (1994), US20030070185, . WO . 96/34096, y . Solicitud PCT No. PCT/US96/05928.

En otra modalidad, una molécula SDAB se obtiene del animal . no ' humano, y luego se modifica, por. ejemplo, humanizada, desinmunizada, y/o quimerizada. Estas moléculas SDAB pueden producirse usando técnicas de AD recombinantes conocidas en el arte. Se ha descrito una variedad de enfoques para hacer anticuerpos quiméricos y moléculas SDAB. ' Ver por ejemplo, Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. 81:6851(1985); Takeda . et al, Nature 314:452(1985); Patentes de E.U.A. Nos. 4, 816, 567 y 4, 816, 397;· Publicaciones de Patente Europea .EP171 96 .y 0173494.;. y Patente de Reino Unido GB¦ 2177096B. La:; . moléculas SDAB humanizadas también pueden producirse, por ejemplo, usando catones transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana, pero son- incapaces de .expresar los genes de' inmunoglobulina de ratón endógeno.

Winter.. describe un método de injerto por. CDR ejemplar que puede usarse ; para preparar la molécula SDAB humanizada descrita en la presente (Patente, de E.U.A. No. 5,225,539). Todas de las CDRs de una molécula SDAB particular puede reemplazarse con al menos una porción de una CDR no humana, o sólo' algunas de las . CDRs pueden- reemplazarse con CDRs no humanas. Sólo, es necesario reemplazar el número de CDRs requeridas para enlace de la molécula . SDAB a un antigeno predeterminado.

... Las, moléculas SDAB humanizadas pueden . generarse al reemplazar secuencias¦ del dominio variable que no se involucran directamente en el enlace al ¦ antigeno con secuencias equivalentes de dominios variables humanos. Los métodos ejemplares para generar anticuerpos humanizados "o fragmentos de lo mismos se proporcionan por Morrison Science 229:1202-1207(1985);. Oi et al. BioTechniques 4:214(1986); y Patentes de E.ü.A. Nos. 5,585,089;. 5,693,761;. 5,693,762; 5,859,205; y 6, 07, 213.

Aquellos métodos incluyen aislar, manipular, y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o parte de los dominios variables de inmunoglobulina de al menos una cadena pesada, o ligera. Tales ácidos, nucleicos pueden obtenerse de un hibridoma que . produce una molécula SDAB contra un objeti vo ' predeterminado, .. como se describe arriba, asi como de otras fuentes. El ADN recómbinante que codifica la molécula SDAB humanizada, luego puede clonarse en un vector de expresión apropiado.

En ciertas modalidades, una molécula SDAB humanizada se optimiza por la introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de linea germinal ' y/o retro mutaciones. Tales moléculas de inmunoglobuliná alteradas pueden hacerse por cualquiera de diversas técnicas conocidas en el arte, (por ejemplo, Teng et al, Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. 80:7308-7312(1983); Kozbor et al, Immunolooy Today ' 4 : 7279 (1983)' ; ' Olsson et al, Meth. Enzymol, 92:3-16(1982)), y pueden hacerse .de acuerdo a las enseñanzas de WO92/06193 o EP 0239400. Las técnicas para humanizar moléculas SDAB también se proporcionan en WO 06/122786. ..

Una molécula SDAB también puede- modificarse por eliminación especifica de epítopos .de- célula T humana - o "desinmunizáción" por los · métodos descritos en WO 98/52976 y WO 00/34317. B oyamente, los dominios variables de cadena pesada de una molécula SDAB pueden analizarse por péptidos que enlazan, a MHC Clase II; estos péptidos representan epitopos de célula T potencial (como se define en WO 98/52976 y WO 00/34317). Para, la detección de. epitopos de célula T potenciales, un enfoque de modelado por computadora nombrado "reconocimiento del .plegamiento de péptidos" puede aplicarse, y además una base de datos de péptidos enlazados a MHC clase II humano pueden buscarse para porciones presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en la WO 98/52976 y WO 00/34317. Estáis porciones enlazan a cualquiera de los 18 alotipos MHC clase II DR principales, y de esta manera constituir epitopos de célula T potencial. Los epitopos de célula T potenciales detectados pueden eliminarse al sustituir números, pequeños de residuos, de aminoácido en los dominios variables, o preferiblemente, por sustituciones de aminoácido sencillo. . Típicamente, se hacen sustituciones conservadoras.

A menudo, . pero no exclusivamente, puede usarse un aminoácido común para una posición en las secuencias de anticuerpo de linea germinal humano.' Las secuencias de linea germinal humanas, por -ejemplo, se describen en Tomlinson et al., J. Mol. Biol. : 227:776-798 (1992) ; Cook et al., Immunol . Today 16 (5) : 237-242 ( 1995) ; Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799-817(1992); y Tomlinson et al., EMBO J. 14:4628-4638(1995). El directorio V BASE proporciona un directorio detallado de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana (recopilado por- Tomlinson, LA. .et al. RC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU) . Estas secuencias pueden usarse como una fuente de secuencia humana, por ejemplo, para regiones de estructura y CDR's. Las' regiones de estructura humana de consenso también pueden usarse, por ejemplo, como se describe en la U.S. 6,300,064. Las moléculas SDAB pueden producirse por células hospederas vivas que se han preparado por ingeniería genéticamente' para producir la proteína. Los métodos de células preparadas por ingeniería genéticamente para producir proteínas son bien conocidos en el arte. Ver por ejemplo Ausubel et al., eds . (1990), Gurrent Protocols i.n Molecular Biology-, (Wiley, New York) . Tales métodos incluyen introducir ácidos . nucleicos que codifican y permiten la expresión de la ..proteína en células hospederas vivas. Estas células hospederas pueden ser células bacterianas, células de hongos, o, preferiblemente, células de animal ¦ que crecen en el cultivo.. Las ::6 Lulas hospederas bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células Escherichia col-i: Los ejemplos de cepas E. coli adecuadas incluyen: HBlOl,: DH5a, GM2929, JM109, KW251, . NM538, NM539, y. cualquier cepa E. coli que falla para escindir el ADN exterior. Las células hospederas de hongos que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, células Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoras y Aspergillus. Unos pocos ejemplos de lineas celulares de animal- que pueden usarse son CHO, VERO,. BHK, HeLa, Cos, MDC , 293, 3T3, y WI38.. Nuevas lineas, celulares de animal pueden establecerse usando métodos bien conocidos, por aquellos experimentados en el arte (por ejemplo, por transformación, infección vírica, y/o selección) . Opcionalmente, la proteína ' puede secretarse por las células hospederas .en el medio.

Moléculas SDAB modificadas Las formulaciones de la invención pueden contener al menos una molécula . SDAB que - tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de un dominio, que se presenta naturalmente, por ejemplo, dominio VH, por al menos una. posición de aminoácido en una de las regiones de estructura. Deberá entenderse que las secuencias de aminoácido de - algunas de las. moléculas SDAB de la invención, tales- como las moléculas. SDAB humanizadas, pueden diferir por al menos una posición de aminoácido en al menos una de las regiones de estructura de las secuencias de aminoácido del .dominio que se presenta naturalmente, por ejemplo, los dominios VHI-I que se presentan naturalmente. ;.

La invención, también incluye formulaciones de derivados de las moléculas . SDAB'. Tales derivados pueden generalmente obtenerse por modificación, y en particular por modificación química y/o biológica (por ejemplo, enzimática) , de las moléculas SDAB y/o de uno o más de los residuos de aminoácido que forman las moléculas SDAB descritas en la presente. Los ejemplos de tales modificaciones, así como ejemplos de residuos de aminoácido' dentro de .la secuencia de molécula SDAB que pueden modificarse de tal manera (esto es ya sea en la columna de proteína pero preferiblemente en una cadena lateral), los métodos y técnicas que. pueden usarse para introducir tales .'modificaciones y los. usos potenciales y ventajas de tales modificaciones será claro 'para la persona experimentada.

Por ejemplo, tal modificación puede involucrar la introducción (por ejemplo por ligadura covalente o en cualquier otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales, residuos o porciones, en' o dentro de la molécula SDAB, y en particular de uno o más grupos, funcionales, residuos o porciones que confieren una o más porciones o funcionalidades deseadas para las moléculas SDAB. El ejemplo de tales grupos funcionales será claro para la persona experimentada.

Por ejemplo, tal modificación, puede comprender la introducción (por ejemplo por enlace ¿oválente o en cualquier otra manera adecuada), de uno o más grupos funcionales que incrementan la vida media, la solubilidad y/o la absorción de la molécula. SDAB,. que reduce la inmunogenicidad · y/o la toxicidad de la molécula SDAB, que elimina o atenúa cualquiera de los efectos colaterales indeseados de la molécula SDAB, y/o que confiere otras propiedades ventajosas para y/o reduce las propiedades indeseadas de la molécula SDAB; o cualquier combinación de dos o más de los exteriores. Los ejemplos de tales grupos funcionales y de técnicas para introducirlos serán claros para la persona experimentada, y pueden generalmente comprender todas las técnicas y grupos funcionales mencionados en la técnica general de los antecedentes citados arriba asi como los grupos funcionales y técnicas conocidas per. se para la modificación de proteínas farmacéuticas, y en particular pará la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (incluyendo ScFvs y anticuerpos de dominio sencillo) , para los cuales se hace referencia por ejemplo a Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed., Mack Publishing Co., Easton, -P (1980). Tales grupos funcionales pueden por. ejemplo ligarse directamente (por ejemplo . covalentemente) a una molécula SDAB de. la invención, u opcionalmente por medio de un espaciador o ligadura adecuada, como de nuevo será claro para la persona experimentada. Una técnica ampliamente usada para incrementar la vida media y/o la inmundgenicidad reducida de proteínas farmacéuticas comprende unión de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, tal como poli (etilenglico.l ) ; (PEG) o derivados de los mismos (tales como metoxipoli .( etilenglicol ) o mPEG) . Generalmente, puede usarse' cualquier :f.orma adecuada de pegilación, tal como la pegilación usada, en el arte para anticuerpos y. fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero no limitado a anticuerpos de dominio (sencillo) y ScFvs) ; se hace' referencia a por ejemplo Chapman, Nat . Biotechnol., 54:531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug.. Deliv. Rev. 54:453-456 (2003); Harris and Chess, Nat. Rev. Drug.. Discov., - 2, (2003); y WO 04/060965. Varios reactivos para peg.ilación de proteínas también están comercialmente disponibles, por ejemplo de Nektar Therapeutics, EUA ..¦· Preferiblemente, se usa pegilación dirigida al sitio, en particular por medio de una cisteína-residuo (ver por ejemplo Yang et al., Prot.e.in Éngineering 16 (10) : 761-770 (2003)). Por ejemplo, para este propósito, PEG puede unirse a un residuo de cisteína que ocurre naturalmente en una molécula SDAB, una molécula SDAB puede modificarse, a · fin de · introducir adecuadamente uno. o más residuos de cisteína para enlace de PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más residuos de cisteína para unión de PEG puede fusionarse a la terminal N y/o C de una SDAB de la invención, todos usando técnicas de proteína preparada por. ingeniería conocidas per se para la persona experimentada.

Preferiblemente, para la molécula SDAB, se usa un PEG con un peso molecular de más de 5000, tal como más de 10,000 y menos de 200,000, tal como menos de 100,000; por ejemplo en el intervalo de 20, 000-80, 000.

¦ Con respecto a la' pegilación, debe señalarse que generalmente, la invención también abarca cualquier molécula SDAB que se ha pegilado en una o más posiciones de aminoácido,, preferiblemente de tal manera que la pegilación ya sea. (1) . incrémenta -la vida media in vivo; . (2) reduce la inmunogenicidad; (.3) proporciona una o más propiedades benéficas adicionales conocidas per se para pegilación; (4) no afecta esencialmente la afinidad de la molécula SDAB (por ejemplo no reduce la afinidad por más de 90%, preferiblemente nó por más de 50%, ;y por no más de 10%, como se determina por un ensayo adecuado, tales como aquellos descritos en los Ejemplos a continuación);, y/o (4) no afecta cualquiera de las otras propiedades deseadas de la molécula SDAB. Los métodos y grupos PEG adecuados para unirlos, ya seá específicamente o no específicamente, será claro para la persona experimentada.

Se describen SDABs pegilados, por ejemplo en' la Solicitud Provisional de E.U.A. No . 61/265 , 307 , .presentada el 16 de julio de 20-1, que se incorpora como referencia en la presente.

En algunas modalidades, el SDAB pegilado comprende . una molécula SDAB modificada ligada a un . olímero .PEG, en donde la molécula de polímero PEG es una molécula de polímero PEG ramificada seleccionada del grupo que consiste de formulas En algunas modalidades, el SDAB pegilado comprende: (i) uno o más dominios enlazados al antígeno sencillos que enlazan a uno o más objetivos; (ii) una ligadura no peptídica; y (iii) . una o más moléculas de polímero, en donde la ligadura no peptídica es una porción de la fórmula ( I ) : en on e Wl y W2 son cada uno independientemente seleccionados de un enlace o NR1 ; : Y es un enlace,, alquileno Cl-4 sustituido con 0-2 ocurrencias de Ra o una pirrolidin-2, 5-diona; X es 0, un enlace o está ausente; Z es 0, NR3, S. p un enlace; Rl y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1- 6 ; R2. está ausente o es una o más porciones de polímero; Ra es selecciona de hidroxilo, alquilo Cl-4 o alcoxi Cl- 4; m es 0 o 1 ; n és 0, 1, 2 o 3; . p es O, 1, 2, 3 o 4.

En modalidadés adicionales, el SDAB pegilado se liga al PEG por medio de una ligadura representada por la siguiente fórmula : En modalidades particulares, la molécula SDAB modificada comprende la siguiente estructura: . ', Otra modificación usualmente menos preferida comprende glicosilación N-ligada u O-ligada., usualmente como parte de la modificación. · co-traducción y/o post-traducción, dependiendo de la célula hospedera usada para expresar la molécula SDAB.

Métodos para hacer SDABs Las moléculas SDAB pueden producirse por células hospederas vivas que se han preparado por .ingeniería genéticamente para producir la proteína. Los métodos de células preparada$ por ingeniería genéticamente para producir proteínas son bien conocidos en. el arte. Ver por ejemplo Ausubel et al., eds .. (1990), Current. Protocols in Molecular Biology (Wiley, Mew York) . Tales métodos incluyen introducir ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión de la proteína en células , hospederas vivas. Estas células hospederas pueden ser células bacterianas, células de hongos, o células animales que crecen en el. ' cultivo. Las células hospederas bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células Escherichia coli. Los ejemplos de cepas E. coli adecuadas incluyen: HB101, DM5a, GM29.29, JM109, K 251, NM538, NM539, y cualquier' cepa E. coli- que falla para escindir el ADN exterior. Las células hospederas de hongos que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, células Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus. Pocos ejemplos de las líneas celulares animales que pueden usarse son CHO, VERO, BHK, HeLa, Coa, MDCK, 293, 3T3, y WI3.8. Las nuevas líneas celulares animales pueden establecerse usando métodos bien conocidos por aquellos experimentados en el arte (por ejemplo, por transformación, infección vírica, y/o selección) . Opcionalmente, la proteína puede secretarse por las células hospederas en el medio.

En algunas modalidades, las moléculas SDAB pueden producirse en células bacterianas, por ejemplo, células El. coli. Por ejemplo, si la SDAB se codifica por secuencias en n vector de despliegue de fagos que incluye un códón de paro supresivo entré la entidad de despliegue y una proteina de bacteriófago (o fragmento del mismo) ,. el ácido nucleico vector puede transferirse en una célula bacteriana que no puede suprimir . un codón de paro. En este ;caso, la SDAB no se fusiona la proteina del gen IEI y se secreta en .el periplasmo y/o medios .

Las moléculas SDAB también pueden producirse en células eucárióticas . En . Una modalidad, : las moléculas SDAB. se expresan en una célula, de levadura tal como Pichia (ver, por ejemplo, Powers et al. J Immunol Methods 251:123-35 (2001).)-, Hansenula, o Saccharomyces .

En una modalidad, las moléculas SDAB se producen en células mamiferas. Las células hospederas mamiferas típicas para expresar los anticuerpos del clon o fragmentos enlazados al antígeno de la:; mismas incluyen Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células .dhfr - CHO, descritas en Urlaub y Chasín, . Proc; Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220 (1980), usadas . con un como un. marcador . seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, Mol. Biol. 159: 601-621 (1982) ) , las líneas celulares linfocíticas , por ejemplo, células de mieloma NS0 y células SP2, células COS, y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial mamífera...

Además de las secuencias de' . ácido nucleico que codifican la molécula SDAB, los vectores de expresión recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la r.eplicación del vector en células hospederas (por ejemplo, origines de replicación) y genes marcadores selecciónateles. El gen marcador selecciónatele facilita la selección de células hospederas en las cuales el vector se ha introducido . (ver por ejemplo. Patentes de E.ü.A Nos. 4,399,216; 4,634,665; y 5,179,017) . Por ejemplo, típicamente el gen marcador selecciónatele confiere resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina , o metotrexato, en una célula hospedera en la cual el vector se ha introducido.

En un sistema ejemplar para la expresión recombinante de la molécula SDAB, un vector de expresión recombinante que codifica la cadena de anticuerpo de dominio sencillo se introduce e células dhfr-CHO por. transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes del anticuerpo ' se ligan operativamente a los elementos reguladores aumentadores/promotores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirüs y los similares, tales como un elemento regulador aumentador CMV/promotor AdMLP o un elemento regulador aumentador SV40 /promotor AdMLP) para conducir ¦niveles .. altos de transcripción de los, genes.. El vector de expresión recombinante' también porta un gen · DHFR, que se permite para selección de células. CHO que se . han transfectado con el vector usando selección/amplificación de metotrexato. Las células hospederas transformantes seleccionadas pueden cultivarse para permitir la expresión de las cadenas de anticuerpo y el. dominio sencillo intacto se recupera del medio de cultivo. Las tecnologías de biología molecular estándares pueden usarse para preparar el vector de expresión recombinante , transfectar las células hospederas, : seleccionar los transformantes, cultivar las células hospederas y recuperar la molécula de anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, algunas moléculas- SDAB pueden aislarse por cromatografía de afinidad.

En una modalidad, la molécula SDAB se purifica como se describe en la WO 10/056550. En' una modalidad ejemplar, el SDAB se purific;. de uno o más contaminantes al: poner en contacto una mezcla . de SDAB y contaminantes con un soporte con base en la Proteína A y/o un soporte de intercambio de iones, bajo condiciones que permiten a la SDAB enlazar a o adsorber al. soporte; remover uno o más^ contaminantes al lavar el soporte de enlace. bajo condiciones donde la SDAB- permanece enlazada al soporte, y eluir selectivamente la SDAB del soporte, al eluir la molécula SDAB adsorbida con una solución amortiguadora de elución.

Las moléculas SDAB también pueden, producirse por un animal transgénico. Por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,849,992 describe un método para expresar un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Un transgen que está construido incluye un promotor específico de leche y ácidos nucleicos que codifican la molécula de anticuerpo y una secuencia de señal para secreción. La lecha producida por las hembras de tales mamíferos transgénicos incluye, secretada de las mismas, el dominio sencillo de interés. La molécula de anticuerpo' puede purificarse de la leche, o para algunas aplicaciones, usadas directamente.

Formulaciones Las SDABs de .la invención pueden formularse en cualquier formulación farmacéuticamente aceptable. La formulación puede ser líquida o seca. La formulación puede generarse por medio de mezclado, secado, liofilización, secado al vacío, o cualquier método conocido para . formular composiciones farmacéuticas.

Una formulav:ión farmacéutica puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para concentración de proteína alta. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse al incorporar un .. agente descrito en la presente en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados arriba, . como se requiera, seguido por esterilización, filtrada. Generalmente, las dispersiones so preparan al incorporar un agente descrito en la presente en. un vehículo que contiene . un ' medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados a -continuación.. La . fluidez, apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, por el. uso de un recubrimiento tal como lecitina,. por el mantenimiento del tamaño de partícula · requerido en el caso de dispersión y por el uso de los tensoactivos .

La absorción prolongada de composiciones inyectables puede traerse alrededor .'al incluir en la composición ün agente que retrasa la absorción, por. ejemplo, sales de monostearato y gelatina.

·.. Una. formulación de una molécula ¦ SDAB incluye una molécula SDAB, un compuesto que puede servir como un crioprotector, y una solución amortiguadora. El pH de la formulación es generalmente pH 5.5 - 7.0, preferiblemente alrededor de pH 6. En algunas modalidades,., una formulación se almacena como un líquido. En otras modalidades, una formulación se prepara como un líquido y luego se seca, por ejemplo, por liofilización o secado por rocío, antes del almacenamiento. Una formulación seca puede usarse como un compuesto seco, por ejemplo, como un aerosol o polvo, o reconstituirse a su concentración original u otra, por ejemplo, usando agua, una solución amortiguadora, u otro líquido apropiado...

El proceso de purificación de 3.a molécula SDAB se diseña para permitir la transferencia de una molécula SDAB en una formulación adecuada para almacenamiento de larga duración como un líquido congelado y posteriormente para secado por congelado (por ejemplo, usando una formulación de histidina/sacarosaj . La formulación, se liofiliza con la proteína en una concentración específica. La formulación liofilizada luego puede reconstituirse como se necesario con un diluyente adecuado (por ejemplo, agua) para; resolubilizar los componentes ' . de. formulación originales para una concentración deseada,. generalmente la misma o superior concentración comparada con la .' concentración antes de la liofilización .

La formulación- liofilizada puede reconstituirse para producir una formulación que tiene una' concentración que difiere de la concentración original (esto es, antes de la liofilización) , dependiendo dé la cantidad de agua ,o diluyente agregado al liofilado relativo al volumen de líquido que originalmente se secó por congelado. Las formulaciones adecuadas pueden identificarse al procesar por ensayo uno o más parámetros de la integridad del anticuerpo.

Las SDABs de la invención pueden formularse como se describe en la WO 10/077422. Las SDABs de la invención pueden formularse por los siguientes procesos ejemplares: liofilizar una mezcla 10 de . una SDAB,' un lioprotector , un tensoactivo, y una solución .amortiguadora; y reconstituir la mezcla liofilizada. en los diluyentes, . por ello prepara la formulación. En modalidades particulares, las SDABs de la invención se formulan por el siguiente proceso: expresando la SDAB en un cultivo celular; purificando. la SDAB. por medio de la etapa de purificación de cromatografía y/o una etapa de ultrafiltración/dia.filtración; ajusfando la concentración de la SDAB hasta alrededor de 10 hasta 250 mg/ml en una formulación que contiene sacarosa en una concentración de alrededor de 5-10°., polisorbato-80. en una concentración de alrededor de 0.01-0.02%, y una solución amortiguadora de histidina en una concentración de alrededor de 10-20 mM o una solución amortiguadora Tris en una concentración de alrededor de 20 mM, de manera qué el pH de la formulación es alrededor de 5 hasta 7.5.

Métodos de tratamiento Las moléculas SDAB pueden administrarse' a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) solas o en combinación con un segundo agente, por ejemplo,. un segundo agente terapéuticamente o farmacológicamente activo, para tratar o prevenir (por ejemplo, reducir o aliviar uno o más síntomas asociados: con) un trastorno asociado con TNFa, por ejemplo, trastornos inflamatorios o autoinmunitarios .

Las moléculas SDAB de la invención, tales como polipéptidos que comprenden dos SDABs del factor alfa de la: necrosis anti-tumor (TNFa) y .. un SDAB de albúmina de suero anti—humano. ' (HSA) , pueden usarse para tratar o prevenir un trastorno inmunitario en un humano que necesita del mismo, solo o en combinación con- un segundo agente como se, describe en la' presente.

El término "tratamiento" se refiere a administrar una terapia en una cantidad, manera, y/o modo efectivo para mejorar una afección, síntoma, o parámetro asociado con un trastorno o para prevenir el progreso de una enfermedad, a ya sea un grado estadísticamente importante o a un grado detectable para alguien experimentado en el arte. En el caso de uso terapéutico, el tratamiento puede mejorar, curar, mantener, ..o disminuir la duración, el trastorno - o afección en el sujeto. En usos terapéuticos, el sujeto puede tener una manifestación parcial o completa de los síntomas. En un caso típico, el tratamiento mejora, el trastorno o afección del sujeto a una. extensión detectable por un médico, o .previene el empeoramiento del trastorno o afección. Una cantidad, manera, ¦ o modo efectivo puede variar dependiendo del sujeto y. puede personalizarse para el sujeto. ¦ Como se usa en la presente, los términos "sujeto", y "paciente"' se usan intercambiablemente. Como .se usa en la presente, los términos "sujeto" y "sujetos" se refieren a un animal, por ejemplo, un mamífero, incluyendo uno no primate (por ejemplo, una vaca, cerdo, caballo, burro, cabra, camello, gato, perro, conejillo de indias, rata, ¦ ratón, oveja) . y uno primate (por ejemplo, · un mono, tal como un mono cynomolgus, gorila chimpancé y un. humano) .

Los ejemplos no limitantes de trastornos inmunitarios que . pueden tratarse incluyen,¦ pero no se limitan a, trastornos inmunitarios,. por ejemplo,, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis . reumatoide juvenil, .osteoartritis, artritis psoriática, ¦ artritis asociada con lupus o espondilitis, anquilosante), . escleroderma , lupus sistémico eritematoso, síndrome, de Sjbgren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y ' dermatitis eccematosa ) ,/ miastenia gravis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis); afecciones inflamatorias agudas (por ejemplo, éndotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome de choque tóxico y enfermedad infecciosa); rechazo al trasplante y alergia. En una modalidad, el trastorno asociado con TNFa es, un trastorno artrítico, por ejemplo, un trastorno elegido de una o más de artritis reumatoide, artritis . eumatoide · juvenil (RA) (por ejemplo, . artritis reumatoide moderada a severa), osteoartritis, . : artritis psoriática, o espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil poliparticular (JIA); o psoriasis, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfermedad' inflamatoria del . intestino, y/o esclerosis múltiple.

En ciertas modalidades, las moléculas' SDAB (o formulaciones) se administran o usan para administración en combinación .con un segundo agente terapéutico. Por ejemplo, para TNF-SDABs, el segundo agente puede ser un anticuerpo anti-TNF. o fragmento enlazado a TNF del mismo, en donde el segundo anticuerpo TNF tiene una- especificidad de epítopo diferente que la molécula SDAB enlazada a TNF de la formulación. Otros ejemplos no limitantes de agentes 61 ¦ ¦ .· . ' ¦ que pueden co-formularse con . SDAB enlazados a TNF incluyen, por ejemplo, un inhibidor de citocina, un inhibidor del factor de crecimiento, un inmunosupresivo, un agente anti-i'nflamatorio, un inhibidor metabólico, un inhibidor de enzima,- un agente citotóxico, y un agente citostático. En una modalidad, el agente adicional es un tratamiento estándar para .artritis, incluyendo, pero no limitado a, . agentes anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs) ; , corticosteroides , incluyendo prednisolona , prednisona, corti ona, y triamcinolona ; y fármacos antireumáticos que modifican la enfermedad (DMARDs), tales como metotrexato, hidroxicloroquina (Plaquenil) .y sulfasalazina,- leflunomida (Arava®) , inhibidores del factor de la necrosis del tumor, . incluyendo etanercept (Enbrel®) , infliximab (Remicade®) (con o sin metotrexato)', y adalimumab (Humira®) , anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, Rituxan®) , receptor de interleucina-1 soluble, tal como anaquinra (Kineret) , oro, minociclina ;¦ (Minocin®) , penicilamina , y agentes citotóxicos, ·, ' incluyendo azatioprina, c:ic:lofosfamida , y eiclosporina . Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones inferiores de los; . agentes terapéuticos administrados,' de esta manera evitando toxicidades posibles o complicaciones asociadas con las varias monoterapias .

Cuando el agente adicional es metotrexato, la dosis de metotrexato puede estar en el intervalo desde alrededor de 7.5 hasta alrededor de 25 mg semanalmente .

La molécula .' SDAB' puede administrarse o usarse para administración en la forma de una solución liquida (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles) . Tales composiciones pueden administrarse por un modo parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular),, .' o. '. por inhalación. . Las frases "administración . parenteral" y, "administrado parenteralmente" como se usa en la presente significa modos de administración, diferentes de la administración completa y tópica, . usualmente por inyección, e incluyen, administración. . subcutánea o intramuscular, asi como infusión e . inyección intravenosa, intracapsular , intraorbital , intracardiaca, intradérmica , intraperitoneal, t.ranstraqueal , subcuticular , subcapsular, subaracnoidea, intraspinal, epidural y intrasternal . En una modalidad, las formulaciones descritas en la presente se administran subcutáneamente.

Los inventores actuales hipotetizan que los sitios de interacción biespecificos de ozoraiizumab con : TNFa son particularmente . útiles para. tratar trastornos inmunitarios . En consecuencia,, la presente invención se refiere a un método para tratar un trastornó inmunitario en un humano que necesita del ' mismo, que comprende administrar al humano un polipéptido que compite con el polipéptido que comprende la secuencia, de aminoácidos de la SEQ.ID N0:1 (ozoraiizumab) .

Regímenes de dosificación El ozoraiizumab muestra eficacia al tratar artritis reumatoide cuando se administra subcutáneamente con al menos cuatro semanas entre las dosis.. En contraste, la dosificación recomendada para Humira* es la administración cada dos semanas ¦ y Remicad ® debe administrarse intravenosamente..- En consecuencia los regímenes de dosificación de la invención actual' proporcionan, ventajas sobre el. estado del arte.

Las moléculas SDAB de la invención han mostrado eficacia al tratar : la. enfermedad en dosis de 30 mg y 80 mg administradas cada 4 semanas. El modelado con base en estos resultados de eficacia . indican que en dosis superiores (por ejemplo, 120-200 mg o. 200-400 mg), las moléculas SDAB dé la ' invención son eficaces al tratar la enfermedad cuando se administra cada. 6 u 8 semanas o 2 meses. Este perfil ventajoso, resulta en una carga de inyección disminuida.

Además, el modelado también indica que las infecciones serias (SI) del tratamiento ozoraiizumab fueron inferiores que' con etanercept . e inflixima . En particular, comparadas con el arte previo- los inhibidores anti-TNFa, las moléculas SDAB de la presente invención demuestran un beneficio muy favorable (eficacia), para la relación de riesgo (efectos SI) . - En ' consecuencia, las moléculas SDAB de la invención pueden administrarse cada¦ , 6, u 8 semanas en dosis en el intervalo desde 30-200 mg . Las dosis eficaces particulares son 30-400 mg . En modalidades particulares, la dosis comprende alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 320, 350, 375 o 400 mg de una molécula SDAB.

Las dosis sencillas de alrededor. de 30-200. mg o aún 30-400 mg pueden administrarse aproximadamente cada día, cada dos días, dos veces a la semana, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 semanas, o cada 1. o 2 meses.. .

En modalidades particulares, una dosis de- alrededor de 30, 80, 120, 160,' 200, 240, 280, 320, 360 o 400 mg de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (ozoraiizumab) se administra a sujetos humanos aproximadamente cada 4, 6, u 8 semanas o 2 meses. En algunas modalidades, los sujetos están sufriendo de artritis reúmatoide .

En modalidades adicionales, la dosis de la molécula SDAB es alrededor de 1, 5, 10, 15, 20, 25, .30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145,' 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, . 290, 295, 300,- 305, 310, 315, 320,. 325, 330, 335, 34.0,- 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, .385, 390, 395 o 400 mg.

. En algunas modalidades, la dosis es alrededor de 3.6, 10.8, 36, 72, 144, o 288 mg.

En modalidades particulares, la ..molécula SDAB está PEGilada y la dosis es alrededor de 3.6, 10.8, 36, 72, 144, o 288 mg.

Para administración a pacientes juveniles, la dosis deberá ajustarse al peso del paciente. En modalidades particulares la ' dosis es alrededor de.0.1, 0.38, 1, 2, 3, 3.5, 4, .5 o 5 rng/kg.

Los sujetos pueden tratarse concurrentemente con metotrexato. En algunas modalidades, los sujetos pueden haber recibido metotrexato durante al menos, alrededor de 6 o 12 semanas antes de la dosificación inicial con ozoralizumab . El metotrexato puede administrarse por cualquier vía adecuada, y la dosis puede estar en el intervalo desde, alrededor de 7.5 hasta 25 mg sémanalmente .

Métodos para determinar la eficacia La eficacia ¦'. de . cualquier molécula SDAB particular o régimen de dosificación puede determinarse por métodos disponibles para aquellos de experiencia en el arte. Brevemente, durante una prueba clínica,, los pacientes pueden observarse por personal médico y el estado de enfermedad se evalúa por cualquier combinación de criterios. La mejora de un estado de enfermedad del paciente se determina con base en estos . criterios en numerosos puntos de tiempo y la combinación de estas determinaciones en una población del paciente se gráfica para evaluar la eficacia del tratamiento.

En modalidades ejemplares, el progreso de la enfermedad ¦para artritis feumatoide puede' medirse por cualquiera o todos de los criterios establecidos en la Tabla 2.

Tabla 2 EJEMPLOS Ejemplo 1 Se realizó un estudio controlado por placebo, doble ciego, estratificado, aleatorio, de 1/2 fase constante en pacientes con artritis reumatoide (RA) con: ozoralizumab . Hubo un total de 254 sujetos colocados aleatoriamente al estudio; de los cuales un sujeto no se trató y los 253 sujetos restantes se incluyeron en la población pretendida para tratar modificada' (mITT) asi como la población de seguridad. Cada sujeto se asignó aleatoriamente a sólo un grupo de tratamiento, estratificado con base en el inhibidor TNF (TNFi) no tratado o uso antes de TNFi.. Hubo un, total de seis grupos de tratamiento, descritos en , la Tabla 3, con 40-45 pacientes elegidos aleatoriamente en cada grupo.

Tabla 3 Las características del valor de referencia en estos seis grupos fueron generalmente similares; la diferencia sólo pequeña pero estadísticamente importante (p=0.048) observada entres los grupos fue en DAS28 con el DAS28 medio más alto (6.59) en el grupo Q4 'de 80 mg. Las edades del sujeto están en el intervalo desde 18 hasta 79. (media de 52.1) y la mayoría de los sujetos (80.2%) fueron hembras (como se espera para una prueba clínica en pacientes RA) . La media general de la duración de la enfermedad fue 8.3 años, y 28.9% de los sujetos han recibido tratamiento previo TNFi.

La población primaria para el. análisis de eficacia fue la población mITT, definida como todos los sujetos aleatorios quienes reciben al menos una dosis de ozoralizumab . Todos los pacientes se trataron concurrentemente, con metotrexato .en · dosis de 7.5 hasta 25 mg semanalmente .

Cada sujeto recibe una inyección subcutánea (SC) de un nivel de dosis sencilla de ozoralizumab o placebo en los puntos de tiempo indicados.

Las comparaciones primarias de interés son las comparaciones de cada grupo de tratamiento ATN-103 contra placebo.

La Tabla 4 muestra las tasas de respuesta del Colegio Americano de Reumatología 20 (ACR20) en la semaria 16.

Tabla 4 Diferencia ajustada con placebo y su intervalo de confianza (30% percentil, 80% Tratamiento N n % Valor P percentil) OZORALIZUMAB general (OZORALIZUMAB - Placebo) contra placebo Placebo 45 19 (42.2) 0.120 10 mg Q4 42 22 (52.4) 0 130 10.2 (9.3, 24.7) 10 mg Q8 41 20 (48.8) 0.390 6.6 (3.6, 19.6) 30 mg Q4 40 2 (60.0) 0.122 17.8 (9.4, 25.0) 80 mg Q4 43 31 (72.1) 0.006 29.9 (23.5, 38.7) 80 mg Q8 42 25 (59.5) 0.101 17.3 (12.2, 27.9) El valor P se obtuvo con base en la prueba Cochran-Mantel-Haenszel estratificada (TNFi no tratado o uso previo a TNFi). El método de ponderación de riesgo mínimo (MR) propuesto por Mehrotrá y Railkar - se usa para cálculo del intervalo de confianza estratificado (TNFi no tratado o uso previo a TNFi) para la diferencia ajustada por placebo. Se usó la última observación realizada para el enfoque delantero (LOCF) para imputar cualquier dato perdido de los componentes ACR antes de que la respuesta ACR20 se derive.

La Figura 1 muestra el porcentaje de sujetos que logran los criterios ACR20, ACR50, y ACR70 en la semana 8 y semana 16. Algunos de los regímenes de dosificación tienen una ventaja sobre placebo en los siguientes puntos finales: ACR20 (Figuras 1 y 2), ACR50 (Figura 1),; DAS28 (Figura' 3), ACR-N, TJG, SJC, VAS do Dolor, HAQ-DI, CRP, Evaluación Global del Medico, Evaluación Global del Paciente, VA5 de Salud General, y respuesta EULAR (no se muestran- los datos) .

Brevemente, como se muestra en la Figura 1, en la semana 8, para 10 mg de Q.8, 36.6% de los sujetos alcanzan ACR20, 9.8% de los sujetos alcanzan ACR50, y 0% de los sujetos alcanzan ACR70; para 10 mg de Q4, 45.2% de los sujetos alcanzan ACR20, '· 11.9%. de los sujetos alcanzan ACR50, y 7.1% de los sujetos alcanzan ACR70; para 30 mg de Q4, 50% de los sujetos alcanzan ACR20, 32.5% .de los. sujetos alcanzan ACR50, y;15% de los sujetos alcanzan ACR70; para 80 mg Q8, 54.8% de los sujetos alcanzan ACR20, 23.8% de los sujetos alcanzan ACR50, y 4.8% de los sujetos alcanzan ACR70; y para 80 mg de Q4, 65.1% de los sujetos alcanzan ACR20, 25.6% de los sujetos alcanzan ACR50, y 2.3% de los sujetos alcanzan ACR70. En la semana 16, para 10 mg de Q8, 48.8% de los sujetos alcanzan ACR20, 24.4% de los sujetos alcanzan ACR50, y 8.9% de los sujetos alcanzan ACR70; para 10 mg de Q4, 52.4% de los sujetos alcanzan ACR20, 21.4% de los sujetos alcanzan ACR50, y 4.8% de los sujetos alcanzan ACR70; para 30 mg de Q4, 60% dé los sujetos alcanzan ACR20, 32.5% de los sujetos alcanzan ACR50, y 20% de los sujetos alcanzan ACR70; para 80 mg de Q8, 59.5% de los sujetos' alcanzan ACR20, 31% de los sujetos alcanzan ACR50, y 19% de los sujetos alcanzan ACR70; y para 80 mg de Q4, 72.1% de los sujetos alcanzan ACR20, 37.2% de los sujetos alcanzan ACR50, y 11.6% de los sujetos alcanzan ACR70.

Como se muestra en la Figura 3, en la semana 4, el cambio medio observado del valor de referencia (placebo) para los criterios DAS28 fue 1.39% para 10 mg de Q4, 1.05% para 10 mg de Q8, 1.62% para 30 mg de Q4, 1.63% para 80 mg de Q4,. y 1.67% para 80 mg de Q8.¦ En la semana 8, el cambio medio observado del valor de referencia para los criterios DAS28 fue 1.59% para 10 mg de Q4, 1.01% para 10 mg de Q8, 1.78% para 30. mg de Q4, 2.00% para 80 mg de Q4, y 1.85% para 80 mg de Q8.. En semana 12, el cambio medio observado del valor de referencia para los criterios DAS28 fue. 1.61% para 10 mg de Q4, 1.72% para 10 mg de Q8, 2.31% para 30 mg de Q , 2.30% para 80 mg de Q4, y 2.20% para 80 mg de Q8. En la semana 16, el cambio medio observado del valor de referencia para los criterios DAS28 fue 1.60% para 10 mg de Q4 , 1.70%. para 10 mg de Q8, 2.09% para .30 mg de Q4, 2.46% para 80 mg de Q4, y 1.93% para .80 mg de Q8. En la semana 20, el cambio medio observado del valor de referencia para los criterios DAS28 fue 1.02% para 10 mg. de Q4 , 1.03% para 10 mg. de Q8, 1.62% para 30 mg de Q4, 2.00% para 80 mg de Q4, y 1.36% para 80 mg de Q8.

En general, el perfil de seguridad de ozoralizumab aparece para ser ¦ comparable con aquel de otros agentes inhibidores TNF (TNFi) . Los SAEs reportados también fueron consistentes con el perfil de seguridad de otros agentes anti-TNF (no se muestran los datos ) .

Ejemplo 2: Eficiencias Comparativas del Nanobody® ATN-103 contra cinco anti-TNFs comercializados en Artritis revmatoide 2.1 Objetivos: Ozoralizumab '> -(ATN-103') , un inhibidor del ..factor de la necrosis del tumor . novedoso '. (TNFi), es un Nanobody humanizado, trivalente, biespecífico que contiene dos dominios enlazados a TNF humano ligados a un dominio enlazado a albúmina de suero humano. Se hizo un análisis meta basado en el modelo (MBMA). para evaluar las eficiencias comparativas de varios regímenes de dosis/dosificación de ATN-103 contra cinco fármacos que bloquean el factor alfa de la necrosis del tumor comercializados (anti-TNFa) con respecto a la eficacia (ACR20/50/70, ¦ DAS, HAQ) y seguridad/tolerabilidad (tasa de infecciones serias, %SI) y para evaluar el efecto de covariables explicativas. 2.2 Métodos: El.. análisis de. seguridad y eficacia comparativa con base en el modelo se. condujo a través de 5 comparadores (infliximab, adalimumab, etanercept, certolizumab pegol y golimumab) usando- fecha publicada, resumido en el nivel de extremidad del estudio, y en datos de..Fase lia interno.

En particular, el conjunto de datos ACR20/50/70 incluye datos de 7, 474 sujetos, que participan en 20 pruebas con un total de 63 extremidades. Se observó DAS en 21 extremidades en 8' pruebas. El conjunto de datos de la tasa de infección seria incluye datos de 6,209 sujetos, que participan en 14 pruebas con un total de 46 extremidades. Los conjuntos de datos que contienen mediciones de la exposición de fármaco (resistencias a la dosis, intervalos de dosificación), covariables de severidad de la enfermedad ' de valor de referencia (recuento de articulaciones sensibles e hinchadas, DAS observado, evaluación global de los médicos y pacientes, concentración CRP, duración de la enfermedad) , características de las poblaciones .de prueba (porcentajes de sujetos experimentados anti-TNFa, y geografía (sujetos Asiáticos contra no Asiáticos).

Los tres puntos finales ACR y los puntos finales DAS se describieron usando modelos, de articulación ACR20/50/70 y DAS, respectivamente.. 2.3 Resultados : 2.3.1 Respuesta AC20/50/70 de dosis simulada La relación de respuesta de dosis esperada de ATN-103 y cinco fármacos comparadores después de 24 semanas de tratamiento complementarios para medicación de fondo DMARD continua se simuló usando el modelo ACR20/50/70 final en una población del- paciente típico (TNF experimentado con un conteo de articulación hinchada de valor de .referencia media de 19 y 21% de respondedores ACR20 en el grupo placebo) . La Figura 4 muestra, la relación de respuesta de dosis predicha de ATN-103 para la. respuesta ACR20 en la semana 24 comparada con otros fármacos anti'-TNFa en la población.

Las simulaciones sugieren que 80 mg. de tratamiento Q4W ATN-103 es comparable con 95% de la respuesta para adalimumab y golimumab, mientras que 200 mg de ATN-103 Q4W se predice que produzcan una respuesta similar al 95% de la respuesta para etanercept. 2.3.2 Respuesta DAS de dosis simulada Se simuló la relación de respuesta de dosis esperada de ATN-103 y cinco fármacos comparadores para DAS ¾CfB después de 24 semanas de tratamiento complementario para experimentar medicación de fondo DMARD. La respuesta de placebo DAS se asumió para ser -16% de cambio del valor de referencia para DAS, reflejando la media de los estimados del parámetro del modelo de placebo medio no estructurado (no se muestran los datos ) .

La Figura 5 muestra la relación de respuesta de dosis esperada de ATN-103 para respuesta DAS comparadas con otros fármacos anti-TNFa. En 200- mg^ de Q4W, las simulaciones indican que ATN-103 es superior a golimumab y certolizumab en término de DAS %CfB.. 2.3.3 Tasas de infección serias simuladas Un %SI corregido de placebo simulado sugiere que la tasa de infección esperada de ATN-103 es comparable con aquella de ádaiimumab y golimumab, .mientras ' que ¦¦ . certolizumab, etanercept, e infliximab puede tener tasas de infección serias superiores (no se muestran los datos).

La Figura 6 proporciona una revisión integrada de la eficacia esperada (ACR) y perfil de seguridad (¾SI) de ATN-103 contra otros fármacos anti-TNFa. En . particular, la Figura 6 muestra, los intervalos de predicción al 95% de eficacia simulada (ACR20) de fármacos anti-TNFa en- régimen de dosificación relevante e intervalos de predicción al 95% simulados correspondientes de las tasas de infección serias. Se muestra una utilidad de eficacia/seguridad óptima hacia la esquina izquierda superior (alta eficacia, tasa de infección seria baja), disminuyendo hace la esquina derecha inferior. Los trazos de burbuja muestran una superposición considerable en utilidad entre los fármacos anti-TNFa.

Esta representación de seguridad y eficacia simulada sugiere que 200 mg de- ATN-103 Q4W pueden posicionarse bien contra otros fármacos anti-TNFa. 2.3.4 Régimen de- dosificación de 400 mg de Q8W El modelo . sugiere que la respuesta no es dependiente del régimen de tratamiento, y los efectos similares pueden obtenerse para el régimen de 200 mg de Q4 o uno de 400 mg de Q8W. 2.4. Conclusiones : Las eficiencias comparativas de' ATN-103 contra cinco fármacos anti-TNFa para eficacia (ACR/DAS) : y seguridad/tolerabilidad (tasa de infección seria) se evaluó en un análisis meta- con base en modelo. Comparado con otros fármacos anti-TNFa, ATN-103 muestra una combinación favorable de eficacia y efectos ST.

TLas simulaciones con base en el modelo . indican que 200 mg de ATN-103 Q4 o 400 ¦ mg de ATN-103 Q8W son similares en eficacia a etanercept,- adaiimumab e infliximab.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido caracterizado porque comprende dos SDABs del factor alfa de la necrosis anti-tumor (TNFa) y una SDAB de albúmina de suero anti-humano (HSA) para uso al tratar un trastorno inmunitario en un humano que necesita del mismo, al administrar. al humano múltiples dosis de 30-400 mg del polipéptido, en donde las dosis son aí menos alrededor de cada cuatro semanas separadas.

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cada SDAB anti-TNFa comprende 3 regiones que determinan la complementariedad . (CDR1, CDR2, y CDR3) en donde (a) CDR1 comprende (i) la . secuencia de aminoácidos DYWMY (SEQ ID NO: 22) ; (ii) una secuencia de aminoácidos que. tiene al menos 80% de identidad de secuencia con DYWMY (SEQ ID NO:22).; o.. ¦ '¦' · ¦ '· (iii) una. secuencia de aminoácidos que tiene sólo 1 diferencia de aminoácido de DY MY (SEQ ID NO: 22); (b) CDR2 comprende (i) la. secuencia de aminoácidos ' EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO: 23) ; . (ii) una secuencia de aminoácidos .que tiene al menos 80%, 90%, o 95% de- identidad de secuencia con EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ. ID NO: 23); O (iii) una: secuencia de aminoácidos que tiene 2 o 1 diferencias de aminoácido de EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO: 23) ; y (c) CDR3 comprende (i) la secuencia de aminoácidos SPSGFN (SEQ ID NO: 24) ; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% -de identidad de secuencia, con SPSGFN (SEQ ID NO: 24) ;.. o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene 1 diferencia de aminoácido de SPSGFN (SEQ ID. NO:24). .

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque CDR1 comprende la. secuencia de aminoácidos DYWMY (SEQ ID NO:22), CDR2 comprende la. secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO: 23), y CDR3 comprende la secuencia .de aminoácidos SPSGFN (SEQ ID NO:24).

4. El polipéptido. de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizado porque al menos una de las SDABs anti-TNFa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80%, 90%, 95%, o .99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 (TNF30) .

5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 4, .caracterizado porque cada SDAB anti-TNFa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, 90%, 95%, o 95%. de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 (TNF30) .

6: El. polipéptido' de conformidad' con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque el SDAB anti-HSA comprende 3 CDRs (CDR1, CDR2, y CDR3) en donde (a) CDR1 comprende (i) la secuencia de aminoácidos SFGMS (SEQ ID NO: 25) ; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SFGMS (SEQ ID NO:25); o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene sólo 1 diferencia. de aminoácido de SFGMS (SEQ ID NO: 25).; (b) CDR2 comprende (i) la secuencia de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID. NO: 26) ; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, . 90%, o 95% de identidad de secuencia con SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ -ID NO:26); o . (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o 1 diferencias de aminoácido de SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 26) ; y (c) CDR3 comprende (i) la secuencia de aminoácidos GGSLSR (SEQ ID NO: 27) ; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con GGSLSR (SEQ ID NO: 27) ; o (iii) una ¦ secuencia de aminoácidos que tiene 1 diferencia de/aminoácido de GGSLSR (SEQ ID NO : 27 ) .

7. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SFG S (SEQ ID NO:25), CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG : (SEQ. ID NO:26), y. CDR3 comprende la secuencia.de aminoácidos GGSLSR (SEQ ID NO:27).

8. El polipéptido : de conformidad con la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque el SDAB anti-HSA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, 90%, 95%, o 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 (ALB8).

9. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 8, caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1 (ozoralizumab) .

10. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado porque al menos una de las SDABs está humanizada.

11. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 10,· caracterizado porque cada uno de los dos SDABs anti-TNF y- SDAB anti-HSA se ligan por medio de ligaduras, en donde cada ligadura se selecciona del grupo que consiste de las secuencias de aminoácido de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO : 7.

12. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizado porque las dosis se separan en tiempo por al menos alrededor de un mes.

13. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 36, caracterizado porque las dosis se separan, en tiempo por al menos alrededor de - 6 semanas.

14. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 13, caracterizado porque las dosis se separan en tiempo por al menos alrededor de 8 semanas.

15. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 14, caracterizado porque las dosis, se seleccionan del grupo que' consiste de alrededor de 10, 30, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 275, 300, 320, 350,' 3.75 y 400 mg de la molécula SDAB.

. 16. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 15, caracterizado porque el polipéptido se administra subcutáneamente o intravenosamente.

1 . EL polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 16, caracterizado porque el humano se trata concurrentemente con metotrexato.

18. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 hasta 17, caracterizado porque el polipéptido se formula en una formulación farmacéuticamente aceptable.

19. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la formulación comprende (a) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 en una concentración de alrededor de 10 mg/ml hasta 250 mg/ml; (b) un lioprotector elegido de sacarosa, sorbitol, o trehalosa en una concentración de alrededor' de 5% hasta alrededor de 10%; ¦ (c) un t.ensoactivo elegido de polisorbato-80 o poloxámero-188 en una concentración de alrededor de 0.01% hasta 0.6%; y (d) una solución amortiguadora elegida de solución amortiguadora de ' h'istidina en una concentración de alrededor de 10 hasta 20 mM o una solución amortiguadora Tris en una concentración de alrededor de 20 mM'de manera que el pH de la formulación es alrededor de 5.0 hasta .7.5.

20. El polipéptido de conformidad con la reivindicación -19, caracterizado porque¦ la formulación comprende 100 mg/ml del polipéptido de conformidad con ..la reivindicación 1, histidina 20 mM, 7.5% (p/v) de sacarosa, y polisorbato-80 al 0.01% en pH 6.0. .

21. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 20, caracterizado porque el trastorno inmunitario se selecciona del grupo que consiste-de: inflamación, artritis., incluyendo artritis reumatoide, artritis psoriática, espondilitis anquilosante., artritis y osteoartritis idiopática juvenil, C.OPD, asma, enfermedades inflamatorias del intestino incluyendo enfermedad de Croh y colitis ulcerativa., , esclerosis múltiple, 'enfermedad' de Addison, Hepatitis autoinmunitaria, Parotitis autoinmunitaria, . Diabetes tipo . I, Epididimitis , Glomerulonefritis, enfermedad de Graves, Síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimot.o, Anemia hemolítica, Lupus eritematoso sistémico, Infertilidad masculina, Esclerosis múltiple, Miastenia gravis, Pénfigos, Psoriasis, Hidradenitis supurativa,. Fiebre ' reumática, Sarcoidosis , Escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías , Tiroiditis, y vascúlitis.

22. El polipéptido de conformidad con la .reivindicación 21, caracterizado porque el trastorno inmunitario es artritis reumatoide .

23. Un polipéptido caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID ÑO: 1 para. uso al tratar artritis reumatoide. en. un humano que necesita del mismo, al administrar, al humano 80 mg de un. polipéptido alrededor de cada cuatro semanas, en donde el humano se trata concurrentemente : con metotrexato.

24. Un polipéptido caracterizado . porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l para uso al tratar artritis reumatoide¦ en un humano que necesita del mismo, al administrar al humano 80 mg de un polipéptido alrededor de cada ocho semanas, . en donde el humano se .trata concurrentemente . con metotrexato.

25. El polipéptido para uso al tratar un trastorno inmunitario- en un humano que necesita ¦ del mismo, caracterizado porque el polipéptido compite con el polipéptido que .'.comprende la secuencia de aminoácidos d la SEQ ID NO:l (ozoralizumab) de conformidad con la reivindicación 9.