ES2606302T3 - Moléculas de unión biespecíficas que se unen a VEGF y ANG2 - Google Patents

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Abstract

Una molécula de unión biespecífica que comprende - un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a VEGF, - un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina sérica, y - un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a Ang2, en donde - dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a VEGF tiene las siguientes secuencias de CDR: CDR1: SYSMG CDR2: AISKGGYKYDAVSLEG CDR3: SRAYGSSRLRLADTYEY, - dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina sérica tiene las siguientes secuencias de CDR: CDR1: SFGMS (SEQ ID NO:255) CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:256) CDR3: GGSLSR (SEQ ID NO:257), - dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a Ang2 tiene las siguientes secuencias de CDR: CDR1: DYAIG (SEQ ID NO:248) CDR2: AIRSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:249) CDR3: VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA (SEQ ID NO:250), y donde dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a Ang2 se une con Ang2 con una potencia al menos 5.000 veces más alta que a Ang1 o a Ang4.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión biespecíficas que se unen a VEGF y ANG2
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la terapia humana, en particular de la terapia de cánceres, y a agentes y composiciones útiles en dicha terapia. 5
Antecedentes de la invención
Cuando los tumores alcanzan un tamaño crítico de aproximadamente 1 mm3, se vuelven dependientes de la angiogénesis para mantener el suministro de sangre con oxígeno y nutrientes que permite el crecimiento adicional. Las terapias antiangiogénesis se han convertido en una opción de tratamiento importante para varios tipos de tumores. Estas terapias se han centrado en el bloqueo de la ruta de VEGF (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 10 Mayo de 2004; 3(5): 391-400) mediante la neutralización de VEGF (Avastin) o sus receptores (Sutent y Sorafinib). Los estudios recientes en ratones han mostrado que la Angiopoyetina 2 (Ang2), un ligando del receptor Tie2, controla la remodelación vascular permitiendo las funciones de otros factores angiogénicos tales como el VEGF. Ang2 se expresa principalmente por células endoteliales inducidas fuertemente por hipoxia y otros factores angiogénicos, y se ha demostrado que regula la plasticidad de los vasos tumorales, permitiendo que los vasos 15 respondan a VEGF y FGF2 (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. Marzo de 2009; 10(3): 165-77). Como consecuencia de este papel, la deleción o inhibición de Ang2 tiene como resultado una reducción de la angiogénesis (Gale et al., Dev Cell. Septiembre de 2002; 3(3):302-4.) (Falcón et al., Am J Pathol. Noviembre de 2009; 175(5): 2159-70). Se han notificado concentraciones elevadas de Ang2 en suero para pacientes con cáncer colorrectal, NSCLC y melanoma (Goede et al., Br J Cancer. 26 de Octubre de 2010; 103(9): 1407-14), (Park et al., Chest. Julio 20 de 2007; 132(1): 200-6), (Helfrich et al., Clin Cancer Res. 15 de Feb de 2009; 15(4): 1384-92). En el cáncer CRC, los niveles en suero de Ang2 se correlacionan con la respuesta terapéutica a la terapia anti-VEGF.
El sistema Ang-Tie consiste en 2 receptores (Tie1 y Tie2) y 3 ligandos (Ang1, Ang2 y Ang4) (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. Marzo de 2009; 10(3): 165-77). Tie2, Ang1 y Ang2 son los miembros mejor estudiados de esta familia, Tie 1 es un receptor huérfano y aún tiene que definirse el papel de Ang4 para la remodelación vascular. Ang2 y 25 Ang1 median funciones opuestas sobre la unión y activación de Tie2. La activación de Tie2 mediada por Ang2 da como resultado la activación de células endoteliales, la disociación de pericitos, la fuga de vasos y la inducción de la ramificación de los vasos. A diferencia de lo que ocurre con Ang2, la señalización de Ang1 mantiene la integridad de los vasos por reclutamiento de pericitos, manteniendo de esta manera la quiescencia de las células endoteliales.
La angiopoyetina 2 (Ang2) es un ligando de 66 kDa secretado por la tirosina quinasa receptora Tie2 (Augustin et al., 30 Nat Rev Mol Cell Biol. Marzo de 2009; 10(3):165-77). Ang2 consiste en un dominio superenrollado N-terminal y un dominio similar al fibrinógeno C-terminal, este último es necesario para la interacción con Tie2. Ang2 se expresa principalmente por las células endoteliales y se induce fuertemente por hipoxia y otros factores angiogénicos, incluyendo VEGF. Tie2 se encuentra en las células endoteliales, células madre hematopoyéticas y células tumorales. Se ha demostrado que Ang2-Tie2 regulan la plasticidad de los vasos tumorales, permitiendo que los 35 vasos respondan a VEGF y FGF2.
Se ha mostrado que Ang2 in vitro actúa como un mitógeno modesto, quimioatrayente e inductor de la formación de tubos en las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Ang2 induce la fosforilación de tirosina de Tie2 expresado ectópicamente en fibroblastos y promueve acontecimientos de señalización aguas abajo, tales como la fosforilación de ERK-MAPK, AKT y FAK en HUVEC. Se ha descrito un papel antagonista de Ang2 en respuestas 40 de células endoteliales inducidas por Ang1.
Se ha demostrado que la deficiencia de Ang2 da como resultado un profundo defecto de diseño linfático en ratones. Aunque la pérdida de Ang2 es prescindible para el desarrollo vascular embrionario, los ratones con deficiencias de Ang2 tienen defectos vasculares persistentes en la retina y riñón. Junto con el patrón dinámico de la expresión de Ang2 en sitios de angiogénesis (por ejemplo, ovario), estos descubrimientos indican que Ang2 controla la 45 remodelación vascular al permitir las funciones de otros factores angiogénicos, tales como VEGF.
El sistema Ang2-Tie2 ejerce papeles cruciales durante el cambio angiogénico y etapas posteriores de angiogénesis tumoral. La expresión de Ang2 está fuertemente regulada de forma positiva en el endotelio asociado con tumor. Se ha observado crecimiento reducido de tumores cuando se implantan en ratones deficientes para Ang2, especialmente durante etapas tempranas de crecimiento tumoral. El bloqueo terapéutico de Ang2 con mAb de Ang2 50 ha mostrado amplia eficacia en una diversidad de modelos de xenotrasplante tumoral. Se han descrito efectos aditivos de mAb de Ang2 con inhibidores de VEGFR2 (mAb e inhibidores de peso molecular pequeño).
Como se ha descrito en, por ejemplo, los documentos US2008/0014196 y WO2008/101985 la angiogénesis está implicada en la patogénesis de varios trastornos, incluyendo tumores sólidos y metástasis así como enfermedades oculares. Uno de los factores proangiogénicos más importantes es el factor de crecimiento endotelial vascular 55 (VEGF), también denominado VEGF-A o factor de permeabilidad vascular (VPF). VEGF pertenece a una familia génica que incluye factor de crecimiento placentario (PlGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E y VEGF-F. El
corte y empalme alternativo de ARNm de un gen sencillo de VEGF humano da como resultado al menos seis isoformas (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 y VEGF206), siendo VEGF165 la isoforma más abundante.
Se han identificado dos tirosina quinasas receptoras de VEGF (VEGFR) que interaccionan con VEGF, es decir, VEGFR-1 (también conocido como FIt-1) y VEGFR-2 (también conocido como KDR o FIK-1). VEGFR-1 tiene la 5 mayor afinidad por VEGF, mientras que VEGFR-2 tiene una afinidad algo menor por VEGF. Ferrara (Endocrine Rev. 2004, 25: 581-611) proporciona una descripción detallada de VEGF, la interacción con sus receptores y su función en procesos patológicos y normales pueden encontrarse en Hoeben et al. Pharmacol. Rev. 2004, 56: 549 580.
Se ha indicado que VEGF es un regulador clave de angiogénesis tanto normal como anómala (Ferrara y Davis-Smyth, Endocrine Rev. 1997, 18: 4-25; Ferrara J. MoL Med. 1999, 77: 527-543). En comparación con otros factores 10 de crecimiento que contribuyen a los procesos de formación vascular, VEGF es único en su alta especificidad por células endoteliales dentro del sistema vascular.
Se sobreexpresa ARNm de VEGF por la mayoría de los tumores humanos. En el caso de crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser crucial para la transición de hiperplasia a neoplasia, y para proporcionar alimento para el crecimiento y metástasis del tumor (Folkman et al., 1989, Nature 339-58), lo que permite a las células tumorales 15 adquirir una ventaja de crecimiento en comparación con las células normales. Por lo tanto, las terapias anti-angiogénesis se han convertido en una opción de tratamiento importante para varios tipos de tumores. Estas terapias se han centrado en el bloqueo de la ruta de VEGF (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. Mayo 2004; 3(5): 391 400).
VEGF también está implicado en enfermedades oculares. La concentración de VEGF en los fluidos oculares está 20 altamente correlacionada con la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatías diabéticas y otras relacionadas con isquemia. Además, recientes estudios han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por degeneración macular relacionada con la edad (AMD). La regulación positiva de VEGF también se ha observado en diversos trastornos inflamatorios. VEGF se ha implicado en la patogénesis de artritis reumatoide, una enfermedad inflamatoria en la que la angiogénesis 25 desempeña un papel significativo.
La elucidación de VEGF y su papel en la angiogénesis y diferentes procesos ha proporcionado una nueva diana potencial de intervención terapéutica. La función de VEGF se ha inhibido por moléculas pequeñas que bloquean o previenen la activación de tirosina quinasas receptoras de VEGF (Schlaeppi y Wood, 1999, Cancer Metastasis Rev., 18: 473-481) y en consecuencia interfieren con la ruta de transducción de señales del receptor de VEGF. Los 30 conjugados citotóxicos que contienen toxinas bacterianas o vegetales pueden inhibir el efecto estimulante de VEGF en angiogénesis tumoral. Los conjugados de toxina VEGF-DT385 (dominios de toxina diftérica fusionados o conjugados químicamente con VEGF165), por ejemplo, inhiben eficazmente el crecimiento tumoral in vivo. La inhibición de crecimiento tumoral también podría conseguirse suministrando un mutante de FIk-1 o receptores de VEGF solubles por un retrovirus. 35
Se han desarrollado anticuerpos neutralizadores de VEGF, tales como A4.6.l y MV833, para bloquear la unión de VEGF con sus receptores y han mostrado actividad antitumoral preclínica (Kim et al. Nature 1993, 362: 841-844; Folkman Nat. Med. 1995, 1: 27-31; Presta et al. Cancer Res. 1997, 57: 4593-4599; Kanai et al. Int. J. Cancer 1998, 77: 933-936; Ferrara y Alitalo Nat. Med. 1999, 5: 1359-1364; 320, 340). Para una revisión de ensayos de enfoques terapéuticos anti-VEGF, véase Campochiaro y Hackett (Oncogene 2003, 22: 6537 6548). 40
La mayor parte de la experiencia clínica se ha obtenido con A4.6.1, también llamado bevacizumab (Avastin; Genentech, San Francisco, CA).
El documento WO2008/101985 describe dominios variables sencillos de inmunoglobulina de camélidos (VHH o “Nanobodies” como se define en la presente memoria), que se unen a VEGF, y su uso en el tratamiento de afecciones y enfermedades caracterizadas por angiogénesis o neovascularización excesiva y/o patológica. 45
WO2010/040508 describe anticuerpos anti-VEGF/anti-Ang-2 biespecíficos. Las moléculas dadas a conocer en el mismo por sus secuencias específicas son anticuerpos de cuatro cadenas clásicos, que tienen una segunda especificidad debido a una parte de unión adicional, esp. una porción de unión a scFv, fusionada al extremo C-terminal de las cadenas pesadas ( "CrossMabs")..
El artículo publicado por Kienast et al.: "Ang-2-VEGF-A CrossMab, a Novel Bispecific Human IgG1 Antibody Blocking 50 VEGF-A and Ang-2 Functions Simultaneously, Mediates Potent Antitumor Antiangiogenic, and Antimetastatic Efficacy" (2013); Clinical Cancer Research 19(24); páginas 6730-6740; da a conocer más datos sobre una de las moléculas CrossMab dadas a conocer en WO2010/040508, e i.a. muestra una comparación con moléculas anti-Ang2 y Anti-VEGF-A con respecto a un efecto necrótico sobre los tumores.
Ha sido un objeto de la presente invención proporcionar nuevas moléculas de unión anti-angiogénicas para terapia 55 humana.
Ha sido un objeto adicional de la invención proporcionar métodos para la prevención, tratamiento, alivio y/o diagnóstico de tales enfermedades, trastornos o afecciones, que implican el uso y/o administración de tales moléculas de unión y composiciones que las comprenden. En particular, ha sido un objeto de la invención proporcionar tales moléculas de unión farmacológicamente activas, composiciones y/o métodos que proporcionan ventajas en comparación con los agentes, composiciones y/o métodos usados actualmente y/o conocidos en la 5 técnica. Estas ventajas incluyen propiedades terapéuticas y/o farmacológicas mejoradas y/u otras propiedades ventajosas, por ejemplo, para fines de fabricación, especialmente en comparación con anticuerpos convencionales como los descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos.
Breve sumario de la invención
De acuerdo con un primer aspecto, se proporcionan moléculas de unión biespecíficas como se definen en las 10 reivindicaciones 1 a 3.
En otro aspecto, la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican las moléculas de unión biespecíficas de la invención así como a células hospedadoras que los contienen.
La invención se refiere además a un producto o composición que contiene o que comprende al menos una molécula de unión biespecífica de la invención y opcionalmente uno o más componentes adicionales de dichas 15 composiciones.
La invención se refiere además a métodos para preparar o generar las moléculas de unión biespecíficas, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritas en el presente documento.
La invención se refiere además a aplicaciones y usos de las moléculas de unión biespecíficas, ácidos nucleicos, células hospedadoras, productos y composiciones descritas en el presente documento, así como a métodos para la 20 prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos que pueden modularse por inhibición de Ang2.
Se ha descubierto que el componente de unión a Ang2 de las moléculas de unión biespecíficas de acuerdo con la presente invención se une y antagoniza Ang2 con una potencia al menos 5.000 veces mayor, preferiblemente 10.000 veces mayor que a Ang1 o Ang4. Esto evitará en gran medida la activación bloqueante de la señalización mediada por Ang1, que contrarrestaría el efecto antiangiogénico deseado. 25
Además, se ha descubierto que el componente de unión a VEGF de las moléculas de unión biespecíficas de acuerdo con la presente invención se une a VEGF-A con una afinidad al menos 1.000 veces mayor, preferiblemente al menos 5.000 veces mayor, más preferiblemente al menos 10.000 veces mayor que a VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o PLGF. Debido a la unión altamente preferente con VEGF-A no se interfiere con la señalización de VEGFR3, que modula la angiogénesis linfática. 30
Las moléculas de unión biespecíficas de la presente invención se proporcionan como dominios VHH unidos. Dichas moléculas son significativamente más pequeñas que los anticuerpos convencionales y, por lo tanto, pueden penetrar en un tumor a una mayor profundidad que dichos anticuerpos convencionales. Esta ventaja se acentúa adicionalmente por las secuencias específicas descritas en el presente documento después de liberarse de los sitios de glucosilación. 35
Además, debido a la naturaleza biespecífica (componentes de unión a VEGF y Ang2 en una molécula), la penetración en el tumor de las dos funcionalidades necesariamente será igual, lo cual asegurará que los efectos beneficiosos del antagonismo combinado de VEGF y Ang2 se proporcionen en toda la profundidad de penetración del tumor. Esto es una ventaja con respecto a la combinación de antagonistas individuales contra estas dianas, ya que la profundidad de penetración de los antagonistas individuales siempre variará en alguna medida. 40
Otra ventaja de las moléculas de unión biespecíficas preferidas de la presente invención es su mayor semivida en suero debido a un componente de unión a albúmina sérica tal como una molécula de unión a albúmina sérica como se describe en el presente documento.
Estos y otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención se harán evidentes tras la descripción adicional proporcionada a continuación. 45
Definiciones
A menos que se indique o se definan de otra manera, todos los términos usados tienen su significado habitual en la técnica, que será evidente para el experto en la materia. Se hace referencia, por ejemplo, a manuales convencionales tales como Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2ª Ed.), VoI. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, Nueva York, (1990), y Roitt et al., 50 "Immunology" (2ª Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), así como a la técnica antecedente general citada en el presente documento. Además, a menos que se indique otra cosa, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente con detalle pueden realizarse y se han realizado de una manera conocida per se, como será evidente para el experto en la materia. Por ejemplo, de nuevo se hace
referencia a manuales convencionales, a la técnica antecedente general mencionada anteriormente y a otras referencias citadas en el presente documento.
La expresión “molécula de unión biespecífica” se refiere a una molécula que comprende al menos una molécula de unión a Ang2 (o “componente de unión a Ang2”) y al menos una molécula de unión a VEGF (o “componente de unión a VEGF”). Una molécula de unión biespecífica puede contener más de una molécula de unión a Ang2 y/o más 5 de una molécula de unión a VEGF, es decir, en caso de que la molécula de unión biespecífica contenga una molécula de unión a Ang2 biparatópica (como se define más adelante) y/o una molécula de unión a VEGF biparatópica, en la parte de la molécula que se une a Ang2 o a VEGF, es decir, en su “componente de unión a Ang2” (o componente anti-Ang2) o “componente de unión a VEGF” (o componente anti-VEGF), respectivamente. Sin embargo, la palabra “biespecífico” en este contexto no debe considerarse excluyente de componentes de unión 10 adicionales con especificidad de unión a moléculas distintas de VEGF y Ang2 de la molécula de unión biespecífica. Son ejemplos no limitantes de dichos componentes de unión adicionales componentes de unión que se unen a la albúmina sérica.
A menos que se indique otra cosa, los términos “inmunoglobulina” y “secuencia de inmunoglobulina” – tanto si se usan en el presente documento para hacer referencia a un anticuerpo de cadena pesada como si se usan para 15 hacer referencia a un anticuerpo de cuatro cadenas convencional – se usan como términos generales para incluir el anticuerpo de tamaño completo, las cadenas individuales del mismo, así como todas las partes, dominios o fragmentos del mismo (incluyendo, pero sin limitación, dominios de unión a antígeno o fragmentos tales como dominios VHH o dominios VH/VL, respectivamente). Además, generalmente debe entenderse que el término “secuencia”, como se usa en el presente documento (por ejemplo, en términos tales como “secuencia de 20 inmunoglobulina”, “secuencia de anticuerpo”, “secuencia de dominio variable (individual)”, “secuencia de VHH” o “secuencia de proteína”), incluye tanto la secuencia de aminoácidos relevante como las secuencias de ácido nucleico o secuencias de nucleótidos que los codifican, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada.
El término “dominio” (de un polipéptido o proteína), como se usa en el presente documento, se refiere a una 25 estructura de proteína plegada que tiene la capacidad de conservar su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. En general, los dominios son responsables de las propiedades funcionales discretas de las proteínas, y en muchos casos pueden añadirse, retirarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio.
La expresión “dominio de inmunoglobulina”, como se usa en el presente documento, se refiere a una región globular 30 de una cadena de anticuerpo (tal como, por ejemplo, una cadena de un anticuerpo de 4 cadenas convencional o de un anticuerpo de cadena pesada), o a un polipéptido que consiste esencialmente en dicha región globular. Los dominios de inmunoglobulina se caracterizan por retener el plegamiento de inmunoglobulina característico de las moléculas de anticuerpo, que consiste en un sándwich de 2 capas de aproximadamente 7 cadenas beta antiparalelas dispuestas en dos láminas beta, opcionalmente estabilizado por un enlace disulfuro conservado. Un 35 dominio de inmunoglobulina comprende (a) uno o más dominios variables, es decir, uno o más dominios variables de inmunoglobulina.
La expresión “domino variable de inmunoglobulina”, como se usa en el presente documento, significa un dominio de inmunoglobulina que consiste esencialmente en cuatro “regiones marco”, que se denominan en la técnica y más adelante en el presente documento “región marco 1” o “FR1”; “región marco 2” o “FR2”; “región marco 3” o “FR3”; y 40 “región marco 4” o “FR4”, respectivamente; estando dichas regiones marco interrumpidas por tres “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”, que se denominan en la técnica y más adelante en el presente documento “región determinante de complementariedad 1” o “CDR1”; “región determinante de complementariedad 2” o “CDR2”; y “región determinante de complementariedad 3” o “CDR3”, respectivamente. De esta manera, la estructura general o secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina puede indicarse como se indica a 45 continuación: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Es el dominio o dominios variables de inmunoglobulina los que confieren especificidad a un anticuerpo por el antígeno al llevar el sitio de unión al antígeno. Las moléculas de la presente invención incluyen dominios variables individuales de inmunoglobulina tales como VHH.
La expresión “dominio variable individual de inmunoglobulina”, como se usa en el presente documento, significa un 50 dominio variable de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a un epítopo del antígeno sin emparejarse con un dominio de inmunoglobulina variable adicional. Un ejemplo de dominios variables individuales de inmunoglobulina en el significado de la presente invención son “anticuerpos de dominio”, tales como los dominios variables individuales de inmunoglobulina VH y VL (dominios VH y dominios VL). Otros ejemplos de dominios variables individuales de inmunoglobulina son los “dominios VHH” (o simplemente “VHH”) de camélidos, como se 55 define más adelante en el presente documento.
En vista de la definición anterior, el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional (tal como una molécula de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE; conocida en la técnica) o de un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv tal como un Fv con enlaces disulfuro o un fragmento scFv, o un diacuerpo (todos ellos conocidos en la técnica) derivados de dichos anticuerpo de 4 cadenas convencional, normalmente no se 60
consideraría un dominio variable individual de inmunoglobulina ya que, en estos casos, la unión al epítopo respectivo de un antígeno normalmente no se produciría por un (solo) dominio de inmunoglobulina, sino por un par de dominios de inmunoglobulina (en asociación) tales como dominios variables de cadena ligera y pesada, es decir, por un par VH-VL de dominios de inmunoglobulina, que conjuntamente se unen a un epítopo del antígeno respectivo.
Los “dominios VHH”, también conocidos como VHH, dominios VHH, fragmentos de anticuerpo VHH y anticuerpos 5 VHH, se han descrito originalmente como el dominio de inmunoglobulina de unión a antígeno (variable) de “anticuerpos de cadena pesada” (es decir, de “anticuerpos que carecen de cadenas ligeras”; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: “Naturally occurring antibodies devoid of light chains”; Nature 363, 446-448 (1993)). La expresión “dominio VHH” se ha elegido para distinguir estos dominios variables de los dominios variables de cadena pesada que están presentes en los 10 anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominan en el presente documento “dominios VH” o “dominios VH”) y de los dominios variables de cadena ligera que están presentes en los anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominan en el presente documento “dominios VL” o “dominios VL”). Los dominios VHH pueden unirse específicamente a un epítopo sin un dominio de unión a antígeno adicional (en contraposición a los dominios VH o VL en un anticuerpo de 4 cadenas convencional, en cuyo caso el epítopo se reconoce por un domino 15 VL junto con un dominio VH). Los dominios VHH son unidades de reconocimiento de antígeno pequeñas, sólidas y eficaces formadas por un solo dominio de inmunoglobulina.
En el contexto de la presente invención, los términos dominio VHH, VHH, dominio VHH, fragmento de anticuerpo VHH, anticuerpo VHH, así como “Nanobody®” y “dominio de Nanobody®” (siendo “Nanobody” una marca comercial de la compañía Ablynx N. V.; Ghent; Bélgica) se usan indistintamente y representan dominios variables individuales 20 de inmunoglobulina (que tienen la estructura FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y, específicamente, que se unen a un epítopo sin necesitar la presencia de un segundo dominio variable de inmunoglobulina), y que se distinguen de los dominios VH por los denominados “restos característicos (hallmark residues)”, como se define, por ejemplo, en el documento WO2009/109635, Fig. 1.
Los restos de aminoácido de un dominio variable individual de inmunoglobulina, por ejemplo, un VHH, se enumeran 25 de acuerdo con la numeración general para dominios VH proporcionada por Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), como se aplica a dominios VHH de camélidos, como se muestra, por ejemplo, en la Figura 2 de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999). De acuerdo con esta numeración,
 FR1 comprende los restos de aminoácido en las posiciones 1-30, 30
 CDR1 comprende los restos de aminoácido en las posiciones 31-35,
 FR2 comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 36-49,
 CDR2 comprende los restos de aminoácido en las posiciones 50-65,
 FR3 comprende los restos de aminoácido en las posiciones 66-94,
 CDR3 comprende los restos de aminoácido en las posiciones 95-102, y 35
 FR4 comprende los restos de aminoácido en las posiciones 103-113.
Sin embargo, debe indicarse que – como es bien conocido en la técnica para dominios VH y para dominios VHH – el número total de restos de aminoácido en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de restos de aminoácido indicado por la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones de acuerdo con la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencia real puede contener más 40 restos de aminoácido que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, en general, la numeración de acuerdo con Kabat puede corresponder o no a la numeración real de los restos de aminoácido en la secuencia real.
En la técnica se conocen métodos alternativos para numerar los restos de aminoácidos de dominios VH, pudiendo aplicarse dichos métodos de una manera análoga a dominios VHH. Sin embargo, en la presente descripción, 45 reivindicaciones y figuras, se seguirá la numeración de acuerdo con Kabat y aplicada a los dominios VHH como se ha descrito anteriormente, a menos que se indique otra cosa.
El número total de restos de aminoácido en un dominio VHH normalmente estará en el intervalo de 110 a 120, con frecuencia entre 112 y 115. Sin embargo, debe indicarse que también pueden ser adecuadas secuencias de menor y mayor tamaño para los fines descritos en el presente documento. 50
Los dominios variables individuales de inmunoglobulina, por ejemplo, VHH y anticuerpos de dominio, de acuerdo con las realizaciones preferidas de la invención, tienen un número de características estructurales únicas y propiedades funcionales que hacen que sean muy ventajosos para uso en terapia como moléculas de unión a antígeno funcionales. En particular, y sin limitarse a ello, los dominios VHH (que se han “diseñado” por la naturaleza para
unirse funcionalmente a un antígeno sin emparejarse con un dominio variable de cadena ligera) pueden funcionar como unidades estructurales de unión a antígeno funcionales, relativamente pequeñas e individuales.
Debido a sus propiedades únicas, los dominios variables individuales de inmunoglobulina, como se definen en el presente documento, tales como VHH o VH (o VL) – solos o como parte de un polipéptido de mayor tamaño, por ejemplo, una molécula biparatópica – ofrecen varias ventajas significativas: 5
 se necesita sólo un dominio para unirse a un antígeno con alta afinidad y con alta selectividad, de forma que no se necesita tener dos dominios separados ni asegurarse de que estos dos dominios están presentes en la conformación y configuración espacial correcta (es decir, mediante el uso de enlazadores diseñados especialmente, como ocurre con los scFv);
 los dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden expresarse a partir de una sola molécula de 10 ácido nucleico y no necesitan ninguna modificación postraduccional (tal como glucosilación);
 los dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden modificarse fácilmente por ingeniería genética en formatos multivalentes y multiespecíficos (como se analiza adicionalmente en el presente documento);
 los dominios variables individuales de inmunoglobulina tienen alta especificidad y afinidad por su diana, baja toxicidad intrínseca y pueden administrarse mediante vías alternativas a la infusión o inyección; 15
 los dominios variables individuales de inmunoglobulina son muy estables al calor, pH, proteasas y otros agentes o condiciones desnaturalizantes y, por lo tanto, pueden prepararse, almacenarse o transportarse sin el uso de equipos de refrigeración;
 los dominios variables individuales de inmunoglobulina se pueden preparar de una manera relativamente fácil y barata, tanto a pequeña escala como a escala de fabricación. Por ejemplo, pueden producirse dominios 20 variables individuales de inmunoglobulina usando fermentación microbiana (por ejemplo, como se describe adicionalmente más adelante) y no requieren el uso de sistemas de expresión de mamífero, como ocurre, por ejemplo, con los anticuerpos convencionales;
 los dominios variables individuales de inmunoglobulina son relativamente pequeños (de aproximadamente 15 kDa, o 10 veces más pequeños que una IgG convencional) en comparación con los anticuerpos de 4 cadenas 25 convencionales y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y por lo tanto muestran una mayor penetración en tejidos (incluyendo, pero sin limitación tumores sólidos y otros tejidos densos) y pueden administrarse en dosis mayores que dichos anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos;
 Los VHH tienen las denominadas “propiedades de unión a cavidades” específicas (entre otras cosas, debido a su bucle CDR3 extendido, en comparación con dominios VH de anticuerpos de 4 cadenas) y, por lo tanto, 30 también puede acceder a dianas y epítopos no accesibles para los anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos;
 Los VHH tienen la ventaja particular de que son muy solubles y muy estables y no tienen tendencia a agregar (como ocurre con los dominios de unión a antígeno derivados de ratón descritos por Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)). 35
Los dominios variables individuales de inmunoglobulina de la invención no están limitados con respecto a una fuente biológica específica a partir de la cual se han obtenido o a un método específico de preparación. Por ejemplo, la obtención de VHH puede incluir las siguientes etapas:
(1) aislamiento del dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada natural; o exploración de una biblioteca que comprende anticuerpos de cadena pesada o VHH y aislamiento de VHH a partir de los mismos; 40
(2) expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un VHH con la secuencia natural;
(3) “humanización” (como se describe en el presente documento) de un VHH, opcionalmente después de maduración de afinidad, con una secuencia natural o expresión de un ácido nucleico que codifica dicho VHH humanizado;
(4) “camelización” (como se describe más adelante) de un dominio pesado variable individual de inmunoglobulina a 45 partir de un anticuerpo natural de una especie animal, en particular una especie de mamífero, tal como de un ser humano, o expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica dicho dominio camelizado;
(5) “camelización” de un VH, o expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica dicho VH camelizado;
(6) uso de técnicas para preparar de forma sintética o semisintética proteínas, polipéptidos u otras secuencias de aminoácidos; 50
(7) preparación de una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio VHH usando técnicas para la síntesis de ácidos nucleicos, seguido de expresión del ácido nucleico obtenido de esta manera;
(8) sometimiento de anticuerpos de cadena pesada o VHH a maduración de afinidad, a mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida) y/o cualquier otra técnica para aumentar la afinidad y/o especificidad del VHH; y/o 5
(9) combinaciones o selecciones de las etapas anteriores.
En la técnica se conocen métodos y técnicas adecuadas para realizar las etapas descritas anteriormente y serán evidentes para el experto en la materia. A modo de ejemplo, en los documentos WO2006/040153 y WO2006/122786 se han descrito métodos de obtención de dominios VHH que se unen a un antígeno o epítopo específico.
De acuerdo con realizaciones específicas, los dominios variables individuales de inmunoglobulina de la invención o 10 presentes en los polipéptidos de la invención son dominios VHH con una secuencia de aminoácidos que corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH natural, pero que se ha “humanizado” o “de secuencia optimizada” (opcionalmente, después de la maduración de afinidad), es decir, mediante el reemplazo de uno o mas restos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de dicha secuencia de VHH natural por uno o más de los restos de aminoácido que aparecen en la posición o posiciones correspondientes 15 en un dominio pesado variable de un anticuerpo de 4 cadenas convencional procedente de un ser humano. Esto puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica, que pueden usarse rutinariamente por el experto en la materia.
Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de región marco completamente humanas y, en una realización incluso más específica, puede contener secuencias de región marco humanas procedentes de las 20 secuencias de Vh3 de línea germinal humana DP-29, DP-47, DP-51, o partes de las mismas, o ser muy homólogo a las mismas, opcionalmente combinado con secuencias JH, tales como JH5. De esta manera, un protocolo de humanización puede comprender el reemplazo de cualquiera de los restos de VHH con los restos de la región marco 1, 2 y 3 (FRl, FR2 y FR3) correspondientes de genes de VH de la línea germinal tales como
DP 47,
DP 29 y
DP 51) solos o en combinación. Pueden seleccionarse regiones marco (FR) adecuadas de los dominios variables 25 individuales de inmunoglobulina de la invención entre los indicados, por ejemplo, en el documento WO 2006/004678 y, específicamente, incluyen las denominadas clases “KERE” y “GLEW”. Son ejemplos dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen la secuencia de aminoácidos G-L-E-W aproximadamente en las posiciones 44 a 47, y sus homólogos humanizados respectivos. Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de región marco completamente humanas. 30
A modo de ejemplo, una sustitución de humanización para VHH que pertenece al grupo 103 P, R, S y/ al grupo GLEW (como se define más adelante) es 108Q a 108L. En la técnica se conocen métodos para humanizar dominios variables individuales de inmunoglobulina.
La unión de dominios variables individuales de inmunoglobulina con propiedades mejoradas en vista de la aplicación terapéutica, por ejemplo, mayor afinidad o menor inmunogenicidad, puede conseguirse a partir de moléculas de 35 unión individuales por técnicas conocidas en este campo, tales como maduración de afinidad (por ejemplo, partiendo de secuencias de inmunoglobulina sintéticas aleatorias o naturales), injerto de CDR, humanización, combinación de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamblaje por PCR usando cebadores solapantes y técnicas similares para modificar por ingeniería genética secuencias de inmunoglobulina bien conocidas por el experto en la materia; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores, también 40 denominada “optimización de secuencia” como se describe en el presente documento. Se hace referencia, por ejemplo, a manuales convencionales, así como a la descripción adicional y los Ejemplos.
Si es apropiado, puede obtenerse una molécula de unión con mayor afinidad por maduración de afinidad de otra molécula de unión, representando esta última, con respecto a la molécula madurada por afinidad, la molécula de unión “parental”. 45
Anteriormente se han descrito métodos para obtener VHH que se unen a un antígeno o epítopo específico, por ejemplo, en los documentos WO2006/040153 y WO2006/122786. Como también se describe con detalle en dichos documentos, los dominios VHH derivados de camélidos pueden “humanizarse” (también denominado “optimizarse su secuencia” en el presente documento, “la optimización de secuencia” puede, además de la humanización, incluir una modificación adicional de la secuencia por una o más mutaciones que proporcionan al VHH propiedades 50 mejoradas, tales como la eliminación de sitios de modificación postraduccionales potenciales) reemplazando uno o más restos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de VHH original por uno o más de los restos de aminoácido que aparecen en la posición o posiciones correspondientes en un dominio VH de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano. Un dominio VHH humanizado puede contener una o más secuencias de región marco completamente humanas y, en una realización incluso más específica, puede contener 55 secuencias de región marco humana derivadas de DP-29, DP-47, DP-51, o partes de las mismas, opcionalmente combinadas con secuencias de JH, tales como JH5.
Los anticuerpos de dominio, también conocidos como “Dab” y “dAb” (usándose los términos “Anticuerpos de Dominio” y “dAb” como marcas comerciales por el grupo de compañías GlaxoSmithKline) se han descrito, por ejemplo, en Ward, E. S., et al.: “Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli”; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L. J. et al.: “Domain antibodies: proteins for therapy”; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); y en el documento WO2003/002609. 5
Los anticuerpos de dominio corresponden esencialmente a los dominios VH o VL de anticuerpos de mamíferos no camélidos, en particular anticuerpos de 4 cadenas humanos. Para unirse a un epítopo como un dominio de unión de un solo antígeno, es decir, sin emparejarse con un dominio VL o VH, respectivamente, se necesita la selección específica de dichas propiedades de unión a antígeno, por ejemplo, usando bibliotecas de secuencias de dominios VH o VL individuales humanas. 10
Los dominios de anticuerpos tienen, al igual que las VHH, un peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa y, si proceden de secuencias completamente humanas, no requieren humanización, por ejemplo, para uso terapéutico en seres humanos. Como ocurre con los dominios VHH, también se expresan bien en sistemas de expresión procariotas, proporcionando una reducción significativa en el coste de fabricación global.
Además, también será evidente para el experto en la materia que es posible “injertar” una o más de las CDR 15 mencionadas anteriormente en otros “armazones” que incluyen, pero sin limitación, armazones humanos o armazones que no son inmunoglobulinas. En la técnica se conocen armazones adecuados y técnicas para dichos injertos de CDR.
Los términos “epítopo” y “determinante antigénico”, que pueden usarse indistintamente, se refieren a la parte de una macromolécula, tal como un polipéptido, que se reconoce por moléculas de unión a antígeno, tales como 20 anticuerpos convencionales o los polipéptidos de la invención y, más particularmente, por el sitio de unión a antígeno de dichas moléculas. Los epítopos definen el sitio de unión mínimo para una inmunoglobulina y, por lo tanto, representan la diana de especificidad de una inmunoglobulina.
Un polipéptido (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, un dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención o, en general, una molécula de unión a antígeno o un fragmento de la misma) que puede “unirse a” o 25 “unirse específicamente a”, que “tiene afinidad por” y/o que “tiene especificidad por” un cierto epítopo, antígeno o proteína (o por al menos una parte, fragmento o epítopo de la misma) se dice que está “contra” o “dirigido contra” dicho epítopo, antígeno o proteína o es una molécula de “unión” con respeto a dicho epítopo, antígeno o proteína. En este contexto, un componente de unión a VEGF también puede denominarse “neutralizante de VEGF”.
En general, el término “especificidad” se refiere al número de tipos diferentes de antígenos o epítopos a los que 30 puede unirse una molécula de unión a antígeno o proteína de unión a antígeno particular (tal como un dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención). La especificidad de una molécula de unión a antígeno puede determinarse basándose en su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (KD), es una medida de la fuerza de unión entre un epítopo y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno: cuanto menor es el valor de la KD, mayor 35 es la fuerza de unión entre un epítopo y la molécula de unión a antígeno (como alternativa, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (KA), que es 1/KD). Como será evidente para el experto en la materia (por ejemplo, basándose en la divulgación adicional del presente documento), la afinidad puede determinarse de una manera conocida per se, dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión a antígeno (tal como una inmunoglobulina, un anticuerpo, 40 un dominio variable individual de inmunoglobulina o un polipéptido que lo contiene y el antígeno pertinente). La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo y su sitio de unión a antígeno en la molécula de unión a antígeno como con el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión a antígeno.
La parte de una molécula de unión a antígeno que reconoce el epítopo se denomina parátopo.
A menos que se indique otra cosa, la expresión “molécula de unión a VEGF” o “molécula de unión a Ang2” incluye 45 anticuerpos anti-VEGF o anti-Ang2, fragmentos de anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de anticuerpos anti-VEGF, “moléculas similares a anticuerpos anti-VEGF” o “moléculas similares a anticuerpos anti-Ang2”, como se define en el presente documento, y conjugados con cualquiera de éstos. Los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales y monoclonales quimerizados. El término “anticuerpo” incluye inmunoglobulinas completas, tales como anticuerpos monoclonales producidos por expresión recombinante en células hospedadoras, 50 así como fragmentos de anticuerpo o “moléculas similares a anticuerpos”, incluyendo anticuerpos monocatenarios y anticuerpos lineales, denominados “SMIP” (“Inmunofarmacéuticos Modulares Pequeños”), como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2002/056910; las moléculas similares a anticuerpos incluyen dominios variables individuales de inmunoglobulina como se definen en el presente documento. Otros ejemplos para moléculas similares a anticuerpos son anticuerpos de superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) o moléculas con CDR injertadas. 55
Las expresiones “molécula de unión a Ang2” o “molécula de unión a VEGF”, respectivamente, se refieren a moléculas de unión a dianas monovalentes (es decir, moléculas que se unen a un epítopo de la diana respectiva) así como a moléculas de unión bi- o multivalentes (es decir, moléculas de unión que se unen a más de un epítopo, por
ejemplo, moléculas “biparatópicas” como se definen más adelante en el presente documento. Las moléculas de unión a Ang2 (o VEGF) que contienen más de un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a Ang2 (o VEGF) también se denominan moléculas de unión “formateadas”, éstas, dentro del componente de unión a la diana, además de los dominios variables individuales de inmunoglobulina, pueden comprender enlazadores y/o restos con funciones efectoras, por ejemplo, restos que prolongan la semivida tales como dominios variables individuales de 5 inmunoglobulina de unión a albúmina, y/o un compañero de fusión tal como albúmina sérica y/o un polímero unido tal como PEG.
Las expresiones “molécula de unión a Ang2 (o VEGF) biparatópica” o “dominio variable individual de inmunoglobulina biparatópico”, como se usan en el presente documento, significarán una molécula de unión que comprende un primer dominio variable individual de inmunoglobulina y un segundo dominio variable individual de 10 inmunoglobulina como se definen en el presente documento, donde las dos moléculas se unen a dos epítopos no solapantes del antígeno respectivo. Las moléculas de unión biparatópicas se componen de dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades con respecto al epítopo. La parte de una molécula de unión a antígeno (tal como un anticuerpo o un dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención) que reconoce el epítopo se denomina parátopo. 15
Una molécula de unión formateada, aunque es menos preferido, también puede comprender dos dominios variables individuales de inmunoglobulina idénticos o dos dominios variables individuales de inmunoglobulina diferentes que reconocen los mismos epítopos o epítopos solapantes o su antígeno respectivo. En este caso, con respecto al VEGF, los dos dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden unirse al mismo epítopo o a un epítopo solapante en cada uno de los dos monómeros que forman el dímero de VEGF. 20
Típicamente, las moléculas de unión de la invención se unirán con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-14 moles/litro (M) o menor, y preferiblemente de 10-7 a 10-14 moles/litro (M) o menor, más preferiblemente de 10-8 a 10-14 moles/litro, e incluso más preferiblemente de 10-11 a 10-13, como se mide, por ejemplo, en un ensayo Biacore o en un ensayo Kinexa), y/o con una constante de asociación (KA) de al menos 107 M-1, preferiblemente al menos 108 M-1, más preferiblemente al menos 109 M-1, tal como al menos 1011 M-1. Generalmente se considera que cualquier valor 25 de KD mayor de 10-4 M indica unión no específica. Preferiblemente, un polipéptido de la invención se unirá al antígeno deseado, es decir VEGF o Ang2, respectivamente, con una KD menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o epítopo puede determinase de cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, los ensayos descritos en la presente memoria, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión 30 competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competición de sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidos per se en la técnica.
Los restos de aminoácidos se indicarán de acuerdo con el código de aminoácidos convencionales de tres letras o una letra, como se conoce generalmente y se ha convenido en la técnica. Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, la expresión “diferencia de aminoácidos” se refiere a inserciones, deleciones o sustituciones del 35 número indicado de restos de aminoácidos en una posición de la secuencia de referencia, en comparación con una segunda secuencia. En el caso de las sustituciones, dichas sustituciones preferiblemente serán sustituciones de aminoácidos conservativas, lo que significa que un resto de aminoácido se reemplaza por otro resto de aminoácido de estructura química similar y que tiene una influencia pequeña o esencialmente nula sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Dichas sustituciones de aminoácidos conservativas son bien conocidas 40 en la técnica, por ejemplo, por el documento WO 1998/49185, donde las sustituciones de aminoácidos conservativas preferiblemente son sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (i) – (v) se sustituye por otro resto de aminoácido dentro del mismo grupo: (i) restos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y GIy; (ii) restos polares cargados negativamente y sus amidas (sin carga): Asp, Asn, GIu y GIn; (iii) restos polares cargados positivamente: His, Arg y Lys; (iv) restos alifáticos grandes no polares: Met, Leu, Ile, VaI 45 y Cys; y (v) restos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Son sustituciones de aminoácidos conservativas particularmente preferidas las siguientes: Ala por GIy o por Ser; Arg por Lys; Asn por GIn o por His; Asp por GIu; Cys por Ser; GIn por Asn; GIu por Asp; GIy por Ala o por Pro; His por Asn o por GIn; Ile por Leu o por VaI; Leu por Ile o por VaI; Lys por Arg, por GIn o por GIu; Met por Leu, por Tyr o por Ile; Phe por Met, por Leu o por Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o por Phe; VaI por Ile o por Leu. 50
Una molécula de polipéptido o ácido nucleico se considera “(en) (forma) esencialmente aislada” - por ejemplo, en comparación con su fuente biológica nativa y/o el medio de reacción o el medio de cultivo a partir del cual se ha obtenido - cuando se ha separado de al menos otro componente con el cual normalmente está asociada en dicha fuente o medio, tal como otra proteína/polipéptido, otro ácido nucleico, otro componente biológico o macromolécula o al menos un contaminante, impureza o componente minoritario. En particular, un polipéptido o molécula de ácido 55 nucleico se considera “esencialmente aislada” cuando se ha purificado al menos 2 veces, en particular al menos 10 veces, más en particular al menos 100 veces y hasta 1000 veces o más. Una molécula de polipéptido o ácido nucleico que está “en forma esencialmente aislada” preferiblemente es esencialmente homogénea, como se determina usando una técnica adecuada, tal como una técnica cromatográfica adecuada, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida. 60
La “identidad de secuencia” entre dos secuencias de moléculas de unión a VEGF o entre dos secuencias de
moléculas de unión a Ang2 indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. Puede calcularse o determinase como se describe en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 del documento WO 2008/020079. La “similitud de secuencia” indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservativas.
En la técnica se conocen métodos alternativos para numerar los restos de aminoácidos de dominios VH, pudiendo 5 aplicarse también dichos métodos de una manera análoga a los dominios VHH. Sin embargo, en la presente descripción, reivindicaciones y figuras, se seguirá la numeración de acuerdo con Kabat y aplicada a dominios VHH como se ha descrito anteriormente, a menos que se indique otra cosa.
Un molécula de unión a VEGF o molécula de unión a Ang2 “maduradas por afinidad”, en particular un VHH o un anticuerpo de dominio, tiene una o más alteraciones en una o más CDR que dan como resultado una mejor afinidad 10 por VEGF o Ang2, en comparación con la molécula de unión a VEGF o molécula de unión a Ang2 parental respectiva. Las moléculas de unión a VEGF o moléculas de unión a Ang2 maduradas por afinidad de la invención pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe por Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, o Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, Estados Unidos 91: 3809 3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7): 15 3310-9; y Hawkins et al., 1992, J. MoI. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson y RE Hawkins, “Affinity maturation of antibodies using phage display”, Oxford University Press 1996.
Para la presente invención, una “secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: x”: incluye, si no se indica otra cosa, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 100% con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: x respectiva. 20
Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento/proliferación celular desregulada. Los ejemplos de cáncer a tratar con una molécula de unión biespecífica de la invención incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres, sugeridos para el tratamiento con antagonistas de VEGF en el documento US 2008/0014196, incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, 25 cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, cáncer gástrico, melanoma y diversos tipos de 30 cáncer de cabeza y cuello. La desregulación de la angiogénesis puede conducir a muchos trastornos que pueden tratarse por composiciones y métodos de la invención. Estos trastornos incluyen tanto afecciones no neoplásicas como afecciones neoplásicas. Las neoplasias incluyen, pero sin limitación, las descritas anteriormente.
Los trastornos no neoplásicos incluyen, pero sin limitación, los sugeridos para el tratamiento con antagonistas de VEGF en el documento US 2008/0014196, hipertrofia indeseada o aberrante, artritis, artritis reumatoide (AR), 35 psoriasis, placas psoriásicas, sarcoidosis, aterosclerosis, placas ateroscleróticas, retinopatía diabética y otras retinopatías proliferativas, incluyendo retinopatía del prematuro, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización de la córnea, neovascularización de injerto de córnea, rechazo de injerto de córnea, neovascularización retiniana/coroidal, neovascularización del ángulo iridocorneal (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, reestenosis vascular, 40 malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias de tiroides (incluyendo enfermedad de Grave), trasplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/ARDS, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociado con ictus agudo/lesión craneal cerrada/traumatismo), inflamación sinovial, formación de pannus en AR, miositis ossificans, formación ósea hipertrófica, osteoartritis (OA), ascitis refractaria, enfermedad de 45 ovario poliquístico, endometriosis, enfermedades de 3ª separación de fluidos (pancreatitis, síndrome compartimental, quemaduras, enfermedad intestinal), fibroides uterinos, parto prematuro, inflamación crónica tal como IBD (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), rechazo de aloinjertos renales, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome nefrótico, crecimiento indeseado o aberrante de masas de tejidos (no cáncer), articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición del crecimiento del cabello, síndrome de Osier-Weber, granuloma piogénico, 50 fibroplasias retrolentales, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada con pericarditis), y efusión pleural.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de unión biespecífica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.. 55
Estas moléculas incluyen al menos un componente de unión a VEGF, al menos un componente de unión a Ang2, y al menos un componente de unión a albúmina sérica (molécula de unión a albúmina sérica).
El componente de unión a albúmina sérica de la molécula de unión de la presente invención es un dominio variable
individual de inmunoglobulina aislado o un polipéptido que contiene uno o más de dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina, donde dicho dominio variable individual de inmunoglobulina consiste en cuatro regiones marco y tres regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, y donde dicha CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 257.
Dicho uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina del componente de unión a albúmina sérica 5 contiene
a. una CDR3 con una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 257;
b. una CDR1 con una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 255;
c. una CDR2 con una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 256.
En una realización más preferida, los dominios variables individuales de inmunoglobulina del componente de unión a 10 albúmina sérica son VHH que tienen una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 254.
En particular, la CDR3 del dominio de unión a VEGF tiene la secuencia SEQ ID NO: 4 SRAYGSSRLRLADTYEY.
De acuerdo con realizaciones preferidas, los dominios variables individuales de inmunoglobulina son VHH, preferiblemente un VHH que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 57.
El dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a Ang-2 comprende al menos un dominio variable con 15 cuatro regiones marco y tres regiones determinantes de complementariedad CDR1, CRD2 y CDR3, respectivamente, en el que dicha CDR3 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 250.
Dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a Ang-2 contiene
a. una CDR3 con una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 250 (véase también la Tabla 49):
b. una CDR1 con una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 248 (véase también la Tabla 49); 20
c. una CDR2 con una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 249 (véase también la Tabla 49).
Preferiblemente, el dominio variable individual de inmunoglobulina del componente de unión a Ang2 es un VHH, preferiblemente que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 222.
La presente invención, de esta manera, se refiere a moléculas de unión que comprenden un VHH de unión a Ang2 con una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 222. 25
Como se describe en el presente documento, las moléculas de unión de la presente invención se definen por las reivindicaciones 1 b y 3 y comprenden al menos un componente de unión a albúmina sérica, al menos un componente de unión a VEGF, y al menos un componente de unión a Ang2. El orden de estos tres componentes de unión podría ser cualquier orden posible tal como el orden indicado en la Tabla 45-B, 46-A, o 47-A; o en la Figura 30, por ejemplo, el componente de unión a albúmina sérica, a Ang2 o a VEGF puede ser N-terminal o C-terminal. 30 Particularmente, “1D01” (SEQ ID NO: 214), “11B07”, “00027” (SEQ ID NO:216), “00908”, “7G08” (SEQ ID NO:215), “00919”, “00921” (SEQ ID NO: 220), “00928” (SEQ ID NO:221), “00932”, “00933”, “00934”, “00935”, “00936”, “00937”, “00938” (SEQ ID NO:222), o “00956” (SEQ ID NO:223) a los que se hace referencia en la leyenda de las Tablas y Figuras anteriormente mencionadas representan componentes de unión a Ang2, mientras que “00038” representa un componente de unión a VEGF y “ALB11” representa un componente de unión a albúmina sérica. 35 Ninguno de ellos debe considerarse una secuencia específica, sino que representa un componente de unión a Ang2, VEGF y albúmina sérica en general cuando se usa en el contexto de posibles preparaciones de moléculas de unión de la presente invención.
Sin embargo, se prefiere que el componente de unión a albúmina sérica esté entre el componente de unión a VEGF y Ang2 (o viceversa), mientras que es particularmente preferido que al menos un componente de unión a VEGF esté 40 en posición N-terminal, seguido por al menos un componente de unión a albúmina sérica, seguido por al menos un componente de unión a Ang2 en el extremo C. Esta disposición se considera específicamente útil.
La presente invención se refiere, en un aspecto preferido, a moléculas de unión que comprenden al menos un componente de unión a VEGF, al menos un componente de unión a Ang2 y al menos un componente de unión a albúmina sérica que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 207. 45
Los componentes de unión a VEGF y/o Ang2 con propiedades mejoradas a la vista de la aplicación terapéutica, por ejemplo, afinidad potenciada o inmunogenicidad reducida, pueden obtenerse de componentes de unión a VEGF o Ang2 individuales por técnicas conocidas en la materia, tales como maduración de afinidad (por ejemplo, comenzando a partir de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias o de origen natural), injerto de CDR, humanización, combinación de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamblaje por 50 PCR usando cebadores solapantes y técnicas similares para obtener por ingeniería genética secuencias de
inmunoglobulina bien conocidas por el experto en la materia; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de los anteriores, también denominada “optimización de secuencia”, como se describe en la presente memoria. Se hace referencia, por ejemplo, a manuales convencionales, así como a la descripción y los Ejemplos adicionales.
Si resulta apropiado, puede obtenerse un componente de unión a VEGF o Ang2 contenido en las moléculas de la invención con afinidad aumentada por maduración de afinidad u otro componente de unión a VEGF o Ang2, 5 representando el último, con respecto a la molécula de afinidad madurada, el componente de unión a VEGF “precursor”.
En VHH de VEGF o Ang2 de las moléculas de la invención que comienzan con EVQ, el E N-terminal puede reemplazarse por un D (que con frecuencia es un resultado de optimización de secuencia) o puede faltar (como para expresión del VHH en E. coli). Para componentes de unión a VEGF formateado, esto se aplica habitualmente 10 solamente al VHH que está situado en el extremo N terminal.
Una sustitución humanizante preferida, pero no limitante, para dominios de VHH de VEGF que pertenecen al grupo 103, P,R,S y/o el grupo GLEW (como se define posteriormente) es 108Q a 108L. Se conocen en la técnica métodos para humanizar dominios variables sencillos de inmunoglobulina. De acuerdo con otra realización, el dominio variable individual de inmunoglobulina es un anticuerpo de dominio, como se define en el presente documento. 15
En otra realización, los representantes de la clase de dominios variables individuales de inmunoglobulina de unión a VEGF y/o a Ang2 de la invención tienen secuencias de aminoácidos que corresponden a las secuencias de aminoácidos de un dominio de VH natural que se ha “camelizado”, es decir, reemplazando uno o más restos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable natural de un anticuerpo de 4 cadenas convencional por uno o más restos de aminoácidos que aparecen en la posición o posiciones correspondientes en 20 un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada. Esto puede realizarse de una manera conocida per se, que será evidente para el experto en la materia, y además se hace referencia al documento WO 1994/04678. Dicha camelización puede producirse preferentemente en posiciones de aminoácidos que están presentes en la interfaz VH-VL y en los denominados restos característicos de camélidos (véase también, por ejemplo, el documento WO 1994/04678). Puede tomarse una descripción detallada de dichas técnicas de “humanización” y “camelización” y 25 secuencias de regiones marco preferidas coherentes con esto, por ejemplo, en la pág. 46 y en la pág. 98 del documento WO 2006/040153 y en la pág. 107 del documento WO 2006/122786.
Los componentes de unión a VEGF de las moléculas de la invención, es decir, los dominios variables individuales de inmunoglobulina, tienen especificidad por VEGF ya que se unen específicamente a uno o más epítopos dentro de la molécula de VEGF. Lo mismo ocurre para componentes de unión a Ang2 de la invención. 30
La unión específica de un componente de unión a VEGF a su antígeno VEGF, puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA y ELISA) y ensayos de competición de tipo sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas per se en la técnica. Lo mismo ocurre para un componente de unión a Ang2 cuando se une a su antígeno. 35
Con respecto al antígeno VEGF, un componente de unión a VEGF de la invención, es decir, el dominio variable individual de inmunoglobulina, no está limitado con respecto a la especie. De esta manera, los dominios variables individuales de inmunoglobulina de la invención o preferiblemente se unen a VEGF humano, si están destinados a fines terapéuticos en seres humanos. Sin embargo, también están dentro del alcance de la invención los dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen a VEGF de otra especie de mamífero con tal que caigan bajo 40 las definiciones de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. Un dominio variable individual de inmunoglobulina que se une a una forma de VEGF de una especie puede presentar reacción cruzada con VEGF, que tiene una secuencia diferente de la humana, de una o más especies distintas. Por ejemplo, los dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen a VEGF humano pueden presentar reactividad cruzada con VEGF de una o más especies distintas de primates y/o con VEGF de una o más especies de animales que se usan en modelos animales 45 para enfermedades, por ejemplo mono, ratón, rata, conejo, cerdo o perro) y, en particular, en modelos animales para enfermedades y trastornos asociados con efectos mediados por VEGF sobre la angiogénesis (tales como las especies y modelos animales mencionados en el presente documento). Los dominios variables individuales de inmunoglobulina que muestran dicha reactividad cruzada son ventajosos en una investigación y/o en el desarrollo de fármacos, ya que permiten ensayar los dominios variables individuales de inmunoglobulina en modelos de 50 enfermedades conocidos tales como monos, en particular Cynomolgus o Rhesus, o ratones y ratas.
Preferiblemente, en vista de la reactividad cruzada con una o más moléculas de VEGF de especies distintas de ser humano que están destinadas al uso como un modelo animal durante el desarrollo de un antagonista de VEGF terapéutico, un componente de unión a VEGF reconoce un epítopo en una región del VEGF de interés que tiene un alto grado de identidad con VEGF humano. 55
Un dominio variable individual de inmunoglobulina reconoce un epítopo que se localiza, totalmente o en parte, en una región de VEGF que es relevante para unión a su receptor, en particular a VEGFR-2, que se ha mostrado que es el receptor cuya activación está implicada de forma causativa en la neovascularización de tumores. Los dominios
variables sencillos de inmunoglobulina dados a conocer aquí bloquean la activación del receptor de VEGF, en particular activación de VEGFR-2, al menos parcialmente, o sustancialmente, o totalmente.
Como se ha descrito anteriormente, la capacidad de un componente de unión a VEGF para bloquear la interacción entre VEGF y sus receptores, en particular el VEGFR-2, puede determinarse por un Ensayo Homogéneo de Proximidad Luminiscente Amplificado (AlphaScreen), un ELISA de competición o un ensayo basado en resonancia 5 de plasmón (SPR) (Biacore), como se describe en los Ejemplos.
Preferiblemente, un dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención se une a VEGF con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM (como se determina por análisis de Resonancia de Plasmón Superficial, como se describe en el Ejemplo 5.7). Lo mismo ocurre para un dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención que se une a angiopoyetina. 10
Preferiblemente, los dominios variables individuales de inmunoglobulina de la invención tienen valores de CI50, medidos en un ensayo ELISA de competición como se describe en el Ejemplo 5.1, en el intervalo de 10-6 a 10-10 moles/litro o menores, más preferiblemente en el intervalo de 10-8 a 10-10 moles/litro o menores e incluso más preferiblemente en intervalo de 10-9 a 10-10 moles/litro o menores.
De acuerdo con una realización no limitante pero preferida de la invención, los dominios variables individuales de 15 inmunoglobulina de unión a VEGF de la invención se unen a VEGF con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro (M) o menor, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro (M) o menor y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro (M), y/o con una constante de asociación (KA) de al menos 107 M-1, preferiblemente al menos 108 M-1, más preferiblemente al menos 109 M-1, tal como al menos 1012 M-1; y en particular con una KD menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. Los valores de 20 KD y KA del dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención contra VEGF pueden determinarse. Lo mismo ocurre para un dominio variable individual de inmunoglobulina que se une a Ang2 de la invención.
Los componentes de unión a VEGF biparatópicos que comprenden dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina consisten esencialmente en o comprenden (i) un primer dominio variable individual de inmunoglobulina que se une específicamente a un primer epítopo de VEGF, y (ii) un segundo dominio variable 25 individual de inmunoglobulina que se une específicamente a un segundo epítopo de VEGF donde el primer epítopo de VEGF y el segundo epítopo de VEGF no son epítopos idénticos. En otras palabras, dicho polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente en dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina que están dirigidos contra al menos dos epítopos no solapantes presentes en VEGF, donde dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina están unidos entre sí de tal forma que son capaces de unirse 30 simultáneamente a VEGF. En este sentido, el polipéptido de la invención puede considerarse también una construcción de inmunoglobulina “bivalente” o “multivalente” y especialmente como una “construcción de dominio variable individual de inmunoglobulina multivalente”, ya que el polipéptido contiene al menos dos sitios de unión para VEGF. Tales construcciones también se denominan moléculas de unión a VEGF “formateado”, por ejemplo VHH “formateado”). Lo mismo ocurre para componentes de unión a Ang2 biparatópicos, cambiando lo que deba 35 cambiarse.
Dicho componente de unión a VEGF o Ang2 incluye (al menos) dos dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-VEGF o Ang2, respectivamente donde (los) dos dominios variables individuales de inmunoglobulina se dirigen preferiblemente contra epítopos no solapantes dentro de la molécula de VEGF o molécula de angiopoyetina. De esta manera, estos dos dominios variables individuales de inmunoglobulina tendrán 40 una especificidad de antígeno diferente y, por lo tanto, diferentes secuencias de CDR. Por esta razón, dichos polipéptidos de la invención también se denominarán en el presente documento “polipéptidos biparatópicos” o “construcciones de anticuerpo de dominio biparatópico” (si los dominios variables individuales de inmunoglobulina consisten o consisten esencialmente en anticuerpos de dominio) o, “construcciones de VHH biparatópicas” (si los dominios variables individuales de inmunoglobulina consisten o consisten esencialmente en VHH) respectivamente, 45 ya que los dos dominios variables individuales de inmunoglobulina incluirán dos parátopos diferentes.
Si un polipéptido de la invención es una molécula biparatópica como se ha definido en la presente memoria, al menos uno de los componentes de dominio variable individual de inmunoglobulina se une a un epítopo de modo que la interacción entre VEGF humano recombinante y VEGFR-2 humano recombinante se bloquea a una tasa de inhibición de  80 %. Como se ha mostrado en experimentos de la invención, ciertas moléculas formateadas 50 contienen dos VHH que bloquean ambos el receptor VEGFR-2 a una tasa de inhibición de  80 %. Ciertos VHH de la invención bloquean el VEGFR-2 a una tasa de inhibición de 100 %, es decir, son bloqueadores completos.
En ambos casos, pueden estar presentes secuencias y restos adicionales dentro de los componentes de unión a VEGF de la invención, por ejemplo en N-terminal, C-terminal o localizados entre los dos dominios variables sencillos de inmunoglobulina, por ejemplo secuencias enlazadoras y secuencias que posibilitan las funciones efectoras, como 55 se expone en más detalle en la presente memoria.
De acuerdo con otra realización, aunque menos preferida, un componente de unión a VEGF puede incluir más de dos dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-VEGF, es decir, tres, cuatro o incluso más VHH anti-
VEGF. En este caso al menos dos de los dominios variables individuales de inmunoglobulina anti-VEGF se dirigen contra epítopos no solapantes dentro de la molécula de VEGF, donde cualquier dominio variable individual de inmunoglobulina adicional puede unirse a cualquiera de los dos epítopos no solapantes y/o a un epítopo adicional presente en la molécula de VEGF.
De acuerdo con la invención, los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden ser, 5 independientemente entre sí, VHH o anticuerpos de dominio, y/o cualquier otro tipo de dominio variable individual de inmunoglobulina, tal como dominios VL, como se definen en el presente documento, siempre que estos dominios variables individuales de inmunoglobulina se unan al antígeno, es decir, VEGF o angiopoyetina, respectivamente, y caen bajo las definiciones de cualquiera de las moléculas 1 a 3.
La descripción detallada de los componentes de unión se proporciona principalmente por el componente de unión a 10 VEGF. Sin embargo, todas las características y opciones indicadas en el presente documento para el componente de unión a VEGF también se aplican de forma equivalente al componente de unión a Ang2, mutatis mutandis.
De acuerdo con realizaciones preferidas, las moléculas de unión presentes en las moléculas de unión biespecíficas (las moléculas de unión a Ang2 dentro del componente de unión a Ang2 o las moléculas de unión a VEGF dentro del componente de unión a VEGF o los dos componentes de unión a Ang2 y VEGF adyacentes) pueden conectarse 15 entre sí directamente (es decir, sin el uso de un enlazador) o a través de un enlazador. El enlazador preferiblemente es un péptido enlazador y se seleccionará de tal forma que permita la unión de las dos moléculas de unión diferentes a cada uno de los epítopos no solapantes de las dianas, dentro de solo una de las moléculas diana, o dentro de dos moléculas diferentes.
En el caso de moléculas de unión biparatópicas, la selección de enlazadores dentro del componente de unión a 20 Ang2 o VEGF, entre otras cosas, dependerá de los epítopos y, específicamente, de la distancia entre los epítopos en la diana a la que se unen los dominios variables individuales de inmunoglobulina, y será evidente para el experto en la materia basándose en la descripción del presente documento, opcionalmente después de algún grado limitado de experimentación rutinaria.
Dos moléculas de unión (dos VHH o anticuerpos de dominio o VHH y un anticuerpo de dominio), o dos componentes 25 de unión, pueden unirse entre sí a través de un VHH o anticuerpo de dominio adicional, respectivamente (en dichas moléculas de unión, los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden unirse directamente a dicho dominio variable individual de inmunoglobulina adicional o a través de enlazadores adecuados). Dicho anticuerpo de dominio o VHH adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de dominio o VHH que proporcione una mayor semivida. Por ejemplo, el último anticuerpo de dominio o VHH puede ser uno que sea capaz de unirse a 30 una proteína de suero (humano) tal como albúmina sérica (humana) o transferrina (humana).
Como alternativa, los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen a la diana respectiva pueden unirse en serie (directamente o a través de un enlazador adecuado) y el anticuerpo de dominio o VHH adicional (que puede proporcionar una mayor semivida) puede conectarse directamente o a través de un enlazador a una de estas dos o más secuencias de inmunoglobulina mencionadas anteriormente. 35
Los enlazadores adecuados se describen en el presente documento en relación con polipéptidos específicos de la invención y pueden comprender – por ejemplo y sin limitación – una secuencia de aminoácidos, teniendo dicha secuencia de aminoácidos preferiblemente una longitud de 9 o más aminoácidos, más preferiblemente de al menos 17 aminoácidos, tal como de aproximadamente 20 a 40 aminoácidos. Sin embargo, el límite superior no es crítico, sino que se elige por razones de conveniencia en relación, por ejemplo, con la producción biofarmacéutica de dichos 40 polipéptidos.
La secuencia enlazadora puede ser una secuencia natural o una secuencia no natural. Si se usa para fines terapéuticos, el enlazador preferiblemente es no inmunogénico en el sujeto al que se administra la molécula de unión biespecífica de la invención.
Un grupo útil de secuencias enlazadoras son enlazadores derivados de la región de bisagra de anticuerpos de 45 cadena pesada como se describen en los documentos WO 1996/34103 y WO 1994/04678.
Otros ejemplos son secuencias enlazadoras de polialanina tales como Ala- Ala-Ala.
Otros ejemplos preferidos de secuencias enlazadoras son enlazadores Gly/Ser de diferente longitud tales como enlazadores (glyxsery)z, incluyendo (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3 y (gly3ser2)3.
Algunos ejemplos no limitantes de enlazadores están contenidos en moléculas de unión biespecíficas de la 50 invención mostradas en la Tabla 15 (SEQ ID NO: 128 - 168), por ejemplo, los enlazadores
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (35GS; SEQ ID NO: 169);
GGGGSGGGS (9GS; SEQ ID NO: 170);
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (40GS; SEQ ID NO: 171).
Además, el enlazador también puede ser un resto de polietilenglicol, como se muestra, por ejemplo, en el documento WO 2004/081026.
En otra realización, los dominios variables individuales de inmunoglobulina están unidos entre sí a través de otro resto (opcionalmente a través de uno o dos enlazadores), tal como otro polipéptido que, en una realización preferida pero no limitante, puede ser un dominio variable individual de inmunoglobulina adicional como se ha descrito 5 anteriormente. Dicho resto puede ser esencialmente inactivo o puede tener un efecto biológico tal como mejorar las propiedades deseadas del polipéptido o puede conferir una o más propiedades deseadas adicionales al polipéptido. Por ejemplo, y sin limitación, el resto puede mejorar la semivida de la proteína o polipéptido, y/o puede reducir su inmunogenicidad o mejorar cualquier otra propiedad deseada.
La molécula de unión biespecífica de la invención incluye un resto que prolonga la semivida del polipéptido de la 10 invención en suero u otro fluido corporal de un paciente. El termino “semivida” se define como el tiempo que transcurre hasta que la concentración en suero del polipéptido (modificado) se reduce en un 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación y/o eliminación y/o secuestro del polipéptido por mecanismos naturales.
Más específicamente, dicho resto que prolonga la semivida se une covalentemente o se fusiona a un dominio variable individual de inmunoglobulina y es un resto de albúmina, a saber, un dominio invariable individual de 15 inmunoglobulina anti-albúmina.
La molécula de unión biespecífica de la invención comprende un resto que se une a un antígeno encontrado en la sangre, es decir albúmina sérica, confiriéndose de esta manera una mayor semivida in vivo al polipéptido resultante de la invención. Dicho resto es un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina tal como un dominio VHH de unión a albúmina. 20
El dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina se une a albúmina sérica humana y es un dominio VHH de unión a albúmina humanizada.
Los dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen a albúmina sérica humana se conocen en la técnica y se describen adicionalmente con detalle, por ejemplo, en el documento WO 2006/122786. Específicamente, son VHH de unión a albúmina útiles ALB 1 y su homólogo humanizado, ALB 8 (documento 25 WO 2009/095489). Sin embargo, también pueden usarse otros dominios VHH de unión a albúmina mencionados en la publicación de patente anterior, con tal que cumplan la definición proporcionada en las reivindicaciones.
Un dominio VHH de unión a albúmina específicamente útil está indicado en SEQ ID NO: 254.
De acuerdo con otra realización, los dominios variables individuales de inmunoglobulina son anticuerpos de dominio, como se define en el presente documento. 30
Los dominios variables individuales de inmunoglobulina presentes en las moléculas de unión biespecíficas de la invención también pueden tener secuencias que corresponden a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH natural que se ha “camelizado”, es decir, reemplazando uno o más restos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable natural de un anticuerpo de 4 cadenas convencional por uno o más restos de aminoácido que aparecen en la posición o posiciones correspondientes en un domino VHH de un 35 anticuerpo de cadena pesada. Esto puede realizarse de una manera conocida per se, que será evidente para el experto en la materia, y adicionalmente se hace referencia al documento WO1994/04678. Dicha camelización puede realizarse preferiblemente en posiciones de aminoácidos que están presentes en la interfaz VH-VL y en los denominados restos característicos de camélidos (véase también, por ejemplo, el documento WO1994/04678). Puede tomarse una descripción detallada de dichas técnicas de “humanización” y “camelización” y secuencias de 40 región marco preferidas coherentes con ellas, por ejemplo, en la pág. 46 y en la pág. 98 del documento WO2006/040153 y en la pág. 107 del documento WO2006/122786.
Los componentes de unión tienen especificidad por Ang2 o VEGF, respectivamente, ya que comprenden, en una realización preferida, uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen específicamente a uno o más epítopos dentro de la molécula de Ang2 o dentro de la molécula de VEGF, respectivamente. 45
La unión específica de un componente de unión a su antígeno Ang2 o VEGF puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento, el análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA y ELISA) y ensayos de competición de tipo sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas per se en la técnica. 50
Con respecto al antígeno Ang2 o VEGF, respectivamente, un dominio variable individual de inmunoglobulina no está limitado con respecto a la especie. De esta manera, los dominios variables individuales de inmunoglobulina preferiblemente se unen a Ang2 humano o a VEGF humano, respectivamente, si están destinados a fines terapéuticos en seres humanos. Sin embargo, también están dentro del alcance de la invención los dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen a Ang2 o VEGF, respectivamente, de otras especies de 55
mamífero, o polipéptidos que los contienen en la medida en la que están cubiertos por la definición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
Un dominio variable individual de inmunoglobulina que se une a una forma de especie de Ang2 o VEGF puede presentar reacción cruzada con el antígeno respectivo de una o más especies distintas. Por ejemplo, los dominios variables individuales de inmunoglobulina que se unen al antígeno humano pueden presentar reactividad cruzada 5 con el antígeno respectivo de una o más especies distintas de primate y/o con el antígeno de una o más especies de animales que se usan en modelos animales para enfermedades, por ejemplo mono (en particular cynomolgus o Rhesus), ratón, rata, conejo, cerdo o perro) y, en particular, en modelos animales para enfermedades y trastornos que pueden modularse mediante la inhibición de Ang2 (tales como las especies y modelos animales mencionados en el presente documento). Los dominios variables individuales de inmunoglobulina de la invención que muestran 10 dicha reactividad cruzada son ventajosos en investigación y/o en el desarrollo de fármacos, ya que permite ensayar los dominios variables individuales de inmunoglobulina de la invención en modelos y enfermedades conocidos tales como monos, en particular cynomolgus o Rhesus, o ratones y ratas.
Además, los componentes de unión no están limitados o definidos por un dominio específico o un determinante antigénico del antígeno contra el cual están dirigidos. Preferiblemente, en vista de la reactividad cruzada con una o 15 más moléculas de antígeno de especies distintas del ser humano que se pretenden usar como modelo animal durante el desarrollo de un antagonista terapéutico de Ang2/VEGF, un componente de unión reconoce un epítopo en una región del antígeno respectivo que tiene un alto grado de identidad con el antígeno humano. A modo de ejemplo, en vista del uso de un modelo de ratón, un dominio variable individual de inmunoglobulina anti-Ang2 contenido en las moléculas de unión biespecíficas de la invención reconoce un epítopo que está localizado, 20 totalmente o en parte, dentro del dominio de FLD de Ang2, que muestra una alta identidad entre el ser humano y el ratón.
El componente de unión a VEGF se une a las isoformas de VEGF VEGF165 y/o VEGF 121.
En otro aspecto, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de unión biespecíficas de la invención. Dichas moléculas de ácido nucleico también se denominarán en el presente 25 documento “ácidos nucleicos de la invención” y también pueden estar en forma de una construcción genética, como se define en el presente documento. Un ácido nucleico de la invención puede ser ADN genómico, ADNc o ADN sintético (tal como ADN con un uso de codones que se ha adaptado específicamente para la expresión en la célula hospedadora u organismo hospedador deseado). De acuerdo con una realización de la invención, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, como se ha definido anteriormente en el presente documento. 30
El ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, puede estar presente en y/o puede ser parte de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, cósmido o YAC. El vector puede ser, especialmente, un vector de expresión, es decir un vector que puede permitir la expresión de la molécula de unión biespecífica in vitro y/o in vivo (es decir, en una célula hospedadora, organismo hospedador y/o sistema de expresión adecuado). Dicho vector de expresión generalmente comprende al menos un ácido nucleico de la invención que está unido operativamente a 35 uno o más elementos reguladores adecuados, tales como uno o más promotores, potenciadores, terminadores y similares. Dichos elementos y su selección en vista de la expresión de una secuencia específica en un hospedador específico son del conocimiento común del experto en la materia. Se describen ejemplos específicos de elementos reguladores y otros elementos útiles o necesarios para expresar moléculas de unión biespecíficas de la invención, tales como promotores, potenciadores, terminadores, factores de integración, marcadores de selección, secuencias 40 líder, genes indicadores y similares, por ejemplo, en las págs. 131 a 133 del documento WO 2006/040153.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse u obtenerse de una manera conocida per se (por ejemplo, por síntesis de ADN automática y/o tecnología de ADN recombinante), basándose en la información de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de la invención proporcionada en el presente documento, y/o pueden aislarse a partir de una fuente natural adecuada. 45
En otro aspecto, la invención se refiere a células hospedadoras que expresan o que son capaces de expresar una o más moléculas de unión biespecíficas de la invención; y/o que contienen un ácido nucleico de la invención. De acuerdo con una realización particularmente preferida, dichas células hospedadoras son células bacterianas; otras células útiles son células de levadura, células fúngicas o células del mamífero.
Las células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas bacterianas gram-negativas tales como cepas de 50 Escherichia coli, Proteus, y Pseudomonas, y cepas bacterianas gram-positivas tales como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, y Lactococcus. La célula fúngica adecuada incluye células de especies de Trichoderma, Neurospora, y Aspergillus. Las células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por ejemplo Schizosaccharomyces pombe), Pichia (por ejemplo Pichia pastoris y Pichia methanolica), y Hansenula. 55
Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS y similares. Sin embargo, también pueden usarse células de anfibio, células de insecto, células vegetales, y cualquier otra célula usada en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas.
La invención proporciona además métodos para fabricar una molécula de unión biespecífica de la invención, comprendiendo dichos métodos generalmente las etapas de:
 cultivar células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico capaz de codificar una molécula de unión biespecífica en condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión biespecífica de la invención; y
 recuperar o aislar el polipéptido expresado por las células hospedadoras a partir del cultivo; y 5
 opcionalmente purificar adicionalmente y/o modificar y/o formular la molécula de unión biespecífica de la invención.
Para la producción a escala industrial, los organismos hospedadores preferidos incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris, y S. cerevisiae, que son adecuadas para la expresión, producción y fermentación a gran escala y, en particular, para la expresión, producción y fermentación farmacéutica a gran escala. 10
La elección del sistema de expresión específico depende, en parte, de la necesidad de ciertas modificaciones postraduccionales, más específicamente glucosilación. La producción de una molécula de unión biespecífica de la invención para la que se desea o requiere glucosilación necesitaría el uso de hospedadores de expresión de mamífero que tuvieran la capacidad de glucosilar la proteína expresada. A este respecto, será evidente para el experto en la materia que el patrón de glucosilación obtenido (es decir, el tipo, número y posición de restos unidos) 15 dependerá de la célula o línea celular que se usa para la expresión.
Las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden producirse en una célula como se ha indicado anteriormente intracelularmente (por ejemplo en el citosol, en el periplasma o en cuerpos de inclusión) y después aislarse a partir de las células hospedadoras y opcionalmente purificarse adicionalmente; o pueden producirse extracelularmente (por ejemplo, en el medio en el que se cultivan las células hospedadoras) y después aislarse a 20 partir del medio de cultivo y opcionalmente purificarse adicionalmente.
En la técnica se conocen métodos y reactivos usados para la producción recombinante de polipéptidos, tales como vectores de expresión adecuados específicos, métodos de transformación o transfección, marcadores de selección, métodos de inducción de la expresión de proteínas, condiciones de cultivo y similares. De forma similar, son bien conocidas para el experto en la materia técnicas de aislamiento y purificación de proteínas útiles en un método de 25 fabricación de un polipéptido de la invención.
La invención se refiere además a un producto o composición que contiene o comprende al menos una molécula de unión biespecífica de la invención y, opcionalmente, uno o más componentes adicionales de dichas composiciones conocidas per se, es decir, dependiendo del uso deseado de la composición.
Para uso farmacéutico, una molécula de unión biespecífica de la invención puede formularse como una preparación 30 o composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de unión biespecífica de la invención y al menos un vehículo, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Por medio de ejemplos no limitantes, dicha formulación puede estar en una forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa), para administración tópica, para 35 administración por inhalación, por medio de un parche cutáneo, por un implante, por un supositorio, etc. Dichas formas de administración adecuadas – que pueden ser sólidas, semisólidas o líquidas, dependiendo de la forma de administración – así como los métodos y vehículos para uso en su preparación, serán evidentes para el experto en la materia y se describen adicionalmente en el presente documento.
De esta manera, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al 40 menos una molécula de unión biespecífica, en particular un dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención y al menos un vehículo, diluyente o excipiente adecuado (es decir, adecuado para uso farmacéutico) y, opcionalmente, una o más sustancias activas adicionales.
Las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden formularse y administrarse de cualquier manera adecuada conocida per se: se hace referencia, por ejemplo, en particular para los dominios variables individuales de 45 inmunoglobulina, a los documentos WO 2004/041862, WO 2004/041863, WO 2004/041865, WO 2004/041867 y WO 2008/020079, así como a manuales convencionales, tales como Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., Mack Publishing Company, Estados Unidos (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21ª Edición, Lippincott Williams and Wilkins (2005); o el Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (véanse, por ejemplo, las páginas 252-255). 50
Por ejemplo, una molécula de unión de la invención puede formularse y administrarse de cualquier manera conocida per se para anticuerpos convencionales y fragmentos de anticuerpo (incluyendo ScFv y diacuerpos), y otras proteínas farmacéuticamente activas. Dichas formulaciones y métodos para prepararlas serán evidentes para el experto en la materia, e incluyen, por ejemplo, preparaciones adecuadas para administración parenteral (por ejemplo administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraluminal, intraarterial o intratecal), o para 55 administración tópica (es decir transdérmica o intradérmica).
Las preparaciones para administración parenteral pueden ser, por ejemplo, soluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones estériles que son adecuadas para infusión o inyección. Los vehículos o diluyentes adecuados para dichas preparaciones incluyen, por ejemplo, sin limitación, agua estéril y tampones y soluciones acuosas farmacéuticamente aceptables tales como solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank; agua, aceites; glicerol; etanol, glicoles tales como propilenglicol o también 5 aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja así como mezclas adecuadas de los mismos. Normalmente, se preferirán soluciones o suspensiones acuosas.
De esta manera, la molécula de unión biespecífica de la invención puede administrarse sistémicamente, por ejemplo, por vía oral, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Para administración terapéutica oral, la molécula de unión biespecífica de la 10 invención puede combinarse con uno o más excipientes y usarse en forma de comprimidos que se pueden ingerir, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparaciones deben contener al menos 0,1% de la molécula de unión de la invención. Su porcentaje en las composiciones y preparaciones, por supuesto, puede variar y, convenientemente, puede estar comprendido entre aproximadamente 2 y aproximadamente 60% del peso de una forma de dosificación unitaria dada. La cantidad de la 15 molécula de unión biespecífica de la invención en dichas composiciones terapéuticamente útiles será tal que se obtenga un nivel de dosificación eficaz.
Los comprimidos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, y agentes edulcorantes o saporíferos, por ejemplo, los mencionados en las páginas 143-144 del documento WO2008/020079. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, 20 además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Pueden estar presentes diversos materiales distintos como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la forma de dosificación unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener las moléculas de unión de la invención, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y 25 saporífero tal como aroma de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, las moléculas de unión biespecíficas de la invención pueden incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.
Las preparaciones y formulaciones para administración oral también pueden proporcionarse con un recubrimiento 30 entérico que permita que las construcciones de la invención resistan el entorno gástrico y pasen al intestino. Más generalmente, pueden formularse convenientemente preparaciones y formulaciones para administración oral para su liberación en cualquier parte deseada del tracto gastrointestinal. Además, puede usarse supositorios adecuados para administración en el tracto gastrointestinal.
Las moléculas de unión biespecíficas de la invención también pueden administrarse por vía intravenosa o 35 intraperitoneal por infusión o inyección, como se describe adicionalmente en las páginas 144 y 145 del documento WO 2008/020079.
Para administración tópica de las moléculas de unión biespecíficas de la invención, generalmente será deseable administrarlas en la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un vehículo dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido, como se describe adicionalmente en la página 145 del documento 40 WO 2008/020079.
En general, la concentración de las moléculas de unión biespecíficas de la invención en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente 0,1-25% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,5-10% en peso. La concentración en una composición semisólida o sólida tal como un gel o un polvo será de aproximadamente 0,1-5% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,5-2,5% en peso. 45
La cantidad de las moléculas de unión biespecíficas de la invención necesaria para uso en el tratamiento variará no sólo con la molécula de unión particular seleccionada, sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección a tratar y la edad y estado del paciente, y finalmente estará a la discreción del médico o especialista clínico a cargo del caso. Además, la dosificación de las moléculas de unión de la invención varía dependiendo de la célula, tumor, tejido, injerto u órgano diana. 50
La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una sola dosis o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis al día. La propia subdosis puede dividirse adicionalmente, por ejemplo, en varias administraciones discretas espaciadas ligeramente; tales como múltiples inhalaciones desde un insuflador o por aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo.
Un régimen de administración puede incluir el tratamiento diario a largo plazo. Por “largo plazo” se entiende al 55 menos dos semanas y, preferiblemente, varias semanas, meses o años de duración. Las modificaciones necesarias en este intervalo de dosificación pueden determinarse por un experto en la materia usando únicamente la experimentación rutinaria dadas las enseñanzas del presente documento. Véase Remington’s Pharmaceutical
Sciences (Martin, E. W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosificación también puede ajustarse por el médico individual en caso de cualquier complicación.
De acuerdo con una realización adicional, la invención se refiere al uso de moléculas de unión biespecíficas, por ejemplo, dominios variables individuales de inmunoglobulina, para fines terapéuticos, tales como
 para la prevención, tratamiento y/o alivio de un trastorno, enfermedad o afección, especialmente en un ser 5 humano, que está asociada con efectos mediados por VEGF y/o Ang2 sobre la angiogénesis o que puede prevenirse, tratarse o aliviarse mediante la modulación de la ruta de señalización Notch y/o la ruta de señalización Tie2 con una molécula de unión biespecífica de acuerdo con la invención,
 en un método de tratamiento de un paciente que necesita dicha terapia, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una molécula de 10 unión biespecífica de la invención, por ejemplo, un dominio variable individual de inmunoglobulina, o una composición farmacéutica que lo contiene;
 para la preparación de un medicamento para la prevención, tratamiento o alivio de trastornos, enfermedades o afecciones asociadas con efectos mediados por VEGF y/o Ang2 sobre la angiogénesis;
 como un ingrediente activo en una composición farmacéutica o medicamento usado para los fines anteriores. 15
De acuerdo con un aspecto específico, dicho trastorno, enfermedad o afección es un cáncer o enfermedad cancerosa, como se define en el presente documento.
De acuerdo con otro aspecto, la enfermedad es una enfermedad ocular asociada con efectos mediados por VEGF y/o Ang2 sobre la angiogénesis o que puede tratarse o aliviarse mediante la modulación de la ruta de señalización Notch con una molécula de unión biespecífica. 20
Dependiendo de la enfermedad cancerosa a tratar, una molécula de unión biespecífica de la invención puede usarse por sí misma o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en particular seleccionados entre agentes quimioterapéuticos tales como agentes que dañan el ADN o compuestos terapéuticamente activos que inhiben la angiogénesis, rutas de transducción de señales o puntos de control mitótico en células cancerosas.
El agente terapéutico adicional puede administrarse simultáneamente con, opcionalmente como un componente de 25 la misma preparación farmacéutica, o antes o después de la administración de la molécula de unión.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional puede ser, sin limitación (y en el caso de los receptores, incluyendo los ligandos respectivos), uno o más inhibidores seleccionados entre el grupo de inhibidores de EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK y PI3 quinasa, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R o IR. 30
Otros ejemplos de agentes terapéuticos adicionales son inhibidores de CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, antagonistas de hedgehog, inhibidores de JAK/STAT, MEK, mTor, NFkappaB, el proteasoma, Rho, un inhibidor de la señalización de wnt o un inhibidor de la ruta de ubiquitinación u otro inhibidor de la ruta de señalización Notch.
Son ejemplos de inhibidores de Aurora, sin limitación, PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, 35 VX-667, MLN-8045, PF-3814735.
Un ejemplo de un inhibidor de PLK es GSK-461364.
Son ejemplos de inhibidores de raf BAY-73-4506 (también un inhibidor de VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (también además un inhibidor de VEGFR), sorafenib (también además un inhibidor de VEGFR) y XL 281.
Son ejemplos de inhibidores de KSP ispinesib, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, 40 MK-0731 y SB-743921.
Son ejemplos de inhibidores de src y/o bcr-abl dasatinib, AZD-0530, bosutinib, XL 228 (también un inhibidor de IGF-1R), nilotinib (también un inhibidor de PDGFR y cKit), imatinib (también un inhibidor de cKit) y NS-187.
Un ejemplo de un inhibidor de PDK1 es BX-517.
Un ejemplo de un inhibidor de Rho es BA-210. 45
Son ejemplos de inhibidores de la PI3 quinasa PX-866, BEZ-235 (también un inhibidor de mTor), XL 418 (también un inhibidor de Akt), XL-147 y XL 765 (también un inhibidor de mTor).
Son ejemplos de inhibidores de cMet o HGF XL-184 (también un inhibidor de VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (también un inhibidor de VEGFR), MGCD-265 (también un inhibidor de VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 y AV-299.
Un ejemplo de un inhibidor de c-Myc es CX-3543.
Son ejemplos de inhibidores de Flt3 AC-220 (también un inhibidor de cKit y PDGFR), KW 2449, lestaurtinib (también 5 un inhibidor de VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (también un inhibidor de JAK2), XL-999 (también un inhibidor de cKit, FGFR, PDGFR y VEGFR), sunitinib (también un inhibidor de PDGFR, VEGFR y cKit), y tandutinib (también un inhibidor de PDGFR, and cKit).
Son ejemplos de inhibidores de HSP90 tanespimicina, alvespimicina, IPI-504 y CNF 2024.
Son ejemplos de inhibidores de JAK/STAT CYT-997 (que también interacciona con tubulina), TG 101348 (también 10 un inhibidor de Flt3), y XL-019.
Son ejemplos de inhibidores de MEK ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330, y XL 518.
Son ejemplos de inhibidores de mTor temsirolimus, AP-23573 (que también actúa como inhibidor de VEGF), everolimus (además un inhibidor de VEGF), XL-765 (también un inhibidor PI3 quinasa) y BEZ-235 (también un inhibidor de PI3 quinasa). 15
Son ejemplos de inhibidores de Akt perifosina, GSK-690693, RX-0201 y triciribina.
Son ejemplos de inhibidores de cKit AB-1010, OSI-930 (también actúa como un inhibidor de VEGFR), AC-220 (también un inhibidor de Flt3 y PDGFR), tandutinib (también un inhibidor de Flt3 y PDGFR), axitinib (también un inhibidor de VEGFR y PDGFR), XL-999 (también un inhibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), sunitinib (también un inhibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR), y XL-820 (también actúa como un inhibidor de VEGFR- y PDGFR), imatinib 20 (también un inhibidor de bcr-abl), nilotinib (también un inhibidor de bcr-abl y PDGFR).
Son ejemplos de antagonistas de hedgehog IPI-609 y CUR-61414.
Son ejemplos de inhibidores de CDK seliciclib, AT-7519, P-276, ZK-CDK (que también inhibe VEGFR2 y PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 y AG 024322.
Son ejemplos de inhibidores de proteasoma bortezomib, carfilzomib, y NPI-0052 (también un inhibidor de 25 NFkappaB).
Un ejemplo de un inhibidor de la ruta de NFkappaB es NPI-0052.
Un ejemplo de un inhibidor de la ruta de ubiquitinación es HBX-41108.
En realizaciones preferidas, el agente terapéutico adicional es un agente antiangiogénico.
Son ejemplo de agentes antiangiogénicos inhibidores de FGFR, PDGFR y VEGFR o los ligandos respectivos (por 30 ejemplo, inhibidores de VEGF tales como pegaptanib o el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab), inhibidores de EGFL7, tales como mAb anti EGFL7, inhibidores angiopoyetina 1/2 tales como AMG386 y talidomidas, seleccionándose dichos agentes entre, sin limitación, bevacizumab, motesanib, CDP-791, SU-14813, telatinib, KRN-951, ZK-CDK (también un inhibidor de CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (fármacos inmunomoduladores), el derivado de talidomida CC-4047, lenalidomida, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, 35 brivanib, cediranib, XL-999 (también un inhibidor de cKit y Flt3), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (también un inhibidor de Flt3), sunitinib (también un inhibidor de cKit y Flt3), axitinib (también un inhibidor de cKit), lestaurtinib (también un inhibidor de Flt3 y PKC), vatalanib, tandutinib (también un inhibidor de Flt3 y cKit), pazopanib, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, tosilato de sorafenib (también un inhibidor de Raf), RAF-265 (también un inhibidor de Raf), vandetanib, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (también un 40 inhibidor de EGFR y Her2), BAY-57-9352 (también un inhibidor de Raf), BAY-73-4506 (también un inhibidor de Raf), XL 880 (también un inhibidor de cMet), XL-647 (también un inhibidor de EGFR y EphB4), XL 820 (también un inhibidor de cKit), y nilotinib (también un inhibidor de cKit y brc-abl).
El agente terapéutico adicional también puede seleccionarse entre inhibidores de EGFR, puede ser un inhibidor de EGFR de molécula pequeña o un anticuerpo anti-EGFR. Son ejemplos de anticuerpos anti-EGFR, sin limitación, 45 cetuximab, panitumumab, matuzumab; un ejemplo de un inhibidor de EGFR de molécula pequeña es gefitinib. Otro ejemplo de un modulador de EGFR es la toxina de fusión de EGF.
Entre los inhibidores de EGFR y Her2 útiles para combinación con la molécula de unión biespecífica de la invención se encuentran lapatinib, gefitinib, erlotinib, cetuximab, trastuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, vandetanib (también un inhibidor de VEGFR), pertuzumab, XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, 50 BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (también un inhibidor de VEGFR), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab.
Otros agentes que pueden combinarse ventajosamente en una terapia con la molécula de unión biespecífica de la invención son tositumumab y ibritumomab tiuxetan (dos anticuerpos anti-CD20 radiomarcados), alemtuzumab (un anticuerpo anti-CD52), denosumab (un inhibidor del ligando del factor de diferenciación de osteoclastos), galiximab (un antagonista de CD80), ofatumumab (un inhibidor de CD20), zanolimumab (un antagonista de CD4), SGN40 (un modulador del receptor del ligando de CD40), rituximab (un inhibidor de CD20), mapatumumab (un agonista del 5 receptor TRAIL-1), REGN421 (SAR153192) o OMP-21M18 (inhibidores de Dll4).
Otros fármacos quimioterapéuticos que pueden usarse en combinación con la molécula de unión biespecífica de la presente invención se seleccionan entre, pero sin limitación, hormonas, análogos hormonales y antihormonales (por ejemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, fulvestrant, acetato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, finasterida, acetato de buserelina, fludrocortisona, fluoximesterona, medroxiprogesterona, 10 octreótido, arzoxifeno, pasireótido, vapreótido), inhibidores de aromatasa (por ejemplo, anastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formestano), agonistas y antagonistas de LHRH (por ejemplo, acetato de goserelina, leuprolida, abarelix, cetrorelix, deslorelina, histrelina, triptorelina), antimetabolitos (por ejemplo, antifolatos tales como metotrexato, pemetrexed, análogos de pirimidina tales como 5 fluorouracilo, capecitabina, decitabina, nelarabina y gemcitabina, análogos de purina y adenosina tales como mercaptopurina tioguanina, cladribina y pentostatina, 15 citarabina, fludarabina); antibióticos antitumorales (por ejemplo, antraciclinas tales como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e idarubicina, mitomicina-C, bleomicina dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, pixantrona, estreptozocina); derivados de platino (por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, lobaplatinp, satraplatino); agente alquilantes (por ejemplo, estramustina, mecloretamina, melfalán, clorambucilo, busulfán, dacarbacina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiurea, temozolomida, nitrosoureas tales como carmustina y lomustina, 20 tiotepa); agentes antimitóticos (por ejemplo, alcaloides de la vinca tales como vinblastina, vindesina, vinorelbina, vinflunina y vincristina; y taxanos tales como paclitaxel, docetaxel y sus formulaciones, larotaxel; simotaxel y epotilonas tales como ixabepilona, patupilona, ZK-EPO); inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas tales como etopósido y etopofos, tenipósido, amsacrina, topotecan, irinotecan) y diversos agentes quimioterapéuticos tales como amifostina, anagrelida, interferón alfa, procarbazina, mitotano y porfímero, 25 bexaroteno, celecoxib.
La eficacia de la molécula de unión biespecífica de la invención o polipéptidos, y de las composiciones que las comprenden, puede ensayarse usando cualquier ensayo in vitro, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal adecuado conocido per se, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o trastorno específico de interés. Los ensayos y modelos animales adecuados serán evidentes para el experto en la 30 materia y, por ejemplo, incluyen los ensayos descritos en el presente documento y usados en los ejemplos proporcionados a continuación, por ejemplo, un ensayo de proliferación.
Los datos obtenidos en los experimentos de la invención confirman que las moléculas de unión biespecíficas de la invención tienen propiedades que son superiores a las de las moléculas de unión de la técnica anterior. Entre tales propiedades están inhibición completa de la interacción VEGF165-VEGFR2 y una CI50 baja, como puede extraerse, 35 por ejemplo, de los datos del ELISA de la Figura 1 y tabla 5, así como los valores de CI50 (nM) para VHH en el ensayo AlphaScreen como se muestra en las Figuras 3, 17, 18 y Tabla 7; y la KD de afinidad (nM) de VHH purificados sobre VEGF humano recombinante y VEGF de ratón en la Tabla 9, 10 y Figura 5. Además, como se muestra en la Tabla 13, los agentes de unión a VEGF de la invención tienen alta potencia, es decir, en el intervalo subnanomolar, n el ensayo de proliferación de HUVEC. Esto indica que las moléculas de unión biespecíficas de la 40 invención son candidatos prometedores para tener eficacia terapéutica en enfermedades y trastornos asociados con los efectos mediados por VEGF sobre la angiogénesis, tales como el cáncer.
Breve descripción de las Figuras:
Figura 1: Los VHH monovalentes purificados bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR2-Fc (ELISA)
Figura 2: Los VHH monovalentes purificados bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR1-Fc (ELISA) 45
Figura 3: Los VHH monovalentes purificados bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen)
Figura 4: Los VHH monovalentes purificados bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR1-Fc (AlphaScreen)
Figura 5: Unión de VHH monovalentes con VEGF de ratón y humano recombinante (ELISA) 50
Figura 6: Unión de VHH monovalentes con VEGF121 humano
Figura 7: Los VHH purificados no se unen a VEGFB, VEGFC, VEGFD y PlGF
Figura 8: Los VHH formateados bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR2-Fc (ELISA)
Figura 9: Los VHH formateados bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR1-Fc (ELISA)
Figura 10: Los VHH formateados bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen)
Figura 11: Los VHH formateados bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR1-Fc (AlphaScreen)
Figura 12: Los VHH formateados bloquean la interacción mVEGF164/mVEGFR2-Fc (AlphaScreen)
Figura 13: Los VHH formateados se unen a VEGF humano y de ratón
Figura 14: Los VHH formateados no se unen a VEGFB, VEGFC, VEGFD y PlGF 5
Figura 15: Los VHH formateados se unen a VEGF121
Figura 16: Alineamiento de secuencias de VHH VEGFBII23B04 con secuencia consenso de línea germinal de VH3/JH humano
Figura 17: Variantes de VHH de VEGFBII23B04 bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen) 10
Figura 18: Los clones de secuencia optimizada de VEGFBII23B04 bloquean la interacción hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen)
Figura 19: Alineamiento de secuencias de VHH VEGFBII5B05 con secuencia consenso de línea germinal de VH3/JH humana
Figura 20: Descripción de VHH de Ang2 bivalentes 15
Figura 21: VHH de Ang2 bivalentes purificados que bloquean la interacción de hAng2-hTie2 (25-1), mAng2-mTie2 (25-2) y cAng2-cTie2 (25-3) (ELISA)
Figura 22: Los VHH de Ang2 bivalentes purificados que bloquean la interacción hAng1-hTie2 (ELISA)
Figura 23: Descripción de VHH biespecífico de VEGFxAng2 trivalentes
Figura 24: Nanobodies VEGFxAng2 trivalentes purificados que bloquean interacción hVEGF-hVEGFR2 20 (AlphaScreen)
Figura 25: VHH de VEGFxAng2 trivalentes purificados que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (ELISA)
Figura 26: Descripción de VHH biespecíficos de VEGFxAng2 tetravalentes y trivalentes
Figura 27: VHH de VEGFxAng2 trivalentes y tetravalentes purificados que bloquean la interacción VEGF-hVEGFR2 (31-1) y hVEGF-hVEGFR1 (31-2) (AlphaScreen) 25
Figura 28: VHH de VEGFxAng2 trivalentes y tetravalentes purificados que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (32-1), mAng2-mTie2 (32-2) y cAng2-cTie2 (32-3) (ELISA)
Figura 29: VHH de VEGFxAng2 trivalentes y tetravalentes purificados que bloquean la supervivencia de HUVEC mediada por hAng2.
Figura 30: Descripción de VHH biespecíficos de VEGFxAng2 de afinidad y de secuencia optimizada 30
Figura 31: VHH de VEGFxAng2 VEGFANGBII00022-25-28 purificados que bloquean la interacción hVEGF-hVEGFR2 (35-1) y hVEGF-hVEGFR1 (35-2) (AlphaScreen)
Figura 32: VHH de VEGFxAng2 VEGFANGBII00022-25-28 purificados que se unen a VEGF165 (36-1) humano y hVEGF121 (36-2) (ELISA)
Figura 33: VHH de VEGFxAng2 VEGFANGBII00022-25-28 purificados que se unen a VEGF164 de (A) ratón 35 y (B) rata (ELISA)
Figura 34: VHH de VEGFxAng2 VEGFANGBII00022-25-28 purificados que se unen a (A) VEGF-B humano, (B) VEGF-C humano, (C) VEGF-D humano y (D) PlGF humano (ELISA)
Figura 35: VHH de VEGFxAng2 VEGFANGBII00022-25-28 purificados que bloquean la interacción hAng2-hTie2 (39-1), mAng2-mTie2 (39-2) y cAng2-cTie2 (39-3) (ELISA) 40
Figura 36: VHH de VEGFxAng2 VEGFANGBII00022-25-28 purificados que bloquean la interacción hAng1-hTie2 (ELISA)
Figura 37: VHH de VEGFxAng2 VEGFANGBII00022-25-28 que bloquean la supervivencia de HUVEC mediada por hAng2.
Materiales y métodos:
a) Producción y ensayo de funcionalidad de VEGF109
Se clona un ADNc que codifica el dominio de unión a receptor de la isoforma del factor de crecimiento endotelial vascular humano VEGF165 (GenBank: AAM03108.1; restos de aminoácidos 27-135) en el vector pET28a vector (Novagen, Madison, WI) y se sobreexpresa en E. coli (BL21 Star DE3) como un proteína insoluble marcada con His. 5 La expresión se induce mediante la adición de IPTG 1 mM y se permite que continúe durante 4 horas a 37 ºC. Las células se recogen por centrifugación y se lisan por sonicación del sedimento celular. Se aíslan cuerpos de inclusión por centrifugación. Después de una etapa de lavado con Tritón X 100 1 % (Sigma-Aldrich), se solubilizan proteínas usando clorhidrato de guanidina 7,5 M y se vuelven a plegar por ciclos consecutivos de diálisis durante una noche usando tampones con concentraciones de urea decrecientes de 6 M a 0 M. La proteína replegada se purifica por 10 cromatografía de intercambio iónico usando una columna MonoQ5/50GL (Amersham BioSciences) seguido de filtración en gel con una columna de Superdex75 10/300GL (Amersham BioSciences). La pureza y homogeneidad de la proteína se confirma por SDS-PAGE y transferencia de Western. Además, la actividad de unión a VEGFR1, VEGFR2 y Bevacizumab se controla por ELISA. Para este fin, se inmoviliza VEGF109 humana recombinante 1 g/ml durante una noche a 4 ºC en una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Los pocillos se 15 bloquean con una solución de caseína (1 %). Se añaden diluciones en serie de VEGFR1, VEGFR2 o Bevacizumab a la placa recubierta con VEGF109 y se detecta la unión usando IgG, antihumana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (AP), específica de Fc (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, Estados Unidos) y una reacción enzimática posterior en presencia del sustrato PNPP (p-nitrofenilfosfato) (Sigma-Aldrich). VEGF109 se pudo unir a VEGFR1, VEGFR2 y Bevacizumab, lo que indica que el VEGF109 producido está activo. 20
b) Conjugación de KLH de VEGF165 y ensayo de funcionalidad de VEGF165 conjugado con KLH
Se conjuga VEGF165 humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos) con hemocianina de lapa californiana de maricultura (mcKLH) usando el kit Imject Immunogen EDC con mcKLH (Pierce, Rockford, IL, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se confirma conjugación eficaz del polipéptido con mcKLH por SDS-PAGE. La funcionalidad de la proteína conjugada se comprueba por ELISA: se inmoviliza 25 VEGF165 conjugado con KLH 2 g/ml durante una noche a 4 ºC en una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Los pocillos se bloquean con una solución de caseína (1 %). Se añaden diluciones en serie de VEGFR1 o VEGFR2 y la unión se detecta usando una IgG antihumana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP), específica de Fc (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, Estados Unidos) y una reacción enzimática posterior en presencia del sustrato TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina) (Pierce, 30 Rockford, IL, Estados Unidos). La proteína conjugada con KLH aún podía interaccionar con VEGFR1, VEGFR2 y Bevacizumab, lo que confirma que los epítopos relevantes de VEGF165 aún están accesibles.
Ejemplo 1
La inmunización con formatos de VEGF diferentes induce una respuesta inmune humoral en llama
1.1. Inmunizaciones 35
Después de la aprobación por el Comité de Ética de la facultad de Medicina Veterinaria (University Ghent, Bélgica), se inmunizan 4 llamas (denominadas Nº 264, 265, 266, 267) de acuerdo con protocolos convencionales con 6 inyecciones intramusculares (100 o 50 g/dosis a intervalos semanales) de VEGF109 humano recombinante La primera inyección en el día 0 se formula en Adyuvante Completo de Freund (Difco, Detroit, MI, Estados Unidos), mientras que las inyecciones posteriores se formulan en Adyuvante Incompleto de Freund (Difco, Detroit, MI, 40 Estados Unidos). Además, se inmunizan cuatro llamas (designadas Nº 234, 235, 280 y 281) de acuerdo con el siguiente protocolo: 5 inyecciones intramusculares con VEGH165 humano conjugado con KLH (100 o 50 g/dosis a intervalos bisemanales) seguido de 4 inyecciones intramusculares de VEGF109 humano (primera dosis de 100 g seguido 2 semanas después de tres dosis de 50 g a intervalo semanal).
1.2. Evaluación de respuestas inmunes inducidas por VEGF en llama 45
Para controlar titulaciones de suero específicas de VEGF, se prepara un ensayo de ELISA en el que se inmovilizan 2 g/ml de VEGF165 o VEGF109 humano recombinante durante una noche a 4 ºC en una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Los pocillos se bloquean con una solución de caseína (1%). Después de la adición de diluciones de suero, se detecta IgG total unida usando inmunoglobulina de cabra anti-llama conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, Estados Unidos) y una reacción 50 enzimática posterior en presencia del sustrato TMB (3,3’,5,5’-tetramentilbencidina) (Pierce, Rockford, IL, Estados Unidos). Para llamas 264, 265, 266 y 267, se realiza un ELISA adicional en el que las respuestas específicas de isotipo contra VEGF165 y VEGF109 se evalúan. Las respuestas específicas de isotipo se detectan usando mAb de ratón que reconocen específicamente IgG1 de llama convencional e IgG2 e IgG3 de llama únicamente de cadena pesada [Daley et al. (2005). Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386] seguido de un conjugado de HRP de conejo anti 55 ratón (DAKO). Se desarrollan ELISA usando TMB como sustrato cromogénico y se mide la absorbancia a 450 nm. En la Tabla 1 se representan los títulos en suero para cada llama.
Tabla 1: Respuesta en suero específica mediada por anticuerpo contra VEGF165 y VEGF109.
ELISA (recubierto en fase sólida con proteína recombinante)
VEGF165 humano recombinante VEGF109 recombinante
Llama
Inmunógeno IgG Total IgG1 IgG2 IgG3 IgG Total IgG1 IgG2 IgG3
234
VEGF165-KLH + VEGF109 ++ n/d n/d n/d ++ n/d n/d n/d
235
VEGF165-KLH + VEGF109 ++ n/d n/d n/d ++ n/d n/d n/d
280
VEGF165-KLH + VEGF109 + n/d n/d n/d + n/d n/d n/d
281
VEGF165-KLH + VEGF109 + n/d n/d n/d + n/d n/d n/d
264
VEGF109 n/d ++ + + ++ ++ + +
265
VEGF109 n/d ++ + + + ++ + +
266
VEGF109 n/d ++ + +/- ++ ++ + +/-
267
VEGF109 n/d +/- - - +/- +/- - -
n/d: no determinado
Ejemplo 2
Clonación de repertorios de fragmentos de anticuerpo sólo de cadena pesada y preparación de fagos 5
Después de la inyección de inmunógenos final, se recogen tejidos inmunes como fuente de células B que producen los anticuerpos de cadena pesada a partir de las llamas inmunizadas. Típicamente, se recogen dos muestras de sangre de 150 ml, recogidas 4 y 8 días después de la última inyección de antígeno, y una biopsia de ganglio linfático, recogida 4 días después de la última inyección de antígeno, por animal. A partir de las muestras de sangre, se preparan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando Ficoll-Hypaque de acuerdo con las 10 instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Estados Unidos). A partir de las PBMC y de la biopsia de ganglio linfático, se extrae el ARN total, que se usa como material de partida para RT-PCR para amplificar los segmentos de ADN que codifican VHH, como se describe en el documento WO 2005/044858. Para cada llama inmunizada, se construye una biblioteca reuniendo el ARN total aislado de todos los tejidos inmunes recogidos de ese animal. En resumen, el repertorio de VHH amplificado por PCR se clona mediante sitios de restricción 15 específicos en un vector diseñado para facilitar la presentación en fagos de la biblioteca de VHH. El vector procede de pUC119 y contiene el promotor de LacZ, una secuencia codificante de la proteína gIII del fago M13, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonación múltiple y una secuencia líder híbrida de gIII-pelB (pAX050). En fase con la secuencia codificante de VHH, el vector codifica una señal c-myc C-terminal y un marcador His6. Los fagos se preparan de acuerdo con protocolos convencionales y se almacenan después de la esterilización 20 en filtro a 4 ºC para un uso adicional.
Ejemplo 3
Selección de VHH específicos para VEGF mediante presentación en fago
Se usan bibliotecas de fago de VHH en diferentes estrategias de selección, aplicando una multiplicidad de condiciones de selección. Las variables incluyen i) el formato de proteína VEGF (rhVEGF165, rhVEGF109 o 25 rmVEGF164), ii) el método de presentación de antígeno (fase sólida: recubiertas directamente o mediante un marcador de biotina en placas recubiertas de Neutravidina; fase de solución: incubación en solución seguido de captura en placas recubiertas con Neutravidina), iii) la concentración de antígeno y iv) el método de elución (tripsina o elución competitiva usando VEGFR2). Todas las selecciones se realizan en placas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania). 30
Las selecciones se realizan como se indica a continuación: se incuban bibliotecas de fagos a RT con concentraciones variables de antígeno de VEGF, en solución o inmovilizado en un soporte sólido. Después de 2 h de incubación y lavado extensivo, se eluye el fago unido. En caso de que se use tripsina para la elución de fagos, la actividad proteasa se neutraliza inmediatamente por adición de inhibidor de proteasa AEBSF 0,8 mM. Las producciones de fago que muestran enriquecimiento con respecto al nivel de fondo se usan para infectar E. coli. Las 35 células E. coli infectadas se usan para preparar fagos para la siguiente vuelta de selección (rescate de fagos) o se
cultivan en placas de agar (LB+amp+glucosa2%) para el análisis de clones de VHH individuales. Para explorar una producción de selección con respecto a agentes de unión específicos, se seleccionan colonias individuales a partir de las placas de agar y se cultivan en placas de 96 pocillos profundos de 1 ml. La expresión de VHH controlada por LacZ se induce añadiendo IPTG (0,1-1 mM final). Se preparan extractos periplásmicos (en un volumen de 80 l) de acuerdo con métodos convencionales. 5
Ejemplo 4
Identificación de VHH de unión a VEGF y bloqueo del receptor de VEGF
Se ensayan extractos periplásmicos con respecto a unión a VEGF165 por ELISA. Brevemente, se inmoviliza VEGF humano recombinante 2 g/ml durante una noche a 4 ºC en una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania). Los pocillos se bloquean con una solución de caseína (1 %). Después de la adición típicamente de un 10 dilución 10 veces de los extractos periplásmicos, se detecta unión a VHH usando anti-myc de ratón (Roche) y un conjugado anti-HRP de ratón (DAKO). Los clones que muestran señales de ELISA de > 3 veces por encima del fondo se consideran VHH que se unen a VEGF.
Además, se exploran extractos periplásmicos en un ensayo AlphaScreen de VEGFR2 humano/VEGF165 humano (Ensayo Homogéneo de Proximidad Luminiscente Amplificada) para evaluar la capacidad de bloqueo de los VHH. 15 Se biotinila VEGF165 humano usando Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Rockord, IL, Estados Unidos). Se captura quimera de VEGFR2/Fc humano (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos) usando un VHH anti-Fc humano que se acopla a perlas aceptoras de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer, Waltham, MA, Estados Unidos). Para evaluar la capacidad de neutralización de los VHH, se diluyen extractos periplásmicos 1/25 en tampón de PBS que contiene Tween 20 0,03 % (Sigma-Aldrich) y se preincuba con VEGF165 humano biotinilado 20 0,4 nM durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA). A esta mezcla se añaden las perlas aceptoras (10 g/ml) y VEGFR2-huFc 0,4 nM y se incuba adicionalmente durante 1 hora a TA en oscuridad. Se añaden posteriormente perlas donantes (10 g/ml) seguido de incubación de 1 hora a TA en oscuridad. La fluorescencia se mide leyendo las placas en el lector de Placas multimarcador Envision (Perkin Elmer, Waltham, MA, Estados Unidos) usando una longitud de onda de excitación de 680 nm y una longitud de onda de emisión entre 520 nm y 620 nm. El extracto 25 periplásmico que contiene VHH irrelevante se usa como control negativo. Los extractos periplásmicos que contienen VHH anti-VEGF165 que son capaces de reducir la señal de fluorescencia con más de 60 % en relación con la señal del control negativo se identifican como un acierto. Todos los aciertos identificados en el AlphaScreen se confirman en un ELISA de competición. Para este fin, se reviste una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con quimera de VEGFR2 humana 1 g/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos). Se incuban 30 diluciones cinco veces de los extractos periplásmicos en presencia de una concentración fija (4 nM) de VEGF165 humano biotinilado en tampón de PBS que contiene caseína 0,1 % y Tween 20 0,05 % (Sigma-Aldrich). La unión de estos complejos de VHH/bio-VEGF165 con la placa revestida con quimera de VEGFR2 humano se detecta usando extravidina conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (HRP), (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos). Se enumeran los ID de secuencia de VHH y las secuencias de aminoácidos correspondientes de VHH de unión a VEGF 35 (no bloqueadores del receptor) y VHH inhibidores (bloqueadores del receptor) en la Tabla 2 y Tabla 3, respectivamente.
Tabla 2: ID de secuencia y secuencias de aminoácidos de VHH anti-VEGF monovalentes “no bloqueadores del receptor” (FR, marco; CDR, región determinante de complementariedad).
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 01C02/58
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCTASGGSFS SYGMG WFRQSPG KEREFVS AISEYSNTY CSDSVRG RFTISRDNTKNTV YLQMNSLTPDDTA IYYCAA SPTILLT TEWYKY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 01E07/59
EVQLVESGGG LVQAGDSLRL SCVATGRTFR ASDMG WFRQAPG KEREFVA AINWSGLST FYTDSVKG RFTISRDNDNGAL YLQMNTLKPEDTA VYSCAA GRIPSSS RFSSPA AYAS WGQG TQVTVSS
VEGFBII 03D12/60
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCTASTSIYT ITVMA WFRQAPG KEREFVA AITWSAPTT YYADSVKG RFTISRDNAKNTV YLRMNSLKPEDSA IYYCAA DRFKGRSI VTPSDYRY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 04B08/61
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGSAVG DITVA WYRQAPG IQRQLVA TITPSGYT YYWDFVKG RFTISRDNSKNIV YLQMNSLKPEDTA AYYCNT QFY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 05B02/62
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS TDDVG WFRQAPG KEREFVA VIRWSTGGT YTSDSVKG RFTLSRDNAKNTM YLQMNSLKPEDTA VYYCAA RSRPLGA GAWYSG EKHYNY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 05B03/63
EVQLVESGGG LAQAGDSLRL SCAASGRSFS HYNMG WFRQAPG KEREFVA SIRGGGGST TYANSVKD RFTISRENAKNTV YLQMNSLKPEDTA VYYCAA TAFYRGPY DYDY WGQGTQ VTVSS
VEGFBII 05B05/64
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCVASGIRFM SMA WYRQAPG KHRELVA RISSGGTTA YVDSVKG RFTISRDNSKNTV YLQMNSLKAEDTA VYYCNT FSSRPNP WGAGTQ VTVSS
VEGFBII 06G02/65
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGNIFS NNAMA WYRQAPG KQRELVA RISSGGGFT YYLDSVKG RFTVSRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTA VYYCNA AYRTYNY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 07A03/66
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASTSIYS ITVMA WFRQAPG KESEFVA AITWSAPSS YYADSVKG RFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDSA IYYCAA DRFKGRSI VTRSD YKY WGQGT QVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 07A06/67
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAVSTSIYS ISVMA WFRQAPG KERAFVA AITWSAPTT YYADSVKG RFTISRDNAKNTV YLQTNSLKPEDSA IYYCAA DRFKGRS IVTRSDYRY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 07D08/68
EVQLVESGGG LVQTGGSLRL SCAASGRTFS NYAMA WFRQAPG KEREFVS AINQRGSNT NYADSVKG RFTISRDSAKNSVF LQMNSLKPEDTAVY YCAA STWYGYSTY ARREEYRY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 08D09/69
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRSFS DNVMG WFRQAAG KEREFVA HISRGGSRT EYAESVKG RFTISRDNTKKTMYL QMNSLKPEDTAV YYCAA SRSVALA TARPYDY WGQG TQVTVSS
VEGFBII 08E07/70
EVQLVESGGG LAQAGGSLRL SCTTSGLTFS SYYMG WFRQAPG KEREFVA TISWNKIST IYTDSVKG RFTVSRDNNKN TVYLQMNSLKPE DTAVYYCAA DASRPTL RIPQY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 08F06/71
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGSIVR SDVMG WYRQAPG KQRELVA FIRSLGSTY YAGSVKG RFTISRDDAAN TVYLQMNNLKPE DTAVYYCNA RFSGESY WGQGT PVTVSS
VEGFBII 08F07/72
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAVSGSTFG LYAMG WFRQAPG REREFLS AITWSAGDT QYADSVKG RFTISRDNARNTV NLQMNGLKPEDTA VYYCAG RQWGGTYYY HGSYAY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 09A09/73
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCVASGIRFM SMA WYRQAPG KHRELVA RISSEGTTA YVDSVKG RFTISRDNSKNTV YLQMNSLKAEDTA VYYCNT FSSRPNP WGAG TTVTVSS
VEGFBII 09A12/74
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS TDDVG WFRQAPG KEREFVA VIRWSTGGT YTSDSVAG RFTLSRDNAKNTM YLQMNSLKPEDTA VYYCAA RSRPLGAGAW YTGETRYDS WGQGT QVTVSS
VEGFBII 09D05/75
EVQLVESGGG LVQPGDSLRL SCAASGLSFS RYGMG WFRQAPG KEREFVI AISEYDNVY TADSVRG RFTISRDNSKSTVY LQMNSLKSEDTAVY YCAA SPTILLSTDE WYKY WGRG TQVTVSS
VEGFBII 09F05/76
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL TDDVG WFRQAPG KEREFVA VIRWSTGGT YTSDSVKG RFTLSRDNAKNTM YLQMNSLKPEDTAV RSRPLGAGA WYTGETRYNY WGQG TQVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
SCAASGRTFS
YYCAA
VEGFBII 10C07/77
EVQLVESGGG LVQAGGSLSL SCAASARAFS NYAMG WFRQVPG REREFVA VITRSPSNT YYTDSVKG RFTISRDNAKNIV YLQMNSLKPEDTA VYYCAA HYWNSDSYTY TDSRWYNY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 10E07/78
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS NYAMG WFRQAPG KERVLVA DISSSGINT YVADAVKG RFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAV YYCAA SAWWYSQ MARDNYRY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 10G04/79
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGDTLS RYAMG WFRQAPG KEREFVA SINTSGKRT SYADSMKG RFAVSRDNAKNTG YLQMNSLKLEDTA TYYCAA DRFFGSD SNEPRAYRY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 10G05/80
EVQLVESGGG LVQAGESLRL SCVASGITFS NYNMG WFRQAPG KEREFVA TIRHHGYDT YYAESVKG RFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDT ALYSCAK KLFWDMDP KTGFSS WGQGT QVTVSS
VEGFBII 11C08/81
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTLS SYGLG WFRQAPG KEREFVA AIGWSGSST YYADSVKG RFTVSVDNAKNT VYLKMNSLEPE DTAVYYCAA KVRNFNSD WDLLTSYNY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 11C11/82
EVQLVESGGG LVQAGGSLML SCAASGRALS SYAIG WFRQAPG REREFVA RISWSGANT YYADSVKG RFTISRGNAKNTVYL QMNSLKPEDTAAY YCAA QTTSKYDNYD ARAYGY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 11D09/83
EEQLVESGGG LVQAGGSLML SCAASGRALS SYAIG WFRQAPG REREFVA RISWSGANT YYADSVKG RFTISRGNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAAYYCAA QTTSKYDNY DARAYGY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 11E04/84
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS SYAMG WFRQAPG KEREFVA TISQSGYST YYADSVKG RFTISRDNAKNTVN LQMNSLKPEDTAVY YCAA DPFYSYGS PSPYRY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 11E05/85
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCASSGRLFS FSAMG WFRQAPG KEREFVA AFKWSGSTT YYADYVKG RFTISTDNAKNILF LQMNSLKPEDTA IYYCAV DRFYTGRYY SSDEYDY WGQGT QVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 11F10/86
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASTSIYS ITVMA WFRQAPG KEREFVA AITWSAPSS YYADSVKG RFTISRDNAKNTVYLQ VNSLKPEDSAIYYCAA DRFKGR SIVTRSDYRY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 11F12/87
EVQLVESGGG LVQSGGSLRL SCAASGRSFS SLAMG WFRQVPG KDREFVA SISQSGITT SYADSVKS RFTISRDSAKNTVYLQ MNLLKPEDTAVYYCAT SVFYSTAL TRPVDYRY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 11G09/88
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASTSIYS ITVMA WFRQAPG KEREFVA AITWSAPTT YSADSVKG RFTISRDNAKNTVYLQ MNSLKPEDSAIYYCAA DRFKGRSIV TRSDYRY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 12A07/89
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCSVTGRTFN KYVMG WFRQAPG NDREFVA AITSRDGPT YYADSVKG RFTISGDNTKNKIFLQ MNSLMPEDTAVYYCAI DEDLYHYSSYH FTRVDLYHY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 12B01/90
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL ACAASGFTLS SSWMY WVRQAPG KGLEWVS RISPGGLFT YYVDSVKG RFSVSTDNANNTLYLQ MNSLKPEDTALYSCAK GGAPNYTP RGRGT QVTVSS
VEGFBII 12C04/91
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGSIVR SDVMG WYRQAPG KQRELVA FIRSLGST YYAGSVKG RFTISRDNAANTVYLQ MNNLKPEDTAVYYCNA RFSGESY WGQGT PVTVSS
VEGFBII 12E10/92
EVQLVESGGG LAQAGGSLRL SCTASGRTFN NYVMG WFRQAPG NEREFVA AITSTNGPT YYADSVKG RFTISGDNTKNKVFL QMDSLRPEDTAVYYCAI DEDLYHYSSYH YTRVALYHY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 12G04/93
EVQLVESGGG LVQSGDSLRL SCAVSGNTFG LYAMG WFRQAPG REREFVS AITWSAGDT QYADSVKG RFTISRDNARNTVNL QMNGLKPEDTAVYYCAG RQWGGTYY YHGSYAW WGQGT QVTVSS
VEGFBII 16C03/94
EVQLVESEGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS TDDVG WFRQAPG KEREFVA VIRWSTGGT YTSDSVKG RFTLSRDNAKNTMYLQ MNSLKPEDTAVYYCAA RSRPLGAGA WYTGENYYNY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 16F11/95
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL GYDMG WFRQAPG KEREFVT AITWSGGST YSPDSVKG RFTISRDNAKNTVYL QMNNLTPEDTAVYYCAS GRIWRSRD DSEKYYDI WGHGT QVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
SCAASGRTSS
VEGFBII 36C08/96
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS AYDMG WFRQAPG KEREFVA VISWTNSMT YYADSVKG RFTISRDNAKNTVY LQMNSLKPEDTAVYYCAV DRRRTYSR WRFYTGVNDYDY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 37F09/97
EVQLVESGGG LVQTGGSLRL SCAASGRTFS AYDMG WFRQAPG KEREFVA VISWSGGMT YYADSVQG RFTISRDNAKSTVYL QMNSPKPEDTAVYYCAV DRRRAYSR WRYYTGVNDYEF WGQGT QVTVSS
VEGFBII 38A06/98
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS AYDMG WFRQAPG KEREFVA VISWSGGMT YYADSVKG RFTISRDNAKNTVYL QMNSLKPEDTAVYYCAV DRRRLYSRW RYYTGVNDYDY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 39H11/99
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS AYDMG WFRQAPG KEREFVA VISWTGGMT YYADSVKG RFTISRDKAKNTVSLQ MNSLKPEDTAVYYCAV DRRRTYSRWR YYTGVNEYEY WGQGTQ VTVSS
VEGFBII 41B06/ 100
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS AYDMG WFRQAPG KEREFVA VISWTGDMT YYADSVKG RFTISRDKAKNTVSLQ MNSLKPEDTAVYYCAA DRRRTYSRWRYY TGVNEYEY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 41C05/ 101
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS VYTMG WFRQAPG KEREFVA TISRTGDRT SYANSVKG RFTISRENAKNTVYLQ MNSLKPEDTAVYSCAA GPIAPSPRPREYYY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 41D11/ 102
EVQLMESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS AYDMG WFRQAPG KEREFVA VISWTGGMT YYADSVKG RFTISRDKAKNTVSLQ MNSLKPEDTAVYYCAV DRRRTYSRWR YYTGVNEYEY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 42F10/ 103
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS AYDMG WFRQAPG KEREFVA VISWSGGMT DYADSVKG RFTISRENAKNTQFLQ MNSLKPEDTAVYYCAV GRRRAYSRWRY YTGVNEYDY WGQG TQVTVSS
VEGFBII 86C11/ 104
EVQLVESGGG LVQAGDSLRL SCTASGRTFN SYAMG WFRQAPG KERESVA HINRSGSST YYADSVKG RFTISRDNAKNTVYL QLNSLKPEDTAVYYCAA GRYYSSDGVP SASFNY WGQGT QVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 86F11/ 105
EVQLVESGGGL VQAGDSLRL SCFTSARTFD TWAMA WFRQAPG KEREFIS AISWSGSMT YYTDSVKG RFIISRDNAQNTLFLQ MNNTAPEDTAVYYCAA KTVDYCSAYEC YARLEYDY WGRGA QVTVSS
VEGFBII 86G08/ 106
EVQLVESGGG LMQTGDSLRL SCAASGLRFT STNMG WFRQGPG KEREFVA AITLSGTT YYAEAVKG RFTISRDNDKNTVALQ MNSLKPEDTAVYYCGA DPSYYSTSRYT KATEYDY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 86G10/ 107
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFN TYTMG WFRQTPG TEREFVA AIRWTVNIT YYADSVKG RFTISRDIVKNTVYLQ MNSLKPEDTAVYYCAA QTSAPRSLIRM SNEYPY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 86G11/ 108
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGLTFS LYTVG WFRQAPG KEREFVA YISRSGSNR YYVDSVKG RFTLSRDNAKNTVD LQMNSLKTEDTAVYYCAA TSRGLSSLAGEYNY WGRG TQVTVSS
VEGFBII 86H09/ 109
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCTASGSAFK SYRMG WFRRTPG KEDEFVA SISWTYGST FYADSVKG RFTMSRDKAKNAG YLQMNSLKPEDTA LYYCAA GAQSDRYNIRSYDY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 87B07/ 110
EVQLVESGGG LVQPGGSLKL SCTASGFTFS TSWMH WVRQAPG KGLEWVS SIPPVGHFA NYAPSVKG RFTISRDNAKNTL FLQMNSLKSEDTAV YYCAK DSAGRT KGQGT QVTVSS
VEGFBII 88A01/ 111
KVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASERTFS NYAMD WFRQAPG KEREFVA AITRSGGGT YYADSVKG RFTISRDNAKNTVY LQMNSLKPEDTAVYY CAA TRSSTIVVGVGGMEY WGKG TLVTVSS
VEGFBII 88A02/ 112
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGFTFG DYDIG WFRQAPG NEREGVS CITTDVGTT YYADSVKG RFTISSDNAKNTVYL QINDLKPEDTAIYYCAV DTQDLGLDIF CRGNGPFDG WGQGT QVTVSS
VEGFBII 88B02/ 113
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCTASGLNLD DYAIG WFRQAPG KEREGVS CISSYDSVT YYADHVKG RFTISRDSAKNTLYL QMNSLSIEDTGVY YCAA EREQLRRRESPHD ELLRLCFYGMRY SGKGT LVTVSS
VEGFBII 88E02/
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL DYAIG WFRQAPG KEREAVS CISSSDTSI DYTNSVKG RFTFSRDNAKNTVY LQMNSLKPEDTAVY AFRCSGYELRGFPT WGQGT QVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
114
SCVASGFRLD YCAA
VEGFBII 88G03/ 115
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGGTFS SLAVG WFRQAPG KEREFVA RITWSGATT YYADAVKD RFTISRDNAKNTMY LQMNSLKPEDTAV YYCAA DRSPNIINVVTAYEYDY WGQG TQVTVSS
VEGFBII 88G05/ 116
EVQLVESGGG LVQPGASLRL SCAASGDGFT LYNMG WFRQAPG KEREFVA AITSSPMST YYADSVKG RFSISINNDKTTGF LQMNVLKPEDTGV YFCAA PEGSFRRQYAD RAMYDY WGQGT QVTVSS
VEGFBII 88G11/ 117
EVQLVESGGG LAQAGGSLRL SCAASGRTFS GSDMG WFRQSPG KEREIVA AIRLSGSIT YYPDSVKG RFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTA VYYCAA RSTYSYYLALADRGG YDY WGQG TQVTVSS
VEGFBII 88H01/ 118
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCVASGFTLG TYAIG WFRQAPG KEREAVS CMSAGDSIP WYTASVKG RFTTSTDNARNTV YLQMNSLKPEDTA HYYCAA ARYHGDYCYYEGY YPF WGQGT QVTVSS
VEGFBII 89B04/ 119
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASTSISS TNFMG WYRQAPG KQRELVA TITSSSITN YVDSVKG RFTISRDNAKNTV YLQMTSLKPEDTAVYYCHA RWRWSDVEY WGKGT LVTVSS
VEGFBII 89B08/ 120
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGTTSS IFAMR WYRQAPG KQRELVA SITRSSITT YADSVKG RFTPSRDNAKNTV SLQMNSLKPEDTAVYYCNA AIRPELYSVVNDY WGQGTQ VTVSS
VEGFBII 89D04/ 121
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCATSGLTFS DYNLG WFRQAPG KERQFVA VISWRDSFA YYAEPVKG RFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTA VYYCAA DRVSSRLVLPNTSP DFGS WGQGTQ VTVSS
VEGFBII 89F09/ 122
EVQLVESGGG LVQAGDSLRL SCAASGRTFN NAIMG WFRQAPG QEREFVA AMNWRGGPT YYADSVKG RFTISGDNTKNTV FLQMNFLKPEDTA VYYCAA DEDLYHYSSYHYS RVDLYHY WGQGTQV TVSS
VEGFBII 89G09/ 123
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGTTSS IFAMR WYRQAPG KQRELVA SITRSSITT YADSVKG RFTLSRDNAKNTV SLQMNSLKPEDTA VYYCNA AIRPELYSVVNDY WGQGTQ VTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 89H08/ 124
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGGSFS SYAPG WFRQAPG KEREFVA AFTRSSNIP YYKDSVKG RFTISRDNAHTVY LQMNSLKPEDTAI YYCAV NLGSTWSRDQRTY DY WGQGTQ VTVSS
Tabla 3: ID de secuencia y secuencias de aminoácidos de VHH anti-VEGF monovalentes bloqueadores del receptor (FR, marco; CDR, región determinante de complementariedad) SEQ ID NO: 9-46
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 22A10/9
EVQLVESGGGLVQPGDSL KLSCAFSGR TFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNT VYLQTPSLKPEDTADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 22A11/10
EVQLVESGG GLVQPGDSLKLSCAFSGR TFS SYSMA WFRQAQGKEREFVV AISSGGFIYDAVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 22B06/11
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 22B07/12
EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGNYKYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLGDTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 22E04/13
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCVASGRTSS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSGGSIYDSVSLQG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYASSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23A03/14
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCVASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSGGYIYDSVSLQG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23A06/15
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSGGFIYDAVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23A08/16
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCVASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISNGGYKYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 23A09/17
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFG SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNSKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLPDTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23B04/18
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEG RFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23D11/19
EVQLVESGGGLVQPGDSLRLSCAFSGRTFS SYSMA WFRQAQGKEREFVV AISSGGFIYDAVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23E05/20
EVQLVESEGGLVQPGDSLKLSCVASGRTSS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSGGYIYDSVSLQG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23F02/21
EMQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23F05/22
EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGNYKYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQINSLKPKDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLGDTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23F11/23
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSGGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 23G03/24
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFG SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNSKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLPGTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 24C04/25
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCVASGRTSS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSGGYIYDSVSLQG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 27D08/26
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSGGYKYDSVSLEG RFTISRDNTQNTVYLQINSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSGRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 27G07/27
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCVASGRTSS SYSMG WFRQAQGQEREFVV AISSGGYIYDSVSLQG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 30C09/28
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCIASGRTSS SYSMG WFRQAQGQEREFVV AISSGGYIYDSVSLQG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 30E07/29
EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGNYKYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLGDTYDY WGQGTRVTVSS
VEGFBII 31C07/30
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCAASGGTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 39E02/31
EVQLVESGGGLVQPGDPLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 39G04/32
EVPLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGNYKYDSASLEG RFTISRDNTKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLGDTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 40F02/33
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMA WFRQAQGKEREFVV AISSGGFIYDAVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEGTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 40G07/34
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNAVYLQTPSLKPEDTADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 40H10/35
EVQLMESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 41B05/36
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSGGFIYDAVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 41G03/37
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMA WFRQAQGKEREFVV AISSGGFIYDAVSLEG RFTISRENTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 42A05/38
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQMPSLKPEDTADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 42D05/39
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 42F11/40
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCVASGRTSS SYSVG WFRQAQGKEREFVV AISSGGYIYDSVSLQG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 56E11/41
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDAADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 60A09/42
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYIYDSVSLEG RFTISRDNTRNTVYLQTPSLKPEDTADYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 61A01/43
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSGGYKYDAVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYASSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 62A09/44
EVQLVESGGDLVQPGDSLKLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGGYI YDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 62D10/45
EVQLVESEGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISSSGNYK YDSVSLEG RFTISRDNTKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLGDTYDY WGQGTQVTVSS
VEGFBII 62F02/46
EVQLVESGGGLVQPGDSLKLSCAFSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AIASGGYIY DAVSLEG RFTISRDNTKDTVYLQTPSLKPEDTAVYYCAA SRAYGSSRLRLADTYDY WGQGTQVTVSS
Las tasas de disociación de VHH inhibidores se analizan en Biacore (instrumento Biacore T100 GE Healthcare). Se usa tampón HBS-EP+ como tampón de ejecución y se realizan experimentos a 25 ºC. Se captura VEGF165 humano recombinante de forma irreversible en una microplaca sensora CM5 mediante acoplamiento de amina (usando EDC y NHS) hasta un nivel diana de +/- 1500 UR. Después de la inmovilización, las superficies se desactivan con inyección de 10 min de etanolamina 1 M pH 8,5. Se activa una superficie de referencia y se desactiva con EDC/NHS 5 y etanolamina respectivamente. Se inyectan extractos periplásmicos de VHH a una dilución 10 veces en tampón de ejecución durante 2 min a 45 l/min y se permite que se disocien durante 10 ó 15 min. Entre diferentes muestras, las superficies se regeneran con tampón de regeneración. Se toman dobles referencias de los datos por resta de las curvas en el canal de referencia y de una inyección de tampón de ejecución en blanco. Las curvas procesadas se evalúan ajustando un modelo de desintegración de dos fases en el software de Evaluación Biacore T100 v2.0.1. Los 10 valores para kd-rápida, kd-lenta y % de rápida se enumeran en la Tabla 4.
Tabla 4: Determinación de tasa de disociación de VHH de bloqueo del receptor anti-VEGF con Biacore
Linaje de linfocitos B
Variante de secuencia única VHH ID representativa kd(rápida) kd(lenta) % de rápida Nivel de unión (UR)
1
1
VEGFBII22B07 1,50E-02 7,80E-05 31 328
1
2 VEGFBII23A08 1,30E-02 5,00E-05 19 502
1
3 VEGFBII23B04 8,80E-03 4,00E-05 12 768
1
4 VEGFBII27D08 2,40E-02 8,10E-05 13 225
1
5 VEGFBII24C04 1,30E-02 3,40E-05 17 456
1
6 VEGFBII27G07 1,30E-02 3,80E-05 18 471
1
7 VEGFBII22E04 1,80E-02 1,10E-04 14 520
1
8 VEGFBII23A03 1,50E-02 3,20E-05 15 487
1
9 VEGFBII22B06 3,80E-02 9,00E-05 23 168
1
10 VEGFBII23A09 2,70E-02 4,60E-05 20 247
1
11 VEGFBII23G03 2,80E-02 8,60E-05 28 141
1
12 VEGFBII22A11 2,20E-02 4,70E-05 12 461
1
13 VEGFBII23A06 1,70E-02 3,70E-05 13 547
1
14 VEGFBII23F11 2,70E-02 1,30E-04 22 134
1
15 VEGFBII22A10 3,70E-02 4,00E-05 19 229
1
16 VEGFBII23F05 1,60E-02 1,30E-04 29 198
Linaje de linfocitos B
Variante de secuencia única VHH ID representativa kd(rápida) kd(lenta) % de rápida Nivel de unión (UR)
1
17 VEGFBII23D11 1,90E-02 5,80E-05 13 510
1
18 VEGFBII23F02 n/d n/d n/d n/d
1
19 VEGFBII23E05 1,50E-02 6,90E-05 18 275
1
20 VEGFBII31C07 3,70E-02 1,50E-04 25 77
1
21 VEGFBII30C09 1,50E-02 7,60E-05 19 264
1
22 VEGFBII30E07 1,70E-02 1,30E-04 29 226
1
23 VEGFBII39G04 1,40E-02 7,40E-04 40 210
1
24 VEGFBII41G03 1,20E-02 2,70E-04 20 332
1
25 VEGFBII41B05 1,90E-02 1,20E-04 16 324
1
26 VEGFBII40F02 1,20E-02 9,80E-05 20 258
1
27 VEGFBII39E02 1,90E-02 2,40E-04 13 181
1
28 VEGFBII42D05 3,30E-02 1,50E-04 26 77
1
29 VEGFBII40G07 1,80E-02 3,20E-04 19 139
1
30 VEGFBII42A05 1,60E-02 3,40E-04 25 118
1
31 VEGFBII42F11 9,10E-03 5,00E-04 46 100
1
32 VEGFBII40H10 1,40E-02 2,90E-04 17 200
1
33 VEGFBII62A09 4,10E-02 1,10E-04 23 84
1
34 VEGFBII60A09 3,70E-02 9,30E-05 20 106
1
35 VEGFBII62F02 1,40E-02 8,50E-05 21 205
1
36 VEGFBII62D10 1,90E-02 1,60E-04 40 94
Linaje de linfocitos B
Variante de secuencia única VHH ID representativa kd(rápida) kd(lenta) % de rápida Nivel de unión (UR)
1
37 VEGFBII61A01 7,40E-03 1,70E-04 21 275
1
38 VEGFBII56E11 3,30E-02 1,40E-04 24 76
n/d, no determinado
Ejemplo 5
Caracterización de VHH anti-VEGF purificados
Se seleccionan tres VHH anti-VEGF inhibidores para caracterización adicional como proteína purificada: VEGFBII23B04, VEGFBII24C4 y VEGFBII23A6. Estos VHH se expresan en E. coli TG1 como c-myc, proteínas 5 marcadas con His6. La expresión se induce por adición de IPTG 1 mM y se permite que continúe durante 4 horas a 37 ºC. Después de centrifugar los cultivos celulares, se preparan extractos periplásmicos por congelación-descongelación de los sedimentos. Estos extractos se usan como material de partida para purificación de VHH mediante IMAC y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Las preparaciones de VHH finales muestran el 95 % de pureza según se evalúa mediante SDS-PAGE. 10
5.1. Evaluación de VHH que bloquean VEGFR2/VEGF165 humano en ELISA de bloqueo de VEGFR2-Fc humano/VEGF165 humano
La capacidad de bloqueo de los VHH se evalúa en un ELISA de bloqueo de VEGFR2-Fc humano/VEGF165 humano. Brevemente, se reviste una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con quimera de VEGFR2-Fc 1 g/ml (R&D Systems Minneapolis, MN, Estados Unidos). Se incuban series de diluciones (intervalo de 15 concentraciones 1 mM - 64 pM) de los VHH purificados en tampón de PBS que contienen caseína 0,1 % y Tween 20 0,05 % (Sigma) en presencia de VEGF165 biotinilado 4 nM. Se detecta unión residual de bio-VEGF165 con VEGFR2 usando extravidina conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos) y TMB como sustrato. Como controles se añaden Bevacizumab (Avastin) y Ranibizumab (Lucentis). Se muestran curvas de inhibición de dosis en la Figura 1; los valores de CI50 correspondientes y % de inhibición se 20 resumen en la Tabla 5.
Tabla 5: Valores de CI50 (nM) y % de inhibición para VHH monovalentes en ELISA de competición de hVEGF165/hVEGFR2-Fc
VHH ID
CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII23B04
2,1 100
VEGFBII23A06
3,0 100
VEGFBII24C04
2,5 100
Ranibizumab
1,6 100
Bevacizumab
1,7 100
5.2. Evaluación de VHH que bloquean VEGFR2/VEGF165 humano en ELISA de bloqueo de VEGFR1-Fc 25 humano/VEGF165 humano
Los VHH también se evalúan en un ELISA de bloqueo de VEGFR1-Fc humano/VEGF165 humano. Brevemente, se reviste una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con quimera de VEGFR1-Fc 2 g/ml (R&D Systems Minneapolis, MN, Estados Unidos). Se incuban series de diluciones (intervalo de concentraciones 1 mM - 64 pM) de los VHH purificados en tampón de PBS que contiene caseína 0,1 % y Tween 20 0,05 % (Sigma) en 30 presencia de VEGF165 biotinilado 0,5 nM. Se detecta la unión residual de bio-VEGF165 con VEGFR1 usando extravidina conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos) y TMB como sustrato. Como controles se añaden Bevacizumab, Ranibizumab y un VHH irrelevante (2E6). Se muestran las curvas de inhibición de dosis en la Figura 2; los valores de CI50 correspondientes y % de inhibición se resumen en la Tabla 6. 35
Tabla 6: Valores de CI50 (nM) y % de inhibición para VHH monovalentes en ELISA de competición de hVEGF165/hVEGFR1-Fc
VHH ID
CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII23B04
0,5 64
VEGFBII23A06
0,9 55
VEGFBII24C04
0,8 71
Ranibizumab
1,2 91
Bevacizumab
1,5 96
5.3. Evaluación de los VHH anti-VEGF165 en el AlphaScreen de bloqueo de VEGFR2-Fc humano/VEGF165 humano 5
La capacidad de bloqueo de los VHH también se evalúa en un AlphaScreen de bloqueo de VEGFR2-Fc humano/VEGF165 humano. Brevemente, se añaden diluciones en serie de VHH purificados (intervalo de concentración: 200 nM – 0,7 pM) en tampón de PBS que contiene Tween 20 0,03 % (Sigma) a bio-VEGF165 4 pM y se incuba durante 15 min. Posteriormente se añaden VEGFR2-Fc (0,4 nM) y perlas aceptoras recubiertas con VHH anti-Fc (20 g/ml) y esta mezcla se incuba durante 1 hora en oscuridad. Finalmente, se añaden perlas donantes de 10 estreptavidina (20 g/ml) y después de una hora de incubación en oscuridad, se mide la fluorescencia en el lector de microplacas Envision. Se muestran curvas de respuesta a dosis en la Figura 3. Los valores de CI50 para VHH que bloquean la interacción VEGF165 humano – VEGFR2-Fc humano se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7: Valores de CI50 (pM) y % de inhibición para VHH en AlphaScreen de competición de hVEGF165/hVEGFR2-Fc 15
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición
VEGFBII23B04
160 100
VEGFBII23A06
250 100
VEGFBII24C04
250 100
Ranibizumab
860 100
5.4. Evaluación de los VHH anti-VEGF165 en el AlphaScreen de bloqueo de VEGFR1-Fc humano/VEGF165 humano
La capacidad de bloqueo de los VHH también se evalúa en un AlphaScreen de bloqueo de VEGFR1-Fc humano/VEGF165 humano. Brevemente, se añaden diluciones en serie de VHH purificados (intervalos de 20 concentración: 500 nM – 1,8 pM) en tampón de PBS que contiene Tween 20 0,03 % (Sigma) a bio-VEGF165 0,4 nM y se incuba durante 15 min. Posteriormente se añaden VEGFR1-Fc (1 nM) y perlas aceptoras recubiertas con VHH anti-Fc (20 g/ml) y esta mezcla se incuba durante 1 hora en oscuridad. Finalmente, se añaden perlas donantes de estreptavidina (20 g/ml) y después de una hora de incubación en oscuridad, se mide la fluorescencia en el lector de microplacas Envision. Se muestran curvas de respuesta a dosis en la Figura 4. Los valores de CI50 y % de inhibición 25 para VHH que bloquean la interacción VEGF165 humano – VEGFR1-Fc humano se resumen en la Tabla 8.
Tabla 8: Valores de CI50 (nM) para VHH en AlphaScreen de competición de hVEGF165/hVEGFR1-Fc
VHH ID
CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII23B04
0,9 41
VEGFBII23A06
0,4 46
VEGFBII24C04
0,2 53
Ranibizumab
3,3 79
5.5. Determinación de la afinidad de la interacción VEGF165 humano – VHH
La cinética de unión de VHH VEGFBII23B04 con hVEGF165 se analiza por SPR en un instrumento Biacore T100. Se inmoviliza VEGF165 humano recombinante directamente en una microplaca CM5 mediante acoplamiento de amina (usando EDC y NHS). Los VHH se analizan a diferentes concentraciones entre 10 y 360 nM. Se inyectan muestras durante 2 min y se permite que se disocien hasta 20 min a un caudal de 45 l/min. Entre inyecciones de 5 muestra, la superficie de la microplaca se regenera con HCl 100 mM. Se usa HBS-EP+ (tampón Hepes pH 7,4 + EDTA) como tampón de ejecución. Las curvas de unión se ajustan usando un modelo de Reacción de Dos Estados mediante el Software de Evaluación Biacore T100 v2.0.1. Las afinidades calculadas de los VHH anti-VEGF se enumeran en la Tabla 9.
Tabla 9: KD de afinidad (nM) de VHH purificados para VEGF165 humano recombinante 10
VEGF165
VHH ID
ka (M-1.s-1) ka1 (M-1.s-1) ka2 (M-1.s-1) kd (s-1) kd1 (s-1) kd2 (s-1) KD (nM)
VEGFBII23B04(a)
- 2,1E+05 1,4E-02 - 8,6E-03 2,4E-04 0,7
VEGFBII23A06(a)
- 4,2E+05 2,0E-02 - 5,7E-02 1,0E-04 0,7
VEGFBII24C04(a)
- 3,2E+05 1,8E-02 - 2,6E-02 9,6E-05 0,4
(a) Curva de unión heterogénea que no da como resultado ajuste 1:1; las curvas se ajustan usando un modelo de Reacción de Dos Estados mediante Software de Evaluación Biacore T100 v2.0.1.
5.6. Unión a VEGF164 de ratón
La reactividad cruzada con VEGF164 de ratón se determina usando un ELISA de unión. Brevemente, se reviste una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con VEGF164 de ratón recombinante (R&D Systems 15 Minneapolis, MS, Estados Unidos) durante una noche a 4 ºC a 1 g/ml. Los pocillos se bloquean con una solución de caseína (1 % en PBS). Se aplican VHH como serie de diluciones (intervalo de concentración: 500 mM - 32 pM) en tampón de PBS que contiene caseína al 0,1 % y Tween 20 0,05 % (Sigma) y la unión se detecta usando un anti-myc de ratón (Roche) y un conjugado de HRP anti-ratón (DAKO) y una reacción enzimática posterior en presencia del sustrato TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina) (Pierce, Rockord, IL, Estados Unidos) (Figura 5). Se incluye un mAb 20 sensible a VEGF164 de ratón como un control positivo. Como referencia, también se mide la unión a VEGF165 humano. Los valores de CE50 se resumen en la Tabla 10.
Tabla 10: Valores de CE50 (pM) para VHH en un ELISA de unión de VEGF165 humano recombinante y VEGF164 de ratón
rhVEGF165 rmVEGF164
VHH ID
CE50 (pM) CE50 (pM)
VEGFBII23B04
297 NB
VEGFBII24C04
453 NB
VEGFBII23A06
531 NB
NB, sin unión 25
5.7. Unión con VEGF121
La unión con VEGF121 humano recombinante se evalúa mediante un ELISA de unión de fase sólida. Brevemente, se reviste una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con VEGF121 humano recombinante (R&D Systems Minneapolis, MS, Estados Unidos) durante una noche a 4 ºC a 1 g/ml. Los pocillos se bloquean con una solución de caseína (1 % en PBS). Los VHH se aplican como serie de dilución (intervalo de concentración: 500 30 mM - 32 pM) en tampón de PBS que contiene caseína 0,1 % y Tween 20 0,05 % (Sigma) y la unión se detecta usando un anti-myc de ratón (Roche) y un conjugado de HRP anti-ratón (DAKO) y una reacción enzimática posterior en presencia del sustrato TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina) (Pierce, Rockord, IL, Estados Unidos) (Figura 6). Como control positivo se añaden diluciones en serie del VEGFR2. Los valores de CE50 se resumen en la Tabla 11.
35
Tabla 11: Valores de CE50 (pM) para VHH monovalentes en un ELISA de unión de VEGF121 humano recombinante
VHH ID
CE50 (pM)
VEGFBII23B04
510
VEGFBII24C04
792
VEGFBII23A06
928
5.8. Unión con miembros de la familia VEGF VEGFB, VEGFC, VEGFD y PlGF
La unión a VEGFB, VEGFC, VEGFD y PlGF se evalúa mediante un ELISA de unión de fase sólida. Brevemente, se reviste una placa MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con VEGFB, VEGFC, VEGFD y PlGF (R&D 5 Systems, Minneapolis, MS, Estados Unidos) durante una noche a 4 ºC a 1 g/ml. Los pocillos se bloquean con una solución de caseína (1 % en PBS). Se aplican VHH como serie de diluciones (intervalo de concentración 500 mM - 32 pM) y la unión se detecta usando un anti-myc de ratón (Roche) y un conjugado de AP anti-ratón (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos). Como controles positivos se toman diluciones en serie de los receptores apropiados y se detectan con anticuerpo específico de Fc anti-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano 10 rusticano (HPR) (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, Estados Unidos) y una reacción enzimática posterior en presencia del sustrato TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina) (Pierce, Rockord, IL, Estados Unidos). Las curvas de respuesta a dosis de VHH y controles se muestran en la Figura 7. Los resultados muestran que no hubo unión detectable de los VHH seleccionados con VEGFB, VEGFC, VEGFD o PlGF
5.9. Clasificación de epítopos 15
Se realizan experimentos de clasificación de epítopos basados en Biacore para investigar qué agentes de unión de VEGF se unen a un epítopo similar o solapante como VEGFBII23B04. Para este fin, simboliza VEGFBII23B04 en una microplaca sensora CM5. Para cada muestra, se pasa VEGF165 humano sobre la superficie de la microplaca y se captura de forma reversible por VEGFBII23B4. Se inyectan después VHH purificados (100 nM) o extractos periplásmicos (diluidos 1/10) con un tiempo de contacto de superficie de 240 segundos y un caudal de 10 l/minuto. 20 Entre diferentes muestras, la superficie se regenera con tampón de regeneración (HCl 100 mM). Las curvas procesadas se evalúan con software de Evaluación Biacore T100. Los VHH podrían dividirse dentro de dos grupos: el grupo uno que proporciona unión adicional a VEGF165 capturado en VEGFBII23B04 y un segundo grupo que no es capaz de unirse simultáneamente a VEGF165 capturado en VEGFBII23B04. La Tabla 12-A resume los epítopos de unión de los VHH ensayados. 25
La misma preparación de ensayos se usa para evaluar si VEGFR1, VEGFR2, Ranibizumab y Bevacizumab son capaces de unirse a VEGF-165 humano simultáneamente con VEGFBII23B04. La Tabla 12-B presenta las respuestas de unión adicionales a VEGF165 capturado en VEGFBII23B04. Sólo VEGFR2 no es capaz de unirse a VEGF165 capturado en VEGFBII23B04, lo que subraya la capacidad de bloqueo de VEGFBII23B04 para la interacción VEGF-VEGFR2. Además, estos datos muestran que el epítopo de VEGFBII23B04 es diferente del 30 epítopo de Bevacizumab y Ranibizumab.
Tabla 12-A: Clasificación de epítopos de VHH anti-VEGF, unión simultánea con VEGFBII23B04
Unión adicional baja o nula con VEGF165* capturado en 23B04
1C02 86G10 88H01 1E07 86G11 89B04 4B08 87B07 89D04 8E07 88A01 89F09 8F07 88A02 89G09 12A07 88B02 89H08 12B01 88E02 24C04 86C11 88G03 23A6 86F11 88G05 27G07 86G08 88G11 23B04
Unión adicional a VEGF165 capturado en 23B04
3D12 10G04 5B02 10G05 5B03 11C08 5B05 11D09 6G02 11E04 7D08 11E05 8D09 11F12 8F06 86H09 10C07 41C05 10E07
* indica epítopos iguales o solapantes
Tabla 12-B: Clasificación de epítopos de VEGFBII23B04: unión de inhibidores de punto de referencia o receptores afines en VEGF165 capturado en VEGFBII23B04 35
Etapa de inyección
Unión [muestra] Nivel de unión (UR)
1
VEGF165 100 nM 1727
Etapa de inyección
Unión [muestra] Nivel de unión (UR)
2
VEGFBII23B04 100 nM -
3
Ranibizumab 100 nM 763
4
Bevacizumab 100 nM 1349
5
VEGFR1 100 nM 1011
6
VEGFR2 100 nM -
5.10 Caracterización de los VHH anti-VEGF en el ensayo de proliferación de HUVEC
La potencia de los VHH seleccionados se evalúa en un ensayo de proliferación. Brevemente, a las células HUVEC primarias (Technoclone) se les priva del complemento durante una noche y después se siembran 4000 células/pocillo por cuadruplicado en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Las células se estimulan en ausencia o 5 presencia de VHH con VEGF 33 ng/ml. Las tasas de proliferación se miden por incorporación de [3H] Timidina el día 4. Los resultados del ensayo de proliferación de HUVEC se muestran en la Tabla.
Tabla 13: Valores de CI50 (nM) y % de inhibición de VEGFBII23B04, VEGFBII23A06 y VEGFBII24C04 monovalentes en ensayos de proliferación de HUVEC VEGF.
VHH ID
CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII23B04
0,36 91
Bevacizumab
0,21 92
10
VHH ID
CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII23A06
4,29 73
VEGFBII24C04
3,8 79
Bevacizumab
0,78 78
5.11 Caracterización de los VHH anti-VEGF en el ensayo de fosforilación de Erk de HUVEC
La potencia de los VHH seleccionados se evalúa en el ensayo de fosforilación de Erk de HUVEC. Brevemente, se les priva de suero a células HUVEC primarias durante una noche y después se estimulan en ausencia o presencia de VHH con VEGF 10 ng/ml durante 5 minutos. Las células se fijan con formaldehído 4 % en PBS y los niveles de 15 fosforilación de ERK se miden por ELISA usando anticuerpos específicos de fosfoERK (anti-fosfoMAP Quinasa pERK1&2, M8159, Sigma) y conjugado de HRP-Inmunoglobulina Anti-Ratón de Conejo policlonal (PO161, Dako). Como se muestra en la Tabla 14, VEGFBII23B04 y Bevacizumab inhiben la fosforilación de Erk inducida por VEGF en al menos 90 %, con CI50 <1 nM.
Tabla 14: Valores de CI50 (nM) y % de inhibición de VEGFBII23B04 monovalente en ensayo de fosforilación de Erk 20 de HUVEC VEGF
VHH ID
CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII23B04
0,37 90
Bevacizumab
0,63 98
Ejemplo 6
Generación de VHH de bloqueo anti-VEGF multivalentes
El VHH VEGFBII23B04 se fusiona genéticamente con uno de los VEGFBII23B04 dando como resultado un VHH 25 homodimérico (secuencia de aminoácidos véase Tabla 15) o diferentes VHH de unión a VEGF dando como
resultado VHH heterodiméricos. Para generar los VHH heterodiméricos se enlaza un panel de 10 VHH de unión a VEGF únicos mediante un enlazador flexible de 9 ó 40 Gly-Ser en dos orientaciones diferentes con VEGFBII23B04 (secuencias de aminoácidos véase Tabla 15). VEGFBII23B04 homodiméricos (VEGFBII010) y los 40 VHH bivalentes heterodiméricos se expresan en E. coli TG1 como proteínas marcadas con His6, c-myc. La expresión se induce por adición de IPTG 1 mM y se permite que continúe durante 4 horas a 37 ºC. Después de centrifugar los cultivos 5 celulares, se preparan extractos periplásmicos por congelación-descongelación de los sedimentos. Estos extractos se usan como material de partida y los VHH se purifican mediante IMAC y desalación dando como resultado el 90 % de pureza según se evalúa median SDS-PAGE.
Tabla 15: ID de secuencia, VHH ID y secuencia de aminoácidos de VHH anti-VEGF bivalentes (cada uno de los enlazadores usados se resalta en una secuencia relevante)
ID de secuencia/SEQ ID NO:
VHH ID Secuencia de aminoácidos
VEGFBII23B04-35GS-23B04/128
VEGFBII010 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSG RTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDT AVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS-4B08/129
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSAVGDITVAWYRQAPGIQRQLVATITPSGY TYYWDFVKGRFTISRDNSKNIVYLQMNSLKPEDTAAYYCNTQFYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS-5B03/130
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLAQAGDSLRLSCAASGRSFSHYNMGWFRQAPGKEREFVASIRGG GGSTTYANSVKDRFTISRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATAFYRGPYDYDYWGQGTQV TVSS
VEGFBII23B04-9GS-5B05/131
VEGFBII022 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTT AYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS-6G02/132
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIFSNNAMAWYRQAPGKQRELVARISSGG GFTYYLDSVKGRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAAYRTYNYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS-10E07/133
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKERVLVADISSSG INTYVADAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASAWWYSQMARDNYRYWGQGT QVTVSS
VEGFBII23B04-9GS-12B01/134
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTLSSSWMYWVRQAPGKGLEWVSRISPG GLFTYYVDSVKGRFSVSTDNANNTLYLQMNSLKPEDTALYSCAKGGAPNYTPRGRGTQVTVSS
ID de secuencia/SEQ ID NO:
VHH ID Secuencia de aminoácidos
VEGFBII23B04-9GS-86C11/135
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTASGRTFNSYAMGWFRQAPGKERESVAHINRSG SSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAAGRYYSSDGVPSASFNYWGQGT QVTVSS
VEGFBII23B04-9GS-86H09/136
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSAFKSYRMGWFRRTPGKEDEFVASISWTYGSTFYADSVKGRFTMSRDKAKNAGYLQMNSLKPEDTALYYCAAGAQSDRYNIRSYDYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS-87B07/137
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFTFSTSWMHWVRQAPGKGLEWVSSIPPVG HFANYAPSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAVYYCAKDSAGRTKGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS-88A01/138
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFSNYAMDWFRQAPGKEREFVAAITRSG GGTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATRSSTIVVGVGGMEYWGKGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS-4B08/139
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGSAVGDITVAWYRQAPGIQRQLVATITPSGYTYYWDFVKGRFTISRDNSKNIVYLQMNSLK PEDTAAYYCNTQFYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS-5B03/140
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLAQAGDSLRLS CAASGRSFSHYNMGWFRQAPGKEREFVASIRGGGGSTTYANSVKDRFTISRENAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAATAFYRGPYDYDYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS-5B05/141
VEGFBII021 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKA EDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSS
ID de secuencia/SEQ ID NO:
VHH ID Secuencia de aminoácidos
VEGFBII23B04-40GS-6G02/142
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGNIFSNNAMAWYRQAPGKQRELVARISSGGGFTYYLDSVKGRFTVSRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCNAAYRTYNYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS-10E07/143
VEGFBII023 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLS CAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKERVLVADISSSGINTYVADAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNS LKPEDTAVYYCAASAWWYSQMARDNYRYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS-12B01/144
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLA CAASGFTLSSSWMYWVRQAPGKGLEWVSRISPGGLFTYYVDSVKGRFSVSTDNANNTLYLQMN SLKPEDTALYSCAKGGAPNYTPRGRGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS-86C11/145
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGDSLRLS CTASGRTFNSYAMGWFRQAPGKERESVAHINRSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQLNS LKPEDTAVYYCAAGRYYSSDGVPSASFNYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS-86H09/146
VEGFBII024 EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLS CTASGSAFKSYRMGWFRRTPGKEDEFVASISWTYGSTFYADSVKGRFTMSRDKAKNAGYLQMN SLKPEDTALYYCAAGAQSDRYNIRSYDYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS-87B07/147
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLS CTASGFTFSTSWMHWVRQAPGKGLEWVSSIPPVGHFANYAPSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMN SLKSEDTAVYYCAKDSAGRTKGQGTQVTVSS
ID de secuencia/SEQ ID NO:
VHH ID Secuencia de aminoácidos
VEGFBII23B04-40GS-88A01/148
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLS CAASERTFSNYAMDWFRQAPGKEREFVAAITRSGGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNS LKPEDTAVYYCAATRSSTIVVGVGGMEYWGKGTQVTVSS
VEGFBII4B08-9GS-23B04/149
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSAVGDITVAWYRQAPGIQRQLVATITPSGYTYYWDFV KGRFTISRDNSKNIVYLQMNSLKPEDTAAYYCNTQFYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLV ESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII5B03-9GS-23B04/150
EVQLVESGGGLAQAGDSLRLSCAASGRSFSHYNMGWFRQAPGKEREFVASIRGGGGSTTYAN SVKDRFTISRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATAFYRGPYDYDYWGQGTQVTVSSGGGG SGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKY DSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII5B05-9GS-23B04/151
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTTAYVDSVKG RFTISRDNSKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQL VESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII6G02-9GS-23B04/152
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIFSNNAMAWYRQAPGKQRELVARISSGGGFTYYLDS VKGRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAAYRTYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII10E07-9GS-23B04/153
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKERVLVADISSSGINTYVADAV KGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASAWWYSQMARDNYRYWGQGTQVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII12B01-9GS-23B04/154
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTLSSSWMYWVRQAPGKGLEWVSRISPGGLFTYYVDS VKGRFSVSTDNANNTLYLQMNSLKPEDTALYSCAKGGAPNYTPRGRGTQVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII86C11-9GS-23B04/155
EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTASGRTFNSYAMGWFRQAPGKERESVAHINRSGSSTYYADSV KGRFTISRDNAKNTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAAGRYYSSDGVPSASFNYWGQGTQVTVSSGGGG SGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYD SVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
ID de secuencia/SEQ ID NO:
VHH ID Secuencia de aminoácidos
VEGFBII86H09-9GS-23B04/156
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSAFKSYRMGWFRRTPGKEDEFVASISWTYGSTFYADSVK GRFTMSRDKAKNAGYLQMNSLKPEDTALYYCAAGAQSDRYNIRSYDYWGQGTQVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII87B07-9GS-23B04/157
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFTFSTSWMHWVRQAPGKGLEWVSSIPPVGHFANYAP SVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAVYYCAKDSAGRTKGQGTQVTVSSGGGGSGGGS EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSL EGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII88A01-9GS-23B04/158
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFSNYAMDWFRQAPGKEREFVAAITRSGGGTYYAD SVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATRSSTIVVGVGGMEYWGKGTQVTVSSG GGGSGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISK GGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQ GTQVTVSS
VEGFBII4B08-40GS-23B04/159
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSAVGDITVAWYRQAPGIQRQLVATITPSGYTYYWDFVK GRFTISRDNSKNIVYLQMNSLKPEDTAAYYCNTQFYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMG WFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRA YGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII5B03-40GS-23B04/160
EVQLVESGGGLAQAGDSLRLSCAASGRSFSHYNMGWFRQAPGKEREFVASIRGGGGSTTYANS VKDRFTISRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATAFYRGPYDYDYWGQGTQVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGR TFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVY YCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII5B05-40GS-23B04/161
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTTAYVDSVKGR FTISRDNSKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMG WFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAY GSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII6G02-40GS-23B04/162
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIFSNNAMAWYRQAPGKQRELVARISSGGGFTYYLDSVK GRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAAYRTYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSM GWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRA YGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
ID de secuencia/SEQ ID NO:
VHH ID Secuencia de aminoácidos
VEGFBII10E07-40GS-23B04/163
VEGFBII025 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKERVLVADISSSGINTYVADAVK GRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASAWWYSQMARDNYRYWGQGTQVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVS GRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTA VYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII12B01-40GS-23B04/164
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTLSSSWMYWVRQAPGKGLEWVSRISPGGLFTYYVDS VKGRFSVSTDNANNTLYLQMNSLKPEDTALYSCAKGGAPNYTPRGRGTQVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFS SYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYC ASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII86C11-40GS-23B04/165
EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTASGRTFNSYAMGWFRQAPGKERESVAHINRSGSSTYYADSV KGRFTISRDNAKNTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAAGRYYSSDGVPSASFNYWGQGTQVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCE VSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPE DTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII86H09-40GS-23B04/166
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSAFKSYRMGWFRRTPGKEDEFVASISWTYGSTFYADSVK GRFTMSRDKAKNAGYLQMNSLKPEDTALYYCAAGAQSDRYNIRSYDYWGQGTQVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGR TFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVY YCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII87B07-40GS-23B04/167
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFTFSTSWMHWVRQAPGKGLEWVSSIPPVGHFANYAPSVK GRFTISRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAVYYCAKDSAGRTKGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGW FRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGS SRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII88A01-40GS-23B04/168
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFSNYAMDWFRQAPGKEREFVAAITRSGGGTYYADSVKG RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATRSSTIVVGVGGMEYWGKGTQVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSS YSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASS RAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
El panel de 40 VHH bivalentes se ensaya en el ensayo AlphaScreen que bloquea VEGFR2 y VEGFR1, como se describe en el Ejemplo 5.3 y 5.4, respectivamente. Basándose en la potencia y nivel máximo de inhibición, los 5 mejores VHH bivalentes (VEGFBII021, VEGFBII022, VEGFBI023, VEGFBI024 y VEGFBII025) se seleccionan para caracterización adicional. Se muestra una visión de conjunto de los resultados de la exploración para los 5 VHH bivalentes seleccionados en el AlphaScreen de VEGFR2 y VEGFR1 competitivo en la Tabla 16. 5
Tabla 16: Potencia y eficacia de los 5 mejores VHH bivalentes en el ensayo AlphaScreen de competición de VEGF/VEGFR1 y VEGF/VEGFR2
VHH ID
VEGFR2 VEGFR1
CI50 (pM) CI50 (pM) % de inhibición
VEGFBII021
9 16 100
VEGFBII022
7 8 100
VEGFBII023
38 44 91
VEGFBII024
12 46 100
VEGFBII025
51 39 82
Ejemplo 7
Caracterización de VHH anti-VEGF formateados 10
Se comparan los VHH VEGFBII010, VEGFBII021, VEGFBII022, VEGFBII023, VEGFBII024 y VEGFBII025 en paralelo en el ELISA de bloqueo de VEGFR2 y VEGFR1 (Figura 8 y 9, Tabla 17 y Tabla 18 respectivamente) y ensayo AlphaScreen (Figura 10 y 11, Tabla 19 y 20) como se ha descrito en los Ejemplos 5.1, 5.2, 5.3 y 5.4, respectivamente.
Tabla 17: Valores de CI50 (pM) y % de inhibición para VHH formateado en ELISA de competición de 15 hVEGF165/hVEGFR2-Fc
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición
VEGFBII010
49 100
VEGFBII021
204 100
VEGFBII022
164 100
VEGFBII023
213 100
VEGFBII024
292 100
VEGFBII025
577 100
Bevacizumab
315 100
Ranibizumab
349 100
Tabla 18: Valores de CI50 (pM) y % de inhibición para VHH formateado en ELISA de competición de VEGF165/hVEGFR1-Fc
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición
VEGFBII010
73,5 67
VEGFBII021
254 97
VEGFBII022
225 89
VEGFBII023
279 91
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición
VEGFBII024
326 92
VEGFBII025
735 91
Bevacizumab
484 91
Ranibizumab
594 96
Tabla 19: Valores de CI50 (pM) y % de inhibición para VHH formateado en AlphaScreen de competición de hVEGF165/hVEGFR2-Fc
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición
VEGFBII010
16 100
VEGFBII021
7 100
VEGFBII022
7 100
VEGFBII023
46 100
VEGFBII024
50 100
VEGFBII025
51 100
Ranibizumab
600 100
Tabla 20: Valores de CI50 (pM) y % de inhibición de VHH formateado en AlphaScreen de competición de 5 VEGF165/hVEGFR1-Fc
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición
VEGFBII010
21 70
VEGFBII021
12 100
VEGFBII022
9 98
VEGFBII023
48 87
VEGFBII024
69 98
VEGFBII025
71 82
Ranibizumab
1300 87
Además, los VHH formateados también se ensayaron con respecto a su capacidad para bloquear la interacción de mVEGF164/mVEGFR2-huFc. Brevemente, se añaden diluciones en serie de VHH purificados (intervalo de concentración: 4 M – 14,5 pM) en tampón PBS que contiene Tween 20 0,03 % (Sigma) a mVEGF164 biotinilado 10 0,1 nM y se incuban durante 15 min. Posteriormente se añaden VEGFR2-huFc de ratón (0,1 nM) y perlas aceptoras revestidas con VHH anti-huFc (20 g/ml) y esta mezcla se incuba durante 1 hora. Finalmente, se añaden perlas donantes de estreptavidina (20 g/ml) y después de 1 hora de incubación se mide la fluorescencia en el lector de microplacas Envision. Se muestran curvas de respuesta a dosis en la Figura 12. Los valores de CI50 para VHH que bloquean la interacción de VEGF164/VEGFR2-hFC de ratón se resumen en la Tabla 21. 15
Tabla 21: Valores de CI50 (pM) y % de inhibición para VHH formateado en AlphaScreen de competición de mVEGF164/mVEGFR2-hFc
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición
VEGFBII022
108 100
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición
VEGFBII024
- -
mVEGF164
0,05 100
Ranibizumab
- -
Los VHH formateados también se ensayan en ELISA con respecto a su capacidad para unirse a mVEGF164 y VEGF165 humano (Ejemplo 5.6; Figura 13; Tabla 22); VEGF121 (Ejemplo 5.7; Figura 15; Tabla 23) y los miembros de la familia de VEGF VEGFB, VEGFC, VEGFD y PlGF (Ejemplo 5.8; Figura 14). La cinética de unión con respecto a VEGF165 humano se analiza como se ha descrito en el Ejemplo 5.5. Los valores de KD se enumeran en la Tabla 24. 5
Tabla 22: Valores de CE50 (pM) para VHH formateado en ELISA de unión de VEGF165 humano recombinante y VEGF164 de ratón
rhVEGF165 rmVEGF164
VHH ID
CE50 (pM) CE50 (pM)
VEGFBII010
428 -
VEGFBII021
334 502
VEGFBII022
224 464
VEGFBII023
221 -
VEGFBII024
320 -
VEGFBII025
668 -
Tabla 23: Valores de CE50 (pM) para VHH formateado en un ELISA de unión de VEGF121 humano recombinante
rhVEGF121
VHH ID
CE50 (pM)
VEGFBII010
920
VEGFBII022
540
VEGFBII024
325
VEGFBII025
475
10
Tabla 24: KD de afinidad (nM) de VHH formateado purificados para VEGF165 humano recombinante
VHH ID
ka1 (1/Ms) kd1 (1/s) ka2 (1/s) kd2 (1/s) KD (nM)(a)
VEGFBII010(b)
4,5E+05 1,7E-02 2,9E-02 1,3E-04 0,16
VEGFBII021(b)
1,2E+06 1,1E-02 2,3E-02 1,9E-04 0,07
VEGFBII022(b)
1,2E+06 9,1E-03 1,4E-02 2,6E-04 0,14
VEGFBII023(b)
3,0E+05 1,8E-02 2,4E-02 2,7E-04 0,69
VEGFBII024(b)
3,0E+05 1,3E-02 2,6E-02 2,8E-04 0,47
VEGFBII025(b)
3,3E+05 1,7E-02 1,8E-02 3,7E-04 1,1
(a) KD = kd1/ka1*(kd2/(kd2+ka2))
(b) Se ajustan las curvas usando un modelo de Reacción de Dos Estados mediante Software de Evaluación de
Biacore T100 v2.0.1.
Los VHH VEGFBII010, VEGFBII022, VEGFBII024 y VEGFBII025 también se ensayan en el ensayo de proliferación de fosforilación de Erk y HUVEC mediada por VEGF.
La potencia de los VHH formateados seleccionados se evalúa en un ensayo de proliferación. Brevemente, se les priva a células HUVEC primarias (Technoclone) de complemento durante una noche y después se siembran a 4000 5 células/pocillo por cuadruplicado en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Las células se estimulan en ausencia o presencia de VHH con VEGF 33 ng/ml. Las tasas de proliferación se miden por incorporación de [3H] Timidina el día 4. Los resultados mostrados en la Tabla 25 demuestran que los VHH formateados y Bevacizumab inhiben la proliferación de HUVEC inducida por VEGF en más de 90 % con CI50 < 1nM.
Tabla 25: Valores de CI50 (nM) y % de inhibición de VHH formateado en ensayo de proliferación de HUVEC de 10 VEGF
VHH ID
CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII010
0,22 95
VEGFBII021
0,40 98
VEGFBII022
0,34 100
VEGFBII023
0,52 98
VEGFBII024
0,38 96
VEGFBII025
0,41 104
Bevacizumab
0.21 92
La potencia de los VHH formateados seleccionados se evalúa en el ensayo de fosforilación de Erk de HUVEC. Brevemente, a las células HUVEC primarias se les priva de suero durante una noche y después se estimulan en ausencia o presencia de VHH con VEGF 10 ng/ml durante 5 minutos. Las células se fijan con Formaldehído 4 % en PBS y los niveles de fosforilación de ERK se miden por ELISA usando anticuerpos específicos 15 de fosfoERK (pERK1&2 anti-fosfoMAP quinasa, M8159, Sigma) y conjugado de HRP-Inmunoglobulina Anti-Ratón de Conejo policlonal (PO161, Dako). Como se muestra en la Tabla 26, los VHH formateados y Bevacizumab inhiben la fosforilación de Erk inducida por VEGF en más del 90 %, con CI50 <1 nM.
Tabla 26: Valores de CI50 (nM) y % de inhibición de VHH formateado en ensayo de fosforilación de Erk de HUVEC de VEGF 20
VHH ID
CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII010
0,19 92
VEGFBII021
0,21 103
VEGFBII022
0,18 94
VEGFBII023
0,25 100
VEGFBII024
0,23 94
VEGFBII025
0,23 99
Bevacizumab
0,63 98
Ejemplo 8
Optimización de secuencias
8.1. Optimización de secuencia de VEGFBII23B04
La secuencia de aminoácidos de VEGFBII23B04 se alinea con la secuencia de línea germinal humana VH3-23/JH5, 25 véase Figura 16 (SEQ ID NO: 179).
El alineamiento muestra que VEGFBII23B04 contiene 19 mutaciones marco en relación con la secuencia de línea
germinal de referencia. Los restos no humanos en las posiciones 14, 16, 23, 24, 41, 71, 82, 83 y 108 se seleccionan para sustitución con sus homólogos de línea germinal humana. Se genera un conjunto de 8 variantes de VEGFBII23B04 que portan diferentes combinaciones de restos humanos en estas posiciones (las secuencias de aminoácidos se enumeran en la Tabla 27). Se construye una variante adicional en la que el sitio de isomerización potencial en la posición D59S60 (región CDR2, véase Figura 16, indicada como restos en negrita y cursiva) se retira 5 por introducción de una mutación S60A.
Tabla 27: Secuencia de aminoácidos de variantes con secuencia optimizada de VHH VEGFBII23B04 (FR, marco; CDR, región determinante de complementariedad)
VHH ID/ SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII 111D05/47
EVQLVESGGGLVQTGGSLRLSCEASGRTFS SYSMG WFRQAPGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEG RFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
VEGFBII 111G06/48
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAPGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEG RFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
VEGFBII 112D11/49
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGRTFS SYSMG WFRQAPGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEG RFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
VEGFBII 113A08/50
EVQLVESGGGLVQTGGSLRLSCEVSGRTFS SYSMG WFRQAPGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEG RFTISKDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
VEGFBII 113E03/51
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEG RFTISKDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
VEGFBII 114C09/52
EVQLVESGGGLVQPGDSLRLSCEVSGRTFS SYSMG WFRQAPGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEG RFTISKDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
VEGFBII 114D02/53
EVQLVESGGGLVQTGGSLRLSCEVSGRTFS SYSMG WFRQAPGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEG RFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
VEGFBII 114D03/54
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCAVSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEG RFTISKDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
VEGFBII 118E10/55
EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFS SYSMG WFRQAQGKEREFVV AISKGGYKYDAVSLEG RFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTQVTVSS
Estas variantes se caracterizan como proteínas purificadas en el AlphaScreen de VEGF165/VEGFR2 (Ejemplo 5.3, Figura 17). La temperatura de fusión (Tm) de cada clon se determina en un ensayo de desplazamiento térmico, que se basa en el aumento de la señal de fluorescencia tras la incorporación de Naranja Sypro (Invitrogen) (Ericsson et al, Anal. Biochem. 357 (2006), pp 289-298). Todas las variantes presentaron CI50 comparables en comparación con VEGFBII23B04 y valores de Tm que son similares o más altos cuando se comparan con el VEGFBII23B04 precursor. 5 La Tabla 28 resume los valores de CI50 y los valores de Tm a pH 7 para los 9 clones ensayados.
Tabla 28: Valores de CI50 (pM), % de inhibición y temperatura de fusión (a pH 7) de variantes con secuencia optimizada de VEGFBII23B04
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición Tm a pH 7 (°C)
VEGFBII23B04 (wt)
169 100 63
VEGFBII111D05
209 100 68
VEGFBII111G06
366 100 71
VEGFBII112D11
221 100 70
VEGFBII113A08
253 100 69
VEGFBII113E03
290 100 68
VEGFBII114C09
215 100 71
VEGFBII114D02
199 100 74
VEGFBII114D03
227 100 64
VEGFBII118E10
189 100 62
En un segundo ciclo, se combinan mutaciones toleradas del esfuerzo de humanización (VEGFBII111G06) y 10 mutaciones para evitar posible modificación postraduccional en sitios seleccionados (la D16G, la sustitución S60A y una mutación E1D) dando como resultado un clon con secuencia optimizada derivado de VEGFBII23B04: VEGFBII0037. Se anticipa una variante con secuencia optimizada extra (VEGFBII038) que contiene las mismas sustituciones que VEGFII0037, con la excepción de la mutación I82M, puesto que esta mutación puede estar asociada con una reducción menor de la potencia. Las secuencias de ambos clones con secuencia optimiza se 15 enumeran en la Tabla 29. VEGFBII0037 y VEGFBII0038 se caracterizan en el AlphaScreen de bloqueo de VEGF165/VEGFR2 (Ejemplo 5.3, Figura 18), la temperatura de fusión se determina en el ensayo de desplazamiento térmico como se ha descrito anteriormente y la afinidad de unión en VEGF165 se determina en Biacore (Ejemplo 5.5). Una visión de conjunto de las características de los 2 VHH con secuencia optimizada se presenta en la Tabla 30. 20
Tabla 29: Secuencias de aminoácidos de las variantes con secuencia optimizada de VHH VEGFBII23B04
VHH ID/SEQ ID NO:
FR 1 CDR 1 FR2 CDR 2 FR3 CDR 3 FR 4
VEGFBII037 56
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAPGKEREFVV AISKGGYKYDAVSLEG RFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
VEGFBII038 57
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFS SYSMG WFRQAPGKEREFVV AISKGGYKYDAVSLEG RFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCAS SRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTLVTVSS
Tabla 30: Valores de CI50 (pM), % de inhibición, temperatura de fusión (a pH 7) y afinidad (pM) de los clones con secuencia optimizada VEGFBII037 y VEGFBII038
VHH ID
CI50 (pM) % de inhibición Tm a pH 7 (°C) KD (pM)
VEGFBII23B04
152 100 63 560
VEGFBII037
300 100 72 270
VEGFBII038
143 100 71 360
8.2. Optimización de secuencia de VEGFBII5B05
La secuencia de aminoácidos de VEGFBII5B05 se alinea con la secuencia de línea germinal VH3-23/JH5, véase 5 Figura 19 (SEQ ID NO: 179). El alineamiento muestra que VEGFBII5B05 contiene 15 mutaciones marco en relación con la secuencia de línea germinal de referencia. Se seleccionan restos no humanos en las posiciones 23, 60, 83, 105, 108 para sustitución con sus homólogos de línea germinal humana mientras que la histidina en la posición 44 se selecciona para sustitución por glutamina. Se construye una variante de humanización que porta las 6 mutaciones descritas (la secuencia de aminoácidos se enumera en la Tabla 31). 10
Tabla 31: Secuencias de aminoácidos de variantes con secuencia optimizada de VHH VEGFBII5B05 (FR, marco; CDR, región determinante de complementariedad)
VHH ID/SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII119G11/125
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIRFM SMA WYRQAPGKQRELVA RISSGGTTAYADSVKG RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNT FSSRPNP WGQGTLVTVSS
VEGFBII120E10/126
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFI SMA WYRQAPGKHRELVA RISSGGTTAYVDSVKG RFTISRDNSKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNT FSSRPNP WGAGTQVTVSS
Se construye una variante adicional en la que el sitio de oxidación potencial en la posición M30 (región CDR1, véase Figura 19 indicada como resto en cursiva y negrita) se retira por introducción de una mutación M30I. Ambas 15 variantes se ensayan con respecto a su capacidad para unirse a hVEGF165 usando el ProteOn. Brevemente, una microplaca Sensora ProteOn GLC se reviste con VEGF165 humano. Se diluyen extractos periplásmicos de las variantes 1/10 y se inyectan a través de la microplaca revestida con VEGF165 humano. Las tasas de disociación se calculan y se comparan con las tasas de disociación del VEGFBII5B05 precursor. Las tasas de disociación de las 2 variantes están en el mismo intervalo que las tasas de disociación de VEGFBII5B05 precursor lo que indica que se 20 toleran todas las mutaciones (Tabla 32).
Tabla 32: Variantes con secuencia optimizada de tasas de disociación de VEGFBII5B05
VHH ID
nivel de unión (UR) kd (1/s)
VEGFBII5B05
242 6,15E-02
VEGFBII119G11
234 7,75E-02
VEGFBII120E10
257 4,68E-02
En un segundo ciclo, se combinan mutaciones del intento de humanización y la sustitución M30I dando como resultado un clon con secuencia optimizada de VEGFBII5B05, designado VEGFBII032. La secuencia se enumera en 25 la Tabla 33. La afinidad de VEGFBII032 se determina por Biacore (véase Ejemplo 5.5) y la temperatura de fusión se determina en el ensayo de desplazamiento térmico como se ha descrito anteriormente. Se presenta una visión de conjunto de las características del VHH VEGFBII032 con secuencia optimizada en la Tabla 34.
Tabla 33: Secuencias de aminoácidos del clon con secuencia optimizada VEGFBII032 (FR, marco; CDR, región determinante de complementariedad)
VHH ID SEQ ID NO:
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VEGFBII032/127
EVQLVES GGGLVQP GGSLRLS CAASGIRFI SMA WYRQAP GKQRELV A RISSG GTTA YADS VKG RFTISRDNSK NTVYLQMNS LRAEDTAVY YCNT FSSR PNP WGQGT LVTVSS
Tabla 34: Temperatura de fusión (a pH 7) y afinidad (nM) del clon con secuencia optimizada VEGFBII032
VHH ID
Tm (°C) a pH 7 KD (nM)
VEGFBII5B05(wt)
69 32
VEGFBII0032
71 44
5
La potencia de los clones con secuencia optimizada VEGFBII037 y VEGFBII038 se evalúa en un ensayo de proliferación. Brevemente, se priva de complemento a células HUVEC primarias (Technoclone) durante una noche y después se siembran 4000 células/pocillo por cuadruplicado en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Las células se estimulan en ausencia o presencia de VHH con VEGF 33 ng/ml. Las tasas de proliferación se miden por incorporación de [3H] Timidina el día 4. Los resultados mostrados en la Tabla 35, demuestran que la actividad 10 (potencia y grado de inhibición) del VHH precursor VEGFBII23B04 se conservan en el clon con secuencia optimizada VEGFBII038.
Tabla 35: Valores de CI50 (nM) y % de inhibición de los clones con secuencia optimizada VEGFBII037 y VEGFBII038 en el ensayo de proliferación de HUVEC VEGF
VHH ID
CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII23B04
0,68 92
VEGFBII037
1,54 78
VEGFBII038
0,60 92
Bevacizumab
0,29 94
15
Ejemplo 9
Construcción, producción y caracterización de VHH bivalentes que se dirigen a Ang2
Los VHH 1D01 (SEQ ID NO: 214), 11B07, 00908 y 00027 (SEQ ID NO: 216) se fusionan genéticamente con 1D01 (SEQ ID NO: 214), 11B07, 00908 y 00027 (SEQ ID NO: 216), respectivamente, dando como resultado VHH homodiméricos. Los VHH bivalentes se enlazan mediante un enlazador flexible 9-GlySer o 40-GlySer. Las 20 secuencias de ADN codificantes del VHH formateado se clonan en el vector de expresión pAX172. Los VHH se expresan en Pichia pastoris como proteínas marcadas con His6 – myc c-terminal. Brevemente, se inician cultivos de BGCM a partir de una estría de colonia sencilla incubada durante el fin de semana a 30 ºC (250 rpm). Después de cambio de medio a BMCM, los cultivos se incuban hasta la noche a 30 ºC (250 rpm) y seguido de una inducción con metanol 100 %. Al día siguiente los cultivos se inducen 3 veces más (mañana, tarde, noche). Al día siguiente los 25 cultivos se centrifugan durante 20 min a 4 ºC (1.500 xg). Los VHH marcados con His6 presentes en el sobrenadante se purifican a través de cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC) seguido de desalación (DS) y finalmente filtración en gel (GF) para retirar cualquier endotoxina/impureza. Se representa una visión de conjunto del formato y secuencia de todos los VHH bivalentes en la Figura 20 y Tabla 36-A (secuencias enlazadoras subrayadas), SEQ ID NO: 180-185. Los niveles de expresión se indican en la Tabla 36-B. 30
Para explorar las propiedades de bloqueo anti-Ang2 en comparación con los componentes básicos monovalentes, los VHH bivalentes se analizan en un ELISA de competición de Ang2 humano/hTie2 (Figura 21-1), Ang2 de ratón/Tie2 (Figura 21-2), Ang2 de mono cynomolgus /cTie2 (Figura 21-3) y Ang1 humano/hTie2 (Figura 22). Se muestra un compendio de valores de CI50 en la Tabla 37.
35
Tabla 36-A
Secuencias de VHH bivalente que se dirige a Ang2
VHH ID
Secuencia de aminoácidos
ANGBII00001
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 180)
ANGBII00002
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 181)
ANGBII00003
EVQLVESGGGLVQVGDSLRLSCAASGRTFSTYLMVGWFRQAPGKEREFAAGIWSSGDTAYADSVRGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCAGSYDGNYYIPGFYKDWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQVGDSLRLSCAASGRTFSTYLMVGWFRQAPGKEREFAAGIWSSGDTAYADSVRGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCAGSYDGNYYIPGFYKDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 182)
ANGBII00004
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 183)
ANGBII00005
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 184)
ANGBII00006
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 185)
Tabla 36-B
VHH ID
Formato Expresión (mg/l)
ANGBII00001
1D011D01 31
ANGBII00002
1D011D01 37
ANGBII00003
11B0711B07 28
ANGBII00004
0002700027 651
ANGBII00005
0002700027 203
VHH ID
Formato Expresión (mg/l)
ANGBII00006
0090800908 3
Tabla 37: Valores de CI50 (pM) en ELISA de competición de Ang2 humano/Tie2, Ang2 de ratón/Tie2 de ratón, Ang2 de mono cynomolgus/Tie2 de mono cynomolgus y hAng1/hTie2
hAng2 mAng2 cAng2 relación hAng1/hAng2
VHH ID
Formato CI50 (pM) CI50 (pM) CI50 (pM)
1D01
1D01 6.973 10.455 9.484 >10.800
ANGBII00001
11 18 27 n.d.
ANGBII00002
20 32 n.d. n.d.
11B07
11B07 15.205 10.000 16.400 > 8.570
ANGBII00003
24 47 35 n.d.
00027
00027 541 1.785 568 >14.878
ANGBII00004
17 33 34 n.d.
ANGBII00005
13 32 n.d. n.d.
00908
00908 52 85 79 >192.014
ANGBII00006
19 28 25 6.052.631
AMG386
4 3 10 5.600
n.d., no determinado
Ejemplo 10 5
Construcción, producción y caracterización de VHH biespecíficos trivalentes que se dirigen a VEGF y Ang2 usando albúmina antisuero como extensión de semivida.
El VHH anti-VEGF VEGFBII00038 (documento US 2011/0172398 A1) y el VHH anti-Ang2 00027 (SEQ ID NO: 216) se usan como componentes básicos para generar VHH biespecíficos VEGFANGBII00001-00004. Se usa una fusión genética con una albúmina de suero que se une a VHH como una metodología de extensión de semivida. Los 10 componentes básicos se enlazan mediante un enlazador flexible de triple Ala o 9 Gly-Ser. Se producen VHH y se purifican como se ha descrito en el Ejemplo 9. Se representa una visión de conjunto del formato y secuencia de los cuatro VHH biespecíficos en la Figura 23 y Tabla 37-A (secuencias enlazadoras subrayadas), SEQ ID NO: 186-189. Los niveles de expresión se indican en la Tabla 38-B.
15
Tabla 38-A
Secuencias de VHH biespecíficos que se dirigen a VEGF y Ang2
VHH ID
Secuencia de aminoácidos
VEGFANGBII00001
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 186)
VEGFANGBII00002
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 187)
VEGFANGBII00003
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSDVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 188)
VEGFANGBII00004
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 189)
Tabla 38-B
VHH ID
Formato Expresión (mg/l)
VEGFANGBII00001
0003800027ALB11 13,3
VEGFANGBII00002
0003800027ALB11 11,3
VEGFANGBII00003
0003800027ALB11 15,4
VEGFANGBII00004
AAA0003800027ALB11AAA 19,2
Para explorar las propiedades de bloqueo anti-VEGF en comparación con el componente básico monovalente 5 VEGFBII00038, los cuatro VHH biespecíficos se analizan en el AlphaScreen de competición VEGF/VEGFR2-Fc (Figura 22). El ensayo se ajusta ligeramente en comparación con el Ejemplo 12.3 descrito en la Patente de Estados Unidos 2011/0172398 A1. Se añaden tanto VEGF165 humano como VEGFR2-Fc humano a 0,05 nM. Este ensayo de competición también se realiza después de preincubación del VHH con albúmina de suero humano 25 M. Se
muestra un compendio de valores de CI50 y % de inhibición en la Tabla 39.
Tabla 39: Valores de CI50 (nM) en AlphaScreen de competición de VEGF165 humano/VEGFR2 humano.
VHH ID
Formato HSA CI50 (nM) % de inhibición
VEGFBII00038
00038 - 0,5 100
+
0,5 100
VEGFANGBII00001
- 0,4 100
+
0,6 100
VEGFANGBII00002
- 0,7 100
+
1,2 100
VEGFANGBII00003
- 0,6 100
+
1,3 100
VEGFANGBII00004
- 0,5 100
+
0,7 100
Ranibizumab
- 0,8 100
+
1,1 100
Para explorar las propiedades de bloqueo anti-Ang2 en comparación con el componente básico monovalente 00027 (SEQ ID NO: 216), los cuatro VHH biespecíficos se analizan en un ELISA de competición de Ang2/hTie2-Fc humano 5 (Figura 25). Este ensayo también se realiza después de incubación del VHH con albúmina de suero humano 0,5 M. Se muestra un compendio valores de CI50 en la Tabla 40.
Tabla 40: Valores de CI50 (pM) en ELISA de competición de Ang2 humano/Tie2 humano.
VHH ID
Formato HSA CI50 (pM)
00027
00027 - 516
+
n.d.
VEGFANGBII00001
- 240
+
179
VEGFANGBII00002
- 463
+
330
VEGFANGBII00003
- 273
+
154
VEGFANGBII00004
- 111
+
92
AMG386
- 2
+
n.d.
n.d., no determinado
Ejemplo 11
Construcción, producción y caracterización de VHH biespecíficos trivalentes y tetravalentes que se dirigen a VEGF y Ang2 usando unión anti-albúmina de suero como extensión de la semivida
Se construyen diez VHH biespecíficos que se dirigen a VEGF y Ang2 (VEGFANGBII00005-00015). En estas construcciones se incluyen componentes básicos anti-Ang2 1D01 monovalente y bivalente (SEQ ID NO: 214), 7G08 5 monovalente y bivalente (SEQ ID NO: 215) y 00027 bivalente (SEQ ID NO: 216). Se usa una fusión genética con una albúmina de suero que se une a VHH como metodología de extensión de la semivida. Los componentes básicos se enlazan mediante un enlazador flexible 9 Gly-Ser. Se producen VHH y se purifican como se ha descrito en el Ejemplo 8. Se representa una visión de conjunto del formato y secuencia de los diez VHH biespecíficos en la Figura 26 y Tabla 41-A (secuencias enlazadoras subrayadas), SEQ ID NO: 190-199. Se indican los niveles de expresión en 10 la Tabla 41-B.
Tabla 41-A
Secuencias de VHH biespecífico que se dirige a VEGF y Ang2
VHH ID
Secuencia de aminoácidos
VEGFANGBII00005
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALDYYAIGWFRQVPGKEREGVSCISSSDGITYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDSGGYIDYDCMGLGYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 190)
VEGFANGBII00006
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALDYYAIGWFRQVPGKEREGVSCISSSDGITYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDSGGYIDYDCMGLGYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 191)
VEGFANGBII00007
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALDYYAIGWFRQVPGKEREGVSCISSSDGITYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDSGGYIDYDCMGLGYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALDYYAIGWFRQVPGKEREGVSCISSSDGITYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDSGGYIDYDCMGLGYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 192)
VEGFANGBII00008
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 193)
Secuencias de VHH biespecífico que se dirige a VEGF y Ang2
Secuencias de VHH biespecífico que se dirige a VEGF y Ang2
VHH ID
Secuencia de aminoácidos
VEGFANGBII00009
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 194)
VEGFANGBII00010
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 195)
VEGFANGBII00011
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 196)
VEGFANGBII00012
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 197)
VEGFANGBII00013
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 198)
VHH ID
Secuencia de aminoácidos
VEGFANGBII00014
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 199)
Tabla 41-B
VHH ID
Formato Expresión (mg/l)
VEGFANGBII00005
00038ALB117G08 1,3
VEGFANGBII00006
000387G08ALB11 1,3
VEGFANGBII00007
000387G08ALB117G08 0,3
VEGFANGBII00008
00038ALB110002700027 30,0
VEGFANGBII00009
000380002700027ALB11 71,4
VEGFANGBII00010
0003800027ALB1100027 25,0
VEGFANGBII00011
00038ALB111D011D01 4,0
VEGFANGBII00012
000381D011D01ALB11 6,6
VEGFANGBII00013
000381D01ALB111D01 2,9
VEGFANGBII00014
000381D01ALB11 45,6
Para explorar las propiedades de bloqueo anti-VEGF en comparación con el componente básico monovalente VEGFII00038, los diez VHH biespecíficos se analizan en el AlphaScreen de competición de VEGF/VEGFR2-Fc 5 (Ejemplo 10; Figura 27-1) y VEGF/VEGFR1 (Figura 27-2). El ensayo de VEGFR1 se ajusta ligeramente en comparación con el Ejemplo 12.4 como se describe en la Patente de Estados Unidos 2011/0172398 A1. Se añade VEGF165 humano y VEGFR1-Fc humano a 0,05 nM. Estos ensayos de competición también se realizan después de preincubación del VHH con albúmina de suero humano 25 M. Se muestra un compendio de valores de CI50 en la Tabla 42. 10
Tabla 42: Valores de CI50 (nM) en AlphaScreen de competición de VEGF165 humano/VEGFR2 humano y de VEGF165 humano/VEGFR1 humano
VEGFR1 VEGFR2
VHH ID
Formato HSA CI50 (nM) % inh CI50 (nM) % inh
VEGFBII00038
- 0,6 67 0,5 100
+
0,6 64 0,5 100
VEGFANGBII00005
- n.d. n.d. n.d. n.d.
+
n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00006
- 0,8 64 1,0 100
+
1,0 71 1,4 100
VEGFANGBII00007
- n.d. n.d. n.d. n.d.
+
n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00008
- 0,6 77 0,3 100
+
0,7 73 0,4 100
VEGFANGBII00009
- 0,8 71 0,4 100
+
1,5 72 0,7 100
VEGFANGBII00010
- 0,5 72 0,3 100
+
1,1 78 0,7 100
VEGFANGBII00001
- 0,6 68 0,4 100
+
0,8 76 0,6 100
VEGFANGBII00011
- 0,8 74 0,9 100
+
2,5 81 0,8 100
VEGFANGBII00012
- 1,0 74 0,4 100
+
1,5 80 0,7 100
VEGFANGBII00013
- n.d. n.d. n.d. n.d.
+
n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00014
- 0,8 69 0,4 100
+
1,0 80 0,7 100
Ranibizumab
- 2,5 92 1,2 100
+
5,3 86 1,1 100
n.d., no determinado
Para explorar las propiedades de bloqueo anti-Ang2 en comparación con su componente básico monovalente respectivo 7G08 (SEQ ID NO: 215), 1D01 (SEQ ID NO: 214) y 00027 (SEQ ID NO: 216), los diez VHH biespecíficos 5 se analizan en el ELISA de competición de Ang2 humano/hTie2-Fc (véase Ejemplo 5.1; Figura 28-1), Ang2 de ratón/mTie2-Fc (véase Ejemplo 5.2; Figura 28-2) y Ang2 de mono cynomolgus/cTie2-Fc (véase Ejemplo 5.2; Figura 28-3). El ensayo humano también se realiza después de incubación del VHH con albúmina de suero humano 0,5 M. Adicionalmente, se realiza un ensayo de supervivencia de HUVEC mediada por hAng2 (véase Ejemplo 5.5; Figura 29). Se muestra un compendio de valores de CI50 y % de inhibición en la Tabla 43.10
Tabla 43: Valores de CI50 (pM) y % de inhibición en ELISA de competición de Ang2 humano/hTie2 humano, Ang2 de ratón/Tie2 de ratón y Ang2 de mono cynomolgus/Tie2 de mono cynomolgus y valores de CI50 (nM) y % de inhibición en supervivencia de HUVEC mediada por hAng2.
hAng2 mAng2 cAng2 supervivencia de HUVEC
VHH ID
Formato HSA CI50 (pM) % de inh. CI50 (pM) % de inh. CI50 (pM) % de inh. CI50 (nM) % de inh.
7G08
7G08 + 110 100 n.d. n.d. n.d. n.d. 1,5 100
-
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00005
- n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
+
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00006
- 560 100 n.d. n.d. n.d. n.d. 4,9 100
+
400 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00007
- n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
+
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
AMG386
- 5 100 n.d. n.d. n.d. n.d. 1,2 100
+
4 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
00027
- 540 100 1.800 100 570 100 2,0 100
+
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00001
- 360 100 1.300 100 390 100 5,7 100
+
290 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00008
- 47 100 71 100 79 100 5,6 100
+
52 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00009
- 33 100 36 100 46 100 3,6 100
+
39 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00010
- 32 100 78 100 59 100 n.d. n.d.
+
49 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
AMG386
- 5 100 4 100 3 100 1,3 100
+
4 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
1D01
1D01 - 7.000 100 10.000 100 9.500 100 7,8 100
+
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00011
- 31 100 56 100 95 100 3,7 100
+
34 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
hAng2 mAng2 cAng2 supervivencia de HUVEC
VHH ID
Formato HSA CI50 (pM) % de inh. CI50 (pM) % de inh. CI50 (pM) % de inh. CI50 (nM) % de inh.
VEGFANGBII00012
- 40 100 68 100 100 100 3,6 100
+
65 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00013
- n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
+
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00014
- 710 100 1.000 100 1.100 100 n.d. n.d.
+
1.200 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
AMG386
- 4 100 4 100 10 100 1,3
+
4 100 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
n.d., no determinado
Se han determinado las afinidades para albúmina de suero humano y se muestran en la Tabla 44. Brevemente, se inmoviliza albúmina de suero humano (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos) en una microplaca CM5 mediante acoplamiento de aminas. Se usa un enfoque cinético multiciclo: se inyectan concentraciones crecientes de VHH (2-8-31-125-500 nM) y se permite que se asocien durante 2 min y se disocien durante 10 min a un caudal de 100 l/min. Entre inyecciones de VHH, las superficies se regeneran con un pulso de 10 s de Glicina-HCl 10 mM pH 1,5 y 5 periodo de estabilización de 60 s. Los datos de asociación/disociación se evalúan ajustando un modelo de interacción 1:1 (unión de Langmuir) o modelo de Ligando Heterogéneo. La constante de afinidad KD se calcula a partir de las constantes de tasa de asociación y disociación resultantes ka y kd (Tabla 44).
Tabla 44: KD de afinidad de VHH purificados para albúmina de suero humano (HSA), mono cynomolgus (CSA) y de ratón (MSA) 10
HSA CSA MSA
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
ALB11
4,5E+05 1,8E-03 4 4,3E+05 1,6E-03 4 6,6E+05 3,2E-02 49
VEGFANGBII00001
2,3E+05 4,8E-03 22 1,8E+05 4,3E-03 24 n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00005
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00006
2,0E+05 4,6E-03 22 1,5E+05 4,5E-03 30 1,7E+05 6,0E-02 360
VEGFANGBII00007
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00008
1,3E+05 4,3E-03 34 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00009
1,5E+05 4,6E-03 30 1,1E+05 4,2E-03 39 1,2E+05 4,0E-02 340
VEGFANGBII00010
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00011
1,3E+05 4,0E-03 31 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00012
1,5E+05 4,3E-03 31 1,2E+05 4,2E-03 24 1,0E+05 2,5E-02 240
VEGFANGBII0013
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII0014
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
n.d., no determinado
Ejemplo 12 (Este Ejemplo incluiye realizaciones de la invención) Construcción, producción y caracterización de VHH biespecíficas con secuencia optimizada y afinidad madurada que se dirigen a VEGF y Ang2 usando unión con anti albúmina de suero como extensión de la semivida.
Se construyen 14 VHH biespecíficos que se dirigen a VEGF y Ang2 (VEGFANGBII00015-00028). En estas 15 construcciones se incluyen componentes básicos anti-Ang2 bivalente 00921 (un variante de 1D01 con secuencia optimizada) (SEQ ID NO: 220), VHH monovalentes 00908 – 00932 – 00933 – 00934 – 00935 – 00936 – 00937 – 00938 (variantes de 28D10 con secuencia optimizada/afinidad madura) (SEQ ID NO: 222), bivalente 00956 (SEQ ID NO: 223) (variante de 28D10 con secuencia optimizada) y monovalente 00928 (SEQ ID NO: 221) (variante de 37F02 con secuencia optimizada). Se usa una fusión genética con una albúmina de suero que se une a VHH como 20 metodología de extensión de la semivida. Los componentes básicos se enlazan mediante un enlazador flexible 9 Gly-Ser. Se representa una visión de conjunto del formato y secuencia de los 14 VHH biespecíficos en la Figura 30 y Tabla 45-A (secuencias del enlazador subrayadas), SEQ ID NO: 200-213. Los niveles de expresión se indican en la Tabla 45-B.
25
Tabla 45-A
Secuencias de VHH biespecífico que se dirige a VEGF y Ang2
VHH ID
Secuencia de aminoácidos
VEGFANGBII00015
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 200)
VEGFANGBII00016
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 201)
VEGFANGBII00017
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 202)
VEGFANGBII00018
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRESGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 203)
VEGFANGBII00019
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRSSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 204)
VEGFANGBII00020
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 205)
Secuencias de VHH biespecífico que se dirige a VEGF y Ang2
Secuencias de VHH biespecífico que se dirige a VEGF y Ang2
VHH ID
Secuencia de aminoácidos
VEGFANGBII00021
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRESGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 206)
VEGFANGBII00022 Realización de la invención
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRSSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 207)
VEGFANGBII00023
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 208)
VEGFANGBII00024
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS SEQ ID NO: 209)
VEGFANGBII00025
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAPGKEREGVSCIRCSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAPGKEREGVSCIRCSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 210)
VHH ID
Secuencia de aminoácidos
VEGFANGBII00026
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAPGKEREGVSCIRCSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAPGKEREGVSCIRCSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS SEQ ID NO: 211)
VEGFANGBII00027
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCATDSGGYIDYDCSGLGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 212)
VEGFANGBII00028
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRSSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRSSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 213)
Tabla 45-B
VHH ID
Formato Expresión (mg/l)
VEGFANGBII00022
0003800938ALB11
VEGFANGBII00025
000380092100921ALB11
VEGFANGBII00028
000380095600956ALB11
Para explorar las propiedades de bloqueo anti-VEGF en comparación con el componente básico monovalente VEGFBII00038, los VHH biespecíficos se analizan en el AlphaScreen de competición de VEGF/VEGFR2-Fc 5 (Ejemplo 10; Figura 31-1) y VEGF/VEGFR1 (Ejemplo 11; Figura 31-2). Estos ensayos de competición también se realizan después de preincubación del VHH con albúmina de suero humano 25 M. Se muestra un compendio de los valores de CI50 en la Tabla 46-A.
10
Tabla 46-A Valores de CI50 (nM) en AlphaScreen de competición de VEGF165 humano/VEGFR2 humano y VEGF165 humano/VEGFR1 humano
VEGFR1 VEGFR2
VHH ID
Formato HSA CI50 (nM) % de inh. CI50 (nM) % de inh.
VEGFBII00038
- 0,4 57 0,2 100
+
n.d. n.d. n.d. n.d.
VEGFANGBII00022
- 0,4 64 0,2 100
+
0,6 75 0,3 100
VEGFANGBII00025
- 0,6 68 0,2 100
+
0,9 75 0,3 100
VEGFANGBII00028
- 0,5 64 0,2 100
+
0,5 64 0,2 100
Ranibizumab
- 3,2 97 0,7 100
+
n.d. n.d. 0,9 100
n.d., no determinado
Se analiza la cinética de unión de los VHH biespecíficos en VEGF165 humano por SPR en un instrumento Biacore T100 (véase Ejemplo 12.5 descrito en la Patente de Estados Unidos 2011/0172398 A1). Se añade Nanobody 5 monovalente VEGFBII00038 como referencia (Tabla 46-B).
Tabla 46-B: Visión de conjunto de los parámetros cinéticos en ensayo de Biacore de hVEGF165.
ka1 (1/Ms) kd1 (1/s) ka2 (1/s) kd2 (1/s) KD1 (M)
VEGFBII00038
2,6E+05 1,3E-02 1,3E-02 1,9E-04 7,5E-10
VEGFANGBII00022
1,6E+05 1,4E-02 1,4E-02 2,2E-04 1,4E-09
VEGFANGBII00025
1,1E+05 1,4E-02 1,4E-02 2,1E-04 1,9E-09
VEGFANGBII00028
1,7E+05 1,3E-02 1,3E-02 2,1E-04 1,1E-09
La capacidad de los VHH para unirse a la isoforma humana VEGF121 se determina en un ELISA de unión. La unión de una serie de dilución de VHH a VEGF121 humano recubierto directamente 1 g/ml (R&D) (VEGF165 humano 10 como referencia) se detecta usando un 1A4 anti-VHH biotinilado seguido de extravidina-HRP. 1A4 es un VHH anti-VHH (generado de forma interna por Ablynx NV). El Avastin de punto de referencia actúa como control positivo y se detecta usando un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con HRP. Un VHH irrelevante actúa como control negativo. Se muestran curvas de respuesta a unión representativas en VEGF165 y VEGF121 en la Figura 46, los valores correspondientes de CE50 se resumen en la Tabla 46-C. 15
Tabla 46-C: Visión en conjunto de valores de CE50 en ELISA de unión de hVEGF165 y hVEGF121.
hVEGF165 hVEGF121
CE50 (M) CE50 (M)
VEGFANGBII00022
1,4E-09 2,3E-09
VEGFANGBII00025
1,5E-09 2,5E-09
hVEGF165 hVEGF121
CE50 (M) CE50 (M)
VEGFANGBII00028
1,2E-09 2,1E-09
La unión con VEGF164 de rata y de ratón se evalúa en un ELISA de unión. Los VHH que se unen a VEGF164 de rata o murino recubierto directamente 1 g/ml (R&D) se detectan usando 1A4 anti-VHH biotinilado seguido de extravidina-HRP. Como control positivo el anticuerpo monoclonal de reacción cruzada ratón/rata B20-4.1 (Genentech) se valora y se detecta con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con HRP. Un VHH irrelevante 5 actúa como control negativo. Los resultados se muestran en la Figura 33. Ninguno de los 3 VHH biespecíficos reaccionan de forma cruzada con VEGF de ratón y de rata.
La unión con VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y PlGF se evalúa mediante un ELISA de unión. La unión de los VHH con VEGF-B (R&D), VEGF-C (R&D), VEGF-D (R&D) y PlGF (R&D) recubierto directamente 1 g/ml se detectó usando 1A4 anti-VHH biotinilado seguido de extravidina-HRP. Como controles positivos se añade una serie de diluciones de 10 los receptores apropiados (hVEGFR1-Fc para hVEGF-B y hPlGF, hVEGFR2-Fc para hVEGF-C, mAb anti-hVEGF-D (R&D) para hVEGF-D). Un VHH irrelevante actúa como control negativo. Los resultados se muestran en la Figura 34. Ninguno de los 3 VHH biespecíficos se unen a miembros de la familia de VEGF.
Para explorar las propiedades de bloqueo anti-Ang2 en comparación con su componente básico monovalente respectivo 00921 (SEQ ID NO: 220) y 00938 (SEQ ID NO: 222), los 3 VHH biespecíficos se analizan en el ELISA de 15 competición de Ang2 humano/hTie2-Fc (véase Ejemplo 5.1; Figura 35-1), Ang2 de ratón/mTie2-Fc (véase Ejemplo 5.2; Figura 35-2) y Ang2 de mono cynomolgus/cTie2-Fc (véase Ejemplo 5.2; Figura 35-3). El ensayo humano también se realiza después de incubación del VHH con albúmina de suero humano 0,5 M. Adicionalmente, se ensayan VHH biespecíficos en el ELISA de competición de hAng1/hTie2 (véase Ejemplo 5.3; Figura 36) y el ensayo de supervivencia de HUVEC mediada por Ang2 (véase Ejemplo 5.5; Figura 37). Se muestra un compendio de los 20 valores de CI50 y el % de inhibición en la Tabla 47-A.
Tabla 47-A: Valores de CI50 (pM) en ELISA de competición de Ang2 humano/Tie2 humano, Ang2 de ratón/Tie2 de ratón y Ang2 de mono cynomolgus/ Tie2 de mono cynomolgus, ELISA de hAng1 y valores de CI50 (nM) en ensayo de supervivencia de HUVEC mediada por hAng2
ELISA Supervivencia de HUVEC
Ang2 mAng2 cAng2 hAng1
VHH ID
Formato HSA CI50 (pM) % de inh. CI50 (pM) % de inh. CI50 (pM) % de inh. relación de CI50 hAng1/hAng2 CI50 (nM) % de inh.
00938
00938 - 33 100 58 100 86 100 > 60.395 4,3 100
VEGFANGBII00022
- 50 100 56 100 101 100 > 39.902 1,9 100
+
45 100 68 100 115 100 > 44.771
AMG386
- 5 100 2 100 13 100 5.656 1,4 100
00921
00921 - 15.940 100 27.990 100 43.500 100 > 125 18,8 100
VEGFANGBII00025
- 12 100 15 100 38 100 > 160.694 2,2 100
+
15 100 17 100 37 100 > 133.660
AMG386
- 5 100 2 100 15 100 5.632 1,2 100
00956
00956 - 1.010 100 1.816 100 1.294 100 > 1.979 6,8 100
VEGFANGBII00028
- 30 100 72 100 65 100 > 66.222 3,7 100
+
39 100 69 100 78 100 > 50.816
AMG386
- 4 100 3 100 14 100 5.194 1,0 100
n.d., no determinado
Las afinidades de VEGFANGBII00022-25-28 para Ang2 humano, de ratón, de mono cynomolgus y de rata (véase Ejemplo 5.4) se han determinado y se muestran en la Tabla 47-B.
Tabla 47-B: KD de afinidad de VHH purificados para Ang2 humano, de mono cynomolgus, de ratón y de rata recombinante
Ang2-FLD humano Ang2-FLD de mono cynomolgus
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
VEGFANGBII00022
9,7E+05 1,5E-05 1,6E-11 1,5E+06 1,3E-05 8,1E-12
VEGFANGBII00025
2,7E+06 1,2E-02 4,5E-09 4,3E+06 1,1E-02 2,7E-09
VEGFANGBII00028
5,9E+05 9,6E-04 1,6E-09 8,4E+05 8,7E-04 1,0E-09
5
Ang2-FLD de ratón Ang2-FLD de rata
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
VEGFANGBII00022
5,5E+05 2,8E-05 5,1E-11 3,9E+05 3,8E-05 9,9E-11
VEGFANGBII00025
1,3E+06 1,4E-02 1,1E-08 8,7E+05 2,9E-02 3,3E-08
VEGFANGBII00028
3,6E+05 2,0E-03 5,6E-09 2,5E+05 3,1E-03 1,2E-08
Se han determinado las afinidades de VEGFANGBII00022-25-28 para albúmina sérica humana, de ratón y de mono cynomolgus (Ejemplo 11) y se muestran en la Tabla 48. La constante de afinidad KD se calcula a partir de las constantes de la velocidad de asociación y disociación resultantes ka y kd (Tabla 48).
Tabla 48: KD de afinidad de VHH purificados para albúmina sérica humana recombinante, de ratón y de mono 10 cynomolgus usando (A) modelo de interacción 1:1 o (B) modelo de ligando heterogéneo
(A)
HSA CSA MSA
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
ALB11
5,6E+05 1,9E-03 4 4,5E+05 1,7E-03 4 5,9E+05 3,0E-02 51
VEGFANGBII00022
6,7E+05 6,0E-03 9 6,2E+05 5,4E-03 9 5,2E+05 5,4E-03 150
VEGFANGBII00025
5,6E+05 5,6E-03 12 4,3E+05 5,1E-03 12 - - -
VEGFANGBII00028
5,6E+05 5,8E-03 10 5,2E+05 5,3E-03 10 - - -
(B)
MSA
ka1 (1/Ms) kd1 (1/s) ka2 (1/s) kd2 (1/s) KD1 (nM) KD2 (nM)
VEGFANGBII00025
6,2E+05 9,9E-02 4,7E+04 5,7E-04 160 * 12
VEGFANGBII00028
5,9E+04 6,9E-04 5,7E+05 9,4E-02 12 160 *
* describe 70 % o más de la interacción
Componentes de unión a Ang2 (Tabla 53)

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de unión biespecífica que comprende
    - un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a VEGF,
    - un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina sérica, y
    - un dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a Ang2, 5
    en donde
    - dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a VEGF tiene las siguientes secuencias de CDR:
    CDR1: SYSMG
    CDR2: AISKGGYKYDAVSLEG
    CDR3: SRAYGSSRLRLADTYEY, 10
    - dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a albúmina sérica tiene las siguientes secuencias de CDR:
    CDR1: SFGMS (SEQ ID NO:255)
    CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:256) CDR3: GGSLSR (SEQ ID NO:257),
    - dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a Ang2 tiene las siguientes secuencias de CDR: 15
    CDR1: DYAIG (SEQ ID NO:248)
    CDR2: AIRSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:249)
    CDR3: VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA (SEQ ID NO:250),
    y donde dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a Ang2 se une con Ang2 con una potencia al menos 5.000 veces más alta que a Ang1 o a Ang4. 20
  2. 2. La molécula de unión biespecífica de la reivindicación 1, en la que dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina son VHH.
  3. 3. Una molécula de unión biespecífica que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 207 (VEGFANGBII00022)..
  4. 4. Una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de unión biespecífica de una cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.
  6. 6. Una célula hospedadora que contiene un vector de la reivindicación 5.
  7. 7. Una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de unión biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como ingrediente activo. 30
  8. 8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para uso en el tratamiento de cáncer o para uso en el tratamiento de enfermedades oftálmicas.
  9. 9. Un método de fabricación de una molécula de unión biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las etapas de:
    - cultivar células hospedadoras según la reivindicación 6 en condiciones que permiten la expresión de dicha 35 molécula de unión biespecífica; y
    - recuperar o aislar del cultivo dicha molécula de unión biespecífica expresada por dichas células hospedadoras.
  10. 10. El método de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente la etapa de:
    - purificar o modificar adicionalmente o formular dicha molécula de unión biespecífica.
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