KR20240048555A - 항 ang2 항체 및 그 제조방법과 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 및 그 응용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 의약분야에 관한 것이며, 구체적으로 ANG2(angiopoietin-2, 인간 혈관신생 2)의 항체 및 그 제조방법과 응용에 관한 것이다.
ANG2에 대한 항체는 신생혈관의 형성과 누출을 억제하고 염증반응의 발생을 감소시킨다. ANG/Tie2는 혈관신생을 조절하는 중요한 신호 경로이다. ANG1은 내피세포수용체 Tie2의 인산화를 촉진하고, 혈관평활근세포, 주위세포 등 혈관주위세포를 유인하여 내피세포를 포위하고 지지하며, 혈관 재생을 촉진하고, 혈관의 완전성을 유지하며 혈관기능을 조절하고; ANG1은 혈관을 병변으로부터 보호하고, 혈관형태를 유지하지만, ANG2는 혈관 누출을 촉진하여, 저혈압과 혈관구조 이상을 유발한다. 많은 기업에서 개발한 ANG2 항체에 대한 임상실험을 진행하고 있지만, 현재 시중에는 ANG2에 대한 항체 약물이 없다.
본 발명은 ANG2의 혈관신생 촉진 활성의 억제 및 혈관신생 과정으로 인한, 또는 이와 관련된 질병 및 병증의 치료에서 작용을 발휘하는 ANG2에 대한 특이적 단일클론항체를 제공하고, 상기 질병 및 병증은 예를 들어 안저 신생혈관성 질환, 류마티스관절염 및 건선이다. 또한, 혈관신생은 종양의 성장 및 유지에 매우 중요하며, ANG2를 억제하는 단일클론항체는 암 치료 과정에 대해서도 영향을 미칠 수 있다. 또한, 본 발명은 ANG2 및 VEGF에 대한 이중 특이적 항체를 더 제공한다. 본 발명의 항체는 인간 ANG2, 토끼 ANG2 및 원숭이 ANG2와 결합할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 다음과 같은 방면에 관련된다.
1. 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 이는 서열번호 1-10 중 어느 하나로 표시되는 중쇄 가변 영역에 포함된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 또는 그 변이체를 포함하고,
바람직하게는, IMGT 넘버링 시스템에 따라, 다음 각 항으로 구성된 군에서 선택된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함한다.
(1) 서열번호 21로 표시되는 HCDR1, 서열번호 22로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 HCDR3,
(2) 서열번호 34로 표시되는 HCDR1, 서열번호 35로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 HCDR3,
(3) 서열번호 37로 표시되는 HCDR1, 서열번호 38로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 39로 표시되는 HCDR3,
(4) 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 41로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 42로 표시되는 HCDR3, 또는 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 41로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 42로 표시되는 HCDR3의 변이체, 및 그 조합, 여기서 상기 변이체는 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 41로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 42로 표시되는 HCDR3에 비해, 각각 하나 이상(바람직하게는 1개, 2개 또는 3개)의 보존적 아미노산 돌연변이(바람직하게는 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하며 ANG2에 대한 결합 친화도를 유지하는 아미노산 서열이고,
바람직하게는, 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 41로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 42로 표시되는 HCDR3이고, 여기서 서열번호 40으로 표시되는 CDR1에서 5번 내지 8번 위치 및 10번 내지 11번 위치의 아미노산, 서열번호 41로 표시되는 CDR2에서 2번 내지 5번 위치의 아미노산 및 7번 위치의 아미노산, 서열번호 42로 표시된 CDR3에서 1번 위치의 아미노산, 3번 내지 8번 위치의 아미노산은 아미노산 X에서 선택되고, 상기 아미노산 X는 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 구성된 군에서 선택되며,
바람직하게는, 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1의 변이체이고, 여기서 1번 위치의 글리신 G는 Ala, Val, Leu 및 Ile로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 대체될 수 있고; 2번 위치의 페닐알라닌 F는 Tyr로 대체될 수 있으며; 3번 위치의 프롤린 P는 Trp 및 His로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 대체될 수 있고; 4번 위치의 Ser은 Thr로 대체될 수 있으며; 9번 위치의 Ser은 Thr로 대체될 수 있고; 12번 위치의 Gln은 Asn로 대체될 수 있으며;
서열번호 41로 표시되는 HCDR2의 변이체이고, 1번 위치의 Ile는 Ala, Val, leu 및 Gly로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 대체될 수 있고; 6번 위치의 Leu는 Ile로 대체될 수 있고; 8번 위치의 Lys는 Arg로 대체될 수 있으며;
서열번호 42로 표시되는 HCDR3의 변이체이고, 여기서 2번 위치의 Val는 Ala, Gly, Leu 및 Ile로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 대체될 수 있고; 9번 위치의 Asp는 Glu로 대체될 수 있으며,
(5) 서열번호 43으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 44로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 45로 표시되는 HCDR3,
(6) 서열번호 46으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 44로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 48로 표시되는 HCDR3,
(7) 서열번호 49로 표시되는 HCDR1, 서열번호 44로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 48로 표시되는 HCDR3,
(8) 서열번호 52로 표시되는 HCDR1, 서열번호 44로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 48로 표시되는 HCDR3, 및
(9) 서열번호 55로 표시되는 HCDR1, 서열번호 56으로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 57로 표시되는 HCDR3.
2. 제1 항목에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 여기서 상기 ANG2는 인간 ANG2, 토끼 ANG2, 또는 원숭이 ANG2로부터 선택된다.
3. 제1 항목 또는 제2 항목에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 이는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1-10 중 어느 하나로 표시되는 서열 또는 서열번호 1-10 중 어느 하나에 따른 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 가지며 ANG2 결합 활성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.
4. 재조합 단백질, 이는 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체를 포함하고, 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 생물학적 활성 물질을 더 포함하며, 예를 들어 효소 활성을 갖는 독소 또는 그 활성 단편(예: 아브린(Abrin), 리신(Ricin) A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소), 종양 괴사 인자 또는 인터페론(예: IFN-γ), 생물학적 반응 조절물질(예: 림포카인, IL-2, IL-2, IL2-6, IL-10, 및 GM-CSF), 및/또는 Fc 단편(예를 들어 IgG(예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM의 Fc 영역에서 유래되고, 예를 들어 인간, 토끼 또는 원숭이의 IgG, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM의 Fc 영역에서 유래됨)을 포함하고, 바람직하게는, 상기 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체와 상기 Fc 단편은 연결 펩티드를 통해 연결되고, 바람직하게는, 상기 연결 펩티드는 (GGGGS)n이고, n=1, 2 또는 3이며, 바람직하게는, 상기 Fc 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이고, 더욱 바람직하게는 GenBank No. AK303185.1 또는 서열번호 29로 표시되는 Fc 단편이고, 더욱 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 서열번호 11-20으로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
5. 다중 특이적 항체, 바람직하게는 이중 특이적 항체, 이는 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체를 포함하고, 바람직하게는 상기 이중 특이적 항체의 구조는, 경쇄 및 중쇄를 포함하며, 여기서 경쇄-중쇄가 페어링되어 사슬간 이황화 결합을 형성하고, 두 개의 중쇄가 페어링되어 사슬간 이황화 결합을 형성하며, 여기서 중쇄는 (VH)-(CH1)-(힌지 영역)-(Fc)-(연결 펩티드)-(VHH)이고, 경쇄는 (VL)-(경쇄 불변 영역)인 구조이다.
6. 제5 항목에 따른 다중 특이적 항체, 여기서 VHH는 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 단일 도메인 항체이고, VH 및 VL는 두 번째 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이며, 바람직하게는 상기 두 번째 항체가 표적으로 하는 항원은 면역세포 표면 항원, 종양 항원, 바이러스, 세균, 내독소, 사이토카인 또는 그 조합에서 선택되고; 더욱 바람직하게는, PD-L1, PD-1, VEGFA, IL-10, IL-10R, BCMA, VEGF, TGF-β, CTLA-4, LAG-3, TIGIT, CEA, CD38, SLAMF7, B7-H3, Her2, EpCAM, CD19, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, EGFR, GD2, GD3, GM2, RANKL, CD3, 및/또는 CD16a로부터 선택되며, 바람직하게는 두 번째 항체가 표적으로 하는 항원은 VEGF이고, 더욱 바람직하게는 두 번째 항체는 항 VEGF 항체에서 선택되며, 상기 항 VEGF 항체는 서열번호 24로 표시되는 중쇄 가변 영역에 포함된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3(바람직하게는 IMGT 넘버링 시스템에 따라, 서열번호 50으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 51로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 HCDR3을 포함함) 및 서열번호 27로 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3(바람직하게는 IMGT 넘버링 시스템에 따라, 서열번호 54로 표시되는 LCDR1, 서열번호 58로 표시되는 LCDR2 및 서열번호 59로 표시되는 LCDR3을 포함함)을 포함하고, 더욱 바람직하게는, 상기 항 VEGF 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 24로 표시되는 서열 또는 서열번호 24로 표시되는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되며; 상기 항 VEGF 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 27로 표시되는 서열 또는 서열번호 27로 표시되는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.
7. 제5 항목 또는 제6 항목에 따른 다중 특이적 항체에 있어서, 여기서 CH1의 서열은 서열번호 25로 표시된 바와 같고, 힌지 영역의 서열은 서열번호 26으로 표시된 바와 같으며, Fc 불변 영역의 서열은 서열번호 29로 표시된 바와 같고, 연결 펩티드의 서열은 서열번호 30 또는 서열번호 47로 표시된 바와 같으며, 경쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 28로 표시된 바와 같고; 바람직하게는, 상기 다중 특이적 항체는 다음 군에서 선택된다.
(1) 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 이들로 구성된 Y400C; 여기서 중쇄의 서열은 서열번호 24, 25, 26, 29, 30 및 4를 포함하거나, 이들로 구성되고; 경쇄의 서열은 서열번호 27 및 28을 포함하거나 이들로 구성되며;
(2) 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 이들로 구성된 Y400E; 여기서 중쇄의 서열은 서열번호 24, 25, 26, 29, 47 및 4를 포함하거나, 이들로 구성되고; 경쇄의 서열은 서열번호 27 및 28을 포함하거나, 이들로 구성된다.
8. 폴리뉴클레오티드, 이는 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4 항목에 따른 재조합 단백질, 또는 제5 항목 내지 제7 항목 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체를 코딩한다.
9. 벡터, 이는 제8 항목에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
10. 숙주세포, 이는 제9 항목에 따른 벡터를 포함한다.
11. 접합체(conjugates), 이는 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4 항목에 따른 재조합 단백질, 또는 제5 항목 내지 제7 항목 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체, 및 접합부분을 포함하고, 여기서, 상기 접합부분은 정제(Purification) 태그(예: His태그), 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 또는 그 조합이며; 바람직하게는, 상기 접합부분은 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광물질, 유색물질, 화학요법제, 생물학적 독소, 폴리에틸렌글리콜 또는 효소이다.
12. 키트, 이는 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4 항목에 따른 재조합 단백질, 제5 항목 내지 제7 항목 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11 항목에 따른 접합체를 포함하고; 바람직하게는, 상기 키트는 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4 항목에 따른 재조합 단백질, 제5 항목 내지 제7 항목 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11 항목에 따른 접합체를 특이적으로 식별하는 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 재조합 단백질 또는 다중 특이적 항체를 더 포함하며; 선택적으로, 상기 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 재조합 단백질 또는 다중 특이적 항체는, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광물질, 유색물질 또는 효소와 같은 검출 가능한 마커를 더 포함하고; 바람직하게는, 상기 키트는 시료 내 ANG2의 존재 또는 그 수준을 검출하는 데 사용되고; 또는
상기 키트는 (1) 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4 항목에 따른 재조합 단백질, 제5 항목 내지 제7 항목 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11 항목에 따른 접합체; 및 (2) 기타 항원에 대한 항체 또는 그 항원 결합 단편, 및/또는 세포독성제, 및/또는 화학요법 약물, 및 선택적으로, 사용설명서를 포함한다.
13. 약학적 조성물에 있어서, 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4 항목에 따른 재조합 단백질, 제5 항목 내지 제7 항목 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11 항목에 따른 접합체를 포함하고; 선택적으로, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 벡터 및/또는 부형제를 더 포함하며; 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 피하 주사, 피내 주사, 정맥 주사, 근육 주사 또는 병소 내 주사를 통한 투여에 적합한 형태이다.
14. ANG2의 혈관신생 촉진 활성의 억제, 혈관신생 과정으로 인한 또는 이와 관련된 질병, 예를 들어 안저 신생혈관성 질환, 류마티스관절염 및 건선, 및/또는 종양의 예방 및/또는 치료에서의; 또는, ANG2의 혈관신생 촉진 활성의 억제, 혈관신생 과정으로 인한 또는 이와 관련된 질병, 예를 들어 안저 신생혈관성 질환, 류마티스관절염 및 건선, 및/또는 종양의 예방 및/또는 치료에 사용되는 약물 제조에서의, 제1 항목 내지 제3 항목 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4 항목에 따른 재조합 단백질, 제5 항목 내지 제7 항목 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11 항목에 따른 접합체의 용도.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 기술적 특징과 이하(예: 실시예)에서 구체적으로 설명된 각 기술적 특징 간에 서로 결합되어 신규 또는 바람직한 기술적 방안을 구성할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 편폭의 제약으로 여기서는 다시 일일이 설명하지 않는다.
본 발명에 관련된 용어는 본 분야의 당업자가 이해하는 통상적인 의미를 갖는다. 본 기술 분야에서 사용 및/또는 허용 가능한 경우, 하나의 용어가 둘 이상의 정의를 갖는다면, 본 명세서에서 사용되는 용어의 정의는 모든 의미를 포함하도록 사용된다.
본 분야의 당업자는 항체의 CDR 영역이 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 담당한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 알고 있는 경우, 현재 Kabat, IMGT, Chothia 및 AbM 넘버링 시스템을 포함하여 항체 CDR 영역을 결정하는 방법은 여러 가지가 존재한다. 그러나 항체 또는 그 변이체에 대한 각 CDR 정의의 응용은 모두 본 명세서에서 정의 및 사용되는 용어의 범위 내에 있다. 상기 항체의 가변 영역의 아미노산 서열이 주어지면, 본 분야의 당업자는 일반적으로 상기 서열 자체를 제외한 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고 특정 CDR을 결정할 수 있다.
본 발명에서, VHH 도메인, VHH 항체 단편 또는 VHH 항체라고도 하는 중쇄 단일 도메인 항체는 "중쇄 항체"(즉, 경쇄가 없는 항체)라 칭하는 항원 결합 면역글로불린의 가변 도메인(Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, BEndahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains", Nature 363, 446-448, 1993)이다. VHH 도메인은 다른 항원 결합 도메인 없이 에피토프에 특이적으로 결합한다. VHH 도메인은 단일 면역글로불린 도메인으로 형성되는 작고 안정적이며 효율적인 항원 인식 단위이다.
본 발명의 중쇄 단일 도메인 항체는 수요가 있는 생물학적 활성 물질과 결합하여 재조합 단백질을 형성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 생물학적 활성 물질은 예를 들어 효소 활성을 갖는 독소 또는 그 활성 단편(예: 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소), 종양 괴사 인자 또는 인터페론(예: IFN-γ), 생물학적 반응 조절물질(예: 림포카인, IL-2, IL2-6, IL-10, 및 GM-CSF), Fc 단편에서 선택된다. 본 발명의 재조합 단백질에 포함된 Fc 단편은 재조합 단백질이 이량체를 형성하도록 하면서 상기 재조합 단백질의 체내 반감기를 연장시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 사용될 수 있는 Fc 단편은 IgG(예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IIGM과 같은 다양한 아형의 면역글로불린으로부터 제공될 수 있다.
본 발명의 항체는 (i) 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩타이드, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기 중에서 치환기를 갖는 폴리펩타이드 또는 (iii) 성숙한 폴리펩타이드와 다른 하나의 화합물(예: 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜)이 융합되어 형성된 폴리펩타이드, 또는 (iv) 추가 아미노산 서열이 해당 폴리펩타이드 서열에 융합되어 형성된 폴리펩타이드(예: 선도 서열 또는 분비 서열 또는 해당 폴리펩타이드의 정제에 사용되는 서열 또는 피브리노겐(fibrinogen) 서열 또는 6His 태그와 함께 형성된 융합 단백질)일 수 있다. 본 명세서의 암시에 따르면, 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 본 분야 당업자에게 알려진 범위에 속한다.
보존적 치환:
"보존적 아미노산 치환"이란 그 중의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 대체되는 것을 의미한다. 본 분야에서는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리에 대해 정의하였고, 이는 염기성 측쇄(예: 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예: 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분지된 측쇄(예: 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩타이드의 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리의 기타 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 다른 일부 실시 형태에서, 하나의 아미노산 열은 구조적으로 유사한 아미노산 열로 대체될 수 있으며, 후자는 순서상 및/또는 측쇄 패밀리의 구성상에서 다르다.
다음 표에서 보존적 아미노산 치환의 비제한적인 예를 제공하고, 여기서 유사성 점수가 0 이상인 경우, 해당 두 개의 아미노산 사이에 보존적 치환이 있음을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 상기 보존적 치환은 바람직하게는 다음과 같은 치환을 의미한다. 즉, 여기서, 하기 그룹 (a) 내지 그룹 (e) 내의 하나의 아미노산이 같은 그룹 내의 다른 하나의 아미노산 잔기로 대체되며, 여기서, (a) 작은 지방족, 비극성 또는 저극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성, 음전하를 띤 잔기 및 그(전하를 띠지 않은) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성, 양전하를 띤 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp이다.
특별히 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다. Ala를 Gly로 대체하거나 Ser로 대체하고; Arg를 Lys로 대체하며; Asn을 Gln로 대체하거나 His로 대체하고; Asp를 Glu로 대체하며; Cys를 Ser로 대체하고; Gln을 Asn으로 대체하며; Glu를 Asp로 대체하고; Gly를 Ala로 대체하거나 Pro로 대체하며; His를 Asn으로 대체하거나 Gln으로 대체하고; Ile을 Leu로 대체하거나 Val로 대체하며; Leu를 Ile로 대체하거나 Val로 대체하고; Lys를 Arg로 대체하거나 Glu로 대체하거나 Glu로 대체하며; Met은 Leu로 대체하거나 Tyr로 대체하거나 Ile로 대체하고; Phe를 Met로 대체하거나 Leu로 대체하거나 Tyr로 대체하며; Ser을 Thr로 대체하고; Thr을 Ser로 대체하며; Trp를 Tyr로 대체하고; Tyr을 Trp로 대체하며; 및/또는 Phe를 Val로 대체하거나 Ile로 대체하거나 Leu로 대체한다.
일부 실시 형태에서 다음 아미노산은 유사한 구조적 특징과 특성을 가지고 있다.
예를 들어, 글리신 G, 알라닌 A, 발린 V, 류신 L 및 이소류신 I는 모두 하나의 아미노기 및 하나의 카르복실기를 함유하는 중성 아미노산에 속하고;
세린 S와 트레오닌 T는 모두 하이드록시 아미노산에 속하며;
시스테인 C와 메티오닌 M은 모두 황 함유 아미노산에 속하고;
아스파라긴 N과 글루타민 Q는 모두 아미드기 함유 아미노산에 속하며;
아스파르트산 D와 글루탐산 E는 모두 산성 아미노산에 속하고;
라이신 K와 아르기닌 R은 모두 염기성 아미노산에 속하며;
페닐알라닌 F와 티로신 Y는 모두 방향족 아미노산에 속하고;
트립토판 W, 히스티딘 H 및 프롤린 P는 모두 헤테로고리 아미노산에 속한다. 따라서, 유사한 구조적 특성과 특성으로 인해 서로 간에 보존적 치환을 수행할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체는 치료제(예: 화학요법 약물, 예를 들어 시스플라틴, 카보플라틴), 약물 전구체, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 조절제 및 약제 또는 PEG와 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 치료제에 연결되거나 융합될 수 있으며, 상기 치료제는 방사성 마커, 면역 조절제, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오티드, 광활성 치료제 또는 진단제, 세포독성제와 같은 검출 가능한 마커를 포함할 수 있으며, 약물 또는 독소, 초음파 강화제 및 비방사성 마커, 이들의 조합 및 해당 분야에서 알려진 기타 성분일 수 있다.
도 1은 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc에 인간 ANG2를 결합한 경우의 생물학적 활성을 나타낸 도면이다.
도 2는 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc에 원숭이 ANG2를 결합한 경우의 생물학적 활성을 나타낸 도면이다.
도 3은 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc가 인간 ANG2와 그 수용체 hTIE2의 결합을 억제하는 생물학적 활성을 나타낸 도면이다.
도 4는 항체가 인간 ANG2와 HUVEC의 결합을 억제하는 생물학적 활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 항체가 인간 ANG1과 HUVEC의 결합을 억제하는 생물학적 활성을 나타낸 도면이다.
도 6은 항체가 인간 ANG2가 의존하는 HUVEC 세포의 AKT 인산화를 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
도 2는 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc에 원숭이 ANG2를 결합한 경우의 생물학적 활성을 나타낸 도면이다.
도 3은 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc가 인간 ANG2와 그 수용체 hTIE2의 결합을 억제하는 생물학적 활성을 나타낸 도면이다.
도 4는 항체가 인간 ANG2와 HUVEC의 결합을 억제하는 생물학적 활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 항체가 인간 ANG1과 HUVEC의 결합을 억제하는 생물학적 활성을 나타낸 도면이다.
도 6은 항체가 인간 ANG2가 의존하는 HUVEC 세포의 AKT 인산화를 억제하는 것을 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하도록 한다. 본 분야의 당업자는 아래의 실시예가 예시 목적으로만 사용된다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 정신과 범위는 청구범위에 의해 한정된다. 아래 실시예에서 사용된 방법은 특별한 설명이 없으면 모두 일반적인 방법이며, 사용된 시약은 특별한 설명이 없으면 모두 상업적으로 구매 가능한 시약이다.
실시예 1: ANG2에 대한 중쇄 단일 도메인 항체의 스크리닝
인간 ANG2의 Lys275-Phe496 위치의 아미노산에 대응되는 재조합 인간 ANG2 단백질, 이하 hANG2로 약칭하고, 서열은 서열번호 32로 표시된 바와 같으며; 원숭이 ANG2 단백질의 서열은 서열번호 33으로 표시된 바와 같고, 이하 cynoANG2로 약칭한다. 구체적인 ANG2 ECD 분자의 아미노산 서열 정보는 표 1과 같다.
표 1. 재조합 인간 ANG2 서열 정보
1.1 중쇄 단일 도메인 항체 파지 라이브러리의 구축:
알파카(Alpaca) 2마리를 선택하여 항원면역을 수행하고, 인간 ANG2 단백질로 4회 면역시킨 후, 알파카 말초혈액 100ml의 림파구를 추출하고, RNAiso Plus 시약(TAKARA, 9109)으로 총 RNA를 추출하며, PrimeScript II 키트(TAKARA, 6210A)를 사용하여 추출된 RNA를 cDNA로 역전사한다. PCR 증폭 방법을 사용하여 먼저 750bp 길이의 중쇄 항체 가변 영역 및 불변 영역 CH2의 핵산 단편을 증폭하며, 그 다음, 이전 단계에서 회수한 750bp 길이의 핵산 단편을 주형으로 사용하여 타겟 단편 즉 중쇄 항체 가변 영역 단편을 증폭한다. 벡터 pComb3XSS(NBbiolab, NPL-001)와 타겟 단편에 대해 각각 SfiI로 효소 절단을 수행하며 50℃에서 밤새 효소 절단을 수행하고, 타겟 단편을 회수하며, 연결 몰비에 따라 벡터:단편=1:3의 비율로 연결한다. 연결생성물을 대장균 컴피턴트 세포 TG1에 전기 형질전환시키고, 각 알파카의 연결생성물에 대해 10회의 전기천공을 이용한 형질전환을 수행한다. 구배 희석 분주로 저장 용량의 크기를 계산하면 두 알파카의 파지 라이브러리 크기는 각각 1.21×109 및 1×109이다. 역가 측정 플레이트에서 무작위로 96개의 클론을 선택하여 식별한 결과, 삽입률이 100%인 것으로 나타났다.
1.2 ANG2에 대한 중쇄 단일 도메인 항체 스크리닝:
hANG2 단백질 10μg/웰로 플레이트를 코팅하고 4℃에서 밤새 놓아 둔다. 다음날 실온에서 2시간 동안 1% BSA로 차단(blocking)한 후, 100μl의 파지(2×109pfu/웰, 1.1에서 구축된 중쇄 단일 도메인 항체 파지 라이브러리에서 유래)를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 이후 PBST(PBS에는 0.05% 트윈 20이 함유됨)로 5회 세척하여 결합되지 않은 파지를 씻어낸다. 마지막으로 hANG2에 특이적으로 결합된 파지를 글리신-염산(200mM)으로 용리시키고, 대수성장기의 대장균 TG1에 감염시켜, 다음 스크리닝에 사용될 파지를 생성하고 정제한다. 동일한 스크리닝 과정을 2회 반복한 후, 얻어진 파지를 대장균 TG1에 감염시켜 분주하고, 플레이트에서 단일 클론을 선택하여 시퀀싱한다. 서열 비교 결과에 따라 각 클론의 단백질 서열을 분석하고, CDR1, CDR2, CDR3 서열이 다른 클론을 상이한 항체로 간주하여 최종적으로 총 10개의 서로 다른 항체를 얻었다.
표 2. 중쇄 단일 도메인 항체 가변 영역 아미노산 서열 정보(Numbering Scheme IMGT)
실시예 2: ANG2에 대한 중쇄 단일 도메인 항체의 초기 평가 및 동정(identification)
1. 숙주균인 대장균에서의 중쇄 단일 도메인 항체의 발현:
얻어진 10개의 중쇄 단일 도메인 항체의 TG1 숙주균에서 단일 콜로니를 선택하여 접종하고 밤새 배양하며, 다음날 밤새 배양된 균종을 옮겨 접종하고 증폭시키며, 0.5mM IPTG로 유도하고, 37℃에서 진탕기(shaker)로 밤새 배양한다. 다음날, 원심분리하여 상층액을 수집하여 검출한다.
2. ELISA로 10개의 중쇄 단일 도메인 항체 친화도를 검출:
hANG2 단백질 용액 및 BSA를 각각 2μl/웰로 ELISA 플레이트를 코팅하고, 4℃에서 밤새 놓아 두며; 상층액을 버리고 각 웰에 차단액(blocking solution) 300μl(3% BSA를 함유한 PBS)를 넣고, 37도에서 2시간 동안 차단하며; 원심분리에 의해 수집된 상층액을 웰당 200μl씩 ELISA 플레이트 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 정치 배양하고, 상층액을 버리며; 200μl/웰의 PBST(PBS는 0.1% Tween 20을 함유)로 3회 세척하고; 희석된 HRP 라벨된 항-VHH 이차 항체(Genscript, A01861)를 첨가하며, 이차 항체는 1:10000으로 희석하여 사용하고, 희석액은 1% BSA의 PBS이고, 부피는 100μl/웰이며, 실온에서 1시간 동안 배양하고; 200μl/웰의 PBST로 5회 세척하며; TMB 발색액(BD, 55214) 100μl/웰을 첨가하여, 37℃에서 8분 동안 발색시킨다. 2M의 HCl 정지액(stopping solution) 100μl/웰을 넣고, 정지액을 첨가한 후, 30분 내에 마이크로플레이트 리더기로 450nm에서의 값을 판독한다. 결과는 아래 표 3에 나타낸 바와 같다.
표 3. 중쇄 단일 도메인 항체와 hANG2 항원이 결합한 OD 값
실시예 3: 항-ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc의 플라스미드 제조
PCR로 클론한 단일 항체 중쇄 가변 영역(서열번호 1~10)에 해당하는 코딩 DNA 서열과 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(GenBank No. AK303185.1)에 해당하는 코딩 DNA를 연결하여 중쇄 항체를 구성함으로써, 항-ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc 발현 플라스미드를 얻고, 벡터는 일반적으로 pcDNA3.1(-) (Invitrogen에서 구입) 또는 기타 진핵 발현 벡터를 사용한다. 상기 중쇄 항체 단백질 서열의 가변 영역과 불변 영역 사이는 연결 펩티드로 연결되며, 상기 연결 펩티드는 (GGGGS) n이며, n=1, 2 또는 3이다.
표 4. 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc아미노산 서열
실시예 4. 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc의 발현 및 정제
내독소가 없는 플라스미드 대량 추출 키트(Qiagen, 제품 번호 12391)를 사용하여 플라스미드 추출을 수행하며 구체적인 작업은 제조업체에서 제공한 설명서에 따라 수행한다. CHO-S 세포 배양은 제조업체가 제공한 설명서에 따라 CD CHO 배지(Gibco, 제품 번호 10743-029)에서 37℃, 5% CO2의 세포 배양기에 넣어 배양하고, 세포를 준비한 후, 항-ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc 서열을 포함하는 플라스미드를 함께 CHO-S 세포에 공동 형질감염시켜 항체-Fc를 발현시킨다. 형질감염 후의 두 번째 날, 배양 온도를 32℃로 낮추고, 매일 3.5% 2xEFC+(Gibco, 제품 번호 A2503105)를 첨가하며, 14일 배양한 후, 800xg로 원심분리하여 발현 상층액을 얻는다. 그리고, 0.22μm의 여과막으로 여과한다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하여 배양 상층액의 항체-Fc를 얻는다. 280nm에서의 UV 흡광도 및 각 단백질에 해당하는 흡광 계수(extinction coefficient)를 통해, 정제된 항체-Fc 농도를 측정한다. SDS-PAGE 및 SE-HPLC를 통해 항체-Fc의 순도 및 균질성을 평가한다. 또는 이온 교환 및 Superdex 200의 SEC를 사용하여 2차 정제를 수행하여 비상으로 사용하기 위한 고순도 항체-Fc 시료를 제작한다.
실시예 5. 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc와 ANG2 결합의 친화도
본 실시예는 ELISA 검출 방법으로 10개의 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc 친화도를 평가한다.
ANG2 단백질 용액을 각각 2μl/웰로 ELISA 플레이트를 코팅하고, 4℃에서 밤새 놓아 두며; 상층액을 버리고, 각 웰에 차단액(3% BSA를 함유한 PBS) 300μl를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 차단하며; 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc를 구배 희석하며, 희석액은 1% BSA의 PBS이다. 예를 들어, 희석의 초기 농도는 500nM이고, 10배 희석하며, 8개의 농도 구배로 희석한다. 희석된 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc를 웰당 200μl씩 ELISA 플레이트의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 정치 배양시키고, 상층액을 버리며; 200μl/웰의 PBST(PBS는 0.1% Tween 20을 함유)로 3회 세척하고; 희석된 HRP 라벨된 항 인간 Fc 이차 항체(SIGMA, A8667)를 첨가하고, 이차 항체는 1:20000으로 희석한 후 사용하며, 희석액은 1% BSA의 PBS이고, 부피는 100μl/웰이며, 실온에서 1시간 동안 배양하고; 200μl/웰의 PBST로 5회 세척하며; TMB 발색액(BD, 55214) 100μl/웰을 첨가하여, 37℃에서 8분 동안 발색시킨다. 2M의 HCl 정지액 100μl/웰을 넣고, 정지액을 첨가한 후, 30분 내에 마이크로플레이트 리더기로 450nm에서의 값을 판독한다. GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 친화도를 피팅하여 EC50 값을 얻으며, 그 결과는 도 1, 도 2 및 표 5에 나타낸 바와 같다. B2-E2-Fc는 인간 ANG2 및 원숭이 ANG2 단백질에 대한 친화도가 가장 높다.
표 5. ANG2 단백질에 대한 중쇄 단일 도메인 항체의 친화도
실시예 6. 항-ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc가 hANG2와 그 수용체 hTIE2의 결합을 억제
100μL의 2μg/mL로 PBS에서 제조된 hTIE2-Fc(Novoprotein, CW98)로 96웰 플레이트를 처리하고 4℃에서 밤새 배양한다. 그런 다음 플레이트를 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS 세척 완충액으로 3회 세척하고, 1% BSA를 함유하는 300μL의 PBS를 첨가하여 2시간 동안 차단한다. 측정할 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc를 희석하고, 최종 농도가 10μg/mL인 hANG2와 혼합하며, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 항원-항체 혼합물을 96웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS 세척 완충액으로 세척한 후, 희석된 HRP 라벨된 항 His 이차 항체(Proteintech, 66005-1-Ig)를 첨가하고, 이차 항체는 1:2000으로 희석하여 사용하며, 희석액은 1% BSA의 PBS이고, 부피는 100μl/웰이며, 실온에서 1시간 동안 배양하고; 200μl/웰의 PBST로 5회 세척하며; TMB 발색액(BD, 55214) 100μl/웰을 첨가하여, 37℃에서 8분 동안 발색시킨다. 2M의 HCl 정지액 100μl/웰을 넣고, 정지용액을 첨가한 후, 30분 내에 마이크로플레이트 리더기로 450nm에서의 값을 판독한다. GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 친화도를 피팅하여 EC50 값을 얻으며, 그 결과는 도 3에 도시된 바와 같고, B2E2-Fc는 인간 ANG2와 그 수용체 TIE2의 결합에 현저한 억제 효과가 있다.
실시예 7: 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc의 산 안정성 및 열 안정성 평가
아래의 산 안정성 및 열 안정성 평가 방법에 따라 B2-E2-Fc에 대해 평가한다. 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc 분자에 대해 protein A 친화성 크로마토그래피를 수행할 때, 산 용리 단계(pH 3.5의 시트르산 완충액을 사용)에서 용리된 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc 용액을 중화하지 않으며, 해당 완충액에서 일정 시간 유지한 후, 30분이 되었을 때 시료를 채취하여 1/10 부피의 1M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가하여 중화하고, 해당 시료에 대한 HPLC-SEC 검출을 수행한다. 항체 분자는 pH 3.5에서 30분 동안 처리한 후에도 응집되거나 분해되는 현상이 나타나지 않았으며, 순도 변화가 4% 미만으로, 산성 환경에서 안정성을 유지할 수 있음을 나타낸다. 또한, 40℃의 배양기에서 14일 동안 배양한 후, 해당 시료의 HPLC-SEC 검출을 수행하였고, 응집이나 분해는 없었으며, 순도 변화는 4% 미만으로 40℃ 환경에서 안정성을 유지할 수 있음을 나타낸다. 표 6 및 표 7의 결과에서 보여주는 바와 같이, B2-E2-Fc는 우수한 산 안정성 및 열 안정성을 가진다.
표 6. 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc의 산 안정성 평가 결과
표 7. 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체-Fc의 열 안정성 평가 결과
실시예 8. 이중 특이적 항체의 구축 및 응용
(1) 이중 특이적 항체의 구축
표 8에 나타낸 이중 특이적 항체의 아미노산 서열에 따라, DNA 코딩의 역번역 및 DNA 단편의 합성을 수행하고, 발현 벡터 pcDNA3.1에 구축하며, 293 또는 CHO 세포로 일시적 형질감염시켜 발현하도록 한다. 상층액을 수집하고 단백질 정제를 수행하여 95% 이상의 순도를 갖는 이중 특이적 항체 Y400C 및 Y400E를 얻었다. 구체적인 벡터의 구축, 일시적 형질감염 및 단백질 정제 방법은 전술한 각 실시예를 참조하면 된다. 상기 이중 특이적 항체의 구조는 경쇄 및 중쇄를 포함하되, 여기서 경쇄-중쇄는 페어링되어 사슬간 이황화 결합을 형성하고, 두 개의 중쇄는 페어링되어 사슬간 이황화 결합을 형성하며, 여기서 중쇄는 (VH)-(CH1)-(힌지 영역)-(Fc)-(연결 펩티드)-(VHH)이고, 경쇄는 (VL)-(경쇄 불변 영역)이며, VH 및 VL는 항 VEGF 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이고, VHH는 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체의 가변 영역이다.
표 8: 이중 특이적 항체의 아미노산 서열(Numbering scheme IMGT)
(2) 이중 특이적 항체의 열 안정성 고찰
이중 특이적 항체를 40℃의 배양기에서 14일 또는 28일 동안 처리한 후, 해당 시료에 대한 HPLC-SEC 검출을 수행한다. 그 결과, 본 발명의 항체 분자는 40℃에서 28일 동안 처리한 후에도 응집되거나 분해되는 현상이 나타나지 않았으며, 순도 변화가 4% 미만으로 표 9에 나타낸 바와 같이 40℃ 환경에서 안정성을 유지할 수 있음을 알 수 있다.
표 9: 항체의 열 안정성 평가 결과
결과에서 보여주는 바와 같이, 이중 항체 분자 Y400C 및 Y400E는 모두 우수한 열 안정성을 가진다.
(3) 이중 특이적 항체와 hANG2의 결합
Sensor Chip Protein A 칩(GE, 제품 번호: 28995056)을 사용하여 시험 항체를 포획하고, 항원 인간 ANG2 단백질(623-AN-025/CF, R&D)을 분석물로 사용하여 그와 시험 샘플의 결합에 대한 동역학 및 친화도 데이터를 검출한다. 항원과 시험 샘플의 결합의 검출 시작 농도는 10nM이며, 이 기초상에서, 2배의 구배희석을 수행하고, 즉 항원 희석의 농도는 각각 10nM, 5nM, 2.5nM, 1.25nM, 0.625nM이며, 항원은 저농도에서 고농도의 방식으로 순차적으로 주입하고, 1개의 음성 대조군(즉 1×HBS-EP+buffer)과 1개의 반복농도(일반적으로 최저농도로 반복)를 설정하며, 주입 전 최소 3회 Start up(1×HBS-EP+buffer)의 세척 과정을 수행하여 시스템의 균형을 맞추고, 항원과 시험 샘플의 결합 및 해리 경향을 검출하고, 해리가 완료된 후, 재생시약을 주입하여 칩을 재생하고, 칩 재생이 완료된 후, 그 다음의 농도를 검출한다. 검출이 완료된 후, 데이터 분석 소프트웨어(Biacore T200 Evaluation Software)의 1:1 Binding 피팅 방법을 사용하여 데이터 피팅을 수행하고 그 결과를 표 10에 나타내었다.
표 10: 항체의 인간 ANG2 친화도 검측 결과
인간 ANG2와의 친화도 검측 결과에서 보여주는 바와 같이, 이중 특이적 항체는 인간 ANG2에 대해 강한 친화도를 가진다.
(4) 이중 특이적 항체가 hANG2와 HUVEC 세포의 결합을 억제
성장 상태가 좋은 HUVEC 세포(H-003, Allcells)를 사용하여 단세포 현탁액을 제조한다. 세포 계수(cell counting) 후, 105개 세포/웰로 96웰 플레이트에 도포하고; 인간 ANG2 단백질(623-AN-025/CF, R&D)의 최종 농도를 10μg/ml로 고정하며, 실험 설계에 따라 각 웰에 검출할 항체를 첨가하고, 항체의 최고 농도는 1000nM이며, 순차적으로 5배 희석하여 총 7개의 농도 구배를 설정하고, 또한 블랭크 대조군과 양성 대조군 RG7716(ATAD00534, Atagenix)을 설정하며; 세포를 실온에서 30분간 배양한 후, 각 웰의 세포를 3회 세척하고 재현탁시키며, 이후, 형광 라벨된 이차 항체 PEanti-His(362603, Biolegend)를 첨가하고, 실온에서 빛을 차단하여 30분간 배양하며; 각 웰 세포를 3회 세척하고 재현탁한 후, 유세포 분석기로 검출한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 이중 특이적 항체 Y400C 및 Y400E는 대조군 양성 항체보다 ANG2 및 HUVEC 세포에 대한 차단 활성이 더 우수하였다.
표 11: 항체가 인간 ANG2와 HUVEC 결합을 억제하는 생물학적 활성
(5) 이중 특이적 항체가 hANG1과 HUVEC 세포의 결합을 억제하지 않음
ANG1/ANG2-TIE2 신호 경로와 관련된 생물학적 기능에서, ANG1 활성의 보존은 일부 항혈관신생 치료에 유익하다. 따라서, 본 발명의 항체는 ANG2에 특이적으로 결합하지만 ANG1에는 결합하지 않으며, ANG2와 그 수용체 TIE2의 결합만 억제하고, ANG1과 그 수용체 TIE2의 결합은 억제하지 않는다. 본 발명의 항체는 ANG2의 혈관신생 촉진 활성의 억제 및 혈관신생 과정으로 인한, 또는 이와 관련된 질병 및 병증의 치료에 특히 유용하다.
성장 상태가 좋은 HUVEC 세포(H-003, Allcells)를 사용하여 단세포 현탁액을 제조한다. 세포 계수 후, 105개 세포/웰로 96웰 플레이트에 도포하여 넣고; 인간 ANG1 단백질(623-AN/CF, R&D)의 최종 농도를 10μg/ml로 고정하며, 실험 설계에 따라 각 웰에 검출할 항체를 첨가하고, 항체의 최고 농도는 1000nM이며, 순차적으로 5배 희석하여 총 7개의 농도 구배를 설정하고, 또한 블랭크 대조군과 양성 대조군 hTIE2-Fc(Novoprotein, CW98)을 설정하며; 세포를 실온에서 30분간 배양한 후, 각 웰의 세포를 3회 세척하고 재현탁시키며, 이후 형광 라벨된 이차 항체 PEanti-His(362603, Biolegend)를 첨가하고, 실온에서 빛을 차단하여 30분간 배양하며; 각 웰 세포를 3회 세척하고 재현탁한 후, 유세포 분석기로 검출한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 이중 특이적 항체 Y400C 및 Y400E는 ANG1과 HUVEC 세포에 대한 결합 차단 활성이 없었다.
(6) 이중 특이적 항체가 hANG2가 의존하는 HUVEC 세포의 AKT 인산화를 억제
HUVEC 세포 표면에서 ANG2 단백질의 수용체가 자연적으로 발현되고, ANG2가 세포 표면 수용체와 결합하면, AKT 인산화 반응을 활성화한다. Phospho-AKT 분석 키트(64AKSPE 1-1, Cisbio)에는 두 가지의 라벨된 항체가 포함되며, 그 중 하나는 공여자 형광단(donor fluorophore)이 있는 항체이고, 다른 하나는 수용체가 있는 항체이다. 제1 항체를 선택한 이유는 단백질의 인산화 모티프와의 특이적인 결합 때문이고, 제2 항체를 선택한 이유는 단백질을 인식하는 능력이 인산화 상태와는 무관하기 때문이다. 단백질의 인산화는 면역 복합체의 형성이 라벨된 항체와 관련되게 할 뿐만 아니라, 공여자의 형광단이 수용체에 가깝게 하여 신호를 생성하도록 한다. 본 실험에서, HUVEC 세포는 연속 희석된 시료 및 고정된 농도의 ANG2와 함께 공동 배양된다. HUVEC 세포의 AKT 인산화 정도를 통해, ANG2 기능 활성 및 ANG2 기능 활성에 대한 시료의 억제 효과를 평가한다. 성장 상태가 좋은 HUVEC 세포(70013502, ATCC)를 단일 세포 현탁액으로 제조한다. 세포 계수 후, 105개 세포/웰로 96웰 플레이트에 도포하고; 인간 ANG2 단백질(623-AN-025/CF, R&D)의 최종 농도를 10μg/ml로 고정하며, 실험 설계에 따라 각 웰에 검출할 항체를 첨가하고, 항체의 최고 농도는 1000nM이며, 순차적으로 5배 희석하여 총 8개의 농도 구배를 설정하고, 또한 블랭크 대조군과 양성 대조군 RG7716(ATAD00534, Atagenix)을 설정하고; 세포를 37℃에서 10분 동안 배양한 후, 웰 내의 상층액을 제거하고, 용해액을 첨가한 후, 상온에서 30분간 진탕 배양하며, 세포 용해액을 취하여 384웰 플레이트에 넣고, 검출 시약을 첨가하고, 빛을 차단하여 4시간 동안 배양하며, PHERAstar를 사용하여 검출을 수행한다. 도 6에 도시된 바와 같이, 이중 특이적 항체 Y400C 및 Y400E는 대조군 양성 항체보다 hANG2가 의존하는 HUVEC 세포의 AKT 인산화에 대한 억제 활성이 더 우수하였다.
표 12: 항체가 인간 ANG2가 의존하는 HUVEC 세포의 AKT 인산화를 억제
본 발명에서 언급한 모든 문헌은 본 출원에서 참조로 인용되며, 각 문헌이 개별적으로 참조로 인용되는 것과 같다. 또한, 본 발명의 상기 설명된 내용을 읽은 후, 본 분야의 당업자는 본 발명을 다양하게 변경 또는 수정할 수 있으며, 이러한 등가 형태도 마찬가지로 본 출원에 첨부된 청구범위에서 한정한 범위에 속함을 이해할 수 있을 것이다.
Claims (14)
- 서열번호 1-10 중 어느 하나로 표시되는 중쇄 가변 영역에 포함된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 또는 그 변이체를 포함하고,
바람직하게는, IMGT 넘버링 시스템에 따라, 다음 각 항으로 구성된 군에서 선택된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는, 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체:
(1) 서열번호 21로 표시되는 HCDR1, 서열번호 22로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 HCDR3;
(2) 서열번호 34로 표시되는 HCDR1, 서열번호 35로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 HCDR3;
(3) 서열번호 37로 표시되는 HCDR1, 서열번호 38로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 39로 표시되는 HCDR3;
(4) 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 41로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 42로 표시되는 HCDR3, 또는 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 41로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 42로 표시되는 HCDR3의 변이체, 및 그 조합, 상기 변이체는 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 41로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 42로 표시되는 HCDR3에 비해, 각각 하나 이상(바람직하게는 1개, 2개 또는 3개)의 보존적 아미노산 돌연변이(바람직하게는 치환, 삽입 또는 결실)를 구비하며 ANG2에 대한 결합 친화도를 유지하는 아미노산 서열이고,
바람직하게는, 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 41로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 42로 표시되는 HCDR3이고, 여기서 서열번호 40으로 표시되는 CDR1에서 5번 내지 8번 위치 및 10번 내지 11번 위치의 아미노산, 서열번호 41로 표시되는 CDR2에서 2번 내지 5번 위치의 아미노산 및 7번 위치의 아미노산, 서열번호 42로 표시된 CDR3에서 1번 위치의 아미노산, 3번 내지 8번 위치의 아미노산은 아미노산 X에서 선택되고, 상기 아미노산 X는 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 구성된 군에서 선택되며,
바람직하게는, 서열번호 40으로 표시되는 HCDR1의 변이체이고, 여기서 1번 위치의 글리신 G는 Ala, Val, Leu 및 Ile로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 대체될 수 있고; 2번 위치의 페닐알라닌 F는 Tyr로 대체될 수 있으며; 3번 위치의 프롤린 P는 Trp 및 His로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 대체될 수 있고; 4번 위치의 Ser은 Thr로 대체될 수 있으며; 9번 위치의 Ser은 Thr로 대체될 수 있고; 12번 위치의 Gln은 Asn로 대체될 수 있으며,
서열번호 41로 표시되는 HCDR2의 변이체이고, 1번 위치의 Ile는 Ala, Val, leu 및 Gly로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 대체될 수 있고; 6번 위치의 Leu는 Ile로 대체될 수 있고; 8번 위치의 Lys는 Arg로 대체될 수 있으며,
서열번호 42로 표시되는 HCDR3의 변이체이고, 여기서 2번 위치의 Val는 Ala, Gly, Leu 및 Ile로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 대체될 수 있고; 9번 위치의 Asp는 Glu로 대체될 수 있으며;
(5) 서열번호 43으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 44로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 45로 표시되는 HCDR3;
(6) 서열번호 46으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 44로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 48로 표시되는 HCDR3;
(7) 서열번호 49로 표시되는 HCDR1, 서열번호 44로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 48로 표시되는 HCDR3;
(8) 서열번호 52로 표시되는 HCDR1, 서열번호 44로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 48로 표시되는 HCDR3; 및
(9) 서열번호 55로 표시되는 HCDR1, 서열번호 56으로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 57로 표시되는 HCDR3. - 제1항에 있어서,
상기 ANG2는 인간 ANG2, 토끼 ANG2, 또는 원숭이 ANG2로부터 선택되는 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1-10 중 어느 하나로 표시되는 서열 또는 서열번호 1-10 중 어느 하나에 따른 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 가지며 ANG2 결합 활성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 구성되는 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체. - 재조합 단백질에 있어서,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체를 포함하고, 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 생물학적 활성 물질을 더 포함하며, 예를 들어 효소 활성을 갖는 독소 또는 그 활성 단편(예: 아브린(Abrin), 리신(Ricin) A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소), 종양 괴사 인자 또는 인터페론(예: IFN-γ), 생물학적 반응 조절물질(예: 림포카인, IL-2, IL-2, IL2-6, IL-10, 및 GM-CSF), Fc 단편(예를 들어 IgG(예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM의 Fc 영역에서 유래되고, 예를 들어 인간, 토끼 또는 원숭이의 IgG, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM의 Fc 영역에서 유래됨)을 포함하고, 바람직하게는, 상기 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체와 상기 Fc 단편은 연결 펩티드를 통해 연결되며, 바람직하게는, 상기 연결 펩티드는 (GGGGS)n이고, n=1, 2 또는 3이며, 바람직하게는, 상기 Fc 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이고, 더욱 바람직하게는 GenBank No. AK303185.1로 표시되는 Fc 단편이며, 더욱 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 서열번호 11-20으로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되는 재조합 단백질. - 다중 특이적 항체에 있어서,
바람직하게는 이중 특이적 항체이고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체를 포함하고, 바람직하게는 상기 이중 특이적 항체의 구조는, 경쇄 및 중쇄를 포함하며, 여기서 경쇄-중쇄가 페어링되어 사슬간 이황화 결합을 형성하고, 두 개의 중쇄가 페어링되어 사슬간 이황화 결합을 형성하며, 여기서 중쇄는 (VH)-(CH1)-(힌지 영역)-(Fc)-(연결 펩티드)-(VHH)이고, 경쇄는 (VL)-(경쇄 불변 영역)인 다중 특이적 항체. - 제5항에 있어서,
VHH는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 단일 도메인 항체이고, VH 및 VL는 두 번째 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이며, 바람직하게는 상기 두 번째 항체가 표적으로 하는 항원은 면역세포 표면 항원, 종양 항원, 바이러스, 세균, 내독소, 사이토카인 또는 그 조합에서 선택되고; 더욱 바람직하게는, PD-L1, PD-1, VEGFA, IL-10, IL-10R, BCMA, VEGF, TGF-β, CTLA-4, LAG-3, TIGIT, CEA, CD38, SLAMF7, B7-H3, Her2, EpCAM, CD19, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, EGFR, GD2, GD3, GM2, RANKL, CD3, 및/또는 CD16a로부터 선택되며, 바람직하게는 두 번째 항체가 표적으로 하는 항원은 VEGF이고, 더욱 바람직하게는 두 번째 항체는 항 VEGF 항체에서 선택되며, 상기 항 VEGF 항체는 서열번호 24로 표시되는 중쇄 가변 영역에 포함된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3(바람직하게는 IMGT 넘버링 시스템에 따라, 서열번호 50으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 51로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 HCDR3을 포함함) 및 서열번호 27로 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3(바람직하게는 IMGT 넘버링 시스템에 따라, 서열번호 54로 표시되는 LCDR1, 서열번호 58로 표시되는 LCDR2 및 서열번호 59로 표시되는 LCDR3을 포함함)을 포함하고, 더욱 바람직하게는, 상기 항 VEGF 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 24로 표시되는 서열 또는 서열번호 24로 표시되는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되며; 상기 항 VEGF 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 27로 표시되는 서열 또는 서열번호 27로 표시되는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되는 다중 특이적 항체. - 제5항 또는 제6항에 있어서,
CH1의 서열은 서열번호 25로 표시된 바와 같고, 힌지 영역의 서열은 서열번호 26으로 표시된 바와 같으며, Fc 불변 영역의 서열은 서열번호 29로 표시된 바와 같고, 연결 펩티드의 서열은 서열번호 30 또는 서열번호 47로 표시된 바와 같으며, 경쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 28로 표시된 바와 같은 다중 특이적 항체. - 폴리뉴클레오티드에 있어서,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4항에 따른 재조합 단백질, 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드. - 제8항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제9항에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포.
- 접합체에 있어서,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4항에 따른 재조합 단백질, 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체, 및 접합부분을 포함하고, 여기서, 상기 접합부분은 정제 태그(예: His태그), 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 효소 또는 그 조합이며; 바람직하게는, 상기 접합부분은 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광물질, 유색물질, 화학요법제, 생물학적 독소, 폴리에틸렌글리콜 또는 효소인 접합체. - 키트에 있어서,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4항에 따른 재조합 단백질, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11항에 따른 접합체를 포함하고; 바람직하게는, 상기 키트는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4항에 따른 재조합 단백질, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11항에 따른 접합체를 특이적으로 식별하는, 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 재조합 단백질 또는 다중 특이적 항체를 더 포함하고; 선택적으로, 상기 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 재조합 단백질 또는 다중 특이적 항체는, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광물질, 유색물질 또는 효소와 같은 검출 가능한 마커를 더 포함하고; 바람직하게는, 상기 키트는 시료 내 ANG2의 존재 또는 그 수준을 검출하는 데 사용되고; 또는
(1) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4항에 따른 재조합 단백질, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11항에 따른 접합체; 및 (2) 기타 항원에 대한 항체 또는 그 항원 결합 단편, 및/또는 세포독성제, 및/또는 화학요법 약물, 및 선택적으로, 사용설명서를 포함하는 키트. - 약학적 조성물에 있어서,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4항에 따른 재조합 단백질, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11항에 따른 접합체를 포함하고; 선택적으로, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 벡터 및/또는 부형제를 더 포함하며; 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 피하 주사, 피내 주사, 정맥 주사, 근육 주사 또는 병소 내 주사를 통한 투여에 적합한 형태인 약학적 조성물. - ANG2의 혈관신생 촉진 활성의 억제, 혈관신생 과정으로 인한 또는 이와 관련된 질병, 예를 들어 안저 신생혈관성 질환, 류마티스관절염 및 건선, 및/또는 종양의 예방 및/또는 치료에서의; 또는, ANG2의 혈관신생 촉진 활성의 억제, 혈관신생 과정으로 인한 또는 이와 관련된 질병, 예를 들어 안저 신생혈관성 질환, 류마티스관절염 및 건선, 및/또는 종양의 예방 및/또는 치료에 사용되는 약물 제조에서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항 ANG2 중쇄 단일 도메인 항체, 제4항에 따른 재조합 단백질, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제11항에 따른 접합체의 용도.
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