BR112013025304B1 - Molécula de ligação biespecífica, seu método de fabricação e composição farmacêutica - Google Patents

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Abstract

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO BIESPECÍFICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO. A presente invenção refere-se a moléculas de ligação biespecíficas que ligam a VEGF e Ang2, preferivelmente na forma de domínios variáveis simples da imunoglobulina como VHHs e anticorpos de domínio, composições farmacêuticas contendo as mesmas e seu uso no tratamento de doenças que estão associadas com efeitos mediados por VEGF e/ou Ang2 em angiogênese são revelados. Ainda, os ácidos nucleicos que codificam as moléculas de ligação biespecíficas, células hospedeiras e métodos para preparar as mesmas são também descritos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a campo de terapia humana, em particular terapia de câncer e agentes e composições úteis em tal terapia.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Quando os tumores alcançam um tamanho crítico de aproxi madamente 1 mm3, eles ficam dependentes em angiogênese para manter a provisão de sangue com oxigênio e nutrientes para permitir mais crescimento. Terapias antiangiogênese se tornaram uma opção de tratamento importante para vários tipos de tumores. Estas terapias focalizaram em bloquear a via de VEGF (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. maio de 2004;3(5):391-400.) neutralizando VEGF (Avastin) ou seus receptores (Sutent e Sorafinib). Estudos recentes em camundongos mostraram que a Angiopoietina2 (Ang2), um ligante do receptor de Tie2, controla a remodelagem vascular permitindo as funções de outros fatores angiogênicos, tais como VEGF. Ang2 é expressado primariamente por células endoteliais, fortemente induzidas por hipoxia e outros fatores angiogênicos e foi demonstrado regular a plasticidade vascular do tumor, permitindo os vasos a responder a VEGF e FGF2 (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. março de 2009;10(3):165-77). Consistente com este papel, a deleção ou inibição de Ang2 resulta em angiogênese reduzida (Gale et al., Dev Cell. setembro de 2002;3(3):302-4) (Falcón et al., Am J Pathol. novembro de 2009;175(5):2159-70). Concentrações elevadas de Ang2 em soro foram relatadas para pacientes com câncer colorretal, NSCLC e melanoma (Goede et al., Br J Cancer. 26 de outubro de 2010;103(9):1407-14), (Park et al., Chest. julho de 2007;132(1):200-6), (Helfrich et al., Clin Cancer Res. 15 de fevereiro de 2009;15(4):1384-92). Em câncer CRC, os níveis séricos de Ang2 correlatam com a resposta terapêutica à terapia de anti-VEGF.
[0003] O sistema de Ang-Tie consiste em 2 receptores (Tie1 e Tie2) e 3 ligantes (Ang1, Ang2 e Ang4) (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. março de 2009;10(3):165-77.). Tie2, Ang1 e Ang2 são os melhores membros estudados desta família, Tie1 é um receptor de órfão e o papel de Ang4 para remodelagem vascular ainda precisa ser definido. Ang2 e Ang1 medeiam funções opostas sob ligação e ativação de Tie2. Ativação de Tie2 mediada por Ang2 resulta em ativação das células endote- liais, dissociação dos perícitos, vazamento vascular e indução de brota- mento de vasos. Em contraste com Ang2, a sinalização de Ang1 mantém a integridade do vaso mediante recrutamento de perícitos, assim mantendo quietude das células endoteliais.
[0004] Angiopoietina 2 (Ang2) é um ligante de 66 kDa segregado para a tirosina cinase do receptor de Tie2 (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. março de 2009;10(3):165-77.). Ang2 consiste em um domínio coiled-coil N-terminal e um domínio fibrinogênio-símile C-terminal, o último é requerido para interação de Tie2. Ang2 é expressado primariamente através das células endoteliais e fortemente induzido por hipoxia e outros fatores angiogênicos, incluindo VEGF. Tie2 é encontrado em células endoteliais, células-tronco hematopoiéticas e células tumorais. Ang2-Tie2 foi demonstrado regular a plasticidade vascular do tumor, permitindo os vasos responderem a VEGF e FGF2.
[0005] Ang2 in vitro foi mostrado atuar como um mitógeno modesto, quimioatrativo e indutor da formação de tubo em células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). Ang2 induz fosforilação de tirosina de Tie2 ectopicamente expresso em fibroblastos e promove eventos de sinalização a jusante, tais como fosforilação de ERK-MAPK, AKT e FAK em HUVEC. Um papel antagonístico de Ang2 em respostas de células endoteliais induzidas por Ang1 foi descrito.
[0006] Deficiência de Ang2 foi mostrada resultar em um defeito de padronização linfático profundo em camundongos. Embora a perda de Ang2 seja dispensável para o desenvolvimento vascular embrionário, camundongos deficientes de Ang2 têm defeitos vasculares persistentes na retina e rim. Junto com o padrão dinâmico da expressão de Ang2 em sítios da angiogênese (por exemplo, ovário), estes achados indicam que Ang2 controla a remodelagem vascular permitindo as funções de outros fatores angiogênicos, tais como VEGF.
[0007] O sistema de Ang2-Tie2 exerce papéis cruciais durante a troca angiogênica e estágios posteriores da angiogênese tumoral. Expressão de Ang2 é fortemente suprarregulada no endotélio associado ao tumor. Crescimento reduzido dos tumores foi observado quando implantado em Camundongos deficientes de Ang2, especialmente durante estágios prematuros do crescimento do tumor. Bloqueio terapêutico de Ang2 com mAbs de Ang2 mostrou eficácia vasta em uma variedade de modelos de xenoenxerto de tumor. Efeitos aditivos de mAbs de Ang2 com inibidores de VEGFR2 (mAbs e inibidores de peso molecular pequeno) foram descritos.
[0008] Como descrito, por exemplo, na US2008/0014196 e no WO2008/101985, a angiogênese está implicada na patogênese de vários distúrbios, incluindo tumores sólidos e metástase como também doenças oculares. Um dos fatores pró-angiogênicos mais importantes é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), também denominado VEGF-A ou fator de permeabilidade vascular (VPF). VEGF pertence a uma família de genes que inclui fator de crescimento de placenta (PlGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E e VEGF-F. Splicing alternativo de mRNA de um gene simples de VEGF humano resulta em pelo menos seis isoformas (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189, e VEGF206), VEGF165 que é a isoforma mais abundante.
[0009] Dois receptores de VEGF tirosina cinase (VEGFR) foram identificados que interagem com VEGF, isto é, VEGFR-1 (também conhecido como FIt-1) e VEGFR-2 (também conhecido como KDR ou FIK- 1). VEGFR-1 tem a afinidade mais alta por VEGF, enquanto VEGFR-2 tem uma afinidade um pouco mais baixa por VEGF. Ferrara (Endocrine Rev. 2004, 25: 581-611) fornece uma descrição detalhada de VEGF, a interação com seus receptores e sua função em processos normais e patológicos pode ser encontrada em Hoeben et al. Pharmacol. Rev. 2004, 56: 549-580.
[00010] VEGF foi relatado ser um regulador pivotante da angiogê- nese normal e anormal (Ferrara e Davis-Smyth, Endocrine Rev. 1997, 18: 4-25; Ferrara J. MoL Med. 1999, 77: 527-543). Comparado a outros fatores de crescimento que contribuem para os processos de formação vascular, VEGF é único em sua especificidade alta a células endoteliais dentro do sistema vascular.
[00011] mRNA de VEGF é supraexpressado pela maior parte dos tumores humanos. No caso de crescimento do tumor, a angiogênese parece ser crucial para a transição de hiperplasia para neoplasia, e para prover nutrição para o crescimento e metástase do tumor (Folkman et al., 1989, Nature 339-58) que permite as células tumorais adquirir uma vantagem de crescimento comparada às células normais. Portanto, terapias antiangiogênese se tornaram uma opção de tratamento importante para vários tipos de tumores. Estas terapias focalizaram em bloquear a via de VEGF (Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. maio de 2004; 3(5): 391-400.
[00012] VEGF está também envolvido em doenças oculares. A concentração de VEGF em fluidos do olho está altamente correlatada com a presença de proliferação ativa dos vasos sanguíneos em pacientes com diabete e outras retinopatias relacionadas à isquemia. Além disso, estudos recentes demonstraram a localização de VEGF em membranas neovasculares coroidais em pacientes afetados por degeneração macular relacionada à idade (AMD). Para suprarregulação de VEGF tem também sido observada em vários distúrbios inflamatórios. VEGF esteve implicado na patogênese de artrite reumatoide, uma doença inflamatória em que a angiogênese representa um papel significativo.
[00013] A elucidação de VEGF e seu papel em angiogênese e processos diferentes forneceu um novo alvo potencial de intervenção terapêutica. A função de VEGF foi inibida por moléculas pequenas que bloqueiam ou impedem a ativação das tirosina cinases do receptor de VEGF (Schlaeppi e Wood, 1999, Cancer Metastasis Rev., 18: 473-481) e por conseguinte interfere com a via de transdução de sinal do receptor de VEGF. Conjugados citotóxicos contendo toxinas bacterianas ou vegetais podem inibir o efeito estimulante de VEGF em angiogênese tumoral. Conjugados de toxina de VEGF-DT385 (domínios de toxina de difteria fundidos ou quimicamente conjugados com VEGF165), por exemplo, eficientemente inibem o crescimento do tumor in vivo. Inibição do crescimento do tumor pôde ser também alcançado liberando um mutante de FIk-1 ou receptores de VEGF solúveis por um retrovírus.
[00014] Anticorpos neutralizantes de VEGF, tais como A4.6.l e MV833, foram desenvolvidos para bloquear VEGF de ligar a seus receptores e mostraram atividade antitumoral pré-clínica (Kim et al. Nature 1993, 362: 841-844; Folkman Nat. Med. 1995, 1: 27-31; Presta et al. Cancer Res. 1997, 57: 4593-4599; Kanai et al. Int. J. Cancer 1998, 77: 933-936; Ferrara e Alitalo Nat. Med. 1999, 5: 1359-1364; 320, 340. Para uma revisão de experimentações terapêuticas de abordagens de anti- VEGF, vide Campochiaro e Hackett (Oncogene 2003, 22: 6537-6548).
[00015] A maioria das experiências clínica foi obtida com A4.6.1, também chamado bevacizumab (Avastin®; Genentech, São Francisco, CA).
[00016] O WO2008/101985 descreve domínios variáveis simples da imunoglobulina de camelídeos (VHHs ou "Nanobodies®, como definidos aqui) que ligam ao VEGF, e seu uso no tratamento de condições e doenças caracterizadas por angiogênese excessiva e/ou patológica ou neovascularização.
[00017] Foi um objetivo da presente invenção fornecer novas moléculas de ligação antiangiogênicas para terapia humana.
[00018] Foi um objetivo adicional da invenção fornecer métodos para a prevenção, tratamento, alívio e/ou diagnose de tais doenças, distúrbios ou condições, envolvendo o uso e/ou administração de tais moléculas de ligação e composições compreendendo as mesmas. Em particular, foi um objetivo da invenção fornecer tais moléculas de ligação far- macologicamente ativas, composições e/ou métodos que fornecem vantagens comparadas aos agentes, composições e/ou métodos correntemente usados e/ou conhecidos na técnica. Estas vantagens incluem propriedades terapêuticas e/ou farmacológicas melhoradas e/ou outras propriedades vantajosas, por exemplo, para propósitos de fabricação, especialmente quando comparados a anticorpos convencionais como aqueles descritos acima, ou fragmentos dos mesmos.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00019] De acordo com um primeiro aspecto, são fornecidas moléculas de ligação biespecíficas, preferivelmente imunoglobulinas biespecí- ficas, preferivelmente domínios variáveis simples da imunoglobulina como VHHs e anticorpos de domínio, compreendendo pelo menos um componente de ligação a VEGF e pelo menos um componente de ligação a Ang2 em uma molécula simples. Preferivelmente, as ditas moléculas de ligação biespecíficas ainda compreendem um componente de ligação à albumina sérica.
[00020] Mais especificamente, uma molécula de ligação biespecífica da invenção essencialmente compreende (i) um componente de ligação a Ang2 que especificamente liga a pelo menos um epítopo de Ang2 e (ii) um componente de ligação a VEGF que especificamente liga a pelo menos um epítopo de VEGF, em que os componentes são ligados entre si em um tal modo que eles ligam simultaneamente a Ang2 e VEGF ou que eles ligam a Ang2 ou VEGF um de cada vez.
[00021] De acordo com aspectos preferidos da invenção, os dois componentes compreendem um ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina que podem ser, independentemente um do outro, VHHs ou anticorpos de domínio, e/ou qualquer outro tipo de domínios variáveis simples da imunoglobulina, tais como domínios VL, como definidos aqui, contanto que cada um destes domínios variáveis simples da imunoglo- bulina liguem ao antígeno, isto é, Ang2 ou VEGF, respectivamente.
[00022] De acordo com uma modalidade preferida, os domínios variáveis simples da imunoglobulina são do mesmo tipo, em particular, todos os domínios variáveis simples da imunoglobulina são VHHs ou anticorpos de domínio.
[00023] De acordo com uma modalidade particularmente preferida, todos os domínios variáveis simples da imunoglobulina são VHHs, preferivelmente VHHs humanizados (ou "otimizados na sequência", como definidos aqui). Consequentemente, a invenção diz respeito às moléculas de ligação biespecíficas compreendendo um VHH de anti-Ang2 (opcionalmente humanizado ou otimizado na sequência) e um VHH de anti- VEGF (opcionalmente humanizado ou otimizado na sequência).
[00024] Porém, estará claro à pessoa versada que o ensinamento aqui pode ser aplicado analogamente às moléculas de ligação biespe- cíficas incluindo outros domínios variáveis simples da imunoglobulina anti-Ang2 ou anti-VEGF, tais como anticorpos de domínio.
[00025] Em outro aspecto, a invenção diz respeito a ácidos nucleicos que codificam as moléculas de ligação biespecíficas da invenção como também células hospedeiras contendo as mesmas.
[00026] A invenção ainda diz respeito a um produto ou composição contendo ou compreendendo pelo menos uma molécula de ligação biespecífica da invenção e opcionalmente um ou mais componentes adicionais de tais composições.
[00027] A invenção ainda diz respeito a métodos para preparar ou gerar as moléculas de ligação biespecíficas, ácidos nucleicos, células hospedeiras, produtos e composições descritos aqui.
[00028] A invenção ainda diz respeito a aplicações e usos das moléculas de ligação biespecíficas, ácidos nucleicos, células hospedeiras, produtos e composições descritos aqui, como também a métodos para a prevenção e/ou tratamento para doenças e distúrbios que podem ser modulados pela inibição de Ang2.
[00029] Foi descoberto que o componente de ligação a Ang2 das moléculas de ligação biespecíficas de acordo com a presente invenção liga e antagoniza Ang2 com uma potência pelo menos 5.000 vezes mais alta, preferivelmente 10.000 vezes mais alta que a Ang1 ou Ang4. Isso evitará em grande parte ativação do bloqueio da sinalização mediada por Ang1, que poderia opor-se ao efeito antiangiogenético intencionado.
[00030] Foi ainda descoberto que o componente de ligação a VEGF das moléculas de ligação biespecíficas de acordo com a presente invenção liga a VEGF-A com uma afinidade de pelo menos 1.000 vezes mais alta, preferivelmente pelo menos 5.000 vezes mais alta, mais preferivelmente pelo menos 10.000 vezes mais alta que a VEGF-B, VEGF- C, VEGF-D ou PLGF. Devido à ligação altamente preferencial por VEGF-A, a sinalização de VEGFR3, que modula a angiogênese linfática, não é interferida.
[00031] Em uma modalidade preferida, as moléculas de ligação bi- específicas da presente invenção são fornecidas como domínios VHH ligados. Tais moléculas são significativamente menores que os anticorpos convencionais e têm, desse modo, o potencial para penetrar em um tumor mais profundo que tais anticorpos convencionais. Este benefício é ainda acentuado pelas sequências específicas reveladas aqui após estarem livres dos sítios de glicosilação.
[00032] Ainda, devido à natureza biespecífica (componentes de ligação de VEGF e Ang2 em uma molécula), a penetração do tumor de ambas as funcionalidades será necessariamente igual, o que assegurará que os efeitos benéficos do antagonismo combinado de VEGF e Ang2 serão fornecidos dentro da profundidade inteira de penetração do tumor. Esta é uma vantagem na combinação de antagonistas individuais contra estes alvos, uma vez que a profundidade de penetração dos antagonistas individuais sempre variará até certo ponto.
[00033] Outra vantagem de umas moléculas de ligação biespecíficas preferidas da presente invenção é seu quase meio soro aumentado devido a um componente de ligação à albumina sérica tal como uma molécula de ligação de albumina sérica como descrita aqui.
[00034] Estes e outros aspectos, modalidades, vantagens e aplicações da invenção ficarão claros da descrição adicional mais abaixo. DEFINIÇÕES
[00035] A menos que do contrário indicado ou definido, todos os termos usados têm seu significado usual na técnica que estará claro à pessoa versada. Referência é feita, por exemplo, aos manuais padrões, tais como Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, Nova Iorque, (1990), e Roitt et al., "Immunology" (2a Ed.), Gower Medical Publishing, Londres, Nova Iorque (1989), como também ao antecedente da técnica geral citado aqui. Além disso, a menos que do contrário indicado, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritos em detalhes podem ser executados e foram executados de uma maneira conhecida per se, como estará claro à pessoa versada. Referência é novamente feita, por exemplo, aos manuais padrões, ao antecedente da técnica geral referido acima e às referências adicionais citadas na mesma.
[00036] O termo "molécula de ligação biespecífica" refere-se a uma molécula compreendendo pelo menos uma molécula de ligação a Ang2 (ou "componente de ligação a Ang2") e pelo menos uma molécula de ligação a VEGF (ou "componente de ligação a VEGF"). Uma molécula de ligação biespecífica pode conter mais de uma molécula de ligação a Ang2 e/ou mais de uma molécula de ligação a VEGF, isto é, no caso que a molécula de ligação biespecífica contiver uma molécula de ligação a Ang2 biparatópica (como definida abaixo) e/ou uma molécula de ligação a VEGF biparatópica, na parte da molécula que liga a Ang2 ou a VEGF, isto é, em seu "componente de ligação a Ang2" (ou componente de anti-Ang2) ou "componente de ligação a VEGF" (ou componente de anti-VEGF), respectivamente. Porem, a palavra "biespecífica" neste contexto não é para ser interpretada como para excluir outros compo-nentes de ligação com especificidade de ligação a moléculas diferentes de VEGF e Ang2 da molécula de ligação biespecífica. Exemplos não- limitativos de tais outros componentes de ligação são componentes de ligação que ligam à albumina sérica.
[00037] A menos que do contrário indicado, os termos "imunoglobu- lina" e "sequência de imunoglobulina" - se usados aqui para referir a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo convencional de 4 cadeias - são usados como termos gerais para incluir ambos o anticorpo completo, as cadeias individuais do mesmo, como também todas as partes, domínios ou fragmentos do mesmo (incluindo mas não limitados os domínios de ligação de antígeno ou fragmentos tais como domínios VHH ou domínios VH/VL, respectivamente). Além disso, o termo "sequência", como aqui usado, (por exemplo, em termos como "sequência de imunoglobulina", "sequência de anticorpo", "sequência de domínio variável (simples)", "sequência de VHH" ou "sequência de proteína"), devem ser entendidos, em geral, para incluir tanto a sequência de aminoácido relevante como também as sequências de ácido nucleico ou sequências de nucleotídeo que codificam a mesma, a menos que o contexto requeira uma interpretação mais limitada.
[00038] O termo "domínio" (de um polipeptídeo ou proteína) como aqui usado refere-se a uma estrutura de proteína dobrada que tem a habilidade para reter sua estrutura terciária independentemente do resto da proteína. Em geral, os domínios são responsáveis por propriedades funcionais distintas das proteínas, e em muitos casos podem ser adicionados, removidos ou transferidos para outras proteínas sem perda de função do restante da proteína e/ou do domínio.
[00039] O termo "domínio de imunoglobulina", como aqui usado, refere-se a uma região globular de uma cadeia de anticorpo (tal como, por exemplo, uma cadeia de um anticorpo convencional de 4 cadeias ou de um anticorpo de cadeia pesada), ou a um polipeptídeo que essencialmente consiste em uma tal região globular. Domínios de imunoglobulina são caracterizados em que eles retêm a característica de dobramento da imunoglobulina das moléculas de anticorpo, que consiste em um sanduíche de 2 camadas de cerca de 7 filamentos beta antiparalelos dispostos em duas folhas beta, opcionalmente estabilizado por uma ligação de dissulfeto conservada. Um domínio de imunoglobulina compreende (a) domínio(s) variável(is), isto é, um ou mais domínios variáveis da imunoglobulina.
[00040] O termo "domínio variável da imunoglobulina", como aqui usado, significa um domínio de imunoglobulina essencialmente consistindo em quatro "regiões de estrutura" que são referidos na técnica e mais abaixo como "região de estrutura 1" ou "FR1"; como "região de estrutura 2" ou "FR2"; como "região de estrutura 3" ou "FR3"; e como "região de estrutura 4" ou "FR4", respectivamente; cujas regiões de estrutura são interrompidas por três "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs" que são referidas na técnica e mais abaixo como "região de determinação de complementaridade 1" ou "CDR1"; como "região de determinação de complementaridade 2" ou "CDR2"; e como "região de determinação de complementaridade 3" ou "CDR3", respectivamente. Desse modo, a estrutura ou sequência geral de um domínio variável da imunoglobulina pode ser indicada como segue: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. É o(s) domínio(s) variá- vel(eis) da imunoglobulina que confere especificidade a um anticorpo para o antígeno carregando o sítio de ligação de antígeno. No contexto da presente invenção, domínios variáveis simples da imunoglobulina como VHHs e anticorpos de domínio são preferidos.
[00041] O termo "domínio variável simples da imunoglobulina", como aqui usado, significa um domínio variável da imunoglobulina que é capaz de especificamente ligar a um epítopo do antígeno sem parear com um domínio variável da imunoglobulina adicional. Um exemplo de domínios variáveis simples da imunoglobulina no significado da presente invenção são os "anticorpos de domínio", tais como os domínios variáveis simples da imunoglobulina VH e VL (domínios VH e domínios VL). Outro exemplo de domínios variáveis simples da imunoglobulina são "domínios VHH" (ou simplesmente "VHHs") de camelídeos, como definidos doravante.
[00042] Em vista da definição acima, o domínio de ligação de antí- geno de um anticorpo convencional de 4 cadeias (tal como uma molécula de IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE; conhecidas na técnica) ou de um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fv tal como um Fv ligado a dissulfeto ou um fragmento scFv, ou um diacorpo (todos conhecidos na técnica) derivado de tal anticorpo convencional de 4 cadeias, normalmente não será considerado como um domínio variável simples da imunoglobulina, como, nestes casos, ligando ao respectivo epítopo de um antígeno normalmente não ocorreria por um domínio de imuno- globulina (simples) mas por um par de domínios de imunoglobulina (associados) tais como domínios variáveis da cadeia leve e pesada, isto é, por um par de domínios de imunoglobulina VH-VL, que juntamente ligam a um epítopo do respectivo antígeno.
[00043] "Domínios VHH", também conhecidos como VHHs, domínios VHH, fragmentos de anticorpo de VHH, e anticorpos de VHH, foram descritos originalmente como o domínio da imunoglobulina de ligação de antígeno (variável) de "anticorpos de cadeia pesada" (isto é, de "anticorpos destituídos de cadeias leves"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)). O termo "domínio VHH" foi escolhido para distinguir estes domínios variáveis dos domínios variáveis de cadeia pesada que estão presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos aqui como "domínios VH" ou "domínios VH") e dos domínios variáveis de cadeia leve que estão presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos aqui como "domínios VL" ou "domínios VL"). Domínios VHH podem especificamente ligar a um epítopo sem um domínio de ligação de antígeno adicional (ao invés dos domínios VH ou VL em um anticorpo convencional de 4 cadeias, em cujo caso o epítopo é reconhecido por um domínio VL junto com um domínio VH). Domínios VHH são unidades de reconhecimento de antí- geno pequenas, robustas e eficientes formadas por um domínio de imu- noglobulina simples.
[00044] No contexto da presente invenção, os termos domínio VHH, VHH, domínio VHH, fragmento de anticorpo de VHH, anticorpo de VHH, como também "Nanobody®" e "domínio de Nanobody®" ("Nanobody" sendo uma marca registrada da companhia Ablynx N.V.; Ghent; Bélgica) são usados alternadamente e são representativos dos domínios variáveis simples da imunoglobulina (tendo a estrutura FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4 e especificamente ligando a um epítopo sem requerer a presença de um segundo domínio variável da imunoglobu- lina), e que são distinguidos dos domínios VH pelos assim-chamados "resíduos conspícuos", como definidos, por exemplo, no WO2009/109635, Fig. 1.
[00045] Os resíduos de aminoácido de um domínio variável simples da imunoglobulina, por exemplo, um VHH, são numerados de acordo com a numeração geral para os domínios VH dada por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicação No. 91), como aplicada aos domínios VHH de Camelídeos, como mostrado por exemplo na Figura 2 de Riechmann e Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999). De acordo com esta numeração: - FR1 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 1-30, - CDR1 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 31-35, - FR2 compreende os aminoácidos nas posições 36-49, - CDR2 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 50-65, - FR3 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 66-94, - CDR3 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 95-102, e - FR4 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 103-113.
[00046] Porém, deveria ser observado que - como é bem conhecido na técnica para domínios VH e para domínios VHH - o número total de resíduos de aminoácido em cada uma das CDRs pode variar e pode não corresponder ao número total de resíduos de aminoácido indicados pela numeração de Kabat (isto é, uma ou mais posições de acordo com a numeração de Kabat podem ser ocupadas na sequência atual, ou a sequência atual pode conter mais resíduos de aminoácido que o número permitido pela numeração de Kabat). Isto significa que, em geral, a numeração de acordo com Kabat pode ou não corresponder à numeração atual dos resíduos de aminoácido na sequência atual.
[00047] Métodos alternativos para numerar os resíduos de aminoá- cido dos domínios VH, cujos métodos podem ser também aplicados de uma maneira análoga aos domínios VHH, são conhecidos na técnica. Porém, na presente descrição, reivindicações e figuras, a numeração de acordo com Kabat e aplicada aos domínios VHH como descrito acima será seguida, a menos que do contrário indicado.
[00048] O número total de resíduos de aminoácido em um domínio VHH será usualmente na faixa de 110 a 120, frequentemente entre 112 e 115. Porém, deveria ser observado que sequências menores e mais longas podem ser também adequadas para os propósitos descritos aqui.
[00049] Domínios variáveis simples da imunoglobulina, por exemplo, VHHs e anticorpos de domínio, de acordo com as modalidades preferidas da invenção, têm várias características estruturais e propriedades funcionais únicas que as tornam altamente vantajosas para o uso em terapia como moléculas de ligação de antígeno funcionais. Em particular, e sem ser limitado a isso, os domínios VHH (que foram "projetados" por natureza para ligar funcionalmente a um antígeno sem parear com um domínio variável de cadeia leve) podem funcionar como unidades estruturais de ligação de antígeno simples, relativamente pequenas, funcionais.
[00050] Devido às suas propriedades únicas, os domínios variáveis simples da imunoglobulina, como definidos aqui, como VHHs ou VHs (ou VLs) - ou sozinhos ou como parte de um polipeptídeo maior, por exemplo, uma molécula biparatópica - oferecem várias vantagens significativas: * apenas um domínio simples é requerido para ligar um an- tígeno com afinidade alta e com seletividade alta, de modo que não há nenhuma necessidade de ter dois domínios separados presentes, nem assegurar que estes dois domínios estejam presentes na conformação e configuração espacial direita (isto é, através do uso de ligadores es-pecialmente projetados, como com scFv’s); * os domínios variáveis simples da imunoglobulina podem ser expressados de uma molécula de ácido nucleico simples e não requerem nenhuma modificação pós-translacional (como glicosilação); * os domínios variáveis simples da imunoglobulina podem ser facilmente engenheirados em formatos multivalentes e multiespecí- ficos (como ainda debatido aqui); * os domínios variáveis simples da imunoglobulina têm es-pecificidade e afinidade altas por seu alvo, baixa toxicidade inerente e podem ser administrados por meio de rotas alternativas do que infusão ou injeção; * os domínios variáveis simples da imunoglobulina são altamente estáveis ao calor, pH, proteases e outros agentes ou condições desnaturantes e, desse modo, podem ser preparados, armazenados ou transportados sem o uso de equipamentos de refrigeração; * domínios variáveis simples da imunoglobulina são fáceis e relativamente baratos de preparar, ambos em escala pequena e em uma escala de fabricação. Por exemplo, os domínios variáveis simples da imunoglobulina podem ser produzidos usando fermentação microbiana (por exemplo, como ainda descrito abaixo) e não requerem o uso de sistemas de expressão mamíferos, por exemplo, como com os anticorpos convencionais; * domínios variáveis simples da imunoglobulina são rela-tivamente pequenos (aproximadamente 15 kDa, ou 10 vezes menores que uma IgG convencional) comparados aos anticorpos convencionais de 4 cadeias e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, e, portanto mostram penetração mais alta em tecidos (incluindo mas não limitados a tumores sólidos e outros tecidos densos) e podem ser administrados em doses mais altas que tais anticorpos convencionais de 4 cadeias e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos; * VHHs têm as assim-chamadas "propriedades de ligação de cavidade" específicas (inter alia devido à sua alça de CDR3 estendida, comparada aos domínios VH de anticorpos de 4 cadeias) e, portanto, podem também acessar os alvos e epítopos não acessíveis por anticorpos convencionais de 4 cadeias e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos; * VHHs têm a vantagem particular que eles são altamente solúveis e muito estáveis e não têm uma tendência de se agregarem (como com os domínios de ligação de antígeno derivados de camundongo descritos por Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)).
[00051] Os domínios variáveis simples da imunoglobulina da invenção não estão limitados com respeito a uma fonte biológica específica da qual foram obtidos ou a um método específico de preparação. Por exemplo, para obter os VHHs pode incluir as etapas seguintes: (1) isolar o domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada de ocorrência natural; ou triar uma biblioteca compreendendo anticorpos de cadeia pesada ou VHHs e isolar os VHHs dele; (2) expressar uma molécula de ácido nucleico que codifica um VHH com a sequência de ocorrência natural; (3) "humanizar" (como descrito aqui) um VHH, opcionalmente após maturação por afinidade, com uma sequência de ocorrência natural ou expressar um ácido nucleico que codifica tal VHH humanizado; (4) "camelizar" (como descrito abaixo) um domínio variável simples de cadeia pesa da imunoglobulina de um anticorpo de ocorrência natural de uma espécie animal, em particular uma espécie mamífera, tal como de um ser humano, ou expressar uma molécula de ácido nu- cleico que codifica tal domínio camelizado; (5) "camelizar" um VH, ou expressar uma molécula de ácido nucleico que codifica um tal VH camelizado; (6) usar técnicas para preparar sintética ou semissintetica- mente proteínas, polipeptídeos ou outras sequências de aminoácido; (7) preparar uma molécula de ácido nucleico que codifica um domínio VHH usando técnicas para síntese de ácido nucleico, seguidas por expressão do ácido nucleico desse modo obtido; (8) submeter os anticorpos de cadeia pesada ou VHHs à ma-turação por afinidade, para mutagênese (por exemplo mutagênese aleatória ou mutagênese dirigida) e/ou qualquer/quaisquer outra(s) téc- nica(s) para aumentar a afinidade e/ou especificidade do VHH; e/ou (9) combinações ou seleções das etapas anteriores.
[00052] Métodos e técnicas adequados para executar as etapas acima descritas são conhecidos na técnica e estarão claros à pessoa versada. Por via de exemplo, os métodos de obter domínios VHH que ligam a um antígeno ou epítopo específico foram descritos no WO2006/040153 e no WO2006/122786.
[00053] De acordo com as modalidades específicas, os domínios variáveis simples da imunoglobulina da invenção ou presentes nos poli- peptídeos da invenção são domínios VHH com uma sequência de ami- noácido que essencialmente corresponde à sequência de aminoácido de um domínio VHH de ocorrência natural, mas que foi "humanizada" ou "otimizada na sequência" (opcionalmente após maturação por afinidade), isto é, substituindo um ou mais resíduos de aminoácido na sequência de aminoácido da dita sequência de VHH de ocorrência natural por um ou mais dos resíduos de aminoácido que ocorrem na(s) posição(ões) correspondente(s) em um domínio pesado variável de um anticorpo convencional de 4 cadeias de um ser humano. Isto pode ser executado usando os métodos conhecidos na técnica, que podem ser habitualmente usados pela pessoa versada.
[00054] Um domínio VHH humanizado pode conter uma ou mais sequências de região de estrutura completamente humanas, e, em ainda outra modalidade mais específica, pode conter sequências de região de estrutura humanas derivadas das sequências de Vh3 de linhagem germinal humana DP-29, DP-47, DP-51, ou partes das mesmas, ou ser altamente homólogas a estas, opcionalmente combinadas com as sequências de JH, tais como JH5. Desse modo, um protocolo de humanização pode compreender a substituição de quaisquer dos resíduos de VHH com os resíduos 1, 2 e 3 de estrutura correspondentes (FR1, FR2 e FR3) dos genes de VH de linhagem germinal tais como DP 47, DP 29 e DP 51) ou sozinhos ou em combinação. Regiões de estrutura adequadas (FR) dos domínios variáveis simples da imunoglobulina da invenção podem ser selecionadas daquelas como expostas por exemplo em WO2006/004678 e especificamente incluem as assim-chamadas classes de "KERE" e "GLEW". Exemplos são domínios variáveis simples da imunoglobulina tendo a sequência de aminoácido G-L-E-W em volta das posições 44 a 47, e suas respectivas contrapartes humanizadas. Um domínio VHH humanizado pode conter uma ou mais sequências de região de estrutura completamente humanas.
[00055] Por via de exemplo, uma substituição humanizada para VHHs que pertence ao grupo 103 P,R,S e/ou ao grupo GLEW (como definido abaixo) é 108Q a 108L. Métodos para humanizar os domínios variáveis simples da imunoglobulina são conhecidos na técnica.
[00056] Domínios variáveis simples de ligação da imunoglobulina com propriedades melhoradas em vista da aplicação terapêutica, por exemplo afinidade intensificada ou imunogenicidade diminuída, podem ser obtidos de moléculas de ligação individuais por técnicas conhecidas na técnica, tais como maturação por afinidade (por exemplo, a partir das sequências de imunoglobulina sintéticas, aleatórias ou de ocorrência natural), fragmentos de enxerto, humanização, combinação de CDR derivados das sequências de imunoglobulina diferentes, montagem de PCR usando iniciadores de sobreposição, e técnicas similares para en- genheirar sequências de imunoglobulina bem conhecidas à pessoa versada; ou qualquer combinação adequada de qualquer um dos antecedentes, também denominadas "otimização de sequência", como descrita aqui. Referência é feita, por exemplo, aos manuais padrões, como também à descrição adicional e Exemplos.
[00057] Se apropriado, uma molécula de ligação com afinidade aumentada pode ser obtida por maturação de afinidade de outra molécula de ligação, a última representando, com respeito à molécula madura por afinidade, a molécula de ligação "fonte".
[00058] Métodos de obter VHHs que liga a um antígeno ou epítopo específico foram descritos anteriormente, por exemplo no WO2006/040153 e no WO2006/122786. Como também descrito nos mesmos em detalhes, os domínios VHH derivados de camelídeos podem ser "humanizados" (também denominados "otimizados na sequência" aqui, "otimização da sequência" pode, além de humanização, abranger uma modificação adicional da sequência por uma ou mais mutações que fornecem o VHH com propriedades melhoradas, tais como a remoção dos sítios de modificação pós-translacionais potenciais) substituindo um ou mais resíduos de aminoácido na sequência de ami- noácido da sequência de VHH original por um ou mais dos resíduos de aminoácido que ocorrem na(s) posição(ões) correspondente(s) em um domínio VH de um anticorpo convencional de 4 cadeias de um ser humano. Um domínio VHH humanizado pode conter uma ou mais sequências de região de estrutura completamente humanas, e, em uma outra modalidade mais específica, pode conter sequências de região de estrutura humanas derivadas de DP-29, DP-47, DP-51, ou suas partes, opcionalmente combinadas com as sequências de JH, tais como JH5.
[00059] Anticorpos de domínio, também conhecidos como "Dabs" e "dAbs" (os termos "Anticorpos de Domínio" e "dAbs" sendo usados como marcas registradas pelo grupo de companhias GlaxoSmithKline) foram descritos, por exemplo, em Ward, E. S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L. J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy", TRENDS in Biotechnology 21(11): 484490 (2003); e WO2003/002609.
[00060] Anticorpos de domínio essencialmente correspondem aos domínios VH ou VL de anticorpos mamíferos de não-camelídeos, em particular anticorpos humanos de 4 cadeias. Para ligar um epítopo como um domínio de ligação de antígeno simples, isto é, sem ser pareado com um domínio VL ou VH, respectivamente, seleção específica para tais propriedades de ligação de antígeno é requerida, por exemplo usando bibliotecas das sequências de domínio VH ou VL simples humanas.
[00061] Anticorpos de domínio têm, como VHHs, um peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa e, se derivado das sequências completamente humanas, não requerem humanização, por exemplo, para uso terapêutico em seres humanos. Como no caso de domínios VHH, os mesmos são bem expressos também em sistemas de expressão procariótica, fornecendo uma redução significativa no custo de fabricação geral.
[00062] Além disso, também estará claro à pessoa versada que é possível "enxertar" uma ou mais das CDR’s mencionadas acima sobre outros "andaimes", incluindo mas não limitados a andaimes humanos ou andaimes de não-imunoglobulina. Andaimes e técnicas adequados para tal enxerto de CDR são conhecidos na técnica.
[00063] Os termos "epítopo" e "determinante antigênico" que podem ser usados alternadamente, referem-se à parte de uma macromolécula, tal como um polipeptídeo que é reconhecido pelas moléculas de ligação de antígeno tais como anticorpos convencionais ou os polipeptídeos da invenção, e mais particularmente pelo sítio de ligação de antígeno das ditas moléculas. Epítopos definem o sítio de ligação mínimo para uma imunoglobulina, e desse modo representam o alvo de especificidade de uma imunoglobulina.
[00064] Um polipeptídeo (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, um domínio variável simples da imunoglobulina da invenção, ou em geral uma molécula de ligação de antígeno ou um fragmento da mesma) que pode "ligar" ou "especificamente ligar", que "tem afinidade a" e/ou que "tem especificidade a" um certo epítopo, antígeno ou proteína (ou a pelo menos uma parte, fragmento ou epítopo do mesmo) é dito ser "contra" ou "direcionado contra" o dito epítopo, antígeno ou proteína ou é uma molécula de "ligação" com respeito a tal epítopo, antígeno ou proteína. Neste contexto, um componente de ligação a VEGF pode ser também referido como "neutralização de VEGF".
[00065] Em geral, o termo "especificidade" refere-se ao número de tipos diferentes de antígenos ou epítopos aos quais uma molécula de ligação de antígeno particular ou molécula de proteína de ligação de antígeno (tal como um domínio variável simples da imunoglobulina da invenção) pode ligar-se. A especificidade de uma molécula de ligação de antígeno pode ser determinada com base em sua afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pelo constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação de antígeno (KD), é uma medida para a resistência de ligação entre um epítopo e um sítio de ligação de antígeno na proteína de ligação de antígeno: quanto menor o valor da KD, mais forte a resistência de ligação entre um epítopo e a molécula de ligação de antígeno (alternativamente, a afinidade pode ser também expressada como a constante de afinidade (KA) que é 1/KD). Como estará claro à pessoa versada (por exemplo, com base na revelação adicional aqui), a afinidade pode ser determinada de uma maneira conhecida per se, dependendo do antígeno específico de interesse. Avidez é a medida da resistência de ligação entre uma molécula de ligação de antígeno (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo, um domínio variável simples da imunoglobulina ou polipeptí- deos contendo o mesmo e o antígeno pertinente. Avidez está relacionada tanto à afinidade entre um epítopo e seu sítio de ligação de antí- geno na molécula de ligação de antígeno e ao número de sítios de ligação pertinentes presentes na molécula de ligação de antígeno.
[00066] A parte de uma molécula de ligação de antígeno que reconhece o epítopo é chamada um parátopo.
[00067] A menos que do contrário indicado, os termos "molécula de ligação a VEGF" ou "molécula de ligação a Ang2" incluem anticorpos de anti-VEGF ou anti-Ang2, anticorpo de anti-VEGF ou fragmentos de anticorpo de anti-Ang2, "moléculas semelhantes a anticorpos de anti- VEGF" ou "moléculas semelhantes a anticorpos de anti-Ang2", como definidos aqui, e conjugados com qualquer um destes. Anticorpos incluem, mas não são limitados a, anticorpos monoclonais e monoclonais quimerizados. O termo "anticorpo" abrange imunoglobulinas completas, como anticorpos monoclonais produzidos por expressão recombinante em células hospedeiras, como também fragmentos de anticorpo ou "moléculas semelhantes a anticorpos", incluindo anticorpos de cadeia simples e anticorpos lineares, assim-chamados "SMIPs" ("Imunofarmacêu- ticos Modulares Pequenos"), como por exemplo descritos no WO2002/056910; Moléculas semelhantes a anticorpos incluem domínios variáveis simples da imunoglobulina, como definidos aqui. Outros exemplos para moléculas semelhantes a anticorpos são anticorpos da superfamília da imunoglobulina (IgSF), ou moléculas enxertadas com CDR.
[00068] "Molécula de ligação a Ang2" ou "molécula de ligação a VEGF" respectivamente, referem-se a ambas moléculas de ligação ao alvo monovalentes (isto é, moléculas que ligam a um epítopo o respectivo alvo) como também a moléculas de ligação bi ou multivalentes (isto é, moléculas de ligação que ligam a mais de um epítopo, por exemplo moléculas "biparatópicas" como definidas mais abaixo). Moléculas de ligação a Ang2(ou VEGF) contendo mais de um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação a Ang2(ou VEGF) são também denominadas moléculas de ligação "formatadas", elas podem, dentro do componente de ligação ao alvo, além dos domínios variáveis simples da imunoglobulina, compreender ligadores e/ou metades com funções efe- toras, por exemplo metades extensoras da meia-vida como dos domínios variáveis simples da imunoglobulina de ligação à albumina, e/ou um par de fusão como da albumina sérica e/ou um polímero ligado como PEG.
[00069] Os termos "molécula de ligação a Ang2(ou VEGF) biparató- pica" ou "domínio variável simples da imunoglobulina biparatópica", como aqui usados, significarão uma molécula de ligação compreendendo um primeiro domínio variável simples da imunoglobulina e um segundo domínio variável simples da imunoglobulina como aqui definidos, em que as duas moléculas ligam-se a dois epítopos não-sobrepos- tos do respectivo antígeno. As moléculas de ligação biparatópicas são compostas de domínios variáveis simples da imunoglobulina tendo especificidades diferentes com respeito ao epítopo. A parte de uma molécula de ligação de antígeno (tal como um anticorpo ou um domínio variável simples da imunoglobulina da invenção) que reconhece o epítopo é chamada um parátopo.
[00070] Uma molécula de ligação formatada pode, embora menos preferido, também compreender dois domínios variáveis simples de imunoglobulina idênticos ou dois domínios variáveis simples de imuno- globulina diferentes que reconhecem os mesmos epítopos ou sobrepostos ou seu respectivo antígeno. Neste caso, com respeito ao VEGF, os dois domínios variáveis simples da imunoglobulina podem ligar o mesmo epítopo ou sobreposto em cada um dos dois monômeros que formam o dímero de VEGF.
[00071] Tipicamente, as moléculas de ligação da invenção ligar-se- ão com uma constante de dissociação (KD) de 10E-5 a 10E-14 moles/li- tro (M) ou menos, e preferivelmente 10E-7 a 10E-14 moles/litro (M) ou menos, mais preferivelmente 10E-8 a 10E-14 moles/litro, e até mesmo mais preferivelmente 10E-11 a 10E-13, como medido por exemplo em um Biacore ou em um ensaio de Kinexa), e/ou com uma constante de associação (KA) de pelo menos 10E7 ME-1, preferivelmente pelo menos 10E8 ME-1, mais preferivelmente pelo menos 10E9 ME-1, tal como pelo menos 10E11 ME-1. Qualquer valor de KD maior que 10E-4 M é em geral considerado indicar ligação não-específica. Preferivelmente, um polipeptídeo da invenção ligará ao antígeno desejado, isto é, VEGF ou Ang2, respectivamente, com uma KD menor que 500 nM, preferivelmente menor que 200 nM, mais preferivelmente menor que 10 nM, tal como menor de 500 pM. Ligação específica de uma proteína de ligação de antígeno a um antígeno ou epítopo pode ser determinada de qualquer maneira adequada conhecida per se, incluindo, por exemplo, os ensaios descritos aqui, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva, tais como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA) e ensaios de competição em sanduíche, e as variantes diferentes dos mesmos conhecidas per se na técnica.
[00072] Os resíduos de aminoácido serão indicados de acordo com o código de aminoácido de três letras ou uma letra padrão, como em geral conhecido e de acordo com a técnica. Ao comparar duas sequências de aminoácido, o termo "diferença de aminoácido" refere-se às inserções, deleções ou substituições do número indicado de resíduos de aminoácido em uma posição da sequência de referência, comparada a uma segunda sequência. No caso de substituição(ões), tais substitui- ção(ões) preferivelmente será(ão) substituição(ões) de aminoácido con- servadora(s), que significa que um resíduo de aminoácido é substituído com outro resíduo de aminoácido de estrutura química similar e que tem pouca ou essencialmente nenhuma influência na função, atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptídeo. Tais substituições de aminoácido conservadoras são bem conhecidas na técnica, por exemplo do WO1998/49185, em que as substituições de aminoácido conservadoras são preferivelmente substituições em que um aminoácido dentro dos grupos seguintes (i) - (v) é substituído por outro resíduo de ami- noácido dentro do mesmo grupo: (i) resíduos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares pequenos: Ala, Ser, Thr, Pro e GIy; (ii) resíduos polares, negativamente carregados e suas amidas (descarregadas): Asp, Asn, GIu e Gln; (iii) resíduos polares, positivamente carregados: His, Arg e Lys; (iv) resíduos alifáticos, não polares grandes: Met, Leu, Ile, VaI e Cys; e (v) resíduos aromáticos: Phe, Tyr e Trp. Substituições de aminoácido conservadoras particularmente preferidas são como segue: Ala em GIy ou em Ser; Arg em Lys; Asn em Gln ou em His; Asp em GIu;Cys em Ser; Gln em Asn; GIu em Asp; GIy no Ala ou em Pro; His em Asn ou em Gln; Ile em Leu ou em VaI; Leu em Ile ou em VaI; Lys em Arg, em Gln ou em GIu; Met em Leu, em Tyr ou em Ile; Phe em Met, em Leu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser;Trp em Tyr; Tyr em Trp ou em Phe; VaI em Ile ou em Leu.
[00073] Um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico é considerada estar "(em forma) essencialmente isolada" - por exemplo, quando comparada à sua fonte biológica nativa e/ou ao meio de reação ou meio de cultivo do qual foi obtida - quando foi separada de pelo menos um outro componente com o qual está usualmente associada na dita fonte ou meio, tal como outra proteína/polipeptídeo, outro ácido nucleico, outro componente biológico ou macromolécula ou pelo menos um conta- minante, impureza ou componente secundário. Em particular, um poli- peptídeo ou molécula de ácido nucleico é considerada estar "essencialmente isolada" quando foi purificada pelo menos 2 vezes, em particular pelo menos 10 vezes, mais em particular pelo menos 100 vezes, e até 1000 vezes ou mais. Um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico que estão "em forma essencialmente isolada" é de preferência essencialmente homogênea, como determinado usando uma técnica adequada, tal como uma técnica cromatográfica adequada, tal como eletroforese em gel de poliacrilamida.
[00074] "Identidade de sequência" entre duas sequências de molécula de ligação a VEGF ou entre duas sequências de molécula de ligação a Ang2 indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos entre as sequências. Pode ser calculada ou determinada como descrito no parágrafo f) nas páginas 49 e 50 do WO2008/020079. "Similaridade de sequência" indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições de aminoácido conservadoras.
[00075] Métodos alternativos para numeração dos resíduos de ami- noácido de domínios VH, cujos métodos podem ser também aplicado de uma maneira análoga aos domínios VHH, são conhecidos na técnica. Porém, na descrição presente, reivindicações e figuras, a numeração de acordo com Kabat e aplicada aos domínios VHH como descritos acima será seguida, a menos que do contrário indicado.
[00076] Uma molécula de ligação a VEGF ou molécula de ligação a Ang2 "madura na afinidade", em particular um VHH ou um anticorpo de domínio, tem uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs o que resulta em uma afinidade melhorada por VEGF ou Ang2, quando comparada à respectiva molécula de ligação a VEGF ou molécula de ligação a Ang2 de origem. As moléculas de ligação a VEGF ou as moléculas de ligação a Ang2 maduras em afinidade da invenção podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descritos por Marks et al., 1992, Biotechnology 10: 779-783, ou Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, EUA 91: 3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; e Hawkins et al., 1992, J. MoI. Biol. 226(3): 889-896; KS Johnson e RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996.
[00077] Para a presente invenção, uma "sequência de aminoácido da SEQ ID NO: x": inclui, se do contrário não declarado, uma sequência de aminoácido que é 100% idêntica com a sequência mostrada na respectiva SEQ ID NO: x; a) sequências de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade de aminoácido com a sequência mostrada na respectiva SEQ ID NO: x; b) sequências de aminoácido tendo 3, 2, ou 1 diferenças de aminoácido com a sequência mostrada na respectiva SEQ ID NO: x.
[00078] Os termos "câncer" e "canceroso" se referem ou descrevem à condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento/proliferação celulares desregulados. Exemplos de câncer a ser tratado com uma molécula de ligação biespecífica da invenção incluem, mas não se limitam a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres, como sugerido para o tratamento com antagonistas de VEGF em US 2008/0014196 incluem câncer de células escamosas, câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamosa do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gastrintestinal, câncer pancreá- tico, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula sa- lival, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tiróide, carcinoma hepático, câncer gástrico, melanoma, e vários tipos de câncer da cabeça e pescoço. Desregulação da angiogê- nese pode conduzir a muitos distúrbios que podem ser tratados pelas composições e métodos da invenção. Estes distúrbios incluem condições não-neoplásticas e neoplásticas. Neoplastias incluem, mas não se limitam àquelas descritas acima.
[00079] Distúrbios não-neoplásticos incluem, mas não se limitam a, como sugerido para tratamento com antagonistas de VEGF em US2008/0014196, hipertrofia indesejada ou aberrante, artrite, artrite reumatóide (RA), psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, ateroscle- rose, placas ateroscleróticas, retinopatia proliferativa diabética e outras incluindo retinopatia de pré-maturidade, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneração macular relacionada à idade, edema macular diabético, neovascularização córnea, neovascularização de enxerto córneo, rejeição a enxerto córneo, neovascularização retinal/co- roidal, neovascularização do ângulo (rubeose), doença neovascular ocular, restenose vascular, malformações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasia da tiróide (incluindo doença de Grave), transplantação de tecido córneo e outra, inflamação crônica, inflamação pulmonar, lesão pulmonar aguda / ARDS, sepse, hipertensão pulmonar primária, efusões pulmonares malignas, edema cerebral (por exemplo, associado com acidente vascular cerebral agudo / lesão de cabeça fechada / trauma), inflamação sinovial, formação do pannus em RA, miosite ossificante, formação óssea hipertrópica, oste- oartrite (OA), ascite refratária, doença ovariana policística, endometri- ose, 3° espaçamento de doenças de fluidos (pancreatite, síndrome de compartimento, queimaduras, doença do intestino), fibroides uterinas, trabalho de parto prematuro, inflamação crônica tal como IBD (doença de Crohn e colite ulcerativa), rejeição de aloenxerto renal, doença inflamatória do intestino, síndrome nefrótica, crescimento de massa de tecido indesejado ou aberrante (não-câncer), juntas hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição do crescimento do cabelo, síndrome de Osier- Weber, fibroplasias retrolentais de granuloma piogênico, escleroderma, tracoma, adesões vasculares, sinovite, dermatite, pré-eclampsia, ascites, efusão pericardial (tal como à associada com pericardite), e efusão pleural.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00080] Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma molécula de ligação biespecífica compreendendo pelo menos um componente de ligação a Ang2 e pelo menos um componente de ligação a VEGF.
[00081] Em uma modalidade preferida, a presente invenção diz respeito a uma molécula de ligação biespecífica compreendendo pelo menos um componente de ligação a VEGF e pelo menos um componente de ligação a Ang2 que ainda compreende pelo menos um componente de ligação adicional, preferivelmente um componente de ligação à albumina sérica (molécula de ligação de albumina sérica).
[00082] Em uma modalidade preferida, o componente de ligação à albumina sérica da molécula de ligação da presente invenção é um domínio variável simples de imunoglobulina isolada ou um polipeptídeo contendo um ou mais dos ditos domínios variáveis simples da imuno- globulina, em que o dito domínio variável simples da imunoglobulina consiste em quatro regiões de estrutura e três regiões de determinação de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e em que a dita CDR3 tem uma sequência de aminoácido selecionada das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 257, 260, 263, 266, 269, 272, ou 275.
[00083] Mais preferivelmente, os ditos um ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina do componente de ligação à albumina sérica contêm: a) uma CDR3 com uma sequência de aminoácido selecionada de um primeiro grupo das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 257, 260, 263, 266, 269, 272, ou 275; b) uma CDR1 com uma sequência de aminoácido selecionada de um segundo grupo das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 255, 258, 261, 264, 267, 270, ou 273; c) uma CDR2 com uma sequência de aminoácido selecionada de um segundo grupo das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 256, 259, 262, 265, 268, 271, ou 274.
[00084] Em uma modalidade mais preferida, os ditos um ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina do componente de ligação à albumina sérica são VHHs, preferivelmente tendo uma sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 98 ou 254.
[00085] De acordo com as modalidades preferidas, o dito componente de ligação a Ang2 e o dito componente de ligação a VEGF compreendem pelo menos um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação a Ang2 e pelo menos um domínio variável simples da imuno- globulina de ligação a VEGF, respectivamente.
[00086] Em um aspecto preferido, o dito componente de ligação a Ang2 e o dito componente de ligação a VEGF compreendem cada pelo menos um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação a VEGF e pelo menos um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação a Ang2, respectivamente, em que cada um dos ditos domínios variáveis simples da imunoglobulina têm quatro regiões de estrutura e três regiões de determinação de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente.
[00087] Desse modo, o componente anti-Ang2 e/ou anti-VEGF contido nas moléculas de ligação biespecíficas da invenção pode incluir dois (ou mais) domínios variáveis simples da imunoglobulina de anti- Ang2 (ou anti-VEGF, respectivamente), em que os domínios variáveis simples da imunoglobulina são direcionados contra epítopos diferentes dentro do alvo Ang2 (ou VEGF). Desse modo, os dois domínios variáveis simples da imunoglobulina em uma molécula de ligação biespecí- fica terão especificidade de antígeno diferente e, portanto, sequências de CDR diferentes.
[00088] Tais moléculas de ligação bivalentes são também denominadas "construções de anticorpo de domínio simples biparatópica" (se os domínios variáveis simples da imunoglobulina consistirem ou essencialmente consistirem em anticorpos de domínio simples), ou "construções de VHH biparatópicas" (se os domínios variáveis simples da imunoglo- bulina consistirem ou essencialmente consistirem em VHHs), respectivamente, visto que os dois domínios variáveis simples da imunoglobu- lina incluirão dois parátopos diferentes.
[00089] Na molécula de ligação biespecífica da invenção, uma ou ambas das moléculas de ligação podem ser bivalentes; por exemplo, o componente de ligação a VEGF pode ser biparatópico e o componente de ligação a Ang2 pode ser um domínio variável simples da imunoglo- bulina, ou o componente de ligação a VEGF pode ser um domínio variável simples da imunoglobulina e o componente de ligação a Ang2 pode ser biparatópico.
[00090] Em moléculas de ligação biespecíficas da invenção, é preferível que o componente de ligação a VEGF contenha um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação a VEGF bivalente, por exemplo um VHH biparatópico.
[00091] Tal domínio variável simples da imunoglobulina de ligação a VEGF pode ser dois ou mais VHHs de ligação a VEGF, que são: a. VHHs idênticos que são capazes de bloquear a interação entre VEGF humano recombinante e o VEGFR-2 humano re- combinante com uma taxa de inibição de > 60% ou b. VHHs diferentes que ligam a epítopos de VEGF não- sobrepostos, em que pelo menos um VHH é capaz de bloquear a interação entre VEGF humano recombinante e o VEGFR-2 humano recom- binante com uma taxa de inibição de > 60% e em que pelo menos um VHH é capaz de bloquear a dita interação com uma taxa de inibição de > 60%.
[00092] O componente de ligação a VEGF compreendendo pelo menos um domínio variável com quatro regiões de estrutura e três regiões de determinação de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, em que a dita CDR3 tem a sequência de aminoácido Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr como mostrada na SEQ ID NO: 1, em que Xaa na posição 5 é Gly ou Ala; Xaa na posição 7 é Ser ou Gly; Xaa na posição 12 é Gly, Ala ou Pro; Xaa na posição 13 é Asp ou Gly; Xaa na posição 16 é Asp ou Glu; e em que o dito componente de ligação a VEGF é capaz de bloquear a interação de VEGF165 recombinante humano com o VEGFR-2 recombinante humano com uma taxa de inibição de > 60%.
[00093] De acordo com as modalidades preferidas, Xaa na posição 5 é Gly, Xaa na posição 7 é Ser, Xaa na posição 12 é Ala, e Xaa na posição 13 é Asp.
[00094] Em particular, a dita CDR3 tem uma sequência selecionada da: SEQ ID NO: 2 SRAYGSSRLRLGDTYDY; SEQ ID NO: 3 SRAYGSSRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 4 SRAYGSSRLRLADTYEY; SEQ ID NO: 5 SRAYGSGRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 6 SRAYASSRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 7 SRAYGSSRLRLPDTYDY; SEQ ID NO: 8 SRAYGSSRLRLPGTYDY.
[00095] De acordo com certas modalidades, um componente de ligação a VEGF compreende um ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina, cada contendo: a. uma CDR3 com uma sequência de aminoácido selecionada de um primeiro grupo das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 2 a 8; b. uma CDR1 e uma CDR2 com uma sequência de aminoá- cido que está contida, como indicado na Tabela 3, em uma sequência selecionada de um segundo grupo das sequências de aminoácido mos-tradas nas SEQ ID NOs: 9 a 46, em que a dita segunda sequência con-tém a respectiva CDR3 selecionada de acordo com a).
[00096] De acordo com as modalidades preferidas, os domínios variáveis simples da imunoglobulina são VHHs.
[00097] De acordo com as modalidades específicas, os VHHs têm sequências de aminoácido selecionadas das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 9 - 46.
[00098] De acordo com outra modalidade específica, os VHHs têm sequências de aminoácido selecionadas das SEQ ID NOs: 15, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 25.
[00099] A invenção também diz respeito ao componente de ligação a VEGF que foi obtido através de maturação por afinidade e/ou otimização de sequência de um VHH acima definido, por exemplo a um VHH que foi obtido por otimização de sequência de um VHH tendo uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 18. Exemplos são VHHs tendo as sequências de aminoácido selecionadas das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 47 - 57.
[000100] De acordo com certas modalidades, um domínio de ligação a VEGF da invenção pode ser formatado, como aqui definido, por exemplo, pode ser biparatópico ou pode compreender dois domínios variáveis simples de imunoglobulina idênticos. Tais componentes de ligação a VEGF podem compreender dois ou mais VHHs que são: a) VHHs idênticos que são capazes de bloquear a interação entre VEGF humano recombinante e o VEGFR-2 humano recombinante com uma taxa de inibição de > 60% ou b) VHHs diferentes que ligam a epítopos de VEGF não-so- brepostos, em que pelo menos um VHH é capaz de bloquear a interação entre VEGF humano recombinante e o VEGFR-2 humano recombinante com uma taxa de inibição de > 60% e em que pelo menos uma ligação de VHH é capaz de bloquear a dita interação com uma taxa de inibição de > 60%.
[000101] A porcentagem de bloquear a dita interação a uma taxa de inibição de > 60% ou > 60 %, respectivamente, refere-se a uma taxa de inibição como determinado por um Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificada (AlphaScreen®), um ensaio de ELISA de competição, um ensaio com base em ressonância de plasmon (SPR) (Biacore®) como usado nos Exemplos.
[000102] No seguinte, a habilidade dos VHHs de acordo com a) é tam-bém denominada "bloqueador de receptor", enquanto a habilidade dos VHHs de acordo com b) é também denominada "não-bloqueador de re-ceptor".
[000103] Preferivelmente, os VHHs bloqueadores de receptor têm uma taxa de inibição de > 80%, mais preferivelmente > 90%; os VHHs mais preferidos que são bloqueadores de receptor completos, isto é, têm uma taxa de inibição de 100%.
[000104] Um componente de ligação a VEGF pode conter dois ou mais VHHs idênticos a) selecionados de VHHs tendo as sequências de aminoácido mostrados nas SEQ ID NOs: 9 - 46 ou VHHs que foram obtidos através de maturação por afinidade e/ou otimização de sequência de tal VHH. O VHH pode ser selecionado de VHHs tendo o aminoá- cido mostrado na SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 47 - 57.
[000105] De acordo com as modalidades preferidas, um componente de ligação a VEGF formatado compreende dois VHHs, cada um tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 57.
[000106] Em componentes de ligação a VEGF formatados compreen-dendo dois VHHs diferentes: a) os ditos um ou mais VHHs com uma taxa de inibição de > 60% são selecionados de: i. VHHs tendo uma sequência de aminoácido selecionada das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 9 - 46 ou ii. VHHs que foram obtidos através de maturação por afini-dade e/ou otimização de sequência de tais VHHs, e em que b) os ditos um ou mais VHHs com uma taxa de inibição de > 60% são selecionados de i. SEQ ID NOs: 58 - 124 ou ii. VHHs que foram obtidos através de maturação por afini-dade e/ou otimização de sequência de tal VHH.
[000107] De acordo com as modalidades preferidas, dois VHHs estão contidos nos polipeptídeos com as sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 128 - 168, separadas por sequências de ligador como indicado na Tabela 15.
[000108] Em um componente de ligação a VEGF preferido VHH a) i. tem uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 18 e VHH b) i. tem uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 64.
[000109] Em outros componentes de ligação a VEGF preferidos VHHs de acordo com a) ii. é selecionado de VHHs tendo uma sequência de aminoácido mostrado nas SEQ ID NOs: 47 - 57 e VHHs de acordo com b) ii. é selecionado de VHHs tendo uma sequência de aminoácido mos-trada nas SEQ ID NOs: 125 - 127.
[000110] Particularmente preferido é um componente de ligação a VEGF biparatópico compreendendo dois VHHs, um deles tendo o ami- noácido mostrado na SEQ ID NO: 57 e um deles tendo o aminoácido mostrado na SEQ ID NO: 127.
[000111] O componente de ligação a Ang2 compreende pelo menos um domínio variável com quatro regiões de estrutura e três regiões de determinação de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3, respecti-vamente, em que a dita CDR3 tem uma sequência de aminoácido sele-cionada das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, ou 253.
[000112] Em um segundo aspecto, o dito componente de ligação a Ang2 é um domínio variável simples de imunoglobulina isolada ou um polipeptídeo contendo um ou mais dos ditos domínios variáveis simples da imunoglobulina, em que o dito domínio variável simples da imunoglo- bulina consiste em quatro regiões de estrutura e três regiões de deter-minação de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e em a que dita CDR3 tem uma sequência de aminoácido selecionada das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, ou 253.
[000113] Em um outro aspecto, o dito domínio variável simples da imu- noglobulina do componente de ligação a Ang2 contém: a. uma CDR3 com uma sequência de aminoácido selecionada de um primeiro grupo das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: Ids das SEQ NOs: 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, ou 253 (vide também Tabela 49); b. uma CDR1 com uma sequência de aminoácido que está contida, como indicado nas Tabelas 36-A, 38-A, 41-A, ou 45-A, como sequência parcial em uma sequência selecionada de um segundo grupo das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, ou 251 (vide também Tabela 49); c. uma CDR2 com uma sequência de aminoácido que está contida, como indicado na Tabela 36-A, 38-A, 41-A, ou 45-A, como se-quência parcial em uma sequência selecionada de um segundo grupo das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, ou 252 (vide também Tabela 49).
[000114] Preferivelmente, o domínio variável simples da imunoglobu- lina do componente de ligação a Ang2 é um VHH, preferivelmente tendo a sequência de aminoácido selecionada das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, ou 223.
[000115] Em outra modalidade preferida, o domínio variável simples da imunoglobulina do componente de ligação a Ang2 foi obtido através de maturação por afinidade ou humanização de um domínio variável simples da imunoglobulina como descrito aqui.
[000116] Similarmente, a presente invenção também diz respeito a um VHH que foi obtido através de maturação por afinidade ou humanização de um VHH do componente de ligação a Ang2 como descrito aqui.
[000117] A presente invenção desse modo também diz respeito a um VHH de ligação a Ang2 com uma sequência de aminoácido selecionada das sequências de ácido mostradas nas SEQ ID NOs: 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, ou 223.
[000118] Componentes de ligação a Ang2 parentais adequados para maturação por afinidade são, por via de exemplo, os VHHs acima des-critos com as sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs:214, 215, 216, 217, 218, ou 219.
[000119] Consequentemente, a invenção também diz respeito às mo-léculas de ligação a Ang2 que foram obtidas através de maturação por afinidade e/ou otimização de sequência de um VHH acima definido, por exemplo, a um VHH que foi obtido por otimização de sequência de um VHH tendo uma sequência de aminoácido mostrada como SEQ ID NOs: 217, 218, 219, 220, 221, 222, ou 223. As sequências de aminoácido "fonte" que foram usadas para gerar os últimos VHHs estão mostradas nas SEQ ID NOs: 214, 215, ou 216. Também, estas sequências de ami- noácido são componentes de ligação a Ang2 adequados que podem ser aplicados nas moléculas de ligação da presente invenção.
[000120] Como descrito aqui, a molécula de ligação da presente in-venção preferivelmente compreende pelo menos um componente de li-gação à albumina sérica. Particularmente, as moléculas de ligação pre-feridas desse modo têm pelo menos um componente de ligação a VEGF, pelo menos um componente de ligação a Ang2 e pelo menos um componente de ligação à albumina sérica. A ordem destes três compo-nentes de ligação poderia ser qualquer ordem possível tal como a ordem exposta na Tabela 36-B, 38-B, 40, 41-B, 42, 43, 45-B, 46-A, ou 47-A; ou na Figura 20, 23, 27, ou 30, por exemplo, o componente de ligação a VEGF, a Ang2 ou à albumina sérica, pode ser N-terminal ou C-terminal. Notavelmente, "1D01" (SEQ ID NO: 214), "11B07", "00027" (SEQ ID NO: 216), "00908", "7G08" (SEQ ID NO: 215), "00919", "00921" (SEQ ID NO: 220), "00928" (SEQ ID NO: 221), "00932", "00933", "00934", "00935", "00936", "00937", "00938" (SEQ ID NO: 222), ou "00956" (SEQ ID NO: 223) como referida na legenda das Tabelas acima mencionada e nas Figuras representam os componentes de ligação a Ang2, enquanto "00038" representa um componente de ligação a VEGF e "ALB11" representa um componente de ligação à albumina sérica. Nenhum deles é para ser interpretado como uma sequência específica, mas representa um componente de ligação a Ang2, VEGF e à albumina sérica em geral quando usados no contexto de possíveis arranjos de moléculas de ligação da presente invenção.
[000121] Porém, prefere-se que o componente de ligação à albumina sérica esteja entre o componente de ligação a VEGF e a Ang2 (ou vice- versa), enquanto é particularmente preferido que pelo menos um com-ponente de ligação a VEGF seja N-terminal, seguido por pelo menos um componente de ligação à albumina sérica, seguido por pelo menos um componente de ligação a Ang2 no término C. Este arranjo é mostrado ser especificamente útil.
[000122] A presente invenção, desse modo, diz respeito em um aspecto preferido às moléculas de ligação compreendendo pelo menos um componente de ligação a VEGF, pelo menos um componente de ligação a Ang2 e pelo menos um componente de ligação à albumina sérica tendo uma sequência de aminoácido selecionada das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 180-213.
[000123] "Pelo menos um" componente de ligação (VEGF, Ang2 ou albumina sérica) quando aqui usado inclui que uma molécula de ligação da presente invenção pode conter um, dois, três, quatro ou cinco com-ponentes de ligação a VEGF, Ang2 e/ou à albumina sérica (isto é, enti-dades, unidades) que são preferivelmente representados isoladamente por um domínio variável da imunoglobulina como descrito aqui.
[000124] Os componentes de ligação a VEGF e/ou a Ang2 com pro-priedades melhoradas em vista da aplicação terapêutica, por exemplo afinidade intensificada ou imunogenicidade diminuída, podem ser obtidos de componentes de ligação a VEGF ou a Ang2 individuais da invenção através de técnicas conhecidas na técnica, tais como maturação por afinidade (por exemplo, a partir das sequências de imunoglobulina sintéticas, aleatórias ou de ocorrência natural), fragmentos de enxerto, humanização, combinação de CDR derivados das sequências de imu- noglobulina diferentes, arranjo de PCR usando iniciadores de sobrepo-sição, e técnicas similares para engenharia das sequências de imuno- globulina bem conhecidas à pessoa versada; ou qualquer combinação adequada de qualquer um dos antecedentes, também denominada "otimização de sequência", como descrita aqui. Por exemplo, referência é feita aos manuais padrões, como também à descrição adicional e Exemplos.
[000125] Se apropriado, um componente de ligação a VEGF ou a Ang2 da invenção com afinidade aumentada pode ser obtido por maturação de afinidade de outro componente de ligação a VEGF ou a Ang2, o último representando, com respeito à molécula madura por afinidade, o componente de ligação a VEGF "fonte".
[000126] Em VHHs de VEGF ou Ang2 da invenção que começam com EVQ, o E N-terminal pode ser substituído por um D (que é frequente-mente um resultado da otimização de sequência) ou pode estar faltando (como para expressão do VHH em E. coli). Para componentes de ligação a VEGF formatados, isto usualmente se aplica apenas ao VHH que está N-terminalmente situado.
[000127] Uma substituição humanizada preferida, mas não-limitativa, para domínios VHH de VEGF pertencendo ao grupo 103 P,R,S e/ou ao grupo GLEW (como definidos abaixo) é 108Q por 108L. Métodos para humanizar domínios variáveis simples da imunoglobulina são conhecidos na técnica.
[000128] De acordo com outra modalidade, o domínio variável simples da imunoglobulina é um anticorpo de domínio, como definido aqui.
[000129] Em ainda outra modalidade, os representativos da classe dos domínios variáveis simples da imunoglobulina de ligação a VEGF e/ou a Ang2 da invenção têm sequências de aminoácido que correspondem à sequência de aminoácido de um domínio VH de ocorrência natural que foi "camelizado", isto é, substituindo um ou mais resíduos de aminoácido na sequência de aminoácido de uma cadeia pesada variável de ocorrência natural de um anticorpo convencional de 4 cadeias por um ou mais resíduos de aminoácido que ocorrem na(s) posição(ões) correspondente(s) em um domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada. Isto pode ser executado de uma maneira conhecida per se que estará claro à pessoa versada e referência é adicionalmente feita ao WO1994/04678. Tal camelização pode ocorrer preferencialmente nas posições de aminoácido que estão presentes na interface de VH-VL e nos assim chamados resíduos Camelidae Hallmark (vide por exemplo também o WO1994/04678). Uma descrição detalhada de tais técnicas de "humanização" e "camelização" e sequências de região de estrutura preferidas consistentes com as mesmas pode ser adicionalmente tirada, por exemplo, da página 46 e página 98 do WO2006/040153 e página 107 do WO2006/122786.
[000130] Os componentes de ligação a VEGF da invenção, por exemplo, domínios variáveis simples da imunoglobulina, têm especificidade para VEGF em que eles compreendem um ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina que especificamente ligam a um ou mais epí- topos dentro da molécula de VEGF. O mesmo é verdade para os com-ponentes de ligação a Ang2 da invenção.
[000131] Ligação específica de um componente de ligação a VEGF a seu VEGF de antígeno pode ser determinada de qualquer maneira adequada conhecida per se, incluindo, por exemplo, os ensaios descritos aqui, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva, tais como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA e ELISA) e ensaios de competição em sanduíche, e as variantes diferentes dos mesmos conhecidas per se na técnica. O mesmo é verdade para um componente de ligação a Ang2 ao ligar-se a seu antígeno.
[000132] Com respeito ao VEGF de antígeno, um componente de ligação a VEGF da invenção, por exemplo um domínio variável simples da imunoglobulina, não é limitado com respeito às espécies. Desse modo, os domínios variáveis simples da imunoglobulina da invenção ligam-se preferivelmente ao VEGF humano, se intencionado para propósitos terapêuticos em seres humanos. Porém, os domínios variáveis simples da imunoglobulina que se ligam a VEGF de outras espécies mamíferas estão também dentro do escopo da invenção. Um domínio variável simples da imunoglobulina da invenção que se liga a uma forma de espécie de VEGF pode reagir cruzado com VEGF tendo uma se-quência diferente que a humana, de uma ou mais outras espécies. Por exemplo, os domínios variáveis simples da imunoglobulina da invenção que se ligam ao VEGF humano podem exibir reatividade transversal com VEGF de uma ou mais outras espécies de primatas e/ou com VEGF de uma ou mais espécies de animais que são usados em modelos animais para doenças, por exemplo macaco, camundongo, rato, coelho, porco, cão, e em particular em modelos animais para doenças e distúrbios associados com efeitos mediados por VEGF em angiogênese (tal como as espécies e modelos de animais mencionados aqui). Domínios variáveis simples da imunoglobulina da invenção que mostram tal reatividade cruzada são vantajosos em uma investigação e/ou desen-volvimento de fármaco, uma vez que permite os domínios variáveis sim-ples da imunoglobulina da invenção serem testados em modelos de do-ença reconhecida tais como macacos, em particular Cinomólogo ou Reso, ou camundongos e ratos.
[000133] Preferivelmente, em vista da reatividade cruzada com uma ou mais moléculas de VEGF de espécies diferente de humana que é/são intencionada(s) para o uso como um modelo animal durante o de-senvolvimento de um antagonista de VEGF terapêutico, um componente de ligação a VEGF reconhece um epítopo em uma região do VEGF de interesse tendo um grau alto de identidade com VEGF humano.
[000134] Um domínio variável simples da imunoglobulina da invenção reconhece um epítopo que fica, totalmente ou em parte, localizado em uma região de VEGF que é relevante para ligar a seu receptor, em par-ticular ao VEGFR-2 que foi mostrado ser o receptor cuja ativação está causalmente envolvida na neovascularização de tumores. De acordo com os aspectos preferidos, os domínios variáveis simples da imuno- globulina da invenção bloqueiam ativação do receptor de VEGF, em particular ativação de VEGFR-2, pelo menos parcialmente, de preferência substancialmente e mais preferivelmente por completo.
[000135] Como descrito acima, a habilidade de um componente de ligar-se a VEGF para bloquear a interação entre VEGF e seus receptores, em particular o VEGFR-2, pode ser determinada por um Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificada (AlphaScreen®), um ensaio de ELISA de competição, ou um ensaio com base em ressonância de plasmon (SPR) (Biacore®), como descrito nos Exemplos.
[000136] Preferivelmente, um domínio variável simples da imunoglo- bulina da invenção liga-se a VEGF com uma afinidade menor que 500 nM, preferivelmente menor que 200 nM, mais preferivelmente menor que 10 nM, tal como menos de 500 pM (como determinado por análise de Ressonância de Plasmon de Superfície, como descrito no Exemplo 5.7). O mesmo é verdade para um domínio variável simples da imuno- globulina da invenção que se liga à angiopoietina.
[000137] Preferivelmente, os domínios variáveis simples da imunoglo- bulina da invenção têm valores de IC50, como medido em um ensaio de ELISA de competição como descrito no Exemplo 5.1. na faixa de 10-6 a 10-10 moles/litro ou menos, mais preferivelmente na faixa de 10-8 a 1010 moles/litro ou menos e até mesmo mais preferivelmente na faixa de 10-9 a 10-10 moles/litro ou menos.
[000138] De acordo com uma modalidade não-limitativa mas preferida da invenção, os domínios variáveis simples da imunoglobulina de ligação a VEGF da invenção ligam-se a VEGF com uma constante de dissociação (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro (M) ou menos, e preferivelmente 10-7 a 10-12 moles/litro (M) ou menos e mais preferivelmente 108 a 10-12 moles/litro (M), e/ou com uma constante de associação (KA) de pelo menos 107 M-1, preferivelmente pelo menos 108 M-1, mais pre-ferivelmente pelo menos 109 M-1, tal como pelo menos 1012 M-1; e em particular com uma KD menor que 500 nM, preferivelmente menor que 200 nM, mais preferivelmente menor que 10 nM, tal como menor que 500 pM. Os valores KD e KA do domínio variável simples da imunoglo- bulina da invenção contra VEGF podem ser determinados. O mesmo é verdade para um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação a Ang2 da invenção.
[000139] Componentes de ligação a VEGF biparatópicos compreendendo dois ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina es-sencialmente consistem ou compreendem (i) um primeiro domínio vari-ável simples da imunoglobulina que especificamente liga-se a um pri-meiro epítopo de VEGF e (ii) um segundo domínio variável simples da imunoglobulina que especificamente liga-se a um segundo epítopo de VEGF, em que o primeiro epítopo de VEGF e o segundo epítopo de VEGF não são epítopos idênticos. Em outras palavras, tal polipeptídeo da invenção compreende ou essencialmente consiste em dois ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina que são direcionados contra pelo menos dois epítopos de não-sobreposição presentes no VEGF, em que os ditos domínios variáveis simples da imunoglobulina são ligados entre si em um tal modo que eles são capazes de ligar a VEGF simultaneamente. Neste sentido, o polipeptídeo da invenção pode ser também considerado uma construção de imunoglobulina "bivalente" ou "multivalente", e especialmente como uma "construção de domínio variável simples da imunoglobulina multivalente", em que o po- lipeptídeo contém pelo menos dois sítios de ligação para VEGF. (Tais construções são também denominadas moléculas de ligação a VEGF "formatadas", por exemplo VHHs "formatados"). O mesmo é verdade para componentes de ligação a Ang-2 biparatópicos, mutatis mutandis.
[000140] Tal componente de ligação a VEGF ou a Ang2 da invenção inclui (pelo menos) dois domínios variáveis simples da imunoglobulina anti-VEGF ou Ang2, respectivamente, em que os dois domínios variáveis simples da imunoglobulina são preferivelmente direcionados contra epítopos não-sobrepostos dentro da molécula de VEGF ou molécula de angiopoietina, respectivamente. Desse modo, estes dois domínios vari-áveis simples da imunoglobulina terão uma especificidade de antígeno diferente e portanto sequências de CDR diferentes. Por este motivo, tais polipeptídeos da invenção serão aqui também denominados "polipeptí- deos biparatópicos", ou "construções de anticorpo de domínio biparató- pico" (se os domínios variáveis simples da imunoglobulina consistirem ou essencialmente consistirem em anticorpos de domínio), ou "constru-ções de VHH biparatópicas" (se os domínios variáveis simples da imu- noglobulina consistirem ou essencialmente consistirem em VHHs), res-pectivamente, visto que os dois domínios variáveis simples da imuno- globulina incluirão dois parátopos diferentes.
[000141] Se um polipeptídeo da invenção for uma molécula biparató- pica como definida aqui, pelo menos um dos componentes de domínio variável simples da imunoglobulina liga-se a um epítopo de modo que a interação entre o VEGF humano recombinante e VEGFR-2 humano re- combinante é bloqueada a uma taxa de inibição de > 80%. Como foi mostrado em experimentos da invenção, certas moléculas formatadas contêm dois VHHs que ambos bloqueiam o receptor de VEGFR2 a uma taxa de inibição de > 80%. Certos VHHs da invenção bloqueiam o VEGFR-2 a uma taxa de inibição de 100%, isto é, os mesmos são blo- queadores completos.
[000142] Em ambos os casos, sequências e metades adicionais podem estar presentes dentro dos componentes de ligação a VEGF da invenção, por exemplo, N-terminal, C-terminalmente, ou localizadas entre os dois domínios variáveis simples da imunoglobulina, por exemplo sequências de ligador e sequências que fornecem funções efetoras, como exposto em mais detalhe aqui.
[000143] De acordo com outra modalidade, embora menos preferida, um componente de ligação a VEGF da invenção pode incluir mais de dois domínios variáveis simples da imunoglobulina anti-VEGF, isto é, três, quatro ou até mesmo mais VHHs de anti-VEGF. Neste caso, pelo menos dois dos domínios variáveis simples da imunoglobulina anti- VEGF são direcionados contra epítopos não-sobrepostos dentro da molécula de VEGF, em que qualquer domínio variável simples da imuno- globulina ainda pode ligar-se a qualquer um dos dois epítopos de não- sobreposição e/ou um epítopo ainda presente na molécula de VEGF.
[000144] De acordo com a invenção, os dois ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina podem ser, independentemente um do outro, VHHs ou anticorpos de domínio, e/ou qualquer outro tipo de domínios variáveis simples da imunoglobulina, tais como domínios VL, como definidos aqui, contanto que estes domínios variáveis simples da imunoglobulina liguem-se ao antígeno, isto é, VEGF ou angiopoietina, respectivamente.
[000145] A descrição detalhada dos componentes de ligação é provida primariamente para o componente de ligação a VEGF. Porém, todas as características e opções esboçadas aqui para o componente de ligação a VEGF também se aplicam ao componente de ligação a Ang2, mutatis mutandis, equivalentemente.
[000146] De acordo com as modalidades preferidas, as moléculas de ligação presentes nas moléculas de ligação biespecíficas (as moléculas de ligação a Ang2 dentro do componente de ligação a Ang2 ou as mo-léculas de ligação a VEGF dentro do componente de ligação a VEGF ou os dois componentes de ligação a Ang2 e VEGFs adjacentes) podem estar conectados entre si diretamente (isto é, sem o uso de um ligador) ou por meio de um ligador. O ligador é preferivelmente um peptídeo li- gador e será selecionado para permitir ligação das duas moléculas de ligação diferentes a cada uns dos epítopos de não-sobreposição dos alvos, ou dentro de um e da mesma molécula alvo, ou dentro de duas moléculas diferentes.
[000147] No caso moléculas de ligação biparatópicas, a seleção dos ligadores dentro do componente de ligação a Ang2 ou VEGF dependerá, inter alia, dos epítopos e, especificamente, da distância entre os epítopos no alvo ao qual os domínios variáveis simples da imunoglobu- lina se ligam, e estará claro à pessoa versada com base na revelação aqui, opcionalmente após algum grau limitado de experimentação rotineira.
[000148] Duas moléculas de ligação (dois VHHs ou anticorpos de do-mínio ou VHH e um anticorpo de domínio), ou dois componentes de li-gação, podem estar ligados um ao outro por meio de um VHH adicional ou anticorpo de domínio, respectivamente (em tais moléculas de ligação, os dois ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina podem ser ligados diretamente ao dito domínio variável simples da imuno- globulina adicional ou por meio de ligadores adequados). Um tal VHH adicional ou anticorpo de domínio pode ser, por exemplo, um VHH ou anticorpo de domínio que fornece uma meia-vida aumentada. Por exemplo, o último VHH ou anticorpo de domínio pode ser um que seja capaz de ligar-se a uma proteína de soro (humana) tal como albumina sérica (humana) ou transferrina (humana).
[000149] Alternativamente, os dois ou mais domínios variáveis simples da imunoglobulina que se ligam ao respectivo alvo podem ser ligados em série (ou diretamente ou por meio de um ligador adequado) e o VHH adicional ou anticorpo de domínio (que pode fornecer meia-vida aumentada) pode ser conectado diretamente ou por meio de um ligador a uma destas duas ou mais sequências de imunoglobulina acima men-cionadas.
[000150] Os ligadores adequados aqui são descritos com relação aos polipeptídeos específicos da invenção e pode compreender - por exemplo e sem limitação - uma sequência de aminoácido cuja sequência de aminoácido preferivelmente tem um comprimento de 9 ou mais amino- ácidos, mais preferivelmente pelo menos 17 aminoácidos, tal como cerca de 20 a 40 aminoácidos. Porém, o limite superior não é crítico mas é escolhido por motivo de conveniência considerando, por exemplo, a produção biofarmacêutica de tais polipeptídeos.
[000151] A sequência de ligador pode ser uma sequência de ocorrência natural ou uma sequência de ocorrência não-natural. Se usado para propósitos terapêuticos, o ligador é preferivelmente não-imunogênico no sujeito ao qual a molécula de ligação biespecífica da invenção é admi-nistrada.
[000152] Um grupo útil das sequências de ligador são ligadores deri-vados da região de dobradiça de anticorpos de cadeia pesada como descrito no WO1996/34103 e no WO1994/04678.
[000153] Outros exemplos são sequências de ligador de poli-alanina tal como Ala - Ala - Ala.
[000154] Outros exemplos preferidos das sequências de ligador são ligadores de Gly/Ser de comprimento diferente tal como (ligadores de glyxsery)z, incluindo (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3, e (gly3ser2)3.
[000155] Alguns exemplos não-limitativos de ligadores estão contidos nas moléculas de ligação biespecíficas da invenção mostradas na Tabela 15 (SEQ ID NOs 128 - 168), por exemplo os ligadores: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (35GS; SEQ ID NO: 169); GGGGSGGGS (9GS; SEQ ID NO: 170); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (40GS; SEQ ID NO: 171).
[000156] Se uma molécula de ligação biespecífica formatada da invenção for modificada pela ligação de um polímero, por exemplo de uma metade de polietileno glicol PEG (polietileno glicol), a sequência de ligador preferivelmente inclui um resíduo de aminoácido, tal como uma cisteína ou uma lisina, permitindo tal modificação, por exemplo PEGila- ção, na região do ligador.
[000157] Exemplos de ligadores úteis para a PEGilação são: GGGGCGGGS ("GS9,C5", SEQ ID NO: 172); GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS25,C5", SEQ ID NO: 173) GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG ("GS27,C14", SEQ ID NO: 174), GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS35,C15", SEQ ID NO: 175), e GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS35,C5", SEQ ID NO: 176).
[000158] Além disso, o ligador pode ser também uma metade de poli(etileno) glicol, como mostrado, por exemplo, no WO2004/081026.
[000159] Em outra modalidade, os domínios variáveis simples da imu- noglobulina são ligados entre si por meio de outra metade (opcionalmente por meio de uma ou dois ligadores), tais como outro polipeptídeo que, em uma modalidade preferida mas não-limitativa, pode ser um outro domínio variável simples da imunoglobulina como descrito acima. Tal metade pode ser essencialmente inativa ou pode ter um efeito biológico tal como melhorar as propriedades desejadas do polipeptídeo ou pode conferir uma ou mais propriedades adicionais desejadas ao polipeptí- deo. Por exemplo, e sem limitação, a metade pode melhorar a meia- vida da proteína ou polipeptídeo, e/ou reduzir sua imunogenicidade ou melhorar qualquer outra propriedade desejada.
[000160] De acordo com uma modalidade preferida, uma molécula de ligação biespecífica da invenção inclui, especialmente quando intencionado para o uso ou usada como um agente terapêutico, uma metade que estende a meia-vida do polipeptídeo da invenção em soro ou outros fluidos do corpo de um paciente. O termo "meia-vida" é definido como o tempo que leva para a concentração de soro do polipeptí- deo (modificado) reduzir em 50%, in vivo, por exemplo devido à degradação do polipeptídeo e/ou depuração e/ou sequestro por mecanismos naturais.
[000161] Mais especificamente, tal metade de extensão da meia-vida pode ser covalentemente ligada ou fundida a um domínio variável sim-ples da imunoglobulina e pode ser, sem limitação, uma porção de Fc, uma metade de albumina, um fragmento de uma metade de albumina, uma metade de ligação da albumina, tal como um domínio variável sim-ples da imunoglobulina antialbumina, uma metade de ligação da trans- ferrina, tal como um domínio variável simples da imunoglobulina de an- titransferrina, uma molécula de polioxialquileno, tal como uma molécula de polietileno glicol, um peptídeo de ligação de albumina ou um derivado de hidroxietil amido (HES).
[000162] Em outra modalidade, a molécula de ligação biespecífica da invenção compreende uma metade que liga a um antígeno encontrado no sangue, tal como albumina sérica, imunoglobulinas séricas, proteína de ligação à tiroxina, fibrinogênio ou transferrina, assim conferindo uma meia-vida aumentada in vivo ao polipeptídeo resultante da invenção. De acordo com uma modalidade especificamente preferida, tal metade é uma imunoglobulina de ligação à albumina e, especialmente preferido, um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação à albumina tal como um domínio VHH de ligação à albumina.
[000163] Se intencionado para o uso em seres humanos, tal domínio variável simples da imunoglobulina de ligação à albumina preferivelmente se liga à albumina sérica humana e preferivelmente é um domínio VHH de ligação à albumina humanizada.
[000164] Domínios variáveis simples da imunoglobulina que se ligam à albumina sérica humana são conhecidos na técnica e são descritos em mais detalhes, por exemplo, no WO2006/122786. Especificamente, VHHs de ligação à albumina úteis são ALB 1 e sua contraparte humanizada, ALB 8 (WO2009/095489). Outros domínios VHH de ligação à albumina mencionados na publicação de patente acima podem ser, no entanto, usados também.
[000165] Um domínio VHH de ligação à albumina especificamente útil é ALB8 que consiste ou contém a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 98 ou 254.
[000166] De acordo com uma outra modalidade da invenção, os dois domínios variáveis simples da imunoglobulina, preferivelmente em VHHs, podem ser fundidos a uma molécula de albumina sérica, tal como descrito por exemplo no WO2001/79271 e no WO2003/59934. Por exemplo, como descrito no WO2001/79271, a proteína de fusão pode ser obtida através de tecnologia recombinante convencional: uma molécula de DNA que codifica para albumina sérica, ou um fragmento da mesma, é unida ao DNA que codifica para a molécula de ligação bies- pecífica, a construção obtida é inserida em um plasmídeo adequado para expressão na célula hospedeira selecionada, por exemplo, uma célula de levedura como Pichia pastoris ou uma célula bacteriana, e a célula hospedeira é depois transfeccionada com a sequência de nucle- otídeo fundida e cultivada sob condições adequadas. A sequência de um HSA útil é mostrada na SEQ ID NO: 99.
[000167] De acordo com outra modalidade, uma meia-vida que estende a modificação de um polipeptídeo da invenção (tal modificação também reduzindo a imunogenicidade do polipeptídeo) compreende a ligação de um polímero farmacologicamente aceitável adequado, tal como poli(etileno) glicol de cadeia reta ou ramificada) (PEG) ou derivados do mesmo (tal como metoxipoli(etileno glicol) ou mPEG). Em geral, qualquer forma adequada de PEGilação pode ser usada, tal como a PE- Gilação usada na técnica para anticorpos e fragmentos de anticorpos (incluindo mas não limitados a anticorpos de domínio e scFv’s); referên-cia é feita, por exemplo, a: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese e Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris e Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); e no WO2004/060965.
[000168] Vários reagentes para PEGilação dos polipeptídeos estão também comercialmente disponíveis, por exemplo de Nektar Therapeu-tics, EUA, ou NOF Corporation, Japão, tal como a Série EA, Série SH, Série MA, Série CA, e Série ME da Sunbright®, tal como Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, e Sunbright® ME-400MA.
[000169] Preferivelmente, a PEGilação loco-direcionada é usada, em particular por meio de um resíduo de cisteína (vide por exemplo Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)). Por exemplo, para este propósito, PEG pode ser ligado a um resíduo de cisteína que natural-mente ocorre em um polipeptídeo da invenção, um polipeptídeo da in-venção pode ser modificado para adequadamente introduzir um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG, ou uma sequência de amino- ácido compreendendo um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG pode ser fundida ao término N e/ou C de um polipeptídeo da in-venção, tudo usando as técnicas de engenharia de proteína conhecida per se à pessoa versada.
[000170] Preferivelmente, para os polipeptídeos da invenção, um PEG é usado com um peso molecular de mais de 5 kDa, tal como mais de 10 kDa e menos de 200 kDa, tal como menos de 100 kDa; por exemplo na faixa de 20 kDa a 80 kDa.
[000171] Com respeito à PEGilação, deveria ser observado que em geral, a invenção também abrange qualquer molécula de ligação bies- pecífica que foi PEGilada em uma ou mais posições de aminoácido, pre-ferivelmente em um tal modo que a dita PEGilação ou (1) aumenta a meia-vida in vivo; (2) reduz a imunogenicidade; (3) fornece uma ou mais outras propriedades benéficas conhecidas per se para PEGilação; (4) não essencialmente afeta a afinidade do polipeptídeo por seu alvo (por exemplo, não reduza a dita afinidade em mais que 50 %, e mais prefe-rivelmente em não mais que 10%, como determinado por um ensaio adequado descrito na técnica); e/ou (4) não afeta nenhuma das outras propriedades desejadas das moléculas de ligação biespecíficas da in-venção. Grupos PEG adequados e métodos para ligar os mesmos, es-pecífica ou não-especificamente, estarão claros à pessoa versada. Vá-rios reagentes para PEGilação de polipeptídeos estão também comer-cialmente disponíveis, por exemplo, de Nektar Therapeutics, EUA, ou NOF Corporation, Japão, tal como a Série EA, Série SH, Série MA, Série CA, e Série EM da Sunbright®, tal como Sunbright® ME-100MA, Sun-bright® ME-200MA, e Sunbright® ME-400MA.
[000172] De acordo com uma modalidade especialmente preferida da invenção, um polipeptídeo PEGilado da invenção inclui uma metade de PEG de PEG linear tendo um peso molecular de 40 kDa ou 60 kDa, em que a metade de PEG é ligada ao polipeptídeo em uma região de ligador e, especificamente, a um resíduo Cys na posição 5 de um peptídeo li- gador de GS9 como mostrado na SEQ ID NO: 93, na posição 14 de um peptídeo ligador de GS27 como mostrado na SEQ ID NO: 95, ou na posição 15 de um peptídeo ligador de GS35 como mostrado na SEQ ID NO: 96, ou na posição 5 de um peptídeo ligador de 35GS como mostrado na SEQ ID NO: 97.
[000173] Uma molécula de ligação biespecífica da invenção pode ser PEGilada com um dos reagentes de PEG como mencionados acima, tal como "Sunbright® ME-400MA", como mostrado na fórmula química se-guinte:
Figure img0001
[000174] As moléculas de ligação biespecíficas contendo ligadores e/ou grupos de extensão de meia-vida funcionais são mostradas na SEQ ID NO: 81 e na Figura 48.
[000175] De acordo com outra modalidade, os domínios variáveis sim-ples da imunoglobulina são anticorpos de domínio, como definidos aqui.
[000176] Os domínios variáveis simples da imunoglobulina presentes nas moléculas de ligação biespecíficas da invenção podem também ter sequências que correspondam à sequência de aminoácido de um do-mínio VH de ocorrência natural que foi "camelizado", isto é, substituindo um ou mais resíduos de aminoácido na sequência de aminoácido de uma cadeia pesada variável de ocorrência natural de um anticorpo con-vencional de 4 cadeias por um ou mais resíduos de aminoácido que ocorrem na(s) posição(ões) correspondente(s) em um domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada. Isso pode ser executado de uma maneira conhecida per se que estará claro à pessoa versada e referência é adicionalmente feita ao WO1994/04678. Tal camelização pode ocorrer preferencialmente nas posições de aminoácido que estão presentes na interface de VH-VL e nos assim-chamados resíduos de Camelidae Hall-mark (vide por exemplo também o WO1994/04678). Uma descrição de-talhada de tal "humanização" e técnicas de "camelização" e sequências de região de estrutura preferidas consistentes com as mesmas podem ser adicionalmente tirados, por exemplo, da pág. 46 e pág. 98 do WO2006/040153 e pág. 107 do WO2006/122786.
[000177] Os componentes de ligação têm especificidade para Ang2 ou VEGF, respectivamente, em que eles compreendem em uma modalidade preferida um ou mais domínios variáveis simples da imunoglobu- lina que especificamente ligam a um ou mais epítopos dentro da molécula de Ang2 ou dentro da molécula de VEGF, respectivamente.
[000178] A ligação específica de um componente de ligação a seu an- tígeno Ang2 ou VEGF pode ser determinada de qualquer maneira ade-quada conhecida per se, incluindo, por exemplo, os ensaios descritos aqui, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva, tais como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA e ELISA) e ensaios de competição em sanduíche, e as variantes diferentes dos mesmos conhecidas per se na técnica.
[000179] Com respeito ao antígeno Ang2 ou VEGF, respectivamente, um domínio variável simples da imunoglobulina não está limitado com respeito às espécies. Desse modo, os domínios variáveis simples da imunoglobulina preferivelmente ligam-se a Ang2 humano ou a VEGF humano, respectivamente, se intencionado para propósitos terapêuticos em humanos. Porém, os domínios variáveis simples da imunoglobulina que se ligam a Ang2 ou VEGF, respectivamente, de outras espécies mamíferas, ou polipeptídeos contendo os mesmos, estão também dentro do escopo da invenção. Um domínio variável simples da imunoglo- bulina que se liga a uma forma de espécie de Ang2 ou VEGF pode reagir cruzado com o respectivo antígeno de uma ou mais outras espécies. Por exemplo, os domínios variáveis simples da imunoglobulina que se ligam ao antígeno humano podem exibir reatividade cruzada com o respectivo antígeno de uma ou mais outras espécies de primatas e/ou com o antígeno de uma ou mais espécies de animais que são usados em modelos de animais para doenças, por exemplo macaco (em particular Cinomólogo ou Reso), camundongo, rato, coelho, porco, cão ou) e em particular em modelos de animais para doenças e distúrbios que podem ser modulados por inibição de Ang2 (tais como as espécies e modelos de animais mencionados aqui). Domínios variáveis simples da imuno- globulina da invenção que mostram tal reatividade cruzada são vantajo-sos em uma investigação e/ou desenvolvimento de fármaco, uma vez que permite os domínios variáveis simples da imunoglobulina da inven-ção serem testados em modelos de doença reconhecidos tais como ma-cacos, em particular Cinomólogo ou Reso, ou camundongos e ratos.
[000180] Também, os componentes de ligação não são limitados ou definidos por um domínio específico ou um determinante antigênico do antígeno contra o qual são direcionados. Preferivelmente, em vista da reatividade cruzada com uma ou mais moléculas de antígeno de espé-cies diferentes de humana que é/são intencionadas para o uso como um modelo animal durante o desenvolvimento de um antagonista de Ang2/VEGF terapêutico, um componente de ligação reconhece um epí- topo em uma região do respectivo antígeno tendo um grau alto de iden-tidade com o antígeno humano. Por via de exemplo, em vista de usar um modelo de camundongo, um domínio variável simples da imunoglo- bulina de anti-Ang2 contido nas moléculas de ligação biespecíficas da invenção reconhece um epítopo que está, totalmente ou em parte, loca-lizado dentro do domínio de FLD de Ang2, que mostra uma identidade alta entre o humano e camundongo.
[000181] Preferivelmente, o componente de ligação a VEGF liga às isoformas de VEGF VEGF165 e/ou VEGF121.
[000182] Em outro aspecto, a invenção diz respeito às moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de ligação biespecíficas da invenção. Tais moléculas de ácido nucleico serão também referidas aqui como "ácidos nucleicos da invenção" e podem também ser na forma de uma construção genética, como definida aqui. Um ácido nucleico da in-venção pode ser DNA genômico, cDNA ou DNA sintético (tal como DNA com um uso de códon que foi especificamente adaptado para a expres-são na célula hospedeira ou organismo hospedeiro intencionado). De acordo com uma modalidade da invenção, o ácido nucleico da invenção é essencialmente na forma isolada, como definido mais acima.
[000183] O ácido nucleico da invenção pode também ser na forma, pode estar presente e/ou pode fazer parte de um vetor, tal como por exemplo um plasmídeo, cosmídeo ou YAC. O vetor pode ser especial-mente um vetor de expressão, isto é, um vetor que pode fornecer ex-pressão da molécula de ligação biespecífica in vitro e/ou in vivo (isto é, em uma célula hospedeira, organismo hospedeiro e/ou sistema de ex-pressão adequados). Tal vetor de expressão em geral compreende pelo menos um ácido nucleico da invenção que está operavelmente ligado a um ou mais elementos reguladores adequados, tais como promotor(es), intensificador(es), terminador(es), e outros. Tais elementos e sua sele-ção em vista da expressão de uma sequência específica em um hospe-deiro específico são de conhecimento comum da pessoa versada. Exemplos específicos de elementos reguladores e outros elementos úteis ou necessários para expressar as moléculas de ligação biespecí- ficas da invenção, tais como promotores, intensificadores, terminadores, fatores de integração, marcadores de seleção, sequências líder, genes repórter, e outros, são revelados, por exemplo, nas pp.. 131 a 133 do WO2006/040153.
[000184] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados ou obtidos de uma maneira conhecida per se (por exemplo, através da sín-tese de DNA automatizada e/ou tecnologia de DNA recombinante), com base na informação sobre as sequências de aminoácido para os poli- peptídeos da invenção dados aqui, e/ou podem ser isolados de uma fonte natural adequada.
[000185] Em outro aspecto, a invenção diz respeito às células hospe-deiras que expressam ou que são capazes de expressar uma ou mais moléculas de ligação biespecíficas da invenção; e/ou que contêm um ácido nucleico da invenção. De acordo com uma modalidade particular-mente preferida, as ditas células hospedeiras são células bacterianas; outras células úteis são células de levedura, células fúngicas ou células mamíferas.
[000186] As células bacterianas adequadas incluem células de cepas bacterianas gram-negativas tais como cepas de Escherichia coli, Pro-teus, e Pseudomonas, e cepas bacterianas gram-positivas tais como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, e Lactococcus. Célula fúngica adequada inclui células de espécies de Trichoderma, Neu- rospora, e Aspergillus. Células de levedura adequadas incluem células de espécies de Saccharomyces (por exemplo Saccharomyces cerevi- siae), Schizosaccharomyces (por exemplo Schizosaccharomyces pombe), Pichia (por exemplo Pichia pastoris e Pichia methanolica), e Hansenula.
[000187] As células mamíferas adequadas incluem por exemplo células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, e outras. Porém, células de anfíbios, células de insetos, células de plantas, e quaisquer outras células usadas na técnica para a expressão de proteínas heterólo- gas podem ser usadas também.
[000188] A invenção ainda fornece métodos de fabricar uma molécula de ligação biespecífica da invenção, tais métodos em geral compreendendo as etapas de: - cultivar as células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico capaz de codificar uma molécula de ligação biespecífica sob condições que permitem a expressão da molécula de ligação biespecí- fica da invenção; e - recuperar ou isolar o polipeptídeo expressado pelas células hospedeiras da cultura; e - opcionalmente ainda purificar e/ou modificar e/ou formular a molécula de ligação biespecífica da invenção.
[000189] Para produção em uma escala industrial, organismos hospe-deiros preferidos incluem cepas de E. coli, Pichia pastoris, e S. cerevi- siae que são adequadas para expressão em escala grande, produção e fermentação, e em particular para expressão, produção e fermentação farmacêuticas em grande escala.
[000190] A escolha do sistema de expressão específico depende em parte do requerimento para certas modificações pós-translacionais, mais especificamente glicosilação. A produção de uma molécula de ligação biespecífica da invenção para a qual glicosilação é desejada ou requerida necessitaria de o uso de hospedeiros de expressão mamífera tendo a habilidade para glicosilar a proteína expressa. Neste respeito, estará claro à pessoa versada que o padrão de glicosilação obtido (isto é, o tipo, número e posição dos resíduos ligados) dependerá da célula ou linhagem celular sendo usada para a expressão.
[000191] As moléculas de ligação biespecíficas da invenção podem ser produzidas ou em uma célula como exposto acima intracelularmente (por exemplo no citosol, no periplasma ou em corpos de inclusão) e depois isoladas das células hospedeiras e opcionalmente ainda purificadas; ou elas podem ser produzidas extracelularmente (por exemplo no meio no qual as células hospedeiras são cultivadas) e depois isoladas do meio de cultura e opcionalmente ainda purificadas.
[000192] Métodos e reagentes usados para a produção recombinante dos polipeptídeos, tais como vetores de expressão adequados específicos, métodos de transformação ou transfecção, marcadores de seleção, métodos de indução de expressão de proteína, condições de cultura, e outros, são conhecidos na técnica. Similarmente, as técnicas de isolamento e purificação de proteína úteis em um método de fabricação de um polipeptídeo da invenção são bem conhecidas à pessoa versada.
[000193] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um peptídeo tendo uma sequência de aminoácido de uma CDR3 contida em um anti- VEGF-VHH tendo uma sequência de aminoácido selecionada das se-quências mostradas nas SEQ ID NOs: 9 a 57 ou SEQ ID NOs: 58 - 127, respectivamente, e uma molécula de ácido nucleico codificando a mesma.
[000194] Estes peptídeos correspondem às CDR3s derivadas dos VHHs da invenção. Eles, em particular as moléculas de ácido nucleico codificando os mesmos, são úteis para enxerto de CDR para substituir uma CDR3 em uma cadeia de imunoglobulina, ou para inserção em um andaime de não-imunoglobulina, por exemplo um inibidor de protease, proteína de ligação de DNA, citocromo b562, uma proteína de feixe de hélices, um peptídeo ligado a dissulfeto, uma lipocalina ou uma antica- lina, desse modo conferindo propriedades de ligação ao alvo a tal an-daime. O método de enxerto de CDR é bem conhecido na técnica e foi extensamente usado, por exemplo para humanizar anticorpos (que usu-almente compreende enxertar as CDRs de um anticorpo roedor sobre as estruturas de Fv de um anticorpo humano).
[000195] Para obter uma imunoglobulina ou um andaime de não-imu- noglobulina contendo uma CDR3 da invenção, o DNA que codifica tal molécula pode ser obtido de acordo com os métodos padrões de biologia molecular, por exemplo através de síntese gênica, por anelamento de oligonucleotídeo ou por meio de fragmentos de PCR sobrepostos, como por exemplo descrito por Daugherty et al., 1991, Nucleic Acids Research, Vol. 19, 9, 2471 - 2476. Um método para inserir uma CDR3 de VHH em um andaime de não-imunoglobulina foi descrito por Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13, 1882 - 1891.
[000196] A invenção ainda diz respeito a um produto ou composição contendo ou compreendendo pelo menos uma molécula de ligação bi- específica da invenção e opcionalmente um ou mais componentes adi-cionais de tais composições conhecidas per se, isto é, dependendo do uso intencionado da composição.
[000197] Para o uso farmacêutico, uma molécula de ligação biespecí- fica da invenção pode ser formulada como uma preparação ou compo-sição farmacêutica compreendendo pelo menos uma molécula de ligação biespecífica da invenção e pelo menos um veículo, diluente ou excipiente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis, e opcionalmente um ou mais outros polipeptídeos e/ou compostos farmaceutica- mente ativos. Por meio de exemplos não-limitativos, uma tal formulação pode ser em uma forma adequada para administração oral, para administração parenteral (tal como por injeção intravenosa, intramuscular ou subcutânea ou infusão intravenosa), para administração tópica, para ad-ministração por inalação, por um emplastro de pele, por um implante, por um supositório, etc. Tal forma de administração adequada - que pode ser sólida, semissólida ou líquida, dependendo da maneira de administração - como também métodos e veículos para o uso em sua preparação, estarão claros à pessoa versada, e são adicionalmente descritos aqui.
[000198] Desse modo, em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica contendo pelo menos uma molécula de ligação biespecífica, em particular um domínio variável simples da imunoglobulina, da invenção e pelo menos um veículo, diluente ou ex- cipiente adequados (isto é, adequados para uso farmacêutico), e opcio-nalmente uma ou mais outras substâncias ativas.
[000199] As moléculas de ligação biespecíficas da invenção podem ser formuladas e administradas de qualquer maneira adequada conhecida per se: Referência, em particular por domínios variáveis simples da imunoglobulina, é feita, por exemplo, ao WO2004/041862, WO2004/041863, WO2004/041865, WO2004/041867 e WO2008/020079, como também pelos manuais padrões, tais como Re-mington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Publishing Company, EUA (1990), Remington, Science and Practice of Pharmacy, 21a Edição, Lippincott Williams e Wilkins (2005); ou Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (vide por exemplo páginas 252-255).
[000200] Por exemplo, um domínio variável simples da imunoglobulina da invenção pode ser formulado e administrado de qualquer maneira conhecida per se para anticorpos convencionais e fragmentos de anti-corpos (incluindo ScFv’s e diacorpos) e outras proteínas farmaceutica- mente ativas. Tais formulações e métodos para preparar os mesmos estarão claro à pessoa versada, e por exemplo incluem preparações adequadas para administração parenteral (por exemplo administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intraluminal, in-tra-arterial ou intratecal) ou para administração tópica (isto é, transdér- mica ou intradérmica).
[000201] As preparações para administração parenteral podem ser, por exemplo, soluções, suspensões, dispersões ou emulsões estéreis que sejam adequadas para infusão ou injeção. Por exemplo, veículos ou diluentes adequados para tais preparações incluem, sem limitação, água estéril e tampões aquosos farmaceuticamente aceitáveis e soluções tais como solução salina fisiológica tamponada com fosfato, soluções de Ringer, solução de dextrose, e a solução de Hank; óleos de água; glicerol; etanol; glicóis tais como propileno glicol ou como também óleos minerais, óleos animais e óleos vegetais, por exemplo óleo de amendoim, óleo de soja, como também misturas adequadas dos mes-mos. Usualmente, soluções ou suspensões aquosas serão preferidas.
[000202] Desse modo, a molécula de ligação biespecífica da invenção pode ser sistemicamente administrada, por exemplo, oralmente, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável tal como um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. Para administração terapêutica oral, a molécula de ligação biespecífica da invenção pode ser combinada com um ou mais excipientes e usada na forma de tabletes ingeríveis, tabletes bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas, e outros. Tais composições e preparações deveriam conter pelo menos 0,1% da molécula de ligação da invenção. Sua porcentagem nas composições e preparações pode ser variada, claro, e pode ser convenientemente entre cerca de 2 a cerca de 60% do peso de uma forma de dosagem de unidade dada. A quantidade da mo-lécula de ligação biespecífica da invenção em tais composições tera- peuticamente úteis é de modo que um nível de dosagem efetivo seja obtido.
[000203] Os tabletes, pílulas, cápsulas, e outros podem também conter aglutinantes, excipientes, agentes desintegrantes, lubrificantes e agentes adocicantes ou aromatizantes, por exemplo aqueles mencionados nas páginas 143-144 do WO2008/020079. Quando a forma de dosagem de unidade for uma cápsula, pode conter, além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido, tal como um óleo vegetal ou um polieti- leno glicol. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para do contrário modificar a forma física da forma de dosagem de unidade sólida. Por exemplo, tabletes, pílulas, ou cápsulas podem ser revestidos com gelatina, cera, goma-laca ou açúcar e outros. Um xarope ou elixir podem conter as moléculas de ligação da invenção, sacarose ou frutose como um agente adoçante, metil e propilparabenos como conservantes, uma tintura e condimento tal como sabor cereja ou laranja. Claro que, qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem de unidade deveria ser farmaceuticamente aceitável e substancialmente não-tóxico nas quantidades empregadas. Além disso, as moléculas de ligação biespecíficas da invenção podem ser in-corporadas em preparações e dispositivos de liberação contínua.
[000204] As preparações e formulações para administração oral podem ser também fornecidas com um revestimento entérico que permitirá as construções da invenção resistir ao ambiente gástrico e passar nos intestinos. Mais em geral, as preparações e formulações podem ser adequadamente formuladas para administração oral para liberação em qualquer parte desejada do trato gastrintestinal. Além disso, supositórios adequados podem ser usados para liberação no trato gastrintestinal.
[000205] As moléculas de ligação biespecíficas da invenção podem ser também administradas intravenosa ou intraperitonealmente por infusão ou injeção, como ainda descrito nas páginas 144 e 145 do WO2008/020079.
[000206] Para administração tópica das moléculas de ligação biespe- cíficas da invenção, será em geral desejável as administrar à pele como composições ou formulações, em combinação com um veículo derma- tologicamente aceitável que pode ser um sólido ou um líquido como ainda descrito na página 145 do WO2008/020079.
[000207] Em geral, a concentração das moléculas de ligação biespe- cíficas da invenção em uma composição líquida, tal como uma loção, será de cerca de 0,1-25 % em peso, preferivelmente de cerca de 0,5-10 % em peso A concentração em uma composição semissólida ou sólida tal como um gel ou um pó será cerca de 0,1-5 % em peso, preferivel-mente cerca de 0,5-2,5 % em peso
[000208] A quantidade das moléculas de ligação biespecíficas da in-venção requerida para o uso no tratamento não só variará com a molé-cula de ligação particular selecionada, mas também com a rota de ad-ministração, a natureza da condição sendo tratada e a idade e condição do paciente e será, por fim, à discrição do médico ou clínico atendente. Também, a dosagem das moléculas de ligação da invenção varia, de-pendendo da célula alvo, tumor, tecido, enxerto, ou órgão.
[000209] A dose desejada pode ser convenientemente apresentada em uma dose única ou como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais subdoses por dia. A própria subdose pode ser ainda dividida, por exemplo, em várias administrações distintas livremente espaçadas; tais como inalações múltiplas de um insuflador ou por aplicação de uma pluralidade de gotas no olho.
[000210] Um regime de administração pode incluir tratamento a longo prazo, diário. Por "a longo prazo" é significado pelo menos duas semanas e preferivelmente, várias semanas, meses, ou anos de duração. Modificações necessárias nesta faixa de dosagem podem ser determi-nadas por alguém de habilidade usual na técnica usando apenas expe-rimentação rotineira dado os ensinamentos aqui. Vide Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E. W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. A dosagem pode ser também ajustada pelo médico individual no caso de qualquer complicação.
[000211] De acordo com uma modalidade adicional, a invenção diz respeito ao uso de moléculas de ligação biespecíficas, por exemplo do-mínios variáveis simples da imunoglobulina, para propósitos terapêuti-cos, tais como: - para a prevenção, tratamento e/ou alívio de um distúrbio, doença ou condição, especialmente em um ser humano, que esteja as-sociado com efeitos mediados por VEGF e/ou Ang2 em angiogênese ou que possa ser impedido, tratado ou aliviado modulando a via de sinali-zação de Notch e/ou a via de sinalização de Tie2 com uma molécula de ligação biespecífica de acordo com a invenção, - em um método de tratamento de um paciente em necessi-dade de tal terapia, tal método compreendendo administrar, a um sujeito em necessidade do mesmo, uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos uma molécula de ligação biespecífica da invenção, por exemplo um domínio variável simples da imunoglobulina, ou uma com-posição farmacêutica contendo a mesma; - para a preparação de um medicamento para a prevenção, tratamento ou alívio de distúrbios, doenças ou condições associados com efeitos mediados por VEGF e/ou Ang2 em angiogênese; - como um ingrediente ativo em uma composição farmacêu-tica ou medicamento usado para os propósitos acima.
[000212] De acordo com um aspecto específico, o dito distúrbio, doença ou condição é um câncer ou doença cancerosa, como definida aqui.
[000213] De acordo com outro aspecto, a doença é uma doença ocular associada com os efeitos mediados por VEGF e/ou Ang2 em angio- gênese ou que pode ser tratada ou aliviada modulando a via de sinali-zação de Notch com uma molécula de ligação biespecífica.
[000214] Dependendo da doença cancerosa a ser tratada, uma molécula de ligação biespecífica da invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, em par-ticular selecionados de agentes quimioterapêuticos como agentes pre-judiciais de DNA ou compostos terapeuticamente ativos que inibem an- giogênese, vias de transdução de sinal ou pontos de verificação mitóti- cos nas células cancerosas.
[000215] O agente terapêutico adicional pode ser administrado simul-taneamente, opcionalmente como um componente da mesma preparação farmacêutica, ou antes ou após a administração da molécula de ligação.
[000216] Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional pode ser, sem limitação (e no caso dos receptores, incluindo os respectivos ligantes), um ou mais inibidores selecionados do grupo de inibidores de EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK e PI3 cinase, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R ou IR.
[000217] Mais exemplos dos agentes terapêuticos adicionais são ini-bidores de CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, antagonistas de ouriço, inibidores de JAK/STAT, MEK, mTor, NFcapaB, proteassoma, Rho, um inibidor de sinalização de wnt ou um inibidor da via de ubiquitinação ou outro inibidor da via de sinalização de Notch.
[000218] Exemplos para inibidores de Aurora são, sem limitação, PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.
[000219] Um exemplo para um inibidor de PLK é GSK-461364.
[000220] Exemplos para inibidores de raf são BAY-73-4506 (também um inibidor de VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (também, além disso, um inibidor de VEGFR), sorafenib (também, além disso, um inibidor de VEGFR), e XL 281.
[000221] Exemplos para inibidores de KSP são ispinesib, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731, e SB- 743921.
[000222] Exemplos para inibidores de src e/ou de bcr-abl são dasati- nib, AZD-0530, bosutinib, XL 228 (também um inibidor de IGF-1R), nilo- tinib (também um inibidor de PDGFR e de cKit), imatinib (também um inibidor de cKit), e NS-187.
[000223] Um exemplo para um inibidor de PDK1 é BX-517.
[000224] Um exemplo para um inibidor de Rho é BA-210.
[000225] Exemplos para inibidores de PI3 cinase são PX-866, BEZ- 235 (também um inibidor de mTor), XL 418 (também um inibidor de Akt), XL-147, e XL 765 (também um inibidor de mTor).
[000226] Exemplos para inibidores de cMet ou HGF são XL-184 (também um inibidor de VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (também um inibidor de VEGFR), MGCD-265 (também um inibidor de VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, e AV-299.
[000227] Um exemplo para um inibidor de c-Myc é CX-3543.
[000228] Exemplos para inibidores de Flt3 são AC-220 (também um inibidor de cKit e PDGFR), KW 2449, lestaurtinib (também um inibidor de VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (também um inibidor de JAK2), XL-999 (também um inibidor de cKit, FGFR, PDGFR e VEGFR), suniti- nib (também um inibidor de PDGFR, VEGFR e cKit), e tandutinib (também um inibidor de PDGFR, e cKit).
[000229] Exemplos para inibidores de HSP90 são tanespimicina, alvespimicina, IPI-504 e CNF 2024.
[000230] Exemplos para inibidores de JAK/STAT são CYT-997 (também interagindo com tubulina), TG 101348 (também um inibidor de Flt3), e XL-019.
[000231] Exemplos para inibidores de MEK são ARRY-142886, PD- 325901, AZD-8330, e XL 518.
[000232] Exemplos para inibidores de mTor são temsirolimus, AP- 23573 (que também atua como um inibidor de VEGF), everolimus (um inibidor de VEGF, além disso). XL-765 (também um inibidor de PI3 kinase), e BEZ-235 (também um inibidor de PI3 cinase).
[000233] Exemplos para inibidores de Akt são perifosina, GSK- 690693, RX-0201, e triciribina.
[000234] Exemplos para inibidores de cKit são AB-1010, OSI-930 (também atua como um inibidor de VEGFR), AC-220 (também um inibidor de Flt3 e PDGFR), tandutinib (também um inibidor de Flt3 e PDGFR), axitinib (também um inibidor de VEGFR e PDGFR), XL-999 (também um inibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), sunitinib (também um inibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR), e XL-820 (também atua como um inibidor de VEGFR e de PDGFR), imatinib (também um inibidor de bcr-abl), nilotinib (também um inibidor de bcr-abl e PDGFR).
[000235] Exemplos para antagonistas de ouriço são IPI-609 e CUR- 61414.
[000236] Exemplos para inibidores de CDK são seliciclib, A-7519, P276, ZK-CDK (também inibindo VEGFR2 e PDGFR), PD-332991, R- 547, SNS-032, PHA-690509, e AG 024322.
[000237] Exemplos para inibidores de proteassoma são bortezomib, carfilzomib, e NPI-0052 (também um inibidor de NFcapaB).
[000238] Um exemplo para um inibidor da via de NFcapaB é NPI- 0052.
[000239] Um exemplo para um inibidor da via de ubiquitinação é HBX- 41108.
[000240] Em modalidades preferidas, o agente terapêutico adicional é um agente antiangiogênico.
[000241] Exemplos para agentes antiangiogênicos são inibidores do FGFR, PDGFR e VEGFR ou o respectivo ligantes (por exemplo inibido-res de VEGF como pegaptanib ou o bevacizumab de anticorpo de anti- VEGF), inibidores de EGFL7, tal como anti-EGFL7 MAb, inibidores de angiopoietin1/2 tal como AMG386, e talidomidas, tais agentes que são selecionados de, sem limitação, bevacizumab, motesanib, CDP-791, SU-14813, telatinib, KRN-951, ZK-CDK (também um inibidor de CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs (fárma- cos imunomodulador), derivado de talidomida CC-4047, lenalidomida, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, brivanib, cediranib, XL-999 (também um inibidor de cKit e Flt3), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (também um inibidor de Flt3), sunitinib (também um inibidor de cKit e Flt3), axitinib (também um inibidor de cKit), lestaurtinib (também um inibidor de Flt3 e PKC), vatalanib, tandutinib (também um inibidor de Flt3 e cKit), pazopa- nib, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E- 7080, CHIR 258, tosilato de sorafenib (também um inibidor de Raf), RAF-265 (também um inibidor de Raf), vandetanib, CP-547632, OSI- 930, AEE-788 (também um inibidor de EGFR e Her2), BAY-57-9352 (também um inibidor de Raf), BAY-73-4506 (também um inibidor de Raf), XL 880 (também um inibidor de cMet), XL-647 (também um inibidor de EGFR e EphB4), XL 820 (também um inibidor de cKit), e nilotinib (também um inibidor de cKit e brc-abl).
[000242] O agente terapêutico adicional pode ser também selecionado de inibidores de EGFR, pode ser um inibidor de EGFR de molécula pequena ou um anticorpo anti-EGFR. Exemplos para anticorpos anti- EGFR, sem limitação, são cetuximab, panitumumab, matuzumab; um exemplo para um inibidor de EGFR de molécula pequena é gefitinib. Outro exemplo para um modulador de EGFR é a toxina de fusão de EGF.
[000243] Entre os inibidores de EGFR e Her2 úteis para combinação com a molécula de ligação biespecífica da invenção estão lapatinib, ge- fitinib, erlotinib, cetuximab, trastuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, vandetanib (também um inibidor de VEGFR), pertuzumab, XL-647, HKI- 272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (também um inibidor de VEGFR), ARRY- 333786, IMC-11F8, Zemab.
[000244] Outros agentes que podem ser vantajosamente combinados em uma terapia com a molécula de ligação biespecífica da invenção são tositumumab e ibritumomab tiuxetan (dois anticorpos de anti-CD20 ra- diomarcados), alemtuzumab (um anticorpo de anti-CD52), denosumab, (um inibidor de ligante do fator de diferenciação osteoclasto), galiximab (um antagonista de CD80), ofatumumab (um inibidor de CD20), zan- olimumab (um antagonista de CD4), SGN40 (um modulador do receptor de ligante de CD40), rituximab (inibidor de CD20), mapatumumab (um agonista do receptor de TRAIL-1), REGN421 (SAR153192) ou OMP- 21M18 (inibidores de Dll4).
[000245] Outros fármacos quimioterapêuticos que podem ser usados em combinação com a molécula de ligação biespecífica da presente in-venção são selecionados de, mas não limitados a hormônios, análogos hormonais e anti-hormonais (por exemplo tamoxifeno, toremifeno, ra- loxifeno, fulvestrant, acetato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalu- tamida, acetato de ciproterona, finasterida, acetato de buserrelina, fludrocortisona, fluoximesterona, medroxiprogesterona, octreotide, ar- zoxifeno, pasireotide, vapreotide), inibidores de aromatase (por exemplo anastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formestano), agonistas e antagonistas de LHRH (por exemplo acetato de goserrelina, leuprolida, abarelix, cetrorelix, deslorrelina, histrelina, triptorrelina), antimetabólitos (por exemplo antifolatos como metotrexato, peme- trexed, análogos de pirimidina como 5 fluorouracila, capecitabina, deci- tabina, nelarabina, e gencitabina, purina e análogos de adenosina tais como tioguanina de mercaptopurina, cladribina e pentostatina, citara- bina, fludarabina); antibióticos antitumorais (por exemplo, antraciclinas como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina, mitomi- cina-C, bleomicina dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, pixantrona, estreptozocina); derivados de platina (por exemplo cisplatina, oxalipla- tina, carboplatina, lobaplatina, satraplatina); agentes de alquilação (por exemplo estramustina, mecloretamina, melfalan, clorambucila, bussul- fano, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiureia, te- mozolomida, nitrosoureias tais como carmustina e lomustina, tiotepa); agentes antimitóticos (por exemplo alcalóides de vinca como vinblas- tina, vindesina, vinorelbina, vinflunina e vincristina; e taxanos como pa-clitaxel, docetaxel e suas formulações, larotaxel; simotaxel, e epotilonas como ixabepilona, patupilona, ZK-EPO); inibidores de topoisomerase (por exemplo epipodofilotoxinas como etoposide e etopofos, teniposide, ansacrina, topotecan, irinotecan) e quimioterapêutica diversa tal como amifostina, anagrelida, interferona alfa, procarbazina, mitotano, e porfí- mero, bexaroteno, celecoxib.
[000246] A eficácia da molécula de ligação biespecífica da invenção ou polipeptídeos, e das composições compreendendo os mesmos, pode ser testada usando qualquer ensaio in vitro adequado, ensaio baseado em célula, ensaio in vivo e/ou modelo animal conhecido per se, ou qualquer combinação dos mesmos, dependendo da doença específica ou distúrbio de interesse. Ensaios adequados e modelos de animais estarão claros à pessoa versada, e por exemplo incluem os ensaios descritos aqui e usados nos Exemplos abaixo, por exemplo um ensaio de proliferação.
[000247] Os dados obtidos nos experimentos da invenção confirmam que as moléculas de ligação biespecíficas da invenção têm propriedades que são superiores àquelas das moléculas de ligação da técnica anterior. Entre tais propriedades está inibição completa da interação de VEGF165-VEGFR2 e um IC50, como pode ser tirado, por exemplo, dos dados do ensaio de ELISA da Figura 1 e Tabela 5 como também os valores de IC50 (nM) para VHHs no ensaio de AlphaScreen como mostrado nas Figuras 3, 17, 18 e Tabela 7; e a KD de afinidade (nM) dos VHHs purificados em VEGF humano recombinante e VEGF de camundongo na Tabela 9, 10 e Figura 5. Também, como mostrado na Tabela 13, os aglutinantes de VEGF da invenção têm potência alta, isto é, na faixa de subnanomolar, no ensaio de proliferação de HUVEC. Isto indica que as moléculas de ligação biespecíficas da invenção são candidatas promissoras para ter eficácia terapêutica em doenças e distúrbios asso-ciados com efeitos mediados por VEGF em angiogênese, tais como câncer.
[000248] De acordo com outra modalidade da invenção, é fornecido um método de diagnosticar uma doença: a) contatando uma amostra com uma molécula de ligação da invenção como definida acima, e b) detectando a ligação da dita molécula de ligação à dita amostra, e c) comparando a ligação detectada na etapa (b) com um pa-drão, em que uma diferença na ligação com relação à dita amostra é diagnóstica de uma doença ou distúrbio associado com efeitos mediados por VEGF e/ou Ang2 em angiogênese.
[000249] Para estes usos e outros, pode ser útil ainda modificar uma molécula de ligação biespecífica da invenção, tal como para introdução de um grupo funcional que é uma parte de um par de ligação específica, tal como o par de ligação de biotina-(estrept)avidina. Um tal grupo fun-cional podem ser usado para ligar a molécula de ligação da invenção à outra proteína, polipeptídeo ou composto químico que está ligado a outra metade do par de ligação, isto é, através de formação do par de ligação. Por exemplo, uma molécula de ligação biespecífica da invenção pode ser conjugada com biotina, e ligada à outra proteína, polipeptídeo, composto ou veículo conjugado para avidina ou estreptavidina. Por exemplo, uma tal molécula de ligação biespecífica conjugada da invenção pode ser usada como um repórter, por exemplo em um sistema de diagnóstico onde um agente produtor de sinal detectável é conjugado com avidina ou estreptavidina.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:
[000250] A Figura 1: VHHs monovalentes purificados bloqueiam a interação de hVEGF165/hVEGFR2-Fc (ELISA)
[000251] A Figura 2: VHHs monovalentes purificados bloqueiam a interação de hVEGF165/hVEGFR1-Fc (ELISA)
[000252] A Figura 3: VHHs monovalentes purificados bloqueiam a interação de hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen)
[000253] A Figura 4: VHHs monovalentes purificados bloqueiam a interação de hVEGF165/hVEGFR1-Fc (AlphaScreen)
[000254] A Figura 5: Ligação de VHHs monovalentes ao VEGF hu mano e de camundongo recombinante (ELISA)
[000255] A Figura 6: Ligação dos VHHs monovalentes a VEGF121 humano
[000256] A Figura 7: VHHs purificados não ligam a VEGFB, VEGFC, VEGFD e PlGF
[000257] A Figura 8: VHHs formatados bloqueiam a interação de hVEGF165/hVEGFR2-Fc (ELISA)
[000258] A Figura 9: VHHs formatados bloqueiam a interação de hVEGF165/hVEGFR1-Fc (ELISA)
[000259] A Figura 10: VHHs formatados bloqueiam a interação de hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen)
[000260] A Figura 11: VHHs formatados bloqueiam a interação de hVEGF165/hVEGFR1-Fc (AlphaScreen)
[000261] A Figura 12: VHHs formatados bloqueiam a interação de mVEGF164/mVEGFR2-Fc (AlphaScreen)
[000262] A Figura 13: VHHs formatados ligam a VEGF de camundongo e humano
[000263] A Figura 14: VHHs formatados não ligam a VEGFB, VEGFC, VEGFD e PlGF
[000264] A Figura 15: VHHs formatados ligam a VEGF121
[000265] A Figura 16: Alinhamento de sequência de VEGFBII23B04 DE VHH com sequência de consenso de linhagem germinal de VH3/JH humano
[000266] A Figura 17: Variantes de VHH de VEGFBII23B04 bloqueiam interação de hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen)
[000267] A Figura 18: Clones otimizados na sequência de VEG- FBII23B04 bloqueiam a interação de hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaS-creen)
[000268] A Figura 19: Alinhamento de sequência de VEGFBII5B05 de VHH com sequência de consenso de linhagem germinal de VH3/JH humano
[000269] A Figura 20: Descrição de VHHs de Ang2 bivalentes
[000270] A Figura 21: VHHs de Ang2 bivalentes purificados que blo-queiam a interação de hAng2-hTie2 (25-1), mAng2-mTie2 (25-2) e cAng2-cTie2 (25-3) (ELISA)
[000271] A Figura 22: VHHs de Ang2 bivalentes purificados que bloqueia a interação de hAng1-hTie2 (ELISA)
[000272] A Figura 23: Descrição de VHHs de VEGFxAng2 trivalentes biespecíficos
[000273] A Figura 24: Nanocorpos de VEGFxAng2 trivalentes purificados que bloqueiam a interação de hVEGF-hVEGFR2 (AlphaScreen)
[000274] A Figura 25: VHHs de VEGFxAng2 trivalentes purificados que bloqueiam a interação de hAng2-hTie2 (ELISA)
[000275] A Figura 26: Descrição de VHHs de VEGFxAng2 trivalentes e tetravalentes biespecíficos
[000276] A Figura 27: VHHs de VEGFxAng2 trivalentes e tetravalentes purificados que bloqueiam a interação hVEGF-hVEGFR2 (31-1) e hVEGF-hVEGFR1 (31-2) (AlphaScreen)
[000277] A Figura 28: VHHs de VEGFxAng2 trivalentes e tetravalentes purificados que bloqueiam a interação de hAng2-hTie2 (32-1), mAng2-mTie2 (32-2) e cAng2-cTie2 (32-3).
[000278] A Figura 29: VHHs de VEGFxAng2 trivalentes e tetravalentes purificados que bloqueiam a sobrevivência de HUVEC mediada por hAng2
[000279] A Figura 30: Sequência de descrição otimizada e VHHs bi- específico de VEGFxAng2 de afinidade
[000280] A Figura 31: VHHs de VEGFxAng2 de VEGFANGBII00022- 25-28 purificados que bloqueiam a interação de hVEGF-hVEGFR2 (351) e hVEGF-hVEGFR1 (35-2) (AlphaScreen)
[000281] A Figura 32: VHHs de VEGFxAng2 de VEGFANGBII00022- 25-28 purificados que se ligam a VEGF165 humano (36-1) e hVEGF121 (36-2) (ELISA)
[000282] A Figura 33: VHHs de VEGFxAng2 de VEGFANGBII00022- 25-28 purificados que se ligam a VEGF164 de (A) camundongo e de (B) rato (ELISA)
[000283] A Figura 34: VHHs de VEGFxAng2 de VEGFANGBII00022- 25-28 purificados que se ligam a (A) VEGF-B humano, (B) VEGF-C humano, (C) VEGF-D humano e (D) PlGF humano (ELISA)
[000284] A Figura 35: VHHs de VEGFxAng2 de VEGFANGBII00022- 25-28 purificados que bloqueiam a interação de hAng2-hTie2 (39-1), mAng2-mTie2 (39-2) e cAng2-cTie2 (39-3) (ELISA)
[000285] A Figura 36: VHHs de VEGFxAng2 de VEGFANGBII00022- 25-28 purificados que bloqueiam a interação de hAng1-hTie2 (ELISA)
[000286] A Figura 37: VHHs de VEGFxAng2 de VEGFANGBII00022- 25-28 purificados que bloqueiam a sobrevivência de HUVEC mediada por hAng2.
MATERIAIS E MÉTODOS: a) TESTE DE PRODUÇÃO E FUNCIONALIDADE DE VEGF109
[000287] Um cDNA que codifica o domínio de ligação do receptor da isoforma do fator de crescimento endotelial vascular humano VEGF165 (GenBank: AAM03108.1; resíduos AA 27 - 135) é clonado no vetor pET28a (Novagen, Madison, WI) e sobre-expressado em E. coli (BL21 Star DE3) como uma proteína insolúvel marcada com His. Expressão é induzida por adição de 1 mM de IPTG e deixada continuar por 4 horas a 37° C. As células são colhidas por centrifugação e lisadas por sonica- ção da pelota de célula. Os corpos de inclusão são isolados através de centrifugação. Após uma etapa de lavagem com 1% Triton X 100 (Sigma-Aldrich), as proteínas são solubilizadas usando 7,5M de clori- drato de guanidina e redobradas através de círculos sucessivos de diá- lise durante a noite usando tampões com concentrações de uréia de-crescentes de 6M até 0M. A proteína redobrada é purificada através de cromatografia de permuta de íons usando uma coluna de MonoQ5/50GL (Amersham BioSciences) seguido por filtração em gel com uma coluna Superdex75 10/300 GL (Amersheim BioSciences). A pureza e a homo-geneidade da proteína são confirmadas por SDS-PAGE e Westen blot. Além disso, atividade de ligação a VEGFR1, VEGFR2 e Bevacizumab é monitorada por ensaio de ELISA. Para este fim, 1 μg/ml de VEGF109 humano recombinante é imobilizado durante a noite a 4° C em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseína (1%). Diluições seriais de VEGFR1, VEGFR2 ou Bevacizumab são acrescentadas à placa revestida com VEGF109 e ligação é detectada usando IgG anti-humana de cabra conjugada com fosfatase alcalina (AP), Fc específico (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA e uma reação enzimática subsequente na presença do substrato PNPP (p-nitrofe- nilfosfato) (Sigma-Aldrich). VEGF109 poderia ligar-se a VEGFR1, VEGFR2 e Bevacizumab, indicando que o VEGF109 produzido é ativo. b) CONJUGAÇÃO DE KLH DE VEGF165 E TESTE DE FUN-CIONALIDADE DE VEGF165 CONJUGADO COM KLH
[000288] VEGF165 humano recombinante (R&D Systems, Mineápo- lis, MN, EUA) é conjugado com hemocianina de lapa de maricultura (ncKLH) usando o kit de EDC Imject Immunogen com ncKLH (Pierce, Rockford, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Conjugação eficiente do polipeptídeo com ncKLH é confirmada através de SDS-PAGE. Funcionalidade da proteína conjugada é verificada por ensaio de ELISA: 2 μg/ml de VEGF165 conjugado KLH são imobilizados durante a noite a 4° C em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseína (1%). Diluições seriais de VEGFR1 ou VEGFR2 são adicionadas e ligação é detectada usando uma IgG anti-humana de cabra conjugada com peroxidase de raiz-forte (HRP), Fc específico (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA) e uma reação enzimática subsequente na presença do substrato TMB (3,3’,5,5’- tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA). A proteína conjugada com KLH ainda poderia interagir com VEGFR1, VEGFR2 e Bevacizu- mab, confirmando que os epítopos relevantes onVEGF165 ainda estão acessíveis.
EXEMPLO1 IMUNIZAÇÃO COM FORMATOS DE VEGF DIFERENTES INDUZ UMA RESPOSTA IMUNE HUMORAL EM LHAMA 1.1 Imunizações
[000289] Após aprovação do Comitê Ético da faculdade de Medicina Veterinária (Ghent Universitário, Bélgica), 4 lhamas (designados No. 264, 265, 266, 267) são imunizados de acordo com os protocolos padrões com 6 injeções intramusculares (100 ou 50 μg/dose em intervalos semanais) de VEGF109 humano recombinante. A primeira injeção no dia 0 é formulada no Adjuvante de Freund Completo (Difco, Detroit, MI, EUA), enquanto as injeções subsequentes são formuladas no Adjuvante de Freund Incompleto (Difco, Detroit, MI, EUA). Além disso, quatro lha- mas (designados No. 234, 235, 280 e 281) são imunizados de acordo com o seguinte protocolo: 5 injeções intramusculares com VEGH165 humano conjugado com KLH (100 ou 50 μg/dose em intervalos quinzenais) seguido por 4 injeções intramusculares de VEGF109 humano (primeira dose de 100 μg seguida por 2 semanas depois com três 50 μg/dose em intervalo semanal). 1.2 Avaliação das respostas imunes induzidas por VEGF no lhama
[000290] Para monitorar titulações em soro específicas de VEGF, um ensaio de ELISA é estabelecido em que 2 μg/mL de VEGF165 ou VEGF109 humano recombinante são imobilizados durante a noite a 4° C em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseína (1%). Após adição das diluições em soro, a IgG total ligada é detectada usando imu- noglobulina de anti-lhama de cabra conjugada com peroxidase de raiz- forte (HRP) (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, EUA) e uma re-ação enzimática subsequente na presença do substrato TMB (3,3’,5,5’- tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA). Para os lhamas 264, 265, 266 e 267, um ensaio de ELISA adicional é executado em que as respostas isótipo-específicas contra VEGF165 e VEGF109 são avalia-das. As respostas isótipo-específicas são detectadas usando mAbs de camundongo que especificamente reconhecem a IgG1 de lhama convencional e as IgG2 e IgG3 de Ihama apenas de cadeia pesada [Da-ley et al. (2005). Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386] seguido por um conjugado de anticamundongo-HRP de coelho (DAKO). Os ensaios de ELISA são desenvolvidos usando TMB como substrato cromogênico e a absorbância é medida a 450nm. As titulações em soro para cada lhama estão descritas na Tabela 1. Tabela 1: Resposta de soro específica mediada por anti- corpo contra ensaio de ELISA de VEGF165 e VEGF109 (revestido com fase sólida de proteína recombinante)
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EXEMPLO 2 CLONAGEM DOS REPERTÓRIOS DE FRAGMENTO DE ANTICORPO APENAS DE CADEIA PESADA E PREPARAÇÃO DO FAGO
[000291] Seguindo a injeção de imunógeno final, tecidos imunes são colhidos como a fonte de células B que produzem os anticorpos de ca-deia pesada dos lhamas imunizados. Tipicamente, duas amostras de sangue de 150 ml, coletadas 4 e 8 dias após a última injeção de antígeno, e uma biópsia do linfonodo, colecionada 4 dias após a última injeção de antígeno ser colhida por animal. Das amostras de sangue, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) são preparadas usando Ficoll-Hypaque de acordo com as instruções do fabricante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). A partir das PBMCs e da biópsia do linfonodo, RNA total é extraído que é usado como material de partida para RT-PCR amplificar o VHH que codifica segmentos de DNA como descrito no WO2005/044858. Para cada lhama imunizado, uma biblioteca é construída agrupando o RNA total isolado de todos os tecidos imunes coletados daquele animal. Em resumo, o repertório de VHH PCR-amplificado é clonado por meio de sítios de restrição especí-ficos em um vetor projetado para facilitar a exibição de fago da biblioteca de VHH. O vetor é derivado de pUC119 e contém o promotor de LacZ, uma sequência de codificação de proteína de M13 fago gIII, um gene de resistência à ampicilina ou carbenicilina, um sítio de clonagem múltiplo e uma sequência líder de gIII-pelB híbrida (pAX050). No quadro com a sequência de codificação de VHH, o vetor codifica um marcador c- myc C-terminal e um marcador His6. Fago foi preparado de acordo com os protocolos padrões e armazenado após esterilização em filtro a 4° C para outro uso.
EXEMPLO 3 SELEÇÃO DE VHHs VEGF-ESPECÍFICOS POR MEIO DE EXIBIÇÃO DE FAGO
[000292] Bibliotecas de fago de VHH são usadas em estratégias de seleção diferentes que aplicam uma multiplicidade de condições de se-leção. As variáveis incluem i) o formato de proteína de VEGF (rhVEGF165, rhVEGF109 ou rmVEGF164), ii) o método de apresentação de antígeno (fase sólida: diretamente revestido ou por meio de um marcador de biotina sobre placas revestidas com Neutravidina; fase de solução: incubação em solução seguida por captura em placas revestidas com Neutravidina), iii) a concentração de antígeno e iv) o mé-todo de elução (tripsina ou elução competitivo usando VEGFR2). Todas as seleções são realizadas em placas de 96 poços Maxisorp (Nunc, Wi-esbaden, Alemanha).
[000293] As seleções são executadas como segue: bibliotecas de Fago são incubadas em TA com concentrações variáveis de antígeno de VEGF, ou em solução ou imobilizadas em um suporte sólido. Após 2h de incubação e lavagem extensiva, o fago ligado é eluído. No caso de tripsina ser usada para elução do fago, a atividade da protease é neutralizada imediatamente mediante a adição de 0,8 mM de inibidor de protease AEBSF. Os rendimentos do fago que mostram enriquecimento superior à base são usados para infetar E. coli. Células infetadas com E. coli ou são usadas para preparar fago para o próximo ciclo de seleção (salvamento de fago) ou banhadas em placas de ágar (LB+amp+gli- cose2%) para análise dos clones de VHH individuais. Para triar um ren-dimento de seleção para aglutinantes específicos, são escolhidas colô-nias simples das placas de ágar e cultivadas em placas de 1 mL de 96 poços profundos. A expressão de VHH controlado por lacZ é induzida adicionando IPTG (0,1-1mM final). Extratos periplásmicos (em um vo-lume de ~80 μl) são preparados de acordo com os métodos padrões. EXEMPLO 4 IDENTIFICAÇÃO DE VHHs DE LIGAÇÃO A VEGF E DE BLOQUEIO DO RECEPTOR DE VEGF
[000294] Os extratos periplásmicos são testados para ligar a VEGF165 humano por ensaio de ELISA. Em resumo, 2 μg/mL de VEGF165 humano recombinante são imobilizados durante a noite a 4° C em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseína (1%). Após a adição de tipicamente uma diluição de 10 vezes do extrato periplásmico, a ligação de VHH é detectada usando um anti-myc de camundongo (Roche) e um conjugado de anticamundongo-HRP (DAKO). Os clones mostrando sinais do ensaio de ELISA de >3 vezes acima da base são considerados como VHHs de ligação a VEGF.
[000295] Além disso, os extratos periplásmicos são triados em um en-saio AlphaScreen de VEGF165 humano/VEGFR2 humano (Ensaio Ho-mogêneo Amplificada da Proximidade Luminescente) para avaliar a ca-pacidade de bloqueio dos VHHs. VEGF165 humano é biotinado usando Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce, Rockford, IL, EUA). Quimera de VEGFR2/Fc humana (R&D Systems, Mineápolis, MN, EUA) é capturado usando um VHH anti-humanoFc que é acoplado às contas do aceptor de acordo com as instruções do fabricante (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). Para avaliar a capacidade neutralizante dos VHHs, os extratos periplásmicos são diluídos 1/25 em tampão de PBS contendo 0,03% de Tween 20 (Sigma-Aldrich) e pré-incubados com 0,4 nM de VEGF165 humano biotinado durante 15 minutos em temperatura ambiente (TA). A esta mistura as contas do aceptor (10 μg/ml) e 0,4 nM de VEGFR2- huFc são adicionados e ainda incubados por 1 hora em TA na escuridão. Subsequentemente, as contas do doador (10 μg/ml) são adicionadas seguido por incubação de 1 hora em TA na escuridão. Fluorescência é medida lendo as placas na leitora Multi label Plate (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) usando um comprimento de onda de excitação de 680 nm e um comprimento de onda de emissão entre 520 nm e 620 nm. Extrato periplásmico contendo VHH irrelevante é usado como controle negativo. Extrato periplásmico contendo VHHs anti-VEGF165 que pode diminuir o sinal da fluorescência em mais que 60% com relação ao sinal do controle negativo é identificado como uma repetição. Todas as repe-tições identificadas no AlphaScreen são confirmadas em um ensaio de ELISA de competição. Para este fim, 1 μg/ml de quimera de VEGFR2 humano (R&D Systems, Mineápolis, MN, EUA) é revestido em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Diluições de cinco vezes dos extratos periplásmicos são incubadas na presença de uma concentração fixa (4 nM) de VEGF165 humano biotinado em tampão de PBS contendo 0,1% de caseína e 0,05% de Tween 20 (Sigma-Aldrich). Ligação destes complexos de VHH/bio-VEGF165 à placa revestida com quimera de VEGFR2 humano é detectada usando conjugado de peroxidase de raiz-forte (HRP)-extravidina (Sigma, St Louis, MO, EUA). IDs de sequência de VHH e as sequências AA corres-pondentes dos VHHs de ligação a VEGF (sem bloqueio de receptor) VHHs e VHHs inibidores (bloqueio de receptor) estão listados na Tabela 2 e Tabela 3, respectivamente. Tabela 2: IDs de Sequência e sequências AA de VHHs de anti-VEGF "não-bloqueador de receptor" monovalentes (FR, estrutura; CDR, região determinante complementar)
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[000296] As taxas de dissociação de VHHs inibidores são analisadas em Biacore (instrumento Biacore T100, GE Healthcare). Tampão de HBS-EP+ é usado como tampão corrente e os experimentos são executados a 25° C. VEGF165 humano recombinante é irreversivelmente capturado em um circuito integrado de sensor de CM5 por meio de acoplamento de amina (usando EDC e NHS) até um nível alvo de +/- 1500RU. Após imobilização, as superfícies são desativadas com injeção de 10 min de 1M de etanolamina, pH8,5. Uma superfície de referência é ativada e desativada com, respectivamente, EDC/NHS e etanolamina. Extratos periplásmicos de VHHs são injetados a uma diluição de 10 vezes em tampão corrente por 2 min a 45 μl/min e deixados dissociar por 10 ou 15 min. Entre as amostras diferentes, as superfícies são regeneradas com tampão de regeneração. Dados são duplamente referidos por subtração das curvas no canal de referência e de uma injeção de tampão corrente como controle. Os da curvas processadas são avaliados ajustando um modelo de decadência bifásico no software de Avaliação Biacore T100 v2.0.1. Valores para kd-rápida, kd-lenta e % rápida estão listados na Tabela 4. Tabela 4: Determinação da taxa de dissociação dos VHHs de bloqueio de receptor de anti-VEGF com Biacore
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n/d, não determinado
EXEMPLO 5 CARACTERIZAÇÃO DOS VHHS DE ANTI-VEGF PURIFI-CADOS
[000297] Três VHHs de anti-VEGF inibidores são selecionados para caracterização adicional como proteína purificada: VEGFBII23B04, VEGFBII24C4 e VEGFBII23A6. Estes VHHs são expressados em TG1 de E. coli como c-myc, proteínas marcadas com His6. Expressão é induzida por adição de 1 mM de IPTG e deixada continuar por 4 horas a 37° C. Após girar as culturas celulares, os extratos periplásmicos são preparados por congelamento-descongelamento das pelotas. Estes ex-tratos são usados como material de partida para purificação de VHH por meio de IMAC e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Preparações de VHH finais mostram 95% de pureza quando avaliado por meio de SDS-PAGE.
5.1 Avaliação de VHHs de bloqueio de VEGF165/VEGFR2 humano em ensaio de ELISA de bloqueio de VEGF165 hu- mano/VEGFR2-Fc
[000298] A capacidade de bloqueio dos VHHs é avaliada em um ensaio de ELISA de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR2-Fc humano. Em resumo, 1 μg/ml de quimera de VEGFR2-Fc (R&D Systems, Mineá- polis, MN, EUA) é revestido em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Série de diluição (faixa de concentração 1 mM - 64pM) dos VHHs purificados em tampão de PBS contendo 0,1% caseína e 0,05% de Tween 20 (Sigma) é incubada na presença de 4 nM de VEGF165 biotinado. Ligação residual de bio-VEGF165 a VEGFR2 é de-tectada usando conjugado de peroxidase de raiz-forte (HRP)-extravi- dina (Sigma, St Louis, MO, EUA) e TMB como substrato. Como controles Bevacizumab (Avastin®) e Ranibizumab (Lucentis®) são tirados. As curvas de dose-inibição são mostradas na Figura 1; os valores de IC50 correspondentes e a % de inibição estão resumidos na Tabela 5. Tabela 5: Valores de IC50 (nM) e % de inibição para VHHs monovalentes em ensaio de ELISA de competição de hVEGF165/hVEGFR2-Fc
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5.2 Avaliação dos VHHs de bloqueio de VEGF165/VEGFR2 humano em ensaio de ELISA de bloqueio de VEGF165 hu- mano/VEGFR1-Fc humano
[000299] Os VHHs são também avaliados em um ensaio de ELISA de bloqueio VEGF165 humano/VEGFR1-Fc humano. Em resumo, 2 μg/ml de quimera de VEGFR1-Fc (R&D Systems, Mineápolis, MN, EUA) são revestidos em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Ale-manha). Série de diluição (faixa de concentração 1 mM - 64pM) dos VHHs purificados em tampão de PBS contendo 0,1% de caseína e 0,05% de Tween 20 (Sigma) é incubada na presença de 0,5nM de VEGF165 biotinado. Ligação residual de bio-VEGF165 a VEGFR1 é detectada usando conjugado de peroxidase de raiz-forte (HRP)-extravi- dina (Sigma, St Louis, MO, EUA) e TMB como substrato. Como controles Bevacizumab, Ranibizumab e um VHH irrelevante (2E6) são tirados. As curvas de dose-inibição são mostradas na Figura 2; os valores de IC50 correspondentes e a % de inibição estão resumidos na Tabela 6. Tabela 6: Valores de IC50 (nM) e % de inibição de VHHs monovalentes em ensaio de ELISA de competição de hVEGF165/hVEGFR1-Fc
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5.3 Avaliação dos VHHs de anti-VEGF165 no AlphaScreen de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR2-Fc humano
[000300] A capacidade de bloqueio dos VHHs é também avaliada em um AlphaScreen de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR2-Fc humano. Brevemente, diluições seriais de VHHs purificados (faixa de concentração: 200 nM - 0,7 pM) em tampão de PBS contendo 0,03% de Tween 20 (Sigma) são acrescentados a 4pM de bio-VEGF165 e incubadas por 15 min. Subsequentemente VEGFR2-Fc (0,4 nM) e contas do aceptor revestidas com VHH de anti-Fc (20 μg/ml) são adicionadas e esta mistura é incubada por 1 hora na escuridão. Por fim, as contas do doador de estrep- tavidina (20 μg/ml) são adicionadas e após 1 hora de incubação na escu-ridão, a fluorescência é medida na Leitora de microplaca Envision. As curvas de dose-resposta estão mostradas na Figura 3. Os valores de IC50 para VHHs que bloqueia a Interação de VEGF165 humano - VEGFR2-Fc humano estão resumidos na Tabela 7. Tabela 7: Valores de IC50 (pM) e % de inibição para VHHs em AlphaScreen de competição de hVEGF165/hVEGFR2-Fc
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5.4 Avaliação dos VHHs de anti-VEGF165 no AlphaScreen de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR1-Fc humano
[000301] A capacidade de bloqueio dos VHHs é também avaliada em um AlphaScreen de bloqueio de VEGF165 humano/VEGFR1-Fc humano. Brevemente, diluições seriais de VHHs purificados (faixa de con-centração: 500 nM - 1,8 pM)) em tampão de PBS contendo 0,03% de Tween 20 (Sigma) são acrescentadas a 0,4 nM de bio-VEGF165 e in-cubadas por 15 min. Subsequentemente, contas do aceptor de VEGFR1-Fc (1 nM) e revestidas com VHH de anti-Fc (20 μg/ml) são adicionadas e esta mistura é incubada por 1 hora na escuridão. Por fim, as contas do doador de estreptavidina (20 μg/ml) são adicionados e após 1 hora de incubação na escuridão, fluorescência é medida na Leitora de microplaca Envision. As curvas de dose-resposta estão mostradas na Figura 4. Os valores de IC50 e % de inibição para VHHs que bloqueia a Interação de VEGF165 humano - VEGFR1-Fc humano estão resumidos na Tabela 8. Tabela 8: Valores de IC50 (nM) para VHHs em AlphaScreen de competição de ahVEGF165/hVEGFR1-Fc
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5.5 Determinação da afinidade da Interação de VEGF165 humano - VHH
[000302] A cinética de ligação de VEGFBII23B04 de VHH com hVEGF165 é analisada por SPR em um instrumento Biacore T100. VEGF165 humano recombinante é imobilizado diretamente em um circuito integrado CM5 por meio de acoplamento de amina (usando EDC e NHS). As VHHs são analisadas em concentrações diferentes entre 10 e 360 nM. As amostras são injetadas por 2 min e deixadas dissociar até 20 min a uma taxa de fluxo de 45 μl/min. Entre as injeções de amostra, a superfície do circuito integrado é regenerada com 100 mM de HCl. HBS-EP+ (tampão de Hepes pH7,4 + EDTA) é usado como o tampão corrente. As curvas de ligação são ajustadas usando um modelo de Reação de Dois Estados por Biacore T100 Evaluation Software v2.0.1. As afinidades calculadas dos VHHs anti-VEGF são listadas na Tabela 9. Tabela 9: KD de afinidade (nM) de VHHs purificados para VEGF165 humano recombinante
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(a) Curva de ligação heterogênea resultando em ajuste no 1:1, as curvas são ajustadas usando um modelo de Reação de Dois Estados por Bia- core T100 Evaluation Software v2.0.1 5.6 Ligação a VEGF164 de camundongo
[000303] A reatividade cruzada a VEGF164 de camundongo é determinada usando um ensaio de ELISA de ligação. Em resumo, VEGF164 de camundongo recombinante (R&D Systems, Mineápolis, MS, EUA) é revestido durante a noite a 4° C a 1 μg/ml em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseína (1% em PBS). VHHs são apli-cados como série de diluição (faixa de concentração: 500nM - 32pM) em tampão de PBS contendo 0,1% de caseína e 0,05% de Tween 20 (Sigma) e a ligação é detectada usando um anti-myc de camundongo (Roche) e um conjugado de anticamundongo-HRP (DAKO) e uma reação enzimática subsequente na presença do substrato TMB (3,3’,5,5’- tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA) (Figura 5). Um mAb reativo de VEGF164 de camundongo é incluído como controle positivo. Como referência, a ligação a VEGF165 humano é também medida. Os valores de EC50 estão resumidos na Tabela 10. Tabela 10: Valores de EC50 (pM) para VHHs em um ensaio de ELISA de ligação a VEGF165 humano e VEGF164 de camundongo recombinante
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NB, nenhuma ligação 5.7 Ligação a VEGF121
[000304] Ligação a VEGF121 humano recombinante é avaliada por meio de um ensaio de ELISA de ligação de fase sólida. Brevemente, VEGF121 humano recombinante (R&D Systems, Mineápolis, MS, EUA) é revestido durante a noite a 4° C a 1 μg/ml em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseína (1% em PBS). VHHs são aplicados como série de diluição (faixa de concentração: 500nM - 32pM) em tampão de PBS contendo 0,1% de caseína e 0,05% de Tween 20 (Sigma) e ligação é detectada usando um anti-myc de camundongo (Roche) e um conjugado de anticamundongo-HRP (DAKO) e uma reação enzimática subsequente na presença do substrato TMB (3,3’,5,5’-tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA) (Figura 6). Como controle positivo, diluições seriais do VEGFR2 são tiradas. Os valores de EC50 estão resumidos na Tabela 11. Tabela 11: Valores de EC50 (pM) para VHHs monovalentes em um ensaio de ELISA de ligação de VEGF121 humano recombinante
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5.8 Ligação aos membros da família de VEGF VEGFB, VEGFC, VEGFD e PlGF
[000305] Ligação a VEGFB, VEGFC, VEGFD e PlGF é avaliada por meio de um ensaio de ELISA de ligação de fase sólida. Em resumo, VEGFB, VEGFC, VEGFD e PlGF (R&D Systems, Mineápolis, MS, EUA) são revestidos durante a noite a 4° C a 1 μg/ml em uma placa MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha). Os poços são bloqueados com uma solução de caseína (1% em PBS). VHHs são aplicados como série de diluição (faixa de concentração: 500nM - 32pM) e ligação é detectada usando um anti-myc de camundongo (Roche) e um conjugado de anticamundongo-AP (Sigma, St Louis, MO, EUA). Como controles positivos, diluições seriais dos receptores apropriados são triadas e de-tectadas com IgG anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP), anticorpo específico de Fc (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA) e uma reação enzimática sub-sequente na presença do substrato TMB (3,3’,5,5’-tetramentilbenzidina) (Pierce, Rockford, IL, EUA). As curvas de dose-resposta dos VHHs e controles estão mostradas na Figura 7. Os resultados mostram que não houve nenhuma ligação detectável dos VHHs selecionados ao VEGFB, VEGFC, VEGFD ou PlGF. 5.9 Ligação de epítopo
[000306] Experimentos de ligação de epítopo com base em Biacore são executados para investigar quais aglutinantes de VEGF ligam-se a um epítopo similar ou sobreposto como VEGFBII23B04. Para este fim, VEGFBII23B04 é imobilizado em um circuito integrado de sensor CM5. Para cada amostra, VEGF165 humano é passado na superfície do circuito integrado e reversivelmente capturado por VEGFBII23B4. Os VHHs purificados (100 nM) ou extratos periplásmicos (diluídos 1/10) são depois injetados com um tempo de contato de superfície de 240 segundos e uma taxa de fluxo de 10 uL/minuto. Entre as amostras diferentes, a superfície é regenerada com tampão de regeneração (100 mM de HCl). As curvas processadas são avaliadas com software de Biacore T100 Evaluation. VHHs poderiam ser divididos dentro de dois grupos: grupo um que deu ligação adicional ao VEGF165 capturado com VEG- FBII23B04 e um segundo grupo que não pode ligar-se simultaneamente ao VEGF165 capturado com VEGFBII23B04. Tabela 12-A resume os epítopos de ligação dos VHHs testados.
[000307] A mesma configuração de ensaio acima é usada para avaliar se VEGFR1, VEGFR2, Ranibizumab e Bevacizumab podem ligar-se si-multaneamente a VEGF-165 humano com VEGFBII23B04. Tabela 12B apresenta as respostas de ligação adicionais a VEGF165 capturado com VEGFBII23B04. Apenas VEGFR2 não pode ligar-se a VEGF165 capturado com VEGFBII23B04, evidenciando a capacidade de bloqueio de VEGFBII23B04 pela interação de VEGF-VEGFR2. Além disso, estes dados mostram que o epítopo de VEGFBII23B04 é diferente do epítopo de Bevacizumab e Ranibizumab. Tabela 12-A: Ligação de epítopo de VHHs de anti-VEGF - ligação simultânea com VEGFBII23B04
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* indicando os mesmos epítopos ou sobrepostos Tabela 12-B: Ligação de epítopo de VEGFBII23B04 - ligação de inibidores de ponto de referência (ben-chmark) ou receptores cognatos em VEGF165 capturado com VEGFBII23B04
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5.10 Caracterização dos VHHs de anti-VEGF no ensaio de proliferação de HUVEC
[000308] A potência dos VHHs selecionados é avaliada em um ensaio de proliferação. Em resumo, as células HUVEC primárias (Technoclone) são privadas de suplemento durante a noite e depois 4000 células/poço são semeadas em quadruplicação em placas de cultura de tecido de 96 poços. As células são estimuladas na ausência ou presença de VHHs com 33 ng/mL de VEGF. As taxas de proliferação são medidas por in-corporação de [3H] Timidina no dia 4. Os resultados do ensaio de proli-feração de HUVEC estão mostrados na Tabela. Tabela 13: Valores de IC50 (nM) e % de inibição de VEG- FBII23B04, VEGFBII23A06 e VEGFBII24C04 monovalentes em ensaio de proliferação de HUVEC de VEGF
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5.11 Caracterização dos VHHs de anti-VEGF no ensaio de fosforilação de Erk de HUVEC
[000309] A potência dos VHHs selecionados é avaliada no ensaio de fosforilação de Erk de HUVEC. Em resumo, as células HUVE primárias são privadas de soro durante a noite e depois estimuladas na ausência ou presença de VHHs com 10 ng/mL de VEGF por 5 min. As células são fixadas com 4% de Formaldeído em PBS e os níveis de fosforilação de ERK são medidos por ensaio de ELISA usando anticorpos específicos para fosfoERK (anti-phosphoMAP Kinase pERK1&2, M8159, Sigma) e conjugado de Anti-camundongo-Imunoglobulina-HRP de Coelho policlo- nal (PO161, Dako). Como mostrado na Tabela 14, VEGFBII23B04 e Be- vacizumab inibem a fosforilação de Erk induzida por VEGF em pelo me-nos 90%, com IC50s < 1nM. Tabela 14: Valores de IC50 (nM) e % de inibição de VEGFBII23B04 mo-novalente em Ensaio de fosforilação de Erk de HUVEC do VEGF
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EXEMPLO 6 GERAÇÃO DE VHHs de BLOQUEIO DE ANTI-VEGF MUL TIVALENTE
[000310] VEGFBII23B04 de VHH é geneticamente fundido ou a VEG- FBII23B04 resultando em um VHH homodimérico (sequência AA, vide Tabela 15) ou a VHHs de ligação a VEGF diferentes resultando em VHHs heterodiméricos, um painel de 10 VHHs de ligação a VEGF únicos é ligado por meio de um ligador flexível de 9 ou 40 Gly-Ser em duas orientações diferentes a VEGFBII23B04 para gerar os VHHs heterodi- méricos, (sequências AA, vide Tabela 15). VEGFBII23B04 homodimé- rico (VEGFBII010) e os 40 VHHs bivalentes heterodiméricos são expressados em TG1 de E. coli como c-myc, proteínas marcadas com His6. Expressão é induzida por adição de 1 mM de IPTG e deixada continuar por 4 horas a 37° C. Após girar as culturas celulares, os extratos periplásmicos são preparados por congelamento-descongelamento das pelotas. Estes extratos são usados como material de partida e os VHHs são purificados por meio de IMAC e dessalgação resultando em 90% de pureza conforme avaliado por meio de SDS-PAGE. Tabela 15: ID de Sequência, ID de VHH e sequência AA de VHHs bivalentes de anti-VEGF (cada um dos ligadores usados é realçado em uma sequência relevante)
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[000311] O painel de 40 VHHs bivalentes é testado no ensaio de bloqueio de VEGFR2 e VEGFR1 de AlphaS- creen, como descrito nos Exemplos 5.3 e 5.4, respectivamente. Com base no nível máximo de potência e de inibi-ção, os 5 VHHs bivalentes melhores (VEGFBII021, VEGFBII022, VEGFBI023, VEGFBI024 e VEGFBII025) são escolhidos para caracterização adicional. Uma visão geral dos resultados da triagem para os 5 VHHs bivalentes selecionados no AlphaScreen de VEGFR2 e VEGFR1 competitivo é mostrada na Tabela 16. Tabela 16: Potência e eficácia dos 5 melhores VHHs biva- lentes no ensaio de AlphaScreen de VEGF/VEGFR1 e de VEGF/VEGFR2 de competição
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EXEMPLO 7 CARACTERIZAÇÃO DOS VHHs DE ANTI-VEGF FORMA- TADOS
[000312] Os VHHs VEGFBII010, VEGFBII021, VEGFBII022, VEG- FBII023, VEGFBII024 e VEGFBII025 são comparados lado a lado no ensaio de ELISA de bloqueio de VEGFR2 e VEGFR1 (Figura 8 e 9, Ta-bela 17 e Tabela 18, respectivamente) e ensaio de AlphaScreen (Figura 10 e 11, Tabela 19 e 20) como descrito nos Exemplos 5.1, 5.2, 5.3 e 5.4, respectivamente. Tabela 17: Valores de IC50 (pM) e % de inibição para VHHs formatados no ensaio de ELISA de competição de hVEGF165/hVEGFR2-Fc
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Tabela 18: Valores de IC50 (pM) e % de inibição dos VHHs formatados no ensaio de ELISA de competição de VEGF165/hVEGFR1- Fc
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Tabela 19: Valores de IC50 (pM) e % de inibição para VHHs formatados em AlphaScreen de competição de hVEGF165/hVEGFR2- Fc
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Tabela 20: Valores de IC50 (pM) e % de inibição de VHHs formatados em AlphaScreen de competição de VEGF165/hVEGFR1-Fc
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[000313] Além disso, os VHHs formatados são também testados por sua capacidade de bloquear a interação de mVEGF164/mVEGFR2- huFc. Em resumo, diluições seriais de VHHs purificados (faixa de con-centração: 4 μM - 14,5 pM) em tampão de PBS contendo 0,03% de Tween 20 (Sigma) são acrescentadas a 0,1 nM de mVEGF164 biotinado e incubadas por 15 min. Subsequentemente, contas do aceptor de re-vestidas com VHH de VEGFR2-huFc de camundongo (0,1 nM) e de anti- huFc (20 μg/ml) são adicionadas e esta mistura é incubada por 1 hora. Por fim, as contas do doador de estreptavidina (20 μg/ml) são adiciona-das e, após 1 hora de incubação, a fluorescência é medida na leitora de microplaca Envision. As curvas de dose-resposta estão mostradas na Figura 12. Os valores de IC50 para VHHs bloqueando a interação de VEGF164/VEGFR2-hFC de camundongo estão resumidos na Tabela 21. Tabela 21: Valores de IC50 (pM) e % de inibição para VHHs formatados em AlphaScreen de competição de mVEGF164/mVEGFR2-hFc
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[000314] Os VHHs formatados são também testados no ensaio de ELISA para sua habilidade de ligar mVEGF164 e VEGF165 humano (Exemplo 5.6; Figura 13; Tabela 22); VEGF121 (Exemplo 5.7; Figure 15; Tabela 23) e os membros da família de VEGF VEGFB, VEGFC, VEGFD e PlGF (Exemplo 5.8; Figura 14). As cinéticas de ligação a VEGF165 humano são analisadas como descrito no Exemplo 5.5. Os valores de KD estão listados na Tabela 24. Tabela 22. Valores de EC50 (pM) para VHHs formatados em um ensaio de ELISA de ligação a VEGF165 humano e VEGF164 de camundongo recombinante rhVEGF165 rmVEGF164
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Tabela 23: Valores de EC50 (pM) para VHHs formatados em um ensaio de ELISA de ligação a VEGF121 humano recombinante
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Tabela 24: KD de Afinidade (nM) de VHHs formatados purificados para VEGF165 humano recombinante
Figure img0038
(a) KD = kd1/ka1*(kd2/(kd2+ka2)) (b) Curvas são ajustadas usando um modelo de Reação de Dois Estado por Software Biacore T100 Evaluation v2.0.1
[000315] VHHs VEGFBII010, VEGFBII022, VEGFBII024 e VEGFBII025 são também testados na proliferação de HUVEC mediada por VEGF e ensaio de fosforilação de Erk.
[000316] A potência dos VHHs formatados selecionados é avaliada em um ensaio de proliferação. Em resumo, as células HUVEC primárias (Technoclone) são privadas de suplemento durante a noite e depois 4000 células/poço são semeadas em quadruplicação em placas de cultura de tecido de 96 poços. As células são estimuladas na ausência ou presença de VHHs com 33 ng/mL de VEGF. As taxas de proliferação são medidas por incorporação de [3H] Timidina no dia 4. Os resultados mostrados na Tabela 25 demonstram que os VHHs formatados e Be- vacizumab inibem a proliferação de HUVEC induzida por VEGF em mais que 90%, com IC50s < 1nM. Tabela 25: Valores de IC50 (nM) e % de inibição de VHHs formatados em ensaio de proliferação de HUVEC de VEGF
Figure img0039
[000317] A potência dos VHHs formatados selecionados é avaliada no ensaio de fosforilação de Erk de HUVEC. Em resumo, as células HUVE primárias são privadas de soro durante a noite e depois estimulada na ausência ou presença de VHHs com 10ng/mL de VEGF por 5 min. As células são fixadas com 4% de Formaldeído em PBS e os níveis de fosforilação de ERK são medidos por ensaio de ELISA usando anticorpos fosfoERK-específicos (pERK1&2 de anti-phosphoMAP Kinase, M8159, Sigma) e conjugado de Anti-camundongo-Imunoglobulina-HRP de coelho policlonal (PO161, Dako). Como mostrado na Tabela 26, os VHHs formatados e Bevacizumab inibem a fosforilação de Erk induzida por VEGF em mais de 90%, com IC50s < 1nM. Tabela 26: Valores de IC50 (nM) e % de inibição dos VHHs formatados em Ensaio de fosforilação de Erk de HUVEC do VEGF
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EXEMPLO 8 OTIMIZAÇÃO DE SEQUÊNCIA 8.1 Otimização de sequência de VEGFBII23B04 A sequência de aminoácido de VEGFBII23B04 é alinhada à sequência de linhagem germinal humana VH3-23/JH5, vide Figura 16 (SEQ ID NO: 179)
[000318] O alinhamento mostra que VEGFBII23B04 contém 19 mutações estruturais com relação à sequência de linhagem germinal de referência. Resíduos não-humanos nas posições 14, 16, 23, 24, 41, 71, 82, 83 e 108 são selecionados para substituição com suas contrapartes de linhagem germinal humanas. Um conjunto de 8 variantes de VEG- FBII23B04 é gerado carregando combinações diferentes de resíduos humanos nestas posições (sequências AA estão listadas na Tabela 27). Uma variante adicional é construída, em que o sítio de isomerização potencial na posição D59S60 (região de CDR2, vide Figura 16, indicado como resíduos em itálico e negrito) é removida mediante a introdução de uma mutação de S60A. Tabela 27: Sequência de AA das variantes otimizadas na sequência de VEGFBII23B04 de VHH (FR, estrutura; CDR, região determinante complementar)
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[000319] Estas variantes são caracterizadas como proteínas purificadas no AlphaScreen de VEGF165/VEGFR2 (Exemplo 5.3, Figura 17). A temperatura de fundição (Tm) de cada clone é determinada em um ensaio de deslocamento térmico que é com base no aumento no sinal de fluorescência sob incorporação de Sypro Orange (Invitrogen) (Ericsson et al, Anal. Biochem. 357 (2006), págs. 289-298). Todas as variantes exibiram IC50 comparável quando comparadas a VEGFBII23B04 e os valores de Tm que são similares ou mais altos quando comparados ao VEGFBII23B04 fonte. Tabela 28 resume os valores de IC50 e os valores de Tm em pH 7 para os 9 clones testados.
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[000320] Em um segundo ciclo, as mutações to eradas do esforço de humanização (VEGFBII111G06) e as mutações para evitar a modificação pós-translacional potencial nos sítios selecionados (D16G, a substituição de S60A e uma mutação de E1D) são combinadas resultando em um clone otimizado em sequência derivado de VEGFBII23B04: VEGFBII0037. Uma variante extra otimizada na sequência (VEG- FBII038) é antecipada contendo as mesmas substituições que VEG- FBII0037, com a exceção da mutação de I82M, uma vez que esta mutação pode ser associada com uma queda secundária na potência. As sequências de ambos os clones otimizados na sequência estão listadas na Tabela 29. VEGFBII0037 e VEGFBII0038 são caracterizados no AlphaScreen de bloqueio de VEGF165/VEGFR2 (Exemplo 5.3, Figure 18), a temperatura de fundição é determinada no ensaio de deslocamento térmico como descrito acima e a afinidade para ligar em VEGF165 é determinada em Biacore (Exemplo 5.5). Uma visão geral das características das 2 VHHs otimizadas na sequência é apresentada na Tabela 30. Tabela 29: Sequências AA de variantes otimizadas na se- quência de VEGFBII23B04 DE VHH
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Tabela 30: Valores de IC50 (pM), % de inibição, temperatura de fundição (@ pH 7) e afinidade (pM) de clones otimizados na sequência VEGFBII037 e VEGFBII038
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8.2 O timização de sequência de VEGFBII5B05
[000321] A sequência de aminoácido de VEGFBII5B05 é alinhada à sequência de linhagem germinal humana VH3-23/JH5, vide Figura 19 (SEQ ID:NO: 179). O alinhamento mostra que VEGFBII5B05 contém 15 mutações estruturais com relação à sequência de linhagem germinal de referência. Resíduos não-humanos nas posições 23, 60, 83, 105, 108 são selecionados para substituição com suas contrapartes de linhagem germinal humana enquanto a histidina na posição 44 é selecionada para substituição através de glutamina. Uma variante de humanização é construída carregando as 6 mutações descritas (sequência AA é listada na Tabela 31). Tabela 31: Sequências AA de variantes otimizadas na se-quência de VEGFBII5B05 DE VHH (FR, estrutura; CDR, região determinante complementar)
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[000322] Uma variante adicional é construída em que o sítio de oxida- ção potencial na posição M30 (região de CDR1, vide Figura 19 indicada como resíduo em itálico e negrito) é removido pela introdução de uma mutação de M30I. Ambas as variantes são testadas para sua habilidade para ligar hVEGF165 usando ProteOn. Em resumo, um circuito integrado GLC ProteOn Sensor é revestido com VEGF165 humano. Extratos periplásmicos das variantes são diluídos 1/10 e injetados ao longo do circuito integrado revestido com VEGF165 humano. As taxas de dis-sociação são calculadas e comparadas às taxas de dissociação do VEGFBII5B05 fonte. As taxas dissociação das 2 variantes estão na mesma faixa que as taxas de dissociação do VEGFBII5B05 fonte, indicando que todas as mutações são toleradas (Tabela 32). Tabela 32: Taxas de dissociação das variantes otimizadas em sequência - VEGFBII5B05
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[000323] Em um segundo ciclo, as mutações do esforço de humani- zação e da substituição de M30I são combinadas resultando em um clone otimizado na sequência de VEGFBII5B05, designado VEG- FBII032. A sequência está listada na Tabela 33. Afinidade de VEGFBII032 é determinada por Biacore (vide Exemplo 5.5) e a temperatura de fundição é determinada no ensaio de deslocamento térmico como descrito acima. Uma visão geral das características do VHH VEG- FBII032 otimizado na sequência é apresentada na Tabela 34. Tabela 33: Sequência AA de clone otimizado na sequência VEGFBII032 (FR, estrutura; CDR, região determinante complementar)
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Tabela 34: Temperatura de fundição (@ pH 7) e afinidade (nM) de clone otimizado na sequência VEGFBII032
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[000324] A potência dos clones otimizados na sequência VEGFBII037 e VEGFBII038 é avaliada em um ensaio de proliferação. Em resumo, as células de HUVEC primárias (Technoclone) são privadas de suplemento durante a noite e depois 4000 células/poço são semeadas em quadru- plicação em placas de cultura de tecido de 95 poços. As células são estimuladas na ausência ou presença de VHHs com 33 ng/mL VEGF. As taxas de proliferação são medidas por incorporação de [3H] Timidina no dia 4. Os resultados mostrados na Tabela 35 demonstram que a atividade (potência e grau de inibição) do VEGFBII23B04 de VHH fonte é conservado no clone otimizado na sequência VEGFBII038. Tabela 35: Valores de IC50 (nM) e % de inibição dos clones otimizados na sequência VEGFBII037 e VEGFBII038 em ensaio de pro-liferação de HUVEC de VEGF
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EXEMPLO 9 CONSTRUÇÃO, PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VHHs BIVALENTES VISANDO Ang2
[000325] VHHs 1D01 (SEQ ID NO: 214), 11B07, 00908 e 00027 (SEQ ID NO: 216) são geneticamente fundidos com 1D01 (SEQ ID NO: 214), 11B07, 00908 e 00027 (SEQ ID NO: 216), respectivamente, resultando em VHHs homodiméricos. Os VHHs bivalentes são ligados por meio de um ligador flexível de 9-GlySer ou 40-GlySer. As sequências de DNA de codificação dos VHHs formatados são clonados no vetor de expressão pAX172. Os VHHs são expressados em Pichia pastoris como proteínas c-terminalmente myc marcadas com His6. Em resumo, as culturas de BGCM são iniciadas a partir de uma raia de colônia simples incubada durante o fim de semana a 30°C (250 rpm). Após a troca de meio para BMCM, as culturas são incubadas até à noite a 30°C (250 rpm) e seguido por uma indução com 100% de metanol. No dia seguinte, as culturas são induzidas com um adicional 3 vezes (manhã, tarde, noite). As culturas do dia seguinte são centrifugadas por 20 min a 4°C (1.500xg). Os VHHs marcados com His6 presentes no sobrenadante são purificados através de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) seguido por dessalgação (DS) e por fim filtração em gel (GF) para remover quaisquer endotoxinas/impurezas. Uma visão geral do formato e sequência de todos os VHHs bivalentes é descrita na Figura 20 e Tabela 36-A (sequências de ligador sublinhada), SEQ ID Nos 180-185. Os níveis de expressão estão indicados na Tabela 36-B.
[000326] Para explorar as propriedades de bloqueio de anti-Ang2 comparadas com os blocos de construção monovalentes, os VHHs bivalentes são analisados em um ensaio de ELISA de competição de Ang2/hTie2 humano (Figura 21-1), Ang2/mTie2 de camundongo (Figura 21-2), Ang2/cTie2 de cino (Figura 21-3) e Ang1/hTie2 humano (Figura 22). Um sumário dos valores de IC50 é mostrado na Tabela 37. Tabela 36-A
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Tabela 37: Valores de IC50 (pM) em ensaio de ELISA de com- petição Ang2 humano/Tie2 humano, Ang2 de camundongo/Tie2 de ca-mundongo, Ang2 de cino/Tie2 de cino e hAng1/hTie2.
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n.d. não determinado
EXEMPLO 10 CONSTRUÇÃO, PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VHHs BIESPECÍFICOS TRIVALENTES VISANDO VEGF E Ang2 USANDO ALBUMINA DE ANTISSORO COMO EXTENSÃO DA MEIA- VIDA
[000327] O VHH de anti-VEGF VEGFBII00038 (US 2011/0172398 A1) e o VHH de anti-Ang2 00027 (SEQ ID NO: 216) são usados como blocos de construção para gerar VHHs biespecíficos VEGFANGBII00001- 00004. Uma fusão genética com um VHH de ligação à albumina sérica é usada como metodologia de extensão da meia-vida. Os blocos de construção são ligados por meio de um ligador flexível triplo Ala ou 9 Gly-Ser. VHHs são produzidos e purificados como descrito no Exemplo 9. Uma visão geral do formato e sequência de todos os quatros VHHs biespecíficos é descrita na Figura 23 e Tabela 37-A (sequências de li- gador sublinhadas), SEQ ID Nos 186-189, Os níveis de expressão estão indicados na Tabela 38-B. Tabela 38-A
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Tabela 38-B
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[000328] Para explorar as propriedades de bloqueio de anti-VEGF comparadas com o bloco de construção monovalente VEGFBII00038, todos os quatro VHHs biespecíficos são analisados no ensaio AlphaScreen de competição VEGF/VEGFR2-Fc (Figura 22). O ensaio é ligeiramente ajustado comparado ao Exemplo 12.3 descrito na patente US 2011/0172398 A1. VEGF165 humano e VEGFR2-Fc humano são adicionados a 0,05 nM. Este ensaio de competição é também executado após pré-incubação do VHH com 25 μM de albumina sérica humana. Um sumário dos valores de IC50 e % de inibição é mostrado na Tabela 39. Tabela 39: Valores de IC50 (nM) em ensaio AlphaScreen de competição de VEGF165 humano/VEGFR2 humano
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[000329] Para explorar as propriedades de bloqueio de anti-Ang2 comparadas com o bloco de construção monovalente 00027 (SEQ ID NO: 216), todos os quatro VHHs biespecíficos são analisados em um ensaio de ELISA de competição de Ang2/hTie2-Fc humano (Figura 25). Este ensaio é também executado após incubação do VHH com 0,5 μM de albumina sérica humana. Um sumário dos valores de IC50 é mostrado na Tabela 40. Tabela 40: valores de IC50 (pM) em ensaio de ELISA de com-petição de Ang2 humano/Tie2 humano
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n.d., não determinado
EXEMPLO 11 CONSTRUÇÃO, PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VHHs BIESPECÍFICOS TRIVALENTES E TETRAVALENTES VISANDO VEGF E ANG2 USANDO LIGAÇÃO DE ALBUMINA DE ANTIS- SORO COMO EXTENSÃO DA MEIA-VIDA
[000330] Dez VHHs biespecíficos visando VEGF e Ang2 são construídos (VEGFANGBII00005-00015). Nestas construções, blocos de construção de anti-Ang2 de 1D01 monovalentes e bivalentes (SEQ ID NO: 214), 7G08 monovalentes e bivalentes (SEQ ID NO: 215) e 00027 bivalentes (SEQ ID NO: 216) são incluídos. Uma fusão genética com um VHH de ligação de albumina sérica é usada como metodologia de extensão da meia-vida. Os blocos de construção são ligados por meio de um ligador flexível de 9 Gly-Ser. Os VHHs são produzidos e purificados como descrito no Exemplo 8. Uma visão geral do formato e sequência de todos os dez VHHs biespecíficos é descrita na Figura 26 e Tabela 41-A (sequências de ligador sublinhada), SEQ ID Nos 190-199. Os níveis de expressão são indicados na Tabela 41-B.
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[000331] Para explorar as propriedades de bloqueio de anti-VEGF comparadas com o bloco de construção monovalente VEGFBII00038, todos os dez VHHs biespecíficos são analisados no ensaio AlphaScreen de competição de VEGF/VEGFR2-Fc (Exemplo 10; Figura 27-1) e VEGF/VEGFR1 (Figura 27-2). O ensaio de VEGFR1 é ligeiramente ajustado comparado ao Exemplo 12.4 como descrito na patente US 2011/0172398 A1. VEGF165 humano e VEGFR1-Fc humano são adici-onados a 0,05 nM. Estes ensaios de competição são também executados após pré-incubação do VHH com 25 μM de albumina sérica humana. Um sumário dos valores de IC50 é mostrado na Tabela 42. Tabela 42: Valores de IC50 (nM) em ensaio AlphaScreen de competição de VEGF165 humano/VEGFR2 humano e VEGF165 hu- mano/VEGFR1 humano
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n.d., não determinado
[000332] Para explorar as propriedades de bloqueio de anti-Ang2 comparadas com seu respectivo bloco de construção monovalente 7G08 (SEQ ID NO: 215), 1D01 (SEQ ID NO: 214) e 00027 (SEQ ID NO: 216), todos os dez VHHs biespecíficos são analisados no ensaio de ELISA de competição de Ang2/hTie2-Fc humano (vide Exemplo 5.1; Figura 28-1), Ang2/mTie2-Fc de camundongo (vide Exemplo 5.2; Figura 28-2) e Ang2/cTie2-Fc de cino (vide Exemplo 5.2; Figura 28-3). O ensaio humano é também executado após incubação do VHH com 0,5 μM de albumina sérica humana. Adicionalmente, um ensaio de sobrevivência de HUVEC mediado por hAng2 é executado (vide Exemplo 5.5; Figura 29). Um sumário dos valores de IC50 e % de inibição é mostrado na Tabela 43. Tabela 43: Valores de IC50 (pM) e % de inibição em ensaio de ELISA de competição de Ang2 humano/Tie2 humano, Ang2 de camundongo/Tie2 de camundongo e Ang2 de cino/Tie2 de cino e valores de IC50 (nM) e a % de inibição em sobrevivência de HUVEC mediada por hAng2.
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[000333] Afinidades para albumina sérica humana foram determinadas e mostradas na Tabela 44. Brevemente, albumina sérica humana (Sigma, St Louis, MO, EUA) é imobilizada em um circuito integrado CM5 por meio de acoplamento de amina. Uma abordagem cinética de multi- ciclos é usada: concentrações crescentes de VHH (2-8-31-125-500 nM) são injetadas e deixadas associar-se durante 2 min e dissociar-se por 10 min a uma taxa de fluxo de 100 μL/min. Entre as injeções de VHH, as superfícies são regeneradas com um pulso de 10s de 10 mM de Glicina- HCl pH 1,5 e período de estabilização de 60s. Os dados de associa- ção/dissociação são avaliados ajustando um modelo de interação 1:1 (ligação de Langmuir) ou modelo de Ligante Heterogêneo. A constante de afinidade KD é calculada a partir das constantes de taxa de associação e dissociação resultantes ka e kd (Tabela 44). Tabela 44: KD de afinidade de VHHs purificados para albumina sérica humana (HSA), de cino (CSA) e de camundongo (MSA)
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n.d., não determinado
Exemplo 12 CONSTRUÇÃO, PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VHHs BIESPECÍFICOS OTIMIZADOS EM SEQUÊNCIA E MADUROS EM AFINIDADE VISANDO VEGF E Ang2 USANDO LIGAÇÃO DE ALBUMINA DE ANTISSORO COMO EXTENSÃO DA MEIA-VIDA
[000334] 14 VHHs biespecíficos visando VEGF e Ang2 são construí dos (VEGFANGBII00015-00028). Nestas construções, VHHs de 00921 bivalentes (uma variante 1D01 otimizada em sequência) (SEQ ID NO: 220), 00908 - 00932 - 00933 - 00934 - 00935 - 00936 - 00937 - 00938 monovalentes (variantes 28D10 otimizadas em sequência/maduros em afinidade) (SEQ ID NO: 222), 00956 bivalentes (SEQ ID NO: 223) (variante de 28D10 otimizada em sequência) e 00928 monovalentes (SEQ ID NO: 221) (variante de 37F02 otimizada em sequência) são incluídos blocos de construção de anti-Ang2. Uma fusão genética para um VHH de ligação a albumina sérica é usada como metodologia de extensão da meia-vida. Os blocos de construção são ligados por meio de um ligador flexível de 9 Gly-Ser. Uma visão geral do formato e sequência de todos os 14 VHHs biespecíficos é descrita na Figura 30 e Tabela 45-A (sequências de ligador sublinhadas), SEQ ID Nos 200-213.
[000335] Os níveis de expressão são indicados na Tabela 45-B. Tabela 45-A
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[000336] Para explorar as propriedades de bloqueio de anti-VEGF comparadas com o bloco de construção monovalente VEGFBII00038, os VHHs biespecíficos são analisados no ensaio AlphaScreen de competição VEGF/VEGFR2-Fc (Exemplo 10; Figura 31-1) e VEGF/VEGFR1 (Exemplo 11; Figura 31-2). Estes ensaios de competição são também executados após pré-incubação do VHH com 25 μM de albumina sérica humana. Um sumário de valores de IC50 é mostrado na Tabela 46-A. Tabela 46-A Valores de IC50 (nM) em ensaio AlphaScreen de competição de VEGF165 humano/VEGFR2 humano e VEGF165 hu- mano/VEGFR1 humano
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n.d., não determinado
[000337] Cinética de ligação dos VHHs biespecífico em VEGF165 humano é analisada por SPR em um instrumento Biacore T100 (vide Exemplo 12.5 descrito na patente US 2011/0172398 A1). Nanocorpo monovalente VEGFBII00038 é tirado como referência (Tabela 46-B). Tabela 46-B: Visão geral dos parâmetros cinéticos em ensaio de Biacore de hVEGF165.
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[000338] A habilidade dos VHHs para ligar à isoforma humana VEGF121 é determinada em um ensaio de ELISA de ligação. Ligação de uma série de diluições de VHH a 1 μg/ml de VEGF121 humano diretamente revestido (R&D) (VEGF165 humano como referência) é detectada usando anti-VHH 1A4 biotinado seguido por extravidina-HRP. 1A4 é um VHH anti-VHH (gerado em laboratório por Ablynx NV). A Avastina de ponto de referência (benchmark) serve como controle positivo e é detectada usando um anticorpo de Fc anti-humano conjugado com HRP. Um VHH irrelevante serve como controle negativo. As curvas de ligação-resposta representativas em VEGF165 e VEGF121 são mostradas na Figura 46, valores de EC50 correspondentes estão resumidos na Tabela 46-C. Tabela 46-C: Visão geral dos valores de EC50 em ensaio de ELISA de ligação de hVEGF165 e hVEGF121.
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[000339] Ligação a VEGF164 de rato e camundongo é avaliada em um ensaio de ELISA de ligação. Ligação de VHHs a 1 μg/mL de VEGF164 murino ou de rato diretamente revestido (R&D) é detectada usando 1A4 de anti-VHH biotinado seguido por extravidina-HRP. Como controle positivo, o B20-4.1 de anticorpo monoclonal reativo cruzado de camundongo/rato (Genentech) é titulado e detectado com um anticorpo de Fc anti-humano conjugado com HRP. Um VHH irrelevante serve como controle de negativo. Os resultados estão mostrados na Figura 33. Todos os 3 VHHs biespecíficos não reagiram cruzado com VEGF de camundongo e rato. Ligação a VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e PlGF humano é avaliada por meio de um ensaio de ELISA de ligação. Ligação de VHHs a 1 μg/ml de VEGF-B (R&D), VEGF-C (R&D), VEGF-D (R&D) e PIGF diretamente revestidos (R&D) foi detectada usando 1A4 de anti-VHH bi- otinado seguido por extravidina-HRP. Como controles positivos uma série de diluições de receptores apropriados (hVEGFR1-Fc para hVEGF- B e hPlGF, hVEGFR2-Fc para hVEGF-C, mAb de anti-hVEGF-D (R&D) para hVEGF-D) é tirada. Um VHH irrelevante serve como controle negativo. Os resultados estão mostrados na Figura 34. Todos os 3 VHHs biespecíficos não estão ligando aos membros da família de VEGF.
[000340] Para explorar as propriedades de bloqueio de anti-Ang2 comparadas com seu respectivo bloco de construção monovalente 00921 (SEQ ID NO: 220) e 00938 (SEQ ID NO: 222), todos os 3 VHHs biespecíficos são analisados no ensaio de ELISA de competição Ang2/hTie2-Fc humano (vide Exemplo 5.1; Figura 35-1), Ang2/mTie2- Fc de camundongo (vide Exemplo 5.2; Figura 35-2) e Ang2/cTie2-Fc de cino (vide Exemplo 5.2; Figura 35-3). O ensaio humano é também executado após incubação do VHH com 0,5 μM de albumina sérica humana. Adicionalmente, VHHs biespecíficos são testados no ensaio de ELISA de competição de hAng1/hTie2 (vide Exemplo 5.3; Figura 36) e no ensaio de sobrevivência de HUVEC mediada por Ang2 (vide Exemplo 5.5; Figura 37). Um sumário dos valores de IC50 e % da inibição é mostrado na Tabela 47-A. Tabela 47-A: Valores de IC50 (pM) em ensaio de ELISA de competição de Ang2 humano/Tie2 humano, Ang2 de camundongo/Tie2 de camundongo e Ang2 de cino/Tie2 de cino, hAng1 e valores de IC50 (nM) em ensaio de sobrevivência de HUVEC mediado por hAng2
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[000341] Afinidades de VEGFANGBII00022-25-28 para Ang2 humano, de camundongo, cino e rato (vide Exemplo 5.4) foram determinadas e mostradas na Tabela 47-B. Tabela 47-B: KD de afinidade dos VHHs purificados para
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[000342] As afinidades de VEGFANGBII00022-25-28 para albumina sérica humana, de camundongo e de cino foram determinadas (Exemplo 11) e são mostradas na Tabela 48. A constante de afinidade KD é calculada das constantes de taxa de associação e dissociação resultantes ka e kd (Tabela 48). Tabela 48: Afinidade KD (nM) de VHHs purificados para o hu-mano recombinante, camundongo e albumina sérica de cino usando (UM) 1:1 modelo de interação ou (B) modelo de ligante heterogêneo
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descreve 70% ou mais da interação.
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Claims (7)

1. Molécula de ligação biespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende: - um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação à VEGF, - um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação à albumina sérica, e - um domínio variável simples da imunoglobulina de ligação à Ang2, em que - o dito domínio variável simples da imunoglobulina de liga-ção à VEGF apresenta as seguintes sequências de regiões de determi-nação de complementaridade (CDRs): CDR1: SYSMG CDR2: AISKGGYKYDAVSLEG CDR3: SRAYGSSRLRLADTYEY, - o dito domínio variável simples da imunoglobulina de liga-ção à albumina sérica apresenta as seguintes sequências de regiões de determinação de complementaridade (CDRs): CDR1: SFGMS (SEQ ID NO: 255) CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 256) CDR3: GGSLSR (SEQ ID NO: 257), - o dito domínio variável simples da imunoglobulina de liga-ção à Ang2 apresenta as seguintes sequências de regiões de determi-nação de complementaridade (CDRs): CDR1: DYAIG (SEQ ID NO: 248) CDR2: AIRSSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 249) CDR3: VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA (SEQ ID NO: 250), e em que dito domínio variável simples da imunoglobulina de ligação à Ang2 se liga à Ang2 com uma potência pelo menos 5.000 vezes maior que a Ang1 ou a Ang4.
2. Molécula de ligação biespecífica de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizada pelo fato de que os ditos domínios variáveis simples da imunoglobulina são VHHs.
3. Molécula de ligação biespecífica, caracterizada pelo fato de que apresenta a sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 207 (VEGFANGBII00022).
4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma molécula de ligação biespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, como o ingrediente ativo.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer ou para uso no tratamento de doenças no olho.
6. Método para fabricar uma molécula de ligação biespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - cultivar as células hospedeiras que contém um vetor con-tendo uma molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação biespecíficacomo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sob condições que permitem a expressão da dita molécula de ligação biespecífica da invenção; e - recuperar ou isolar a dita molécula de ligação biespecífica expressa pelas ditas células hospedeiras da cultura.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de: - ainda purificar ou modificar ou formular a dita molécula de ligação biespecífica da invenção.
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