EA036746B1 - Биспецифическая связывающая молекула, связывающаяся с vegf и ang2 - Google Patents

Abstract

В патенте описаны связывающие молекулы, которые связываются и с VEGF, и с Ang2, и способы их получения. Кроме того, описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие эти связывающие молекулы, экспрессионные векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего вещества по меньшей мере одну указанную связывающую молекулу и предназначенная для лечения заболевания, которое ассоциировано с опосредуемыми VEGF и/или опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, связывающимся с VEGF И ANG2, способам их получения, молекулам нуклеиновых кислот, к экспрессионным векторам и клеткам - хозяевам с этими нуклеиновыми кислотами, фармацевтической композиции, содержащей в качестве действующего вещества по меньшей мере одну из представленных связывающих молекул.

Предпосылки создания изобретения

Когда опухоли достигают критического размера, составляющего примерно 1 мм³, они начинают зависеть от ангиогенеза для обеспечения поступления с кровью кислорода и питательных веществ, позволяющих им продолжать рост. Антиангиогенные терапии стали важным методом лечения при некоторых типах опухолей. Эти терапии сфокусированы на блокаде пути VEGF (Ferrara и др., Nat Rev Drug Discov. 3(5), май 2004 г., сс. 391-400) путем нейтрализации VEGF (авастин) или его рецепторов (сутент и сорафиниб). Современные проведенные на мышах исследования продемонстрировали, что ангиопоэтин-2 (Ang2), лиганд Tie2-рецептора, контролирует ремоделирование сосудов, обеспечивая функционирование других ангиогенных факторов, таких как VEGF. Ang2 экспрессируется главным образом эндотелиальными клетками, установлено, что имеет место его сильная индукция под действием гипоксии и других ангиогенных факторов, и было продемонстрировано, что он регулирует пластичность сосудов опухоли, что позволяет сосудам реагировать на VEGF и FGF2 (Augustin и др., Nat Rev Mol Cell Biol. 10(3), март 2009 г., cc. 165-177). Установлено, что элиминирование или ингибирование Ang2 приводит к пониженному ангиогенезу (Gale и др., Dev Cell. 3(3), сентябрь 2002 г., cc. 302-304; Falcon и др., Am J Pathol. 175(5), ноябрь 2009 г., cc. 2159-2170), что согласуется с указанной ролью. Повышенные концентрации Ang2 в сыворотке обнаружены у пациентов с колоректальным раком (CRC), NSCLC и меланомой (Goede и др., Br J Cancer. 103(9), 26 октября 2010 г., cc. 1407-1414); Park и др., Chest. 132(1), июль 2007 г., cc. 200-206; Helfrich и др., Clin Cancer Res. 15(4), 15 февраля 2009 г., cc. 1384-1392). При CRC-раке уровни Ang2 в сыворотке коррелируют с терапевтическим ответом на анти-VEGF терапию.

Система Ang-Tie состоит из двух рецепторов (Tie1 и Tie2) и трех лигандов (Ang1, Ang2 и Ang4) (Augustin и др., Nat Rev Mol Cell Biol. 10(3), март 2009 г., cc. 165-177). Tie2, Ang1 и Ang2 являются наиболее хорошо изученными представителями этого семейства, Tiel представляет собой сиротский рецептор, а роль Ang4 в ремоделировании сосудов подлежит изучению. Ang2 и Ang1 опосредуют противоположные функции при связывании с Tie2 и активации. Опосредуемая Ang2 активация Tie2 приводит к активации эндотелиальных клеток, диссоциации перицитов, просачиванию из сосудов и индукции и разрастанию сосудов. В отличие от Ang2 передача сигналов Ang1 поддерживает целостность сосудов путем рекрутмента перицитов, поддерживая тем самым состояние покоя эндотелиальных клеток.

Ангиопоэтин 2 (Ang2) представляет собой секретируемый лиганд для тирозинкиназного Tie2рецептора с молекулярной массой 66 кДа (Augustin и др., Nat Rev Mol Cell Biol. 10(3), март 2009 г., cc. 165-177). Ang2 состоит из N-концевого coiled-coil домена и С-концевого фибриногенподобного домена, последний необходим для взаимодействия с Tie2. Ang2 экспрессируется главным образом эндотелиальными клетками, было установлено, что имеет место его сильная индукция под действием гипоксии и других ангиогенных факторов, включая VEGF. Tie2 обнаружен в эндотелиальных клетках, гематопоэтических стволовых клетках и опухолевых клетках. Установлено, что Ang2-Tie2 регулирует пластичность сосудов опухоли, что позволяет сосудам реагировать на VEGF и FGF2.

In vitro установлено, что Ang2 действует в качестве несильного митогена, хемоаттрактанта и индуктора образования трубочек в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Ang2 индуцирует фосфорилирование тирозина при эктопической экспрессии Tie2 в фибробластах и стимулирует передачу сигналов по ходу транскрипции, таких как фосфорилирование ERK-MAPK, AKT и FAK, в HUVEC. Описано антагонистическое воздействие Ang2 на индуцируемые Ang1 ответы эндотелиальных клеток.

Установлено, что дефицит Ang2 приводит у мышей к выраженному дефекту лимфатической структуры. Хотя снижение уровня Ang2 не имеет решающего значения для развития эмбриональных сосудов, мыши с дефуцитом Ang2 имели устойчивые дефекты сосудов в сетчатке и почке. В сочетании со схемой динамики экспрессии Ang2 в местах ангиогенеза (например, в яичнике), указанные данные свидетельствуют о том, что Ang2 контролирует ремоделирование сосудов, обеспечивая функции других ангиогенных факторов, таких как VEGF.

Система Ang2-Tie2 имеет решающее значение в процессе ангиогенного переключения и на последних стадиях ангиогенеза опухоли. Для экспрессии Ang2 характерна сильная повышающая регуляция в ассоциированном с опухолью эндотелии. Замедленный рост опухолей обнаружен при имплантации в мышей с дефицитом Ang2, прежде всего на ранних стадиях роста опухоли. Установлено, что терапевтическая блокада Ang2 с помощью МАт к Ang2 обладает широким спектром эффективности в отношении моделей различных опухолей, созданных с использованием ксенотрансплантатов.

Описано дополнительное воздействие МАт к Ang2 с использованием ингибиторов VEGFR2 (МАт и низкомолекулярные ингибиторы).

Как обобщено в US 2008/0014196 и WO 2008/101985 ангиогенез принимает участие в патогенезе ряда нарушений, включая плотные (солидные) опухоли и метастазы, а также глазные болезни. Одним из

- 1 036746 наиболее важных проангиогенных факторов является сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который обозначают также как VEGF-A или фактор сосудистой проницаемости (VPF). VEGF принадлежит к семейству генов, включающему плацентарный фактор роста (PLGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E и VEGF-F. Альтернативный сплайсинг мРНК единичного гена человеческого VEGF приводит к образованию по меньшей мере шести изоформ (VEGF 121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 и VEGF206), при этом наиболее часто встречающейся изоформой является VEGF 165.

Идентифицировано два тирозинкиназных рецептора VEGF (VEGFR), которые взаимодействуют с VEGF, а именно, VEGFR-1 (который обозначают также как Fit-1) и VEGFR-2 (который обозначают также как KDR или FIK-1). VEGFR-1 обладает наиболее высокой аффинностью к VEGF, a VEGFR- 2 характеризуется несколько более низкой аффинностью к VEGF. У Ferrara (Endocrine Rev., 25, 2004, cc. 581611) представлено подробное описание VEGF, данные о его взаимодействии с рецепторами и его функция при нормальных и патологических процессах описаны, например, у Hoeben и др., Pharmacol. Rev., 56, 2004, cc. 549-580.

Известно, что VEGF представляет собой имеющий решающее значение регулятор как нормального, так и аномального ангиогенеза (Ferrara и Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18, 1997, cc. 4-25; Ferrara, J. MoL Med., 77, 1999, cc. 527-543). По сравнению с другими факторами роста, которые участвуют в процессах формирования сосудов, VEGF является уникальным благодаря его высокой специфичности в отношении эндотелиальных клеток в сосудистой системе. В большинстве человеческих опухолей обнаружена сверхэкспрессия мРНК VEGF. В случае роста опухолей ангиогенез, по-видимому, имеет решающее значение для перехода от гиперплазии к неоплазии и для обеспечения питания, необходимого для роста и метастазирования опухоли (Folkman и др., Nature 339, 1989, с. 58), что позволяет опухолевым клеткам приобретать преимущества с позиций роста по сравнению со здоровыми клетками. Таким образом, антиангиогенные терапии могут стать важным средством лечения некоторых типов опухолей. Эти терапии сфокусированы на блокаде VEGF-пути (Ferrara и др., Nat Rev Drug Discov., 3(5), май 2004 г., cc. 391-400).

VEGF принимает участие также в патогенезе глазных болезней. Обнаружен высокий уровень корреляции между концентрацией VEGF в глазных жидкостях и наличием активной пролиферации кровеносных сосудов у пациентов с диабетическими и другими связанными с ишемией ретинопатиями. Кроме того, в современных исследованиях продемонстрирована локализация VEGF в хороидальных неоваскулярных мембранах у пациентов, страдающих возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD). При различных воспалительных заболеваниях обнаружена также повышающая регуляция VEGF. VEGF принимает участие в патогенезе ревматоидного артрита (РА), воспалительного заболевания, в котором ангиогенез играет значительную роль.

Раскрытие роли VEGF в ангиогенезе и различных процессах свидетельствует о том, что он представляет собой новую потенциальную мишень для терапевтического вмешательства. Функцию VEGF ингибировали с помощью малых молекул, которые блокируют или предупреждают активацию рецепторных тирозинкиназ VEGF (Schlaeppi и Wood, Cancer Metastasis Rev., 18, 1999, cc. 473-481) и, как следствие, оказывают воздействие на путь трансдукции сигнала рецептора VEGF. Цитотоксические конъюгаты, содержащие бактериальные или растительные токсины, могут ингибировать стимулирующее действие VEGF на ангиогенез опухолей. Например, конъюгаты VEGF-токсин DT385 (домены дифтерийного токсина, слитые или химически конъюгированные с VEGF 165), эффективно ингибируют рост опухолей in vivo. Ингибирование роста опухолей можно осуществлять также путем введения мутанта Flk-1 или растворимых VEGF-рецепторов с использованием ретровирусов.

Разработаны нейтрализующие VEGF антитела, такие как А4.6.1 и MV833, которые блокируют связывание VEGF с его рецепторами, и в доклинических исследованиях была продемонстрирована их противоопухолевая активность (Kim и др., Nature, 362, 1993, cc. 841-844; Folkman Nat. Med., 1, 1995, cc. 2731; Presta и др., Cancer Res., 57, 1997, cc. 4593-4599; Kanai и др., Int. J. Cancer, 77, 1998, cc. 933-936; Ferrara и Alitalo, Nat. Med., 5, 1999, cc. 1359-1364; 320, 340). Обзор исследований с использованием терапевтических подходов, основанных на применении антител к VEGF, представлен у Campochiaro и Hackett, Oncogene, 22, 2003, cc. 6537-6548.

В клинических исследованиях наиболее изученным является антитело А4.6.1, которое обозначают также как бевацизумаб (Avastin®; фирма Genentech, Сан-Франциско, шт. Калифорния).

В WO 2008/101985 описаны иммоноглобулиновые единичные вариабельные домены верблюдовых (VHH или Nanobodies®, представленные в настоящем описании), которые связываются с VEGF, и их применение для лечения состояний и заболеваний, отличающихся чрезмерным и/или патологическим ангиогенезом или неоваскуляризацией.

Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать новые ангиогенные связывающие молекулы, предназначенные для лечения человека.

Способы предупреждения, лечения, облегчения и/или диагностирования указанных заболеваний, нарушений или состояний заключаются в том, что применяют или вводят указанные связывающие молекулы и содержащие их композиции. Фармакологичные активные связывающие молекулы, композиции и/или способы обладают преимуществами по сравнению с агентами, композициями и/или методами, ко- 2 036746 торые применяют в настоящее время и/или которые известны в данной области. Указанные преимущества включают улучшенные терапевтические и/или фармакологические свойства и/или другие обладающие преимуществами свойства, например, для целей изготовления, прежде всего по сравнению с каноническими антителами, описанными выше, или их фрагментами.

Краткое изложение сущности изобретения

Первым объектом изобретения являются связывающие молекулы, которые имеют последовательность в соответсвии с SEQ ID NO: 207, с SEQ ID NO: 210, с SEQ ID NO: 213, но в которых в качестве Nконцевой аминокислоты отсутствует аспарагиновая кислота (D).

Более конкретно, биспецифическая связывающая молекула практически содержит (I) Ang2связывающий компонент, который специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом Ang2, и (II) VEGF-связывающий компонент, который специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом VEGF, где компоненты сцеплены друг с другом таким образом, что они одновременно связываются с Ang2 и VEGF или таким образом, что они связываются в определенный момент времени с Ang2 или VEGF.

Как должно быть очевидно специалисту в данной области, настоящее изобретение можно отнести к биспецифическим связывающим молекулам, которые включают другие анти-Ang2 или анти-VEGF иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, такие как доменные антитела.

Другим объектом изобретения являются нуклеиновые кислоты, кодирующие биспецифические связывающие молекулы, а также клетки-хозяева и экспрессионный вектор, которые их содержат.

Изобретение относится также к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении, она предназначена для лечения заболевания, которое ассоциировано с опосредуемыми VEGF и/или опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез, в частности для лечения рака.

Изобретение относится также к способу получения биспецифических связывающих молекул, включающий этапы:

культивирования клетки-хозяина, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, обеспечивающих экспрессию указанной связывающей молекулы; и выделение или извлечение этой связывающей молекулы, которая экспрессируется этой клеткойхозяином, из культуры.

Дополнительно этот способ включает этап очистки этой связывающей молекулы.

Было установлено, что Ang2-связывающий компонент биспецифических связывающих молекул может связываться с Ang2 по меньшей мере в 5000 сильнее, предпочтительно в 10000 раз сильнее, чем с Ang1 или Ang4. Это должно в большой степени позволять избегать блокады активации опосредуемой Ang1 передачи сигналов, что может препятствовать требуемому антиангиогенному действию.

Установлено также, что VEGF-связывающий компонент биспецифических свяызвающих молекул связывается с VEGF-A с аффинностью по меньшей мере в 1000 раз более высокой, предпочтительно по меньшей мере в 5000 раз более высокой, более предпочтительно по меньшей мере в 10000 раз более высокой, чем с VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D или PLGF. Благодаря наиболее выраженному связыванию с VEGF-A не происходит взаимодействия с передачей сигнала VEGFR3, которой модулирует ангиогенез лимфатических сосудов.

Кроме того, благодаря биспецифической природе (VEGF- и Ang2-связывающие компоненты в одной молекуле) проникновение в опухоль обеих функциональностей неизбежно должно быть одинаковым, что должно гарантировать, что благоприятные действия объединенного антагонизма VEGF и Ang2 должно распространяться на всю глубину проникновения в опухоль. Это может являться преимуществом по сравнению с применением комбинации индивидуальных антагонистов к этим мишениям, поскольку глубина проникновения индивидуальных антагонистов всегда может варьироваться в некоторой степени.

Определения

Если не указано или определено иное, то все применяемые понятия употребляются в их обычном значении, принятом в данной области, которое очевидно специалистам в данной области. В качестве ссылки можно указать, например, стандартные руководства, такие как Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-ое изд., тома 1-3, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Lewin, Genes IV, изд-во Oxford University Press, New York, 1990, и Roitt и др., Immunology (2-ое изд.), изд-во Gower Medical Publishing, London, New York, 1989, а также документы, касающиеся общего уровня техники, процитированные в настоящем описании; кроме того, если не указано иное, все методы, стадии, процессы и манипуляции, которые не описаны конкретно в деталях, можно осуществлять (и их осуществляли) хорошо известными методами, что должно быть очевидно специалисту в данной области. И в этом случае также в качестве ссылки можно, например, указать на известные руководства, сведения, касающиеся общего уровня техники, указанные выше, и дополнительные процитированные в них ссылки.

Понятие биспецифическая связывающая молекула относится к молекуле, которая содержит по меньшей мере одну Ang2-связывающую молекулу (или Ang2-связывающий компонент) и по меньшей мере одну VEGF-связывающую молекулу (или VEGF-связывающий компонент). Биспецифическая свя- 3 036746 зывающая молекула может содержать более одной Апд2-связывающей молекулы и/или более одной VEGF-связывающей молекулы, что имеет место в том случае, когда биспецифическая связывающая молекула содержит бипаратопную (что будет описано ниже) Ang2-связывающую молекулу и/или бипаратопную VEGF-связывающую молекулу, в той части молекулы, которая связывается с Ang2 или с VEGF т.е. в ее Ang2-связывающем компоненте или (анти-Ang2-kомпоненте) или VEGF-связывающем компоненте (или в анти-VEGF-kомпоненте) соответственно. Однако понятие биспецифический в этом контексте не предусматривает, что из биспецифической связывающей молекулы исключаются дополнительные связывающие компоненты, которые имеют связывающую специфичность в отношении молекул, отличных от VEGF и Ang2. Примерами указанных дополнительных связывающих компонентов являются (но не ограничиваясь только ими) связывающие компоненты, которые связываются с сывороточным альбумином.

Если не указано иное, то понятия иммуноглобулин и последовательность иммуноглобулина, если их используют в контексте настоящего описания касательно состоящего только из тяжелых цепей антитела или канонического состоящего из 4 цепей антитела, применяют в качестве общих понятий, которые включают полноразмерное антитело, его индивидуальные цепи, а также все его области, домены или фрагменты (включая (но, не ограничиваясь только ими) антигенсвязывающие домены или фрагменты, такие как VHH-домены или VH/VL-домены соответственно). Кроме того, понятие последовательность в контексте настоящего описания (например, в понятиях типа последовательность иммуноглобулина, последовательность антитела последовательность (единичного) вариабельного домена, последовательность VHH или последовательность белка), как это обычно принято, относится как к соответствующим аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновых кислот или нуклеотидным последовательностям, которые их кодируют, если из контекста не следует более ограниченная интерпретация.

Понятие домен (область) (полипептида или белка) в контексте настоящего описания относится к складчатой белкой структуре, которая обладает способностью сохранять свою третичную структуру, независимо от остального белка. Как правило, домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях их можно добавлять, удалять или переносить в другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена.

Понятие иммуноглобулиновый домен в контексте настоящего описания относится к глобулярной области цепи антитела (такой, например, как цепь канонического состоящего из 4 цепей антитела или состоящего из тяжелых цепей антитела) или к полипептиду, который состоит практически из указанной глобулярной области. Иммуноглобулиновые домены отличаются тем, что они сохраняют присущую иммуноглобулину складчатую структуру молекул антитела, которая представляет собой 2-слойный сэндвич, состоящий примерно из 7 антипараллельных бета-цепей, упакованных в две бета-складки, необязательно стабилизированных с помощью консервативного дисульфидного мостика. Иммуноглобулиновый домен содержит вариабельный(ые) домен(ы), т.е. один или несколько иммуноглобулиновых вариабельных доменов. Понятие иммуноглобулиновый вариабельный домен (область) в контексте настоящего описания относится к иммуноглобулиновому домену, состоящему практически из четырех каркасных участков, как они определены в данной области, и обозначены ниже как каркасный участок 1 или FR1; каркасный участок 2 или FR2; каркасный участок 3 или FR3 и каркасный участок 4 или FR4 соответственно; указанные каркасные участки перемежаются тремя гипервариабельными участками, участками, определяющими комплементарность или CDR, как они определены в данной области, и обозначены ниже как гипервариабельный участок 1 или CDR1; гипервариабельный участок 2 или CDR2 и гипервариабельный участок 3 или CDR3 соответственно. Таким образом, общую структуру или последовательность вариабельного домена иммуноглобулина можно обозначать как: FR1 CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Именно вариабельный(ые) домен(ы) иммуноглобулина придает(ют) специфичность антителу в отношении антигена, поскольку он(они) несут антигенсвязывающий центр. В контексте настоящего изобретения предпочтительными являются иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены типа VHH и доменных антител.

Понятие иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен в контексте настоящего описания относится к иммуноглобулиновому вариабельному домену, который обладает способностью специфически связываться с эпитопом антигена без спаривания с дополнительным иммуноглобулиновым вариабельным доменом. Одним из примеров иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов согласно настоящему изобретению являются доменные антитела, такие как единичные вариабельные домены VH и VL (VH-домены и VL-домены). Другим примером иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов являются VHH-домены (или просто VHH) из представителей верблюдовых, как указано ниже в настоящем описания.

В свете вышеуказанных определений антигенсвязывающий домен канонического состоящего их 4 цепей антитела (такого как молекула IgG, IgM, IgA, IgD или IgE; известная в данной области) или Fabфрагмента, F(ab')2-фрагменmа, Fv-фрагмента, такого как связанный дисульфидным мостиком Fv или scFv-фрагмент, или димерного антитела (диабоди) (которые все известны в данной области), выведенный из указанного канонического состоящего из 4 цепей антитела, не следует рассматривать как иммуногло- 4 036746 булиновый единичный вариабельный домен, поскольку в этих случаях связывание с соответствующим эпитопом антигена в норме не может осуществляться с помощью одного (единичного) иммуноглобулинового домена, а должно происходить посредством спаривания (ассоциации) иммуноглобулиновых доменов, таких как вариабельные области легкой и тяжелой цепей, т.е. с помощью пары VH-VL иммуноглобулиновых доменов, которые совместно связываются с эпитопом соответствующего антигена.

VHH-домены, которые обозначают также как VHH, V_HH-домены, фрагменты VHH-антитела и VHH-антитела, впервые были описаны как антигенсвязывающие иммуноглобулиновые (вариабельные) домены состоящих из тяжелых цепей антител (т.е. антител, в которых отсутствуют легкие цепи), Hamers-Casterman С, Atarhouch T, Muyldermans S., Robinson G., Hamers С, Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. в: Naturally occurring antibodies devoid of light chains; Nature 363, 1993, cc. 446-448). Понятие VHH-домен было выбрано для того, что можно было отличать эти вариабельные домены от вариабельных областей тяжелых цепей, которые присутствуют в канонических состоящих из 4 цепей антителах (они обозначены далее как VH-домены (области) или VH-домены (области)) и от вариабельных областей легких цепей, которые присутствуют в канонических состоящих из 4 цепей антителах (они обозначены далее как VL-домены (области) или VL-домены (области)). VHH-домены могут специфически связываться с эпитопом без дополнительного антигенсвязывающего домена (в отличие от VH- или VL-доменов в каноническом состоящем из 4 цепей антителе, в котором для распознавания эпитопа требуется присутствие VL-домена в сочетании с VH-доменом). VHHдомены представляют собой небольшие, сильные и эффективные распознающие антиген структуры (единицы), образованные единичным иммуноглобулиновым доменом.

В контексте настоящего изобретения понятия VHH-домен, VHH, VHH-домен, фрагмент VHHантитела, VHH-антитело, а также Nanobody® и домен Nanobody® (Nanobody является товарным знаком компании Ablynx N.V.; Гент, Бельгия) применяют взаимозаменяемо, и они относятся к иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменам (которые имеют следующее строение: FR1-CDR1-FR2CDR2-FR3-CDR3-FR4, и которые специфически связываются с эпитопом, не требуя присутствия второго иммуноглобулинового вариабельного домена), и они отличаются от VH-доменов наличием так называемых отличительных остатков, остатков-маркеров, как они определены, например, в WO 2009/109635, фиг. 1.

Аминокислотные остатки иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, например, VHH, нумеруют согласно общей номенклатуре Кэбота для VH-доменов (Sequence of proteins of immunological interest, изд-во US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, публикация № 91), в том виде, в котором ее применяют для VHH-доменов верблюдовых, например, как продемонстрировано на фиг 2 у Riechmann и Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 1999, cc. 25-38. Согласно этой нумерации:

FR1 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 1-30,

CDR1 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 31-35,

FR2 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 36-49, CDR2 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 50-65, FR3 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 66-94, CDR3 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 95-102 и FR4 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 103-113.

Однако следует отметить, что, как хорошо известно для VH-доменов и для VHH-доменов, общее количество аминокислотных остатков в каждом CDR может варьироваться и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанных в номенклатуре Кэбота (т.е. одно или несколько положений согласно номенклатуре Кэбота может быть незанятым в фактической последовательности или фактическая последовательность может содержать большее количество аминокислотных остатков, чем количество остатков, которое должно присутствовать согласно номенклатуре Кэбота). Это означает, что, в целом, нумерация по Кэботу может как соответствовать, так и не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в фактической последовательности.

В данной области известны альтернативные методы нумерации аминокислотных остатков VHдоменов, указанные методы также можно применять аналогичным образом к VHH-доменам. Однако, в настоящем описании, формуле изобретения и на чертежах нумерация соответствует номенклатуре Кэбота, и ее применяют к описанным выше VHH-доменам, если специально не указано иное.

Общее количество аминокислотных остатков в VHH-домене, как правило, составляет от 110 до 120, чаще от 112 до 115. Однако следует отметить, что для целей настоящего изобретения можно применять также как более короткие, так и более длинные последовательности.

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены (например, VHH и доменные антитела), имеют ряд уникальных структурных характеристик и функциональных свойств, которые делают их наиболее предпочтительными для применения в терапии в качестве функциональных антигенсвязывающих молекул. В частности (но, не ограничиваясь только ими), VHH-домены (которые созданы природой таким образом, что они могут функционально связываться с антигеном без спаривания с вариабельной областью легкой цепи) могут функционировать как единичные относительно мелкие функциональные антигенсвязывающие структурные единицы.

- 5 036746

Благодаря своим уникальным свойствам иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, как они определены в настоящем описании, типа VHH или VH (или VL), либо индивидуально, либо в качестве части более крупного полипептида, например, бипаратопной молекулы, обладают рядом важных преимуществ:

только один домен необходим для связывания антигена с высокой аффинностью и высокой селективностью, поэтому отсутствует как необходимость в наличии двух отдельных доменов, так и необходимость в требовании, чтобы эти два домена находились в правильной пространственной конформации и конфигурации (т.е. необходимость в применении специально созданных линкеров, как в случае scFv);

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены можно экспрессировать с одной молекулы нуклеиновой кислоты и при этом отсутствует необходимость в какой-либо пост-трансляционной модификации (типа гликозилирования);

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены легко можно конструировать в многовалентных и мультиспецифических форматах (что подробно обсуждено ниже в настоящем описании);

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены обладают высокой специфичностью и аффинностью к мишени, низкой присущей им токсичностью и их можно вводить путями, отличными от инфузии или инъекции;

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены обладают высокой устойчивостью к нагреванию, рН, протеазам и другим денатурирующим агентам или условиям и поэтому их можно получать, хранить или транспортировать без применения охлаждающего оборудования;

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены можно легко и относительно дешево получать как в лабораторном, так и в промышленном масштабе. Например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и полипептиды, содержащие их, можно получать с использованием ферментации микроорганизмов (что более подробно описано ниже) и для этой цели не требуется применения экспрессионных систем млекопитающих, что имеет место в случае канонических антител;

иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены являются относительно небольшими (примерно 15 кДа или в 10 раз меньше, чем канонический IgG) по сравнению с каноническими состоящими из 4 цепей антителами и их антигенсвязывающими фрагментами, и поэтому для них характерна высокая (более высокая) способность проникать в ткани (включая (но, не ограничиваясь только ими) плотные опухоли и другие плотные ткани) и их можно вводить в более высоких дозах, чем дозы канонических состоящих из 4 цепей антител и их антигенсвязывающих фрагментов;

VHH обладают специфической так называемой способностью связываться с сайтом, расположенном в расщелине (бороздке) (в том числе благодаря их удлиненной CDR3-петле, в отличие от VHдоменов состоящих из 4 цепей антител), и поэтому для них являются доступными также мишени и эпитопы, которые не доступны для канонических состоящих из 4 цепей антител и их антигенсвязывающих фрагментов;

VHH обладают важным преимуществом, которое заключается в том, что они обладают высокой растворимостью и очень высокой стабильностью и не имеют тенденцию к агрегации (что имеет место в случае полученных из антител мышей антигенсвязывающих доменов, описанных у Ward и др., Nature 341, 1989, cc. 544-546)).

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, не ограничены каким-либо конкретным биологическим источником, из которого их получают, или конкретным методом получения. Например, процесс получения VHH может включать следующие стадии:

(1) выделение VHH-домена из встречающегося в естественных условиях содержащего (только) тяжелые цепи антитела; или скрининг библиотеки содержащих (только) тяжелые цепи антител или VHH, и выделение из них VHH;

(2) экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VHH-домен, имеющий встречающуюся в естественных условиях последовательность;

(3) гуманизация (или оптимизация последовательности) VHH, необязательно после созревания аффинности, с помощью имеющей встречающуюся в естественных условиях последовательности, или экспрессия нуклеиновой кислоты, которая кодирует гуманизированный VHH;

(4) камелизация (согласно описанному ниже методу) иммуноглобулинового единичного вариабельного домена тяжелой цепи встречающегося в естественных условиях антитела, полученного из различных видов животных, в частности видов млекопитающих, таких как человек, или экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный камелизированный домен;

(5) камелизация VH или экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей камелизированный VH;

(6) применение методик для получения синтетических или полусинтетических белков, полипептидов или других аминокислотных последовательностей;

(7) получение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VHH-домен, с помощью методов синтеза нуклеиновых кислот с последующей экспрессией полученной таким образом нуклеиновой кислоты;

(8) подвергание содержащих тяжелые цепи антител или VHH процессу созревания аффинности, мутагенезу (например, неспецифическому мутагенезу или сайтаправленному мутагенезу) и/или любой(ым)

- 6 036746 другой(им) обработке(ам) для повышения аффинности и/или специфичности VHH; и/или (9) сочетание или выбор некоторых из вышеизложенных стадий. Приемлемые методы и процессы осуществления указанных выше стадий известны в данной области и должны быть очевидны специалисту в данной области. Например, методы получения VHH-доменов, которые связываются со специфическим антигеном или эпитопом, описаны в WO 2006/040153 и WO 2006/122786.

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены или присутствующие в полипептидах представляют собой VHH-домены, аминокислотная последовательность которых практически соответствует аминокислотной последовательности встречающегося в естественных условиях VHH-домена, но является гуманизированной (имеет оптимизированную последовательность) необязательно в результате созревания аффинности), т.е. имеет(ют) место замена(ы) одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности указанного встречающегося в естественных условиях VHH на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в вариабельной области тяжелой цепи канонического состоящего из 4 цепей человеческого антитела. Для этой цели можно применять методы, известные в данной области, которые являются общепринятыми для специалиста в данной области.

Гуманизированный VHH-домен может содержать одну или несколько последовательностей полностью человеческих каркасных участков и может содержать последовательности человеческих каркасных участков, выведенные из последовательностей человеческой зародышевой линии Vh3, таких как DP-29, DP-47, DP-51, или их части, или обладать высоким уровнем гомологии с ними, необязательно в сочетании с JH-последовательностями, такими как JH5. Так, протокол гуманизации может предусматривать замену любого из остатков VHH на соответствующие остатки каркасного участка 1, 2 и 3 (FR1, FR2 и FR3) генов VH зародышевой линии, таких как DP 47, DP 29 и DP 51, либо индивидуально, либо в комбинации. Приемлемые каркасные участки (FR) иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов можно выбирать из участков, описанных, например, в WO 2006/004678, и в частности, они включают так называемые классы KERE и GLEW. Наиболее предпочтительными являются иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые имеют аминокислотную последовательность G-L-E-W примерно в положениях 44-47, и их соответствующие гуманизированные копии. Гуманизированный VHHдомен может содержать одну или несколько последовательностей полностью человеческого каркасного участка.

Например, применяемая с целью гуманизации замена VHH, принадлежащих к 103 P,R,S-группе и/или GLEW-группе (что описано ниже), представляет собой замену 108Q на 108L. Методы гуманизации иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов известны в данной области.

Связывающие иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены с улучшенными с позиций терапевтического применения свойствами, например, обладающие повышенной аффинностью или пониженной иммуногенностью, можно получать из индивидуальных связывающих молекул с помощью методик, известных в данной области, таких как созревание аффинности (например, используя в качестве исходных синтетические, произвольные или встречающиеся в естественных условиях последовательности иммуноглобулинов), CDR-трансплантация, гуманизация, объединение фрагментов, полученных из различных последовательностей иммуноглобулинов, ПЦР-сборка с использованием перекрывающихся праймеров и аналогичные методики, предназначенные для конструирования последовательностей иммуноглобулинов, которые хорошо известны специалисту в данной области; или любой приемлемой комбинации любых вышеизложенных методов, что обозначают также понятием оптимизация последовательности, употребляемым в настоящем описании. В качестве ссылки можно указать, например, стандартные руководства, а также можно использовать приведенное ниже описание и сведения, представленные в примерах.

При необходимости связывающую молекулу, которая обладает повышенной аффинностью, получают из другой связывающей молекулы путем созревания аффинности, последняя представляет собой родительскую связывающую молекулу относительно молекулы с созревшей аффинностью.

Ранее были описаны методы получения VHH, которые связываются со специфическим антигеном или эпитопом, см., например, WO 2006/040153 и WO 2006/122786. Как подробно описано в указанных документах, VHH-домены, выведенные из представителей верблюдовых, можно гуманизировать (в контексте настоящего описания этот процесс обозначен также как оптимизация последовательности, при этом оптимизация последовательности помимо гуманизации может включать дополнительную модификацию последовательности с помощью одной или нескольких мутаций, которые позволяют получать VHH с улучшенными свойствами, таких как удаление потенциальных сайтов пост-трансляционных модификаций) путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности исходной последовательности VHH на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в VH-области канонического состоящего из 4 цепей человеческого антитела. Гуманизированный VHH-домен может содержать одну или несколько последовательностей полностью человеческого каркасного участка и может содержать последовательности человеческих каркасных участков, выведенные из DP-29, DP-47, DP-51, или их части, необязательно в сочетании с JH-последовательностями, такими как JH5.

- 7 036746

Доменные антитела, которые обозначают также как Dab или dAb (понятия доменные антитела и dAb являются товарным знаком группы компаний GlaxoSmithKline), описаны, например, у

Ward E.S. и др. в: Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from

Escherichia coli, Nature 341, 1989, cc. 544-546; у Holt L.J. и др. в: Domain antibodies: proteins for therapy, TRENDS in Biotechnology 21(11), 2003, cc. 484-490 и в WO 2003/002609.

Доменные антитела в основном соответствуют VH- или VL-доменам антител из представителей млекопитающих, не относящихся к верблюдовым, в частности человеческих состоящих из 4 цепей антител. Для придания способности связываться с эпитопом в виде единичного антигенсвязывающего домена, т.е. без спаривания с VL- или VH-доменом соответственно, требуется осуществлять специфическую селекцию в отношении указанных антигенсвязывающих свойств, например, с использованием библиотек человеческих последовательностей единичных VH- или VL-доменов.

Доменные антитела подобно VHH имеют молекулярную массу, составляющую от примерно 13 до примерно 16 кДа, если их выводят из полностью человеческих последовательностей, и они не нуждаются в гуманизации, например, для терапевтического применения на людях. Также как и в случае VHHдоменов, их можно с успехом экспрессировать также в прокариотических системах экспрессии, что приводит к существенному снижению общей стоимости производства.

Кроме того, что также должно быть очевидно специалисту в данной области, можно трансплантировать один или несколько указанных выше CDR в другие каркасы, включая (но, не ограничиваясь только ими) человеческие каркасы или неиммуноглобулиновые каркасы. Приемлемые каркасы и методики такой трансплантации CDR известны в данной области.

Понятия эпитоп и антигенная детерминанта, которые можно применять взаимозаменяемо, относятся к участку макромолекулы, такой как полипептид, который распознается антигенсвязывающими молекулами, такими как канонические антитела или полипептиды, и более конкретно антигенсвязывающими центрами указанных молекул. Эпитопы представляют собой минимальный сайт связывания для иммуноглобулина и поэтому представляют собой специфическую мишень для иммуноглобулина.

Считают, что полипептид (такой как иммуноглобулин, антитело, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или в целом связывающая молекула или ее фрагмент), который может связываться с или специфически связываться с, который обладает аффинностью к и/или специфичностью к определенному эпитопу, антигену или белку (или по меньшей мере одному его участку, фрагменту или эпитопу), действует против или является направленным против указанного эпитопа, антигена или белка, или является связывающей молекулой в отношении указанного эпитопа, антигена или белка. В этом контексте VEGF-связывающий компонент можно обозначать также как VEGF-нейтрализующий компонент.

Как правило, понятие специфичность относится к ряду антигенов или эпитопов различных типов, с которыми конкретная антигенсвязывающая молекула или молекула антигенсвязывающего белка (такая как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен) может связываться. Специфичность антигенсвязывающей молекулы можно определять на основе ее аффинности и/или авидности. Аффинность, характеризующаяся константной равновесия реакции диссоциации комплекса антиген: антигенсвязывающий белок (KD), является мерой силы связывания между эпитопом и антигенсвязывающим центром антигенсвязывающего белка: чем меньше величина KD, тем выше сила связывания между эпитопом и антигенсвязывающей молекулой (в альтернативном варианте аффинность можно выражать в виде константы аффиннности (KA), которая представляет собой 1/KD). Как должно быть очевидно специалисту в данной области (например, после ознакомления с представленным ниже дополнительным описанием), аффинность можно определять хорошо известным методом в зависимости от специфичности представляющего интерес антигена. Авидность представляет собой меру силы связывания между антигенсвязывающей молекулой (такой как иммуноглобулин, антитело, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или полипептид, содержащий их) и соответствующего антигена. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и его антигенсвязывающем центром антигенсвязывающей молекулы, так и с количеством соответствующих сайтов связывания, которые присутствует в антигенсвязывающей молекуле.

Часть антигенсвязывающей молекулы, которая распознает эпитоп, называется паратопом.

Если не указано иное, то понятие VEGF-связывающая молекула или Ang2-связывающая молекула включает антитела к VEGF или к Ang2, фрагменты антитела к VEGF или антитела к Ang2, молекулы, напоминающие антитело к VEGF или молекулы, напоминающие антитело к Ang2, как они определены в настоящем описании, и конъюгаты, включающие любую из них. Антитела представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные и химерные моноклональные антитела. Понятие антитело относится к полным иммуноглобулинам, например, моноклональным антителам, которые получают путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, а также к фрагментам антител или молекулам, напоминающим антитела, включая одноцепочечные антитела и линейные антитела, так называемые SMIP (Small Modular Immunopharmaceuticals, малые модульные иммунофармацевтические средства), например, описанные в WO 02/056910. Напоминающие антитела молекулы включают иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, представленные в настоящем описании. Другими приме- 8 036746 рами напоминающих антитела молекул являются антитела из суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF) или молекулы с трансплантированными CDR.

Понятие Ang2-связывающая молекула или VEGF-связывающая молекула соответственно относится как к одновалентным мишень связывающим молекулам (т.е. к молекулам, которые связываются с одним эпитопом соответствующей мишени), так и к двух- или многовалентным связывающим молекулам (т.е. связывающим молекулам, которые связываются с более чем одним эпитопом, например, бипаратопным молекулам, как они описаны ниже). Ang2-(или VEGF)-связывающие молекулы, которые содержат более одного связывающегося с Ang2 (или VEGF) иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, обозначают также как форматированные связывающие молекулы, они могут содержать в мишень связывающем компоненте помимо иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов также линкеры и/или фрагменты с эффекторными функциями, например, фрагменты, удлиняющие время полужизни, типа альбуминсвязывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, и/или партера по слиянию типа сывороточного альбумина и/или присоединенного полимера типа ПЭГ.

Понятие бипаратопная Ang2-(или VEGF)-связывающая молекула или бипаратопный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен в контексте настоящего описания означает связывающую молекулу, которая содержит первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен и второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как они определены в настоящем описании, при этом две молекулы связываются с двумя неперекрывающимися эпитопами соответствующего антигена. Бипаратопные связывающие молекулы состоят из иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, которые обладают различными специфичностями в отношении эпитопа. Паратопом называют часть антигенсвязывающей молекулы (такой как антитело или иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен,), которая распознает эпитоп.

Форматированная связывающая молекула может, хотя этот является менее предпочтительным, содержать также два идентичных иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена или содержать два различных иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена, которые распознают один и тот же или перекрывающиеся эпитопы или соответствующий антиген. В этом случае касательно VEGF два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена могут связываться с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом в каждом из двух мономеров, которые образуют димер VEGF.

Как правило, связывание связывающих молекул характеризуется значением константы диссоциации (KD), составляющей от 10Е-5 до 10Е-14 молей/л (М) или менее, и предпочтительно от 10Е-7 до 10Е14 молей/л (М) или менее, более предпочтительно от 10Е-8 до 10Е-14 молей/л и еще более предпочтительно от 10Е-11 до 10Е-13, по данным, полученным, например, с помощью Biacore- или Kinexaанализа), и/или значением константны ассоциации (KA), составляющей по меньшей мере 10Е8 ME^-1, более предпочтительно по меньшей мере 10Е9 МЕ-1, например, по меньшей мере 10Е11 ME^-1 . Как правило, считается, что любое значение величины KD, превышающее 10Е-4 М, свидетельствует о неспецифическом связывании. Предпочтительно связывание полипептидас требуемым антигеном, т.е. VEGF или Ang2 соответственно, должно характеризоваться значением Ко, составляющим менее 500нМ, предпочтительно менее 200нМ, более предпочтительно менее 10нМ, например, менее 500пМ. Специфическое связывание антигенсвязывающего участка с антигеном или эпитопом можно определять с помощью любого приемлемого хорошо известного метода, такого, например, как анализы, представленные в настоящем описании, анализ Скэтчарда и/или анализы связывания в условиях конкуренции (анализы конкурентного связывания), такие как радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (ФИА) и сэндвичанализы в условиях конкуренции и их различные варианты, хорошо известные в данной области.

Аминокислотные остатки обозначают согласно стандартному трехбуквенному или однобуквенному коду аминокислот, что хорошо известно и является общепризнанным в данной области. При сравнении двух аминокислотных последовательностей понятие различие в аминокислотах относится к инсерциям, делециям или заменам указанного количества аминокислотных остатков в определенном положении референс-последовательности по сравнению со второй последовательностью. В случае замен(ы) указанные(ая) замены(а) предпочтительно должны(а) представлять собой консервативные(ую) аминокислотные(ную) замены(у), это означает, что аминокислотный остаток заменяют на другой аминокислотный остаток сходного химического строения, который оказывает незначительное влияние или практически не оказывает влияния на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Указанные консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области, например они описаны в WO 98/49185, при этом консервативные аминокислотные замены предпочтительно представляют собой замены, при которых одну из аминокислот из следующих групп (I) - (V) заменяют на другой аминокислотный остаток, входящий в эту же группу: (I) небольшие алифатические неполярные или имеющие невысокую полярность остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (II) полярные отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (III) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (IV) крупные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и (V) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp. Наиболее предпочтительными являются следующие аминокислотные замены: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; Ile на Leu или на Val; Leu на Ile или на Val; Lys на Arg,

- 9 036746 на Gln или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp или на Phe; Val на Ile или на Leu.

Молекула полипептида или нуклеиновой кислоты рассматривается как практические выделенная (находится в практически выделенной форме), например, из ее нативного биологического источника и/или реакционный среды или среды для культивирования, из которой ее получают, когда она отделена по меньшей мере от одного компонента, с которым она обычно ассоциирована в указанном источнике или указанной среде, такой как другой белок /полипептид, другая нуклеиновая кислота, другой биологический компонент или макромолекула или по меньшей мере один загрязнитель, примесь или минорный компонент. В частности, молекула полипептида или нуклеиновой кислоты рассматривается как практически выделенная, когда степень ее чистоты повышена по меньшей мере в 2 раза, в частности по меньшей мере в 10 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз и вплоть до 1000 раз или более. Молекула полипептида или нуклеиновой кислоты, которая находится в практически выделенной форме, предпочтительно является практически гомогенной, что определяют с помощью приемлемого метода, такого как приемлемый хроматографический анализ, электрофорез в полиакриламидном геле.

Идентичность последовательностей последовательностей двух VEGF-связывающих молекул или последовательностей двух Ang2-связывαющих молекул означает процент аминокислот, идентичных для последовательностей. Его можно рассчитывать или определять согласно методу, изложенному в разделе f) на с. 49 и с. 50 WO 2008/020079. Сходство последовательностей означает процент аминокислот, которые либо идентичны, либо представляют собой консервативные аминокислотные замены.

В данной области известны альтернативные методы нумерации аминокислотных остатков VHдоменов, указанные методы аналогичным образом можно применять для нумерации VHH-доменов. Однако в настоящем описании, формуле изобретения и на чертежах, если не указано иное, используют номенклатуру Кэбота для нумерации VHH-доменов, которая описана выше.

VEGF-связывающая молекула или Ang2-связывающaя молекула с созревшей аффинностью, в частности, VHH или доменное антитело, несет одно или несколько изменений в одном или нескольких CDR, что приводит к улучшенной аффинности к VEGF или Ang2 по сравнению с соответствующей родительской VEGF-связывающей молекулой или VEGF-связывающей молекулой. VEGF-связывающие молекулы или Ang2-связывающие молекулы с созревшей аффинностью можно получать методами, описанными в данной области, например, описанными у Marks и др., Biotechnology 10, 1992, cc. 779-783 или у Barbas и др., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91, 1994, cc. 3809-3813.; Shier и др., Gene 169, 1995, cc. 147-155; Yelton и др., Immunol. 155, 1995, cc. 1994-2004; Jackson и др., J. Immunol. 154(7), 1995, cc. 3310-3319 и у Hawkins и др., J. Mol. Biol. 226(3), 1992, cc. 889-896; у K.S. Johnson и R.E. Hawkins в: Affinity maturation of antibodies using phage display, изд-во Oxford University Press, 1996. В контексте настоящего изобретения аминокислотные последовательности SEQ ID NO: x включают, если не указано иное, аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична последовательности, представленной в соответствующей SEQ ID NO: x;

а) аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны последовательности, представленной в соответствующей SEQ ID NO: х;

б) аминокислотные последовательности, которые имеют 3, 2 или 1 различие в аминокислотах относительно последовательности, представленной в соответствующей SEQ ID NO: x.

Понятие рак и злокачественный относится или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом/пролиферацией клеток. Примерами рака, который можно лечить с помощью биспецифической связывающей молекулы является (но, не ограничиваясь только ими) карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз. Более конкретными примерами указанных видов рака, которые предложено лечить с помощью антагонистов VEGF согласно US 2008/0014196, являются плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарционома легкого, плоскоклеточная карцинома легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак кишечно-желудочной системы, рак поджелудочной железы, глиобластома, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, саркома эндометрия или матки, карцинома слюнных желез, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома печени, рак желудка, меланома и различные виды рака головы и шеи. Нарушение регуляции ангиогенеза может приводить ко многим нарушениям, которые можно лечить с помощью фармацевтических композиций и способов. Эти нарушения включают как ненеопластические, так и неопластические состояния. Неопластические заболевания включают (но, не ограничиваясь только ими) описанные выше заболевания.

Ненеопластические нарушения включают (но, не ограничиваясь только ими) нарушения, которые в US 2008/0014196 предложено лечить с помощью антагонистов VEGF, а именно, нежелательную или аберрантную гипертрофию, артрит, ревматоидный артрит (РА), псориаз, псориатические бляшки, саркоидоз, атеросклероз, атеросклеротические бляшки, диабетические и другие пролиферативные ретинопатии, включая ретинопатию недоношенных, ретролентальную фиброплазию, неоваскулярную глаукому, возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетический макулярный отек, неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию трансплантата роговицы, отторжение трансплантата роговицы, ретинальную/хориои- 10 036746 дальную неоваскуляризацию, неоваскуляризацию угла глаза (покраснение), глазное связанное с неоваскуляризацией заболевание, васкулярный рестеноз, артериовенозные пороки развития (AVM), менингиому, гемангиому, ангиофиброму, гиперлазии щитовидной железы (включая болезнь Грейвса), трансплантацию роговицы и другой ткани, хроническое воспаление, воспаление легких, острое легочное повреждение/РДСВ (респираторный дистресс-синдром взрослых), сепсис, первичную легочную гипертензию, злокачественные пульмональные выпоты, отек головного мозга (например, ассоциированный с острым ударом/закрытым повреждением головы/травмой), синовиальное воспаление, формирование паннуса при RA, оссифицирующий миозит, гипертрофическое образование костной ткани, остеоартрит (ОА), рефрактерные асциты, поликистозное заболевание яичника, эндометриоз, болезни, связанные с накоплением жидкости в третьем пространстве организма (панкреатит, компартмент-синдром, ожоги, болезнь кишечника), фиброиды матки, преждевременные роды, хроническое воспаление, такое как IBD (болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), отторжение почечного аллотрансплантата, воспалительное заболевание кишечника, нефротический синдром, нежелательный или аберрантный рост тканевой массы (неракового происхождения), суставы при гемофилических артропатиях, гипертрофические рубцы, прекращение роста волос, синдром Ослера-Вебера, гнойную грануломатозную ретролентальную фиброплазию, склеродерму, трахому, васкулярные адгезии, синовиит, дерматит, преэклампсию, асциты, перикардиальный выпот (например, ассоциированный с перикардитом) и плевральный выпот.

Подробное описание изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является биспецифическая связывающая молекула, содержащая Ang2-связывающий компонент и VEGF-связывающий компонент.

Биспецифическая связывающая молекула может содержать по меньшей мере один VEGFсвязывающий компонент и по меньшей мере один Ang2-связывающий компонент, который дополнительно содержит по меньшей мере еще один связывающий компонент, а также, возможно, компонент, связывающий сывороточный альбумин (молекула, связывающая сывороточный альбумин).

Компонент связывающей молекулы, который связывает сывороточный альбумин, может представлять собой выделенный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или полипептид, содержащий один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, где указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен состоит из четырех каркасных участков и трех гипервариабельных участков CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно и где указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 257, 260, 263, 266, 269, 272 или 275.

Кроме того, один или несколько иммуноглобулиновый(ых) единичный(ых) вариабельный(их) домен(ов) компонента, связывающего сывороточный альбумин, могут(ет) содержать:

а) CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из первой группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 257, 260, 263, 266, 269, 272 или 275;

б) CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из второй группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 255, 258, 261, 264, 267, 270 или 273;

в) CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из второй группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 256, 259, 262, 265, 268, 271 или 274.

А также указанный(ые) один или несколько иммуноглобулиновый(ых) единичный(ых) вариабельный(их) домен(ов) компонента, связывающего сывороточный альбумин, могут представлять собой VHH, которые предпочтительно имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 98 или 254.

Указанный Апд2-связывающий компонент и указанный

VEGF-связывающий компонент могут содержать по меньшей мере один Ang2-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен и по меньшей мере один VEGF-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен соответственно.

Кроме того, указанный Ang2-связывающий компонент и указанный VEGF-связывающий компонент, содержащие по меньшей мере один Ang2-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен и по меньшей мере один VEGF-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен соответственно, при этом, каждый из иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов могут содержать четыре каркасных участка и три гипервариабельных участка CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно.

Так, анти- Ang2 и/или анти-VEGF-компонент, входящий в биспецифические связывающие молекулы может включать два (или большее количество) анти-Ang2 (или анти-VEGF соответственно) иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, где мишенью иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов являются различные эпитопы в Ang2 (или VEGF). Таким образом, два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена в биспецифической связывающей молекуле должны иметь различную антигенную специфичность и, следовательно, различные CDR-последовательности.

Указанные двухвалентные связывающие молекулы называют также бипаратопными конструкциями однодоменных антител (если иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены состоят или практически состоят из однодоменных антител) или бипаратопными VHH-конструкциями (если имму- 11 036746 ноглобулиновые единичные вариабельные домены состоят или практически состоят из VHH) соответственно, поскольку два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена должны включать два различных паратопа.

В биспецифической связывающей молекуле одна или обе связывающие молекулы могут быть двухвалентными; например, VEGF-связывающий компонент может быть бипаратопным и Ang2связывающий компонент может представлять собой один иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или VEGF-связывающий компонент может представлять собой один иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен и Ang2-связывающий компонент может быть бипаратопным.

В биспецифических связывающих молекулах предпочтительно VEGF-связывающий компонент может содержать двухвалентный VEGF-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, например, бипаратопный VHH.

Указанный VEGF-связывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может содержать два или большее количество VEGF-связывающих VHH, которые представляют собой:

а) идентичные VHH, которые обладают способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования >60%, или

б) различные VHH, которые связываются с неперекрывающимися эпитопами VEGF, где по меньшей мере один VHH обладает способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования >60%, и где по меньшей мере один VHH может блокировать указанное взаимодействие с уровнем ингибирования < 60%.

VEGF-связывающий компонент содержит по меньшей мере вариабельный домен с четырьмя каркасными участками и тремя гипервариабельными участками CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser Arg Ala Tyr Хаа Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr, представленную в SEQ ID NO: 1, в которой

Xaa в положении 5 обозначает Gly или Ala;

Хаа в положении 7 обозначает Ser или Gly;

Хаа в положении 12 обозначает Gly, Ala или Pro;

Хаа в положении 13 обозначает Asp или Gly;

Хаа в положении 16 обозначает Asp или Glu; и при этом, указанный VEGF-связывающая молекула обладает способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF165 с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования >60%.

Кроме того, Хаа в положении 5 может обозначать Gly, Хаа в положении 7 может обозначать Ser, Хаа в положении 12 может обозначать Ala и Хаа в положении 13 может обозначать Asp.

В частности, указанный CDR3 имеет последовательность, выбранную из

SEQ ID NO	2	SRAYGS SRLRLGDT YD Y,
SEQ ID NO	3	SRAYGS SRLRL ADT YD Y;
SEQ ID NO	4	SRAYGS SRLRL ADT YEY;
SEQ ID NO	5	SRAYGSGRLRLADTYDY;
SEQ ID NO	6	SRAYAS SRLRLADT YD Y;
SEQ ID NO	7	SRAYGS SRLRLPDT YD Y;
SEQ ID NO	8	SRAYGS SRLRLPGT YD Y.

А также VEGF-связывающая молекула может содержать один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, каждый из которых содержит

а) CDR3, аминокислотная последовательность которого выбрана из первой группы последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 2-8;

б) CDR1 и CDR2, аминокислотные последовательности которых входят, как показано в таблице 3, в число последовательностей, выбранных из второй группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 9-46, при указанная вторая последовательность содержит соответствующий CDR3, выбранный из указанных в подпункте а).

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены могут представлять собой VHH.

А именно, VHH могут иметь аминокислотные последовательности, выбранные из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 9-46.

А также, VHH могут иметь аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 25.

VEGF-связывающий компонент можно получать в результате созревания аффинности и/или оптимизации последовательности вышеуказанного VHH, например, к VHH, полученному в результате оптимизации последовательности VHH, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18. Примерами являются VHH, которые имеют аминокислотные последовательности, выбранные из последовательностей, представленных в SEQ IDNO: 47-57.

VEGF-связывающий компонент можно форматировать различными методами, например, он может

- 12 036746 быть бипаратопным или может содержать два идентичных иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена. Указанные VEGF-связывающие компоненты могут содержать два или большее количество

VHH, которые представляют собой:

а) идентичные VHH, которые обладают способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования >60%, или

б) различные VHH, которые связываются с неперекрывающимися эпитопами VEGF, где по меньшей мере один VHH обладает способностью блокировать взаимодействие человеческого рекомбинантного VEGF с человеческим рекомбинантным VEGFR-2 с уровнем ингибирования >60%, и где связывание по меньшей мере одного VHH может блокировать указанное взаимодействие с уровнем ингибирования <60%.

Процент блокирования указанного взаимодействия с уровнем ингибирования > 60% или < 60% соответственно можно отнести к уровню ингибирования, определенному с помощью гомогенного анализа усиленного за счет эффекта близости люминисценции (AlphaScreen®), конкурентного ELISA, анализа на основе резонанса плазмона (SPR) (Biacore®), которые применяли в примерах.

Ниже в настоящем описании активность VHH согласно подпункту а), обозначают также как блокирующая рецептор активность, а активность VHH согласно подпункту б) обозначают также как неблокирующая рецептор активность.

Для блокирующих рецептор VHH может быть предпочтителен уровень ингибирования > 80%, более предпочтительно > 90%; наиболее предпочтительные VHH являются полными блокаторами рецептора, т.е. для них характерен уровень ингибирования, равный 100%.

VEGF-связывающий компонент может содержать два или большее количество идентичных VHH, указанных в подпункте а), выбранных из VHH, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 9-46, или VHH, полученных в результате созревания аффинности и/или оптимизации последовательностей указанных VHH. VHH можно выбирать из VHH, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 47-57.

Форматированный VEGF-связывающий компонент может содержать два VHH, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57.

В форматированных VEGF-связывающих компонентах, которые содержат два различных VHH,

а) указанный(ые) один или несколько VHH, для которых характерен уровень ингибирования > 60%, можно выбрать из:

I. VHH, которые имеют аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 9-46, или

II. VHH, которые получены в результате созревания аффинности и/или оптимизации последовательности указанных VHH, и где

б) указанный(ые) один или несколько VHH, для которых характерен уровень ингибирования < 60%, выбирают из

I. SEQ ID NO: 58-124 или

II. VHH, которые получены в результате созревания аффинности и/или оптимизации последовательностей указанных VHH.

Два VHH, которые могут входить в полипептиды, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 128-168, также могут быть разделены линкерными последовательностями, указанными в табл.15.

В VEGF-связывающем компоненте VHH, указанный в подпункте а) I, может иметь аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, и VHH, указанный в подпункте б) I, может иметь аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64.

В других VEGF-связывающих компонентах VHH, указанные в подпункте а) II, могут быть выбраны из VHH, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 47-57, и VHH, указанные в подпункте б) II, могут быть выбраны из VHH, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 125-127.

Наиболее предпочтительным является бипаратопный VEGF-связывающий компонент, который содержит два VHH, один из которых имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 57, и один из которых имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 127.

Ang2-связывающий компонент может содержать по меньшей мере вариабельный домен с четырьмя каркасными участками и тремя гипервариабельными участками CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, и где указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250 или 253.

Указанный Ang2-связывающий компонент может представлять собой выделенный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или полипептид, содержащий один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, где указанный иммуноглобулиновый единичный вариа- 13 036746 бельный домен может содержать четыре каркасных участка и три гипервариабельных участка CDR1,

CDR2 и CDR3 соответственно, и где CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 226, 229, 232, 235, 238, 241,

244, 247, 250 или 253.

Кроме того, указанный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен Ang2-связывαющего компонента может содержать

а) CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из первой группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250 или 253 (см. также таблицу 49);

б) CDR1, имеющий аминокислотные последовательности, которые входят, как показано в таблице 36-А, 38-А, 41-А или 45-А, в качестве частичной последовательности в последовательность, выбранную из второй группы аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248 или 251 (см. также таблицу 49);

в) CDR2, имеющий аминокислотные последовательности, которые входят, как показано в табл.36А, 38-А, 41-А или 45-А в качестве частичной последовательности в последовательность, выбранную из второй группы аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249 или 252 (см. также таблицу 49).

Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен Ang2-связывaющего компонента может представлять собой VHH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223.

А так же иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен Ang2-связывaющего компонента можно получить путем созревания аффинности или гуманизации иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.

А также VHH можно получить путем созревания аффинности или гуманизации VHH Ang2связывающего компонента.

Аминокислотная последовательность Ang2-связывaющего VHH может быть выбрана из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223.

Приемлемыми для осуществления процедуры созревания аффинности родительскими Ang2связывающими молекулами являются, например, описанные выше VHH, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 214, 215, 216, 217, 218 или 219.

Таким образом, описаны Ang2-связывaющие молекулы, полученные путем созревания аффинности и/или оптимизации последовательности вышеуказанного VHH, например, к VHH, который был получен путем оптимизации последовательности VHH, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223. Аминокислотные последовательности, которые представляли собой источник, применяемый для создания последних VHH, представлены в SEQ ID NO: 214, 215 или 261. Кроме того, эти аминокислотные последовательности могут быть пригодны в качестве Ang2-связывaющих компонентов, которые можно применять в связывающих молекулах.

Как указано в настоящем описании, связывающая молекула может содержать по меньшей мере один компонент, связывающий сывороточный альбумин. Так, в частности, предпочтительные связывающие молекулы могут иметь по меньшей мере один VEGF-связывающий компонент, по меньшей мере один Ang2-связывающий компонент и по меньшей мере один компонент, связывающий сывороточный альбумин. Порядок указанных трех связывающих компонентов может представлять собой любой возможный порядок, например, порядок, представленный в таблице 36-Б, 38-Б, 40, 41-Б, 42, 43, 45-Б, 46-А или 47-А или на фиг. 20, 23, 27 или 30, например, VEGF -, Ang2- или связывающий сывороточный альбумин компонент может находиться на N-конце или на С-конце. В частности, 1D01 (SEQ ID NO: 214), 11В07, 00027 (SEQ ID NO: 216), 00908, 7G08 (SEQ ID NO: 215), 00919, 00921 (SEQ ID NO: 220), 00928 (SEQ ID NO: 221), 00932, 00933, 00934, 00935, 00936, 00937, 00938 (SEQ ID NO: 222) или 00956 (SEQ ID NO: 223) в таблицах и в описании к чертежам обозначают Ang2связывающие компоненты, а 00038 обозначает VEGF-связывающий компонент и ALB11 обозначает компонент, связывающий сывороточный альбумин. Ни один из них не ограничен конкретной последовательностью, а обозначает Ang2-, VEGF - и связывающий сывороточный альбумин компонент в целом, при применении в контексте возможных конструкций связывающих молекул.

Однако предпочтительно, чтобы компонент, связывающий сывороточный альбумин, находился между VEGF - и Ang2-связывающим компонентом (или наоборот), при этом наиболее предпочтительно, чтобы по меньшей мере один VEGF-связывающий компонент находился на N-конце, за ним следовал по меньшей мере один компонент, связывающий сывороточный альбумин, а затем по меньшей мере один Ang2-связывающий компонент, расположенный на С-конце. Установлено, что такой порядок является наиболее предпочтительным.

Таким образом, связывающие молекулы, которые содержат по меньшей мере один VEGFсвязывающий компонент, по меньшей мере один Ang2-связывающий компонент и по меньшей мере один

- 14 036746 компонент, связывающий сывороточный альбумин, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 180-213, могут быть наиболее предпочтительными.

Понятие по меньшей мере один связывающий (VEGF, Ang2 или сывороточный альбумин) компонент при применении в контексте настоящего описания указывает на то, что связывающая молекула может содержать один, два, три, четыре или пять связывающих VEGF, Ang2 и/или сывороточный альбумин компонентов (т.е. субстанций/единиц), которые предпочтительно представляют собой иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, указанный в настоящем описании.

VEGF- и/или Ang2-связывающие компоненты с улучшенными с позиций терапевтического применения свойствами, например, обладающие повышенной аффинностью или пониженной иммуногенностью, можно получать из индивидуальных VEGF -или Ang2-связывающих компонентов с помощью методик, известных в данной области техники, таких как созревание аффинности (например, используя в качестве исходных синтетические, произвольные или встречающиеся в естественных условиях последовательности иммуноглобулинов), CDR-трансплантация, гуманизация, объединение фрагментов, полученных из различных последовательностей иммуноглобулинов, ПЦР-сборка с использованием перекрывающихся праймеров и аналогичные методики, предназначенные для конструирования последовательностей иммуноглобулинов, которые хорошо известны специалисту в данной области техники; или любой приемлемой комбинации любых вышеизложенных методов, обозначенных также как оптимизация последовательностей. В качестве ссылки можно указать, например, стандартные руководства, а также можно использовать приведенное ниже описание и сведения, представленные в примерах.

При необходимости VEGF- или Ang2- связывающий компонент, с повышенной аффинностью получают путем созревания другого VEGF- или Ang2-связывающего компонента, последний представляет собой родительский VEGF- или Ang2-связывающий компонент относительно молекулы с созревшей аффинностью.

В анти-VEGF или анти-Ang2 VHH, начинающихся с EVQ, N-концевой остаток Е можно заменять на D (что часто приводит к оптимизации последовательности) или он может отсутствовать (для экспрессии VHH в E.coli). Для форматированных VEGF-связывающих молекул, это применяют, как правило, только для VHH, расположенных на N-конце.

Предпочтительная (но, не ограничиваясь только ею) применяемая с целью гуманизации замена в VHH-доменах, принадлежащих к 103 P,R,S-груππе и/или GLEW-группе (что описано ниже), представляет собой замену 108Q на 108L. Методы гуманизации иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов известны в данной области.

А также иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может представлять собой доменное антитело, представленное в настоящем описании.

Кроме того, репрезентативные представители класса VEGF- и/или Ang2-связывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов имеют аминокислотные последовательности, которые соответствуют аминокислотной последовательности встречающегося в естественных условиях VH-домена, который был камелизирован, т.е. изменен путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, встречающейся в естественных условиях вариабельной области тяжелой цепи канонического состоящего из 4 цепей антитела на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в VHH-домене состоящего из тяжелой цепи антитела. Это можно осуществлять хорошо известным методом, который очевиден специалисту в данной области, и дополнительную информацию о котором можно почерпнуть из WO 1994/04678. Указанная камелизация может затрагивать главным образом аминокислотные положения, которые находятся в области контакта VH-VL, и так называемые остатки-маркеры верблюдовых (см., например, также WO 1994/04678). Подробное описание указанных методов гуманизации и камелизации и предпочтительные последовательности каркасных участков, которые пригодны для осуществления этих методов, можно дополнительно почерпнуть из сведений, представленных на с. 46 и с. 98 WO 2006/040153 и с. 107 WO 2006/122786.

VEGF-связывающие компоненты, например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, обладают специфичностью в отношении VEGF, поскольку они содержат один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, специфически связывающихся с одним или несколькими эпитопами молекулы VEGF. Вышесказанное относится и к Ang2-связывающим компонентам.

Специфическое связывание VEGF-связывающего компонента с антигеном VEGF можно определять с помощью любого приемлемого хорошо известного метода, включая, например, такие как анализ Скэтчарда и/или анализы связывания в условиях конкуренции, такие как радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (ФИА и ELISA) и конкурентные сэндвич-анализы и их различные варианты, хорошо известные в данной области. Это же относится к определению связывания Ang2-связывающего компонента с его антигеном.

Касательно антигена VEGF VEGF-связывающий компонент , например, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, не ограничен происхождением из какого-либо конкретного вида. Так, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, предпочтительно связываются с человеческим

- 15 036746

VEGF, если они предназначены для лечения человека. Однако иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены могут связываться с VEGF из других видов млекопитающих. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с VEGF из одного из видов, может обладать перекрестной реактивностью с VEGF, который имеет последовательность, отличную от человеческой, из одного или нескольких других видов. Например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с человеческим VEGF, могут обладать перекрестной реактивностью с VEGF из одного или нескольких других видов приматов и/или VEGF из одного или нескольких видов животных, которых применяют в качестве животных, на которых моделируют заболевание, например, обезьян, мышей, крыс, кроликов, свиней, собак, и, в частности из животных, на которых моделируют заболевания и нарушения, ассоциированные с опосредуемыми VEGF действиями на ангиогенез (например, в качестве видов и животных моделей, упомянутых в настоящем описании). Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые обладают указанной перекрестной реактивностью, являются важными для исследовательских целей и/или для разработки лекарственных средств, поскольку позволяют тестировать иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, на признанных моделях заболеваний, созданных на таких животных как обезьяны, в частности обезьяны циномолгус или макак резус, или мыши и крысы.

В свете перекрестной реактивности с одной или несколькими молекулами VEGF из видов, отличных от человека, которая(ые) предназначена(ны) для применения на животной модели при разработке терапевтического антагониста VEGF, является предпочтительным, когда VEGF-связывающий компонент распознает эпитоп в той области представляющего интерес VEGF, которая обладает высокой степенью идентичности с человеческим VEGF.

Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен распознает эпитоп, который полностью или частично локализован в области VEGF, которая пригодна для связывания с его рецептором, в частности с VEGFR-2, который, как установлено, является рецептором, активация которого обусловливает неоваскуляризацию опухолей. Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены блокируют активацию VEGF-рецептора, в частности активацию VEGFR-2, по меньшей мере частично, предпочтительно в значительной степени и наиболее предпочтительно полностью.

Как указано выше, способность VEGF-связывающего компонента блокировать взаимодействие между VEGF и его рецепторами, в частности, VEGFR-2, можно определять с помощью гомогенного анализа усиленной за счет эффекта близости люминисценции (AlphaScreen®), конкурентного ELISA или анализа на основе резонанса плазмона (SPR) (Biacore® ), которые описаны в примерах.

Предпочтительно связывание иммуноглобулинового единичного вариабельного домена с VEGF характеризуется величиной аффинности, составляющей менее 500нМ, предпочтительно менее 200нМ, более предпочтительно менее 10нМ, например, менее 500пМ (что определяют с помощью анализа на основе резонанса поверхностного плазмона, описанного в примере 5.7). Вышесказанное относится и к связыванию иммуноглобулинового единичного вариабельного домена с ангиопоэтином.

Предпочтительно для иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов характерны величины IC₅₀, измеренные с помощью конкурентного ELISA, который описан в примере 5.1, составляющие от 10^-6 до 10^-10 молей/л или менее, более предпочтительно от 10^-8 до 10^-10 молей/л или менее и еще более предпочтительно от 10^-9 до 10^-10 молей/л или менее.

Связывание с VEGF VEGF-связывающих иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, характеризуется величиной константы диссоциации (KD), составляющей от 10^-5 до 10^-12 молей/л (М) или менее и предпочтительно от 10^-7 до 10^-12 молей/л (М) или менее и более предпочтительно от 10^-8 до 10^-12 молей/л (М), и/или величиной константы ассоциации (K_A), составляющей по меньшей мере 107 М^-1 , предпочтительно по меньшей мере 10⁸ М^-1 , более предпочтительно по меньшей мере 10⁹М^-1, например, по меньшей мере 10¹² М^-1; и в частности, величиной KD, составляющей менее 500нМ, предпочтительно менее 200нМ, более предпочтительно менее 10нМ, например, менее 500пМ. Таким образом, можно определять величины KD и KA иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, характеризующие связывание с VEGF. Указанное относится и к связывающему Ang2 иммуноглобулиновому единичному вариабельному домену.

Бипаратопные VEGF-связывающие компоненты, которые содержат два или большее количество иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, практически состоят из или содержат (I) первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, специфически связывающийся с первым эпитопом VEGF, и (II) второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, специфически связывающийся со вторым эпитопом VEGF, где первый эпитоп VEGF и второй эпитоп VEGF не являются идентичными эпитопами. Другими словами, указанный полипептид, содержит или практически состоит из двух или большего количества иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, мишенью которых являются по меньшей два неперекрывающихся эпитопа, присутствующих в VEGF, при этом указанные иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены связаны друг с другом таким образом, чтобы они могли одновременно связываться с VEGF. В этом плане полипептид можно рассматривать как двухвалентную или многовалентную иммуноглобулиновую конструкцию и прежде всего

- 16 036746 как многовалентную конструкцию иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, если полипептид содержит по меньшей мере два сайта связывания с VEGF. (Указанные конструкции обозначают также как форматированные VEGF-связывающие молекулы, например, форматированные VHH).

С соответствующими изменениями указанное относится также к бипаратопным Ang2-связывαющим компонентам.

Указанный VEGF- или Ang2-связывающий компонент, включает (по меньшей мере) два анти-VEGF или анти-Ang2 иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена, при этом мишенью (указанных) двух иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов предпочтительно являются неперекрывающиеся эпитопы молекулы VEGF или молекулы ангиопоэтина соответственно. Таким образом, эти два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена должны обладать специфичностью в отношении различных антигенов и поэтому содержать различные CDR-последовательности. По этой причине указанные полипептиды, в контексте настоящего описания можно обозначать также как бипаратопные полипептиды или бипаратопные конструкции доменных антител (если иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены состоят или практически состоят из доменных антител), или бипаратопные VHHконструкции (если иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены состоят или практически состоят из VHH) соответственно, поскольку два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена должны включать два различных паратопа.

Если полипептид, представляет собой бипаратопную молекулу, указанную в настоящем описании, то по меньшей мере один из компонентов иммуноглобулинового единичного вариабельного домена связывается с эпитопом таким образом, что взаимодействие между рекомбинантным человеческим VEGF и рекомбинантным человеческим VEGFR-2 блокируется, что характеризуется уровнем ингибирования >80%. Как продемонстрировано в экспериментах, описанных в зявке, определенные форматированные молекулы содержат два VHH, которые оба блокируют рецептор VEGFR2, что характеризуется уровнем ингибирования >80%. Определенные VHH, блокируют VEGFR-2 с уровнем ингибирования 100%, т.е. они являются полными блокаторами.

В обоих случаях дополнительные последовательности и фрагменты могут присутствовать в VEGFсвязывающих молекулах, например, на N-конце, С-конце или они могут быть локализованы между двумя иммуноглобулиновыми единичными вариабельными доменами, например, линкерные последовательности и последовательности, обеспечивающие эффекторные функции, которые более детально описаны ниже.

Согласно другому, VEGF-связывающий компонент может включать более двух анти-VEGF иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, т.е. три, четыре или даже еще большее количество анти-VEGF VHH. В этом случае по меньшей мере два из анти-VEGF иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов направлены против неперекрывающихся эпитопов внутри молекулы VEGF, а любой дополнительный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может связываться с любым из двух неперекрывающихся эпитопов и/или дополнительным эпитопом, который присутствует в молекуле VEGF.

Два или большее количество иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов могут независимо друг от друга представлять собой VHH или доменные антитела и/или любой другой вид иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, таких как VL-домены, указанные в настоящем описании, при условии, что эти иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены должны связываться с антигеном, т.е. VEGF или ангиопоэтином соответственно.

Подробное описание связывающих компонентов представлено в основном для VEGFсвязывающего компонента. Однако все особенности и характеристики, представленные в настоящем описании для VEGF-связывающего компонента, относятся также (после внесения соответствующих изменений) и к Ang2-связывaющему компоненту.

Связывающие молекулы, присутствующие в биспецифических связывающих молекулах (Ang2связывающие молекулы в Ang2-связывающем компоненте или VEGF-связывающие молекулы в VEGFсвязывающем компоненте или два смежных Ang2- и VEGF-связывающих компонента), можно соединять друг с другом непосредственно (т.е. без применения линкера) или через линкер. Линкер предпочтительно представляет собой пептидный линкер и его выбирают так, чтобы он давал связываться двум различным связывающим молекулам с каждым из неперекрывающихся эпитопов на мишенях, которые присутствуют либо в одной и той же молекуле-мишени, либо в двух различных молекулах.

В случае бипаратопных связывающих молекул выбор линкеров для Ang2-или VEGF-связывающего компонента зависит среди прочего от эпитопов и, в частности, расстояния между эпитопами на мишени, с которыми связываются иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, и очевиден для специалиста в данной области техники на основе настоящего описания, необязательно после проведения ограниченного количества некоторых рутинных экспериментов.

Две связывающие молекулы (два VHH или доменных антитела или VHH и доменное антитело) или два связывающих компонента можно соединять друг с другом через дополнительный VHH или доменное антитело соответственно (в таких связывающих молекулах два или большее количество иммуноглобули- 17 036746 новых единичных вариабельных доменов можно соединять непосредственно с дополнительным иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом или посредством приемлемых линкеров). Указанные дополнительные VHH или доменные антитела могут, например, представлять собой VHH или доменное антитело, которые обеспечивают увеличенное время полужизни. Например, последний VHH или последнее доменное антитело может представлять собой конструкцию, которая обладает способностью связываться с (человеческим) сывороточным белком, таким как (человеческий) сывороточный альбумин или (человеческий) трансферрин.

Альтернативно этому, два или большее количество иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, которые связываются с соответствующей мишенью, можно соединять в серии (либо непосредственно, либо с помощью приемлемого линкера) и дополнительный VHH или дополнительное доменное антитело (которые могут обеспечивать увеличенное время полужизни) можно соединять непосредственно или с помощью линкера с одной из этих двух или большего количества вышеуказанных иммуноглобулиновых последовательностей.

Приемлемые линкеры представлены в настоящем описании в сочетании со специфическими полипептидами, и они могут, например, содержать (но, не ограничиваясь только ею) аминокислотную последовательность, при этом аминокислотная последовательность предпочтительно состоит из 9 или большего количества аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере из 17 аминокислот, например, примерно из 20-40 аминокислот. Однако, хотя верхний предел не имеет решающего значения, но его выбирают, исходя из соображений пригодности, например, для биофармацевтического производства таких полипептидов.

Линкерная последовательность может представлять собой встречающуюся в естественных условиях последовательность или не встречающуюся в естественных условиях последовательность. Для применения в терапевтических целях линкер предпочтительно является неиммуногенным для индивидуума, которому вводят биспецифическую связывающую молекулу.

Одной из пригодных групп линкерных последовательностей являются линкеры, выведенные из шарнирной области тяжелой цепи антител, описанные в WO 1996/34103 и WO 1994/04678.

Другими примерами являются полиаланиновые линкерные последовательности, такие как Ala-AlaAla.

Другими предпочтительными примерами линкерных последовательностей являются Gly/Seлинкеры различной длины, такие как (gly_xser_y)_z-линкеры, включая (gly₄ser)₃, (gly₄ser)₄, (gly₄ser), (gly₃ser), gly₃ и (gjysser₂)3.

Некоторые примеры линкеров представлены в табл. 15 (SEQ ID NO: 128 - 168), например, линкеры

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (35GS; SEQ ID NO: 169);

GGGGSGGGS (9GS; SEQ ID NO: 170);

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (40GS; SEQ ID

NO: 171).

Если биспецифическую связывающую молекулу модифицируют посредством присоединения полимера, например, полиэтиленгликольного (ПЭГ) (полиэтиленгликоль) фрагмента, то линкерная последовательность предпочтительно включает аминокислотный остаток, такой как цистеин или лизин, позволяющий осуществлять модификацию, например, ПЭГилирование в линкерной области.

Примерами линкеров, пригодных для ПЭГилирования, являются:

GGGGCGGGS (“GS9,C5”, SEQ ID NO: 172),

GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS («GS25,C5», SEQ ID NO: 173),

GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG («GS27,C14», SEQ ID NO: 174),

GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS («GS35,C15», SEQ ID

NO:175) и

GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS («GS35,C5», SEQ ID

NO:176).

Кроме того, линкер может представлять собой также поли(этиленгликольный) фрагмент, что описано, например, в WO 2004/081026.

А так же, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены могут быть соединены друг с другом через другой фрагмент (необязательно посредством одного или двух линкеров), такой как другой полипептид, который в предпочтительном, может представлять собой дополнительный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, описанный выше. Указанный фрагмент может либо являться практически неактивным, либо может обладать биологической активностью, такой как улучшение требуемых свойств полипептида, либо может придавать полипептиду одно или несколько дополнительных требуемых свойств. Например, фрагмент может (но, не ограничиваясь только этим) удлинять время по- 18 036746 лужизни белка или полипептида и/или снижать их иммуногенность или улучшать любое другое требуемое свойство.

Биспецифическая связывающая молекула может включать, прежде всего, если она предназначена для применения или ее применяют в качестве терапевтического агента, фрагмент, который удлиняет время полужизни полипептидав сыворотке или другой общей воде организма пациента. Понятие время полужизни определяют как время, необходимое для снижения концентрации (модифицированного) полипептида на 50% in vivo, например, в результате расщепления полипептида и/или клиренса, и/или секвестрования с помощью естественных механизмов.

Более конкретно, указанный удлиняющий время полужизни фрагмент можно ковалентно связывать или сливать с иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом, и он может представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) Fc-область, остаток альбумина, фрагмент остатка альбумина, альбуминсвязывающий остаток, такой как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен антитела к альбумину, трансферринсвязывающий остаток, такой как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен антитела к трансферрину, полиоксиалкиленовую молекулу, такую как, молекула полиэтиленгликоля, альбуминсвязывающий пептид или производное гидроксиэтилкрахмала (HES).

Биспецифическая связывающая молекула может также содержать фрагмент, который связывается с антигеном, присутствующим в крови, таким как сывороточной альбумин, сывороточные иммуноглобулины, тироксинсвязывающий белок, фибриноген или трансферрин, что удлиняет время полужизни in vivo образовавшегося полипептида. Указанный фрагмент может представлять собой альбуминсвязывающий иммуноглобулин и наиболее предпочтительно альбуминсвязывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, такой как альбуминсвязывающий VHH-домен.

Указанный альбуминсвязывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, если он предназначен для применения на людях, предпочтительно связывается с человеческим сывороточным альбумином и предпочтительно представляет собой гуманизированный альбуминсвязывающий VHHдомен.

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с человеческим сывороточным альбумином, известны в данной области и описаны более подробно, например, в WO 2006/122786. В частности, пригодный для связывания с VHH альбумин представляет собой ALB 1 и его гуманизированную копию ALB 8 (WO 2009/095489). Однако можно также с успехом применять другие альбуминсвязывающие VHH-домены, упомянутые в вышеуказанной патентной публикации.

Наиболее приемлемым альбуминсвязывающим VHH-доменом является ALB8, который состоит из или содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 98 или 254.

Два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена, предпочтительно VHH, можно сливать с молекулой сывороточного альбумина, как это описано, например, в WO 2001/79271 и WO 2003/59934. Например, согласно подходу, изложенному в WO 2001/79271, слитый белок можно получать с помощью общепринятой методики рекомбинации: молекулу ДНК, кодирующую сывороточный альбумин, или ее фрагмент связывают с ДНК, кодирующей бипецифическую связывающую молекулу, полученную конструкцию встраивают в плазмиду, которую можно применять для экспрессии в выбранной клетке-хозяине, например, в клетке дрожжей типа Pichia pastoris, или в бактериальной клетке, и затем клетку-хозяина трансфектировать слитой нуклеотидной последовательностью и выращивать в приемлемых условиях. Последовательность человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), которую можно применять, представлена в SEQ ID NO: 99.

Кроме того, приводящая к удлинения времени полужизни модификация полипептида (указанная модификация снижает также иммуногенность полипептида), заключается в присоединении пригодного фармакологически приемлемого полимера, такого как поли(этиленгликоль) (ПЭГ) с прямой или разветвленной цепью или его производные (например, метоксиполи(этиленгликоль) или мПЭГ). Как правило, можно использовать любую приемлемую форму ПЭГилирования, такую как ПЭГилирование, известное в данной области для антител и фрагментов антител (включая (но, не ограничиваясь только ими) доменные антитела и scFv-фрагменты); в качестве ссылки можно указать, например, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 2002, cc. 531-545; Veronese и Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 2003, cc. 453-456; Harris и Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2, 2003 и WO 2004/060965.

Кроме того, в продажу поступают различные реагенты для ПЭГилирования полипептидов, например, от фирм Nektar Therapeutics, США или NOF Corporation, Япония, такие как серии Sunbright® EA, серии SH, серии МА, серии С А и серии ME, такие как Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA и Sunbright® ME-400MA.

Предпочтительно применяют сайтнаправленное ПЭГилирование, в частности через остаток цистеина (см., например, Yang и др., Protein Engineering 16, 2003, cc. 761-770). Например, для этой цели ПЭГ можно присоединять к остатку цистеина, который в естественных условиях присутствует в полипептиде, полипептид можно модифицировать так, чтобы в него можно было вводить один или несколько остатков цистеина для присоединения ПЭГ, или аминокислотную последовательность, содержащую один или несколько остатков цистеина, предназначенных для присоединения ПЭГ, можно сливать с N- и/или С- 19 036746 концом полипептида для всех указанных подходов можно применять методики конструирования белков, хорошо известные специалисту в данной области техники.

Для полипептидов можно применять ПЭГ с молекулярной массой, превышающей 5 кДа, например, превышающей 10 кДа, но более низкой чем 200 кДа, например, более низкой чем 100 кДа; например, составляющей от 20 до 80 кДа.

Касательно ПЭГилирования следует указать, что биспецифическая связывающая молекула, которая ПЭГилирована в одном или нескольких аминокислотных положениях, предпочтительно таким образом, что ПЭГилирование (1) либо удлиняет время полужизни in vivo; (2) либо снижает иммуногенность; (3) либо обеспечивает одно или несколько дополнительных ценных свойств, хорошо известных для ПЭГ илирования; (4) либо не оказывает существенного воздействия на аффинность полипептида с его мишенью (например, не снижает указанную афффиность более чем на 50% и более предпочтительно более чем на 10% при определении с помощью приемлемого анализа, описанного в данной области); и/или (5) либо не оказывает влияния на любое другое из требуемых свойств биспецифических связывающих молекул. Приемлемые ПЭГ-группы и методы их присоединения, либо специфические, либо неспецифические, хорошо известны специалисту в данной области техники. Кроме того, в продажу поступают различные реагенты для ПЭГилирования полипептидов, например, от фирм Nektar Therapeutics, США или NOF Corporation, Япония, такие как серии Sunbright® EA, серии SH, серии МА, серии СА и серии ME, такие как Sunbright® ME-100MA, Sunbright® МЕ-2ООМА и Sunbright® ME-400MA.

А также, ПЭГилированный полипептидможет включать один ПЭГ-фрагмент линейного ПЭГ с молекулярной массой 40 или 60 кДа, при этом ПЭГ-фрагмент присоединен к полипептиду в линкерной области и, в частности, к остатку Cys в положении 5 линкерного пептида GS9, представленного в SEQ ID NO: 93, в положении 14 линкерного пептида GS27, представленного в SEQ ID NO: 95, или в положении 15 линкерного пептида GS35, представленного в SEQ ID NO: 96, или в положении 5 линкерного пептида 35GS, представленного в SEQ IDNO: 97.

Биспецифическую связывающую молекулу можно ПЭГилировать с помощью одного из указанных выше реагентов для ПЭГилирования, такого как Sunbright® ME-400MA, химическая формула которого представлена ниже:

Биспецифические связывающие молекулы, которые содержат линкер и/или обеспечивающие удлинение времени полужизни функциональные группы, имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 81 и на фиг. 48.

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены могут представлять собой доменные анти тела, как они определены в контексте настоящего описания.

Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые присутствуют в биспецифических связывающих молекулах могут иметь также последовательности, которые соответствуют встречающемуся в естественных условиях VH-домену, который был камелизирован, т.е. изменен путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, встречающейся в естественных условиях вариабельной области тяжелой цепи канонического состоящего из 4 цепей антитела на один или несколько аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующем(их) положении(ях) в VHH-домене состоящего из тяжелой цепи антитела. Это можно осуществлять хорошо известным методом, который очевиден специалисту в данной области техники и дополнительную информацию о котором можно почерпнуть из WO 94/04678. Указанная камелизация может затрагивать главным образом аминокислотные положения, которые находятся в области контакта VH-VL, и так называемые остатки-маркеры верблюдовых (см., например, также WO 1994/04678). Подробное описание указанных методов гуманизации и камелизации и предпочтительные последовательности каркасных участков, которые пригодны для осуществления этих методов, можно дополнительно почерпнуть из сведений, представленных на с. 46 и с. 98 WO 2006/040153 и с. 107 WO 2006/122786.

Связывающие компоненты обладают специфичностью в отношении Ang2 или VEGF соответственно, поскольку они содержат один или несколько иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, специфически связывающихся с одним или несколькими эпитопами молекулы Ang2 или молекулы VEGF соответственно.

Специфическое связывание связывающей молекулы с антигеном Ang2 или VEGF можно определять с помощью любого приемлемого хорошо известного метода, включая, например, представленные в настоящем описании методы, такие как анализ Скэтчарда и/или анализы связывания в условиях конкуренции, такие как радиоиммуноанализы (РИА), ферментные иммуноанализы (ФИА и ELISA) и сэнвичанализы в условиях конкуренции, и их различные варианты, хорошо известные в данной области.

Касательно антигена Ang2 или VEGF соответственно иммуноглобулиновый единичный вариабель- 20 036746 ный домен не ограничен происхождением из какого-либо конкретного вида. Так, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены предпочтительно связываются с человеческим Ang2 или человеческим VEGF соответственно, если они предназначены для лечения человека. При этом иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с Ang2 или VEGF соответственно из других видов млекопитающих, или полипептиды, содержащие их, также описаны в заявке. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с Ang2 или VEGF из одного из видов, может давать перекрестную реакцию с соответствующим антигеном из одного или нескольких других видов. Например, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые связываются с человеческим антигеном, могут обладать перекрестной реактивностью с соответствующим антигеном из одного или нескольких других видов приматов и/или антигеном из одного или нескольких видов животных, которых применяют в качестве животных, на которых моделируют заболевание, например, обезьян (в частности циномолгус или макак резус), мышей, крыс, кроликов, свиней, собак), в частности из животных, на которых моделируют заболевания и нарушения, которые можно модулировать путем ингибирования Ang2 (например, в качестве видов и животных моделей, упомянутых в настоящем описании). Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые обладают указанной перекрестной реактивностью, являются важными для исследовательских целей и/или для разработки лекарственных средств, поскольку позволяют тестировать иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, на признанных моделях заболеваний, созданных на таких животных как обезьяны, в частности циномолгус или макак резус, или мыши и крысы.

Кроме того, связывающие компоненты не ограничены или не определены конкретным доменом или антигенной детерминантой антигена, который/которая является их мишенью. Предпочтительно с позиций перекрестной реактивности с одним или несколькими молекулами антигенов из видов кроме человека, которая(ые) предназначена(ы) для применения в качестве животных моделей при разработке терапевтического антагониста Ang2/VEGF, связывающий компонент распознает эпитоп в области соответствующего антигена, которая обладает высокой степенью идентичности с человеческим антигеном. Например, при применении мышиной модели анти-Ang2 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, входящий в биспецифические связывающие молекулы, распознает эпитоп, который полностью или частично локализован в FLD-домене Ang2, для которого характерна высокая идентичность при сравнении человеческой и мышиной последовательности.

Предпочтительно VEGF-связывающий компонент связывается с изоформами VEGF VEGF165 и/или VEGF121.

Другим объектом изобретения являются молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют биспецифические связывающие молекулы,. Указанные молекулы нуклеиновых кислот в контексте настоящего описания обозначают также как нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, и они могут иметь также форму генетической конструкции, указанной в настоящем описании. Нуклеиновая кислота может представлять собой геномную ДНК, кДНК или синтетическую ДНК (такую как ДНК с наиболее часто встречающимися кодонами, которая специально адаптирована для экспрессии в выбранной клеткехозяине или организме-хозяине).Нуклеиновая кислота,может находиться в практически выделенной форме, как указано выше в настоящем описании.

Нуклеиновая кислота может иметь также форму вектора, может присутствовать в векторе и/или представлять собой часть вектора, такого, например, как плазмида, космида или YAC. Вектор может представлять собой прежде всего экспрессионный вектор, т.е. вектор, который может обеспечивать экспрессию биспецифической молекулы in vitro и/или in vivo (т.е. в приемлемой/приемлемом клеткехозяине, организме-хозяине и/или экспрессионной системе). Указанный экспрессионный вектор, как правило, содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, которая функционально связана с одним или несколькими приемлемыми регуляторными элементами, такими как промотор(ы), энхансер(ы), терминатор(ы) и т.п. Указанные элементы и их отбор с позиций экспрессии конкретной последовательности в конкретном хозяине находятся в компетенции специалиста в данной области. Конкретные примеры регуляторных элементов и других элементов, пригодных или необходимых для экспрессии D114связывающих молекул таких как промоторы, энхансеры, терминаторы, факторы интеграции, маркеры для селекции, лидерные последовательности, репортерные гены и т.п., описаны, например, на cc.131-133 WO 2006/040153.

Нуклеиновые кислоты, можно создавать или получать хорошо известным методом (например, путем автоматического синтеза ДНК и/или методом рекомбинантной ДНК) на основе информации об аминокислотных последовательностях полипептидов, которая представлена в настоящем описании, и/или их можно выделять из пригодного встречающегося в естественных условиях источника.

Следующим объектом изобретения являются клетки-хозяева, которые экспрессируют или в которых может происходить экспрессия одной или нескольких биспецифических связывающих молекул; и/или которые содержат нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении. Клетки-хозяева могут представлять собой бактериальные клетки; другими пригодными клетками являются клетки дрожжей, клетки грибов или клетки млекопитающих.

Приемлемыми бактериальными клетками являются клетки грамотрицательных штаммов бактерий,

- 21 036746 таких как штаммы Escherichia coli, Proteus и Pseudomonas, и грамположительных штаммов бактерий, таких как штаммы Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus и Lactococcus. Приемлемыми грибными клетками являются клетки видов Trichoderma, Neurospora и Aspergillus. Приемлемыми клетками дрожжей является клетки видов Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (например, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (например, Pichia pastor is и Pichia methanolica) и Hansenula.

Приемлемыми клетками млекопитающих являются, например, СНО-клетки, ВНК-клетки, HeLaклетки, COS-клетки и т.п. Однако можно использовать также клетки амфибий, клетки насекомых, клетки растений и любые другие клетки, которые применяют в данной области для экспрессии гетерологичных белков.

Изобретение относится также к способам получения биспецифической связывающей молекулы, как правило, заключающимся в том, что осуществляют стадии, на которых:

культивируют клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, обладающую способностью кодировать биспецифическую связывающую молекулу в условиях, которые обеспечивают экспрессию биспецифической связывающей молекулы, предлагаемой в изобретении; и высвобождают или выделяют из культуры полипептид, экспрессируемый клетками-хозяевами; и необязательно дополнительно очищают и/или модифицируют, и/или включают в препаративную форму биспецифическую связывающую молекулу, предлагаемую в изобретении.

Для производства в промышленном масштабе предпочтительными организмами-хозяевами являются штаммы Е. coli, Pichia pastoris и S. cerevisiae, которые пригодны для крупномасштабной экспрессии, производства и ферментации, и прежде всего для крупномасштабной экспрессии, производства и ферментации фармацевтических продуктов.

Выбор конкретной экспрессионной системы зависит, в частности, от требований к определенным пост-трансляционным модификациям, более конкретно к гликозилированию. Для получения биспецифической связывающей молекулы, для которой гликозилирование является желательным или необходимым, требуется применять для экспрессии клетки-хозяева млекопитающих, обладающие способностью гликозилировать белок. В этом плане специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что полученная схема гликозилирования (т.е. вид, количество и положение присоединенных остатков) должна зависеть от клетки или клеточной линии, применяемой для экспрессии.

Биспецифические связывающие молекулы, можно получать либо в клетке, согласно описанному выше методу, внутриклеточно (например, в цитозоле, периплазме или в тельцах включения), а затем выделять из клеток-хозяев и необязательно дополнительно очищать; либо их можно получать внеклеточно (например, в среде, в которой культивируют клетки-хозяева), а затем выделять из культуральной среды и необязательно дополнительно очищать.

Методы и реагенты, которые применяют для получения полипептидов с помощью рекомбинантной ДНК, такие как специфические приемлемые экспрессионные векторы, методы трансформации или трансфекции, маркеры для селекции, методы индукции экспрессии белков, условия культивирования и т.п., известны в данной области. Аналогично этому методики выделения и очистки белков, применяемые в методе производства полипептида, хорошо известны специалисту в данной области.

Пептид может иметь аминокислотную последовательность CDR3, входящую в конструкцию антиVEGF-VHH, которая имеет аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 9-57 и или SEQ ID NO: 58-127 соответственно.

Эти пептиды соответствуют CDR3, выведенным из VHH. Их, в частности, молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют их, можно применять для трансплантации CDR для того, чтобы заменять CDR3 в цепи иммуноглобулина или для инсерции в неимуноглобулиновый каркас, например, ингибитор протеазы, ДНК-связывающий белок, цитохром b562, состоящий из пучка спиралей белок, связанный дисульфидным мостиком пептид, липокаин или антикалин, которые придают указанному каркасу способность связываться с мишенью. Метод трансплантации CDR хорошо известен в данной области и его широко применяли, например, для гуманизации антител (которые, как правило, содержит CDR из антитела грызунов, трансплантированные в каркасные участки Fv человеческого антитела).

Для получения имммуноглобулинового или неиммуноглобулинового каркаса, содержащего CDR3, ДНК, которая кодирует указанную молекулу, можно получать с помощью стандартных методов молекулярной биологии, например, с помощью синтеза генов, отжига олигонуклеотидов или на основе перекрывающихся ПЦР-фрагментов, которые описаны, например, у Daugherty и др., Nucleic Acids Research, т. 19, 9, 1991, cc. 2471-2476. Метод инсерции VHH-CDR3 в неиммуноглобулиновый каркас описан у Nicaise и др., Protein Science, 13, 2004, cc. 1882-1891.

Описана также фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу и может также необязательно содержать один или несколько хорошо известных дополнительных компонентов указанных композиций, т.е. которые зависят от предполагаемого применения композиции. Для фармацевтического применения на основе биспецифической связывающей молекулы, или полипептида, который ее содержит, можно приготавливать формы в виде фармацевтического препарата или композиции, содержащего/содержащей по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель

- 22 036746 или эксципиент и/или адъювант и необязательно один или несколько дополнительных фармацетически активных полипептидов и/или соединений. Примерами таких препаративных форм являются (но, не ограничиваясь только ими) формы, пригодные для орального введения, для парентерального введения (например, с помощью внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции или внутривенной инфузии), для местного применения, для применения путем ингаляции, с помощью кожного пластыря, с помощью имплантата, суппозитория и т.д. Указанные приемлемые для введения формы, которые могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими в зависимости от пути введения, а также методы и носители для их применения в препаратах, должны быть очевидные специалисту в данной области и дополнительно представлены в настоящем описании.

Фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу, в частности один иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, , или полипептид, который его содержит, и по меньшей мере один приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент (т.е. пригодный для фармацевтического применения) и необязательно одну или несколько дополнительных активных субстанций.

Биспецифические связывающие молекулы можно включать в препаративную форму и вводить с помощью любого пригодного хорошо известного метода: см. ссылки, прежде всего касающиеся иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, например, в WO 2004/041862, WO 2004/041863, WO 2-04/041865, WO 2004/041867 и WO 2008/020079, а также в стандартных справочниках, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое изд., изд-во Mack Publishing Company, США, 1990, Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21-ое изд., изд-во Lippincott Williams и Wilkins, 2005 или Handbook of Therapeutic Antibodies, под ред. S. Dubel, изд-во Wiley, Weinheim, 2007 (см., например, cc. 252-255).

Например, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен можно включать в препаративную форму и вводить любым методом, широко применяемым для канонических антител и фрагментов антител (включая ScFv и димерные антитела) и других фармацевтически активных белков. Указанные препаративные формы и методы их получения должны быть очевидны специалисту в данной области и, например, включают препараты, пригодные для парентерального введения (например, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, внутрипросветного, внутриартериального или внутриоболочечного введения) или для местного (т.е. трансдермального или внутридермального) применения.

Препараты для парентерального введения могут представлять собой, например, стерильные растворы, суспензии, дисперсии или эмульсии, которые можно применять для инфузии или инъекции. Приемлемыми носителями или разбавителями для таких препаратов являются, например (но, не ограничиваясь только ими) стерильная вода и фармацевтически приемлемые водные буферы и растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнкса; водные растворы масел; глицерин; этанол; гликоли, такие как пропиленгликоль, или также минеральные масла, животные масла и растительные масла, например, арахисовое масло, соевое масло, а также их приемлемые смеси. Как правило, предпочтительными являются водные растворы или суспензии.

Так, биспецифическую связывающую молекулу можно вводить системно, например, орально, в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем, таким как инертный разбавитель или усвояемый съедобный носитель. Для орального терапевтического применения биспецифическую связывающую молекулу можно объединять с одним или несколькими эксципиентами и применять в форме предназначенных для приема внутрь таблеток, трансбуккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Указанные композиции и препараты должны содержать связывающую молекулу в количестве, составляющем по меньшей мере 0,1%. Указанное процентное содержание в композициях и препаратах может, естественно, варьироваться и может, как правило, составлять от примерно 2 до примерно 60% в пересчете на массу указанной стандартной дозы лекарственного средства. Количество биспецифической связывающей молекулы в предназначенных для терапевтического применения композициях является таким, чтобы получать эффективный уровень доз.

Таблетки, пилюли, капсулы и т.п. могут содержать также связывающие агенты, эксципиенты, разрыхлители, замасливатели и подслащивающие вещества или корригенты, например, упомянутые на cc. 143-144 WO 2008/020079. Когда стандартная доза лекарственного средства представляет собой капсулу, то она может содержать помимо продуктов указанного выше типа жидкий носитель, такой как растительное масло или полиэтиленгликоль.

Различные другие материалы могут присутствовать в виде покрытий или их можно применять для другой модификации физической формы твердой стандартной дозы лекарственного средства. Например, на таблетки, пилюли и капсулы можно наносить покрытие из желатина, воска, шеллака или сахара и т.п. Сироп или эликсир может включать биспецифические связывающие молекулы, сахарозу или фруктозу в качестве подслащивающего вещества, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и корригент, такой как вишневая или апельсиновая отдушка. Естественно, любой продукт, применяемый для приготовления любой стандартной дозы лекарственного средства, должен быть фармацевтически приемлемым и практически нетоксичным в применяемых количествах. Кроме того, биспецифические связывающие молекулы, можно включать в препараты или устройства с замедленным высвобождением.

- 23 036746

Препараты и формы для орального введения могут иметь также энтеросолюбильное покрытие, которое позволяет конструкциям сохраняться в среде желудка и проходить в кишечник. Более конкретно препараты и формы для орального введения можно приготавливать в виде, который позволяет осуществлять введение в требуемый отдел желудочно-кишечного тракта. Кроме того, для введения в желудочнокишечный тракт можно применять суппозитории.

Биспецифические связывающие молекулы можно вводить также внутривенно или внутрибрюшинно с помощью инфузии или инъекции, что более подробно описано на cc. 144 и 145 WO 2008/020079.

В случае предназначенных для местного применения биспецифических связывающих молекул их требуется наносить на кожу в виде композиций или форм в сочетании с приемлемым для дерматологического применения носителем, который может быть твердым или жидким, что более подробно описано на с. 145 WO 2008/020079.

Как правило, концентрация биспецифических связывающих молекул в жидкой композиции, такой как лосьон, должна составлять примерно 0,1-25 мас.%, предпочтительно примерно 0,5-10 мас.%. Концентрация в полутвердой или твердой композиции, такой как гель или порошок, должна составлять примерно 0,1-5 мас.%, предпочтительно примерно 0,5-2,5 мас.%.

Количество биспецифических связывающих молекул, которое требуется для лечения, должно варьироваться не только в зависимости от конкретной выбранной биспецифической связывающей молекулы, но также от пути введения, природы состояния, подлежащего лечению, и возраста и состояния пациента, и, в конце концов, оно определяется предписанием лечащего врача или клинициста. Кроме того, доза биспецифических связывающих молекул варьирует в зависимости от клетки-, опухоли-, ткани-, трансплантата-или органа-мишени.

Требуемую дозу, как правило, можно применять в виде однократной дозы или в виде разделенных доз, которые предназначены для введения с соответствующими интервалами, например, в виде двух, трех, четырех или большего количества субдоз в день. Режим введения самих субдоз можно дополнительно разделять, например, на ряд введений, разделенных пустыми промежутками без обработки; например, на несколько ингаляций с использованием инсуффлятора, или путем внесения нескольких капель в глаз.

Схема введения может включать пролонгированную ежедневную обработку. Под пролонгированной подразумевают обработку в течение периода времени, составляющего по меньшей мере две недели и предпочтительно несколько недель, месяцев или лет. Необходимость изменений в этой схеме приема доз может определять обычный специалист в данной области с помощью общепринятых экспериментов, указанных в настоящем описании (см., Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. Martin E.W., 4-ое изд., изд-во Mack Publishing Co., Easton, PA). Дозу может регулировать также каждый лечащий врач в случае любых осложнений.

Применение биспецифических связывающих молекул, например, иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов или содержащих их полипептидов, возможно для следующих терапевтических целей:

для предупреждения, лечения и/или облегчения нарушения, заболевания или состояния, прежде всего у человека, которое ассоциировано с опосредуемыми VEGF- и /или Ang2 воздействиями на ангиогенез, или которое можно предупреждать, лечить или облегчать посредством модуляции пути передачи сигналов Notch и/или передачи сигналов Tie2 с помощью биспецифической связывающей молекулы в способе лечения пациента, который нуждается в такой терапии, заключающемся в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, в фармацевтически активном количестве по меньшей мере одну биспецифическую связывающую молекулу, например иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, или содержащую их фармацевтическую композицию;

для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения, лечения или облегчения нарушений, заболеваний или состояний, ассоциированных с опосредуемыми VEGF и/или опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез;

в качестве действующего вещества в фармацевтической композиции или лекарственном средстве, применяемой/применяемом для указанных выше целей.

Заболевание или состояние может представлять собой рак или злокачественное заболевание, указанное в настоящем описании.

Другое заболевание может представлять собой глазную болезнь, ассоциированную с опосредуемыми VEGF и/или опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез, или которую можно лечить или облегчать посредством модуляции пути передачи сигналов Notch и/или передачи сигналов Tie2 с помощью биспецифической связывающей молекулы.

В зависимости от подлежащего лечению злокачественного заболевания биспецифическую связывающую молекулу можно применять индивидуально или в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, в частности, выбранными из химиотерапевтических средств типа повреждающих ДНК агентов или терапевтически активных соединений, которые ингибируют ангиогенез, пути трансдукции сигналов или точки контроля митоза в раковых клетках.

Дополнительные терапевтические средства можно вводить одновременно, необязательно в виде

- 24 036746 компонента одного и того же фармацевтического препарата, или до, или после введения биспецифической связывающей молекулы.

Дополнительное терапевтическое средство может представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) один или несколько ингибиторов, выбранных из группы ингибиторов EGFR, VEGFR, HER2-neu,

Her3, AuroraA, AuroraB, PLK и PI3-кuназы, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, PDK1, PTK2, IGF-R или IR.

Другими примерами дополнительных терапевтических агентов могут быть ингибиторы CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, антагонисты hedgehog, ингибиторы JAK/STAT, Mek, mTor, NF каппаВ, протеосом, Rho, ингибитор пути передачи сигналов wnt или ингибитор пути убикитинизации или другой ингибитор пути передачи сигналов Notch.

Примерами ингибиторов киназы Aurora являются (но, не ограничиваясь только ими) РНА-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045,PF-3814735.

Примером ингибитора PLK является GSK-461364.

Примерами ингибиторов raf являются BAY-73-4506 (который является также ингибитором VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (который является также ингибитором VEGFR), сорафениб (который является также ингибитором VEGFR) и XL 281.

Примерами ингибиторов KSP являются испинесиб, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, МК-0731 и SB-743921.

Примерами ингибиторов src и/или bcr-abl являются дасатиниб, AZD-0530, босутиниб, XL 228 (который является также ингибитором IGF-1R), нилотиниб (который является также ингибитором PDGFR и cKit), иматиниб (который является также ингибитором cKit) и NS-187.

Примером ингибитора PDK1 является ВХ-517.

Примером ингибитора Rho является ВА-210.

Примерами ингибиторов PI3 -киназы являются РХ-866, BEZ-235 (который является также ингибитором mTor), XL 418 (который является также ингибитором Akt), XL-147 и XL 765 (который является также ингибитором mTor).

Примерами ингибиторов cMet или HGF являются XL-184 (который является также ингибитором VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (который является также ингибитором VEGFR), MGCD-265 (который является также ингибитором VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 и AV-299.

Примером ингибитора с-Мус является СХ-3543.

Примерами ингибиторов Flt3 являются АС-220 (который является также ингибитором cKit and PDGFR), KW 2449, лестауртиниб (который является также ингибитором VEGFR, PDGFR, PKC), TG101348 (который является также ингибитором JAK2), XL-999 (который является также ингибитором cKit, FGFR,

PDGFR и VEGFR), сунитиниб (который является также ингибитором PDGFR, VEGFR и cKit) и тандутиниб (который является также ингибитором PDGFR и cKit).

Примерами ингибиторов HSP90 являются танеспимицин, алвеспимицин IPI-504 и CNF 2024.

Примерами ингибиторов JAK/STAT являются CYT-997 (который взаимодействует также с тубулином), TG 101348 (который является также ингибитором Flt3) и XL-019.

Примерами ингибиторов Mek являются ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 и XL 518.

Примерами ингибиторов mTor являются темсиролимус, АР-23573 (который действует также как ингибитор VEGF), эверолимус (кроме того, является ингибитором VEGF), XL-765 (который является также ингибитором PI3-кuназы) и BEZ-235 (который является также ингибитором PI3-кuназы).

Примерами ингибиторов Akt являются перифосин, GSK-690693, RX-0201 и трицирибин.

Примерами ингибиторов cKit являются АВ-1010, OSI-930 (который действует также в качестве ингибитора VEGFR), AC-220 (который является также ингибитором Flt3 и PDGFR), тандутиниб (который является также ингибитором Flt3 и PDGFR), акситиниб (который является также ингибитором VEGFR и PDGFR), XL-999 (который является также ингибитором Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), сунитиниб (который является также ингибитором Flt3, PDGFR, VEGFR) и XL-820 (который действует также как ингибитор VEGFR и PDGFR), имиаиниб (который является также ингибитором bcr-abl), нилотиниб (который является также ингибитором bcr-abl и PDGFR).

Примерами антагонистов hedgehog являются IPI-609 и CUR-61414.

Примерами ингибиторов CDK являются селициклиб, АТ-7519, Р-276, ZK-CDK (который является также ингибитором VEGFR2 и PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, РНА-690509 и AG 024322.

Примерами ингибиторов протеосомы являются бортезомиб, карфилзомиб и NPI-0052 (который является также ингибитором NF каппаВ).

Примером ингибитора NF каппаВ-пути является NPI-0052.

Примером ингибитора пути убикитинизации является НВХ-41108.

Кроме того, дополнительное терапевтическое средство может представлять собой антиангиогенный агент.

Примерами антиангиогенных агентов являются ингибиторы FGFR, PDGFR и VEGFR или соответствующие лиганды (например, ингибиторы VEGF типа пэгаптаниба или антитело к VEGF бевасизумаб) и

- 25 036746 талидомиды, указанные агенты выбраны из группы, включающей (но, не ограничиваясь только ими) бевасизумаб, мотесаниб, CDP-791, SU-14813, телатиниб, KRN-951, ZK-CDK (который является также ингибитором CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (иммуномодуляторные лекарственные средства), производное талидомида СС-4047, леналидомид, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, бриваниб, цедираниб, XL-999 (который является также ингибитором cKit и Flt3), 1B3, СР 868596, IMC 3G3, R-1530 (который является также ингибитором Flt3), сунитиниб (который является также ингибитором cKit и Flt3), акситиниб (который является также ингибитором cKit), лестауртиниб (который является также ингибитором Flt3 и PKC), ваталаниб, тандутиниб (который является также ингибитором Flt3 и cKit), пазопаниб, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, Е-7080, CHIR 258, сорафениба тозилат (который является также ингибитором Raf), RAF-265 (который является также ингибитором Raf), вантетаниб, СР-547632, OSI-930, AEE-788 (EGFR и Her2), BAY-57-9352 (который является также ингибитором Raf), BAY-73-4506 (который является также ингибитором Raf), XL 880 (который является также ингибитором cMet), XL-647 (который является также ингибитором EGFR и EphB4), XL 820 (который является также ингибитором cKit) и нилотиниб (который является также ингибитором cKit и brc-abl).

Дополнительное терапевтическое средство можно выбирать также из ингибиторов EGFR, оно может представлять собой низкомолекулярный ингибитор EGFR или антитело к EGFR. Примерами антител к EGFR являются (но, не ограничиваясь только ими) цетуксимаб, панитумумаб, матузумаб; примером низкомолекулярного ингибитора EGFR является гефитиниб. Другим примером модулятора EGFR является конъюгат EGF с токсином.

Из ингибиторов EGFR и Her2, которые можно применять в сочетании с биспецифической связывающей молекулой следует упомянуть лапатиниб, гефитиниб, эрлотиниб, цетуксимаб, трастузумаб, нимотузумаб, залутумумаб, вандетаниб (который является также ингибитором VEGFR), пертузумаб, XL647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (который является также ингибитором VEGFR), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab.

Другими агентами, которые целесообразно применять для лечения в сочетании с биспецифической связывающей молекулой являются тоситумумаб и ибритумомаба тиуксетан (два меченных с помощью радиоактивных изотопов антитела к CD20), алемтузумаб (антитело к CD52), деносумаб (ингибитор лиганда фактора дифференцировки остеокластов), галиксимаб (антагонист CD80), офатумумаб (ингибитор CD20), занолимумаб (антагонист CD4), SGN40 (модулятор лиганда рецептора CD40), ритуксимаб (ингибитор CD20), мапатумумаб (агонист рецептора TRAIL-1), REGN421(SAR153192) или ОМР-21М18 (ингибиторы D114).

Другими химиотерапевтическими лекарственными средствами, которые можно применять в сочетании с биспецифическими связывающими молекулами, являются (но, не ограничиваясь только ими) гормоны, аналоги гормонов и антигормональные средства (например, тамоксифен, торемифен, ралоксифен, фулвестрант, мегестрола ацетат, флутамид, нилутамид, бикалутамид, ципротерона ацетат, финастерид, бусерелина ацетат, флудрокортизон, флуоксиместерон, медроксипрогестерон, остреотид, арзоксифен, пасиреотид, вапреотид), ингибиторы ароматазы (например, анастрозол, летрозол, лиарозол, эксеместан, атаместан, форместан), агонисты и антагонисты LHRH (например, госерелина ацетат, леупролид, абареликс, цетрореликс, деслорелин, гистрелин, трипторелин), антиметаболиты (например, антифолаты типа метотрексата, пеметрекседа, аналоги пиримидина типа 5-фторурацила, капецитабина, децитабина, неларабина и гемцитабина, аналоги пурина и аденозина, такие как меркаптопурина тиогуанин, кладрибин и пентостатин, цитарабин, флударабин); противопухолевые антибиотики (например, антрациклины, такие как доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин и идарубицин, митомицин-С, блеомицин, дактиномицин, пликамицин, митоксантрон, пиксантрон, стрептозоцин); производные платины (например, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, лобаплатин, сатраплатин); алкилирующие средства (например, эстрамустин, меклорэтамин, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, дакарбазин, циклофосфамид, ифосфамид, гидроксимочевина, темозоломид, нитрозомочевины, такие как кармустин и ломустин, тиотепа); антимитотические средства (например, алкалоиды барвинка типа винбластина, виндесина, винорелбина, винфлунина и винкристина; и таксаны, такие как паклитаксел, доцетаксел и их препаративные формы, ларотаксел; симотаксел и эпотилоны типа иксабепилона, патупилона, ZK-EPO); ингибиторы топоизомеразы (например, эпиподофиллотоксины, такие как этопосид и этопофос, тенипосид, амсакрин, топотекан, иринотекан) и химиотерапевтические агенты смешанного типа, такие как амифостин, анагрелид, интерферон альфа, прокарбазин, митотан и порфимер, бексаротен, целекоксиб.

Эффективность биспецифических связывающих молекул или содержащих их полипептидов или содержащих их фармацевтических композиций можно оценивать с помощью приемлемого анализа in vitro, клеточного анализа, анализа in vivo и/или на хорошо известных животных моделях, или с помощью любой их комбинации в зависимости от специфического представляющего интерес заболевания или нарушения. Приемлемые анализы и животные модели очевидны специалисту в данной области техники, и они представляют собой анализы, представленные в настоящем описании, и применяемые ниже в примерах, например, анализ пролиферации.

Данные, полученные в экспериментах, проведенных при создании изобретения, подтверждают, что

- 26 036746 биспецифические связывающие молекулы обладают свойствами, которые превышают свойства связывающих молекул, известных из существующего уровня техники. Одним из указанных свойств является полное ингибирование взаимодействия VEGF165-VEGFR2 и низкое значение IC₅₀, которое можно рассчитывать, например, на основе полученных с помощью ELISA данных, представленных на фиг. 1 и в таблице 5, а также значения IC₅₀ (нМ) для VHH по данным AlphaScreen-анализа, которые представлены на фиг. 3, 17, 18 и в табл.7; и данные об уровне аффинности KD (нМ) очищенных VHH к рекомбинантному человеческому VEGF и мышиному VEGF, которые представлены в таблице 9, 10 и на фиг. 5. Кроме того, что видно из табл.13, связывающие VEGF агенты, обладают высокой эффективностью, т.е. при применении в концентрациях, находящихся в субнаномолярном диапазоне, при оценке пролиферации клеток линии HUVEC. Эти данные свидетельствуют о том, что биспецифические связывающие молекулы являются перспективными кандидатами, которые могут обладать терапевтической эффективностью в отношении заболеваний и нарушений, ассоциированных с опосредуемыми VEGF-воздействиями на ангиогенез, таких как рак.

Диагностирования заболевания может заключаться в том, что:

а) приводят в контакт образец со связывающей молекулой, предлагаемой в изобретении, и

б) определяют связывание указанной связывающей молекулы с образцом, и

в) сравнивают связывание, обнаруженное на стадии (б), со стандартом, при этом различие в связывании с указанным образцом является диагностическим в отношении заболевания или нарушения, ассоциированного с опосредуемыми VEGF- и/или Ang2 воздействиями на ангиогенез.

Для указанного и других вариантов применения может оказаться целесообразным дополнительно модифицировать биспецифическую связывающую молекулу, например, путем интродукции функциональной группы, которая является компонентом специфически связывающейся пары, такой как связывающаяся пара биотин-(стрепт)авидин. Указанную функциональную группу можно применять для соединения связывающей молекулы с другим белком, полипептидом или химическим соединением, который/которое связан/связано с другой половиной связывающейся пары, т.е. посредством формирования связывающейся пары. Например, биспецифическую связывающую молекулу, можно конъюгировать с биотином и связывать с другим белком, полипептидом, соединением или носителем, который конъюгирован с авидином или стрептавидином. Например, указанную конъюгированную биспецифическую связывающую молекулу можно применять в качестве репортера, например, в диагностической системе, в которой выявляемый образующий сигнал агент конъюгирован с авидином или стрептавидином.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано на фиг. 1 - результаты, демонстрирующие, что очищенные одновалентные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR2-Fc (ELISA);

на фиг. 2 - результаты, демонстрирующие, что очищенные одновалентные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFRl-Fc (ELISA);

на фиг. 3 - результаты, демонстрирующие, что очищенные одновалентные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen);

на фиг. 4 - результаты, демонстрирующие, что очищенные одновалентные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFRl-Fc (AlphaScreen);

на фиг. 5 - результаты, демонстрирующие связывание одновалентных VHH с рекомбинантным человеческим и мышиным VEGF (ELISA);

на фиг. 6 - результаты, демонстрирующие связывание одновалентных VHH с человеческим VEGF121;

на фиг. 7- результаты демонстрирующие, что очищенные VHH не связываются с VEGFB, VEGFC, VEGFD и P1GF;

на фиг. 8 - результаты демонстрирующие, что форматированные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR2-Fc (ELISA);

на фиг. 9 - результаты демонстрирующие, что форматированные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFRl-Fc (ELISA);

на фиг. 10 - результаты демонстрирующие, что форматированные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen);

на фиг. 11 - результаты, демонстрирующие, что форматированные VHH блокируют взаимодействие hVEGF165/hVEGFRl-Fc (AlphaScreen);

на фиг. 12 - результаты, демонстрирующие, что форматированные VHH блокируют взаимодействие mVEGF164/mVEGFR2-Fc (AlphaScreen);

на фиг. 13 - результаты, демонстрирующие, что форматированные VHH связываются с мышиным и человеческим VEGF;

на фиг. 14 - результаты, демонстрирующие, что форматированные VHH не связываются с VEGFB, VEGFC, VEGFD и P1GF;

на фиг. 15 - результаты, демонстрирующие, что форматированные VHH связываются с VEGF 121;

на фиг. 16 - сравнительный анализ последовательности VHH VEGFBII23B04 и человеческой кон- 27 036746 сенсусной последовательности зародышевой линии VH3/JH;

на фиг. 17 - результаты, демонстрирующие, что варианты VHH VEGFBII23B04 блокируют взаимодействие hVEGF165/hvEGFR2-Fc (AlphaScreen);

на фиг. 18 - результаты, демонстрирующие, что клоны VEGFBII23B04 с оптимизированной последовательностью блокируют взаимодействие hVEGF 165/hVEGFR2-Fc (AlphaScreen);

на фиг. 19 - сравнительный анализ последовательности VHH VEGFBII5B05 и человеческой консенсусной последовательности зародышевой линии VH3/JH;

на фиг. 20 - описание двухвалентных VHH к Ang2;

на фиг. 21 - результаты, демонстрирующие, что очищенные двухвалентные VHH к Ang2 блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (25-1), mAng2-mTie2 (25-2) и cAng2-cTie2 (25-3) (ELISA);

на фиг. 22 - результаты, демонстрирующие, что очищенные двухвалентные VHH к Ang2 блокируют взаимодействие hAng1-hTie2 (ELISA);

на фиг. 23 - описание трехвалентных биспецифических VHH VEGFxAng2;

на фиг. 24 - результаты, демонстрирующие, что очищенные трехвалентные нанотела VEGFxAng2 блокируют взаимодействие hVEGF-hVEGFR2 (AlphaScreen);

на фиг. 26 - результаты, демонстрирующие, что очищенные трехвалентные VHH VEGFxAng2 блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (ELISA);

на фиг. 26 - описание трехвалентных и четырехвалентных биспецифических VHH VEGFxAng2;

на фиг. 27 - результаты, демонстрирующие, что очищенные трехвалентные и четырехвалентные VHH VEGFxAng2 блокируют взаимодействие hVEGF-hVEGFR2 (31-1) и hVEGF-hVEGFR1 (31-2) (AlphaScreen);

на фиг. 28 - результаты, демонстрирующие, что очищенные трехвалентные и четырехвалентные VHH VEGFxAng2 блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (32-1), mAng2-mTie2 (32-2) и cAng2-cTie2 (32-3) (ELISA);

на фиг. 29 - результаты, демонстрирующие, что очищенные трехвалентные и четырехвалентные VHH VEGFxAng2 блокируют опосредуемое hAng2 выживание клеток HUVEC;

на фиг. 30 - описание биспецифических VHH VEGFxAng2 с оптимизированной последовательностью и аффинностью;

на фиг. 31 - результаты, демонстрирующие, что очищенные VHH VEGFANGBII00022-25-28 VEGFxAng2 блокируют взаимодействие hVEGF-hVEGFR2 (35-1) и hVEGF-hVEGFRl (35-2) (AlphaScreen);

на фиг. 32 - результаты, демонстрирующие, что очищенные VHH VEGFANGBII00022-25-28 VEGFxAng2 связываются с человеческим VEGF165 (36-1) и hVEGF121 (36-2) (ELISA);

на фиг. 33 - результаты, демонстрирующие, что очищенные VHH VEGFANGBII00022-25-28 VEGFxAng2 связываются с (А) мышиным и (Б) крысиным VEGF164 (ELISA);

на фиг. 34 - результаты, демонстрирующие, что очищенные VHH VEGFANGBII00022-25-28 VEGFxAng2 связываются с (А) человеческим VEGF-В, (Б) человеческим VEGF-C, (В) человеческим VEGF-D и (Г) человеческим P1GF (ELISA);

на фиг. 35 - результаты, демонстрирующие, что очищенные VHH VEGFANGBII00022-25-28 VEGFxAng2 блокируют взаимодействие hAng2-hTie2 (39-1), mAng2-mTie2 (39-2) и cAng2-cTie2 (39-3) (ELISA);

на фиг. 36 - результаты, демонстрирующие, что очищенные VHH VEGFANGBII00022-25-28 VEGFxAng2 блокируют взаимодействие hAng1-hTie2 (ELISA);

на фиг. 37 - результаты, демонстрирующие, что очищенные VHH VEGFANGBII00022-25-28 VEGFxAng2 блокируют опосредуемое hAng2 выживание клеток HUVEC.

Материалы и методы

а) Получение VEGF109 и оценка его функциональной активности.

кДНК, кодирующую связывающий рецептор домен изоформы человеческого сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF165 (GenBank: ААМ03108.1; АК-остатки 27-135), клонировали в векторе рЕТ28а (фирма Novagen, Мэдисон, шт. Висконсин) и сверхэкспрессировали в E.coli (BL21 Star DE3) в виде меченного с помощью His нерастворимого белка. Экспрессию индуцировали путем добавления 1мМ изопропилтиогалактозида (ИПТГ) и давали осуществляться в течение 4 ч при 37°С. Клетки собирали центрифугированием и лизировали путем облучения клеточного дебриса ультразвуком. Тельца включения выделяли центрифугированием. После стадии отмывки с помощью 1% Тритон X 100 (фирма Sigma-Aldrich) белки солюбилизировали с помощью 7,5М гидрохлорида гуанидина и осуществляли повторную укладку (рефолдинг) путем последовательных циклов диализа в течение ночи с использованием буферов с концентрациями мочевины, понижающимися с 6М до 0М. Повторно уложенный белок очищали с помощью ионообменной хроматографии с использованием колонки MonoQ5/50GL (фирма Amersham BioSciences) и последующей гель-фильтрации на колонке Супердекс75 10/300 GL (фирма Amersheim BioSciences). Чистоту и гомогенность белка подтверждали методом ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга. Кроме того, оценивали с помощью ELISA активность в отношении связывания с VEGFR1, VEGFR2 и бевацизумабом. Для этой цели рекомбинантный человеческий VEGF109 (1 мкг/мл) иммобилизовали в

- 28 036746 течение ночи при 4°С в 96-луночном планшете MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали раствором казеина (1%). Добавляли серийные разведения VEGFR1, VEGFR2 или бевацизумаба в сенсибилизированный VEGF109 планшет и оценивали связывание с использованием конъюгированного со щелочной фосфатазой (АР) козьего античеловеческого IgG, Fc-специфического (фирма Jackson Immuno Research Laboratories Inc., Вест-Гров, шт. Пенсильвания, США) и последующей ферментативной реакции в присутствии субстрата PNPP (пара-нитрофенилфосфат) (фирма Sigma-Aldrich). Установлено, что VEGF109 может связываться с VEGFR1, VEGFR2 и бевацизумабом, что свидетельствует об активности полученного VEGF109.

б) Конъюгация VEGF165 с KLH и оценка функциональной активности VEGF165, конъюгированного с KLH.

Рекомбинантный человеческий VEGF165 (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) конъюгировали с гемоцианином лимфы улитки, выращенной в условиях марикультуры (mcKLH), используя набор Imject Immunogen EDC, содержащий mcKLH (фирма Pierce, Рокфорд, шт. Иллинойс, США), согласно инструкциям производителя. Эффективность конъюгации полипептида с mcKLH подтверждали с помощью ДСН-ПААГ. Функциональную активность конъюгированного белка оценивали с помощью ELISA: для этой цели конъюгированный с KLH VEGF165 (2 мкг/мл) иммобилизовали в течение ночи при 4°С в 96-луночном планшете MaxiSorp (фира Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали раствором казеина (1%). Добавляли серийные разведения VEGFR1 или VEGFR2 и оценивали связывание с использованием конъюгированного с пероксидазой из хрена (HRP) козьего античеловеческого IgG, Fc-специфического (фирма Jackson Immuno Research Laboratories Inc., Вест-Гров, шт. Пенсильвания, США) и последующей ферментативной реакции в присутствии субстрата ТМВ (3,3',5,5'тетраметилбензидин) (фирма Pierce, Рокфорд, шт. Иллинойс, США). Конъюгированный с KLH белок все еще сохранял способность взаимодействовать с VEGFR1, VEGFR2 и бевацизумабом, это подтверждает, что соответствующие эпитопы VEGF165 все еще являлись доступными.

Пример 1. Иммунизация с использованием различных форматов VEGF индуцирует гуморальный иммунный ответ у лам.

1.1. Иммунизации.

После одобрения Комитетом по этике департамента ветеринарной медицины (Университет Гента, Бельгия), иммунизировали 4 лам (обозначены №№ 264, 265, 266, 267) согласно стандартным протоколам, осуществляя 6 внутримышечных инъекций (100 или 50 мкг/дозу с недельными интервалами) рекомбинантного человеческого VEGF109. Для первой инъекции в день 0 применяли форму в полном адъюванте Фрейнда (фирма Difco, Детройт, шт. Мичиган, США), а для последующих инъекций применяли форму в неполном адъюванте Фрейнда (фирма Difco, Детройт, шт. Мичиган, США). Кроме того, иммунизировали четырех лам (обозначены №№ 234, 235, 280 и 281) согласно следующему протоколу: 5 внутримышечных инъекций с использованием конъюгированного с KLH человеческого VEGH165 (100 или 50 мкг/дозу с двухнедельными интервалами) с четырьмя последующими внутримышечными инъекциями человеческого VEGF109 (первая доза 100 мкг, затем через 2 недели три инъекции с использованием 50 мкг/дозу с недельными интервалами).

1.2. Оценка индуцированных VEGF иммунных ответов у лам.

Для мониторинга VEGF-специфических сывороточных титров применяли анализ ELISA, при осуществлении которого взятый в концентрации 2 мкг/мл рекомбинантный человеческий VEGF 165 или VEGF 109 иммобилизовали в течение ночи при 4°С в 96-луночном планшете MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали раствором казеина (1%). После добавления разведений сыворотки выявляли связанный общий IgG, используя конъюгированное с пероксидазой из хрена (HRP) козье антитело к иммуноглобулину лам (фирма Bethyl Laboratories Inc., Монтгомери, шт. Техас, США) и осуществляя последующую ферментативную реакцию в присутствии субстрата ТМВ (3,3',5,5'тетраметилбензидин) (фирма Pierce, Рокфорд, шт. Иллинойс, США). Для лам №№ 264, 265, 266 и 267 осуществляли дополнительный анализ методом ELISA, в котором оценивали специфические для изотипа ответы против VEGF165 и VEGF109. Специфические для изотипа ответы выявляли с использованием мышиных МАт, специфически распознающих канонический IgGl лам и состоящие только из тяжелой цепи IgG2 и IgG3 лам (Daley и др., Clin. Diagn. Lab. Imm. 12, 2005, cc. 380-386), после чего использовали кроличье антимышиное антитело, конъюгированное с HRP (фирма DAKO). Для визуализации полученных с помощью ELISA результатов использовали ТМВ в качестве хромогенного субстрата и определяли абсорбцию при 450 нм. Данные о титрах в сыворотке каждой ламы представлены в табл. 1.

- 29 036746

Таблица 1. Антитело-обусловленный специфический сывороточный ответ на обработку VEGF165 и

VEGF109 ELISA (твердая фаза сенсибилизирована рекомбинантным белком)

		Рекомбинантный человеческий EGF165	Рекомбинантный человеческий VEGF109
Лама	Иммуноген	Общий IgG	IgGl	IgG2	IgG3	Общий IgG	IgGl	IgG2	IgG3
234	VEGF165-KLH + VEGF109	++	n/d	n/d	n/d	++	n/d	n/d	n/d
235	VEGF165-KLH + VEGF109	++	n/d	n/d	n/d	++	n/d	n/d	n/d
280	VEGF165-KLH + VEGF109	+	n/d	n/d	n/d	+	n/d	n/d	n/d
281	VEGF165-KLH + VEGF109	+	n/d	n/d	n/d	+	n/d	n/d	n/d
264	VEGF109	n/d	++	+	+	++	++	+	+
265	VEGF109	n/d	++	+	+	+	++	+	+
266	VEGF109	n/d	++	+	+/-	++	++	+	+/-
267	VEGF109	n/d	+/-	-	-	+/-	+/-	-	-

n/d: не определяли.

Пример 2. Клонирование популяций содержащих только тяжелую цепь фрагментов антител и получение фага.

После последней инъекции иммуногена получали образцы иммунных тканей иммунизированных лам в качестве источника В-клеток, которые продуцировали антитела с тяжелой цепью. Как правило, собирали по два 150-миллилитровых образца крови через 4 и 8 дней после последней инъекции антигена и у каждого животного получали биопсию одного лимфатического узла через 4 дня после последней инъекции антигена. Из образцов крови получали мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), используя фиколл-пак согласно инструкциям производителя (фирма Amersham Biosciences, Пискатавей, шт. Нью-Джерси, США). Из РВМС и биопсии лимфатических узлов экстрагировали общую РНК, которую применяли в качестве исходного материала для амплификации с помощью ОТ-ПЦР кодирующих VHH ДНК-сегментов согласно методу, описанному в WO 2005/044858. Для каждой иммунизированной ламы конструировали библиотеку путем объединения общей РНК, выделенной из всех собранных образцов иммунных тканей каждого животного. В целом, метод состоял следующем: популяцию амплифицированных с помощью ПЦР VHH клонировали с использованием специфических сайтов рестрикции в векторе, созданном для облегчения фагового дисплея библиотеки VHH. Вектор выводили из pUC119, и он содержал промотор LacZ, последовательность, кодирующую белок gIII фага М13, ген, обусловливающий устойчивость к ампициллину или карбенициллину, сайт множественного клонирования и гибридную лидерную последовательность gIII-pelB (pAX050). В рамке считывания с кодирующей последовательностью VHH вектор кодировал С-концевую c-myc-метку и His6-MeTKy. Фаг получали согласно стандартным протоколам и хранили после стерилизации фильтрацией при 4°С для последующего применения.

Пример 3. Селекция VEGF-специфических VHH с помощью фагового дисплея.

Фаговые библиотеки VHH применяли для различных стратегий селекции, используя различные условия селекции. Варьировали следующие компоненты: I) формат белка VEGF (rhVEGF165, rhVEGF109 или rmVEGF164), II) метод презентации антигена (твердофазный метод: непосредственно на сенсибилизированных планшетах или через биотиновую метку на сенсибилизированных нейтравидином планшетах; или жидкофазный метод: инкубация в растворе с последующей иммобилизацией на сенсибилизированных нейтравидином планшетах), III) концентрацию антигена и IV) метод элюции (элюция с использованием трипсина или конкурентная элюция с использованием VEGFR2). Все селекции осуществляли в 96-луночных планшетах Maxisorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия).

Селекции осуществляли следующим образом: фаговые библиотеки инкубировали при КТ с взятым в различных концентрациях антигеном VEGF, либо находящимся в растворе, либо иммобилизованным на твердой подложке. После инкубации в течение 2 ч с последующей интенсивной отмывкой элюировали связанный фаг. Когда для фаговой элюции применяли трипсин, то протеазную активность сразу же нейтрализовали, применяя 0,8мМ протеазный ингибитор ABSF. Сборы фага, обогащенные по сравнению с фоновым уровнем (контроль без антигена), применяли для заражения Е. coli. Зараженные клетки Е. coli либо применяли для получения фага для следующего цикла селекции (сохранение (спасение) фага), либо высевали на агаровые пластины (LB+amp+глюкоза (2%)) для анализа индивидуальных клонов VHH. Для скрининга продукта селекции в отношении специфических связывающих агентов индивидуальные колонии изымали из агаровых пластин и выращивали в объеме 1 мл в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Контролируемую LacZ экспрессию VHH индуцировали, добавляя ИПТГ (конечная концентрация 0,1-1мМ). Получали экстракты содержимого периплазматического пространства (пери- 30 036746 плазматические экстракты) (в объеме ~80 мкл) согласно стандартным методам.

Пример 4. Идентификация связывающих VEGF и блокирующих VEGF-рецептор VHH.

Периплазматические экстракты тестировали в отношении связывания с человеческим VEGF165 с помощью ELISA. В целом, метод состоял в следующем: рекомбинантный человеческий VEGF165 (2 мкг/мл) иммобилизовали при 4°С в 96-луночном планшете MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали с помощью раствора казеина (1%). После добавления, как правило, 10-кратного разведения периплазматических экстрактов связывание VHH оценивали с использованием мышиного антитела к myc (фирма Roche) и антимышиного антитела, конъюгированного с HRP (фирма DAKO). Клоны, для которых ELISA-сигналы более чем в 3 раза превышали фоновые, рассматривали как клоны VHH, обладающие способностью связывать VEGF.

Кроме того, периплазматические экстракты подвергали скринингу в отношении взаимодействия человеческий УЕОР165/человеческий VEGFR2 с использованием AlphaScreen-анализа (гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминисценции) для оценки блокирующей способности VHH. Человеческий VEGF 165 биотинилировали с помощью реагента сульфо-NHS-LC-биотин (фирма Pierce, Рокфорд, шт. Иллинойс, США). Химеру человеческий VEGFR2/Fc (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) иммобилизовали с помощью VHH к человеческой Fc-области, который сшивали с акцепторными гранулами согласно инструкциям производителя (фирма Perkin Elmer, Валтхам, шт. Массачусетс, США). Для оценки нейтрализующей способности VHH периплазматические экстракты разводили в соотношении 1/25 в ЗФР-буфере, содержащем 0,03% Твин 20 (фирма Sigma-Aldrich), и предварительно инкубировали с 0,4нМ биотинилированным человеческим VEGF165 в течение 15 мин при комнатной температуре (КТ). Для этой цели добавляли смесь акцепторных гранул (10 мкг/мл) и 0,4нМ VEGFR2-huFc и дополнительно инкубировали в течение 1 ч при КТ в темноте. Затем добавляли донорские гранулы (10 мкг/мл) с последующей инкубацией в течение 1 ч при КТ в темноте. Флуоресценцию измеряли с помощью планшет-ридера типа Envision Multilabel (фирма Perkin Elmer, Уолтем, шт. Массачусетс, США), при длине волны возбуждения 680 нм и длине волны испускания от 520 до 620 нм. Периплазматические экстракты, содержащие несоответствующий VHH, применяли в качестве отрицательного контроля. Периплазматические экстракты, содержащие анти-VEGF165 VHH, которые обладали способностью снижать флуоресцентный сигнал более чем на 60% относительно сигнала, соответствующего отрицательному контролю, рассматривали как соответствующие требованиям (хиты). Все хиты, идентифицированные с помощью AlphaScreen, подтверждали с использованием конкурентного ELISA. Для этой цели химеру (1 мкг/мл), содержащую человеческий VEGFR2 (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США), применяли для сенсибилизации 96-луночного планшета MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Пятикратные разведения периплазматических экстрактов инкубировали в присутствии биотинилированного человеческого VEGF165 в фиксированной концентрации (4нМ) в ЗФРбуфере, содержащем 0,1% казеина и 0,05% Твин 20 (фирма Sigma-Aldrich). Связывание этих комплексов VHH/bio-VEGF165 с планшетом, сенсибилизованным химерой, содержащей человеческий VEGFR2, выявляли с помощью конъюгированного с пероксидазой из хрена (HRP) экстравидина (фирма Sigma, СентЛуис, шт. Миссури, США). Идентификационные номера (ID) VHH-последовательностей и соответствующие АК-последовательности VEGF-связывающих (не блокирующих рецептор) VHH и ингибирующих (блокирующих рецептор) VHH представлены в табл. 2 и 3 соответственно.

Таблица 2. ID последовательностей и АК-последовательности одновалентных не блокирующих рецептор анти-VEGF VHH (FR, каркасный участок; CDR, гипервариабельный участок)

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
VEGFBII 01C02/58	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCTASGGS FS	SYGMG	WFRQSPGKER EFVS	AISEYSNTYCSDS VRG	RFTISRDNTKNTVYLQMN SLTPDDTAIYYCAA	SPTILLTTEQWYKY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 01E07/59	EVQLVESGGGLVQA GDSLRLSCVATGRT FR	ASDMG	WFRQAPGKER EFVA	AINWSGLSTFYTD SVKG	RFTISRDNDNGALYLQMN TLKPEDTAVYSCAA	GRIPSSSRFSS PAAYAS	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 03D12/60	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCTASTSI YT	ITVMA	WFRQAPGKER EFVA	AITWSAPTTYYAD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLRMN SLKPEDSAIYYCAA	DRFKGRSIVTPSDYRY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 04B08/61	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGSA VG	DITVA	WYRQAPGIQR QLVA	TITPSGYTYYWDF VKG	RFTISRDNSKNIVYLQMN SLKPEDTAAYYCNT	QFY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 05B02/62	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	TDDVG	WFRQAPGKER EFVA	VIRWSTGGTYTSD SVKG	RFTLSRDNAKNTMYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	RSRPLGAGAWYSGEKHYN	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 05B03/63	EVQLVESGGGLAQA GDSLRLSCAASGRS FS	HYNMG	WFRQAPGKER EFVA	SIRGGGGSTTYAN SVKD	RFTISRENAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	TAFYRGPYDYDY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 05B05/64	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCVASGIR FM	SMA	WYRQAPGKHR ELVA	RISSGGTTAYVDS VKG	RFTISRDNSKNTVYLQMN SLKAEDTAVYYCNT	FSSRPNP	WGAGTQVT VSS
VEGFBII 06G02/65	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGNI FS	NNAMA	WYRQAPGKQR ELVA	RISSGGGFTYYLD SVKG	RFTVS RDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCNA	AYRTYNY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 07A03/66	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASTSI YS	ITVMA	WFRQAPGKES EFVA	AITWSAPSSYYAD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDSAIYYCAA	DRFKGRSIVTRSDYKY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 07A06/67	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAVSTSI YS	ISVMA	WFRQAPGKER AFVA	AITWSAPTTYYAD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQTN SLKPEDSAIYYCAA	DRFKGRSIVTRSDYRY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 07D08/68	EVQLVESGGGLVQT GGSLRLSCAASGRT FS	NYAMA	WFRQAPGKER EFVS	AINQRGSNTNYAD SVKG	RFTISRDSAKNSVFLQMN SLKPEDTAVYYCAA	STWYGYSTYARREEYRY	WGQGTQVT VSS

- 31 036746

VEGFBII 08D09/69	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRS FS	DNVMG	WFRQAAGKER EFVA	HISRGGSRTEYAE SVKG	RFTISRDNTKKTMYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	SRSVALATARPYDY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 08E07/70	EVQLVESGGGLAQA GGSLRLSCTTSGLT FS	SYYMG	WFRQAPGKER EFVA	TISWNKISTIYTD SVKG	RFTVSRDNNKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	DASRPTLRIPQY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 08F06/71	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGSI VR	SDVMG	WYRQAPGKQR ELVA	FIRSLGSTYYAGS VKG	RFTISRDDAANTVYLQMN NLKPEDTAVYYCNA	RFSGESY	WGQGTPVT VSS
VEGFBII 08F07/72	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAVSGST FG	LYAMG	WFRQAPGRER EFLS	AITWSAGDTQYAD SVKG	RFTISRDNARNTVNLQMN GLKPEDTAVYYCAG	RQWGGTYYYHGSYAY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 09A09/73	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCVASGIR FM	SMA	WYRQAPGKHR ELVA	RISSEGTTAYVDS VKG	RFTISRDNSKNTVYLQMN SLKAEDTAVYYCNT	FSSRPNP	WGAGTTVT VSS
VEGFBII 09A12/74	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	TDDVG	WFRQAPGKER EFVA	VIRWSTGGTYTSD SVAG	RFTLSRDNAKNTMYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	RSRPLGAGAWYTGETRYD S	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 09D05/75	EVQLVESGGGLVQP GDSLRLSCAASGLS FS	RYGMG	WFRQAPGKER EFVI	AISEYDNVYTADS VRG	RFTISRDNSKSTVYLQMN SLKSEDTAVYYCAA	SPTILLSTDEWYKY	WGRGTQVT VSS
VEGFBII 09F05/76	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	TDDVG	WFRQAPGKER EFVA	VIRWSTGGTYTSD SVKG	RFTLSRDNAKNTMYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	RS RP L GAGAWYT GET RYN	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 10C07/77	EVQLVESGGGLVQA GGSLSLSCAASARA FS	NYAMG	WFRQVPGRER EFVA	VITRSPSNTYYTD SVKG	RFTISRDNAKNIVYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	HYWNSDSYTYTDSRWYNY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 10E07/78	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	NYAMG	WFRQAPGKER VLVA	DISSSGINTYVAD AVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	SAWWYSQMARDNYRY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 10G04/79	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGDT LS	RYAMG	WFRQAPGKER EFVA	SINTSGKRTSYAD SMKG	RFAVSRDNAKNTGYLQMN SLKLEDTATYYCAA	DRFFGSDSNEPRAYRY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 10G05/80	EVQLVESGGGLVQA GESLRLSCVASGIT FS	NYNMG	WFRQAPGKER EFVA	TIRHHGYDTYYAE SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTALYSCAK	KLFWDMDPKTGFSS	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 11C08/81	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT LS	SYGLG	WFRQAPGKER EFVA	AIGWSGSSTYYAD SVKG	RFTVSVDNAKNTVYLKMN SLEPEDTAVYYCAA	KVRNFNSDWDLLTSYNY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 11C11/82	EVQLVESGGGLVQA GGSLMLSCAASGRA LS	SYAIG	WFRQAPGRER EFVA	RISWSGANTYYAD SVKG	RFTISRGNAKNTVYLQMN SLKPEDTAAYYCAA	QTTSKYDNYDARAYGY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 11D09/83	EEQLVESGGGLVQA GGSLMLSCAASGRA LS	SYAIG	WFRQAPGRER EFVA	RISWSGANTYYAD SVKG	RFTISRGNAKNTVYLQMN SLKPEDTAAYYCAA	QTTSKYDNYDARAYGY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 11E04/84	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	SYAMG	WFRQAPGKER EFVA	TISQSGYSTYYAD SVKG	RFTISRDNAKNTVNLQMN SLKPEDTAVYYCAA	DPFYSYGSPSPYRY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 11E05/85	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCASSGRL FS	FSAMG	WFRQAPGKER EFVA	AFKWSGSTTYYAD YVKG	RFTISTDNAKNILFLQMN SLKPEDTAIYYCAV	DRFYTGRYYSSDEYDY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 11F10/86	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASTSI YS	ITVMA	WFRQAPGKER EFVA	AITWSAPSSYYAD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQVN SLKPEDSAIYYCAA	DRFKGRSIVTRSDYRY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 11F12/87	EVQLVESGGGLVQS GGSLRLSCAASGRS FS	SLAMG	WFRQVPGKDR EFVA	SISQSGITTSYAD SVKS	RFTISRDSAKNTVYLQMN LLKPEDTAVYYCAT	SVFYSTALTRPVDYRY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 11G09/88	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASTSI YS	ITVMA	WFRQAPGKER EFVA	AITWSAPTTYSAD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDSAIYYCAA	DRFKGRSIVTRSDYRY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 12A07/89	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCSVTGRT FN	KYVMG	WFRQAPGNDR EFVA	AITSRDGPTYYAD SVKG	RFTISGDNTKNKIFLQMN SLMPEDTAVYYCAI	DEDLYHYSSYHFTRVDLY HY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 12B01/90	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLACAASGFT LS	SSWMY	WVRQAPGKGL EWVS	RISPGGLFTYYVD SVKG	RFSVSTDNANNTLYLQMN SLKPEDTALYSCAK	GGAPNYTP	RGRGTQVT VSS
VEGFBII 12C04/91	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGSI VR	SDVMG	WYRQAPGKQR ELVA	FIRSLGSTYYAGS VKG	RFTISRDNAANTVYLQMN NLKPEDTAVYYCNA	RFSGESY	WGQGTPVT VSS
VEGFBII 12E10/92	EVQLVESGGGLAQA GGSLRLSCTASGRT FN	NYVMG	WFRQAPGNER EFVA	AITSTNGPTYYAD SVKG	RFTISGDNTKNKVFLQMD SLRPEDTAVYYCAI	DEDLYHYSSYHYTRVALY HY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 12G04/93	EVQLVESGGGLVQS GDSLRLSCAVSGNT FG	LYAMG	WFRQAPGRER EFVS	AITWSAGDTQYAD SVKG	RFTISRDNARNTVNLQMN GLKPEDTAVYYCAG	RQWGGTYYYHGSYAW	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 16C03/94	EVQLVESEGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	TDDVG	WFRQAPGKER EFVA	VIRWSTGGTYTSD SVKG	RFTLSRDNAKNTMYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	RSRPLGAGAWYTGENYYN	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 16F11/95	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT SS	GYDMG	WFRQAPGKER EFVT	AITWSGGSTYSPD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN NLTPEDTAVYYCAS	GRIWRSRDYDSEKYYDI	WGHGTQVT VSS
VEGFBII 36C08/96	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	AYDMG	WFRQAPGKER EFVA	VISWTNSMTYYAD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAV	DRRRTYS RWRFYTGVNDY DY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 37F09/97	EVQLVESGGGLVQT GGSLRLSCAASGRT FS	AYDMG	WFRQAPGKER EFVA	VISWSGGMTYYAD SVQG	RFTISRDNAKSTVYLQMN SPKPEDTAVYYCAV	DRRRAYS RWRYYTGVNDY EF	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 38A06/98	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	AYDMG	WFRQAPGKER EFVA	VISWSGGMTYYAD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAV	DRRRLYS RWRYYTGVNDY DY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 39H11/99	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	AYDMG	WFRQAPGKER EFVA	VISWTGGMTYYAD SVKG	RFTIS RDKAKNTVS LQMN SLKPEDTAVYYCAV	DRRRTYS RWRYYTGVNEY EY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 41В06/ 100	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	AYDMG	WFRQAPGKER EFVA	VISWTGDMTYYAD SVKG	RFTIS RDKAKNTVS LQMN SLKPEDTAVYYCAA	DRRRTYS RWRYYTGVNEY EY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 41С05/ 101	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	VYTMG	WFRQAPGKER EFVA	TISRTGDRTSYAN SVKG	RFTISRENAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYSCAA	GPIAPSPRPREYYY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 41D11/ 102	EVQLMESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	AYDMG	WFRQAPGKER EFVA	VISWTGGMTYYAD SVKG	RFTIS RDKAKNTVS LQMN SLKPEDTAVYYCAV	DRRRTYS RWRYYTGVNEY EY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 42F10/ 103	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FS	AYDMG	WFRQAPGKER EFVA	VISWSGGMTDYAD SVKG	RFTISRENAKNTQFLQMN SLKPEDTAVYYCAV	GRRRAYS RWRYYTGVNEY DY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 86С11/ 104	EVQLVESGGGLVQA GDSLRLSCTASGRT FN	SYAMG	WFRQAPGKER ESVA	HINRSGSSTYYAD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQLN SLKPEDTAVYYCAA	GRYYSSDGVPSASFNY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 86F11/ 105	EVQLVESGGGLVQA GDSLRLSCFTSART FD	TWAMA	WFRQAPGKER EFIS	AISWSGSMTYYTD SVKG	RFIISRDNAQNTLFLQMN NTAPEDTAVYYCAA	KTVDYCSAYECYARLEYD	WGRGAQVT VSS
VEGFBII 86G08/ 106	EVQLVESGGGLMQT GDSLRLSCAASGLR FT	STNMG	WFRQGPGKER EFVA	AITLSGTTYYAEA VKG	RFTISRDNDKNTVALQMN SLKPEDTAVYYCGA	DPSYYSTSRYTKATEYDY	WGQGTQVT VSS

VEGFBII 86G10/ 107	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGRT FN	TYTMG	WFRQTPGTER EFVA	AIRWTVNITYYAD SVKG	RFTISRDIVKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	QTSAPRSLIRMSNEYPY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 86G11/ 108	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGLT FS	LYTVG	WFRQAPGKER EFVA	YISRSGSNRYYVD SVKG	RFTLSRDNAKNTVDLQMN SLKTEDTAVYYCAA	TSRGLSSLAGEYNY	WGRGTQVT VSS
VEGFBII 86Н09/ 109	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCTASGSA FK	SYRMG	WFRRTPGKED EFVA	SISWTYGSTFYAD SVKG	RFTMSRDKAKNAGYLQMN SLKPEDTALYYCAA	GAQSDRYNIRSYDY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 87В07/ 110	EVQLVESGGGLVQP GGSLKLSCTASGFT FS	TSWMH	WVRQAPGKGL EWVS	SIPPVGHFANYAP SVKG	RFTISRDNAKNTLFLQMN SLKSEDTAVYYCAK	DSAGRT	KGQGTQVT VSS
VEGFBII 88А01/ 111	KVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASERT FS	NYAMD	WFRQAPGKER EFVA	AITRSGGGTYYAD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	TRSSTIVVGVGGMEY	WGKGTLVT VSS
VEGFBII 88А02/ 112	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGFT FG	DYDIG	WFRQAPGNER EGVS	CITTDVGTTYYAD SVKG	RFTISSDNAKNTVYLQIN DLKPEDTAIYYCAV	DTQDLGLDIFCRGNGPFD G	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 88В02/ 113	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCTASGLN LD	DYAIG	WFRQAPGKER EGVS	CISSYDSVTYYAD HVKG	RFTISRDSAKNTLYLQMN SLSIEDTGVYYCAA	EREQLRRRESPHDELLRL CFYGMRY	SGKGTLVT VSS
VEGFBII 88Е02/ 114	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCVASGFR LD	DYAIG	WFRQAPGKER EAVS	CISSSDTSIDYTN SVKG	RFTFSRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	AFRCSGYELRGFPT	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 88G03/ 115	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGGT FS	SLAVG	WFRQAPGKER EFVA	RITWSGATTYYAD AVKD	RFTISRDNAKNTMYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	DRS PNIINWTAYEYDY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 88G05/ 116	EVQLVESGGGLVQP GASLRLSCAASGDG FT	LYNMG	WFRQAPGKER EFVA	AITSSPMSTYYAD SVKG	RFSISINNDKTTGFLQMN VLKPEDTGVYFCAA	PEGS FRRQYADRAMYDY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 88G11/ 117	EVQLVESGGGLAQA GGSLRLSCAASGRT FS	GSDMG	WFRQSPGKER EIVA	AIRLSGSITYYPD SVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	RSTYSYYLALADRGGYDY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 88Н01/ 118	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCVASGFT LG	TYAIG	WFRQAPGKER EAVS	CMSAGDSIPWYTA SVKG	RFTTSTDNARNTVYLQMN SLKPEDTAHYYCAA	ARYHGDYCYYEGYYPF	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 89В04/ 119	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASTSI SS	TNFMG	WYRQAPGKQR ELVA	TITSSSITNYVDS VKG	RFTISRDNAKNTVYLQMT SLKPEDTAVYYCHA	RWRWSDVEY	WGKGTLVT VSS
VEGFBII 89В08/ 120	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGTT SS	IFAMR	WYRQAPGKQR ELVA	SITRSSITTYADS VKG	RFT P S RDNAKNTVS LQMN SLKPEDTAVYYCNA	AIRPELYSWNDY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 89D04/ 121	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCATSGLT FS	DYNLG	WFRQAPGKER QFVA	VISWRDSFAYYAE PVKG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLKPEDTAVYYCAA	DRVSSRLVLPNTSPDFGS	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 89F09/ 122	EVQLVESGGGLVQA GDSLRLSCAASGRT FN	NAIMG	WFRQAPGQER EFVA	AMNWRGGPTYYAD SVKG	RFTISGDNTKNTVFLQMN FLKPEDTAVYYCAA	DEDLYHYSSYHYSRVDLY HY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 89G09/ 123	EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGTT SS	IFAMR	WYRQAPGKQR ELVA	SITRSSITTYADS VKG	RFTL S RDNAKNTVS LQMN SLKPEDTAVYYCNA	AIRPELYSWNDY	WGQGTQVT VSS
VEGFBII 89Н08/ 124	EVQLVESGGGLVQA GGSLRLSCAASGGS FS	SYAPG	WFRQAPGKER EFVA	AFTRSSNIPYYKD SVKG	RFTISRDNAHTVYLQMNS LKPEDTAIYYCAV	NLGSTWSRDQRTYDY	WGQGTQVT VSS

Таблица 3. ID последовательностей и АК-последовательности одновалентных блокирующих рецептор анти-VEGF VHH (FR, каркасный участок; CDR, гипервариабельный участок) (SEQ ID NO: 9-46)

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
VEGFBII 22A10/9	EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISSSGGYIYDS VSLEG	RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTADYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD Y	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 22A11/10	EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS	SYSMA	WFRQAQGKEREF VV	AISSGGFIYDAV SLEG	RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD Y	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 22B06/11	EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAASG RTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISSSGGYIYDS VSLEG	RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 22B07/12	EVQLVESGGGLVQ AGDSLRLSCAASG RTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISSSGNYKYDS VSLEG	RFTISRDNTKNTVYLQT NSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLGDTYD	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 22E04/13	EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCVASG RTSS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISSGGSIYDSV SLQG	RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA	SRAYASSRLRLADTYD Y	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 23A03/14	EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCVASG RTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISSGGYIYDSV SLQG	RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 23A06/15	EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISSGGFIYDAV SLEG	RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 23A08/16	EVQLVESGGGLVQ TGDSLRLSCVASG RTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISNGGYKYDSV SLEG	RFTISRDNTKNTVYLQT NSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD Y	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 23A09/17	EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFG	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISSSGGYIYDS VSLEG	RFTISRDNSKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLPDTYD Y	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 23B04/18	EVQLVESGGGLVQ TGDSLRLSCEVSG RTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISKGGYKYDSV SLEG	RFTISKDNAKNTVYLQI NSLKPEDTAVYYCAS	SRAYGSSRLRLADTYE Y	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 23D11/19	EVQLVESGGGLVQ PGDSLRLSCAFSG RTFS	SYSMA	WFRQAQGKEREF VV	AISSGGFIYDAV SLEG	RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD Y	WGQGTQVTVS S

- 33 036746

VEGFBII 23Е05/20	EVQLVESEGGLVQ PGDSLKLSCVASG RTSS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISSGGYIYDSV SLQG	RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 23F02/21	EMQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AISSSGGYIYDS VSLEG	RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTADYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD	WGQGTQVTVS S
VEGFBII 23F05/22 VEGFBII 23F11/23 VEGFBII 23G03/24 VEGFBII 24C04/25 VEGFBII 27D08/26 VEGFBII 27G07/27 VEGFBII 30C09/28 VEGFBII 30E07/29 VEGFBII 31C07/30 VEGFBII 39E02/31 VEGFBII 39G04/32 VEGFBII 40F02/33 VEGFBII 40G07/34 VEGFBII 40H10/35 VEGFBII 41B05/36 VEGFBII 41G03/37 VEGFBII 42A05/38 VEGFBII 42D05/39 VEGFBII 42F11/40 VEGFBII 56E11/41 VEGFBII 60A09/42 VEGFBII 61A01/43 VEGFBII 62A09/44 VEGFBII 62D10/45	EVQLVESGGGLVQ AGDSLRLSCAASG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFG EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCVASG RTSS EVQLVESGGGLVQ TGDSLRLSCAASG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCVASG RTSS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCIASG RTSS EVQLVESGGGLVQ AGDSLRLSCAASG RTFS EVQLVESGGGLVQ TGDSLRLSCAASG GTFS EVQLVESGGGLVQ PGDPLKLSCAFSG RTFS EVPLVESGGGLVQ AGDSLRLSCAASG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS EVQLMESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCAFSG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCVASG RTSS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS EVQLVESGGGLVQ AGGSLRLSCAFSG RTFS EVQLVESGGDLVQ PGDSLKLSCAASG RTFS EVQLVESEGGLVQ AGDSLRLSCAASG RTFS	SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMA SYSMG SYSMG SYSMG SYSMA SYSMG SYSMG SYSVG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG SYSMG	WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGQEREF VV WFRQAQGQEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV WFRQAQGKEREF VV	AISSSGNYKYDS VSLEG AISSGGGYIYDS VSLEG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSGGYIYDSV SLQG AISSGGYKYDSV SLEG AISSGGYIYDSV SLQG AISSGGYIYDSV SLQG AISSSGNYKYDS VSLEG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSSGNYKYDS ASLEG AISSGGFIYDAV SLEG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSGGFIYDAV SLEG AISSGGFIYDAV SLEG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSGGYIYDSV SLQG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSGGYKYDAV SLEG AISSSGGYIYDS VSLEG AISSSGNYKYDS VSLEG	RFTISRDNTKNTVYLQT NSLKPKDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTADYYCAA RFTISRDNSKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTQNTVYLQI NSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT NSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTADYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTADYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT NSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEGTAVYYCAA RFTISRDNTKNAVYLQT PSLKPEDTADYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTADYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRENTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQM PSLKPEDTADYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDAADYYCAA RFTISRDNTRNTVYLQT PSLKPEDTADYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA RFTISRDNTKNTVYLQT NSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLGDTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLPGTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSGRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLGDTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLGDTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD S RAYAS S RLRLADTYD SRAYGSSRLRLADTYD SRAYGSSRLRLGDTYD	WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTRVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S WGQGTQVTVS S
VEGFBII 62F02/46	EVQLVESGGGLVQ PGDSLKLSCAFSG RTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREF VV	AIASGGYIYDAV SLEG	RFTISRDNTKDTVYLQT PSLKPEDTAVYYCAA	SRAYGSSRLRLADTYD	WGQGTQVTVS S

Скорости диссоциации ингибирующих VHH анализировали с помощью Biacore-анализа (устройство Biacore T100, фирма GE Healthcare). Буфер HBS-ЕР+ применяли в качестве подвижного буфера и эксперименты проводили при 25°С. Рекомбинантный человеческий VEGF165 необратимо иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 посредством аминного сочетания (используя EDC и NHS) до достижения требуемого уровня +/- 1500RU. После иммобилизации поверхности дезактивировали с помощью 10минутной инъекции 1М этаноламина, рН 8,5. Референс-поверхность активировали и дезактивировали с помощью EDC/NHS и этаноламина соответственно. Периплазматические экстракты, содержащие VHH, инъецировали в виде 10-кратного разведения в подвижном буфере в течение 2 мин со скоростью потока 45 мкл/мин и давали пройти реакции диссоциации в течение 10 или 15 мин. Между введениями различных образцов поверхности регенерировали с помощью буфера для регенерации. Данные соотносили с двумя референс-вариантами путем вычитания кривых, соответствующих референс-каналу, и соответствующих пустому варианту, для создания которого осуществляли инъекцию только подвижного буфера. Обработанные кривые оценивали путем подгонки с использованием модели двухфазного расщепления с помощью программного обеспечения Biacore T100 Evaluation v2.0.1. Величины kd для быстрой фазы и kd для медленной фазы и % быстрой фазы приведены в табл. 4.

- 34 036746

Таблица 4. Скорости диссоциации блокирующих рецептор анти-VEGF VHH, определенные с помощью Biacore-анализа

В-клеточная линия дифференцировки	Уникальный вариант последовательности	ID репрезентативных VHH	к(1(быстрая фаза)	к()(медленная фаза)	% быстрой фазы	Уровень связывания (RU)
1	1	VEGFBII22B07	1,50Е-02	7,80Е-05	31	328
1	2	VEGFBII23A08	1,ЗОЕ-02	5,00Е-05	19	502
1	3	VEGFBII23B04	8,80Е-03	4,00Е-05	12	768
1	4	VEGFBII27D08	2,40Е-02	8Д0Е-05	13	225
1	5	VEGFBII24C04	1,ЗОЕ-02	3,40Е-05	17	456
1	6	VEGFBII27G07	1,ЗОЕ-02	3,80Е-05	18	471
1	7	VEGFBII22E04	1,80Е-02	1Д0Е-04	14	520
1	8	VEGFBII23A03	1,50Е-02	3,20Е-05	15	487
1	9	VEGFBII22B06	3,80Е-02	9,00Е-05	23	168
1	10	VEGFBII23A09	2,70Е-02	4,60Е-05	20	247
1	11	VEGFBII23G03	2,80Е-02	8,60Е-05	28	141
1	12	VEGFBII22A11	2,20Е-02	4,70Е-05	12	461
1	13	VEGFBII23A06	1,70Е-02	3,70Е-05	13	547
1	14	VEGFBII23F11	2,70Е-02	1,ЗОЕ-04	22	134
1	15	VEGFBII22A10	3,70Е-02	4,00Е-05	19	229
1	16	VEGFBII23F05	1,60Е-02	1,ЗОЕ-04	29	198
1	17	VEGFBII23D11	1,90Е-02	5,80Е-05	13	510
1	18	VEGFBII23F02	N/d	n/d	n/d	n/d
1	19	VEGFBII23E05	1,50Е-02	6,90Е-05	18	275
1	20	VEGFBII31C07	3,70Е-02	1,50Е-04	25	77
1	21	VEGFBII3OCO9	1,50Е-02	7,60Е-05	19	264
1	22	VEGFBII30E07	1,70Е-02	1,ЗОЕ-04	29	226
1	23	VEGFBII39G04	1,40Е-02	7,40Е-04	40	210
1	24	VEGFBII41G03	1,20Е-02	2,70Е-04	20	332
1	25	VEGFBII41B05	1,90Е-02	1,20Е-04	16	324
1	26	VEGFBII40F02	1,20Е-02	9,80Е-05	20	258
1	27	VEGFBII39E02	1,90Е-02	2,40Е-04	13	181
1	28	VEGFBII42D05	3,ЗОЕ-02	1,50Е-04	26	77
1	29	VEGFBII40G07	1,80Е-02	3,20Е-04	19	139
1	30	VEGFBII42A05	1,60Е-02	3,40Е-04	25	118
1	31	VEGFBII42F11	9Д0Е-03	5,00Е-04	46	100
1	32	VEGFBII40H10	1,40Е-02	2,90Е-04	17	200
1	33	VEGFBII62A09	4.10Е-02	1Д0Е-04	23	84
1	34	VEGFBII60A09	3,70Е-02	9,ЗОЕ-05	20	106
1	35	VEGFBII62F02	1,40Е-02	8,50Е-05	21	205
1	36	VEGFBII62D10	1,90Е-02	1,60Е-04	40	94
1	37	VEGFBII61A01	7,40Е-03	1,70Е-04	21	275
1	38	VEGFBII56E11	3,ЗОЕ-02	1,40Е-04	24	76

n/d, не определяли.

Пример 5.

Характеризация очищенных анти-VEGF VHH Три обладающих ингибирующим действием антиVEGF VHH VEGFBII23B04, VEGFBII24C4 и VEGFBII23A6 отбирали для дополнительной характеризации в виде очищенных белков. Эти VHH экспрессировали в клетках Е. coli TG1 в виде меченных c-myc, His6 белков. Экспрессию индуцировали путем добавления 1 мМ ИПТГ и давали осуществляться в течение 4 ч при 37°С. После центрифугирования клеточных культур получали периплазматические экстракты путем замораживания-оттаивания дебриса. Эти экстракты использовали в качестве исходного материала для очистки VHH с помощью ИМАХ (хроматография на иммобилизованном металле) и гельфильтрации (ГФ). Конечные VHH-препараты имели чистоту 95% по данным анализа методом ДСНПААГ.

5.1. Оценка способности VHH блокировать взаимодействие: человеческий VEGF165/VEGFR2 с помощью ELISA, предназначенного для определения блокирующего действия в отношении взаимодейст

- 35 036746 вия: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR2-Fc.

Блокирующую способность VHH оценивали с помощью ELISA, предназначенного для определения блокирующего действия в отношении взаимодействия: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR2Fc. В целом, метод состоял в следующем: содержащую VEGFR2-Fc химеру (1 мкг/мл) (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) применяли для сенсибилизации 96-луночного планшета MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Серии разведений (в диапазоне концентраций от 1 мМ до 64 пМ) очищенных VHH в ЗФР-буфере, содержащем 0,1% казеина и 0,05% Твин 20 (фирма Sigma), инкубировали в присутствии 4 нМ биотинилированного VEGF165. Остаточное связывание bio-VEGF165 с VEGFR2 выявляли с помощью конъюгированного с пероксидазой из хрена (HRP) экстравидина (фирма Sigma, Сент-Луис, шт. Миссури, США) и ТМВ в качестве субстрата. В качестве контролей применяли параллельно бевацизумаб (Avastin® ) и ранибизумаб (Lucentis®). Кривые зависимости ингибирования от дозы представлены на фиг. 1, соответствующие значения IC₅₀ и величины процента ингибирования обобщены в табл. 5.

Таблица 5. Значения IC₅₀ (нМ) и % ингибирования для одновалентных VHH, установленные с помощью конкурентного ELISA, характеризующие способность ингибировать взаимодействие hVEGF 165/hVEGFR2-Fc

VHH ID	1С50 (нМ)	% ингибирования
VEGFBII23B04	2,1	100
VEGFBII23A06	3,0	100
VEGFBII24C04	2,5	100
ранибизумаб	1,6	100
бевацизумаб	1,7	100

5.2. Оценка способности VHH блокировать взаимодействие: человеческий VEGF165/VEGFR1 с помощью ELISA, предназначенного для определения блокирующего действия в отношении взаимодействия: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR1-Fc.

VHH оценивали также с помощью ELISA, предназначенного для определения блокирующего действия в отношении взаимодействия: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR1-Fc. В целом, метод состоял в следующем: содержащую VEGFR1-Fc химеру (2 мкг/мл) (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) применяли для сенсибилизации 96-луночного планшета MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Серии разведений (в диапазоне концентраций от 1мМ до 64пМ) очищенных VHH в ЗФР-буфере, содержащем 0,1% казеина и 0,05% Твин 20 (фирма Sigma), инкубировали в присутствии 0,5 нМ биотинилированного VEGF165. Остаточное связывание bio-VEGF165 с VEGFR1 выявляли с помощью конъюгированного с пероксидазой из хрена (HRP) экстравидина (фирма Sigma, Сент-Луис, шт. Миссури, США) и ТМВ в качестве субстрата. В качестве контролей во всех случаях применяли бевацизумаб, ранибизумаб и несоответствующий VHH (2E6). Кривые зависимости ингибирования от дозы представлены на фиг. 2; соответствующие значения IC₅₀ и % ингибирования обобщены в табл. 6.

Таблица 6. Значения IC₅₀ (нМ) и % ингибирования для одновалентных VHH, установленные с помощью конкурентного ELISA, характеризующие способность ингибировать взаимодействие:

hVEGF 165/hVEGFR1 -Fc

VHH ID	1С50 (нМ)	% ингибирования
VEGFBII23B04	0,5	64
VEGFBII23A06	0,9	55
VEGFBII24C04	0,8	71
ранибизумаб	1,2	91
бевацизумаб	1,5	96

5.3 Оценка анти-VEGF165 VHH с помощью AlphaScreen-анализа, предназначенного для определения способности блокировать взаимодействие: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR2-Fc.

Блокирующую способность VHH оценивали также с помощью AlphaScreen-анализа, предназначенного для оценки блокирующего действия в отношении взаимодействия: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR2-Fc. В целом, метод состоял в следующем: серийные разведения очищенных VHH (в диапазоне концентраций от 200нМ до 0,7 пМ) в ЗФР-буфере, содержащем 0,03% Твин 20 (фирма Sigma), добавляли к 4 пМ bio-VEGF165 и инкубировали в течение 15 мин. Затем добавляли VEGFR2-Fc (0,4 нМ) и сенсибилизированные анти-Fc VHH акцепторные гранулы (20 мкг/мл) и указанную смесь инкубировали в течение 1 ч в темноте. И, наконец, добавляли покрытые стрептавидином донорские гранулы (20 мкг/мл) и после инкубации в течение 1 ч в темноте измеряли флуоресценцию с помощью ридера для микропланшетов типа Envision. Кривые дозовой зависимости представлены на фиг. 3. Значения IC₅₀, характеризующие способность VHH блокировать взаимодействие человеческий VEGF165-человеческий VEGFR2-Fc, обобщены в табл. 7.

- 36 036746

Таблица 7. Значения IC50 (пМ) и % ингибирования для VHH, установленные с помощью конкурентного

AlphaScreen, характеризующие способность ингибировать взаимодействие: hVEGF165/hVEGFR2-Fc

VHH ID	1С50 (пМ)	% ингибирования
VEGFBII23B04	160	100
VEGFBII23A06	250	100
VEGFBII24C04	250	100
Ранибизумаб	860	100

5.4. Оценка анти-VEGF165 VHH с помощью AlphaScreen-анализа, предназначенного для определения способности блокировать взаимодействие: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR1-Fc.

Блокирующую способность VHH оценивали также с помощью AlphaScreen-анализа, предназначенного для оценки блокирующего действия в отношении взаимодействия: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR1-Fc. В целом, метод состоял в следующем: серийные разведения очищенных VHH (в диапазоне концентраций от 500 нМ до 1,8 пМ) в ЗФР-буфере, содержащем 0,03% Твин 20 (фирма Sigma), добавляли к 4 нМ bio-VEGF165 и инкубировали в течение 15 мин. Затем добавляли VEGFR1-Fc (1нМ) и сенсибилизированные анти-Fc VHH акцепторные гранулы (20 мкг/мл) и указанную смесь инкубировали в течение 1 ч в темноте. И, наконец, добавляли покрытые стрептавидином донорские гранулы (20 мкг/мл) и после инкубации в течение 1 ч в темноте измеряли флуоресценцию с помощью ридера для микропланшетов типа Envision. Кривые дозовой зависимости представлены на фиг. 4. Значения IC₅₀, характеризующие способность VHH блокировать взаимодействие: человеческий VEGF165-человеческий VEGFR1-Fc, и величины % ингибирования обобщены в табл. 8.

Таблица 8. Значения IC₅₀ (нМ) и % ингибирования для VHH, установленные с помощью конкурентного AlphaScreen, характеризующие способность ингибировать взаимодействие: hVEGF165/hVEGFR1-Fc

VHH ID	IC50 (нМ)	% ингибирования
VEGFB II23B04	θ,9	41
VEGFB II23A06	0,4	46
VEGFB II24C04	0,2	53
ранибизумаб	3,3	79

5.5. Определение аффинности взаимодействия: человеческий VEGF165-VHH.

Кинетические характеристики связывания VHH VEGFBII23B4 с hVEGF165 анализировали с помощью SPR с использованием устройства Biacore T100. Рекомбинантный человеческий VEGF165 иммобилизовали непосредственно на СМ5-чипе путем аминного сочетания (с использованием EDC и NHS). VHH анализировали в различных концентрациях, находящихся в пределах от 10 до 360.нМ. Образцы инъецировали в течение 2 мин и давали пройти реакции диссоциации в течение вплоть до 20 мин при скорости потока 45 мкл/мин. Между инъекциями образцов поверхность чипа регенерировали с помощью 100мМ HCl. HBS-EP+ (Hepes-буфер, рН 7,4 + ЭДТК) применяли в качестве подвижного буфера. Кривые связывания аппроксимировали с помощью модели реакции между двумя состояниями с использованием программного обеспечения Biacore T100 Evaluation v2.0.1. Данные о рассчитанных величинах аффинности анти-VEGF VHH представлены в табл. 9.

Таблица 9. Аффинность KD (нМ) очищенных VHH к рекомбинантному человеческому VEGF165

	VEGF 165
VHH ID	ka (M-V1)	kal (M^c1)	ka2 (M-V1)	kd (c-1)	kdi (c-1)	kd2 (c-1)	KD (hM)
VEGFB II23B04(a)	-	2ДЕ+05	l,4E-02	-	8,6E-03	2,4E-04	0.7
VEGFB II23A06(a)	-	4,2E+05	2,0E-02	-	5,7E-02	l,0E-04	0.7
VEGFB II24C04(a)	-	3,2E+05	l,8E-02	-	2,6E-02	9,6E-05	0.4

(а) гетерогенная кривая связывания приводила к невозможности осуществления аппроксимации с использованием модели 1:1, кривые аппроксимировали на основе модели реакции с двумя состояниями с использованием программного обеспечения Biacore T100 Evaluation v2.0.1.

5.6. Связывание с мышиным VEGF164.

Перекрестную реактивность с мышиным VEGF164 определяли с помощью предназначенного для оценки связывания ELISA. В целом, метод состоял в следующем: рекомбинантный мышиный VEGF164 (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) (1 мкг/мл) применяли для сенсибилизации в течение ночи при 4°С 96-луночного планшета MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали раствором казеина (1% в ЗФР). VHH вносили в виде серийных разведений (диапазон концентраций: 500 нМ - 32 пМ) в ЗФР-буфере, содержащем 0,1% казеина и 0,05% Твин 20 (фирма Sigma), и связывание оценивали с помощью мышиного антитела к myc (фирма Roche) и антимышиного антитела, конъюгированного с HRP (фирма DAKO), и последующей ферментативной реакции в присутствии субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) (фирма Pierce, Рокфорд, шт. Иллинойс, США) (фиг. 5). МАт, вступающее в реакцию с мышиным VEGF164, применяли в качестве положительного контроля. В каче- 37 036746 стве эталона оценивали также связывание с человеческим VEGF165. Значения ЕС₅₀ обобщены в табл. 10.

Таблица 10. Значения EC₅₀ (пМ), характеризующие связывание VHH с рекомбинантным человеческим VEGF165 и мышиным VEGF164, установленные с помощью ELISA

	RhVEGF165	RmVEGF164
VHH ID	ЕС50 (пМ)	ЕС50 (пМ)
VEGFBII23B04	297	NB
VEGFBII24C04	453	NB
VEGFBII23A06	531	NB

NB - отсутствие связывания.

5.7. Связывание с VEGF121.

Связывание с рекомбинантным человеческим VEGF121 определяли с помощью ELISA, предназначенного для оценки связывания на твердой фазе. В целом, метод состоял в следующем: рекомбинантный человеческий VEGF121 (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) (1 мкг/мл) применяли для сенсибилизации в течение ночи при 4°С 96-луночного планшета MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали раствором казеина (1% в ЗФР). VHH вносили в виде серийных разведений (диапазон концентраций: 500 нМ - 32 пМ) в ЗФР-буфере, содержащем 0,1% казеина и 0,05% Твин 20 (фирма Sigma), и связывание оценивали с помощью мышиного антитела к myc (фирма Roche) и антимышиного антитела, конъюгированного с HRP (фирма DAKO), и последующей ферментативной реакции в присутствии субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) (фирма Pierce, Рокфорд, шт. Иллинойс, США) (фиг. 6). В качестве положительного контроля во всех случаях использовали серийные разведения VEGFR2. Значения EC₅₀ обобщены в табл. 11.

Таблица 11. Значения ЕС₅₀(пМ), характеризующие связывание одновалентных VHH с рекомбинантным человеческим VEGF121, установленные с помощью ELISA

VHH ID	EC50 (пМ)
VEGFB II23B04	510
VEGFB II24C04	792
VEGFB II23A06	928

5.8 Связывание с представителями семейства VEGF VEGFB, VEGFC, VEGFD и P1GF.

Связывание с VEGFB, VEGFC, VEGFD и P1GF определяли с помощью ELISA, предназначенного для оценки связывания на твердой фазе. В целом, метод состоял в следующем: VEGFB, VEGFC, VEGFD и P1GF (фирма R&D Systems, Миннеаполис, шт. Миннесота, США) (1 мкг/мл) применяли для сенсибилизации в течение ночи при 4°С 96-луночного планшета MaxiSorp (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали раствором казеина (1% в ЗФР). VHH вносили в виде серийных разведений (диапазон концентраций: 500 нМ - 32 пМ) и связывание оценивали с помощью мышиного антитела к myc (фирма Roche) и антимышиного антитела, конъюгированного с АР (фирма Sigma, Сент-Луис, шт. Миссури, США). В качестве положительных контролей параллельно использовали серийные разведения соответствующих рецепторов и для обнаружения применяли конъюгированное с пероксидазой из хрена (HRP) козье антитело к человеческому IgG, Fc-специфическое (фирма Jackson Immuno Research Laboratories Inc., Вест-Гров, шт. Пенсильвания, США), и последующую ферментативную реакцию в присутствии субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) (Pierce, Рокфорд, шт. Иллинойс, США). Кривые дозовой зависимости для VHH и контролей представлены на фиг. 7. Результаты свидетельствуют об отсутствии выявляемого связывания выбранных VHH с VEGFB, VEGFC, VEGFD или P1GF.

5.9. Группировка эпитопов.

Основанные на Biacore-анализе эксперименты по группировке эпитопов осуществляли с целью решения вопроса о том, какие связывающие VEGF агенты связываются с эпитопами, которые являются сходными или перекрывающимися с эпитопами VEGFBII23B04. Для этой цели VEGFBII23B04 иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5. Для каждого образца человеческий VEGF165 пропускали по поверхности чипа и обратимо иммобилизовали с помощью VEGFBII23B4. Затем очищенные VHH (100 нМ) или периплазматические экстракты (разведение 1/10) инъецировали так, чтобы время контакта с поверхностью составляло 240 с при скорости потока 10 мкл/мин. Между экспериментами с использованием различных образцов поверхность регенерировали с помощью буфера для регенерации (100 мМ HCl). Обработанные кривые оценивали с использованием программного обеспечения Biacore T100. Установлено, что VHH можно разделить на две группы: первая группа, для которой характерно дополнительное связывание с захваченным с помощью VEGFBII23B04 VEGF165, и вторая группа, для которой не обнаружена способность одновременно связываться с захваченным с помощью VEGFBII23B04 VEGF165. В табл. 12-А обобщены данные о группировке эпитопов оцененных VHH.

Такой же анализ применяли для решения вопроса о том, могут ли VEGFR1, VEGFR2, ранибизумаб и бевацизумаб связываться с человеческим VEGF-165 одновременно с VEGFBII23B04. В табл. 12-Б представлены данные о дополнительном связывании с захваченным с помощью VEGFBII23B04 VEGF165. Только VEGFR2 не обладал способностью связываться с захваченным с помощью

- 38 036746

VEGFBII23B04 VEGF165, что подчеркивает блокирующее действие VEGFBII23B04 в отношении взаимодействия VEGF-VEGFR2. Кроме того, указанные данные демонстрируют, что распознаваемый

VEGFBII23B04 эпитоп не соответствует эпитопу, распознаваемому бевацизумабом и ранибизумабом.

Таблица 12-А. Группировка эпитопов анти-VEGF VHH - одновременное связывание с

VEGFBII23B04

Дополнительное	1С02	1Е07	4В08	8Е07	8F07	12А07	12В01	86С11	86F11	86G08 |
связывание отсутствует или имеет место низкое дополнительное связывание с	86G10	86G11	87В07	88А01	88А02	88В02	88Е02	88G03	88G05	88G11
«захваченным» с помощью 23В04 VEGF165*	88Н01	89В04	89D04	89F09	89G09	89Н08	24С04	23А6	27G07	23В04
Имеет место дополнительное связывание с	3D12	5В02	5В03	5В05	6G02	7D08	8D09	8F06	10С07	10Е07
«захваченным» с	10G04	10G05	11С08	11D09	11Е04	11Е05	11F12	86Н09	41С05

помощью 23В04

VEGF165 * свидетельствует о наличии таких же или перекрывающихся эпитопов.

Таблица 12-Б. Группировка эпитопов VEGFBII23B04 - связывание эталонных (benchmark) ингибиторов или когнатных рецепторов с захваченным с помощью VEGFBII23B04 VEGF165

Стадия инъекции	Связывающий агент	Концентрация образца	Уровень связывания (RU)
1	VEGF165	ЮОнМ	1727
2	VEGFBII23B04	ЮОнМ	-
3	ранибизумаб	ЮОнМ	763
4	бевацизумаб	ЮОнМ	1349
5	VEGFR1	ЮОнМ	1011
6	VEGFR2	ЮОнМ	-

5.10. Характеризация анти-VEGF VHH с помощью анализа пролиферации клеток HUVEC.

Эффективность отобранных VHH оценивали с помощью анализа пролиферации. В целом, метод состоял в следующем: прежде всего HUVEC-клетки (фирма Technoclone) выращивали в минимальной среде в течение ночи и затем высевали в четырех повторностях по 4000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты для культуры ткани. Клетки стимулировали в течение 5 мин с помощью 33 нг/мл VEGF в отсутствии или в присутствии VHH. Уровни пролиферации измеряли по включению [³Н]-тимидина в день 4. Результаты анализа пролиферации HUVEC, представленные в табл. 13.

Таблица 13. Значения IC₅₀ (нМ) и % ингибирования для одновалентных VEGFBII23B04, VEGFBII23A06 и VEGFBII24C04, установленные в анализе индуцируемой VEGF пролиферации клеток HUVEC

VHH ID	IC50 (нМ)	% ингибирования
VEGFBII23B04	0,36	91

бевацизумаб 0,21 92

бевацизумаб

0,21

92

VHH ID	IC50(нм)	% ингибирования
VEGFBII23A06	4,29	73
VEGFBII24C04	3,8	79
бевацизумаб	0,78	78

5.11. Характеризация анти-VEGF VHH с помощью анализа фосфорилирования Erk в клетках HU-

VEC.

Эффективность отобранных VHH оценивали с помощью анализа фосфорилирования Erk в клетках HUVEC. В целом, метод состоял в следующем: прежде всего HUVEC-клетки выращивали в минимальной среде в течение ночи, затем стимулировали с помощью 10 нг/мл VEGF в течение 5 мин в отсутствии или в присутствии VHH. Клетки фиксировали 4% формальдегида в ЗФР и уровни фосфорилирования ERK оценивали с помощью ELISA, используя специфические для фосфо ERK антитела (антитело к фосфоМАР-киназе pERK1/2, M8159, фирма Sigma) и поликлональное кроличье антитело к мышиному иммуноглобулину, конъюгированное с HRP (PO161, фирма Dako). Как видно из табл. 14, VEGFBII23B4 и бевацизумаб ингибировали индуцируемое VEGF фосфорилирование Erk по меньшей мере на 90%, что характеризовалось значениями IC₅₀ <1 нМ.

- 39 036746

Таблица 14. Значения IC50 (нМ) и % ингибирования для одновалентных VEGFBII23B04, полученные в анализе индуцируемого VEGF фосфорилирования Erk в клетках HUVEC

VHH ID	IC50 (нМ)	% ингибирования
VEGFBII23B04	0,37	90
бевацизумаб	0,63	98

Пример 6.

Создание многовалентных блокирующих анти-VEGF VHH VHH VEGFBII23B04 сливали генетически либо с VEGFBII23B04 с получением гомодимерного VHH (АК-последовательности см. в табл.15), либо с другими VEGF-связывающими VHH с получением гетеродимерных VHH. Для создания гетеродимерных VHH соединяли VHH из панели, включающей 10 уникальных VEGF-связывающих VHH, через состоящий из 9 или 40 Gly-Ser гибкий линкер в двух различных ориентациях относительно VEGFBII23B04 (АК-последовательности см. в табл.15). Гомодимерный VEGFBII23B04 (VEGFBII010) и 40 гетеродимерных двухвалентных VHH экспрессировали в клетках Е. coli TG1 в виде меченных c-myc, His6 белков. Экспрессию индуцировали путем добавления 1мМ ИПТГ и давали продолжаться в течение 4 ч при 37°С. После центрифугирования клеточных культур получали периплазматические экстракты путем замораживания-оттаивания дебриса. Эти экстракты применяли в качестве исходного материла и VHH очищали с помощью ИМАХ и обессоливали до достижения чистоты 90% по данным ДСН-ПААГ.

Таблица 15. ID последовательностей, ID VHH и АК-последовательности двухвалентных анти-VEGF VHH (каждый из применяемых линкеров выделен цветом в одной из соответствующих последовательностей)

ID последовательностей/ SEQ ID NO:	ID VHH	AK последовательности
VEGFBH23B04-35GS23В04/128	VEGFBII010	EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGT QVTVSS
VEGFBII23B04-9GS4В08/129		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGSAVGDITVAWYRQAPGIQRQLVATITPSGYTYYWDFVKGRFTISRDNSKNI VYLQMNSLKPEDTAAYYCNTQFYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS5В03/130		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLAQAGDSLRLSCAASGRSFSHYNMGWFRQAPGKEREFVASIRGGGGSTTYANSVKDRFTISRENAK NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATAFYRGPYDYDYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS5В05/131	VEGFBII022	EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTV YLQMNSLKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS6G02/132		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIFSNNAMAWYRQAPGKQRELVARISSGGGFTYYLDSVKGRFTVSRDNAK NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAAYRTYNYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS10Е07/133		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKERVLVADISSSGINTYVADAVKGRFTISRDNAK NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASAWWYSQMARDNYRYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS12В01/134		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQPGGSLRLACAASGFTLSSSWMYWVRQAPGKGLEWVSRISPGGLFTYYVDSVKGRFSVSTDNA NNTLYLQMNSLKPEDTALYSCAKGGAPNYTPRGRGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS86С11/135		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQAGDSLRLSCTASGRTFNSYAMGWFRQAPGKERESVAHINRSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAK NTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAAGRYYSSDGVPSASFNYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS86Н09/136		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQAGGSLRLSCTASGSAFKSYRMGWFRRTPGKEDEFVASISWTYGSTFYADSVKGRFTMSRDKA KNAGYLQMNSLKPEDTALYYCAAGAQSDRYNIRSYDYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS87В07/137		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQPGGSLKLSCTASGFTFSTSWMHWVRQAPGKGLEWVSSIPPVGHFANYAPSVKGRFTISRDNAK NTLFLQMNSLKSEDTAVYYCAKDSAGRTKGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-9GS88А01/138		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFSNYAMDWFRQAPGKEREFVAAITRSGGGTYYADSVKGRFTISRDNAK NT VYLQMNSLKPEDT AVYYC AATRS STI VVGVGGMEYWGKGTQ VT V S S
VEGFBII23B04-40GS4В08/139		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSAVGDITVAWYRQAPGIQ RQLVATITPSGYTYYWDFVKGRFTISRDNSKNIVYLQMNSLKPEDTAAYYCNTQFYWGQGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS5В03/140		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLAQAGDSLRLSCAASGRSFSHYNMGWFRQAPGK EREFVASIRGGGGSTTYANSVKDRFTISRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATAFYRGPYDYDYWG QGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS5В05/141	VEGFBII021	EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHR ELVARISSGGTTAYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSS
VEGFBII23B04-40GS- 6G02/142		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIFSNNAMAWYRQAPGK QRELVARISSGGGFTYYLDSVKGRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAAYRTYNYWGQGTQ VTVSS
VEGFBII23B04-40GS10Е07/143	VEGFBII023	EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVATSKGGYKYDSVSLEGRFTTSK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGK ERVLVADISSSGINTYVADAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASAWWYSQMARDNY RYWGQGTQVTVSS

- 40 036746

VEGFBII23B04-40GS12B01/144		EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTLSSSWMYWVRQAPGK GLEWVSRISPGGLFTYYVDSVKGRFSVSTDNANNTLYLQMNSLKPEDTALYSCAKGGAPNYTPRGRGTQV TVSS
VEGFBII23B04-40GS86C11/145 VEGFBII23B04-40GS86H09/146 VEGFBII23B04-40GS87B07/147 VEGFBII23B04-40GS88A01/148 VEGFBII4B08-9GS23B04/149 VEGFBII5B03-9GS23B04/150 VEGFBII5B05-9GS23B04/151 VEGFBII6G02-9GS23B04/152	VEGFBII024	EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTASGRTFNSYAMGWFRQAPGK ERESVAHINRSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAAGRYYSSDGVPSASFN YWGQGTQVTVSS EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSAFKSYRMGWFRRTPGK EDEFVASISWTYGSTFYADSVKGRFTMSRDKAKNAGYLQMNSLKPEDTALYYCAAGAQSDRYNIRSYDY WGQGTQVTVSS EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFTFSTSWMHWVRQAPGK GLEWVSSIPPVGHFANYAPSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAVYYCAKDSAGRTKGQGTQVTV SS EVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISK DNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFSNYAMDWFRQAPGK EREFVAAITRSGGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATRSSTIVVGVGGMEY WGKGTQVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSAVGDITVAWYRQAPGIQRQLVATITPSGYTYYWDFVKGRFTISR DNSKNIVYLQMNSLKPEDTAAYYCNTQFYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRL SCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTA VYYCASSRAYGSSRLRLADTYEY WGQGTQVTVSS EVQLVESGGGLAQAGDSLRLSCAASGRSFSHYNMGWFRQAPGKEREFVASIRGGGGSTTYANSVKDRFTI SRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATAFYRGPYDYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESG GGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTV YLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTTAYVDSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQTGDS LRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPE DTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIFSNNAMAWYRQAPGKQRELVARISSGGGFTYYLDSVKGRFTV SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAAYRTYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV QTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQIN SLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII10E07-9GS23B04/153		EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKERVLVADISSSGINTYVADAVKGRFTI SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASAWWYSQMARDNYRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQL VESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNA KNT VYLQINSLKPEDT AVYYC AS SRAYGS SRLRL ADTYEY WGQGTQ VT VS S
VEGFBII12B01-9GS23B04/154		EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTLSSSWMYWVRQAPGKGLEWVSRISPGGLFTYYVDSVKGRFS VSTDNANNTLYLQMNSLKPEDTALYSCAKGGAPNYTPRGRGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV QTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQIN SLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII86C11-9GS23B04/155		EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTASGRTFNSYAMGWFRQAPGKERESVAHINRSGSSTYYADSVKGRFTI SRDNAKNTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAAGRYYSSDGVPSASFNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQL VESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNA KNT VYLQINSLKPEDT AVYYC AS SRAYGS SRLRL ADTYEY WGQGTQVTVSS
VEGFBII86H09-9GS23B04/156		EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSAFKSYRMGWFRRTPGKEDEFVASISWTYGSTFYADSVKGRFTM SRDKAKNAGYLQMNSLKPEDTALYYCAAGAQSDRYNIRSYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKN TVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII87B07-9GS23B04/157		EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFTFSTSWMHWVRQAPGKGLEWVSSIPPVGHFANYAPSVKGRFTI SRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAVYYCAKDSAGRTKGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQT GDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSL KPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII88A01-9GS23B04/158		EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFSNYAMDWFRQAPGKEREFVAAITRSGGGTYYADSVKGRFTI SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATRSSTIVVGVGGMEYWGKGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLV ESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAK NT VYLQINSLKPEDT AVYYC AS SRAYGS SRLRL ADTYEYWGQGTQVT VS S
VEGFBII4B08-40GS23B04/159		EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSAVGDITVAWYRQAPGIQRQLVATITPSGYTYYWDFVKGRFTISR DNSKNIVYLQMNSLKPEDTAAYYCNTQFYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKGGYK YDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVSS
VEGFBII5B03-40GS23B04/160		EVQLVESGGGLAQAGDSLRLSCAASGRSFSHYNMGWFRQAPGKEREFVASIRGGGGSTTYANSVKDRFTI SRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATAFYRGPYDYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKER EFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYW GQGTQVTVSS
VEGFBII5B05-40GS23B04/161		EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFMSMAWYRQAPGKHRELVARISSGGTTAYVDSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTFSSRPNPWGAGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISKG GYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTVS S
VEGFBII6G02-40GS23B04/162		EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNIFSNNAMAWYRQAPGKQRELVARISSGGGFTYYLDSVKGRFTV SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAAYRTYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVA ISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQ VTVSS
VEGFBII10E07-40GS23B04/163	VEGFBII025	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKERVLVADISSSGINTYVADAVKGRFTI SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASAWWYSQMARDNYRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQ GKEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTY EYWGQGTQVTVSS
VEGFBII12B01-40GS23B04/164		EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTLSSSWMYWVRQAPGKGLEWVSRISPGGLFTYYVDSVKGRFS VSTDNANNTLYLQMNSLKPEDTALYSCAKGGAPNYTPRGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVV AISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGT QVTVSS
VEGFBII86C11-40GS23B04/165		EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTASGRTFNSYAMGWFRQAPGKERESVAHINRSGSSTYYADSVKGRFTI SRDNAKNTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAAGRYYSSDGVPSASFNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQG KEREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYE YWGQGTQVTVSS
VEGFBII86H09-40GS23B04/166		EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSAFKSYRMGWFRRTPGKEDEFVASISWTYGSTFYADSVKGRFTM SRDKAKNAGYLQMNSLKPEDTALYYCAAGAQSDRYNIRSYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKE REFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRL ADTYEY WGQGTQVTVSS

VEGFBII87B07-40GS23B04/167		EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFTFSTSWMHWVRQAPGKGLEWVSSIPPVGHFANYAPSVKGRFTI SRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAVYYCAKDSAGRTKGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVVAISK GGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTQVTV SS
VEGFBII88A01-40GS23B04/168		EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTFSNYAMDWFRQAPGKEREFVAAITRSGGGTYYADSVKGRFTI SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATRSSTIVVGVGGMEYWGKGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCEVSGRTFSSYSMGWFRQAQGK EREFVVAISKGGYKYDSVSLEGRFTISKDNAKNTVYLQINSLKPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRL ADTYEY WGQGTQVTVSS

- 41 036746

Панель из 40 двухвалентных VHH тестировали в отношении способности блокировать VEGFR2 и VEGFR1 с помощью AlphaScreen-анализа, описанного в примерах 5.3 и 5.4 соответственно. На основе эффективности и максимального уровня ингибирования выбирали пять самых перспективных двухвалентных VHH (VEGFBII021, VEGFBII022, VEGFBI023, VEGFBI024 и VEGFBII025) для дополнительной характеризации. Обзор результатов скрининга пяти отобранных двухвалентных VHH, проведенного с помощью конкурентного AlphaScreen-анализа в отношении VEGFR2 и VEGFR1, представлен в таблице 16.

Таблица 16. Сила и эффективность пяти отобранных двухвалентных VHH в отношении взаимодействия: VEGF/VEGFR1 и VEGF/VEGFR2, установленные с помощью конкурентного AlphaScreen-анализа

VHH ID	VEGFR2	VEGFR1
	IC50 (пМ)	IC50 (nM)	% ингибирования
VEGFBII021	9	16	100
VEGFBII022	7	8	100
VEGFBII023	38	44	91
VEGFBII024	12	46	100
VEGFBII025	51	39	82

Пример 7. Характеризация форматированных анти-VEGF VHH.

VHH VEGFBII010, VEGFBII021, VEGFBII022, VEGFBII023, VEGFBII024 и VEGFBII025 сравнивали в параллельных опытах в отношении блокирования VEGFR2 и VEGFR1 с помощью ELISA (фиг. 8 и 9, табл. 17 и 18 соответственно) и AlphaScreen-анализа (фиг. 10 и 11, табл. 19 и 20) согласно методам, описанным в примерах 5.1, 5.2, 5.3 и 5.4 соответственно.

Таблица 17. Значения IC₅₀ (пМ) и % ингибирования для форматированных VHH, установленные с помощью конкурентного ELISA, характеризующие способность ингибировать взаимодействие:

hVEGF 165/hVEGFR2-Fc

VHH ID	ic50 (nM)	% ингибирования
VEGFBII010	49	100
VEGFBII021	204	100
VEGFBII022	164	100
VEGFBII023	213	100
VEGFBII024	292	100
VEGFBII025	577	100
бевацизумаб	315	100
ранибизумаб	349	100

Таблица 18. Значения IC₅₀ (пМ) и % ингибирования для форматированных VHH, установленные с помощью конкурентного ELISA, характеризующие способность ингибировать взаимодействие hVEGF 165/hVEGFR1-Fc

VHH ID	IC50 (пМ)	% ингибирования
VEGFBII010	73,5	67
VEGFBII021	254	97
VEGFBII022	225	89
VEGFBII023	279	91
VEGFBII024	326	92
VEGFBII025	735	91
бевацизумаб	484	91
ранибизумаб	594	96

Таблица 19. Значения IC₅₀ (пМ) и % ингибирования для форматированных VHH, установленные с помощью конкурентного AlphaScreen-анализа, характеризующие способность ингибировать взаимодействие: hVEGF 165/hVEGFR2-Fc

VHH ID	IC5o (пМ)	% ингибирования
VEGFBII010	16	100
VEGFBII021	7	100
VEGFBII022	7	100
VEGFBII023	46	100
VEGFBII024	50	100
VEGFBII025	51	100
ранибизумаб	600	100

- 42 036746

Таблица 20. Значения IC50 (пМ) и % ингибирования для форматированных VHH, установленные с помощью конкурентного AlphaScreen-анализа, характеризующие способность ингибировать взаимодействие: hVEGF165/hVEGFR1-Fc

VHH ID	IC50 (пМ)	% ингибирования
VEGFBH010	21	70
VEGFBH021	12	100
VEGFBH022	9	98
VEGFBII023	48	87
VEGFBII024	69	98
VEGFBII025	71	82
ранибизумаб	1300	87

Кроме того, оценивали способность форматированных VHH блокировать взаимодействие mVEGF164/mVEGFR2-huFc. В целом, метод состоял в следующем; серийные разведения очищенных VHH (диапазон концентраций: 4 мкМ-14,5пМ) в ЗФР-буфере, содержащем 0,03% Твин 20 (фирма Sigma), добавляли к 0,1 нМ биотинилированному mVEGF164 и инкубировали в течение 15 мин. Затем добавляли комплекс мышиный VEGFR2-huFc (0,1 нМ) и сенсибилизированные анти-huFc VHH акцепторные гранулы (20 мкг/мл) и указанную смесь инкубировали в течение 1 ч. И, наконец, добавляли покрытые стрептавидином донорские гранулы (20 мкг/мл) и после инкубации в течение 1 ч оценивали флуоресценцию с помощью ридера для микропланшетов типа Envision. Кривые дозовой зависимости представлены на фиг. 12. Данные о значениях IC50 , характеризующие способность VHH блокировать взаимодействие мышиный VEGF164/VEGFR2-huFC, обобщены в табл. 21.

Таблица 21. Значения IC50 (пМ) и % ингибирования для форматированных анти-VEGF VHH, установленные с помощью конкурентного AlphaScreen-анализа, характеризующие способность ингибировать взаимодействие mVEGF164/m VEGFR2-hFc

VHH ID	ic50 (пМ)	% ингибирования
VEGFBH022	108	100
VEGFBII024	-	-
mVEGF164	0,05	100
ранибизумаб	-	-

Оценивали также с помощью ELISA способность форматированных VHH связываться с mVEGF164 и rhVEGF165 (пример 5.6; фиг. 13; табл. 22), VEGF121 (пример 5.7; фиг. 15; табл. 23) и с представителями семейства VEGF VEGFB, VEGFC, VEGFD и P1GF (пример 5.8; фиг. 14). Кинетические характеристики связывания с человеческим VEGF 165 анализировали согласно методу, изложенному в примере 5.5. Величины KD представлены в табл. 24.

Таблица 22. Значения IC₅₀ (пМ) для форматированных VHH, характеризующие связывани с рекомбинантным человеческим VEGF165 и мышиным VEGF164, установленные с помощью ELISA

	rhVEGF165	rmVEGF164
VHH ID	EC50 (nM)	EC50 (nM)
VEGFBII010	428	-
VEGFB 11021	334	502
VEGFB II022	224	464
VEGFB II023	221	-
VEGFB II024	320	-
VEGFB II025	668	-

Таблица 23. Значения IC₅₀ (пМ) для форматированных VHH, характеризующие связывание с рекомбинантным человеческим VEGF121, установленные с помощью ELISA

	rhVEGF121
VHH ID	EC50 (nM)
VEGFBII010	920
VEGFBII022	540
VEGFBII024	325
VEGFBH025	475

- 43 036746

Таблица 24. Аффинность K_D (нМ) очищенных форматированных VHH к рекомбинантному человеческому VEGF165

VHH ID	kai (1/Mc)	kdi (1/c)	ka2 (1/c)	kd2 (1/c)	Kd (hM)W
VEGFBH010 ®	4,5E+05	l,7E-02	2,9E-02	l,3E-04	0,16
VEGFBH021·:6’	l,2E+06	I,IE-02	2,3E-02	l,9E-04	0,07
VEGFBH022·:6’	l,2E+06	9,1E-O3	l,4E-02	2,6E-04	0,14
VEGFBII023(6)	3,0E+05	l,8E-02	2,4E-02	2,7E-04	0,69
VEGFBH024(6’	3,0E+05	l,3E-02	2,6E-02	2,8E-04	0,47
VEGFBH025(6’	3,3E+O5	l,7E-02	l,8E-02	3,7E-04	1,1

(а) KD=kdl/kal (k_a2/(kd2+ka2)) ;

(б) аппроксимацию кривых осуществляли на основе модели реакции с двумя состояниями с использованием программного обеспечения Biacore T100 Evaluation v2.0.1.

VHH VEGFBII010, VEGFBII022, VEGFBII024 и VEGFBII025 оценивали также в отношении опосредуемой VEGF пролиферации клеток HUVEC и фосфорилирования Erk.

Эффективность отобранных форматированных VHH оценивали с помощью анализа пролиферации. В целом, метод состоял в следующем: первичные клетки HUVEC (фирма Technoclone) выращивали в минимальной среде в течение ночи и затем по 4000 клеток/лунку высевали в четырех повторностях в 96луночные планшеты для культуры ткани. Клетки стимулировали с использованием 33 нг/мл VEGF в отсутствии или в присутствии VHH. Уровни пролиферации измеряли по включению [³Н]-тимидина в день 4. Результаты, представленные в табл. 25, продемонстрировали, что форматированные VHH и бевацизумаб ингибировали индуцируемую VEGF пролиферацию HUVEC более чем на 90%, при этом значения IC₅₀ составляли < 1 нМ.

Таблица 25. Значения IC₅₀ (нМ) и % ингибирования для форматированных VHH, установленные с помощью анализа индуцируемой VEGF пролиферации клеток HUVEC

VHH ID	IC50 (нМ)	% ингибирования
VEGFBII010	0,22	95
VEGFBII021	0,40	98
VEGFBII022	0,34	100
VEGFBII023	0,52	98
VEGFBII024	0,38	96
VEGFBII025	0,41	104
бевацизумаб	0,21	92

Эффективность отобранных форматированных VHH оценивали также с помощью анализа фосфорилирования Erk в клетках HUVEC. В целом, метод состоял в следующем: первичные HUVEC-клетки выращивали в минимальной среде в течение ночи, затем стимулировали с помощью 10 нг/мл VEGF в течение 5 мин в отсутствии или в присутствии VHH. Клетки фиксировали 4% формальдегида в ЗФР и уровни фосфорилирования ERK оценивали с помощью ELISA, используя специфические для фосфо ERK антитела (антитело к фосфоМАР-киназе pERKl&2, M8159, фирма Sigma) и поликлональное кроличье антитело к мышиному иммуноглобулину, конъютированное с HRP (PO161, фирма Dako). Как видно из табл. 26, форматированные VHH и бевацизумаб ингибировали индуцируемое VEGF фосфорилирование Erk более чем на 90%, что характеризовалось значениями IC₅₀ <1нМ.

Таблица 26. Значения IC₅₀ (нМ) и % ингибирования для форматированных VHH, установленные при анализе индуцируемого VEGF фосфорилирования Erk в клетках HUVEC

VHH ID	IC50 (нМ)	% ингибирования
VEGFBH010	0,19	92
VEGFBH021	0,21	103
VEGFBH022	0,18	94
VEGFBH023	0,25	100
VEGFBH024	0,23	94
VEGFBH025	0,23	99
бевацизумаб	0,63	98

Пример 8. Оптимизация последовательностей.

8.1 . Оптимизация последовательности VEGFBII23B04.

Осуществляли сравнительный анализ аминокислотных последовательностей VEGFBII23B04 и последовательности человеческой зародышевой линии VH3-23/JH5, см. фиг. 16 (SEQ ID NO: 179).

Сравнительный анализ продемонстрировал, что VEGFBII23B04 содержит 19 мутаций в каркасных

- 44 036746 участках относительно референс-последовательности зародышевой линии. Нечеловеческие остатки в положениях 14, 16, 23, 24, 41, 71, 82, 83 и 108 отбирали для замены на их копии из человеческой зародышевой линии. Создавали набор, включающий 8 вариантов VEGFBII23B04, несущих различные комбинации человеческих остатков в этих положениях (АК-последовательности представлены в табл. 27). Конструировали один дополнительный вариант, в котором удаляли потенциальный сайт изомеризации в положении D59S60 (CDR2-участок, см. фиг. 16, остатки обозначены выделенным жирным шрифтом курсивом) путем интродукции мутации S60A.

Таблица 27. АК-последовательность вариантов VHH VEGFBII23B04 с оптимизированной последовательностью (FR, каркасный участок; CDR, гипервариабельный участок)

ID VHH/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
VEGFBII 111D05/47	EVQLVESGGGL VQTGGSLRLSC EASGRTFS	SYSMG	WFRQAPGKEREFV V	AISKGGYK YDSVSLEG	RFTISRDNAKNTVYLQINS LRPEDTAVYYCAS	SRAYGSSR LRLADTYE Y	WGQGTLVTVS S
VEGFBH 111G06/48	EVQLVESGGGL VQPGGSLRLSC AASGRTFS	SYSMG	WFRQAPGKEREFV V	AISKGGYK YDSVSLEG	RFTISRDNAKNTVYLQMN SLRPEDTAVYYCAS	SRAYGSSR LRLADTYE Y	WGQGTLVTVS S
VEGFBH 112D11/49	EVQLVESGGGL VQPGGSLRLSC EASGRTFS	SYSMG	WFRQAPGKEREFV V	AISKGGYK YDSVSLEG	RFTISRDNAKNTVYLQINS LRPEDTAVYYCAS	SRAYGSSR LRLADTYE Y	WGQGTLVTVS S
VEGFBH 113A08/50	EVQLVESGGGL VQTGGSLRLSC EVSGRTFS	SYSMG	WFRQAPGKEREFV V	AISKGGYK YDSVSLEG	RFTISRDNAKNTVYLQINS LRPEDTAVYYCAS	SRAYGSSR LRLADTYE Y	WGQGTLVTVS S
VEGFBII 113E03/51	EVQLVESGGGL VQTGDSLRLSC EVSGRTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREFV V	AISKGGYK YDSVSLEG	RFTISKDN AKNT VYLQMN SLRPEDTAVYYCAS	SRAYGSSR LRLADTYE Y	WGQGTLVTVS S
VEGFBH 114C09/52	EVQLVESGGGL VQPGDSLRLSC EVSGRTFS	SYSMG	WFRQAPGKEREFV V	AISKGGYK YDSVSLEG	RFTISRDNAKNTVYLQINS LRPEDTAVYYCAS	SRAYGSSR LRLADTYE Y	WGQGTLVTVS S
VEGFBH 114D02/53	EVQLVESGGGL VQTGGSLRLSC EVSGRTFS	SYSMG	WFRQAPGKEREFV V	AISKGGYK YDSVSLEG	RFTISRDNAKNTVYLQINS LRPEDTAVYYCAS	SRAYGSSR LRLADTYE Y	WGQGTLVTVS S
VEGFBH 114D03/54	EVQLVESGGGL VQTGDSLRLSC AVSGRTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREFV V	AISKGGYK YDSVSLEG	RFTISRDNAKNTVYLQINS LRPEDTAVYYCAS	SRAYGSSR LRLADTYE Y	WGQGTLVTVS S
VEGFBH 118E10/55	EVQLVESGGGL VQTGDSLRLSC EVSGRTFS	SYSMG	WFRQAQGKEREFV V	AISKGGYK YDAVSLEG	RFTISRDNAKNTVYLQINS LRPEDTAVYYCAS	SRAYGSSR LRLADTYE Y	WGQGTQVTVS S

Эти варианты характеризовали в виде очищенных белков в отношении взаимодействия VEGF165/VEGFR2 с помощью AlphaScreen-анализа (пример 5.3, фиг. 17). Определяли температуру плавления (Т_пл) для каждого клона с помощью анализа термального сдвига, который основан на оценке увеличения сигнала флуоресценции при включении реагента Sypro Orange (фирма Invitrogen) (Ericsson и др., Anal. Biochem. 357, 2006, cc. 289-298). Для всех вариантов характерны сопоставимые значения IC₅₀ при сравнении с VEGFBII23B04, и значения Т_пл, превышающие или близкие к значениям Т_пл для родительского клона VEGFBII23B04. в табл.28 обобщены данные о значениях IC50 изученных 9 клонов и значениях Тпл при рН 7.

Таблица 28. Значения IC₅₀ (пМ), % ингибирования и температура плавления (рН 7) для вариантов с оптимизированной последовательностью VEGFBII23B04

VHH ID	IC50 (nM)	% ингибирования	Тпл, pH 7 (°C)
VEGFBII23B04 (wt)	169	100	63
VEGFBII111D05	209	100	68
VEGFBII111G06	366	100	71
VEGFBII U2D11	221	100	70
VEGFBII 113 A08	253	100	69
VEGFBII113E03	290	100	68
VEGFBII114C09	215	100	71
VEGFBII 114D02	199	100	74
VEGFBII114D03	227	100	64
VEGFBIII18E10	189	100	62

Во втором цикле объединяли приемлемые мутации, полученные в процессе гуманизации (VEGFBII111G06), и мутации, позволяющие избегать возможной пост-трансляционной модификации выбранных сайтов (D16G, замена S60A и мутация E1D), получая клон с оптимизированной последовательностью, выведенный из VEGFBII23B04, а именно, VEGFBII0037. Специально был создан один вариант с оптимизированной последовательностью (VEGFBII038), который содержал все замены, указанные для VEGFBII0037, за исключением мутации I82M, поскольку эта мутация может быть ассоциирована с небольшим снижением эффективности. Последовательности обоих клонов с оптимизированными последовательностями представлены в табл. 29.

VEGFBII0037 и VEGFBII0038 характеризовали в отношении блокады взаимодействия VEGF165/ VEGFR2 с помощью AlphaScreen-анализа (пример 5.3, фиг. 18), температуру плавления определяли с помощью описанного выше анализа термального сдвига, а аффинность связывания с VEGF165 опреде- 45 036746 ляли с помощью Biacore-анализа (пример 5.5). Обобщение характеристик двух VHH с оптимизированными последовательностями представлено в табл. 30.

Таблица 29. АК-последовательности вариантов с оптимизированной последовательностью

VHH VEGFBII23B04

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR 1	CDR 1	FR2	CDR 2	FR3	CDR 3	FR4
VEGFBII037 56	DVQLV ESGGG LVQPG GSLRL SCAAS GRTFS	SYSMG	WFRQ APGKE REFVV	AISKGG YKYDA VSLEG	RFTISRD NAKNTV YLQMNS LRPEDTA VYYCAS	SRAYGS SRLRLA DTYEY	WGQGT LVTVSS
VEGFBII038 57	DVQLV ESGGG LVQPG GSLRL SCAAS GRTFS	SYSMG	WFRQ APGKE REFVV	AISKGG YKYDA VSLEG	RFTISRD NAKNTV YLQINSL RPEDTAV YYCAS	SRAYGS SRLRLA DTYEY	WGQGT LVTVSS

Таблица 30. Значения IC₅₀ (пМ), % ингибирования, температура плавления (рН 7) и аффинность (пМ) для клонов с оптимизированной последовательностью VEGFBII037 и VEGFBII038

VHH ID	IC50 (nM)	% ингибирования	Тпл (°C), pH 7	Кц (пМ)
VEGFBII23B04	152	100	63	560
VEGFBII037	300	100	72	270
VEGFBII038	143	100	71	360

8.2 Оптимизация последовательности VEGFBII5B05 Осуществляли выравнивание аминокислотных последовательностей VEGFBII23B05 и последовательности человеческой зародышевой линии VH323/JH5, см. фиг. 19 (SEQ ID NO: 179). Сравнительный анализ продемонстрировал, что VEGFBII23B05 содержал 15 мутаций в каркасных участках относительно референс-последовательности зародышевой линии. Нечеловеческие остатки в положениях 23, 60, 83, 105, 108 выбирали для замены на их копии из человеческой зародышевой линии, в то время как гистидин в положении 44 выбирали для замены на глутамин. Создавали один гуманизированный вариант, несущий 6 описанных мутаций (АК-последовательности представлены в табл. 31).

Таблица 31. АК-последовательности вариантов с оптимизированной последовательностью VHH VEGFBII5B05 (FR, каркасный участок; CDR, гипервариабельный участок)

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDRI	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
VEGFBH119G11/ 125	EVQLVES GGGLVQ PGGSLRL SCAASGI RFM	SMA	WYRQA PGKQRE LVA	RISSG GTTAY ADSVK G	RFTISRD NSKNTV YLQMNS LRAEDTA VYYCNT	FSSRP NP	WGQ GTLV TVSS
VEGFBH120E10/ 126	EVQLVES GGGLVQ PGGSLRL SCVASGI RFI	SMA	WYRQA PGKHRE LVA	RISSG GTTAY VDSVK G	RFTISRD NSKNTV YLQMNS LKAEDTA VYYCNT	FSSRP NP	WGA GTQV TVSS

Конструировали один дополнительный вариант, в котором потенциальный сайт окисления в положении М30 (CDR1-участок, см. фиг. 19, остаток выделен жирным шрифтом и курсивом) удаляли путем интродукции мутации M30I. Оценивали способность обоих вариантов связываться с hVEGF165 с помощью системы ProteOn. В целом, метод состоял в следующем: сенсорный чип GLC ProteOn сенсибилизировали человеческим VEGF165. Периплазматические экстракты вариантов разводили в соотношении 1/10 и инъецировали на чип, сенсибилизированный человеческим VEGF165. Рассчитывали скорости реакции диссоциации и сравнивали со скоростями реакции диссоциации родительского VEGFBII5B05. Скорости реакции диссоциации двух вариантов оказались такими же, что и скорости реакции диссоциации родительского VEGFBII5B05, это свидетельствует о приемлемости всех мутаций (табл. 32).

Таблица 32. Скорости реакции диссоциации вариантов VEGFBII5B05 с оптимизированной последовательностью

VHH ID	Уровень связывания (RU)	kd(l/c)
VEGFBII5B05	242	6,15E-02
VEGFBII119G11	234	7,75E-02
VEGFBII120E10	257	4,68E-02

Во втором цикле объединяли мутации, полученные в процессе гуманизации, и замену M30I, получая клон с оптимизированной последовательностью, выведенный из VEGFBII23B05, обозначенный как

- 46 036746

VEGFBII032. Последовательность представлена в табл. 33. Аффинность VEGFBII032 определяли с помощью Biacore-анализа (см. пример 5.5), а температуру плавления определяли с помощью описанного выше анализа термального сдвига. Обобщение характеристик VHH VEGFBII032 с оптимизированной последовательностью представлено в табл. 34.

Таблица 33. АК-последовательность клона с оптимизированной последовательностью VEGFBII032 (FR, каркасный участок; CDR, гипервариабельный участок)

VHH ID/ SEQ ID NO:	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
VEGFBH032/ 127	EVQLVE SGGGLV QPGGSL RLSCAA SGIRFI	SMA	WYRQA PGKQRE LVA	RISSG GTTA YADS VKG	RFTISRDNSK NTVYLQMNS LRAEDTAVY YCNT	FSSRP NP	WGQGTL VTVSS

Таблица 34. Температура плавления (рН 7) и аффинность (нМ) клона с оптимизированной последовательностью VEGFBII032

VHH ID	Tn„ (°C), pH 7	KD (hM)
VEGFBII5B05(wt)	69	32
VEGFBII0032	71	44

Эффективность клонов с оптимизированной последовательностью VEGFBII037 и VEGFBII038 оценивали с помощью анализа пролиферации. В целом, метод состоял в следующем: первичные клетки HUVEC (фирма Technoclone) выращивали в минимальной среде в течение ночи и затем по 4000 клеток/лунку высевали в четырех повторностях в 96-луночные планшеты для культуры ткани. Клетки стимулировали с использованием 33 нг/мл VEGF в отсутствии или в присутствии VHH. Уровни пролиферации оценивали по включению [³Н]-тимидина в день 4. Результаты, представленные в табл. 35, демонстрируют что активность (эффективность и степень ингибирования) родительского VHH VEGFBII23B04 полностью соответствовала активности клона с оптимизированной последовательностью VEGFBII038.

Таблица 35. Значения IC₅₀ (нМ) и % ингибирования для клонов с оптимизированной последовательностью VEGFBII037 и VEGFBII038, установленные в анализе индуцируемой VEGF пролиферации клеток HUVEC

VHH ID	IC50 (нМ)	% ингибирования
VEGFB II23B04	0,68	92
VEGFB II037	1,54	78
VEGFB II038	0,60	92
бевацизумаб	0,29	94

Пример 9. Конструирование, получение и характеризация двухвалентных VHH, мишенью которых является Ang2.

Осуществляли генетическое слияние VHH 1D01 (SEQ ID NO: 214), 11В07, 00908 и 00027 (SEQ ID NO: 216) с 1D01 (SEQ ID NO: 214), 11B07, 00908 и 00027 (SEQ ID NO: 216) соответственно с получением гомодимерных VHH. Двухвалентные VHH соединяли через гибкий линкер 9-GlySer или 40-GlySer. Кодирующие последовательности форматированных VHH клонировали в экспрессионном векторе рАХ172. VHH экспрессировали в Pichia pastoris в виде белков, меченных на С-конце с помощью myc - His6. В целом, метод состоял в следующем: начинали создание культуры BGCM с индивидуальной колонии, полученной посевом штрихом, которую инкубировали в течение выходных дней при 30°С (250 об/мин). После замены среды на ВМСМ культуры инкубировали до вечера при 30°С (250 об/мин) и осуществляли последующую индукцию с использованием 100% метанола. На следующий день культуры индуцировали еще трижды (утром, днем и вечером). На следующий день культуры центрифугировали в течение 20 мин при 4°С (1500xg). Меченные с помощью His6 VHH, присутствующие в супернатанте, очищали с помощью хроматографии на иммобилизованном металле (ИМАХ) с последующим обессоливанием (DS) и, наконец, гель-фильтрации (ГФ) для удаления любых эндотоксинов/примесей. Обзор форматов и последовательностей всех двухвалентных VHH представлен на фиг. 20 и в табл. 36-А (линкерные последовательности подчеркнуты), SEQ ID NO: 180-185. Уровни экспрессии представлены табл. 36-Б.

Для исследования блокирующих свойства антител к Ang2 в сравнении с одновалентными конструктивными элементами двухвалентные VHH анализировали в отношении блокады взаимодействий: человеческий Ang2/hTie2 (фиг. 21-1), мышиный Ang2/mTie2 (фиг. 21-2), Ang2 обезьяны циномолгус (супо) /cTie2 (фиг. 21-3) и человеческий Ang1/hTie2 (фиг. 22) с помощью конкурентного ELISA. Обобщение данных о значениях IC₅₀ представлено в табл. 37.

- 47 036746

Таблица 36-А

Последовательности двухвалентных VHH, мишенью которых является Ang2
VHH ID	АК-последовательность
ANGBII00001	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSC IRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVP RSKLEPYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQAGGSLR LSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTI SSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 180)
ANGBII00002	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSC IRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVP RSKLEPYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSEVOLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWF
RQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKP EDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 181)
ANGBII00003	EVQLVESGGGLVQVGDSLRLSCAASGRTFSTYLMVGWFRQAPGKEREFAA GIWSSGDTAYADSVRGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCAGSY DGNYYIPGFYKDWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOVGDSL RLSCAASGRTFSTYLMVGWFRQAPGKEREFAAGIWSSGDTAYADSVRGRF TISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCAGSYDGNYYIPGFYKDWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 182)
ANGBII00004	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSI RDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPA GRLRFGEOWYPLYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLV QAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADS VKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPL YEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 183)
ANGBII00005	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSI RDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPA GRLRFGEQWYPLYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVOLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDD
YAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQ MNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 184)
ANGBII00006	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIR DNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAG RLRYGEOWYPIYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLLESGGGLVOP GGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNGGSTYYADSVK GRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRYGEQWYPIYEY DAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 185)

Таблица 36-Б

VHH ID	Формат	Уровень экспрессии (мг/л)
ANGBII00001	<χ>	31
ANGBII00002		37
ANGBII00003		28
ANGBII00004		651
ANGBII00005		203
ANGBII00006		3

Таблица 37. Значения IC50 (пМ), характеризующие блокаду взаимодействий: человеческий Апд2/человеческий Tie2, мышиный Ang2/мышиный Tie2, cyno Ang2/cyno Tie2 и hAng1/hTie2, полученные с помощью конкурентного ELISA

		hAng2	mAng2	cAng2	Соотношение hAngl/hAng2
VHH ID	Формат	IC50 (nM)	ic50 (nM)	IC50 (nM)
1D01	<Q>	6973	10455	9,484	>10800
ANGBII00001	0^0	11	18	27	n.d.
ANGBII00002		20	32	n.d.	n.d.
11B07	Δ	15205	10000	16400	> 8570
ANGBII00003		24	47	35	n.d.
00027		541	1785	568	>14878
ANGBII00004	qq	17	33	34	n.d.
ANGBII00005		13	32	n.d.	n.d.
00908		52	85	79	>192014
ANGBII00006		19	28	25	6052631
AMG386		4	3	10	5600

n.d., не определяли.

- 48 036746

Пример 10. Конструирование, получение и характеризация трехвалентных VHH, мишенью которых являются VEGF и Ang2, созданных с использованием антитела к сывороточному альбумину для удлинения времени полужизни.

Анти-VEGF VHH VEGFBII00038 (US 2011/0172398 А1) и анти-Ang2 VHH 00027 (SEQ ID NO: 216) применяли в качестве конструктивных элементов для создания биспецифических VHH VEGFANGBII00001-00004. Генетическое слияние со связывающим сывороточный альбумин VHH применяли в качестве методологии удлинения времени полужизни. Конструктивные элементы соединяли через гибкий линкер, содержащий три Ala или 9 Gly-Ser. VHH получали и очищали согласно методу, описанному в примере 9. Обзор форматов и последовательностей всех четырех биспецифических VHH представлен на фиг. 23 и в табл. 38-А (линкерные последовательности подчеркнуты), SEQ ID NO: 186189. Уровни экспрессии представлены табл. 38-Б.

Таблица 38-А

Последовательности биспецифических VHH,мишенью которых являются VEGF и Ang2
VHH ID	АК-последовательность
VEGFANGBH00001	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREG VSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA VPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 186)
VEGFANGBH00002	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSI RDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPA GRLRFGEOWYPLYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV QPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADS VKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS GGGGSGGGSDVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAP GKEREFVVAISKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVY YCASSRAYGSSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 187)
VEGFANGBH00003	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSI RDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPA GRLRFGEOWYPLYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSDVOLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAISKGGYKYDAVSL EGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYGSSRLRLADTYEY WGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSS FGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 188)
VEGFANGBH00004	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGQGTLVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS GFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAK TTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAAEVQLVESGG GLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYY
Последовательности биспецифических VHH,мишенью которых являются VEGF и Ang2
VHH ID	АК-последовательность
	ADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQW YPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 189)

Таблица 38-Б

VHH ID	Формат	Уровень экспрессии (мг/л)
VEGFANGBH00001				13,3
VEGFANGBH00002		11,3
VEGFANGBII00003		15,4
VEGFANGBII00004				19,2

Для исследования блокирующих свойства антител к VEGF в сравнении с одновалентным конструктивным элементом VEGFBII00038 все четыре биспецифических VHH анализировали в отношении блокады взаимодействия VEGF/VEGFR2-Fc (фиг. 22) с помощью конкурентного AlphaScreen. В анализ для его адаптации к рассматриваемому случаю были внесены небольшие изменения по сравнению с анализом, изложенным в примере 12.3 в патенте US 2011/0172398 А1. Как человеческий VEGF165, так и человеческий VEGFR2-Fc добавляли в концентрации 0,05нМ. Этот анализ в условиях конкуренции осуществляли также после предварительной инкубации VHH с 25мкМ человеческим сывороточным альбумином (ЧСА). Обобщенные данные о значениях IC₅₀ и % ингибирования представлены в табл. 39.

- 49 036746

Таблица 39. Значения IC50 (нМ), характеризующие способность ингибировать взаимодействие:

человеческий VEGF165/человеческий VEGFR2, полученные с помощью конкурентного AlphaScreen

VHH ID	Формат	ЧСА	1С50 (нМ)	% ингибирования
VEGFBII00038				-	0,5	100
	+	0,5	100
VEGFANGBII00001				-	0,4	100
	+	0,6	100
VEGFANGBII00002				-	0,7	100
	+	1,2	100
VEGFANGBII00003				-	0,6	100
	+	1,3	100
VEGFANGBII00004				-	0,5	100
	00038 1
+	0,7	100
ранибизумаб		-	0,8	100
+	1,1	100

Для исследования блокирующих свойств антител к Ang2 в сравнении с одновалентным конструктивным элементом 00027 (SEQ ID NO: 216) все четыре биспецифических VHH анализировали в отношении блокады взаимодействия человеческий Ang2/hTie2-Fc (фиг. 25) с помощью конкурентного ELISA. Этот анализ осуществляли также после инкубации VHH с 0,5мкМ человеческим сывороточным альбумином. Обобщенные данные о значениях IC₅₀ представлены в табл. 40.

Таблица 40. Значения IC₅₀ (пМ), характеризующие способность ингибировать взаимодействие: человеческий Ang2/человеческий Tie2, полученные с помощью конкурентного ELISA

VHH ID	Формат	ЧСА	1С50 (пМ)
00027	22)	-	516
+	n.d.
VEGFANGBII00001		-	240
+	179
VEGFANGBII00002		-	463
	+	330

VHH ID	Формат	ЧСА	IC50 (пМ)
VEGFANGBII00003		-	273
	+	154
VEGFANGBII00004		-	111
+	92
AMG386		-	2
+	n.d.

n.d., не определяли.

Пример 11. Конструирование, получение и характеризация трехвалентных и четырехвалентных VHH, мишенью которых являются VEGF и Ang2, созданных с использованием антитела к сывороточному альбумину для удлинения времени полужизни.

Создавали десять биспецифических VHH, мишенью которых является VEGF и Ang2 (VEGFANGBII00005-00015). В эти конструкции включали одновалентные и двухвалентные конструктивные элементы 1D01 (SEQ ID NO: 214), одновалентные и двухвалентные конструктивные элементы 7G08 (SEQ ID NO:215) и двухвалентный конструктивный элемент 00027 (SEQ ID N0:216) анти-Ang2. Генетическое слияние со связывающим сывороточный альбумин VHH применяли в качестве методологии удлинения времени полужизни. Конструктивные элементы соединяли через гибкий линкер 9 Gly-Ser. VHH получали и очищали согласно методу, описанному в примере 8. Обзор форматов и последовательностей всех десяти биспецифических VHH представлен на фиг. 26 и в табл. 41-А (линкерные последовательности подчеркнуты), SEQ ID NO: 190-199. Уровни экспрессии представлены табл. 41-Б.

- 50 036746

Таблица 41-А

Последовательности биспецифических VHH, мишенью которых являются VEGF и Ang2
VHH ID	АК-последовательность
VEGFANGBH00005	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFALDYYAIGWFRQVPGKEREGVSCISSSDGITYYVDSVKGRFTI SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDSGGYIDYDCMGLGYDYWGQG TLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMS WVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSL RPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 190)
VEGFANGBH00006	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI
	SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALDYYAIGWFRQVPGKEREG VSCISSSDGITYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAT DSGGYIDYDCMGLGYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 191)
VEGFANGBII00007	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGGSL RLSCAASGFALDYYAIGWFRQVPGKEREGVSCISSSDGITYYVDSVKGRFTI SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATDSGGYIDYDCMGLGYDYWGQG TLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMS WVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSL RPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQ PGGSLRLS C AASGF ALD YY AIGWFRQ VPGKEREG VSCIS S SD GITYY VD S VK GRFTISRDN AKNT VYLQMNSLKPED T A VYY C ATD S GGYID YD CMGLGYD Y WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 192)
VEGFANGBH00008	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOAGGSL RLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTI SSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAW GOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDD YAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQ MNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGG GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGK GLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVY YCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 193)
VEGFANGBH00009	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREG VSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA VPAGRLRFGEOWYPLYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGG GLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYY ADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQW YPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 194)
VEGFANGBH00010	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQAGGSL RLSCAASGFTLDDY AIGWFRQ APGKEREGVSSIRDNDGSTYYADSVKGRFTI SSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAW GOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSF GMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGG GLVQAGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSSIRDNDGSTYY ADSVKGRFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQW YPLYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 195)
VEGFANGBH00011	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOAGGSL RLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFT ISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLV TVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWF

- 51 036746

	RQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKP EDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLV ESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 196)
VEGFANGBII00012	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREG VSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA SIVPRSKLEPYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOAG GSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKG RFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 197)
VEGFANGBII00013	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQAGGSL RLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGRFT ISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLV TVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVR QAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPE DTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOAGG SLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREGVSCIRCSDGSTYYADSVKGR FTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 198)
VEGFANGBII00014	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAAGKEREG VSCIRCSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA SIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 199)

Таблица 41-Б

VHH ID	Формат	Уровень экспрессии (мг/л)
VEGFANGBII00005		1,3
VEGFANGBII00006		1,3
VEGFANGBII00007		00038		0,3
			—
VEGFANGBII00008		00038		30,0
VEGFANGBII00009		00038		71,4
			—
VEGFANGBII00010		00038		25,0
			—
VHH ID	Формат	Уровень экспрессии (мг/л)
VEGFANGBH00011		00038		4,0
VEGFANGBH00012		00038		6,6
VEGFANGBH00013		00038	row	2,9
VEGFANGBII00014		45,6

Для исследования блокирующих свойства антител к VEGF в сравнении с одновалентным конструктивным элементом VEGFBII00038 все десять биспецифических VHH анализировали в отношении блокады взаимодействия: VEGF/VEGFR2-FC (пример 10, фиг. 27-1) и VEGF/VEGFR1 (фиг. 27-2) с помощью конкурентного AlphaScreen. Анализ для VEGFR1 слегка адаптировали по сравнению с анализом, изложенным в примере 12.4 в патенте US 2011/0172398 А1. Как человеческий VEGF165, так и человеческий VEGFR2-Fc добавляли в концентрации 0,05нМ. Эти анализы в условиях конкуренции осуществляли также после предварительной инкубации VHH с 25 мкМ человеческим сывороточным альбумином. Обобщенные данные о значениях IC₅₀ представлены в табл. 42.

- 52 036746

Таблица 42. Значения IC⁵⁰ (нМ), характеризующие способность ингибировать взаимодействия: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR2 и человеческий VEGF165/человеческий VEGFR1, полученные с помощью конкурентного AlphaScreen

			VEGFR1	VEGFR2
		nr	IC5O	%	IC50	%
VHH ID	Формат	A	(нМ	ингибирован	(нМ	ингибирован
			)	ИЯ	)	ИЯ
			0,6	67	0,5	100
VEGFBII00038
		0,6	64	0,5	100
	+
VEGFANGBII000	ЭЛГЛ?	-
05	+
VEGFANGBII000		-	0,8	64	1,0	100
06	+	1,0	71	1,4	100
VEGFANGBII000		-
07	ШЦ J X \ALBiy У	\ +
VEGFANGBII000		-	0,6	77	0,3	100
08	КЦЦЯ I ) I ) \albii	+	0,7	73	0,4	100
VEGFANGBII000		\ -	0,8	71	0,4	100
09	Kjj&jjjl Vlbii/ ( J (	/ +	1,5	72	0,7	100
VEGFANGBII000		\ -	0,5	72	0,3	100
10	КШЦ ( J Vlbh/ (	/ +	1,1	78	0,7	100
		nr	IC50	%	IC50	%
VHH ID	Формат	A	(нМ	ингибирован	(нМ	ингибирован
			)	ИЯ	)	ия
VEGFANGBII000	AgGQ	-	0,6	68	0,4	100
01	+	0,8	76	0,6	100
VEGFANGBII000		-	0,8	74	0,9	100
11	\ / VkLB11	+	2,5	81	0,8	100
VEGFANGBII000			1,0	74	0,4	100
12	ОЛЛЛЛЛ!		1,5	80	0,7	100
VEGFANGBII000
13	В V w Vi
VEGFANGBII000		-	0,8	69	0,4	100
14	+	1,0	80	0,7	100
Ранибизумаб		-	2,5	92	1,2	100
	+	5,3	86	1,1	100

n.d., не определяли.

Для исследования блокирующих свойства антител к Ang2 в сравнении с соответствующим одновалентным конструктивным элементом 7G08 (SEQ ID NO: 215), 1D01 (SEQ ID NO: 214) и 00027 (SEQ ID NO: 216) все десять биспецифических VHH анализировали в отношении блокады взаимодействий: человеческий Ang2/hTie2-Fc (см. пример 5.1, фиг. 28-1), мышиный Ang2/mTie2-Fc (см. пример 5.2; фиг. 28-2) и cyno Ang2/cTie2-Fc (см. пример 5.2; фиг 28-3) с помощью конкурентного ELISA. Этот анализ осуществляли также после инкубации VHH с 0,5мкМ человеческим сывороточным альбумином. Дополнительно осуществляли анализ опосредуемой hAng2 выживаемости клеток HUVEC (см. пример 5.5; фиг. 29). Обобщенные данные о значениях IC₅₀ и % ингибирования представлены в табл. 43.

Таблица 43. Значения IC₅₀ (пМ) и % ингибирования, характеризующие способность ингибировать взаимодействия: человеческий Ang2/человеческий Tie2, мышиный Ang2/мышиный Tie2 и cyno Ang2/cyno Tie2, полученные с помощью конкурентного ELISA, и значения IC₅₀ (нМ) и % ингибирования, полученные при анализе опосредуемой hAng2 выживаемости клеток HUVEC

			hAng2	mAng2	cAng2	Выживаемость клеток HUVEC
VHH ID	Формат	ЧСА	IC50 (пМ)	% ИНГ.	IC50 (пМ)	% ИНГ.	IC50 (пМ)	% ИНГ.	IC50 (нМ)	% ИНГ.
7G08	Л____	+	ПО	100					1,5	100
-
VEGFANGBII0 0005			гол?	-
	+
VEGFANGBII0 0006		-	560	100					4,9	100
+	400	100
VEGFANGBII0 0007			голт	-
	+
AMG386		-	5	100					1,2	100
+	4	100
00027	(^)	-	540	100	1,800	100	570	100	2,0	100
+
VEGFANGBII0 0001		-	360	100	1,300	100	390	100	5,7	100
+	290	100
VEGFANGBII0 0008	вглол?	-	47	100	71	100	79	100	5,6.	100
+	52	100
VEGFANGBII0 0009	В	-	33	100	36	100	46	100	3,6	100
+	39	100
VEGFANGBII0 0010	СРслРО	-	32	100	78	100	59	100
+	49	100
AMG386		-	5	100	4	100	3	100	1,3	100
+	4	100
1D01		-	7,000	100	10,000	100	9,500	100	7,8	100
+

- 53 036746

VHH ID	Формат	ЧСА	IC50 (пМ)	% ИНГ.	IC50 (пМ)	% ИНГ.	IC50 (пМ)	% ИНГ.	IC50 (нМ)	% ИНГ.
VEGFANGBII0 ООП	ХХУЯ	-	31	100	56	100	95	100	3,7	100
+	34	100
VEGFANGBII0 0012		-	40	100	68	100	100	100	3,6	100
+	65	100
VEGFANGBII0 0013	ХМУО	-
+
VEGFANGBII0 0014		-	710	100	1,000	100	1,100	100
+	1,200	100
AMG386		-	4	100	4	100	10	100	1,3
+	4	100

n.d., не определяли.

Определяли аффинность к человеческому сывороточному альбумину, результаты представлены в табл.44. В целом, метод состоял в следующем: человеческий сывороточный альбумин (фирма Sigma, Сент-Луис, шт. Миссури, США) иммобилизовали на СМ5-чипе путем аминного сочетания. Использовали подход, основанный на применении нескольких циклов кинетического анализа: инъецировали VHH в возрастающих концентрациях (2-8-31-125-500нМ) и давали пройти реакции ассоциации в течение 2 мин и диссоциации в течение 10 мин при скорости потока 100 мкл/мин. Между инъекциями VHH поверхности регенерировали с использованием импульсного внесения в течение 10 с 10мМ глицина-HCl, рН 1,5 и 60-секундного периода стабилизации. Результаты ассоциации/диссоциации оценивали путем аппроксимации с использованием модели взаимодействия 1:1 (связывание по Лэнгмюру) или модели на основе гетерогенных лигандов. Константу аффиности KD рассчитывали на основе констант скорости ассоциации и диссоциации (k_a) и (k_d) (табл. 44).

Таблица 44. Аффинность (KD) очищенных VHH к человеческому (ЧСА), обезьян циномолгус (ЦСА) и мышиному сывороточному альбумину (МСА)

	ЧСА	ЦСА	МСА
	ka (1/Мс)	kd (1/с)	Kd (нМ)	ka (1/Мс)	kd (1/с)	kd (нМ)	ka (1/Мс)	kd (1/с)	KD (нМ)
ALB11	4,5Е+05	Ц8Е-03	4	4,ЗЕ+05	Ц6Е-03	4	6,6Е+05	3,2Е-02	49
VEGFANGBII00001	2,ЗЕ+05	4,8Е-03	22	Ц8Е+05	4,ЗЕ-ОЗ	24
VEGFANGBII00005
VEGFANGBII00006	2,0Е+05	4,6Е-03	22	Ц5Е+05	4,5Е-03	30	Ц7Е+05	6,0Е-02	360
VEGFANGBII00007
VEGFANGBII00008	1,ЗЕ+05	4, ЗЕ-ОЗ	34
VEGFANGBII00009	1,5Е+05	4,6Е-03	30	1ДЕ+05	4,2Е-03	39	Ц2Е+05	4,0Е-02	340
VEGFANGBII00010
VEGFANGBII00011	1,ЗЕ+05	4ДЕ-03	31
VEGFANGBII00012	1,5Е+05	4,ЗЕ-ОЗ	31	1ДЕ+05	4,2Е-03	24	Ι,ΟΕ+05	2,5Е-02	240
VEGFANGBII0013
VEGFANGBII0014

n.d. - не определяли.

Пример 12. Конструирование, получение и характеризация биспецифических VHH с оптимизированной последовательностью и созревшей аффинностью, мишенью которых являются VEGF и Ang2, созданных с использованием связывания с антителом к сывороточному альбумину для удлинения времени полужизни.

Создавали 14 биспецифических VHH, мишенью которых является VEGF и Ang2 (VEGFANGBII00015-00028). В эти конструкции в качестве анти-Ang2 конструктивных элементов включали двухвалентный 00921 (вариант 1D01 с оптимизированной последовательностью) (SEQ ID NO: 220), одновалентные VHH 00908 - 00932 - 00933 - 00934 - 00935 - 00936 - 00937 - 00938 (варианты 28D10 с оптимизированной последовательностью /с созревшей аффинностью) (SEQ ID NO: 222), двухвалентный 00956 (SEQ ID NO: 223) (вариант 28D10 с оптимизированной последовательностью) и одновалентный 00928 (SEQ ID NO: 221) (вариант 37F02 с оптимизированной последовательностью). Генетическое слияние со связывающим сывороточный альбумин VHH применяли в качестве методологии удлинения времени полужизни. Конструктивные элементы соединяли через гибкий линкер 9 Gly-Ser. Обзор форматов и последовательностей всех 14 биспецифических VHH представлен на фиг. 30 и в табл.45-А (линкерные последовательности подчеркнуты), SEQ ID NO: 200-213. Уровни экспрессии представлены в табл.45-Б.

- 54 036746

Таблица 45-А

Последовательности биспецифических VHH, мишенью которых являются VEGF и Ang2
VHH ID	АК-последовательность
VEGFANGBII00015	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGV S SIRDNGGSTYY AD S VKGRFTIS SDNSKNT VYLQMNSLRPEDT AVYYC AAV PAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 200)
VEGFANGBII00016	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGV S SIRDNGGSTYY AD S VKGRFTIS SDNSKNT VYLQMNSLRPEDT AVYYC AAV PAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 201)
VHH ID	АК-последовательность
VEGFANGBII00017	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGV SAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAV PAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 202)
VEGFANGBII00018	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGV SAIRESGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAV PAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 203)
VEGFANGBII00019	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGV SAIRSSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAV PAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 204)
VEGFANGBII00020	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGV SAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAV PAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 205)
VEGFANGBII00021	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGV SAIRESGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAV PAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 206)
VEGFANGBII00022	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGITLDDYAIGWFRQAPGKEREGV SAIRSSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAV PAGRLRYGEQWYPIYEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 207)

- 55 036746

VHH ID	АК-последовательность
VEGFANGBH00023	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGV SAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAV PAGRLRFGEOWYPLYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGL VQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRDNGGSTYYAD SVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPL YEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 208)
VEGFANGBII00024	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRDNGGSTYYADSVKGRFT ISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAW GOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDY AIGWFRQAPGKEREGVSAIRDNGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQM NSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPLYEYDAWGQGTLVTVSSGGG GSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVROAPGKGL EWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYC TIGGSLSRSSQGTLVTVSS SEQ ID NO: 209)
VEGFANGBH00025	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAPGKEREG VSCIRCSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA SIVPRSKLEPYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFDDYALGWFRQAPGKEREGVSCIRCSGGSTYYADSVKGR FTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: 210)
VEGFANGBII00026	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGGSL RLSCAASGFTFDDYALGWFRQAPGKEREGVSCIRCSGGSTYYADSVKGRFT ISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGQGTLV TVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFDDYALGWFR QAPGKEREGVSCIRCSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPED TAVYYCAASIVPRSKLEPYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVES GGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDT LYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTL VTVSS SEQ ID NO: 211)
VEGFANGBII00027	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVOPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALDYYAIGWFRQAPGKEREG VSCISSSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCATD SGGYIDYDCSGLGYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 212)

VHH ID	АК-последовательность
VEGFANGBH00028	DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVVAI SKGGYKYDAVSLEGRFTISRDNAKNTVYLQINSLRPEDTAVYYCASSRAYG SSRLRLADTYEYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGLVQPGNSL RLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSSGGGGSG GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGV SAIRSSGGSTYYADSVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAV PAGRLRFGEOWYPLYEYDAWGOGTLVTVSSGGGGSGGGSEVOLVESGGGL VQPGGSLRLSCAASGFTLDDYAIGWFRQAPGKEREGVSAIRSSGGSTYYAD SVKGRFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAVPAGRLRFGEQWYPL YEYDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 213)

Таблица 45-Б

VHH ID	Формат	Уровень экспрессии (мг/л)
VEGFANGBII00022
VEGFANGBII00025
VEGFANGBH00028	ГШО

Для исследования блокирующих свойства антител к VEGF в сравнении с одновалентным конструктивным элементом VEGFBII00038 биспецифические VHH анализировали в отношении блокады взаимодействия VEGF/VEGFR2-Fc (пример 10, фиг. 31-1) и VEGF/VEGFR1 (пример 11, фиг. 31-2) с помощью конкурентного AlphaScreen. Эти анализы в условиях конкуренции осуществляли также после предварительной инкубации VHH с 25 мкМ человеческим сывороточным альбумином. Обобщенные данные о значениях IC₅₀ представлены в табл. 46-А.

- 56 036746

Таблица 46-А. Значения IC50 (нМ), характеризующие способность ингибировать взаимодействия: человеческий VEGF165/человеческий VEGFR2 и человеческий VEGF165/человеческий VEGFR1, полученные с помощью конкурентного AlphaScreen

			VEGFR1	VEGFR2
VHH ID	Формат	ЧС A	IC5o (нМ )	% ингибирован ИЯ	IC5o (нМ )	% ингибирован ИЯ
VEGFBII00038		00038		-	0,4	57	0,2	100
	+	n.d	n.d.	n.d.	n.d.
VEGFANGBII000 22		-	0,4	64	0,2	100
+	0,6	75	0,3	100
VHH ID	Формат	ЧС A	IC50 (нМ )	% ингибирован ИЯ	IC50 (нМ )	% ингибирован ИЯ
VEGFANGBII000 25			0,6	68	0,2	100
’ +	0,9	75	0,3	100
VEGFANGBII000 28		00038	roor		0,5	64	0,2	100
	/ +	0,5	64	0,2	100
ранибизумаб		-	3,2	97	0,7	100
+			0,9	100

n.d., не определяли.

Кинетические характеристики связывания биспецифических VHH с человеческим VEGF165 анализировали с помощью SPR с использованием устройства Biacore Т100 (см. пример 12.5 в патенте US 2011/0172398 А1). Одновалентное Nanobody VEGFBII00038 применяли одновременно в качестве стандарта (табл. 46-Б).

Таблица 46-Б. Обобщение данных о кинетических параметрах, полученных с помощью Biacore-анализа с использованием hVEGF165

	kal (1/Мс)	kdl (1/с)	ка2 (1/с)	kd2 (1/с)	Kdi (М)
VEGFBII00038	2,6Е+05	1,ЗЕ-02	1,ЗЕ-02	1,9Е-04	7,5Е-10
VEGFANGBII00022	1,6Е+05	1,4Е-02	1,4Е-02	2,2Е-04	1,4Е-09
VEGFANGBII00025	1ДЕ+05	1,4Е-02	1,4Е-02	2ДЕ-04	1,9Е-09
VEGFANGBII00028	1,7Е+05	1,ЗЕ-02	1,ЗЕ-02	2ДЕ-04	1ДЕ-09

Способность VHH связываться с изоформой человеческого VEGF121 определяли с помощью ELISA, предназначенного для оценки связывания. Связывание серий разведений VHH с человеческим VEGF121 (фирма R&D), который в концентрации 1 мкг/мл применяли для непосредственной сенсибилизации планшетов (человеческий VEGF165 применяли в качестве стандарта), определяли с использованием биотинилированного антитела к VHH 1А4, а затем экстравидина-HRP. 1A4 представляет собой антитело к VHH в виде VHH (созданное в лаборатории фирмы Ablynx NV). Эталонное средство авастин служило в качестве положительного контроля и для его выявления использовали конъюгированное с HRP антитело к человеческому Fc. Несоответствующий VHH служил в качестве отрицательного контроля. Репрезентативные кривые, описывающие связывание с VEGF165 и VEGF121, представлены на фиг. 46, соответствующие значения EC50 обобщены в табл.46-В.

Таблица 46-В. Обобщенные данные о значениях EC50, характеризующих связывание с hVEGF165 и hVEGF121, полученные с помощью ELISA

	hVEGF 165	hVEGF121
	ЕС50 (М)	ЕС50 (М)
VEGFANGBII00022	1,4Е-09	2,3Е-09
VEGFANGBII00025	1,5Е-09	2,5Е-09
VEGFANGBII00028	1,2Е-09	2,1Е-09

Связывание с крысиным и мышиным VEGF164 оценивали с помощью ELISA, предназначенного для оценки связывания. Связывание VHH с мышиным или крысиным VEGF164 (фирма R&D), который в концентрации 1 мкг/мл применяли для непосредственной сенсибилизации планшетов, оценивали с использованием биотинилированного антитела к VHH1A4, а затем экстравидина-HRP. В качестве положительного контроля титровали мышиное/крысиное обладающее перекрестной реактивностью моноклональное антитело В20-4.1 (фирма Genentech) и выявляли с помощью конъюгированного с HRP антитела к человеческому Fc. Несоответствующий VHH служил в качестве отрицательного контроля. Результаты представлены на фиг. 33. Все три биспецифических VHH не давали перекрестную реакцию с мышиным и крысиным VEGF.

Связывание с человеческими VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и P1GF оценивали с помощью ELISA,

- 57 036746 предназначенного для оценки связывания. Связывание VHH с VEGF-B (фирма R&D), VEGF-C (фирма R&D), VEGF-D (фирма R&D) и P1GF (фирма R&D), которые в концентрации 1 мкг/мл применяли для непосредственной сенсибилизации планшетов, оценивали с использованием биотинилированного антитела к VHH 1A4, а затем экстравидина-HRP. В качестве положительного контроля применяли параллельно серии разведений соответствующих рецепторов (hVEGFR1-Fc для hVEGF-B и hPlGF, hVEGFR2Fc для hVEGF-C, МАт к hVEGF-D (фирма R&D) для hVEGF-D). Несоответствующий VHH служил в качестве отрицательного контроля.

Результаты представлены на фиг. 34. Все три биспецифических VHH не связывались с представителями семейства VEGF.

Для исследования блокирующих свойства антител к Ang2 в сравнении с соответствующим одновалентным конструктивным элементом 00921 (SEQ ID NO: 220) и 00938 (SEQ ID NO: 222) все три биспецифических VHH анализировали в отношении блокады взаимодействий человеческий Ang2/hTie2-Fc (см. пример 5.1, фиг. 35-1), мышиный Ang2/mTie2-Fc (см. пример 5.2; фиг. 35-2) и cyno Ang2/cTie2-Fc (см. пример 5.2; фиг 35-3) с помощью конкурентного ELISA. Анализ с человеческими компонентами осуществляли также после инкубации VHH с 0,5мкМ человеческим сывороточным альбумином. Кроме того, биспецифические VHH тестировали в отношении взаимодействия hAngl/hTie2 с помощью конкурентного ELISA (см. пример 5.3; фиг. 36) и осуществляли анализ опосредуемой hAng2 выживаемости клеток HUVEC (см. пример 5.5; фиг. 37). Обобщенные данные о значениях IC₅₀ и % ингибирования представлены в табл. 47-А.

Таблица 47-А. Значения IC₅₀ (пМ), характеризующие способность ингибировать взаимодействия: человеческий Ang2/человеческий Tie2, мышиный Ang2/мышиный Tie2 и cyno Ang2/cyno Tie2, полученные с помощью конкурентного ELISA, hAng1-ELISA, и значения IC₅₀ (нМ), полученные при анализе опосредуемой hAng2 выживаемости клеток HUVEC

			ELISA	Выживаемость клеток HUVEC
			Ang2	mAng2	cAng2	hAngl
VHH ID	Формат	ЧСА	IC50 (пМ)	% ИНГ.	IC50 (пМ)	% ИНГ.	IC50 (пМ)	% ИНГ.	Отношение IC50 hAngl /hAng2	IC50 (нМ)	% ИНГ.
00938		-	33	100	58	100	86	100	> 60,395	4,3	100
VEGFANGBH00022		-	50	100	56	100	101	100	> 39,902	1,9	100
+	45	100	68	100	115	100	> 44,771
AMG386		-	5	100	2	100	13	100	5,656	1,4	100
00921		-	15,940	100	27,990	100	43,500	100	> 125	18,8	100
VEGFANGBH00025		-	12	100	15	100	38	100	> 160,694	2,2	100
+	15	100	17	100	37	100	> 133,660
AMG386		-	5	100	2	100	15	100	5,632	1,2	100
00956		-	1,010	100	1,816	100	1,294	100	> 1,979	6,8	100
VEGFANGBH00028		-	30	100	72	100	65	100	> 66,222	3,7	100
+	39	100	69	100	78	100	> 50,816
AMG386		-	4	100	3	100	14	100	5.194	1.0	100

n.d. - не определяли

Определяли аффинность VEGFANGB1100022-25-28 к человеческому, мышиному, обезьяньему (циномолгус) и крысиному Ang2 (см. пример 5.4), данные представлены в табл. 47-Б.

Таблица 47-Б. Аффинность (KD) очищенных VHH к рекомбинантному человеческому, супо, мышиному и крысиному Ang2

	человеческий Ang2-FLD	cyno Ang2-FLD
	ka (1/Мс)	kd (1/с)	kd (М)	ka (1/Мс)	kd (1/с)	Kd (М)
VEGFANGBII00022	9,7Е+05	1,5Е-05	1,6Е-11	1,5Е+06	1,ЗЕ-05	8ДЕ-12
VEGFANGBII00025	2,7Е+06	1ДЕ-02	4,5Е-09	4,ЗЕ+06	1ДЕ-02	2,7Е-09
VEGFANGBII00028	5,9Е+05	9,6Е-04	1,6Е-09	8,4Е+05	8,7Е-04	1,0Е-09

	мышиный Ang2-FLD	крысиный Ang2-FLD
	ka (1/Мс)	kd (1/с)	KD (М)	ka (1/Мс)	kd (1/с)	Kd (М)
VEGFANGBII00022	5,5Е+05	2,8Е-05	5.1Е-11	3,9Е+05	3,8Е-05	9,9Е-11
VEGFANGBII00025	1,ЗЕ+06	1,4Е-02	1.1Е-08	8,7Е+05	2,9Е-02	3,ЗЕ-08
VEGFANGBII00028	3,6Е+05	2,0Е-03	5.6Е-09	2,5Е+05	ЗДЕ-ОЗ	1,2Е-08

- 58 036746

Определяли аффинность VEGFANGBII00022-25-28 к человеческому, мышиному и обезьяньему (циномолгус) сывороточному альбумину (пример 11), и результаты представлены в табл. 48. Константу аффинности (K_D) рассчитывали на основе констант скорости ассоциации и диссоциации (ka) и (kd) (табл.

48).

Таблица 48. Аффинность (KD, нм) очищенных VHH к рекомбинантному человеческому, мышиному и обезьяньему (циномолгус) сывороточному альбумину, определенная с использованием модели взаимодействия 1: 1 (А) или модели на основе гетерогенных лигандов (Б)

(A)	ЧСА	ЦСА
	ka(l/Mc)	kd(l/c)	Kd (hM)	ka (1/Mc)	kd(l/c)	Kd (hM)
ALB 11	5,6E+05	l,9E-03	4	4,5E+05	l,7E-03	4
VEGFANGBII00022	6,7E+05	6,0E-03	9	6,2E+05	5,4E-03	9
VEGFANGBII00025	5,6E+05	5,6E-03	12	4,3E+05	5ДЕ-03	12
VEGFANGBII00028	5,6E+05	5,8E-03	10	5,2E+05	5,3E-O3	10

| MCA

	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD (hM)
ALB 11	5,9E+05	3,0E-02	51
VEGFANGBII00022	5,2E+05	5,4E-03	150
VEGFANGBII00025	-	-	-
VEGFANGBII00028	-	-	-

(Б)	MCA
	kal (1/Mc)	kdl (1/c)	ka2 (1/c)	kd2 (1/c)	Kdi (hM)	KD2 (hM)
VEGFANGBII00025	6,2E+05	9,9E-02	4,7E+04	5,7E-04	160 *	12
VEGFANGBII00028	5,9E+04	6,9E-04	5,7E+05	9,4E-02	12	160 *

* описывает 70% или более взаимодействий.

Ang2-связывающие компоненты (табл. 49).

Таблица 49 (1D01 (SEQ ID NO: 214); 7G08 (SEQ ID NO: 215); 027 (SEQ ID NO: 216); 00042 (SEQ ID NO: 217); 00050 (SEQ DINO: 218); 00045 (SEQ ID NO: 219); 00921 (SEQ ID NO: 220); 00928 (SEQ ID NO: 221); 00938 (SEQ ID NO: 222); 00956 (SEQ ID NO: 223)

1D01 7G08 027 1D01 7G08 027	FR1 CDR1 FR2 CDR2 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFD DYALG WFRQAAGKEREGVS CIRCSDGSTYYADSVK( EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALD YYAIG WFRQVPGKEREGVS CISSSDGITYYVDSVK( EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTLD DYAIG WFRQAPGKEREGVS CIRDSDGSTYYADSVK( FR3 CDR3 FR4 RFTISSDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA SIVPRSKLEPYEYDA WGQGTQVTVSS RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAT DSGGYIDYDCMGLGYDY WGQGTQVTVSS RFTISSDNDKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA WGQGTQVTVSS
00042 00050 00045 00042 00050 00045	FR1 CDR1 FR2 CDR2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLD DYAIG WFRQAPGKEREGVS SIRDNDGSTYYADSVKG EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFD DYALG WFRQAPGKEREGVS CIRCSDGSTYYADSVKG EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALD YYAIG WFRQAPGKEREGVS CISSSDGITYYADSVKG FR3 CDR3 FR4 RFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA WGQGTLVTVSS RFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA SIVPRSKLEPYEYDA WGQGTLVTVSS RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAT DSGGYIDYDCMGLGYDY WGQGTLVTVSS
00921 00928 00938 00956 00921 00928 00938 00956	FR1 CDR1 FR2 CDR2 DYAL CIRCSGGSTYYADSVK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFD G WFRQAPGKEREGVS G YYAI CISSSGGITYYADSVK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFALD G WFRQAPGKEREGVS G DYAI AIRSSGGSTYYADSVK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGITLD G WFRQAPGKEREGVS G DYAI AIRSSGGSTYYADSVK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLD G WFRQAPGKEREGVS G FR3 CDR3 FR4 RFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA SI VPRSKLEPYEYDA WGQGTLVTVSS RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAT DSGGYIDYDCSGLGYDY WGQGTLVTVSS RFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA WGQGTLVTVSS RFTISSDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA WGQGTLVTVSS

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Связывающая молекула, связывающаяся с VEGF и ANG2, которая имеет последовательность в соответсвии с SEQ ID NO: 207, но в которой в качестве N-концевой аминокислоты отсутствует аспарагиновая кислота (D).
2. 2. Связывающая молекула, связывающаяся с VEGF и ANG2, которая имеет последовательность в соответсвии с SEQ ID NO: 210, но в которой в качестве N-концевой аминокислоты отсутствует аспарагиновая кислота (D).
3. 3. Связывающая молекула, связывающаяся с VEGF и ANG2, которая имеет последовательность в соответсвии с SEQ ID NO: 213, но в которой в качестве N-концевой аминокислоты отсутствует аспарагиновая кислота (D).
4. 4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающую молекулу по п.1.
5. 5. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающую молекулу по п.2.
6. 6. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающую молекулу по п.3.
7. 7. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-6.
8. 8. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-6 или вектор по п.7.
9. 9. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего вещества по меньшей мере одну связывающую молекулу по любому из пп.1-3, предназначенная для лечения заболевания, которое ассоциировано с опосредуемыми VEGF и/или опосредуемыми Ang2 воздействиями на ангиогенез.
10. 10. Фармацевтическая композиция по п.9, предназначенная для лечения рака.
11. 11. Способ получения связывающей молекулы по любому из пп.1-3, включающий этапы культивирования клетки-хозяина по п.8, включающей молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-6 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанной связывающей молекулы; и выделение или извлечение этой связывающей молекулы, которая экспрессируется этой клеткойхозяином, из культуры.
12. 12. Способ по п.11, дополнительно включающий этап очистки этой связывающей молекулы.