MX2010014062A

MX2010014062A - Metodos para identificar regiones de enlace a macromoleculas y con tendencia a la agregacion en proteinas y usos de las mismas.

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Publication number: MX2010014062A
Application number: MX2010014062A
Authority: MX
Inventors: Naresh Chennamsetty; Bernhard Helk; Veysel Kayser; Bernhard Trout; Vladimir Voynov
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2011-02-22
Also published as: EP2310970A1; JP2011526382A; KR20110052580A; US20110257104A1; RU2011101997A; JP5694150B2; PL2310970T3; PT2310970E; US20160364521A1; CA2727936C; ES2417781T3; RU2571217C2; CN102099809B; AU2009259906B2; AU2009259906A1; WO2009155518A1; KR101854724B1; CA2727936A1; EP2310970B1; CN102099809A

Abstract

La presente descripción se relaciona a métodos y herramientas computacionales, en base, por lo menos en parte, a simulaciones de computadora que identifican regiones de enlace a macromoléculas y regiones con tendencia a la agregación de una proteína. Las substituciones pueden entonces ser hechas en estas regiones con tendencia a la agregación para modificar las proteínas con estabilidad incrementada y/o tendencia reducida para agregación. Similarmente, las substituciones pueden ser hechas en estas regiones de enlace a macromolécula para modificar proteínas con afinidad de enlace alterada para la macromolécula.

Description

DOS PARA IDENTIFICAR REGIONES DE ENLACE A MACROMO N TENDENCIA A LA AGREGACION EN PROTEINAS Y USOS MISMAS Antecedentes de la Invención El entender y controlar la estabilidad de p ido un propósito muy codiciado para los b eos, e ingenieros. El primer enlace en itución de aminoácidos y enfermedades (Ingram, , 180 (4581) : 326-8) ofrece una perspectiva ial en la estabilidad de proteínas en medad. El reciente incremento tremendo de farma se de proteínas, particularmente farmacéuticos a oglobulinas , ha creado un reto nuevo. Las p éuticas son almacenadas en líquidos por varios r altas concentraciones. El porcentaje de espe er. Nature Reviews Immunology, 2006, 6(5), 343) , su mercado ha estado creciendo en una velo miento promedio anual de 35%, la velocidad todas las categorías de fármacos de biot wal. Nature. Biotech. 2007, 25 (10) 1097).

Los anticuerpos terapéuticos son prepa enados en soluciones acuosas en concentracione es requerido para el tratamiento de enfermeda go, estos anticuerpos son inestables termodinám estas condiciones y se degradan debido a la agr gregación a su vez lleva a una disminución idad de anticuerpo que hace al fármaco ineficaz so generar una respuesta inmunológica . De est una necesidad urgente para desarrollar un enten ico de cómo estos anticuerpos, y en efecto las p eneral, los agregados para descubrir aquellas p circuitos CDR no es la fuerza de agrega namiento, y si injertar los circuitos CDR en u estable no cambia la especificad de enlace del an La tecnología relacionada para prede ones con tendencia a la agregación de proteína pu didas en dos categorías, 1) modelos fenomenológi icas de simulación molecular. Los modelos fenomen principalmente basados para predecir los entes" de agregación a partir de las secuencias p proteínas usando propiedades como la c ofóbica, tendencia a hojas beta, etc, mientras icas de simulación moleculares usan la es imensional y dinámicas de proteínas para ubi ones con tendencia a la agregación. La mayoría icas han sido dirigidas hacia el entender la form ilas amiloides y agregación de otras proteínas ación de una proteína globular pequeña "acilf lar humana (AcP por sus siglas en inglés) j péptidos no estructurados y proteínas no du amente (Chiti, et al., Nature . 2003, 424 pág. te de los Estados Unidos de Norteamérica No. 7 estudio revela correlaciones simples ent edades de agregación y fisicoquímicas como la t beta-hoja, capacidad hidrofóbica y carga, ios son hechos bajo condiciones en las cua ínas son principalmente no estructuradas. De es odelo empírico de tres parámetros es desarroll enlaza la secuencia a la tendencia de agregació l. Nature 2003, 424, 805-808). Este modelo e én, para sugerir variantes de la calcitonina de éptido de 32 residuos para reducir su tendenc ación (Fowler, et al. Proc . Nati. Acad Sci. US dos y proteínas no estructuras. Sin emba ación principal del modelo de siete parámetros los residuos en la secuencia se les da l tancia relativa. Esto es inconsistente vación experimental y simulación la cual mues as regiones son más importantes que otras, dep us tendencia a la estructura secundaria. ecien análisis es además extendido para incluir fac cción para describir la , agregación de cad éptido estructuras (tartagia, G. G. Pawa oni, S. Dobson, C. M. , Chiti, F. , y Vendruscol Biol. (2008) en press) . Algunos sitios predich acuerdo con los sitios tendientes a la ag idos para proteínas tales como la lisozima, mio Un modelo fenomenologico sin parámetros li rollado (Tartaglia, et al. Protein Sci . 2004, 1 apolares, mientras que el momento dipolar de l al polar es usada en el caso de mutación apolar olar a apolar) . Este modelo reproduce la tenden ación relativa de un grupo de 26 secuen péptido, las cuales son predichas para favor sición de beta-hoja paralela en registro.

El modelo de Dubai y colaboradores (Dubai e Biol. 2004, 341, 1317-1326) ha sido modificad sión de una tendencia alfa-helicoidal y fóbico, y comparar la clasificación de tendenc ación de una secuencia de aminoácidos dada encia promedio calculada para un grupo de secue itud similar (Pawar, et al., J. Mol. Biol.. 20 392) . Este modelo ha sido validado en los segm encia a la agregación de tres cadenas de polipé icadas nativamente; ?ß42, a-sinucleina y la prote iormente, TANGO toma en cuenta la estabilidad de o por usar el campo de fuerza FOLD-X. Aunqu le calcular las proporciones absolutas de agrega , proporciona una comparación cualitativa en dos o proteínas que difieren significativam ncía. Serrano y colaboradores (Linding, et al. 2004, 342, 345, 353) han usado TANGO para ana ncía a la ß-agregación de un grupo de p llares no redundantes con un límite superior de idad de secuencia.

Un algoritmo adicional Prediction of Ture Aggregation (PASTA) , es introducido recie editar una función de energía en forma de pa úos que se confrontan entre sí dentro de un ato, et al., Protein Engineering, Design & Se 521-523; Trovato, et al., PloS Comput . Biol . de formación de fibrilas.

Mientras que los modelos fenomenológicos d iormente son mostrados para realizar bien los ños y las proteínas desnaturalizadas, las tend gregación pueden diferir para proteínas globula anticuerpos donde la estructura terciaria ilidad del estado nativo son muy importantes .

Las técnicas de simulación molecular cir las regiones tendientes a la agregación y ecanismo de agregación han empleado en su os de simulación más simples (Ma and Nussiv . Chem. Biol. 2006, 10, 445-452; Cellmer, et al. iotechnology 2007, 25(6), 254). El menos deta modelos de simulación empleado es el modelo de cada residuo es representado como una perla q itio sencillo en una red tridimensional. Mod nuo. El modelo explícito es más exacto que e cito, pero es también más demandante computacion és se desarrolla un protocolo de simulación de d ulares para obtener una información estructura ación ordenada de polipéptidos amiloido hini et al., J. Mol. Biol . 2006, 357, 1306-13 go ya que el procedimiento es de tacionalmente especialmente para proteínas gran anticuerpos no parece haber simulación ató uerpo completo en la literatura. Sin embargo, h laciones atómicas de partes pequeñas del anticu ayoría para el fragmento Fab (Noon, et al., PNA 6466; Sinha and Smith-Gill, Cell Biochemis ysic. 2005, 43, 253).

Numerosos procedimientos existentes para e" ación de anticuerpos emplean el uso de adi ano (Patente de los Estados Unidos de Norteamé 05) , detergentes y tensioactivos como los tensi se de polisorbato (Publicación DE2652636, y Pub 5906 (Solicitud de Patente de Gran Bret 4349) ) , chaperonas como GroEL (Mendoza, Bio 1991, (10), 535-540), amortiguador de 22335) o agentes quelantes (solicitud WO9115509) aditivos permiten a las proteínas ser estabili grado en solución, sufren de ciertas desventa ecesidad de etapas de procesamiento adicion ión de aditivos. De esta forma, se requiere os para entender los mecanismos implicados ación de proteínas e identificar las regi ína las cuales median este fenómeno. Los método útiles en una variedad de áreas de diagnó éuticas, y pueden permitir que las composici estabilidad incrementada y/o tendencia reduci ación .

Adicionalmente la presente descripción se r todos y herramientas computacionales , en base, en parte, a simulaciones de computadora que ide nes de enlace a macromoléculas de una proteí ituciones y eliminaciones pueden entonces ser h regiones de enlace a macromoléculas para modif ínas con afinidad de enlace alterada a la macrom En una modalidad relacionada un méto lar la tendencia de agregación espacial (SAP s en inglés) para un átomo particular en una ende (a) identificar uno o más residuos de ami modelo estructural que representa la proteína, o o más residuos de aminoácidos tienen por lo i dentro de una región espacial definida centr Se entiende que en modalidades partícula n espacial definida es cualquier volumen o mensional. En modalidades específicas la región ida es seleccionada del grupo el cual compr a, un cubo, un cilindro, una pirámide y un e ico. En algunas modalidades la región espacial na región la cual tiene un volumen equivalente a con un radio de entre 1-30 Á, o más. En idades el radio puede ser 50 Á ó más. En idades preferidas el radio de la región ida es 5Á ó 10Á.

En algunas modalidades preferidas la ial definida es una esfera la cual tiene un 1Á ó 30Á. En algunas modalidades la esf ada en el átomo particular, mientras, que lidades la región espacial definida o esfe a región espacial definida son átomos en una al de uno o más aminoácidos.

En modalidades adicionales uno o más átomo adio elegido en un modelo estructural pueden se ridos para estar en una cadena lateral de un ácidos. Alternativamente, el uno o más átomos de elegido en un modelo estructural pueden ser ridos para ser los átomos de cadena principal minoácidos .

El área accesible al solvente (SAA por su nglés) la cual es parte del cálculo de SAP pu as modalidades ser calculada solamente en ales de aminoácidos, o, en algunas modalidades s omos de cadena principal. Los átomos de cadena p n o no pueden incluir los átomos de hidrógeno un En algunas modalidades particularmente pre ender además realizar simulaciones de d ulares y promediar los valores de la SAP calcula iples etapas de tiempo en la simulación de d ulares. Por ejemplo la SAP para el átomo pa ser calculada por realizar una simulación de d ulares antes a la etapa (a) anterior y rep s (a) - (d) , cada vez que se realiza una simul icas moleculares adicional en una pluralidad d iempo, por lo mismo produciendo las sumas múltip a etapa (d) , y calcular el promedio de las suma romedio calculado es la SAP para el átomo partic s ejemplos, puede ser usada una simulación Mon o en combinación con una simulación de ulares .

En modalidades adicionales las clasificac pueden ser sumadas sobre aminoácidos múltipl ncia de proteína o espacialmente en la estru ína .

En donde los métodos llamados para simul icas moleculares, la simulación puede ser r o un empaque de simulación a partir del grupo ende o el cual consiste de ABINIT, AMBER, A ?, CPMD, CHARMM, DL_POLY, FIREBALL, GROMACS , S, MdynaMix, MOLDY, MOSCITO, NAMD, Newton-X, P , SIESTA, VASP, TINKER, YASARA, ORAC y idades particularmente preferidas, el emp ación es el empaque de simulación CHARMM. E idades preferidas el empaque de simulación es el imulación NAMD.

En donde los métodos llamados para los para uno o más átomos dentro de una cadena úo o proteína (por ejemplo, calcular SAA para U s comprenden átomos, grupos de átomos, etc.

En modalidades preferidas adicionales el ctural es un modelo de estructura de cristal de a proteína, o una porción de la misma. En mod ionadas el modelo estructural teórico es un m ogia de la proteína o porción de la misma. idades el modelo estructural teórico es un ctural de proteína ab initio de la proteína, o misma.

En otro aspecto la presente invención pro os para identificar regiones con tendenci ación en una proteína. En una modalidad el mét ificar una región con tendencia a la agregació ína, comprende (a) mapear sobre el modelo estruc como se calcula de acuerdo a cualquiera de los itos en la presente para átomos en la proteín En otra modalidad el método para identif n con tendencia a la agregación en una ende graficar los valores de SAP como se ca do a cualquier método descrito en la presente lar para los picos en la gráfica el área (AUC por sus siglas en inglés) e identificar u nes con una AUC positiva, en donde la reg ncia a la agregación comprende las regiones de ificadas .

En otro aspecto la invención proporciona hacer una variante de proteína la cual ex ncia reducida para agregación. En una m erida, un método para hacer una variante de pro exhibe una tendencia reducida a la agr rende reemplazar o eliminar por lo menos un re ácidos dentro de una región con tendenci En otra modalidad un método para hacer una roteína la cual exhibe una tendencia reduci ación comprende (a) por generar una plural ntes de proteína por reemplazar, en cada variant un residuo dentro de una región con tendenc ación en la proteína, en donde la región con ten ación es identificada usando las clasificaci ladas de acuerdo a cualquier método descrit nte, en donde uno o diferentes residuos o di naciones de residuos se reemplazan en cada var onde el por lo menos un residuo es reemplazado úo el cual es más hidrofílico, y (b) selecci nte de proteína como en (a) la cual exhibe una t ída para agregación.

En algunas modalidades el aminoácido el cionado es el aminoácido más hidrofóbico ( úos son más o menos hidrofílicos o hidrofóbic es la escala de capacidad hidrofóbica de B .

En algunas modalidades por lo menos dos res ácidos dentro de la región con tendencia a la ag reemplazados. En modalidades relacionadas por residuos de aminoácidos dentro de la re ación son reemplazados. También, en mod ares por lo menos un residuo es reemplazado d e una región con tendencia a la agregación dentr ínas .

En modalidades preferidas los métodos desc presente son aplicados a una proteína la cionada del grupo el cual consiste de un anticu entó de Fab, un fragmento Fab', un fragmento entó Fv, un fragmento F(ab')2 y un fragmento Fe. icada, una proteína la cual comprende aminoác ales, o una proteína la cual comprende aminoá es .

En otro aspecto la invención también pro os para calcular el SAA efectivo para un res ácidos en una proteína. Un método preferi lar el SAA efectivo para un residuo de aminoá roteína, comprende (a) calcular para un aminoá rción del área accesible al solvente (SAA) de lo s aminoácidos para el SAA de átomos en un ico el cual es totalmente expuesto; (b) multip rción por la capacidad hidrofóbica del aminoác etermina por una escala de capacidad hidrofó ácidos, donde el producto es el SAA efectiva ácido. Además, el SAA efectivo para un res ácidos en una proteína puede ser calculado por u ificar una región dentro de la proteína la cu pluralidad de átomos que tienen una SAP>0; en n de enlace a macromolécula comprende los ami omprenden la pluralidad de átomos.

En otro aspecto la invención incluye méto ificar una región de enlace a una macromolécul ína, el cual comprende identificar uno o más ami cuales contienen uno o más átomos que tienen a un umbral elegido; en donde la SAP es calc do al método de cualquiera de los aspectos prev la región de enlace a una macromolécula compr ácidos identificados.

En otro aspecto la invención incluye méto ificar una región de enlace a macromolécula ína, los cuales comprenden graficar los valore se calcula en cualquiera de los aspectos prec molécula en la proteína, en donde la región de molécula es identificada usando clasificacio lados de acuerdo a cualquiera de los aspectos pr onde, si se reemplaza el residuo de aminoácidos, lazado con un residuo de aminoácidos más hidrofí forma que la afinidad de enlace para la macromol riante se reduce. En ciertas modalidades por lo laza un residuo y por lo menos un residuo se eli aspecto la invención también incluye métodos pa variante de proteína la cual exhibe una afí e alterada para una macromolécula, el cual compr rar una pluralidad de variantes de prote lazar en cada variante por lo menos un residuo d región de enlace de macromolecula para la macro la proteína, en donde la región de enlac molécula es identificada usando clasificaciones minoácidos dentro de una región con tendenc ación es Phe, Leu, lie, Tyr, Trp, Val, Met, P o Gly. En ciertas modalidades el residuo de ami al es más hidrofílico es seleccionado del grupo iste de Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, Asp y as modalidades, el residuo de aminoácidos el cua fílico es un aminoácido no usual, no na ficado. En ciertas modalidades el residuo de ami ual es más hidrofílico es para determinar la e cidad hidrofóbica de Balck and ould. En Üdades por lo menos dos residuos de aminoácido a región de enlace a macromolécula son reemplaz tas modalidades por lo menos tres residuos de ami ro de la región de enlace a macromoléc lazados . En ciertas modalidades por lo menos un minoácidos es reemplazado dentro de la re ína es seleccionada del grupo el cual consist uerpo, un fragmento de Fab, un fragmento F entó Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab' entó Fe. En ciertas modalidades que pue nadas con las modalidades precedentes, la pro citocina, una quimocina, una lipocina, una mio transmisor, una neurotrofina, una interleucin ferón. En ciertas modalidades que pueden ser co las modalidades precedentes, la proteína es una h factor de crecimiento. En ciertas modalid molécula es un receptor de hormona o receptor d recimiento. En ciertas modalidades la proteín tor o dominio de receptor. En ciertas modalida molécula es un agonista de receptor o un antago tor. En ciertas modalidades la macromolécula ista receptor o un antagonista del receptor del al comprende formular una variante de proteína cuerdo a un proceso de cualquiera de los dentes junto con un portador, adyuvante y/o ex able farmacéuticamente.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención maneja la neces da para entendimiento más profundo del meca ación de proteínas, y para identificar las reg ína implicadas en la agregación. La i rciona, por lo menos en parte, una tecnol lación la cual puede ser usada, al mismo tiempo os experimentales descritos en la presente, para estabilidad de potencialmente todas las p éuticas contra la agregación. Esta tecnologí e potencial científico y potencial c iderando las terapias a base de anticuerpos q umplida para identificar exactamente las regi ína implicadas en el enlace con otras macromolé cuales el enlace está con frecuencia mediado, en parte, a través de grandes parches hidrofób n ser fácilmente identificados usando los itos en la presente. La invención proporciona, en parte, una tecnología de simulación la cu usada, al mismo tiempo con los métodos experi itos en la presente, para alterar la afinidad d potenciales todas las interacciones molécul ínas que están mediadas, por lo menos en s de grandes parches hidrofóbicos . Esta te e enorme potencial científico y comercial cons las terapias a base de proteínas están crecien más alta entre todas las clases de tera os. La capacidad para alterar una afinidad d participar en interacciones de proteína, inter roteína macromolécula, o agregación de prote os proporcionados son basados en una nueva ita en la presente como la "tendencia a la ag ial" o "SAP" . La herramienta de SAP también id ctamente las regiones del anticuerpo con ten e con otras proteínas. Además de los anticuerp mienta puede ser aplicada ampliamente a to ínas para identificación de las regiones con ten gregación o las regiones las cuales enlaza ínas o ligandos. Los métodos de la presente i n ser aplicados a cualquier proteína para la c nible una estructura tridimensional o para la CU creada una estructura tridimensional usando model logía, la modulación molecular o determina ctura ab initio. En general, la "SAP" pu ente la capacidad hidrofóbica de los residuos ína, sino también la estructura tridimensiona ína, y la proximidad de residuos de aminoácido ctura de proteína duplicada.

El término "proteína" es entendido por c ncía de dos o más aminoácidos (también referid nte como "residuos de aminoácidos" o "residuos" sí por enlaces peptídicos entre los grupos car de los aminoácidos adyacentes, independientemen itud, modificación post traducción, modificación ción. "Polipéptido" , "péptido" , y "proteína" so cambiablemente en la presente. En mod ridas, los métodos de la presente invenc ados a una proteína la cual es de suficiente duplicarse en una estructura tridimensional. En Üdades, la proteína es una proteína que se encu S á&es la proteína puede ser una proteína deriv ejemplo, una proteína conjugada químicamente (in no limitada a proteínas conjugadas a políme lo, proteínas pegiladas) . Como se usa en la pres ino "proteína" también se propone para incluir fr roteína. Proteínas de ejemplo incluyen anticuer e limitan a fragmentos, variantes y derivados s .

En efecto, está comprendido que los métod ente invención puedan ser aplicados a cualquier se de aminoácidos para la cual está disponible generado un modelo estructural. Por ejemplo, los ritos en la presente pueden ser aplicados a ficadas, o proteínas las cuales incorporan aminoá ies o no naturales como se describe en la pres as modalidades, las estructuras de aminoác 3; y Freidinger, . M. (1989) Trends Pharmac 0. Ver también Sawyer T.K. (1995) "Peptidomimeti hemical Approaches to Peptide Metabolism" en Tay Amidon G.L. (eds.) Peptide-Based Drug olling Transport and Metabolism, Capítulo 7; Smi et al. (1995) J. Am. Chem. Soc . 117:11113-11123 . 3rd, et al. (1994) J. Am. Chem. Soc 116:9947-9 hman. R. ; et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 11 . ' Un gran número y variedad de péptidos, poli entes terapéuticos de proteína son conocido ea, y son esperados para beneficiarse de los mé resente invención. Estos agentes terapéuticos co s clases muy amplias, las cuales incluyen h ínas, antígenos, inmunoglo esores/activadores, enzimas citosinas, gui iones y enfermedades, incluyendo cáncer, enfe ólicas, enfermedad cardiovascular, af tarias y menopausia.

Inicialmente , se pensó que solamente ínas forman fibrilas o agregados. Evidencia más ras que muchas más proteínas que las esperada nes con tendencia a la agregación (Fandrich M, F . , and Dobson, C.M (2001) Nature 410, 165-I o, se documenta que los péptidos tan cortos úos pueden formar fibrilas (J. Biol . Chem. V 45, 43243-43246, Noviembre 8 de 2002) .

Los terapéuticos de proteína represen cipación de crecimiento del mercado terapéutic lo, la insulina y el glucagon son terapéut ína importantes los cuales regulan el azúcar sa n beneficiarse de los métodos descritos en la p s, la eritropoyetina es una hormona producida la cual puede ser usada en el tratamiento d a, falla renal, y otras afecciones. Finalme tonina es un péptido que ha sido encontrado ivo en el tratamiento de hipercalcemia , enfer y ciertos tipos de osteoporosis .

Ejemplos adicionales de proteínas las cu stas para beneficiarse de los métodos descrito nte incluyen, sin limitación ACTH, tensina, angiogenina, péptidos anti-inflamatori finas, endotelinas, GLIP, factor de liberació na de crecimiento (GRF por sus siglas en ina, insulinotropina, neuropéptido Y, PTH, VIP, iberación de la hormona del crecimiento (GHRH s en inglés) , octreotida, hormonas pituitari lo, hGH) , ANF, factores de crecimiento, na, péptido relacionado a gen de calcitonina ( siglas en inglés) , IGF-1, pentigetide, prot ína S, timosina alfa -1, análogos de antagon resina, TNF- negativo dominante, alfa-MSH, VEGF éptidos, fragmentos, análogos de polipépt ados de los mismos de los mencionados anterior esente .

En modalidades particularmente preferi ína es un anticuerpo o inmunoglobulina . El icuerpo" es usado en el sentido más a cíficamente cubre los anticuerpos monoclonal es incluyen anticuerpos biespecífieos) , anticu a sencilla, anticuerpos quiméricos, ant binantes, y fragmentos de anticuerpos. Un antic itud completa es una glicoproteína la cual compr enos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas (L) ína A se enlaza en la unión ¾-¾ de Fe y amente en la purificación de anticuerpos total a ligera está comprendida de una región vari a ligera (abreviada en la presente como VL) y un ante de cadena ligera. La región constante d a está comprendida de un dominio CL. Las regione n ser además subdivididas en regió variabilidad, nombradas regiones determinan ementaridad (CDR por sus siglas en mezcladas con regiones que están más cons ada regiones de cuadro (FR por sus siglas en VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR di terminación amino a terminación carboxi en el s : FR1, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4. Las bles de las cadenas pesadas y ligeras conti io de enlace que interactúa con un antígeno. 993) ; un fragmento Fd el cual consiste de los CHI; un fragmento el cual consiste de los dominio solo extremo de un anticuerpo, un fragmento d ., (1989), Nature 341:544-546), el cual consist io VH; una región determinante de complementa sus siglas en inglés) y un nanocuerpo, una ble de cadena pesada la cual contiene un solo ble y dos dominios constantes .

Como se usa en la presente una proteína ctural" es una representación de una es daria, terciaria y/o cuaternaria tridimensiona ína. Un modelo estructural comprende las estruc al de rayos X, estructuras NMR, estructuras de p cas, estructuras creadas de modelación de ho os de tomografía de proteína, y modelos ruidos de estudios microscópicos de ele ruido ante una estructura conocida de una ar. En modalidades preferidas, el modelo est preprocesado antes de aplicar los métodos de la ción. Por ejemplo el modelo estructural puede se avés de una simulación de dinámicas moleculare tir a las cadenas laterales de la proteína alea rmación más natural, o el modelo estructural p tido para interactuar con solvente, por ejempl una simulación de dinámicas molecular ocesamiento no es limitado a simulaciones de d ulares y puede ser realizado usando cualquie ido en la técnica para determinar el movimient ína en solución. Una técnica de simulación alt jemplo es una simulación de Monte Cario. Las simu n ser realizadas usando los empaques de simu uier otro medio de computación aceptable. En os estructurales creados por métodos ab i ación de homología. Un "modelo de homología o estructural de proteína tridimensional el o por modelación de homología, el cual amente comparar una secuencia primaria de prote ctura tridimensional conocida de una proteína delación de homología es bien conocida en la t escrita en Kolinski et al. Protein 1999:37(4) : et al., B. Protein Sci. 1996 :5(8) :1704-171 tes de los Estados Unidos de Norteamérica : 647; y 6125331 los cuales son incorporados en la referencia. En particular, Xiang (Curr Protein P Jun ; 7(3), 217-27, incorporada en la present rencia) proporciona una excelente descrip rvación de las técnicas de modelación de homol es pueden ser usadas para generar estructuras úti W (Bates t al . , Proteins : Structure , Funct ics, Suppl. 2001:5:39-46), NESt (Xiang, Curr .

Sci. 2006 Junio: 7 (3 ): 217-227 ) y BUILDER (K ué, Curr Opin. Struct Bio. 1996 : 6 (2 ): 222-226 uerpos en particular, la estructura de bles de anticuerpos puede ser obtenida exa o el método de estructuras canónicas (Chothia C J. Mol. Biol.. 1987, 196, 901: Chothia C et al , 342, 877) .

En modalidades particulares, la modela logía puede ser usada para ensamblar las p ies a partir de los fragmentos de estructura co cuando el fragmento Fab de anticuerpo es modela ento Fe, o cuando un fragmento Fab es creado ctura de proteína teórica y modelado en una es ristal de fragmento Fe. Un técnico experto enten eo química (Bonneau and Baker, Annual Re hysics and Biomolecular Structure. 2001, v nas 173-189 ; Lesk Proteins 1997: 1 : 1 l. Zemla, et al., Proteins: 1997-1:1 l . Ingwall, et al., Biopolymrs 1968:331- Patentes de los Estados Unidos de Norte 6832162; 5878373; 5436850; 6512981; 7 893 ; y la solicitud de los Estados Un eamérica NO. 9/788,006: 11/890,863; y 10/i cuales son incorporadas en la present rencia) . Típicamente, las est rmiñadas exper imentalmente (por e ucturas de cristal de rayos X) y mode logía son preferentemente para modelos aJb que la dificultad en simular el ens icción de proteína de novo, en algunos riben varios ejemplos en procedimientos pa ejemplo en las publicaciones relacionadas nity Wide Experiment on the Critical Ass Techniques for Protein Structure Pre ornar Conference Center, Pacific Grov embre 26-30 de 2006 y también en edings, Proteins : Structure, Functio nformatics 2005: 61(S7) :l-26; CAS P 5 proce eins: Structure, Function and Genetics, 6) :333-595; CASP4 proceedigns, Pr cture, Function, and Genetics, 2001. 45 CASP3 proceedings, Proteins: Structure, F Genetics, 1999: 37(S3) :l-237 (1999) .

La presente invención también proporc do para hacer una variante de proteína be una tendencia reducida a la agregació ficacla o no es tratada.

El término "inhibir" es entendido para na reducción medible en un fenómen uencia usado en la presente en refere racciones o agregación de enlace de proteí Los residuos de aminoácidos, glomér duos, regiones de proteína, péptidos o par superficie de proteína pueden con frecuen ritos en la presente como hidrofíli ofóbicos. De acuerdo a los métodos nción la tendencia a la agregación e ribe capacidad hidrofóbica y es calcula e, usando una escala de capacidad hidrofó oácidos conocida en la técnica. En una mo erida, la escala de capacidad hidrofóbi oácido es la escala indicada en Black and Tabla 1 Ala 0616 Cys 0.68 Asp 0.028 Glu 0.043 Phe 1 Gly 0.501 His 0.165 lie 0.943 Lys 0.283 Leu 0.943 Met 0.738 Asn 0.236 Pro 0.711 GIn 0.251 Arg 0 Ser 0.359 Thr 0.45 ación) , será reemplazado por otro aminoácido el ior en una escala de capacidad de hidrofobici ío, si se selecciona el aminoácido metioni lazo, éste puede ser reemplazado con c ácido el cual es menos hidrofóbico, por ejemp Ala, Gly, etc. En modalidades particu ridas, un aminoácido hidrofóbico es reemplazado odalidades preferidas adicionales, se reemp ácido hidrofóbico con Glu, Gln, Asp, Thr, o Ser , cuando se describe un residuo como "más hidro hidrofílico" , "más hidrof bico" , o "más hidrofól minación de capacidad hidrofóbica/capacidad hid hace de acuerdo a cualquier escala de c fóbica conocida en la técnica, por ejemplo, e rida es Black and Mould.

En la práctica, cualquier escala reconoci nte invención.

Además de la capacidad hidrofóbica de amin métodos descritos en la presente pueden asig idad hidrofóbica para un átomo dentro de una pr o estructural de proteína. En una modal cidad hidrofóbica de átomo" es una proporció idad hidrofóbica del aminoácido la cual comp y el númvero de átomos en el aminoácido, rentemente, el número de átomos en la cadena la ácidos. En una modalidad similar wla c fóbica del átomo" , puede ser una fracción idad hidrofóbica del residuo la cual es proporc o, área superficial del átomo en cuestión. Por átomo de oxígeno compone 5% del volumen de un ninoácidos , la capacidad hidrofóbica del átomo d ígeno será 5% de la capacidad hidrofóbica del re ibución del átomo para la capacidad hidrofóbi se describe anteriormente, la capacidad hidrofó ácido es determinada de acuerdo a una es fobicidad conocida en la técnica.

El término "región con tendencia a la agr se discute en la presente, es una región ctura de protína la cual tienen una tendenc e a otras proteínas, de esta forma, increme bilidad para formación de agregado. La reg ncia a la agregación exhibe carácter hidrofóbi dentifica por las clasificaciones SAP descrita nté . En otra modalidad, una región con tenden ación es una región la cual es más hidrofóbica nes circundantes. En una modalidad específica, l tendencia a la agregación puede ser una imensional, espacial definida, por ejemplo una es s tienen una clasificación SAP superior al umb ío >-0.5, >0, >0.5, etc, o, en una modalidad comprender aquellos átomos o residuos que ti bajo la curva calculada (en una gráf ficaciones SAP como se describe posteriormente) gún umbral, por ejemplo, >-0.5, >0, >0.5, >1, > etc .

En un aspecto los métodos de la invención logía de simulación molecular para preprocesar cturales de proteína y/o para identificar entes a la agregación en proteínas. Por ejem ación de dinámicas moleculares puede ser emplea alcular SAP o SAA. En la práctica, cu ca/empaque de simulación que muestrea rmacionl puede ser usado de acuerdo a los itos. El modo preferido de simulación molecula én ser modelados en simulaciones MDS . Las simu ten a un experto en la técnica observar la estru ína como puede aparecer cuando se solvata, iones más exactas en la estructura de prote diar las mediciones múltiples en varios puntos imulación. En una modalidad preferida, la si ular es realizada usando el paquete de simulació ks et al. J. Comput . Che., 1983, 4, 187). lidad preferida la simulación molecular es r o el paquete NADM (Phillips et al. Jou tational Chemistry, 2005, 26, 1781) . Un expert ica entenderá que los múltiples paqutes pue os, por ejemplo, el paquete CHARMM puede ser fijar o preprocesar un modelo estructural de p atar la estructura, etc y el paquete NAMD p eado para las simulaciones las cuales llegan a s américa No. 5424963; 7096167 y la solicitud de os Estados Unidos de Norteamérica No: 11/520 3,594. En particular, las siguientes platafo are pueden ser empleadas para simulaciones de d ulares : ABINIT (Gonz et al. Comput . Mat . Scienc 478; Gozne et al. Kristallogr. 2005, 220 it.org/); A BER (Duan et al. Journal of Compu istry. 2003, 24 (16) : 1999-2012 ; amber.Scrip lph (agilemolecule.com/Products.html, junio de ) ; CASTEP (Segall, et al. J. Phys : Cond. Mat 1) ¡2717-2743 ; Clark et al. Zitschrif tallographie, 2005, 220(5-6) pág. 567-570; cast . (manual CMPD para versión C PD 3.11.0, marz ; cpmd.org/manual.pdf); CHARMM (Brooks et al. . 1983, 4:187-217; charmm.org); DL_P0LY (Todorov DL POLY 3 USER MANUAL. STFC Daresbury Laboratory.

Laaksonen, Computer Physics Communications. 200 89; fos.su.se/-sasha/mdynamix/); MOLDY (Mol ama de simulación de dinámicas moleculares p computadoras en serie y paralelo; Computer nications. 2000, 126(3) : . ox . ac . uk/~keithr/modly . html ) ; M0SCIT0 (Dietmar Alfons Geiger, User's Guide and Manual, MOS rming Molcular Dynamics simulations. Abril 7 r . chemie .uni-dortmund.de/M0SCIT0/manual4.pdf) ; rx et al. IBM Journal of Research and Developmen en 52, nno. ½; Phillips et al., Procedigns of S .cs.uiuc.edu/research/moldyn/); Newton-X (M. B ranucci, M. Ruckenbauer, M. Pérsico, H. Lischka, paquete para dinámicas de Newton cercano al ba miento, versión 0.15b, 2007; unive . ac . at/ tti, et al., J. Photochem. Photobio. A 190, 228 pi.univie.ac.at/vasp/: TINKER (Ren and Ponder. . B. 2003, 107. 5933-5947; dasher.wustl.edu/t A (Krieger E. Koraimann G, Vriend G. Protei .393-402) : ORAC (Procacci. Et al. Phys . Chem. -10469; chim.unifi.it/orac/); XMD (XMD online Molecular Dynamics Program Jon Rifkin, V2.5.3 2002) .

Como se usa en la presente, los oácido" y "residuo de aminoácidos" y "residuo algunas modalidades, ser usados sinónimamen ise a un aminoácido ya que este existe en u do, por ejemplo, en solución tiene grupos xi no enlazados, o ya que existe en una prote lo, un residuo de aminoácidos enlazado covalent lo menos otro aminoácido por medio de un e ido. Un experto en la técnica entenderá la qu cida, un grupo hidroxilo, un grupo alquenilo, nilo, un grupo éter, un grupo tiol, un grupo su upo seleno, un grupo éster, un grupo tioácido, o, un grupo boronato, un grupo fosfo, un grupo upo fosfina, un grupo heterocíclico, un grupo e imina, un grupo aldehido, un grupo hidroxila ceto, un grupo azúcar, un grupo alfa-hidroxi , propilo, un grupo ciclobutilo, un grupo ciclopen 2 -nitrobencilo, un grupo 3 , 5-dimetoxi-2-nitro rupo 3 , 5-dimetoxi-2-nitroveratrol carbamato, u bencilo, un grupo 3 , 5-dimetoxi-2-nitrobencilo amino.

Por ejemplo, , el aminoácido no natural pu limitación, cualquiera de los siguientes amin XÍ metionina, norvalina, 0-metilserina, crotil xileucina, alo-isoleucina, norleucina, ' ácid nilalanina, 3 , 5-F2- fenilalanina, 2 , 3 -F2-fenil r2-fenilalanina, 2, 5-Br2-fenilalanina, alanina, 3 , 4 -Br2-fenilalanina, 3 , 5 -Br2- fenilalani enilalanina, 2 , 4-C1. sub2-fenilalanina, alanina, 2 , 5-Cl2-fenilalanina, 2 , 6-Cl2-fenil l . sub2-fenilalanina, 2 , 3 , 4-F3-fenilalanina, 2 alanina, 2 , 3 , 6 -F3-fenilalanina , 2 , 4 , 6 -F3- fenil -F3-fenilalanina, 2 , 3 , 4 -Br-sub3-fenilalanina, 2, alanina, 2 , 3 , 6-Br3-fenilalanina, 2,4,6-lalanina, 3 , 4 , 5 -Br3- fenilalanina, 2, lalanina , 2,3, 5 -Cl3-fenilalanina, 2, lalanina, 2 , 4 , 6-Cl3-fenilalanina, 3, lalanina, 2,3,4, 5 -F4-fenilalanina, 2,3,4,5-lalanina, 2,3,4, 5 -Cl - fenilalanina, 2,3, lalanina, 2,3,4,5, 6 -Br5-fenilalanina, 2,3,4, lalanina, ciclohexilalanina , hexahidrot logía Ambrx ReCODE (ambrx.com/wt/pagge/technolo s no naturales seguirán las escalas de hidrof ares a aquellas de los 20 aminoácidos común ío, como se describe en Black and nativamente , la hidrofobicidad de cualquier am atural o no usual puede ser determinada por cas las cuales son bien conocidas en la técni ias revisadas y a las que se hace referencia e . (J. Chromatogr. A. 1000 (2003), 637-655).

El término "análogo del aminoácido" se ref ácido en donde el grupo carboxi C-terminal, N-terminal o grupo funcional de cadena lateral icado químicamente para otro grupo funcion lo, un ácido aspártico (beta-metil éter) es un inoácido de ácido aspártico; N-etilglicina es un minoácidos de glicina; o alanina carboxamida Ejemplos no limitantes adicionales ácidos no usuales (es decir, raros) , no natu gos los cuales pueden ser substituidos en una cuerdo a los métodos de la invención son: 0- ina, L-3 (2-naftil) -alanina, 3 -metil-L- fenil alanina fluorinado, p-benzoil-L-fenilalanina, p alanina, p-bromo-L- fenilalanina, p-amino-L-fenil ihidroxi-L- fenilalanina , isopropil -L- fenilalani -L-fenilalanina, 3 , 4 -dihidroxi -L-fenil opil-L-fenilalanina , p-azido-L-fenilalanina, p-a alanina, m-acetill-L-fenilalanina, 4 - ( 2 -oxo-pro alanina, y los aminoácidos (y métodos para in mismos) los cuales son descritos en las Patent os Unidos de norteamérica No. 7,083,970; las sol Patentes de los Estados Unidos de nort /126,931; 11/002,387; 11/254,170; ll/ : 83-93 los cuales son incorporados en la prese encia. Ejemplos adicinales de aminoácidos no n n ser encontrados, por ejemplo, en las si caciones de patente de los Estados Uni américa. Los contenidos de las cuales se incor resente para referencia. 2003-0082575, 2005- 0108885, 2005-028536 y 2005-0009049. 1. Tendencia a la Agregación Espacial La invención en la presente se relaciona a identificar regiones tendientes a la agregació ficie de proteína y para evitar o reducir la ag na proteína y para identificar una región de molécula en una proteína. Los métodos en la sentan un avance en la capacidad de tacionales para identificar regiones de prote s pueden ser modificadas para reducir la tendenc ' i. oteína, es decir, la superficie de un modelo est oteína. La esfera de la sonda tiene el mismo ra de una molécula de agua, R=1.4Á. Los nativos para calcular SSA, descritos posteriorme idos en la técnica y son compatibles con los itos en la presente. Aunque SAA es muy ú terizar la superficie de la proteína, se encon decuado para caracterizar los parches hidrofóbic superficie de la proteína que son potenc ientes a la agregación debido a las si entaj as , . SAA no distingue entre regiones hidrofó hidrofílicas .

. SAA no es directamente proporcional hidrofobicidad de residuo (por ejemplo, MET t área superficial que LEU pero es menos hidrof efectivo, es generado por calcular la hidrofobi racción del aminoácido el cual es expuesto a la rior : SAA AA efectivo = x hidrofobicidad del re SAA ""totalmente expuesto Una modalidad adicional del SAA efectiv ende resumir el SAA efctivo sobre por lo menos eños tres, por lo menos cuatro, por lo menos cin enos seis (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinc residuos de aminoácidos los cuales son adyacent ncia de proteína primaria. Aunque el SAA senta una mejora sobre el SAA básico, no obs cia de capacidad para tomar en cuenta total ctura de la proteína duplicada y por el hecho de , más avanzada, llamada tendencia de ag ial, la cual destaca la hidrofobicidad efectiv o parche o región en la superficie de prote ncía de agregación espacial es calculada para iadas definidas en o cerca de los átomos de un m ctura de proteína .

En este contexto, una "región espacial defi pacio tridimensional o volumen elegido para capt ctura física local y/o ambiente químico en o cer ctura de proteína. En una modalidad particu rida la tendencia a la agregación espacial es c regiones esféricas con radio R centrado en los eos, o colocados en espacio cerca del ctural . Por consiguiente, en otra modalidad la S calculada para una región espacial definida cen omo, por ejemplo, centrado en un punto en el es 15Á, por lo menos 20Á, por lo menos 25Á, ó por En modalidades particularmente preferidos, e do está entre 5Á y 15Á, más preferentemente en más preferentemente entre 5Á y 10Á. En mod © o íficas el radio elegido es 5A ó 10A.

En modalidades adicionales, la región para endencia a la agregación espacial es calculad ica. La posible conformación de la región pued ender una cuba, un cilindro, un cono, un e ico, una pirámide, un hemisferio, o cualqui rmación la cual puede ser usada para encer ón del espacio. En tales modalidades, el tama n puede ser elegido usando mediciones difere , por ejemplo, la distancia a partir del cent rmación para una cara p vértice.

En una modalidad preferida, la SAP puede s imentalmente . En el segundo procedimiento, el lto rendimiento para estabilizar aditivos, a én el diseño racional de aditivos perm ificación de formulaciones óptimas para una éutica .

La presente invención es esperada para per so de incremento de estabilidad por identifica ntes existentes para agregación computacional zar variantes con substituciones en aquellos imentalmente.

De esta forma, en términos generales, u calcular la tendencia de agregación espacial particular en una proteína comprende (a) ide o más átomos en un modelo estructural que repre ína, en donde uno o más átomos están dentro n espacial definida centrada en o cerca de identificar uno o más residuos de aminoácido o estructural el cual representa la proteína, más residuos de aminoácidos tiene por lo menos o de una región espacial definida centrada en átomo particular; (b) calcular, para cada uno úos de aminoácidos identificados, una proporc accesible al solvente (SAA) de los átomos ácido para el SAA de los átomos en un residuo cual es totalmente expuesto; (c) multiplic rción por la hidrofobicidad de uno o más res ácidos como se determina por una esc fobicidad de aminoácido; y (d) sumar los product (c) ; donde la suma es la SAP para el átomo par dalidades preferidas, el modelo estructural es p S a la etapa (a) por permitir al modelo estructu ractuar con el solvente simulación dinámica mo vez que realizan una simulación de dinámica m onal en una pluralidad de etapas de tiempo, por ciendo múltiples sumas como en la etapa (d) , y romedio de las sumas; donde el promedio calcula ara el átomo particular.

En otras modalidades, este método puede ender realizar opcionalmente una simulación de d ulares antes a la etapa (a) y repetir las eta cada vez realizando una simulación de d culares adicionales en una pluralidad de et o, por lo mismo produciendo múltiples sumas co a (d) , y calcular el promedio de las sumas: edio calculado es la SAP para el átomo particular Un experto en la técnica apreciará lidad de la presente invención la cual emplea el alores calculados sobre una simulación de d tos, por ejemplo, el banco de datos de proteína siglas en inglés) , por lo mismo identificar rap úos hidrofóbicos y parches en todas las estruc ína conocidas. Este método permite el tamizado r es grupos de proteínas para identificar entes a la agregación potencial y/o si acción de proteína.

En una solicitud preferida, la tendenci ación espacial es descrita por la siguiente fórm tendecia a la agregación espacial (SAP) hidrofob , l átomo á Rtodmclo i totalmente expuesto En donde : ) SAA-R de los átomos de cadena lateral de radio R es computado en cada snapshot de sitr solamente los átomos de la cadena lat aminoácido. El SAA puede también ser calc solamente los átomos de cadena princi aminoácido (es decir aquellos átomos de la es principal de péptido e hidrógenos aso Alternativamente, el SAA puede ser calcu solamente los átomos de cadena princi aminoácido con la exclusión de hidrógenos asoc SAA-fe es SAA de cadena lateral de residuo to expuesto (es decir para el aminoácido "X") el obtenido, en una modalidad preferida, por cal SAA de las cadenas laterales del residuo med conformación totalmente extendida de tripépti X-Ala"; y La hidrofobicidad de átomo es obtenida describe anteriormente usando la esc la cálculo sin alterar totalmente o alte tados .

Como se describió anteriormente, los métod nte invención pueden ser aplicados para cualquie ctural de proteína. Por consiguinte la SAP e la estructura de rayos X puede ser fijada como: SAA de átomos de cadena tendencia a la agregación lateral dentro del radio R espacial (SAP) ; X hidr SAA de átomos de cadena jej ¿to lateral del residuo total átomo i mente expuesto Similarmente, si la estructura de rayos X nible, el mismo parámetro de tendencia a la ag ial puede ser aplicado a la estructura generada a modelación de homología, y el parámetro SAP p promediados sobre cada uno del residuo de idual, o sobre grupos pequeños de residuos.

II. Usos de la Invención En un aspecto, la presente invención pu como se describe anteriormente para ide úos de aminoácidos hidrofóbicos , regiones o pa proteína. Sin desear para mantener para los va l específico, residuos de átomos o aminoácidos q endencia de agregación espacial >0 son considera idrofóbicos , o para estar en una región de tend ación. Dependiendo del tipo de proteína, la es cular, y el solvente en cual existe, puede ser identificar átomos o residuos usando un corte ligeramente abajo del cero, por ejemplo, por el s o residuos los cuales tienen una tendenc ación espacial de más de -0.1, -0.15, -0 mensional) . Un método preferido para selecciona siduos en un parche hidrofóbico es mapear los va ncía a la agregación espacial calculada, por o una codificación de color o codificación n modelo estructural de proteína , por ejemplo us icación de color o codificación numérico, en e ctural de la proteína a partir de lo cual se sta forma visualizando diferencias en la tenden ación espacial entre la superficie de proteí anto permitiendo selección fácil de parches hidr siduos. En una modalidad preferida particularme los para tendencia a la agregación espac izados separadamente usando dos valores elegidos , uno de resolución superior, por ejemplo 5A, lución inferior, por ejemplo 10A. En una modali es hidrofóbicos más grandes o más estrechos pu utación para el residuo el cual tiene la clasi P más alto o es más hidrofóbico (por ejemplo, el hidrofóbico en el parche de acuerdo a la escala ould, Anal. Biochem. 1991, 193, 72-82) .

En una modalidad específica un méto tificar una región con tendencia a la agregació eína comprende (a) mapear sobre el modelo estruc como se calcula de acuerdo a cualquiera de los ritos en la presente para átomos en la proteín tificar una región dentro de la proteína la cu pluralidad de átomos que tienen una SAP>0; en ón tendiente a la agregación comprende los ami cuales comprenden la pluralidad de átomos . lidad la SAP puede ser calculada para todos lo na proteína o una porción de los átomos. Se conte uede calcular la SAP para residuos particulares a proteína son graficadas en una gráfica y el á rva (AUC por sus siglas en inglés) es calculada en la gráfica. En la modalidad, los picos con A sentan una o mas regiones tendientes a la ag fóbicas. En modalidades particulares será cionar el reemplazo de uno o más residuos los cu ificados como que existen en un pico, rentemente, en un pico con un AUC grande.

En modalidades particulares la presente i ser usada para hacer una variante de prote e una tendencia reducida para agregación por re lo menos un residuo de aminoácidos dentro de un tendencia a la agregación en la proteína identifi uiera de los métodos descritos en la presente úo de aminoácidos el cual es más hidrofíl uiera de los métodos descritos en la presente fobicidad de Black and Mould.

En una modalidad similar la presente i ser usada para hacer una variante de proteína e una tendencia reducida para agregación por gen lidad de variantes de proteína por reemplazar, nte por lo menos un residuo dentro de una re ncía a la agregación en la proteína, en donde l tendencia a agregación es identificada usa ficaciones SAP calculadas de acuerdo a cualquie ito en la presente, en donde uno o diferentes re entes combinaciones de residuos se reemplazan nte, y en donde el por lo menos un res lazado con un residuo el cual es más hidrofílic cionar una variante de proteína como en (a) e una tendencia reducida para agregación.

Además, un residuo de aminoácidos en una re ial arriba de los cuales se seleccionan los re cuentemente, una pluralidad de variantes de ser generada por reemplazar en la proteína u úos de aminoácidos seleccionados (o uno o más caen en el parche seleccionado) con resi ácidos, los cuales son más hidrofílicos , de t una pluralidad de variantes de proteína son sentando una variedad de diferentes substituc ácidos . Esta población puede entonces ser tamiz cionar una o más variantes de proteína las cuale tendencia reducida para agregación. Un expert Íca apreciará que múltiples regiones tendient ación pueden ser identificadas, y que una tituciones y/o eliminaciones pueden ser hechas regiones tendientes a la agregación. La c fóbica relativa de los aminoácidos puede ser dét Las variantes de proteína pueden ser hec uier método conocido en la técnica incluy énesis dirigida a sitio y otra tecnología binante, por ejemplo, ver las Patentes de los s de Norteamérica NO. 5284760; 5556747; 31, 5932419 y 6391548 las cuals son incorporad nte para referencia.

. En modalidades particulares la presente i ser usada para hacer una variante de proteína e una tendencia reducida para agregación por re lo menos un residuo de aminoácidos dentro de l tendencia a la agregación en la proteína identifi uiera de los métodos descritos en la presente úo de aminoácidos natural, * un residuo de ami ficado, un residuo de aminoácidos no usual, un re ácidos no natural, o un análogo de aminoá oteínas puede ser empleado incluyendo, pero no ellos métodos descritos o a los que se hace re s publicaciones Liao J. Biotechnol Prog. 2007 : 28-31; Rajes, and Iqbal, Curr Pharm Biotech o 7 (4) -247-59; Cardillo et al. Mini Rev Med Ch ; 6 (3) : 293-304 ; Wang et al. Annu Rev Biophys t . 2006:35:225-49. Chakraborty et al., Glycoconj ; 22(3):83-93 las cuales son incorporadas en la referencia. Como un ejemplo adicional, la te ReCODE™ puede ser empleada para desarr porar aminoácidos no naturales, o aminoácidos no roteínas como se indica por los métodos descrit nte .

Las variantes de proteína de acuerdo a la i n exhibir estabilidad mejorada o incrementada mina, por ejemplo, por estudios de est stre o inicial. En la modalidad, la est mentada puede ser evidente como un increment ición de la temperatura de fusión en la vari iben los métodos adicionales para medir la agreg ínas en la solicitud de Patente de los Estados U américa No. 10/176,809 la cual se incorpora nte para referencia.

En otro aspecto de la invención la tenden ación espacial calculada puede ser usad ificar sitios de interacción de proteína-proteí uperficie de una estructura de proteína. Es con écnica que los sitios de interacción de prot encia contienen residuos hidrofóbicos o fóbicos. Se espera que los métodos descrito nte serán útiles para ubicar sitios de enl ificar parches hidrofóbicos Los parches hidr tienen una SAP>0; en donde la región de e molécula comprende los aminoácidos que compre lidad de átomos.

En otro aspecto la invención también os para identificar una región de en molécula, en una proteína, la cual comprende ide o más aminoácidos que contienen uno o más át n una SAP mayor a un umbral elegido; en donde l lada de acuerdo al método de cualquiera de los os y en donde la región de enlace a macro ende los aminoácidos identificado.

En otro aspcto la invención incluye méto ificar una rgión de enlace a macromolécula ína, la cual comprende graficar los valores SAP lan en cualquiera de los aspectos precedntes, ca los picos en la gráfica, el área bajo la curva molécula es identificada usando clasificacio lados de acuerdo a cualquiera de los aspectos pr nde, si se reemplaza el residuo de aminoácidos , lazado con un residuo de aminoácidos el C fílico, de tal forma que la afinidad de enlace molécula de la variante se reduce . En idades por lo menos se reemplaza un residuo y un residuo se elimina. En otro aspecto la i ién incluye métodos para hacer una variante de ual exhibe una afinidad de enlace alterada molécula, el cual comprende (a) generar una pl ariantes de proteína por reemplazar en cada vari enos un residuo dentro de una región de e molécula para la macromolécula en la proteína, egión de enlace a la macromolécula es identificad ificaciones de SAP calculados de acuerdo a cualq ncía a la agregación es Phe, Leu, lie, Tyr, T Pro, Cys, Ala o Gly. En ciertas modalidades el inoácidos el cual es más hidrofílico es seleccio el cual consiste de Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, H y Arg. En ciertas modalidades, el residuo de ami ual es más hidrofílico es un aminoácido no u al o modificado. En ciertas modalidades el re ácidos el cual es más hidrofílico es determ do con la escala de capacidad hidrofóbica de B . En ciertas modalidades por lo menos dos res ácidos dentro de la región de enlace a macromolé lazados. En ciertas modalidades por lo men úos de aminoácidos dentro de la región de molécula son reemplazados. En ciertas modalidade un residuo de aminoácidos es reemplazado dentr n con tendencia a la agregación dentro de la p uerpo, un fragmento de Fab, un fragmento F entó Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab' ento Fe. En ciertas modalidades que pue nadas con las modalidades precedentes, la pro citocina, una quimocina, una lipocina, una mio transmisor, una neurotrofina, una interleucin ieron. En ciertas modalidades que pueden ser co las modalidades precedentes, la proteína es una h factor de crecimiento. En ciertas modalid molécula es un receptor de hormona o receptor d recimiento. En ciertas modalidades la proteín tor o dominio de receptor. En ciertas modalid molécula es un agonista de receptor o un antago tor. En ciertas modalidades la macromolécula ista receptor o un antagonista del receptor del tninio de receptor. En ciertas modalidades que pu métodos de la invención. En aún otro aspe ción proporciona un servicio a base web, a dor, a base de internet para determinar las reg ncía a la agregación en una proteína, el ser comprende aceptar datos acerca de una prote ío, un modelo estructural de proteína) a parti io (por ejemplo, sobre la internet) o recup a partir de la base de datos de tal forma edor de servicio puede generar, recuperar o acc ctura estática de la proteína, opcionalmente que lación de dinámicas moleculares de la proteí rcionar una estructura dinámica de la p minar SAP para átomos o residuos de la proteína estructura estática o dinámica así generada, y datos de SAP, por ejemplo, como un modelo est do con los datos de SAP por el proveedor de se fobicidad de aminoácido , etc, y un servidor de realizar el cálculo SAP en base en informació de datos e información proporcionada o trans s del internet por el usuario.

En algunas modalidades, el servidor we dor de cálculo son el mismo sistema de computa as modalidades el sistema de computadora computadora, una computadora de red, o una est jo sencilla o servidor.

En una modalidad relacionada el servidor ma de cálculo SAP además comprende un controla olar la operación total, una unidad de conexió conectar a la internet, y una unidad de servici proporcionar servicio web para calcular SAP al nal a través de la internet.

Además, las modalidades de la presente i sitivo de almacenamiento de datos que puede a los cuales después de esto pueden ser leídos ma de computadora. Ejemplos de medios leí tadora incluyen, pero no se limitan a disco s suave, mandos rápidos, discos ópticos (por eje HD-DVD, discos de rayos Blu, etc.) y conf ialmente dispositivos hardware tales como c rados especificados de aplicación (ASIC) o disp os programables (PLD por sus siglas en inglés) . e en computadora puede también ser distribuido de datos e emplificada en una onda portadora de sistemas de computadora acoplada de tal form o leíble de computadora es almacenado y ejecutad distribuida. Será apreciado por aquellos expert ica que los elementos hardware y software d iormente son de diseño estándar y construcci able farmacéuticamente. Las composiciones farma a invención también pueden ser administradas en ombinación, es decir, combinadas con otros agen ío, la terapia de combinación puede incl ína de la presente invención combinada con por agente anticáncer.

Como se usa en la presente, "portador a céuticamente" incluye cualquiera y todos los so s de dispersión, recubrimientos, y agentes antif es isotónicos y de retraso de absorción, y simil compatibles fisiológicamente. Preferentemen dor es adecuado para administración intr muscular, subcutánea, parental, espinal o ep ejemplo, por inyección o infusión) . Dependien de administración, el compuesto activo, es d ína o variante del mismo de la invención, p 19) . Ejemplos de las sales incluyen sales de ad y sales de adición de base. Las sales de ad incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgá os, como ácido clorhídrico, nítrico, fo rico, bromhídrico, yodhídrico, fósforo y simila también de ácidos orgánicos no tóxicos como áci icarboxílieos alifáticos, ácidos alcanoicos ituidos, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aro s sulfónicos alifáticos y aromáticos y simila de adición de base incluyen aquellas deri es alcalino térreos, como sodio, potasio, m o y similares, así como también de aminas orgá as, como N, -dibenciletilendiamina , N-metilgl procaína, colina, dietanolamina, etilendiamina , ilares .

Una composición farmacéutica de la i erol, y similares; y (3) agentes de quelación d el ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacéti sus siglas en inglés), sorbitol, ácido tartáric rico, y similares.

Ejemplos de portadores acuosos y no ados que pueden ser empleados en las compo céuticas de la invención incluyen agua, etanol, glicerol, propilenglicol , polietilengli ares) , y mezclas adecuadas de los mismos, ales, como el aceite de oliva, y ásteres 0 tables, como el oleato de etilo. La fluidez a ser mantenida, por ejemplo, por el uso de mater rimiento, como la lecitina, por el mantenimi o de partícula requerido en el caso de dispers l uso de tensioactivos .

Estas composiciones pueden también ngada de la forma farmacéutica inyectable pu da aproximadamente por la inclusión de agen s retrasan la absorción como el monoestea nio y gelatina.

Los portadores aceptables farmacéut yen soluciones o dispersiones acuosas estériles iles para la preparación extemporánea de solu rsiones inyectables estériles. El uso de los es para substancias farmacéuticamente acti ido en la técnica. Excepto hasta ahora en que o o agente convencional es incompatible con el c o, se contempla uso del mismo en las compo céuticas de la invención. Los compuestos lementarios pueden también ser incorporados siciones .

Formulaciones de ejemplo comprenden por estos de estabilización o desagregación pue idos en composiciones farmacéuticas de la i diendo de su uso propuesto y su toxicidad biológ estos de estabilización pueden incluir, por dextrina y sus derivados (Patente de los Estado Norteamérica no. 5730969), composición lglicósido (solicitud de Patente de los Estado Norteamérica No. 11/474,049), el uso de m ronas (por ejemplo, Lea (Goyal et al., Biochem. (pt 1) : 151-7; los métodos de la Patente de los s de Norteaméria NO. 5688651) , compuestos de , Burn, Tolbert, Bioconjug. Chem. 2008 ma ioactivos (por ejemplo, Pluronic F127, Pluron 20 (Wei et a. International Journal of Pharma 338 (1-2) : 125-132)), y los métodos descrito tes de los Estados Unidos de Norteamérica NO. naciones de diferentes clases de excipient lo, (1) disacáridos (por ejemplo, sacarosa, treh les (por ejemplo, sorbitol, manitol) actú ilizantes por exclusión preferencial y son es de actuar como crioprotectores dura lización, (2) tensioactivos (por ejemplo, Polyso orbat 20) actúan por minimizar interacci ínas en las interfaces como liquid ido/superfice material y/o líquido/interfaces de amortiguadores (por ejemplo, fosfato, citrato, hi n a controlar y mantener la formulación de Íguiente, los polioles de disacárido, tensioa iguadores pueden ser usados además de los métod nte invención para además estabilizar las p r su agregación.

Las composiciones terapéuticas típicament ecitina, por el mantenimiento del tamaño de pa ridas en el caso de dispersión por el oactivos. En muchos casos, será preferible es isotónicos, por ejemplo, azúcares, polial manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la comp bsorción prolongada de las composiciones iny ser llevada aproximadamente por incluir sición un agente que retrasa la absorción, por de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pue radas por incorporar el compuesto activo en la rida en un solvente apropiado con una o una com ngredientes enumerados anteriormente, como se r Ído por microfiltracion de esterilización. Gener reparan las dispersiones por incorporar el c o en un vehículo estéril que contiene un combinada con un material portador para prod de dosis sencilla variará dependiendo del sujet ado, y el modo particular de administración. La ingrediente activo la cual puede ser combinada rial portador producir una forma de dosis almente será esa cantidad de la composición uce un efecto terapéutico. Generalmente, fuera ciento, esta cantidad estará en el inter imadamente 0.01 por ciento a aproximadamente n e por ciento del ingrediente activo, preferente ximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente to, más preferentemente de aproximadamente 1 por imadamente 30 por ciento del ingrediente ac inación con un portador aceptable farmacéuticamen Los regímenes de dosis son ajustad orcionar la respuesta deseada óptima (por ejem ados como dosis unitaria para los sujetos das; cada unidad contiene una cantidad predet compuesto activo calculada para producir el éutico deseado en asociación con el céutico requerido. La especificación para las f d de dosis de la invención son dictadas tamente dependiente de (a) las características compuesto activo y el efecto terapéutico partic ogrado, y (b) las limitaciones inherentes en la ompuesto como un compuesto activo para el tratam bilidad en individuos .

Para administración de la proteína, la do 1 intervalo de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/m mente 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal del ?? jemplos las dosis pueden ser 0.3 mg/kg de peso c /kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, entes programa de dosificación: (i) cada cuatro seis dosis, entonces cada tres meses, (ii) c as, (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez segui de peso corporal cada tres semanas.

Alternativamente una proteína de la invenci administrada como una formulación de li nida, caso en el cual se requiere menos admini ente . La dosis y frecuencia varia dependiendo de de la substancia administrada en el pacie al, los anticuerpos humanos muestran la vida m , seguido por anticuerpos humanizados, ant ricos, y anticuerpos no humanos. La dosis y fr administración puede variar dependiendo de miento es administrado en intervalos relat entes sobre un periodo largo de tiempo, ntes continúan recibiendo tratamiento por el ción pueden variar para así obtener una canti diente activo la cual es efectiva para lo esta terapéutica deseada para un paciente par .sición y modo de administración, sin ser tóxica nte. El nivel de dosis seleccionada dependerá dad de factores farmacocinéticos que incl idad de las composiciones particulares de la ción empleada, o el éster, sal o amida del m de administración, el tiempo de administrac rción de excreción del compuesto particular ado, la duración del tratamiento, otros f estos y/o materiales usados en combinación siciones particulares empleadas, la edad, sex ción, salud general e historia médica anter ente que es tratado, y factores similares bien c s técnicas médicas. rentemente por lo menos aproximadamente 40%, inc rentemente por lo menos aproximadamente 60%, y preferentemente por lo menos aproximadamente ión a los sujetos no tratados. La capacida iesto para inhibir el crecimiento tumoral pu ada en un sistema de modelo animal predictiv cia en tumores humanos. Alternativamente, esta p na composición puede ser evaluada por exam idad del compuesto para inhibir, la inhibición ensayos conocidos para el practicante exper idad efectiva terapéuticamente de un c éutico puede disminuir el tamaño del tumor, o mejoran los síntomas en un sujeto. Un experto o a técnica puede ser capaz de determinar las canti a los factores como el tamaño del sujeto, la gra síntomas del sujeto, y la composición particula tánea, espinal u otra parental de administra lo por inyección o infusión. La frase "admini tal" como se usa en la presente significa istración diferentes a la administración ent a, usualmente por inyección, e incluye, sin lim ción intravenosa, intramuscular, intraa tecal, intracapsular , intraorbital , intrac dérmica, intraperitoneal , subcutánea, subcu articular, subcapsular, subaracnoidea, intra ral e intraesternal e infusión.

Alternativamente, una proteína de la i ser administrada por medio de la ruta no párent ruta tópica, epidérmica o mucosal de administrac lo, intranasal, oral, vaginal, rectal, subli camente .

Los compuestos activos pueden ser prepar por ejemplo Sustained and Controlled Relea ery Systems, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekke or, 1978.

Las composiciones terapéuticas puede istradas con dispositivos médicos conocidos ea. Por ejemplo, en una modalidad preferi sición terapéutica de la invención pue istrada con un dispositivo de inyección hipodér , como los dispositivos descritos en las Patente os Unidos de Norteamérica No. 5,399,163; 5, ,335; 5,064,413; 4,941,889; 4,790,824; ó 4, los de implantes bien conocidos y módulos útil nte invención incluyen: Patente de los Estados U américa No. 4,487,603, la cual describe una infusión implantable para dispensar medicació rción controlada: Patente de los Estados Un américa No. 4,439,196 la cual describe un si istro de fármaco osmótico el cual tiene compart ulticámara ; y la Patente de los Estados Un américa No. 4,475,196, la cual describe un si istro de fármacos osmótico. Estas patent poradas en la presente para referencia. Much ntes, sistemas de suministro y módulos son c aquellos expertos en la técnica.

Ej emplos Introducción a los Ejemplos Las técnicas de simulación molecular para regiones tendientes a agregación y estudiar el m gregación tienen modelos de simulación comparat le más empleados (Ma y Nussinov. Curr. Opin. Chem , 10, 445-452; Cellmer, et al., TRENDS in Biote , 25(6) , 254) a diferencia de los modelos -12933; Istrail et al. Comput . Biol. 1999, 6, iarelli et al . , Chem. Phys . 2000. 113, 50 o et al., J. Chem. Phys . 2001, 114, 561-569 ; Br h J. Chem. Phys . 2003, 118, 5185-5194; Combe and . Phys 2003, 118, 9015-9022; Toma an cromolécules, 2000, 1, 232-238; Gupta et al. 1998, 7, 2642-2652; y Nguyen and Hall Bio g. 2002, 80; 823-834). Aquí cada residuo es repr una perla que ocupa un sitio sencillo en mensional. Debido a su simplicidad, el modelo d demandante computacionalmente y ha sido usa ar grandes sistemas para escalas a gran es o. Aunque estos modelos de red proporcionar una ísica básica que subyace a la agregación de prot sentan exactamente la estructura secundaria y te puede tomarse en cuenta para diferentes interacc . Genet. 2001, 44, 376-391; Nguyen et al., Prot 13, 2909-2924 ; Nguyen and Hall. J. Am. Che 128, 1890-1901; Jang et al., Biophys J. 2004, ang et al., Protein Sci. 2004, 13, 40-53). Est ado exitosamente para simular la formación de fi r de sistemas que contienen entre 12 y 96 de pep lanina (16 residuos cada uno) que inicia a pa o aleatorio (Nguyen and Hall, Proc . Nati. Ac ., 2004, 101 (46), 16180-16185; Nguyen and Hall Soc. 2006, 128, 1890-1901). Dokholyan y colab an un modelo para estudiar la formación de est eta-hoja fibrilar por ocho modelos de prote io Src SH3 (Ding, et al., Mol. Biol .. 2002, 3 o por 28 modelos de péptidos Abeta (1-40) (Peng, Rev. E: Stat . Ph. Interdiscip. Top . 2004, 69 ) . ación del heptapéptido GNNQQNY (SEQ ID N0:17), rte de la proteína de levadura Sup25 (Gsponer, . Nati. Acad. Sci. U.S. A. 2003, 100, 5154-51 o similar es usado para la agregación de ide Abl6-22 (KLVFAE (SEQ ID NO: 18) en hoj aralelas (Klimov and Thirumalai, Structure 20 07) . Dokholyan and colaboradores (Khare, ins 2005, 61, 617-632) usa un modelo atómico e investigar la tendencia a la agregación ordena la secuencia de la enzima Cu, dismutasa super (S0D1 por sus siglas en inglés) . Ellos han dese ecuencia S0D1 en heptapéptidos de traslape y rea o mayor de simulaciones dinámicas moleculares ícitas (cada una de 0.5 ns) de segmentos mono icos y tetraméricos . Con esto identifican las idogénicas en la secuencia SOD1 para ser: s de cada segmento. La tendencia a la beta-ag con la secuencia del péptido Abeta de Alzheime contrado para ser altamente heterogéneo con un m egmento Vi2HHQ LVFFAE22 (SEQ ID NO: 19) y mí o dipéptidos como de cambio. Usando esta téc o predicho en la tendencia de agregación de una oble punto del dominio N-terminal del prion de es verificado in vitro usando el ensayo de e avina T. El procedimiento para descomponer la c éptido en segmentos de traslape puede ser extrem te para sistemas como los anticuerpos debido a o. Incluso una simulación atómica de un an leto sencillo en solvente explícito es muy de tacionalmente debido al tamaño de un anticuerpo , no parece ser simulación atómica de anticuer literatura. ación espacial" descrito en la presente. Estas endencia a la agregación son entonces mutad ar anticuerpos con estabilidad incrementa los descritos en la presente se refieren a mod culares, no limitantes de la invención. lo 1; Metodología de Simulación de Dinámicas Mol Las simulaciones de dinámicas molecula zadas para un anticuerpo completo usando un mod co. La estructura inicial para simulación para uerpo es obtenida a partir de las estructuras de ragmentos Fab y Fe individuales. La estructura de na prueba de concepto (POC por sus siglas en in ento de Fab se selecciona para modelar la estru s X de Fe obtenido a partir del anticuerpo I ire et al. Science, 2001. 293, 1155). 1HZH es el la estructura de rayos X es conocida para dos ya que cada subdominio de anticuerpo (CHi, CH ene un enlace disulfuro, y de esta forma los son ampliamente distribuidos entre la estruc o entera. La estructura de cuerpo entera resul ces elegida para realizar simulaciones citas para 30 ns . Se usa un patrón de glicosil las simulaciones ya que esto es el pa silación más común observado en los anticuerpos.

Se usa el empaque de simulación CHARMM (B J. Comput . Chem, 1983, 4, 187) para fijar y ana mpaque NAMD (Phillips et al. Journal of Compu stry, 2005. 26, 1781) para realizar la simula de fuerza totalmente atómica CHARMM (MacKerel ys Chem. B. 1998, 102, 3586) es usado para el mo ína y solvente TIP3P (Jorgensen et al. J. Che , 79, 926) para agua. Las simulaciones son realÍ sta forma minimiza el tiempo computacional . Se ciones de enlace periódicas en todas las 3 dire cubierta de solvatación de agua de 8Á es usada ción del cuadro ortorombico. El tamaño de sister tante es 202130 átomos. Se agregan los iones suf neutralizar la carga total del sistema. Se req alidad de la carga por la técnica de suma Ewald calcular la contribución de las inter rostáticas en el sistema.

Después de que se solvata el anticue iza la energía inicialmente con SD (Steepest D fijar la proteína para permitir que el agua s edor de la proteína. Después las restrai idas y la estructura es además minimizada con on-Raphson de Base Adoptado) . El sistema es tado lentamente a temperatura ambiente con incre ial como se describe anteriormente.

En este ejemplo la "tendencia a la ag ial" es calculada para regiones esféricas con el ado en cada átomo en el anticuerpo descrit lo 1. El valor de la tendencia a la agregación aluada entonces con un promedio de simulación 3 agmento Fe del anticuerpo para los dos radios di rches (R=3Á, 10Á) (un experto en la técnica aprec s etapas de tiempo para simulación pueden ser cuerdo a los recursos computacionales disponibl ución deseada del resultado) . En ambos casos e la mayoría de los valores son negativos, indicand ía de las regiones expuestas son hidrofílicas . se espera ya que la mayoría de la superficie exp roteína es usualmente hidrofílica. Se observa tam unas cuantas regiones con picos positivos ncia a la agregación espacial en r=10Á se in o a los parches hidrofóbicos que rodean un fóbico similar.

Anteriormente, se calculó la tendencia ación espacial como un promedio durante la co ación de 30 ns . Los resultados calculados us ación son entonces comparados con la tendenc ación espacial de solo la estructura de rayos ación molecular. La tendencia a la agregación s X) es similar a aquella del valor prom ación, lo cual tiene picos en las mismas ubi con diferencias en la magnitud de los pic encias son superiores con radio más grande de . Esto es probablemente ya que las diferenc vas cuando se observa en tamaños de parches diferencias se originan debido a la exposi ncía a la agregación espacial. Los valores posi ncia a la agregación espacial (hidrofóbi ados en gris o negro mientras que los valores n ofílicos) están en gris más claro o bla sidad del color es proporcional a la magnitud lo tanto un parche hidrofóbico totalmente expues negro oscuro, y similarmente un hidrofílico a sto será blanco más brillante. También la repres ctural del anticuerpo se basa en el área acc nte para cada residuo. En ambos radios usado lo de la tendencia a la agregación espacial (5Á bserva que la superficie es predominantemente ando que la superficie es en su mayoría hidr es otra vez como se espera ya que la mayorí rficie de la proteína es usualmente hidrofíli rgo, son notables unas cuantas áreas negras i entó Fag es donde el anticuerpo enlaza a los an endencia a la agregación espacial es graficada p respectivamente, en donde la misma correlación egiones de interacción pueden ser observadas. LO teraccion de proteína son obtenidos de la estru X de complejos de proteína, entradas PDB 1T89, (Radaev, J. Biol .. Chem. 2001, 276(19) nhofer et al. Hoppe Seyler"s Z Physiol Chem. 19 985: Deisenhofer J. Biochemistry, 1981, 20, 23 -Eriksson et al. Structure, 1995, 3, 26 acciones hidrofóbicas se correlacionan muy bien s positivos de tendencia a la agregación espacia acciones hidrofílicas se correlacionan bien s negativos de la tendencia a la agregación espac anto, el parámetro de tendencia a la agregación ser usado para predecir los sitios de en ficie del anticuerpo. Un parche en el fondo d ficativamente hidrofóbico, pero está algo oculto la región hidrofólica en sus límites. Similarm es son hidrofóbicos y expuestas a solvente, pe ontando en el interior del anticuerpo. Estos n todavía estar implicados potencialme acciones con otras proteínas si son expuestos os conformacionales significativos o desdobla uerpo. Todos los parches hidrofóbicos pueden tam vados en el radio de parche más pequeño (R-5Á) enos contraste comparado con el radio de parche Á) .

Los valores de tendencia a la agregación s X) los cuales se basan en solo la estructura también mapeados en la superficie del anticuer rarlos con los valores promediados de simulac ser usada para obtener una buena descripció ibución de parches hidrofóbicos en la superfic portante ya que la simulación atómica de un an es demandante computacionalmente . Para prote en del modelo estructural de rayos X, e etro de tendencia a la agregación espacial p ado a la estructura generada a través de la mo homología o predicción de estructura ab-ini ctura de homología es observada para ser muy sim structura de rayos X, y sus valores de tendenc ación son también similares a la estructura de r De esta forma la tendencia a la agregación ífica los parches hidrofóbicos en la superficie del an parches pueden ser expuestos nativamente o expuestos luctuaciones dinámicas o parcial desdoblamiento del an os de estos parches hidrofóbicos también se correlaci proteínas. Por lo tanto, el método puede ser amente a todas las proteínas para identificar las entes a la agregación o regiones de enlace con otras pr mpio 3; Selección de Sitios de anticuerpo para Mbdifica Estabilidad Los sitios a ser modificados para estábi uerpo incrementada son seleccionados en la base del Este parámetro espacial se toma en cuenta par (1) área vente (SAA por sus siglas en inglés) de cada residuo idad hidrofóbica del residuo, y (3) las contr iales de todos los residuos dentro de un cierto radio, ío, los residuos hidrofóbicos que corresponden a l ivos en CH2 son cambios a residuos no hidrofóbicos. sto pueda mejorar la estabilidad de proteína total. S seleccionados (Al y A2) corresponden a dos resi fóbicos. Se toma un análisis de substituciones de estos fectados temporalmente en las células HEK2 uerpos tipo silvestre y variantes son purifi r del sobrenadante de cultivo en una column ína A y pasados sobre una columna Q Sepáre nar impurezas cargadas negativamente. En el p , los anticuerpos son cargados postivamente y pe flujo a través, mientras que las impurezas ivamente enlazan a la matriz cargada positivamen na Q Sepharose. La solución con anticuerpo purif ntrada y el amortiguador se intercambia con 2 iguador His pH 6.5 para una concentración fina .

Como un control de calidad, se anali otas de las muestras purificadas y concentradas y dicroismo circular. Tanto las condiciones redu eductoras son usadas para los geles de prot to, H 6.5, y el porcentaje de agregación es dét SEC-HPLC. Se calcula la agregación como la suma dos los picos no monoméricos dividido por el ár odos los picos. El promedio de 2-4 muestras p de tiempo es mostrado. Los agregados para la on tan bajos como 80% de los agregados para stre. De esta forma, una mutación de punto e la formación de agregado por 20%.

Se compara el tipo silvestre y variante calorimetría de barrido diferencial (DSC, Microc cuerpos completos son proteínas de multidomi isis DSC indica diferentes temperaturas de fus rentes dominios (Ionescu, R. M. , et al. J. Ph , 97(4): pág. 1414-26; Mimura, Y., et al. J. Bio 276 (49) : pág. 45539-47) . Los dominios CH tantes de IgGl Fe humanos tienen temperaturas d De esta forma, CH2 es el dominio de anticuerp ratura de fusión más baja.

El tipo silvestre y la variante Al son an a concentración de 2 mg/ml en 15 mM de amortigu .5 y velocidad de calentamiento de 1.5 grados por alizan los datos de muestra por substraer los encia, normalización a la concentración de pr en de células DSC, e interpolación de una lí a. Una comparación de los termogramas muet mento de la transición de fusión de CH2 en la mparada con el tipo silvestre.

Los análisis de la variante A2 también modi ilidad en base a los valores con tendenci ación espacial, recapitula el descubrimiento ante Al.

En resumen, los análisis biofísicos guiente, el SAA efectivo puede ser usado como u ado, a pesar de que es menos poderoso, para ide regiones con tendencia a la agregación de una p alores altos de SAA efectivo (suma de tres r an las regiones más hidrofóbicas y los valor an las regiones más hidrofílicas . Los datos ina de prueba la cual tiene una tendencia a la f gregados se obtienen de simulaciones moleculare .2 ns (duplicados) y lns (no duplicados). Se gr efectivo para residuos de la proteína y se obs buena correlación entre los picos del SAA efec opla en la red de enlace de la estructura de p indica que el SAA efectivo es exactamente res ificacion de la estructura de proteina lo cual esdoblamiento o agregación de la proteína. S s mutantes de la proteína de prueba y por lo a con el factor de crecimiento epidérmico (EGF s en inglés) , factor de crecimiento trans a) y también consigo mismo para formar un dímer nes de enlace para el anticuerpo IgGl y EGFr so modelos para demostrar . la capcidad de la her ara predecir las regiones de enlace.

Métodos de Simulación Molecular Las simulaciones de dinámicas molecula zadas para un anticuerpo IgGl completo usando u atómico con solvente explícito. La estructura simulación es obtenida por unir las estructuras fragmentos Fab y Fe individuales del anticu ctura de rayos X del fragmento de Fab se o ir de Novartis Pharma AG. La estructura de ray ento Fe es obtenida a partir de otro anticuerpo ncia similar, 1HZH (Saphire et al. Science, 20 zar simulaciones atómicas explícitas para 30 úos CYS en el anticuerpo a resultante está cados en enlaces disulfuro, incluyendo unos en l isagra. Se usa un patrón de glicosilación G0 aciones ya que esto es el patrón de glicosila observado en los anticuerpos.

Se usa el empaque de simulación CHA MM (B J. Comput . Chem, 1983, 4, 187) para fijar y ana mpaque NAMD (Phillips et al. Journal of Compu istry, 2005. 26, 1781) para realizar las simulaci de fuerza totalmente atómica CHARMM (Phillips al of Computational Chemistry. 2005, 26, 1781) la proteína y modelo de solvente TIP3P (Jorgense hem. Phys, 1983, 79, 926) para agua. Las simu realizadas en 298K y latm en el ensamble etros para los grupos de azúcar implic dicas en todas las 3 direcciones. Una cubi tación de agua de 8Á es usada en cada direc o ortorombico . El tamaño de sistema total resul 30 átomos. Se observa que el cuadro ort nece establ durante la simulación de 30 ns si o significativo en dimensiones de cuadro en t ejes. Las dimensiones de cuadro inicial son Á, y 83.2 Á, respectivamente, y cambian muy poco imulación30 ns, terminando en 161.9A, 144.7 A, y ctivamente El anticuerpo no gira significat te la simulación 30 ns, por lo mismo manteni ncia mínima entre el anticuerpo y sus dicas de más de 14Á. Se agregan los iones suf neutralizar la carga total del sistema. Se req alidad de la carga por la técnica de suma Ewald calcular la contribución de las inter ces equilibrado para Ins antes de iniciar la com las varias propiedades de la simulaci guraciones son guardadas cada 0.1 ps dur ación para análisis estadístico adicional erramienta SAP para predecir las regiones de enl anticuerpo IgGl Se aplica la herramienta SAP a las configu roteína obtenidas de simulaciones moleculare cciones más rápidas en aplicaciones de alto rend rramienta SAP puede también ser aplicada a la es ayos X de proteína o estructura derivada de hom chaveta que puede llevar a una pérdida de exact SAP para cada átomo en la proteína es definid nuacion : ^SAA de átomos de cadena tendencia a la agregación espacial (SAP) X hidrofob = i ? tripéptido "Ala-X-Ala" ) Se obtiene la hidrofobicidad del residuo a p la escala de hidrofobicidad de Black and Mou Black and D. R. Mould Anal. Biochem. 193, 72 La escala es normalizada de tal forma que la tiene una hidrofobicdad de cero Por lo ta aminoácidos que son más hidrofógicos que la son positivos y menos hidrofóbicos que la gli negativos en la escala hidrofóbica.

SAP da la hidrofobicidad expuesta dinámic cierto parche centrado en el átomo dado s ficie de la proteína. Esto da un valor de SAP ún átomo. Entonces la SAP para un residuo es obte diar la SAP de todos sus átomos const ituyen res SAP son de esta forma evaludados usando R=10Á uerpo IgGl, y los valores son mapeados en la su o se observa el mapa hidrofóbico, las fóbicas parecen ser distribuidas aleatoriamente perficie, y puede ser difícil de tomar una ciert fóbica para ser más dominante comparada con la o go, ante examinación el mapa de SAP de l ctura, es fácil para manchas las regiones altas al indica regiones hidrofóbicas dinámicamente ex esfavorable termodinámicamente para estos parch stos a agua debido a su naturaleza hidrofóbica. , pueden estar implicados en enlace de proteín de reducir su exposición al solvente. Por l n estar implicados en enlace de proteína con e ir su exposición al solvente. Estas regiones a identificadas como "1" a "6" . Los parches "1" y dos en el fragmento Fab, y los parches "2" a dos en el fragmento Fe. Los parches "1" a uerpo con el receptor Fe, proteína A y proteí dos en la parte superior de los valores SAP. Lo nlace de proteína son obtenidos a partir cturas de rayos X de complejos de proteína, entr , 1FC2, y 1FCC (Radaev, J. Biol . Chem. (2001): Deisenhofer et al. Hoppe Seyler's Z . 359. 975-985, 1978,: Deisenhofer J. Biochemis -2370, 1981, Sauer-Eriksson et al. Structure, , . Se encuentra una fuerte correlación entre los fóbicos identificados a través de SAP y reg ee de proteína. El antígeno enlazado con la r ito CDR marcado como parche sAP "1", el rec za al parche de SAP "2", y la proteína a y la pr nlazan con el parche SAP "3". Adicionalmente , D (DeLano et al. (DeLano W. L. , et al. Science 2 0) ) muestra que la región donde la proteína implicados en el enlace. El núcleo del par cado en interacciones hidrofóbicas , mientras s están implicadas en las interacciones polares.

Se analiza SAP en R=10Á para encontrar los fóbicos amplios implicados en el enlace co ínas. Estos parches pueden ser explorados ile usando la SAP en resolución superior, es deci inferior de R usado en el cálculo dee SAP. , los valores SAP son calculados en r=5Á cuerpo. Estos valores SAP son mapeados en la su anticuerpo. Aquí, los valores SAP positivos es hidrofóbicos dinámicamente expuestos, mien valores SAP negativos indican parches hidr estos dinámicamente. Las regiones que enlazan al proteína a y proteína G son también identi lar a los resultados con SAP en R=10Á, la SAP ipal por sí misma, en lugar de con las ales. redice Tanto Regiones de Enlace y Regiones con T a la Agregación Se ha demostrado que los picos en SAP sponden a regiones que tienden a la autoagreg ínas (Chennamsetty, N. et al. Design of the odies with enhanced stability (Submitted ación es una trayectoria de degradación princi proteínas terapéuticas que llevan a su pér idad e inmunogenicidad potencial. Las mu icadas en los picos de SAP llevan a anticuerpos enos tendencia a la agregación (Chennamsetty, N. n of therapeutic antibodies with enhanced s itted) ) . Los 8 mutantes generados por camb úos hidrofóbicos en los picos SAP a tes. Por lo tanto, los sitios con alta SAP sentan las regiones de tendencia a la agregación La herramienta de SAP de esta forma predi nes de enlace de proteína y regiones con tenden ación.

Una explicación probable es que la agreg ínas también es para formar un enlace p ína# aunque dentro de las proteínas del mis onalmente, se muestra que hay un traslape entre as regiones con tendencia a la agregación y las nlace a proteína . Este traslape es evidente a p residuos L235 y L253 que están implicados en e de proteína y agregación. Análisis de SAP sim ficación de proteínas es realizado en otro an donde este muestra que las regiones con tenden ación se traslapan con regione de enlace a la ncías que regiones de enlace a proteína y con t agregación traslapan (Wang, X., et al. mAbs, ) ) . De esta forma, los parches hidrofóbicos e icamente identificados a través de SAP están im nto el enlace de proteína y autoagregacion de pr El traslape entre los sitios de enlace de p s sitios con tendencia a la agregación sin ntan un nuevo reto en diseño de proteínas tera ue la agregación necesita ser evitada mient rva el enlace de proteína necesario para su resolver este reto, puede ser usado el análisi ución superior (en R=5Á) para ubicar y modif s con tendencia a la agregación alrededor nes de enlace sin alterar el enlace de prote lo, usando análisis SAP en el anticuerpo mina que los sitios 1253, L309 y V282 son todos ínas con una tendencia a la agregación inferior onservan la capacidad de enlace á la proteína.

SAP Predice Regiones de Enlace a EGFR Además de los anticuerpos, el análisis zado en otra proteína llamada receptor del f imiento epidérmico (EGFR por sus siglas en ingl cir las rgiones de enlace. EGFR es un rece rficie celular activado por el enlace de cíficos incluyedo el receptor de factor de cre érmico (EFG por sus siglas en inglés) y transf or de crecimiento beta (TGFp) . La sobre expresión bre actividad ha sido asociada con un número de el cáncer de pulmón y el cáncer de cereb ién se enlaza consigo mismo para formar dím iza un análisis SAP en EGFr para ver si las reg ce predichas coinciden con las regiones de enlace uerpo, los residuos hidrofóbicos para E ibuidos a través de la superficie, y puede ser r a los potencialmente implicados en el enl go, es relativamente más fácil manchar las regi , lo cual indica regiones hidrofóbicas e ialmente. Dos parches principales son identif dos como "1" y "2" .

Las regiones de enlace conocidas de EGFR y con otro EGFR en la forma dimérica son mapead superior de los valores SAP. Estos sitios de e eína son obtenidos de estructuras de rayos X de c roteínas, entradas PDB 1IV0 y lMox (Ogiso, H, . 110: 775-787 (2002): Garrett, T. P.J. et a 763-773 (2002)). El mapeado indica una fuerte cor e los parches hidrofóbicos identificados a travé giones de enlace de proteína. EGFR se enlaza c Conclusiones Ha sido descrita una herramienta computacional la cual proporciona una medición de la exposición rches hidrofóbicos que pueden ser usados para pred nes de enlace de proteína. Usando dos proteínas mo uerpo IgGl y EGFR, se muestra que la SAP amente las regiones de enlace a proteína. En el uerpo IgGl, las regiones de enlace con el rece ína a y proteína G se correlacionan bien con los Para EGFR, las regiones de enlace con EGF, GF y se correlacionan bien con los picos SAP. De esta f ra que SAP es exacta para predecir regiones de enl trada la importancia de los parches fóbicamente par enlace proteína-proteína. El mismo P puede ser realizado en otras proteínas así como predecir sus regiones de enlace. Además, se ha mos o el anticuerpo IgGl donde las regiones con tende ación cercanas a los sitios de enlace de proteí icadas para disminuir la agregación mientras se co idad de enlace. La modificación de proteínas sim a SAP puede ser realizado cerca de las regiones tígeno para disminuir la tendencia a la agregación conserva actividad. De esta forma, la herrami ita en la presente puede ser usada para diseñar éuticas estables, mientras que al mismo tiempo con s de enlace. La herramienta SAP puede también s determinar sitios de enlace aún desconocidos para ínas que vienen de los genómicos eestructurales, proporcionando importantes pistas para su función.

Equivalentes Aquellos expertos en la técnica reconocerán, es de determinar tan sólo con la experiment

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ant ama como propiedad lo contenido en las s ndicaciones : 1. Un método para calcular la tendenci gación espacial (SAP) para un átomo particular eína, caracterizado porque comprende: (a) identificar uno o más átomos en un modelo est que representa la proteína, en donde uno o má están dentro de una región espacial definida en o cerca del átomo particular; (b) calcular, para cada uno o más átomos en l espacial definida, una proporción del área al solvente (SAA) de los átomos para el SA átomos en un residuo idéntico el cual está t expuesto; modelo estructural el cual representa la prot donde uno o más residuos de aminoácidos tien menos un átomo dentro de una región espacial centrada en o cerca del átomo particular; (b) calcular para cada uno o más átomos en l espacial definida, una proporción del área a al solvente (SAA) de los átomos para el SA átomos en un residuo idéntico el cual es to expuesto; (c) multiplicar cada proporción por la hidrofobi uno o más residuos de aminoácidos como se d por una escala de hidrofobicidad de aminoácido (d) sumar los productos de la etapa (c) ; onde la suma es la SAP para el átomo particular. 3. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque uno o más átomos de la etap 6. El método de conformidad con la reivin reivindicación 2, caracterizado porque la región ida es una región la cual tiene un equival en para una esfera con un radio de entre 1-30Á. 7. El método de conformidad con la reivin reivindicación 2, caracterizado porque la región ida es una esfera la cual tiene un equival o en para una esfera con un radio de entre 1-30A. 8. El método de conformidad con la reivin reivindicación 2, caracterizado porque la región ida está centrada en el átomo particular. 9. El método de conformidad con la reivin reivindicación 2 , caracterizado porque la región nida está centrada en el enlace químico. 10. El método de conformidad con la reivin reivindicación 2 , caracterizado porque la región particular. 13. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la región espacial defini ada en un punto en el espacio dentro de 5Á a pa particular. 14. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la región espacial defini ada en un punto en el espacio dentro de 2Á a pa particular. 15. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la región espacial defin rada en un punto en el espacio dentro de lA a pa particular. 16. El método de conformidad con la reivin reivindicación 2, caracterizado porque se calc solamente en átomos en las cadenas later reivindicación 2, caracterizado porque el ctural es procesado antes de la etapa (a) realiz ación de dinámicas moleculares la cual opcio ye un solvente . 20. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el solvente es agua. 21. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la simulación de d ulares es realizada usando un paquete de si ido del grupo el cual comprende ABINIT, aph, CASTEP, CPMD, CHAR M, DL_P0LY, FIREBALL, S, LAMMPS, MdynaMix, MOLDY, MOSCITO, NA D, N Mol, PWscf, SIESTA, VASP, TINKER, YASARA, ORAC y 2 . El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la simulación de d iares es realizada usando un paquete de si inámicas moleculares adicional en una plural s de tiempo, por lo mismo produciendo la ples como en la etapa (d) , y calcular el promedi ; donde el promedio calculado es la SAP para cular . 25. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la simulación -de d lares es realizada usando un paquete de si do del grupo el cual comprende ABINIT, aph, CASTEP, CPMD, CHAR M, DL_POLY, FIREBALL, S, LAMMPS, MdynaMix, MOLDY, MOSCITO, NAMD, N Mol, PWscf , SIESTA, VASP, TIN ER, YASARA, ORAC y 26. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la simulación de d lares es realizada usando un paquete de si M. ncialmente adyacentes junto con la secue ínas . 30. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque los aminoácidos ncialmente adyacentes en el modelo estruct ína. 31. El método de conformidad con cualq reivindicaciones 1 a la reivindicación 30, carac e el modelo estructural es un modelo de estru al de rayos X de la proteína, o porción de la mi 32. El método de conformidad con cualq reivindicaciones 1 a la reivindicación 30, carac e el modelo estructural es un modelo de estru ína teórico de la proteína, o porción de la mism 33. El método de conformidad con cualq reivindicaciones 1 a la reivindicación 30, carac 36. El método de conformidad con la reivin o aracterizado porque el radio es 5A. 37. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el radio es 10Á. 38. Un método para identificar una reg ncia a la agregación, caracterizado porque compr a) mapear sobre el modelo estructural de la pro SAP como se calcula de acuerdo a cualquiera reivindicaciones 1, reivindicación reivindicación 24 para átomos en la proteína; (b) identificar una región dentro de la proteína tiene una pluralidad de átomos que tienen una n donde la región tendiente a la agregación c os aminoácidos los cuales comprenden la plura tomos . 39. Un método para identificar una reg ncía a la agregación en una protéina, carac e comprende graficar los valores de SAP como se onformidad con cualquiera de la reivindica ndicación 2 y reivindicación 24, calculando p en la gráfica el área bajo la curva (AUC por su glés) e ificar una o más regiones con una AUC positiva, onde la región con tendencia a la agregación c egiones de proteína identificadas. 41. Un método para hacer una variante de ual exhibe una tendencia reducida a la agr terizado porque comprende: reemplazar o eliminar por lo menos un re ácidos dentro de una región con tendenci ación en la proteína, en donde la región con tendencia a agrega lazado y por lo menos un residuo es eliminado. 43. Un método para hacer una variante de ual exhibe una tendencia reducida a la agr terizado porque comprende a) generar una pluralidad de variantes de prot reemplazar, en cada variante por lo menos un dentro de una región con tendencia a la agreg la proteína, n donde la región con tendencia a agregaci dentificada usando las clasificaciones SAP calcu cuerdo a cualquiera de la reivindicac eivindicación 2, y rivindicación 24, n donde uno o diferentes residuos o di ombinaciones de residuos se reemplazan en cada v y en donde el por lo menos un residuo es reempla n residuo el cual es más hidrofílico, y or lo menos residuo de aminoácidos dentro de un tendencia a la agregación es Phe, Leu, lie, T Met, Pro, Cys, Ala o Gly. 46. El método de conformidad con cualquie ndicación 41 a reivindicación 43, caracterizad esiduo de aminoácidos más hidrofílico se selecc el cual consiste de Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, H y Arg. 47. El método de conformidad con cualquie indicación 41 a reivindicación 43, caracterizad siduo de aminoácidos más hidrofílico es un amino 1, no natural o modificado. 48. El método de conformidad con cualquie indicación 41 a reivindicación 43, caracterizad esiduo de aminoácidos más hidrofílico es determ rdo a la escala de hidrofobicidad de Black and Mo ndicación 41 a reivindicación 43 , caracterizad or lo menos un residuo es reemplazado dentro de región con tendencia a la agregación dentro ína. 52. El método de conformidad con cualquie ndicación 41 a reivindicación 43, caracterizad egión con tendencia a la agregación es identif do al método de conformidad con cualquiera ndicación 38 a reivindicación 40. 53. El método de conformidad con cualquie ndicación 1 a reivindicación 52, caracterizad roteína se selecciona del grupo el cual consist uerpo, un fragmento de Fab, un fragmento F ento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab' entó Fe 54. El método de conformidad con cualquie oteína es un receptor o dominio de receptor. 57. El método de conformidad con cualquie ndicación 1 a reivindicación 52, caracterizad oteína es un neurotransmisor o neurotrofina . 58. El método de conformidad con cualquie ndicación 1 a reivindicación 52, caracterizad roteína es un peptidomimético, una proteína ende aminoácidos no nautrales, o una proteína ende aminoácidos no usuales. 59. Un método para calculcar el SAA efect esiduo de aminoácidos en una proteína, carac e comprende : (a) calcular, para un aminoácido, una proporción accesible a solvente (SAA) de los átomos par de los átomos en el aminoiácido para el SA átomos en un residuo idéntico el cu entes en la secuencia de proteínas. 61. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque además comprende sumar ivo sobre tres aminoácidos los cuales están ad secuencia de proteínas. 62. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque además comprende sumar ivo sobre cuatro aminoácidos los cuales están ad secuencia de proteínas. 63. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque además comprende sumar tivo sobre cinco aminoácidos los cuales están ad a secuencia de proteínas . 64. Un método para hacer una com acéutica la cual comprende una variante de pro exhibe una tendencia reducida a la agr como se calcula de acuerdo a cualquiera reivindicación 1, reivindicación 2, y reivin 24 para átomos en la proteína y ) identificar una región dentro de la proteína tiene una pluralidad de átomos que tienen un en donde la región de enlace a macro comprende los aminoácidos que compre pluralidad de átomos. 66. Un método para identificar una re e a macromolécula en una proteína, caracterizad ende : identificar uno o más aminoácidos que ti que un umbral elegido; en donde la SAP es calculada de acuerdo a ualquiera de la reivindicación 1, reivindicac ndicación 24 y en donde la región de e ositiva . 68. Un método para hacer una variante de ual exhibe una afinidad de enlace reducida p molécula, caracterizado porque comprende: reemplazar o eliminar por lo menos un res ácidos dentro de una región de enlace a macror la macromolécula en la proteína, en donde la región de enlace a macromolé ificada usando clasificaciones SAP calculadas de alquiera de la reivindicación 1, reivindicaci ndicación 24; y en donde, si se reemplaza el residuo de amin es reemplazado con un residuo de aminoácidos el idrofílico, de tal forma que la afinidad de enl cromolécula de la variante se reduce. 69. El método de conformidad con la reivin n donde la región de enlace a macromolécu dentificada usando las clasificaciones SAP calcu cuerdo a reivindicación 1, reivindicación eivindicación 24; n donde uno o diferentes residuos o di ombinaciones de residuos se reemplazan en cada v b) seleccionar una variante de proteína como en ual exhibe una tendencia reducida para agregació 71. El método de conformidad con cualquie ndicación 68 a reivindicación 70, caracterizad r lo menos residuo de aminoácidos dentro de un lace a macromolécula es el residuo más hidrof gión de enlace a macromolécula. 72. El método de conformidad con cualquie ndicación 68 a reivindicación 70, caracterizad aracterizado porque el residuo de aminoácidos el hidrofílico es un aminoácido no usual, no na icado . 75. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el residuo de aminoácidos el hidrofílico es determinado de acuerdo a la es fobicidad de Black and Mould. 76. El método de conformidad con la reivin reivindicación 70, caracterizado porque por esiduos de aminoácidos dentro de la región de molécula son reemplazados. 77. El método de conformidad con la reivin reivindicación 70, caracterizado porque por residuos de aminoácidos dentro de la región de molécula son reemplazados. 78. El método de conformidad con cualquie ndicación 68 a reivindicación 79, caracterizad acromolécula es otra proteína, un polinuclóti acárido . 81. El método de conformidad con cualquie ndicación 68 a reivindicación 79, caracterizad oteína se selecciona del grupo el cual consiste uerpo, un fragmento de Fab, un fragmento F entó Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab" entó Fe 82. El método de conformidad con cualquie ndicación 68 a reivindicación 80, caracterizad roteína es una citocina, una quimocina, una l miocina, un neurotransmisor, una neurotrofi leucina, o un interferón. 83. El método de conformidad con cualquie ndicación 68 a reivindicación 80, caracterizad toro o antagonista de receptor del receptor o do tor . 87. El método de conformidad con cualquie ndicación 68 a la reivindicación 80, carac e la proteína es un neurotransraisor o neurotrof 88. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la macromolécula es un rec otransmisor o receptor de neurotrofina . 89. Un método para hacer una com céutica caracterizado porque comprende una var ína la cual exhibe una tendencia altera acción con un patrón de enlace, caracterizad ende formular una variante de proteína obte do a un proceso de la reivindicación 68 ó 70 j portador, adyuvante y/o excipientes a céuticamente .