KR101975639B1 - 단백질 응집가능성 예측방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 응집(aggregation) 가능성 예측방법 및 아밀로이드피브릴 과다 질환의 위험성을 결정하기 위한 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명은 단백질, 특히 β-2-마이크로글로불린의 cis-trans 이성질체화 및 이에 따른 구조적, 열역학적 변화를 척도로 하여 단백질, 특히 β-2-마이크로글로불린의 폴딩 및 응집 여부를 예측할 수 있는 신뢰도 높은 정보를 제공할 수 있다. 이에, 본 발명은 다양한 단백질 변성질환(protein conformational disorder)을 치료 또는 예방하는 의약의 개발 및 생물학적 치료제로서 응집-내성 단백질을 설계하는 전략 수립에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

단백질 응집가능성 예측방법{Methods for Predicting a Potential for Protein Aggregation}
본 발명은 단백질의 구조적 및 열역학적 특성 분석을 통한 단백질 응집가능성의 예측방법에 관한 것이다.
β-2-마이크로글로불린(β2m)의 응집에 의한 골관절 조직에서의 아밀로이드 피브릴의 형성은 투석관련 아밀로이드증(dialysis-related amyloidosis, DRA)의 특징적 과정이다.1 완전한 신장 기능을 가지는 경우, 1형 MHC(major histo- compatibility complex class I)로부터 분비되는 β2m은 신장에서 여과 및 분해되어 낮은 혈장농도를 유지하게 된다.2 한편 신장 기능에 이상이 있는 경우, 혈청에서 60배의 β2m농도 증가가 관찰된다.2 이러한 높은 농도는 DRA와 관련된 피브릴 형성의 원인으로 생각되어지나, 골관절 조직에서의 피브릴 양과 혈청 내의 β2m 농도 간의 유의한 상관관계는 아직 발견되지 않아3, 추가적인 인자 및/또는 과정이 생체 내에서 β2m 응집 개시에 관여할 것으로 보인다. 나아가, 생리학적 환경에서 β2m의 단량체 형태는 매우 안정적이어서 인 비트로에서는 농도가 상승하여도 응집 경향을 보이지 않는다.4,5
미스폴딩으로도 불리우는 단량체의 부분적인 언폴딩(unfolding)은 응집을 개시하기 위한 필수적인 단계이다.6 이에, β2m 폴딩 동력학 연구로부터 비-자생적 trans-Pro32 백본 형태에 들어맞는 장수명(long-lived) 폴딩 중간체(intermediate)가 동정되었다.7-11 이와 같은 부분적으로 언폴딩된 중간체는 IT-state로 명명되었고, 비-자생적 trans-Pro32 이성질체가 안정화되는 β2m 변이체에서 증가된 피브릴 형성이 관찰되었기 때문에 IT-state는 중요한 아밀로이드 전구체로 간주되었다.5,11-13 그러나, 32번 프롤린 잔기에서 trans 형태가 주로 나타나는 β2m의 몇몇 돌연변이는 아밀로이드 피브릴을 자발적으로 형성할 수 없다고 보고되었으며13, 이는 상기 위치에서의 trans 펩타이드 형태만으로는 β2m가 아밀로이드를 형성하도록 하는 데 불충분함을 보여준다. β2m의 아밀로이드 생성 경향과 보다 직접적으로 관련된 특성을 규명하기 위하여, cis에서 trans Pro32 백본으로의 이성질체화에 의해 유도되는 구조적 및 열역학적 변화에 대해 보다 구체적인 조사가 필요하다.
본 발명자들은 야생형 β2m 및 이의 돌연변이인 D76N, D59P 및 W60C에 대한 자생적(native, N) 및 중간체(intermediate, IT) 단계의 구조적 및 열역학적 특성에 대한 인 실리코 연구를 수행하였다. 분자 동력학(Molecular dynamics, MD) 시뮬레이션을 수행하여 cis-to-trans Pro32 이성질체화로부터 발생하는 원자 수준의 구조적 변화를 분석하였다. Pro32 이성질체화에 따른 구조적 변화의 열역학적 결과를 분석하기 위하여 용매화 자유에너지 계산을 수행하였다. IT-state에서 관찰된 구조적 및 열역학적 특성이 아밀로이드 형성의 원인인지를 조사하기 위하여 돌연변이 효과도 조사하였다. 뚜렷한 응집 특성을 가지는 세 가지 돌연변이인 D76N, D59P 및 W60C를 선정하였다.14,15 병인성인 가족성 돌연변이 D76N 및 합성 돌연변이 D59P는 야생형 β2m에 비하여 아밀로이드를 더 잘 형성하는 것으로 알려진 반면, 합성 돌연변이 W60C는 응집 성향이 낮다. 이에, 본 발명자들은 β2m의 아밀로이드 형성의 중간체에 대해 구조적 및 열역학적 특성을 규명하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Song-Ho Chong, Sihyun Ham, Conformational Entropy of Intrinsically Disordered Protein J. Phys. Chem. B, 117(18): 5503 5509 (2013)
본 발명자들은 액상 환경에서 단백질의 형태 변화 및 이에 따른 응집 가능성을 정량화할 수 있는 분석방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 특정 아미노산 잔기에서 시스-트랜스 이성질체화가 일어나면서 생성되는 부분적으로 언폴딩된 장수명 중간체(long-lived intermediate)를 동정하고, 상기 중간체에서 나타나는 구조적 및 열역학적 특성을 분석할 경우 해당 단백질의 응집 가능성에 대한 신뢰도 높은 정보를 수득할 수 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 단백질 응집(aggregation) 가능성 예측방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 아밀로이드피브릴 과다 질환의 위험성을 결정하기 위한 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (1) 아미노산 잔기의 시스-트랜스 이성질체화; 및 (2) (i)용매에 노출된 소수성 아미노산 잔기 부분의 변화; (ii 용매화 자유에너지의 변화; 및 (iii) β-쉬트 형성의 변화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 구조적 또는 열역학적 변화를 측정하는 단계를 포함하는 액체 환경에서의 단백질 응집(aggregation) 가능성 예측방법을 제공한다.
본 발명자들은 액상 환경에서 단백질의 형태 변화 및 이에 따른 응집 가능성을 정량화할 수 있는 분석방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 특정 아미노산 잔기에서 시스-트랜스 이성질체화가 일어나면서 생성되는 부분적으로 언폴딩된 장수명 중간체(long-lived intermediate)를 동정하고, 상기 중간체에서 나타나는 구조적 및 열역학적 특성을 분석할 경우 해당 단백질의 응집 가능성에 대한 신뢰도 높은 정보를 수득할 수 있다는 사실을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 "측정"은 특정 데이터를 활용하여 미지의 값을 도출하는 일련의 연역적 및 귀납적 과정을 포괄하는 의미이며, 이에 "계산", "예측", "규명", "결정"과 동일한 의미로 사용된다. 따라서, 본 발명에서 용어 "측정"은 실험적인 계측, 인 실리코 상의 전산적인 계산 및 이를 토대로 한 복수의 변수 간의 관계 수립을 모두 포함한다.
본 명세서에서 용어 "단백질"은 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 일련의 고분자(macromolecule)를 의미한다. 단백질은 아미노산 유닛들의 연속적인 결합으로 이루어진 선형의 분자이나, 전체적인 크기, 전체 또는 각 구성 잔기의 전하 및 소수성, 공유비공유 결합 형성여부 등에 의해 3차원 형태 및 상태 변화 경향이 영향을 받으며, 이러한 형태 및 경향이 비정상적일 경우 다양한 PCD(protein conformational disease) 질환의 원인이 될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "단백질 응집(protein aggregation)"은 세포 내 혹은 세포 외에서 미스폴딩된 단백질이 축적되고 덩어리를 이루어 응집체를 형성하는 것을 의미한다. 용어 "미스폴딩(misfolding)"은 단백질이 고유의 기능 및 활성을 가지는 3차원 구조를 획득하도록 폴리펩타이드가 정상적으로 폴딩되지 못하는 것을 의미한다. 본 발명자들은 비-자생적(non-native) cis-trans 입체구조를 가지는 장수명 언폴딩 중간체를 동정하여 이를 IT-state로 명명하고, 이러한 비-자생적 이성질체가 안정화되는 변이체에서 응집 단백질(예를 들어 아밀로이드 피브릴)이 형성된다는 사실을 확인하였다. 아울러, 상기 IT-state의 구조적 및 열역학적 특성에 대한 인 실리코 분석 결과, 용매에 노출된 소수성 아미노산 잔기 부분의 증가; 용매화 자유에너지의 중가; 및 β-쉬트 형성의 증가가 단백질의 미스폴딩 및 응집의 증가에 기여한다는 사실을 다각적으로 확인함으로써, 이들의 조합된 정보가 단백질 형태이상 가능성의 지표가 될 수 있음을 확인하였다. 단백질의 미스폴딩 및 응집은 정상 단백질의 부족을 초래하거나, 비정상적인 단백질을 축적시켜 독성을 증가시킴으로써 다양한 PCD 질환의 원인이 되므로, 본 발명의 방법은 이러한 질환의 발병 위험성을 예측하고 치료 조성물 개발전략을 수립하는 데에 중요한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 아미노산 잔기의 시스-트랜스 이성질체화 및 구조적 또는 열역학적 변화의 측정은 상기 단백질 분자의 자생적(native) 형태를 출발 구조로 하는 전산 시뮬레이션을 이용하여 이루어진다.
본 명세서에서 용어 "전산 시뮬레이션(computational simulation)"은 하나 또는 네트워크를 이루는 복수의 전산장비를 이용하여 특정 계(system)의 행동을 수학적 모델링을 통해 예측하고 재현하는 모의실험을 의미한다. 구체적으로는, 상기 전산 시뮬레이션은 분자 동력학 시뮬레이션(Molecular Dynamic Simulation)이다. 분자 동력학 시뮬레이션은 확립된 물리법칙에 따라 원자 또는 분자의 궤적을 수치적으로 계산하고 이들의 물리적 운동을 재현하는 전산 시뮬레이션이다. 본 발명에 따르면, 본 발명자들은 야생형 β-2-마이크로글로불린(β2m)에서 Pro32가 비-자생적 trans 형태를 띄는 IT-state에 대해 MD 시뮬레이션을 수행함으로써 cis-to-trans 이성질체화로부터 발생하는 원자 수준의 구조적 변화를 분석하고, 구조적 변화에 따른 열역학적 변화를 분석하기 위하여 용매화 자유에너지 계산을 수행하였다. 아울러, 단백질 응집체 형성 경향이 알려진 돌연변이에 대한 분석을 함께 수행함으로써 IT-state에서 관찰된 구조적 및 열역학적 특성이 단백질 응집체 형성의 원인인지를 다각적으로 확인하였다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 용매에 노출된 소수성 아미노산 잔기 부분의 변화는 소수성 잔기의 용매 접근가능 표면적(solvent accessible surface area, SASA) 변화를 통해 측정한다.
본 명세서에서 용어 "용매 접근가능 표면적(SASA)"은 생체분자를 둘러싸고 있는 용매가 공간적으로 접근할 수 있는 생체 분자의 표면적을 의미한다. SASA는 전형적으로 Shrake & Rupley가 개발한 rolling ball 알고리즘을 이용하여 전산적으로 계산된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 분석하고자 하는 단백질은 야생형 또는 돌연변이 β-2-마이크로글로불린(β-2-microglobulin, β2m)이다.
β2m은 MHC class I 분자의 구성요소로서 응집을 통해 골관절 조직 등에서 아밀로이드 피브릴을 형성한다. 아밀로이드증, 다발성 골수종(multiple myeloma) 및 림프종(lymphoma) 등의 다양한 질환에서 β2m의 농도가 증가하며, 특히 아밀로이드 피브릴의 형성은 투석관련 아밀로이드증(dialysis-related amyloidosis, DRA)의 특징적 과정이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 시스-트랜스 이성질체화는 야생형 또는 돌연변이 β-2-마이크로글로불린의 아미노산 서열의 32번째 프롤린 잔기가 시스에서 트랜스로 이성질체화되는 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 구조적 또는 열역학적 변화량 중 어느 하나 이상이 양의 값일 경우, 상기 단백질의 응집 가능성이 증가하는 것으로 판단한다.
본 명세서에서 용어 "응집 가능성의 증가"는 용매에 노출된 소수성 아미노산 잔기 부분의 변화; 용매화 자유에너지의 변화; 및 β-쉬트 형성의 변화량 중 어느 것도 양의 값이 아닌 대조군 단백질 분자에 비하여 동일 농도의 단량체 분자에 의해 생성되는 응집체(aggregate)의 양이 유의하게 증가하는 경우를 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 아밀로이드피브릴 과다 질환의 위험성을 결정하기 위한 분석 방법을 제공한다:
(a) 유전정보를 포함하는 분리된 생체시료로부터 β-2-마이크로글로불린 코딩 뉴클레오타이드의 서열정보를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 서열정보를 이용하여 (1) β-2-마이크로글로불린의 아미노산 서열의 32번째 프롤린 잔기의 시스-트랜스 이성질체화; 및 (2) (i)용매에 노출된 소수성 아미노산 잔기 부분의 변화; (ii) 용매화 자유에너지의 변화; 및 (iii) β-쉬트 형성의 변화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 구조적 또는 열역학적 변화를 측정하는 단계.
본 명세서에서, 용어 "아밀로이드피브릴 과다 질환"은 체내 β-2-마이크로글로불린(β2m)의 농도가 증가하거나, 또는 β2m에서 아밀로이드피브릴로의 응집이 과도하게 발생하여 조직 내 과량의 아밀로이드 피브릴이 존재함으로써 발생하는 질환을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 방법에서 서열정보 수득을 위한 분석의 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).
출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 인간(예컨대, 비만 또는 당뇨 환자)으로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).
본 발명의 방법에 있어서, 상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
β-2-마이크로글로불린의 구조적 및 열역학적 변화를 측정하는 전산적인 과정에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에서 상기 β-2-마이크로글로불린의 아미노산 서열의 32번째 프롤린 잔기가 트랜스 이성질체화되고, 상기 구조적 또는 열역학적 변화량 중 어느 하나 이상이 양의 값일 경우, 상기 아밀로이드피브릴 과다 질환의 위험성이 증가하는 것으로 판단한다.
본 명세서에서 용어 "아밀로이드피브릴 과다 질환의 위험성의 증가"는 상술한 위험성 관련 지표가 나타나지 않은 대조군 대상체에 비하여 아밀로이드피브릴 과다 질환의 발병 가능성이 유의적으로 높음을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "대상체"는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법으로 그 위험성과 관련돤 마커를 검출할 수 있는 아밀로이드 피브릴 과다질환은 투석관련 아밀로이드증(dialysis related amyloidosis), 다발성 골수종(multiple myeloma) 및 림프종(lymphoma)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 단백질 응집(aggregation) 가능성 예측방법 및 아밀로이드피브릴 과다 질환의 위험성을 결정하기 위한 분석 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 방법은 단백질의 cis-trans 이성질체화 및 이에 따른 구조적, 열역학적 변화를 척도로 하여 단백질, 특히 β-2-마이크로글로불린의 폴딩 및 응집 여부를 예측할 수 있는 신뢰도 높은 정보를 제공할 수 있다.
(c) 본 발명은 단백질 미스폴딩 및 응집에 대한 구체적인 구조적, 열역학적 그림을 제공함으로써, 다양한 단백질 변성질환(protein conformational disorder)을 치료 또는 예방하는 의약의 개발 및 생물학적 치료제로서 응집-내성 단백질을 설계하는 전략 수립에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 자생적 cis- 및 비-자생적 trans-Pro32 잔기를 각각 함유하는 N-state(도 1a) 및 IT-state(도 1b)에서의 대표적인 야생형구조를 보여주는 그림이며, 아미노산 잔기에 대해 평균 β-쉬트 함량을 함께 표시하였다.
도 2는 D76N(a), D59P(b) 및 W60C(c)의 대표적인 N-state 구조(도 2a)와, 이들 단백질의 IT-state 구조(d-f)(도 2b)를 동일한 순서로 나타낸 그림이다. 돌연변이 부위는 공간충진(space-filling) 모델로 나타냈으며, 아미노산 잔기에 대해 평균 β-쉬트 함량도 표시하였다. 도 2b에서, D-가닥 및 DE-루프 부분은 각각 붉은색 및 녹색으로 표시하였다.
도 3은 IT-state 형태의 야생형 β2m(a), D76N(b), D59P(c) 및 W60C(d)에서 C-, D-, E-가닥과 CD- 및 DE-루프 부위에 위치한 소수성 잔기(36-69 잔기)의 표면을 보여주는 그림이다. 돌연변이 부위는 청록색 막대로 표시하였다.
도 4는 각 아미노산 잔기의 용매화 자유에너지변화에 대한 기여를 보여주는 그림이다. IT-state의 돌연변이 D76N(도 4a), D59P(도 4b) 및 W60C(도 4c)에서, ΔΔG solv = ΔG solv (돌연변이)-ΔG solv (야생형)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
N-state에서의 MD 시뮬레이션
중성 pH, 330K 및 1 bar 하에서, β2m의 야생형과 D76N, D59P 및 W60C 돌연변이에 대해 물(explicit water)을 이용한 원자수준의 MD 시뮬레이션을 AMBER12 시뮬레이션 슈트를 이용하여 수행하였다.33 단백질에 대해 ff99SB 역장34을 사용하였으며, 물에 대해 TIP3P 모델35을 사용하였다. X-레이를 통해 Pro32가 cis-형태를 띄는 N-state 시뮬레이션의 초기 구조를 얻었다. 야생형 β2m에 대해서는 PDB entry 2YXF16를, D76N에 대해서는 4FXL14를, D59P에 대해서는 3DHM15를, 그리고 W60C에 대해서는 3DHJ15를 이용하였다. 각 단백질은 ~10,000 물분자에 용해시켰다. 온도 및 압력의 조절은 Berendsen 방법을 통해 이루어졌다.36 수소원자를 포함하는 결합에 대해서는 SHAKE 알고리즘37을 적용하였고, 2.0 fs 시간단계를 이용하였다.
본 발명에서는 모든 MD 시뮬레이션에서 다음의 통상적인 과정을 이용하였다: 에너지 최소화 후에, 일정 부피 하에서 온도가 330 K로 셋팅된 20 ps 평형 시뮬레이션을 수행하였다. 이후 1 bar의 정압 하에서 200 ps 평형 시뮬레이션을 수행하였다. 마지막으로, 330 K 및 1 bar에서 200 ns의 생산공정(Production run)을 수행하였다. 각각의 시스템에 대해 상이한 초기 임의 속도를 가지는 3개의 독립적인 production runs을 수행하여 다양한 관찰결과에 대한 통계적 평균을 계산하였다. 모든 N-state 시뮬레이션 동안 cis-trans Pro32 이성질체화는 관찰되지 않았다.
IT-state에서의 MD 시뮬레이션
본 발명자들은 Pro32이 비-자생적 trans 형태를 보이는 IT-state 시뮬레이션의 초기 구조를 수득하기 위하여 고온에서 부분적인 언폴딩 시뮬레이션을 수행하였다. 실험을 통해 IT-state에 대한 원자 수준의 구조를 수득할 수 없으므로, 고온의 부분적 언폴딩 시뮬레이션은 필수적이다. cis-trans 프롤린 이성질체화는 진보된 샘플링 방법 없이는 캡쳐하기 어려운 가장 느린 단백질 형태 변화 중의 하나이므로, 상기 방법이 이용되었다. 야생형 β2m에 대해 일정부피의 600K에서 330K 및 1 bar의 평형을 이룬 N-state 형태로부터 시작하는 몇몇 짧은 시뮬레이션을 수행하였다. 하나의 고온 궤적에서, ~6 ns에서 Pro32의 cis-trans 이성질체화가 관찰되었으며, 프롤린 이성질체화 직후의 단백질 구조를 야생형 β2m에 대한 IT-state 시뮬레이션의 출발 구조로 취하였다. Swiss PDB Viewer를 이용하여 돌연변이(D76N, D59P 및 W60C)에 대한 IT-state 시뮬레이션의 초기 구조를 생성하였다.38 이후 각 단백질 시스템에 대해 3개의 독립적인 200-ns IT-state 생성 과정을 수행하였다. Pro32는 IT-state 시뮬레이션 동안 모든 경우에 trans 형태를 유지하였다.
구조 및 용매화 자유에너지 분석
시뮬레이션된 단백질 구조를 분석하기 위하여, Cα 평균 제곱근 편차(RMSD) 값, 회전반경(Rg), 2차구조 함량, 소수성 접촉의 수 및 용매 접근가능 표면적(solvent accessible surface area, SASA)을 계산하였으며, 2차 구조 함량을 계산하기 위하여 DSSP39를 사용하였다. 중측쇄(heavy side-chain) 간의 거리가 5.4 Å 미만일 때 한 쌍의 소수성 잔기 간에 소수성 접촉이 형성된 것으로 간주하였다. RMSD-기반 K-클러스터링 분석(3.5-Å 컷오프)을 수행함으로써 대표적인 단백질 구조를 수득하였다.
3차원 참고 상호작용 사이트 모델(3D-RISM) 이론40을 사용하여 시뮬레이션된 단백질 형태의 용매화 자유에너지 △G solv를 계산하였다. 상기 이론은 단백질 구조 주변의 평형수(equilibrium water) 분포함수를 제공하며, 이로부터 △G solv를 계산할 수 있다. 단백질의 △G solv를 구성 아미노산 잔기에 의한 기여로 나누는 정확한 분해 방법도 사용할 수 있는데,41 이는 돌연변이 시 용매화 자유에너지 변화에 대한 잔기-특이적 기여를 분석하는 데 이용될 수 있다.
실험결과
N-state의 단백질 구조는 매우 안정하다
Pro32가 자생적 cis-형태를 보이는 야생형 β2m(99 잔기)는 7개의 β-가닥(A-G로 지칭)를 포함하는 면역 글로불린 폴드를 보였으며, 이들은 이황 가교(Cys25-Cys80)로 연결된 두 개의 β-쉬트(ABED 및 CFG)를 이루었다(도 1a). D76N(PDB entry 4FXL14), D59P(3DHM15) 및 W60C(3DHJ15) 돌연변이의 X-레이 구조는 야생형 구조와 매우 유사하였다. 실제로, Cα 평균 제곱근 편차(RMSD) 값은 이들 모든 X-레이 구조 간에 0.8 Å 이내였다.
본 발명자들은 X-레이 구조를 시작으로, 야생형 β2m 및 이의 D76N, D59P 및 W60C 돌연변이의 N-state 시뮬레이션을 수행하였다. N-state 시뮬레이션 동안 단백질 형태는 X-레이 구조와 유사한 형태를 유지하는 것으로 나타났다(표 1, 도 1a 및 도 2a-2c): 각각의 X-레이 구조에서 얻은 평균 CRMSD 값은 수 Å 이내였으며, 회전반경은 X-레이 구조와 거의 유사하고, 자생적 소수성 접촉 비율은 ~90%이며, X-레이 구조에서 나타난 β-쉬트가 잘 보존되어 있었다. 따라서, 야생형 β2m 뿐 아니라 D76N, D59P 및 W60C 돌연변이 모두 시뮬레이션 결과 매우 안정적이었다.
구조적 특성(평균 ± 표준편차)
CRMSD(Å)a Rg(Å)b 소수성 접촉의 수 자생적 소수성
접촉의 비율 (%)c
X-레이
구조		 야생형 0 14.3 34 100
D76N 0 14.0 35 100
D59P 0 14.5 36 100
W60C 0 14.3 34 100
N-
state		 야생형 2.4 ± 0.5 14.7 ± 0.1 32.8 ± 1.5 89.3 ± 3.6
D76N 2.6 ± 0.5 14.7 ± 0.1 32.8 ± 1.8 86.8 ± 3.9
D59P 2.1 ± 0.4 14.6 ± 0.1 33.4 ± 1.6 86.7 ± 3.3
W60C 2.0 ± 0.4 14.6 ± 0.1 33.2 ± 1.8 91.9 ± 3.3
IT-
state		 야생형 4.9 ± 0.3 14.4 ± 0.2 25.3 ± 2.3 54.0 ± 3.9
D76N 5.8 ± 0.4 14.3 ± 0.2 26.7 ± 3.0 51.3 ± 3.8
D59P 6.2 ± 0.6 14.4 ± 0.2 25.2 ± 2.2 51.6 ± 3.9
W60C 6.2 ± 0.4 14.4 ± 0.2 23.0 ± 2.0 49.5 ± 3.4
a각각의 X-레이 구조에 상대적인 CRMSD 값. b회전반경. c각각의 X-레이 구조에 의해 한정된 자생적 소수성 접촉의 비율.
I T -state에서 야생형 β2m의 구조적 특성
Pro32 이성질체화에 의해 유도되는 구조 변화를 조사하기 위하여, 야생형 β2m에 대해 Pro32가 비-자생적 trans 형태를 띄는 IT-state의 시뮬레이션을 수행하였다(도 1b). 그 밖의 느린 cis-trans Pro32 이성질체화를 촉진시키기 위해, 고온에서 수득한 부분적으로 언폴드된 구조로부터 시뮬레이션을 개시하였다.
도 1a 및 1b에서 보여주는 대표적인 구조 및 평균 β-쉬트 함량에서 알 수 있듯이, 야생형 β2m의 전체적 구조 및 전반적인 위상(topology)은 N- 및 IT-state 간에 잘 보존되어 있는데, 가장 눈에 띄는 예외는 IT-state에서의 이상구조를 가지는(unstructured) 가장자리 D-가닥이다. 비정상의 D-가닥은 이 부위를 둘러싸는 소수성 코어 잔기의 붕괴 및 용매에의 노출을 수반한다(도 3a). 실제로, 자생적 소수성 접촉 비율은 ~50%까지 감소하였으며(표 1), IT-state에서 소수성 잔기의 용매 접근가능 표면적(solvent accessible surface area, SASA)이 증가하였다(표 2). 그러나, IT-state의 야생형 β2m에서의 소수성 접촉의 수(25.3)는 N-state(32.8)에서만큼 감소하지는 않았고(표 1), 이를 통해 재구성되거나 또는 다시 채워진 소수성 코어가 IT-state에서 형성되었음을 알 수 있다.
돌연변이가 I T -state의 구조적 특성에 미치는 효과
돌연변이가 IT-state 구조적 특성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, D76N, D59P 및 W60C의 3개 돌연변이에 대한 IT-state 시뮬레이션을 수행하였다. 이들 돌연변이에 대해서도 N- 및 IT-state 간에 전반적인 구조적 특성이 보존되었다(도 2a 및 2b). 한편, 본 발명자들은 IT-state의 D76N 및 D59P 돌연변이에서 가장자리 D-가닥 주변의 β-쉬트 형성 경향이 증가하는 반면, W60C 돌연변이의 D-가닥은 이상구조로 남아있음을 발견하였다(도 2b). IT-state에서는 N-state에 비하여 모든 돌연변이에서 소수성 코어 또한 붕괴되고 재구성되었다(표 1). 그러나, 붕괴의 정도 및 그 결과로서 나타나는 소수성-코어 잔기의 용매 노출은 돌연변이의 사이트에 따라 그 양상이 달랐다. 본 발명자들은 IT-state에서의 소수성 SASA가 D76N 및 D59P 돌연변이에서 야생형 β2m보다 큰 반면, W60C 돌연변이에서는 작다는 사실을 발견하였다(표 2). 이는 대표적인 IT-state 구조의 C-E 가닥 부위에 위치한 소수성 잔기를 통해서도 알 수 있다(도 3). D76N 및 D59P 돌연변이에서 소수성 잔기의 용매-노출이 상당 수준 발생한 반면, W60C 돌연변이에서는 용매-노출된 소수성 잔기가 보다 소규모임을 관찰하였다.
소수성 측쇄의 SASA(solvent accessible surface area)
소수성 측쇄의 SASA (Å2)
N-state 야생형 911.1 ± 58.3
D76N 882.3 ± 77.8
D59P 848.2 ± 59.5
W60C 770.3 ± 60.9
IT-state 야생형 1037.2 ± 87.1
D76N 1057.7 ± 95.6
D59P 1142.3 ± 76.5
W60C 996.3 ± 104.7
IT-state에서 용매화의 열역학적 특성
Pro32 이성질체화로 유발된 IT-state에서의 구조적 특성은 아밀로이드 생성을 이해하는 데에 필요한 단백질 내생 인자의 후보이나, 용매 물의 역할과 같은 환경적 요인도 반드시 고려되어야 한다. 실제로, 음전하를 띄는 두 개의 β2m 단백질(중성 pH에서 야생형 β2m의 총 전하는 -2)은 정전기적 척력을 극복할 만한 물-매개 원동력이 없다면 서로 접근하지 못할 것이다. 물-매개 상호작용을 정량화하는 핵심적 값은 단백질의 물에 대한 전체적인 친화도를 측정하는 용매화 자유에너지 △G solv이다.17 용매화 분자이론을 이용하여 N- 및 IT-state 모두에서의 야생형 β2m의 △G solv를 계산한 결과, △G solv(IT) 값이 △G sol(N)값보다 +47.9kcal/mol만큼 높음을 확인하였다. 더 큰 △G solv 값은 용매 물에 대한 더 낮은 친화도와 관련이 있으므로, 이러한 결과는 IT-state 단백질 형태가 N-state 형태보다 "소수성"이며, 수성 환경에서 자가-결합하는 경향이 더 강함을 말해준다.
돌연변이 효과를 조사하기 위하여 D76N, D59P 및 W60C 돌연변이의 IT-state에서의 용매화 자유에너지도 계산하였으며, IT-state에서의 야생형 β2m에 대한 상대적인 결과 값인 △G solv(돌연변이)-△G solv(야생형)를 표 3에 표시하였다. D76N 및 D59P 돌연변이의 용매화 자유에너지는 야생형의 그것보다 유의하게 높았던 반면, W60C의 경우는 더 낮았다. 이러한 결과는 물-유도된 인력이 야생형보다 D76N 및 D59P 돌연변이에서 더 강한 반면 W60C 돌연변이에서는 더 약함을 보여준다. 본 발명자들은 또한 돌연변이 부위가 돌연변이 시 용매화 자유에너지 변화의 유일한 원인이 아니라는 사실을 발견하였다. 실제로, 잔기-분해 용매화 자유에너지 값은 돌연변이 부위보다는 아미노산 잔기에 영향을 받았다(도 4). 특히, C-E 가닥 부위는 돌연변이 시 형태적 변화에 적응함으로써 총 용매화 자유에너지 변화에 기여하였다. 전하를 띄는 잔기가 큰 영향을 미친다는 사실은 정전기적 요소가 돌연변이 시 용매화 자유에너지 변화를 좌우한다는 사실을 시사한다.18,19
IT-state에서 돌연변이에 따른 용매화 자유에너지 변화
△△G solv (kcal/mol)a
D76N 882.3 ± 77.8
D59P 848.2 ± 59.5
W60C 770.3 ± 60.9
a야생형과의 용매화 자유에너지 차이, △△G solv = △G solv(mutant)-△G solv(wild type)
추가논의 사항
아밀로이드 피브릴 형성의 분자적 메카니즘을 규명하는 데에는 불활성의 가용성 단백질 이외에 아밀로이드 형성 능력을 부여하는 인자를 규명하는 것이 중요하다. 따라서, 자생적 cis 형태에서 비-자생적 trans 형태로의 Pro32 이성질체화에 의해 유발된 구조적 변화는 실험적 조사의 중요한 대상이다.12,20-24 아밀로이드 중간체에 대한 정밀한 구조 분석은 이들의 일시적인 특성으로 인해 어려운 과제임에도, 최근 D-가닥이 N-state에 비하여 β-쉬트 형태가 덜 조밀하며, 비-자생적 trans-Pro32 형태를 수용하기 위하여 소수성 잔기가 다시 패킹(repacking)되고 노출됨이 보고되었다.12,20,23 시뮬레이션으로 제안된 아밀로이드 중간체인 IT-state는 D-가닥의 붕괴를 보임과 동시에(도 1) 재패킹(표 1) 및 용매 노출된(표 2) 소수성 잔기를 보였는데, 이는 실험적 관찰과 완전히 일치하는 것이다.
본 발명자들은 시뮬레이션된 IT-state에서 나타난 구조적 특징이 실험적으로 관찰된 아밀로이드 형성과정의 특성에 부합하는지를 조사하기 위하여 D76N, D59P 및 W60C 돌연변이를 분석하였다. 이런 점에서, 더 큰 β-쉬트 형성 경향 및 소수성 잔기의 노출은 단백질 응집 특성을 나타나게 하는 주요 인자로 보인다.25,26 시뮬레이션된 IT-state 구조에서, D76N 및 D59P 돌연변이의 비정상 D-가닥 부위에서 β-쉬트 형성 경향이 증가함이 관찰된 반면, W60C 돌연변이에서는 이러한 증가가 보이지 않았다(도 2b). 뿐만 아니라, D76N 및 D59P이 야생형 β2m에 비하여 더 큰 소수성 SASA를 가지는 반면, W60C는 더 낮은 소수성의 SASA를 가진다는 사실을 확인하였다(표 2). 이들 돌연변이-의존성 구조적 특징들은 D76N14 및 D59P15의 증가된 응집 성향 및 W60C15의 감소된 응집 성향과 깊이 연관되어 있어, 이들 구조적 특징이 아밀로이드 형성 능력과 관련되어 있음을 알 수 있었다. 특히, Pro32 이성질체화에 따라 이들 구조 변화가 관찰되는 부위는 가장자리 D-가닥 부위로서, 아밀로이드 피브릴로의 결합에 잠재적인 역할을 한다고 알려진 부위이다.27-29 단백질을 둘러싼 물과의 상호작용 역시 단백질 응집 경향을 결정하는 데에 중요한 역할을 한다.30 실제로, 상당수의 돌연변이에서 돌연변이 시 단백질 응집성향의 변화가 용매화 자유에너지 변화와 유의한 관계가 있음이 밝혀졌다.30 뿐만 아니라, 용매화 자유에너지의 감소는 동일한 전하의 단백질이 먼 거리로부터 접촉 거리까지 접근하도록 하는 주요 원동력임이 확인되었다.31,32 이는 더 큰 용매화 자유에너지를 가지는 단백질이 자가-결합 경향이 크다는 것을 시사한다. 이런 점에서, 본 발명자들은 IT-state에서 D76N 및 D59P 돌연변이가 야생형에 비하여 더 높은 용매화 자유에너지를 가짐에 반해 W60C 돌연변이는 더 작은 용매화 자유에너지를 가짐을 확인하였다(표 3). 이러한 경향은 이들 돌연변이의 아밀로이드 형성에 대한 실험적 관찰과도 일치한다. 돌연변이 시 이와 같은 용매화 자유에너지의 변화는 Pro32 이성질체화에 의해 유도되는 구조적 변화의 결과이다(도 4). 따라서, 본 발명의 연구결과는 비정상 가장자리 D-가닥 부위의 β-쉬트 형성 경향 및 소수성 잔기의 용매 노출은, 수반되는 용매화 자유에너지 변화와 함께, IT-state β2m의 아밀로이드 형성의 원인이 된다.
요약하면, 본 발명자들은 응집-경향성을 가지는 야생형 및 세 개의 돌연변이(D76N, D59P 및 W60C) β2m 중간체(IT) 단계에 대한 드 노보 전산 연구를 수행함으로써 이들의 상이한 아밀로이드 생성 능력을 좌우하는 분자적 결정요인을 조사하고자 하였다. Pro32의 cis(N-state)로부터 비-자생적 trans(IT-state)로의 이성질체화에 의해 유발되는 구조적 및 열역학적 특성의 변화에 초점을 맞추었으며, 상기 이성질체화는 β2m 응집 개시를 촉발하는 것으로 간주하였다. 본 발명자들은 야생형 β2m에서 가장자리 D-가닥에 구조이상이 생기며, 소수성 코어가 붕괴되고 용매에 노출되었으며, 결과적으로 Pro32 cis-trans 이성질체화에 따라 용매화 자유에너지가 증가함을 발견하였다. 이러한 특성은 돌연변이-의존성이며, 실험적으로 측정된 응집 경향과의 비교를 통해, 다음과 같은 사실이 제안되었다: (i) 비정상 D-가닥 부위의 증가된 β-쉬트 형성 경향; (ii) 소수성 잔기의 용매 노출; 및 (iii) 용매화 자유에너지 값의 증가가 아밀로이드를 형성하도록 하는 IT-state에서의 구조적 및 열역학적 특성이다. 본 연구결과로 인해 β2m 아밀로이드 피브릴 형성의 구조적 모티프 및 분자적 기작을 규명할 수 있을 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (12)

  1. (1) 아미노산 잔기의 시스-트랜스 이성질체화; 및
    (2) (ⅰ)용매에 노출된 소수성 아미노산 잔기 부분의 변화;
    (ⅱ) 용매화 자유에너지의 변화; 및
    (ⅲ) β-쉬트 형성의 변화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 구조적 또는 열역학적 변화를 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 아미노산 잔기의 시스-트랜스 이성질체화 및 구조적 또는 열역학적 변화의 측정은 단백질 분자의 자생적(native) 형태를 출발 구조로 하는 전산 시뮬레이션을 이용하여 이루어지는, 액체 환경에서의 야생형 또는 돌연변이 β-2-마이크로글로불린(β-2-microglobulin, β2m)의 응집(aggregation) 가능성 예측방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 전산 시뮬레이션은 분자 동력학 시뮬레이션(Molecular Dynamic Simulation)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 용매에 노출된 소수성 아미노산 잔기 부분의 변화는 소수성 잔기의 용매 접근가능 표면적(solvent accessible surface area, SASA) 변화를 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 시스-트랜스 이성질체화는 야생형 또는 돌연변이 β-2-마이크로글로불린의 아미노산 서열의 32번째 프롤린 잔기가 시스에서 트랜스로 이성질체화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 구조적 또는 열역학적 변화량 중 어느 하나 이상이 양의 값일 경우, 단백질의 응집 가능성이 증가하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 다음을 포함하는 아밀로이드피브릴 과다 질환의 위험성을 결정하기 위한 분석 방법:
    (a) 유전정보를 포함하는 분리된 생체시료로부터 β-2-마이크로글로불린 코딩 뉴클레오타이드의 서열정보를 수득하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 서열정보를 이용하여 (1) β-2-마이크로글로불린의 아미노산 서열의 32번째 프롤린 잔기의 시스-트랜스 이성질체화; 및 (2) (ⅰ)용매에 노출된 소수성 아미노산 잔기 부분의 변화; (ⅱ) 용매화 자유에너지의 변화; 및 (ⅲ) β-쉬트 형성의 변화로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 구조적 또는 열역학적 변화를 측정하는 단계로서,
    상기 β-2-마이크로글로불린의 아미노산 서열의 32번째 프롤린 잔기의 시스-트랜스 이성질체화 및 구조적 또는 열역학적 변화의 측정은 상기 β-2-마이크로글로불린의 자생적(native) 형태를 출발 구조로 하는 전산 시뮬레이션을 이용하여 이루어지는 단계.
  9. 삭제
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 전산 시뮬레이션은 분자 동력학 시뮬레이션(Molecular Dynamic Simulation)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 상기 β-2-마이크로글로불린의 아미노산 서열의 32번째 프롤린 잔기가 트랜스 이성질체화되고, 상기 구조적 또는 열역학적 변화량 중 어느 하나 이상이 양의 값일 경우, 상기 아밀로이드피브릴 과다 질환의 위험성이 증가하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 아밀로이드 피브릴 과다질환은 투석관련 아밀로이드증(dialysis related amyloidosis), 다발성 골수종(multiple myeloma) 및 림프종(lymphoma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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