KR20110052580A - 단백질에서 거대분자 결합 및 응집 경향 영역을 확인하는 방법 및 그것의 사용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질의 거대분자 결합 영역과 응집 경향 영역을 확인하는 컴퓨터 시뮬레이션에 적어도 부분적으로 기초한 방법 및 컴퓨터 상의 도구를 제공한다. 다음에, 이들 응집 경향 영역에서 치환이 이루어져 안정성이 증진되고 및/또는 응집 경향이 감소되도록 단백질이 유전조작될 수 있다. 유사하게, 거대분자 결합 영역에서도 치환이 이루어질 수 있으며, 이 경우 거대분자에 대한 결합 친화성이 변경되도록 단백질이 유전조작될 수 있다.

Description

단백질에서 거대분자 결합 및 응집 경향 영역을 확인하는 방법 및 그것의 사용{METHODS TO IDENTIFY MACROMOLECULE BINDING AND AGGREGATION PRONE REGIONS IN PROTEINS AND USES THEREFOR}
단백질 안정성을 이해하고 조절하는 것은 생물학자, 화학자 그리고 유전공학자들이 노력을 기울이는 매우 바라는 일이다. 아미노산 치환과 질환 사이의 일차적인 관련성(Ingram. Nature. 1957, 180(4581):326-8)이 건강한 상태와 질환 상태에서 단백질 안정성에 대한 새롭고 본질적인 시각을 제공했다. 최근 단백질-기반 약제들의 무서운 증가세는 새로운 도전을 만들고 있다. 치료 단백질은 매우 고 농도로 수 개월간 액체 중에 저장된다. 비-모노머 종들의 퍼센트가 시간에 따라 증가한다. 응집체가 형성됨에 따라, 제품의 효능의 감소할 뿐만 아니라, 투여에 따른 면역학적 반응 등의 부작용이 발생할 수 있다. 제품의 저장수명을 위하여 단백질 약제들의 안정성을 확보하는 것이 필요하다.
단백질은 다양한 질환의 치유에 잠재력을 가지기 때문에, 현재 항체들이 가장 빠르게 성장중인 부류의 인체 치료제를 구성하고 있다(Carter. Nature Reviews Immunology. 2006, 6(5), 343). 2001년 이래로 그 시장은 평균 매년 35%의 성장률로 성장하고 있으며, 모든 부문들 중에서도 가장 성장률이 높은 분야는 바이오테크 약물 분야이다(S. Aggarwal. Nature. BioTech. 2007, 25(10) 1097).
치료 항체는 질환 치료에서 요구되는 바에 따라 수성용액 중에서 고 농도로 제조되어 저장된다. 그러나, 이들 항체는 이런 조건에서 열역학적으로 불안정하며 응집으로 인해 변성된다. 응집은 이어서 항체 활성을 감소시켜서 약물을 비효과적으로 만들고, 심지어는 면역학적 반응을 일으킬 수도 있다. 이와 같이, 이들 항체가, 그리고 실제로는 일반적인 단백질들이 어떻게 응집하는가를 기계학적으로 이해함으로써 응집에 연루되는 단백질 영역을 발견하고, 응집을 방해하는 전략을 개발해야 할 긴급한 필요성이 있다.
이들 효과는 항체 치료제에서 특히 중요하다. 항체 안정화의 한 접근법은 항원 결합 특이성을 부여하는 CDR 루프를 더 안정한 프레임워크에 접목시키는 것이다(Ewert, Honegger, and Pluckthun, Biochemistry. 2003, 42(6):1517-28.). 이런 접근법은 CDR 루프의 아미노산 서열이 응집력을 조종하지 않는 경우와 더 안정한 프레임워크에 CDR 루프를 접목하는 것이 항원 결합 특이성을 변화시키지 않는 경우에만 가능할 것이다.
단백질 응집 경향 영역을 예측하는 것과 관련된 기술은 1) 현상학적 모델 및 2) 분자 시뮬레이션 기술의 두 범주로 나눠질 수 있다. 현상학적 모델은 소수성, β-시트 경향성 등과 같은 특성들을 사용하여 단백질 1차 서열로부터 응집 '핫 스폿'을 예측하는데 주로 기초하는 반면, 분자 시뮬레이션 기술은 단백질의 3-차원 구조와 역학을 사용하여 응집 경향이 있는 영역들을 위치시킨다. 대부분의 기술은 β-시트 형성이 지배적인 다른 작은 단백질들의 아밀로이드 피브릴 형성 및 응집을 이해하는 것에 관련되고 있다.
현상학적 모델은 소수성, β-시트 경향성 등과 같은 물리화학적 특성에 기초하여 개발되었고, 단백질 1차 서열로부터 응집 경향 영역들을 예측한다(Caflisch, Current Opinion in Chemical Biology . 2006, 10, 437-444; Chiti and Dobson. Annu. Rev. Biochem.2006, 75:333-366). 초기 현상학적 모델 중 하나는 다른 무정형(unstructured) 펩티드 및 자연적으로 언폴딩되는 단백질과 함께 작은 구상 단백질인 '사람 근육 아실포스파타제(AcP)'의 응집 반응속도학에 관한 돌연변이 연구를 기초로 이루어졌었다(Chiti, et al . Nature. 2003, 424 p. 805-808; U.S. Pat. No. 7379824). 이 연구에 의해서 β-시트 경향성, 소수성 및 전하와 같은 물리화학적 특성과 응집 사이의 간단한 상관성이 밝혀졌다. 이들 연구는 단백질이 주로 무정형 상태인 조건에서 행해졌다. 따라서, 서열과 응집 경향을 연결하는 3개 변수의 경험적 모델이 개발되었다(Chiti, et al . Nature. 2003, 424, 805-808). 또한, 이 모델을 사용하여 32-잔기 펩티드 호르몬인 칼시토닌의 변이체에서 응집 경향이 감소한다는 것이 제안되었다(Fowler, et al . Proc Natl Acad Sci USA . 2005, 102, 10105-10110). DuBay와 동료들은 3-변수 등식(Chiti, et al . Nature. 2003, 424, 805-808)을 폴리펩티드 사슬의 고유 특성들과 용액의 펩티드 농도, pH 값 및 이온강도와 같은 환경-관련 외부 인자들을 포함하는 7-변수 식으로 확장했다(Dubay, et al. J Mol Biol . 2004, 341, 1317-1326). 이 모델을 사용하여 이들은 광범위한 무정형 펩티드 및 단백질의 시험관내 응집 속도를 재현할 수 있었다. 그러나, 서열의 모든 잔기에 동일한 상대적 중요성이 주어졌다는 점은 7-변수 모델의 주된 제한요인이었다. 이것은 2차 구조 경향성에 따라서 어떤 영역들은 다른 영역들에 비해 더 중요하다는 것을 나타낸 실험적 관찰 및 시뮬레이션 관찰과 모순된다. 최근에, 이 분석은 구조화된 폴리펩티드 사슬의 응집을 설명하기 위해 보호 인자들을 포함하는 것까지 더 확장되었다(Tartaglia, G.G., Pawar, A.P., Campioni, S, Dobson, C. M., Chiti, F., and Vendruscolo, M. J Mol Biol (2008) in press). 예측된 부위의 일부는 리소자임, 미오글로빈 등과 같은 단백질에서 알려진 응집 경향 부위들과 일치했다. 돌연변이시 응집체 피브릴의 신장 속도의 변화를 예측하고, 응집 경향 세그먼트를 확인하기 위해 자유 변수들을 사용하지 않는 현상학적 모델이 개발되었다(Tartaglia, et al . Protein Sci . 2004, 13,1939-1941; Tartaglia, et al . Protein Sci . 2005, 14, 2723-2734). 사용된 물리화학적 특성들은 돌연변이시 β-경향성의 변화, 방향족 잔기 수의 변화, 및 총 전하의 변화이다. 또한, 야생형 측쇄와 돌연변이 측쇄가 모두 극성이거나 모두 비극성일 경우에는 접근가능한 표면적의 비율이 고려되고, 비극성에서 극성으로(또는 극성에서 비극성으로) 돌연변이되는 경우에는 극성 측쇄의 쌍극자 모멘트가 사용된다. 이 모델에 의해 26개 헵타펩티드 서열 집단의 상대적 응집 경향이 재현되었고, 이들은 인-레지스터 평행 β-시트 배열을 선호하는 것으로 예측되었다.
α-나선 경향성과 소수성 패턴화가 포함되고, 주어진 아미노산 서열의 응집 경향 점수가 유사한 길이의 서열 집단에 대해서 계산된 평균 경향성과 비교되도록DuBay와 동료들의 모델(Dubay et al . J Mol Biol . 2004, 341, 1317-1326)이 변형되었다(Pawar, et al., J Mol Biol . 2005, 350, 379-392). 이 모델은 3개의 자연적으로 언폴딩되는 폴리펩티드 사슬, 즉 Aβ42, α시누클레인 및 tau 단백질에 대해서 검증되었다.
TANGO(Fernandez-Escamilla, et al., Nat Biotechnol . 2004, 22, 1302-1306)라고 부르는 또 다른 알고리즘이 개발되었으며, 이것은 동일한 물리화학적 변수들을 균형을 맞추고, 아미노산이 응집된 상태에 완전히 묻혀 있다는 가정에 의해 보충된다. 이것은 2차 구조 경향성과 탈용매화 패널티 추산치에 기초하여 단백질 서열의 β-응집 영역과 돌연변이 효과를 예측한다. 앞서 논의된 모델들과는 다르게, TANGO는 FOLD-X 힘의 장을 사용함으로써 천연 상태의 안정성을 고려한다. TANGO를 사용하여 절대 응집 속도를 계산하는 것은 불가능하지만, 서열에 유의한 차이가 있는 펩티드나 단백질들을 정성적으로 비교하는 것은 가능하다. Serrano와 동료들(Linding, et al. J Mol Biol . 2004, 342, 345-353)은 TANGO를 사용하여 서열 동일성 상한이 40%인 논-리던던트 구성 단백질 집단의 β-응집 경향을 분석했다. 아밀로이드 구조 응집 예측(prediction of amyloid structure aggregation(PASTA))이라고 하는 다른 알고리즘이 최근 도입되었는데, 이것은 β-시트 내에서 서로 마주한 잔기들의 페어 방식 에너지 기능을 편집함으로써 이루어진다(Trovato, et al., Protein Engineering, Design & Selection. 2007, 20(10), 521-523; Trovato, et al., PLoS Comput. Biol. 2006, 2, 1608-1618; Trovato et al., J Phys.: Condens. Matter. 2007, 19, 285221). Yoon 및 Welsh(Yoon and Welsh, Protein Sci . 2004, 13:2149-2160)는 3차 접촉점 수에 대해 조정된 단백질 세그먼트의 β-응집 경향을 검출하기 위한 구조-기반 접근법을 개발했다. 슬라이드 방식 7개-잔기 창을 사용하여, 치밀하게 압축된 환경(즉, 매우 많은 3차 접촉점을 갖는)에서 강한 β-시트 경향성을 나타내는 세그먼트들이 피브릴 형성의 국소 매개인자라고 제안되었다.
상기 설명된 현상학적 모델은 작은 펩티드와 변성 단백질에 대해서는 잘 기능하는 것으로 나타났지만, 천연 상태의 3차 구조와 안정성이 매우 중요한 항체와 같은 구상 단백질에 대해서는 응집 경향에 차이가 있을 수 있었다.
응집 경향 영역을 예측하고 응집 메커니즘을 연구하기 위한 분자 시뮬레이션 기술은 대부분 단순한 시뮬레이션 모델을 채택하고 있다(Ma and Nussinov. Curr . Opin. Chem . Biol . 2006, 10, 445-452; Cellmer, et al., TRENDS in Biotechnology 2007, 25(6), 254). 채택된 시뮬레이션 모델에서 가장 작은 디테일은 격자 모델이었으며, 여기서 각 잔기는 3-차원 격자 상의 단위 부위를 점유한 비드로서 표시된다. 중간 해상도 모델과 같은 더 상세한 모델이 뒤를 이었지만, 이것은 단백질 2차 구조와 3차 구조를 정확히 표시할 수 없다는 동일한 문제를 가졌다.
단순한 모델과는 달리, 원자적 모델은 수소 결합과 같은 모든 원자적 디테일을 포함하며, 따라서 격자 모델이나 중간 해상도 모델보다 더 정확하다. 이러한 원자적 모델은 용매를 드러낸 상태에서 사용되거나, 또는 용매를 숨긴 상태에서 사용되며, 용매를 숨긴 경우에는 용매가 연속체로서 처리된다. 용매를 드러내는 모델이 더 정확하지만, 컴퓨터 상의 요구도 더 많다. 이후에 아밀로이드 형성 폴리펩티드의 규칙적인 β-응집에 대한 구조적 정보를 얻기 위한 분자 역학 시뮬레이션 프로토콜이 개발되었다(Cecchini et al., J Mol Biol . 2006, 357, 1306-1321). 그러나, 이러한 과정은 컴퓨터 상의 요구가 매우 높기 때문에, 특히 항체와 같은 대형 단백질에 대해서는 전체 항체의 원자적 시뮬레이션을 문헌에서 볼 수 없다. 그렇지만, 항체의 일부분에 대한 원자 시뮬레이션은 있으며, 이들은 대부분 Fab 단편에 대한 것이다(Noon, et al., PNAS. 2002, 99, 6466; Sinha and Smith-Gill, Cell Biochemistry and Biophysics. 2005, 43, 253).
항체 응집을 방지하기 위한 많은 기존 접근법들은 단백질 제제 중에 첨가제의 사용을 채택하고 있다. 이것은 분자 시뮬레이션으로부터 예측된 응집 경향 영역에 기초하여 항체 자체가 변형되는 본원에 설명된 직접 접근법과는 상이하다. 항체 안정화에 일반적으로 사용되는 첨가제는 아르기닌, 구아니딘, 또는 이미다졸과 같은 질소-함유 염기들의 염이다(EP 0025275). 안정화를 위한 다른 적합한 첨가제들은 폴리에테르(EPA OO18609), 글리세린, 알부민 및 덱스트란 술페이트(U.S. Pat. No. 4808705), 세제 및 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 기반 계면활성제(공개 DA 2652636, 및 공개 GB 2175906(UK Pat. Appl. No. GB8514349)), 샤프롱, 예를 들어 GroEL(Mendoza. Biotechnol. Tech. 1991, (10) 535-540), 시트레이트 버퍼(WO 9322335) 또는 킬레이트화제(WO 9115509)이다. 이들 첨가제는 용액 중에서는 어느 정도로 단백질을 안정화할 수 있지만, 첨가제 제거를 위해서 추가의 가공 단계가 필요하다는 등의 단점이 있다. 따라서, 단백질 응집에 연루된 메커니즘을 이해하고, 이런 현상을 매개하는 단백질 영역을 확인할 수 있는 새로운 방법이 필요하다. 이러한 방법은 다양한 진단 및 치료 분야에서 유용할 것이며, 항체 치료제와 같은 단백질 조성물을 첨가제의 사용 없이 직접 안정화시킬 수 있을 것이다.
본 발명은 단백질의 응집 경향 영역을 확인하는 컴퓨터 시뮬레이션에 적어도 부분적으로 기초한 방법 및 컴퓨터 상의 도구를 제공한다. 다음에, 이들 응집 경향 영역에서 치환이 이루어져 단백질이 증진된 안정성 및/또는 감소된 응집 경향을 갖도록 조작될 수 있다.
또한, 본 발명은 단백질의 거대분자 결합 영역을 확인하는 컴퓨터 시뮬레이션에 적어도 부분적으로 기초한 방법 및 컴퓨터 상의 도구를 제공한다. 다음에, 이들 거대분자 결합 영역에서 치환 및 결실이 이루어져 단백질이 변경된 거대분자 결합 친화성을 갖도록 조작될 수 있다.
한 양태로서, 본 발명은 단백질 내 특정 원자의 공간-응집-경향(SAP)을 계산하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 단백질을 나타내는 구조 모델에서 하나 이상의 원자를 확인하는 단계, 이때 하나 이상의 원자는 특정 원자에 또는 특정 원자 근처에 중심을 둔 한정된 공간 영역 내에 있고; (b) 한정된 공간 영역 내의 하나 이상의 원자에 대해, 이 원자들의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 동일한 잔기에서 완전히 노출되는 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계; (c) 각 비에 하나 이상의 원자의 원자 소수성을 곱하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 곱들을 합계 내는 단계를 포함하며, 여기서 합계가 특정 원자의 SAP이다.
관련된 구체예에서, 단백질 내 특정 원자의 공간-응집-경향(SAP)을 계산하기 위한 방법은 (a) 단백질을 나타내는 구조 모델에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 이때 하나 이상의 아미노산 잔기는 특정 원자에 또는 특정 원자 근처에 중심을 둔 한정된 공간 영역 내에 적어도 하나의 원자를 가지고; (b) 한정된 공간 영역 내의 원자들에 대해, 이 원자들의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 동일한 잔기에서 완전히 노출되는 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계; (c) 각 비에 아미노산 소수성 등급에 의해 결정된 하나 이상의 아미노산 잔기의 소수성을 곱하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 곱들을 합계 내는 단계를 포함하며, 여기서 합계가 특정 원자의 SAP이다.
특정 구체예에서 한정된 공간 영역은 어떤 3-차원 체적 또는 영역이라는 것이 이해된다. 특정 구체예에서, 한정된 공간 영역은 구체, 입방체, 원통형, 피라미드, 및 타원형 회전타원체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서, 한정된 공간 영역은 1-30Å 반경, 또는 그 이상의 반경을 가진 구체와 동등한 체적을 갖는 영역이다. 어떤 구체예에서, 반경은 50Å 이상일 수 있다. 어떤 바람직한 구체예에서, 한정된 공간 영역의 반경은 5Å 또는 10Å이다.
바람직한 구체예에서, 한정된 공간 영역은 1-30Å의 반경을 갖는 구체이다. 어떤 구체예에서는 구체의 중심이 특정 원자에 있지만, 다른 구체예에서, 한정된 공간 영역 또는 구체의 중심은 화학 결합 내에 있거나, 또는 SAP가 계산될 예정인 원자 근처의 공간 내의 어떤 지점에 있다.
어떤 구체예에서, 한정된 공간 영역의 중심은 특정 원자로부터 30Å 이내에 있는 공간 내의 어떤 지점에 있거나, 또는 어떤 바람직한 구체예에서는 한정된 공간 영역의 중심이 특정 원자로부터 20Å 이내, 10Å 이내, 5Å 이내, 2Å 이내, 1Å 이내에 있는 공간 내의 어떤 지점에 있다.
어떤 구체예에서, 한정된 공간 영역 내에 있는 하나 이상의 원자는 하나 이상의 아미노산의 측쇄에 있는 원자들이다.
다른 구체예에서, 구조 모델에서 선택된 반경 이내에 있는 하나 이상의 원자는 하나 이상의 아미노산의 측쇄에 있을 수 있거나, 또는 측쇄에 있어야 한다. 또는 달리, 구조 모델에서 선택된 반경 이내에 있는 하나 이상의 원자는 하나 이상의 아미노산의 주쇄 원자일 수 있거나, 또는 주쇄 원자여야 한다.
SAP 계산의 일부인 용매 접근가능한 면적(SAA)은, 어떤 구체예에서는 아미노산 측쇄에 있는 원자들에 대해서만 계산될 수 있거나, 또는 어떤 구체예에서는 주쇄 원자들에 대해서만 계산될 수 있다. 주쇄 원자는 부착된 수소 원자를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.
어떤 특히 바람직한 구체예에서, 단백질 구조 모델은 SAP의 계산 전에, 예를 들어 선택적으로 용매를 포함하는 분자 역학 시뮬레이션을 수행함으로써 처리된다. 용매는 물, 본 분야에 공지된 다른 용매일 수 있거나, 또는 용매는 없을 수도 있다. 어떤 특히 바람직한 구체예에서, 단백질 구조 모델은 SAP의 계산 전에, 예를 들어 Monte Carlo 시뮬레이션을 수행함으로써 처리된다.
다른 양태로서, SAP의 계산은 분자 역학 시뮬레이션을 수행하는 단계, 및 분자 영역 시뮬레이션 중에 여러 시간 단계에 걸쳐서 계산된 SAP의 값들을 평균 내는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 원자의 SAP는 상기 단계 (a) 전에 분자 역학 시뮬레이션을 수행하고, 복수의 시간 단계에서 추가의 분자 역학 시뮬레이션이 수행될 때마다 단계 (a)-(d)를 반복하며, 이로써 단계 (d)에서와 같은 합계를 다수 얻고, 이 합계들의 평균을 계산함으로써 계산될 수 있으며, 여기서 계산된 평균이 특정 원자의 SAP이다. 다른 예에서는, Monte Carlo 시뮬레이션이 대신 사용되거나, 또는 분자 역학 시뮬레이션과 조합하여 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, SAP 점수는 다수의 아미노산에 대해서 합계 내어질 수 있으며, 예를 들어 단백질 구조 모델 상의 응집 경향 영역 또는 표면 패치 내에 있는 1 내지 50개의 아미노산에 대한 값들을 합계 낼 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, SAP는 1-20개 아미노산, 1-15개 아미노산, 1-10개 아미노산, 1-5개 아미노산, 1-3개 아미노산에 대해 합계 내어지거나, 또는 SAP는 2개의 인접 아미노산을 가로질러 합계 내어질 수 있다. 어떤 구체예에서, 합계는 단백질 서열을 따라 순서대로, 또는 단백질 구조에서 공간적으로 인접해 있을 수 있는 인접 아미노산들에 대해 이루어질 수 있다.
방법에 분자 역학 시뮬레이션이 필요한 경우에는, ABINIT, AMBER, Ascalaph, CASTEP, CPMD, CHARMM, DL_POLY, FIREBALL, GROMACS, GROMOS, LAMMPS, MDynaMix, MOLDY, MOSCITO, NAMD, Newton-X, ProtoMol, PWscf, SIESTA, VASP, TINKER, YASARA, ORAC, 및 XMD를 포함하거나 이들로 구성되는 군으로부터 선택된 시뮬레이션 패키지를 사용하여 시뮬레이션이 수행될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 시뮬레이션 패키지는 CHARMM 시뮬레이션 패키지이다. 다른 바람직한 구체예에서, 시뮬레이션 패키지는 NAMD 시뮬레이션 패키지이다.
방법들이 측쇄, 잔기 또는 단백질 내에 있는 하나 이상의 원자들에 대해 계산을 수행할 필요가 있는 경우(예를 들어, 하나 이상의 원자에 대해 SAA를 계산하는 경우), 공간 영역, 측쇄, 잔기, 단백질 등에 있는 원자들, 원자쌍들, 원자들의 조합 또는 원자들의 그룹, 원자들의 일부분, 또는 원자들 각각 또는 모든 원자들에 대해 계산이 수행될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인정될 것이다. 본 발명의 방법에서 특징적인 계산을 수행할 경우, 당업자는 또한 원자들, 원자들의 그룹 등을 포함하는 아미노산 잔기, 측쇄 등에 대해서도 계산이 수행될 수 있다는 것을 인정할 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 구조 모델은 단백질 또는 그 일부분의 X-선 결정 구조 모델이거나, 또는 구조 모델은 단백질 또는 그 일부분의 이론적 단백질 구조 모델일 수 있다. 관련된 구체예에서, 이론적 구조 모델은 단백질 또는 그 일부분의 상동성 모델이다. 다른 구체예에서, 이론적 구조 모델은 단백질 또는 그 일부분의 순이론적(ab initio) 단백질 구조 모델이다.
다른 양태로서, 본 발명은 단백질 상의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 단백질 상의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 방법은 (a) 단백질 내의 원자들에 대해 본원에 설명된 어떤 방법에 따라서 계산된 SAP를 구조 모델 상에 지도화하는 단계; 및 (b) 복수의 원자가 SAP > 0을 갖는 단백질 내의 영역을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 응집 경향 영역은 상기 복수의 원자를 포함하는 아미노산들을 포함한다. 어떤 구체예에서, 이 방법은 선택된 역치를 초과하는 SAP를 갖는 하나 이상의 원자를 함유하는 하나 이상의 아미노산을 확인하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 SAP는 본원에 설명된 어떤 방법에 따라서 계산되고, 응집 경향 영역은 확인된 아미노산들을 포함한다.
다른 구체예에서, 단백질 상의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 방법은 본원에 설명된 어떤 방법에 따라서 계산된 SAP 값들의 플롯을 작성하는 단계, 플롯의 피크들에 대해서 곡선하면적(AUC)을 계산하는 단계, 및 양의 AUC를 가진 하나 이상의 단백질 영역을 확인하는 단계를 더 포함하며, 여기서 응집 경향 영역은 확인된 단백질 영역들을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 한 바람직한 구체예에서, 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체의 제조 방법은 단백질에서 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하거나 결실시키는 단계를 포함하며, 여기서 응집 경향 영역은 본원에 설명된 어떤 방법에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 이때 만일 아미노산 잔기가 치환된다면, 그것은 더 친수성인 아미노산 잔기로 치환되며, 이로써 변이체의 응집 경향이 감소된다. 어떤 특정 구체예에서, 적어도 하나의 잔기가 치환되고, 적어도 하나의 잔기가 결실된다.
다른 구체예에서, 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체의 제조 방법은 (a) 단백질에서 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 잔기를 각 변이체에서 치환함으로써 복수의 단백질 변이체를 생성하는 단계; 및 (b) 감소된 응집 경향을 나타내는 (a)에서와 같이 제조된 단백질 변이체를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 응집 경향 영역은 본원에 설명된 어떤 방법에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 하나 이상의 상이한 잔기, 또는 잔기들의 상이한 조합이 각 변이체에서 치환되며, 적어도 하나의 잔기는 더 친수성인 잔기로 치환된다.
어떤 구체예에서, 치환을 위해 선택되는 아미노산은 응집 경향 영역에서 가장 소수성인 아미노산이다(본 분야에서 인정되는 소수성 등급에 의해 결정). 특정 구체예에서, 치환을 위해 선택된 아미노산은 Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp, Val, Met, Pro, Cys, Ala, 또는 Gly이다. 이러한 특정 구체예에서, 단백질로 치환되어 들어가는 더 친수성인 아미노산은 Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, Asp, 및 Arg로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 주로, 잔기가 다른 것들보다 더 친수성인지 소수성인지 아니면 덜 친수성인지 소수성인지 결정하기 위한 바람직한 소수성 등급은 Black 및 Mould 소수성 등급이다.
어떤 구체예에서, 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 2개의 아미노산 잔기가 치환된다. 관련된 구체예에서, 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 3개의 아미노산 잔기가 치환된다. 또한, 유사한 구체예에서, 적어도 하나의 잔기가 단백질 내의 하나보다 많은 응집 경향 영역 내에서 치환된다.
바람직한 구체예에서, 본원에 설명된 방법은 항체, Fab 단편, Fab'단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, 및 Fc 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질에 적용된다.
다른 바람직한 구체예에서, 본원에 설명된 방법은 사이토카인, 케모카인, 리포카인, 미오카인, 신경전달물질, 뉴로트로핀, 인터류킨, 또는 인터페론으로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질에 적용된다. 어떤 특정 구체예에서, 단백질은 호르몬 또는 성장인자, 수용체 또는 수용체 도메인, 또는 신경전달물질 또는 뉴로트로핀일 수 있다. 어떤 구체예에서, 단백질은 펩티도미메틱, 변형 단백질, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 또는 희귀 아미노산을 포함하는 단백질이다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 단백질 내 아미노산 잔기의 유효-SAA를 계산하기 위한 방법을 제공한다. 단백질 내의 아미노산 잔기의 유효-SAA를 계산하기 위한 바람직한 방법은 (a) 아미노산에 대해, 아미노산에 있는 원자들의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 동일한 잔기에서 완전히 노출되는 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계; (b) 아미노산 소수성 등급에 의해 결정된 상기 아미노산의 소수성을 비에 곱하는 단계를 포함하며, 여기서 곱이 아미노산의 유효-SAA이다. 이에 더하여, 단백질 내 아미노산 잔기의 유효-SAA는 단백질 서열에서 인접한 3개 아미노산에 대한, 또는 어떤 구체예에서는 2, 4, 5 또는 6개 아미노산에 대한 유효-SAA를 합계 내는 단계를 더 포함하는 방법에 의해 계산될 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 또한 단백질 상의 거대분자 결합 영역을 확인하기 위한 방법을 포함하며, 이 방법은 (a) 단백질 내의 원자들에 대해 선행 양태들 중 어느 하나에 따라서 계산된 SAP를 단백질의 구조 모델 상에 지도화하는 단계; 및 (b) 복수의 원자가 SAP > 0을 갖는 단백질 내의 영역을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 상기 복수의 원자를 포함하는 아미노산들을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 선택된 역치를 초과하는 SAP를 갖는 하나 이상의 원자를 함유하는 하나 이상의 아미노산을 확인하는 단계를 포함하는, 단백질 상의 거대분자 결합 영역을 확인하기 위한 방법을 포함하며, 여기서 SAP는 선행 양태들 중 어느 하나의 방법에 따라서 계산되고, 거대분자 결합 영역은 확인된 아미노산들을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 선행 양태들 중 어느 하나에서 계산된 SAP 값들의 플롯을 작성하는 단계, 플롯의 피크들에 대해서 곡선하면적(AUC)을 계산하는 단계, 및 양의 AUC를 가진 하나 이상의 단백질 영역을 확인하는 단계를 포함하는, 단백질 상의 거대분자 결합 영역을 확인하기 위한 방법을 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 확인된 단백질 영역들을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 거대분자에 대해 감소된 결합 친화성을 나타내는 단백질 변이체를 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 단백질에서 거대분자에 대한 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하거나 결실시키는 단계를 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 선행 양태들 중 어느 하나에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 이때 만일 아미노산 잔기가 치환된다면, 그것은 더 친수성인 아미노산 잔기로 치환되며, 이로써 변이체의 거대분자에 대한 결합 친화성이 감소된다. 어떤 구체예에서, 적어도 하나의 잔기가 치환되고, 적어도 하나의 잔기가 결실된다. 다른 양태로서, 본 발명은 또한 (a) 단백질에서 거대분자에 대한 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 하나의 잔기를 각 변이체에서 치환함으로써 복수의 단백질 변이체를 생성하는 단계; 및 (b) 거대분자에 대해 변경된 결합 친화성을 나타내는 (a)에서와 같이 제조된 단백질 변이체를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 선행 양태들 중 어느 하나에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 하나 또는 상이한 잔기, 또는 잔기들의 상이한 조합이 각 변이체에서 치환된다. 어떤 구체예에서, 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 거대분자 결합 영역에서 가장 소수성인 잔기이다. 어떤 구체예에서, 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp, Val, Met, Pro, Cys, Ala, 또는 Gly이다. 어떤 구체예에서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, Asp, 및 Arg로 구성되는 군으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 희귀, 비천연, 또는 변형 아미노산이다. 어떤 구체예에서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 Black 및 Mould 소수성 등급에 따라서 결정된다. 어떤 구체예에서, 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 2개의 아미노산 잔기가 치환된다. 어떤 구체예에서, 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 3개의 아미노산 잔기가 치환된다. 어떤 구체예에서, 적어도 하나의 잔기가 단백질 내의 하나보다 많은 응집 경향 영역 내에서 치환된다. 어떤 구체예에서, 응집 경향 영역은 단백질 상의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 선행 양태들 중 어느 하나의 방법에 따라서 확인된다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 거대분자는 다른 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 다당이다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 단백질은 항체, Fab 단편, Fab' 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, 및 Fc 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 단백질은 사이토카인, 케모카인, 리포카인, 미오카인, 신경전달물질, 뉴로트로핀, 인터류킨, 또는 인터페론이다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 단백질은 호르몬 또는 성장인자이다. 어떤 구체예에서, 거대분자는 호르몬 수용체 또는 성장인자 수용체이다. 어떤 구체예에서, 단백질은 수용체 또는 수용체 도메인이다. 어떤 구체예에서, 거대분자는 수용체 또는 수용체 도메인의 수용체 아고니스트 또는 수용체 길항제이다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 단백질은 신경전달물질 또는 뉴로트로핀이다. 어떤 구체예에서, 거대분자는 신경전달물질 수용체 또는 뉴로트로핀 수용체이다.
다른 양태로서, 본 발명은 또한 결합 파트너와의 변경된 상호작용 경향을 나타내는 단백질 변이체를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법을 포함하며, 이 방법은 제약학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트 및/또는 부형제와 함께 선행 양태들 중 어느 과정에 따라서 얻어진 단백질 변이체를 배합하는 단계를 포함한다.
본 발명은 단백질 응집 메커니즘을 더욱 심도 있게 이해하고, 응집에 관련된 단백질 영역들을 확인하고자 하는 충족되지 않은 요구를 다룬다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 모든 잠재적 치료 단백질의 응집에 대한 안정성을 개선하기 위해 본원에 설명된 실험적 방법들과 동시에 사용될 수 있는 시뮬레이션 기술을 제공한다. 이 기술은 항체 기반 치료법들이 모든 사람 치료제 분야에서 급격한 속도로 성장중임을 고려하면 막대한 과학적 및 상업적 잠재력을 나타낸다. 응집은 항체 약물 개발 중 대부분의 단계에서 직면하는 공통된 문제이며, 잠재적 항체 약물 후보들의 신속한 상업화를 막는다. 따라서, 본원에 설명된 방법을 사용한 응집 방지는 단백질 약물 개발에 상당한 영향을 가질 것이다.
또한, 본 발명은 다른 거대분자와의 결합에 관련된 단백질 영역들을 정확히 확인하고자 하는 충족되지 않은 요구를 다루며, 이런 결합은, 적어도 부분적으로, 본원에 개시된 방법을 사용하여 쉽게 확인될 수 있는 커다란 소수성 패치를 통해 주로 매개된다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 커다란 소수성 패치를 통해 적어도 부분적으로 매개되는 모든 잠재적 단백질-분자 상호작용의 결합 친화성을 변경하기 위해 본원에 설명된 실험적 방법과 동시에 사용될 수 있는 시뮬레이션 기술을 제공한다. 이 기술은 항체 기반 치료법들이 모든 사람 치료제 분야에서 급격한 속도로 성장중임을 고려하면 막대한 과학적 및 상업적 잠재력을 나타낸다. 하나 이상의 거대분자에 대한 단백질 치료제의 결합 친화성을 변경할 수 있는 능력은 효능을 개선하고, 원치 않는 2차 거대분자 결합 영역을 통해 매개되는 활성을 감소시키거나 제거하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명은, 특히, 단백질의 응집을 감소시키거나 방지하고, 또는 거대분자에 대한 결합 친화성을 변경하기 위한 방법들을 제공한다. 특히, 이런 방법들은 단백질 상호작용, 단백질-거대분자 상호작용 또는 단백질 응집에 참여할 수 있는 단백질 구조 상의 소수성 영역을 확인하기 위해서 제공된다. 제공된 방법들은 "응집-경향-영역" 또는 "SAP"로 본원에 개시된 새로운 기술에 기초한다. SAP 도구는 또한 다른 단백질과 결합하는 경향이 있는 항체 영역들을 정확히 확인한다. 항체에 더하여, 이 도구는 응집 경향 영역 또는 다른 단백질이나 리간드와 결합하는 영역의 확인을 위해 모든 단백질에 광범하게 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 3-차원 구조를 이용할 수 있거나, 또는 상동성 모델링, 분자 모델링, 또는 순이론적 구조 결정을 사용하여 3-차원 구조가 창조될 수 있는 모든 단백질에 적용될 수 있다. 일반적으로, "SAP"는 본원에 설명된 등식 및 방법을 사용하여 여러 방식으로 계산될 수 있으며, 예를 들어 SAP는 단백질 구조 모델에 대해서 계산될 수도 있고, 또는 구조 모델의 분자 역학 시뮬레이션의 여러 시간 단계에 걸친 평균으로서 계산될 수도 있다. 특정 계산 방법과 얻어진 결과는 본원에 설명된 대로 다양할 수 있지만, 근본적인 원리는 SAP가 단백질에 있는 잔기들의 소수성을 설명할 뿐만 아니라, 단백질 3-차원 구조와 폴딩된 단백질 구조에서 아미노산 잔기들의 인접성도 설명하는 척도라는 사실에 기초한다.
"단백질"은 인접 아미노산들이 카르복실기와 아미노기 사이의 펩티드 결합에 의해 함께 이어진 둘 이상의 아미노산(또한 본원에서는 "아미노산 잔기" 또는 "잔기"라고도 한다)으로 이루어진 어떤 서열을 말하며, 길이, 번역-후 변형, 화학적 변형, 또는 기능과는 무관하다. "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환하여 사용된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 3-차원 구조로 폴딩될 만큼 충분한 길이를 가진 단백질에 적용된다. 어떤 구체예에서, 단백질은 자연 발생 단백질이다. 어떤 구체예에서, 단백질은 화학적으로 합성된다. 어떤 구체예에서, 단백질은 재조합 단백질, 예를 들어 하이브리드 또는 키메라 단백질이다. 어떤 구체예에서, 단백질은 복합체화된 단백질(예를 들어, 복합체화된 상호작용 단백질)이다. 단백질은 분리될 수 있다(예를 들어, 천연 공급원이나 화학적 환경으로부터). 어떤 구체예에서, 단백질은 변형 단백질 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 어떤 구체예에서, 단백질은 유도체화된 단백질, 예를 들어 화학적으로 콘쥬게이트된 단백질일 수 있다(제한은 아니지만, 중합체 콘쥬게이트된 단백질(예를 들어, 페그화 단백질)을 포함한다). 본원에서 사용된 용어 "단백질"은 또한 단백질 단편을 포함하도록 의도된다. 전형적인 단백질은 항체를 포함한다(제한은 아니지만, 그것의 단편, 변이체, 및 유도체를 포함한다).
실제로, 본 발명의 방법은 구조 모델을 이용할 수 있거나, 또는 구조 모델이 생성될 수 있는 모든 아미노산 기반 구조에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 방법은 변형 단백질, 또는 본원에 설명된 희귀 또는 비천연 아미노산이 편입된 단백질에 적용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 희귀, 비천연, 또는 변형 아미노산의 구조가 본원에 설명된 방법의 적용을 위해 컴퓨터에 의해서 구조 모델에 치환되어 들어가거나 삽입될 수 있다. 펩티드 유사체, 유도체 및 미메틱들을 실험적으로 디자인하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Farmer, P.S. in Drug Design (E.J. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980, vol. 10, pp. 119-143; Ball, J.B. and Alewood, P.F.(1990) J. Mol . Recognition 3:55; Morgan, B.A. and Gainor, J.A. (1989) Ann . Rep . Med . Chem. 24:243; 및 Freidinger, R.M. (1989) Trends Pharmacol . Sci. 10:270을 참조한다. 또한, Sawyer, T.K. (1995) "Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" in Taylor, M.D. and Amidon, G.L. (eds.) Peptide - Based Drug Design : Controlling Transport and Metabolism, Chapter 17; Smith, A.B. 3rd, et al . (1995) J. Am . Chem . Soc. 117:11113-11123; Smith, A.B. 3rd, et al . (1994) J. Am . Chem . Soc. 116:9947-9962; 및 Hirschman, R., et al . (1993) J. Am . Chem . Soc . 115:12550-12568을 참조한다.
많은 다양한 펩티드, 폴리펩티드, 및 단백질 치료제가 본 분야에 알려져 있으며, 이들은 본 발명의 방법으로 인해 이익을 얻을 것으로 기대된다. 이들 치료제는 특히 호르몬, 단백질, 항원, 면역글로불린, 억제제/활성제, 효소, 사이토카인, 케모카인, 미오카인, 리포카인, 성장인자, 수용체, 수용체 도메인, 신경전달물질, 뉴로트로핀, 인터류킨, 및 인터페론을 포함하여, 몇 가지 매우 광범한 부류들을 포함한다.
본 발명의 범위에서 채택될 수 있는 적합한 호르몬은 단백질 호르몬들, 예를 들어 혈당을 조절하는 인슐린 및 글루카곤을 포함한다. 당업자에게 인정되는 대로, 주지된 호르몬들은 전형적으로 암, 대사성 질환, 심혈관 질환, 뇌하수체 이상 및 폐경을 포함하여, 여러 상이한 상태 및 질환들의 치료를 위해 채택된다.
초기에는 단지 일부 단백질만이 피브릴을 형성하거나 응집한다고 생각되었다. 더욱 최근에는 예상하는 것보다 더 많은 단백질들이 응집 경향 영역을 가지는 것으로 나타났다(Fandrich, M., Fletcher, M.A., and Dobson, C.M. (2001) Nature 410, 165-166). 실제로, 4개 잔기 정도의 짧은 펩티드도 피브릴을 형성할 수 있다는 것이 보고되었다(J. Biol. Chem., Vol. 277, Issue 45, 43243-43246, Nov. 8, 2002).
단백질 치료제는 치료제 시장에서 시장점유율이 증가하고 있다. 예를 들어, 인슐린과 글루카곤은 혈당을 조절하는 중요한 단백질 치료제이며, 본원에 설명된 방법으로 인해 이익을 얻을 수 있다. 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)도 췌장에 의해 분비되는 호르몬으로서, 당뇨병의 치료에 사용된다. 관심 있는 또 다른 단백질은 과립구 콜로니 자극인자, 또는 G-CSF인데, 이것은 혈액 세포의 생산을 증가시키는데 사용될 수 있는 혈액 성장인자이다. 조직 플라스미노겐 활성제는 뇌졸중이나 심장발작의 치료에 사용되는 혈전치료제이다. 또한, 에리트로포이에틴은 AIDS, 빈혈, 신부전, 및 다른 이상들의 치료에 사용될 수 있는 신장에 의해 생산되는 호르몬이다. 마지막으로, 칼시토닌은 고칼슘혈증, 파젯병, 및 어떤 타입의 골다공증의 치료에 효과적이라고 밝혀진 펩티드이다.
본원에 설명된 방법으로 인해 이익을 얻을 것으로 기대되는 단백질들의 다른 예들은, 제한은 아니지만, ACTH, 아밀린, 안지오텐신, 안지오게닌, 항염증성 펩티드, BNP, 엔도르핀, 엔도텔린, GLIP, 성장 호르몬 방출인자(GRF), 히루딘, 인슐리노트로핀, 뉴로펩티드 Y, PTH, VIP, 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH), 옥트레오티드, 뇌하수체 호르몬(예를 들어, hGH), ANF, 성장인자, bMSH, 소마토스타틴, 혈소판-유래 성장인자 방출인자, 사람 융모성 고나도트로핀, 히루로그, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터류킨, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 메노트로핀(유로폴리트로핀(FSH) 및 LH), 스트렙토키나제, 유로키나제, ANF, ANP, ANP 청소 억제제, 항이뇨성 호르몬 아고니스트, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), IGF-1, 펜티게티드, 단백질 C, 단백질 S, 티모신 알파-1, 바소프레신 길항제 유사체, 우성 음성 TNF-α, 알파-MSH, VEGF, PYY, 및 전술한 것들로부터 유래되는 폴리펩티드, 단편, 폴리펩티드 유사체 및 유도체들을 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 단백질은 항체 또는 면역글로불린이다. 용어 "항체"는 가장 광범한 의미로 사용되며, 구체적으로 단클론 항체(전장 단클론 항체를 포함한다), 다클론 항체, 다중-특이적 항체(예를 들어, 이중-특이적 항체), 단쇄 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 및 항체 단편을 커버한다. 전장 항체는 이황화 결합에 의해서 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. CH2에 있는 Asn-297 잔기는 N-글리코실화된다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로 약기된다)과 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 이루어진다. Fc 수용체는 CH2의 하부 힌지 영역에서 결합되며, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)과 같은 이펙터 기능을 매개한다. 단백질 A는 Fc의 CH2-CH3 정션에서 결합되며, 전체 항체들의 정제에 광범하게 사용된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 VL로 약기된다)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 이루어진다. VH과 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존성인 영역들이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역들로 더 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어지며, 이들은 아미노-말단에서부터 카르복시-말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 따라서, 용어 "항체"는 여러 항체 이소타입 또는 하위부류, 예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함할 것이다. 또한, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; 힌지 영역의 일부분을 가진 본질적으로 Fab인 Fab' 단편(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul ed., 3rd ed. 1993) 참조; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al ., (1989) Nature 341:544-546); 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디가 포함된다.
본원에서 사용된 단백질 "구조 모델"은 단백질의 3-차원 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 표시한다. 구조 모델은 X-선 결정 구조, NMR 구조, 이론적 단백질 구조, 상동성 모델링으로부터 창조된 구조, 단백질 토모그래피 모델, 및 전자현미경 연구로부터 구축된 원자적 모델을 포함한다. 전형적으로, "구조 모델"은 단백질의 1차 아미노산 서열을 포함할 뿐만 아니라, 3-차원 공간에서 단백질 내 원자들에 대한 좌표들도 제공하며, 이로써 단백질 폴딩과 아미노산 잔기 위치가 보이게 된다. 바람직한 구체예에서, 분석된 구조 모델은 X-선 결정 구조, 예를 들어 단백질 데이터 뱅크(PDB, rcsb.org/pdb/home/home.do)에서 얻어진 구조, 또는 유사한 단백질의 공지된 구조에 기초하여 구축된 상동성 모델이다. 바람직한 구체예에서, 구조 모델은 본 발명의 방법을 적용하기 전에 사전-처리될 것이다. 예를 들어, 구조 모델은 분자 역학 시뮬레이션을 거침으로써 단백질 측쇄들이 더욱 자연스러운 입체구조에 도달하게 되거나, 또는 분자 역학 시뮬레이션에서 구조 모델이 용매, 예를 들어 물과 상호작용하도록 허용될 수 있다. 사전-처리는 분자 역학 시뮬레이션에만 제한되지 않으며, 용액 중에서 단백질의 거동을 결정하기 위한 본 분야에서 인정된 어떤 수단을 사용해서도 달성될 수 있다. 전형적인 대체 시뮬레이션 기술은 Monte Carlo 시뮬레이션이다. 시뮬레이션은 시뮬레이션 패키지 또는 어떤 다른 허용되는 컴퓨터 상의 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 어떤 구체예에서, 단백질의 입체구조적 공간을 조사하거나, 탐사하거나, 또는 샘플링하기 위한 시뮬레이션이 구조 모델 상에서 수행될 수 있으며, 이로써 단백질의 거동이 결정될 수 있다.
"이론적 단백질 구조"는 대체로 단백질의 천연 구조의 어떤 직접적인 실험적 측정 없이 컴퓨터 상의 방법을 사용하여 창조되는 3-차원 단백질 구조 모델이다. "이론적 단백질 구조"는 순이론적 방법 및 상동성 모델링에 의해서 창조된 구조 모델을 포함한다. "상동성 모델"은 단백질의 1차 서열을 유사한 단백질의 공지된 3-차원 구조와 비교하는 것을 전형적으로 포함하는 상동성 모델링에 의해서 창조된 3-차원 단백질 구조 모델이다. 상동성 모델링은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 본원에 참고로서 포함되는 Kolinski et al . Proteins. 1999; 37(4):592-510; Rost et al., B, Potein Sci. 1996; 5(8):1704-1718, 및 U.S. Pat. Nos. 7212924; 6256647; 및 6125331에 설명된다. 특히, Xiang(Curr Protein Pept Sci. 2006 Jun; 7(3): 217-27, 본원에 참고로서 포함된다)이 본 발명의 방법에서 유용한 구조를 생성하는데 사용될 수 있는 상동성 모델링 기술에 대해 훌륭한 설명 및 리뷰를 제공한다. 실제로, 본 분야에 알려진 모든 상동성 모델링 소프트웨어가 본 방법에 따라서 사용될 수 있으며, 예를 들어 MODELLER(Eswar, et al., MODELLER을 사용한 비교 단백질 구조 모델링, Current Protocols in Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5.6.1-5.6.30, 200), SEGMOD/ENCAD(Levitt, M., J Mol Biol 1992; 226:507-533), SWISS-MODEL(Schwede, T., Kopp, J., Guex, N., and Peitsch, M. C. Nucleic Acids Research 2003;31:3381-3385), 3D-JIGSAW(Bates, et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, Suppl 2001; 5:39-36), NEST(Xiang. Curr Protein Pept Sci. 2006 June; 7(3):217-227) 및 BUILDER(Koehl and Delarue, Curr Opin Struct Biol 1996; 6(2):222-226)가 있다. 특히 항체에 대해서는, 표준적인 구조 방법을 사용하여 항체 가변 영역의 구조가 정확하게 얻어질 수 있다(Chothia, C. and Lesk, A. M., J. Mol. Biol. 1987, 196, 901; Chothia, C., et al., Nature 1989, 342, 877).
특정 구체예에서, 상동성 모델링을 사용하여 공지된 구조 단편들로부터 전체 단백질을 조립할 수 있으며, 예를 들어 이 경우 항체 Fab 단편이 Fc 단편 위에서 모델링되거나, 또는 이론적 단백질 구조로서 Fab 단편이 창조되고, Fc 단편 결정 구조 위에서 모델링된다. 당업자는 다양한 가능성이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 한 특정 구체예에서, Fab 단편은 상이한 부류 또는 이소타입의 다양한 항체 Fc 구조 위에서 모델링될 수 있다.
또한, 순이론적 모델이 본 발명의 방법에서 채택될 수 있다. "순이론적 단백질 구조 모델"은 물리화학 분야에서 공지된 등식을 사용하여 단백질 폴딩 과정을 시뮬레이션하여 단백질 1차 서열로부터 직접 창조된 단백질 구조 모델이다(Bonneau and Baker, Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 2001, Vol. 30, 173-189; Lesk, Proteins 1997; 1:151-166. Suppl; Zemla, et al., Proteins 1997; 1:140-150. Suppl; Ingwall, et al . Biopolymers 1968; 6:331-368; 및 U.S. Pat. Nos. 6832162; 5878373; 5436850; 6512981; 7158891; 6377893; 및 U.S. Pat. Appln. Nos. 9/788,006; 11/890,863; 및 10/113,219, 모두 본원에 참고로서 포함된다). 전형적으로, 실험적으로 결정된 구조(예를 들어, X-선 결정 구조)와 상동성 모델이 순이론적 모델보다 바람직한데, 왜냐하면 어떤 경우에는 새로이 단백질 폴딩을 시뮬레이션하는데 따른 어려움이 단백질 구조 모델을 부정확하게 만들 수 있기 때문이다.
이론적 단백질 구조를 생성하기 위한 본 분야에 공지된 모든 방법이 본 발명에 따라서 유용할 수 있다는 것이 이해된다. 상기 설명된 방법들에 더하여, 단백질 구조 예측 기술의 중요 평가(Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction: CASP) 회합에서 설명된 것들과 같은 방법이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 다양한 예들이 CASP 회의록에서, 예를 들어 2006년 11월 26-30일에 캘리포니아 퍼시픽 그로브 아실로마 컨퍼런스 센터에서 열린 단백질 구조 예측 기술들의 중요 평가 제7차 공동체 광범위 실험에 관련된 간행물, 및 CASP6 회의록 Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2005. 61(S7):1-236; CASP5 회의록 Proteins: Structure, Function, and Genetics. 2003, 53(S6):333-595; CASP4 회의록 Proteins: Structure, Function, and Genetics. 2001, 45(S5): 1-199; 및 CASP3 회의록 Proteins: Structure, Function, and Genetics, 1999, 37 (S3):1-237(1999)에서 설명된다.
본 발명은 또한 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체의 제조 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 "응집 경향"은 클러스터 또는 덩어리를 형성하는 단백질의 경향이다. 이러한 클러스터나 덩어리는 전형적으로는 동일한 타입의 2개, 또는 주로 3개 이상, 또는 그 이상의 단백질을 함유할 수 있다. 따라서, "감소된 응집 경향"을 나타내는 단백질은 변형되거나 처리되었을 때, 변형되지 않거나 처리되지 않은 동일한 단백질과 비교하여 더 적은 응집체 또는 더 작은 응집체를 형성하는 것이다.
용어 "억제한다"는 어떤 현상의 측정가능한 감소를 의미하며, 본원에서는 주로 단백질 결합 상호작용이나 응집과 관련하여 사용된다.
아미노산 잔기, 잔기들의 클러스터, 단백질 영역, 펩티드, 또는 단백질 표면 상의 패치는 본원에서 주로 친수성 또는 소수성으로서 설명될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라서, 공간-응집-경향이 소수성을 설명하며, 이것은 부분적으로 본 분야에 공지된 아미노산 소수성 등급을 사용하여 계산된다. 바람직한 구체예에서, 아미노산 소수성 등급은 Black and Mould, Anal . Biochem . 1991, 193, 72-82(본원에 참고로서 포함된다)에서 제시된 등급이다. 일반적으로, Black 및 Mould에 따르면, 아미노산 소수성은 다음과 같은 추이를 보인다(가장 소수성인 잔기에서 시작한다): Phe > Leu = Ile > Tyr ~ Trp > Val > Met > Pro> Cys > Ala > Gly > Thr > Ser > Lys > Gln > Asn > His > Glu > Asp > Arg. Black 및 Mould에 의해 보고된 등급화된 소수성 값을 아래 표 1에 나타낸다.
Ala 0.616
Cys 0.68
Asp 0.028
Glu 0.043
Phe 1
Gly 0.501
His 0.165
Ile 0.943
Lys 0.283
Leu 0.943
Met 0.738
Asn 0.236
Pro 0.711
Gln 0.251
Arg 0
Ser 0.359
Thr 0.45
Val 0.825
Trp 0.878
Tyr 0.88
Asx 0.132
Glx 0.147
따라서, 본 발명의 방법에 따른 치환을 위해 아미노산이 선택된 경우(예를 들어, 높은 SAP 점수를 가지거나, 또는 응집 경향 영역에 존재하는 것으로 확인된 경우), 그것은 소수성 등급에서 더 아래쪽에 있는 다른 아미노산으로 치환될 것이다. 예를 들어, 아미노산 메티오닌이 치환을 위해 선택된다면, 그것은 덜 소수성인 어떤 아미노산, 예를 들어 Pro, Cys, Ala, Gly, 등으로 치환될 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 소수성 아미노산은 Lys로 치환된다. 다른 바람직한 구체예에서, 소수성 아미노산은 Glu, Gln, Asp, Thr, 또는 Ser로 치환된다. 따라서, 잔기가 "더 소수성인", "더 친수성인", "가장 소수성인" 또는 "가장 친수성인"이라고 설명될 경우, 소수성/친수성의 결정은 본 분야에 공지된 어떤 소수성 등급, 예를 들어 Black 및 Mould의 바람직한 등급에 따라서 이루어진다.
실제로, 본 분야에서 인정된 모든 아미노산 소수성 등급이 본 발명의 방법에서 채택될 수 있다. 따라서, 표 1에 설명된 등급이 공간-응집-경향을 계산하는 동안 사용될 수 있지만, 본 분야에 공지된 다른 등급들이 대신될 수도 있다. Biswas 등에 의한 최근 리뷰(J. Chromatogr. A 1000 (2003) 637-655; 본원에 참고로서 포함된다)는 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 여러 소수성 등급을 설명하고 있다.
아미노산 소수성에 더하여, 본원에 설명된 방법은 단백질 또는 단백질 구조 모델 내에 원자 소수성을 배정할 수 있다. 한 구체예에서, "원자 소수성"은 그 원자를 포함하는 아미노산의 소수성과 아미노산에 있는 원자 수, 또는 더 바람직하게는 아미노산 측쇄에 있는 원자 수의 비이다. 유사한 구체예에서, "원자 소수성"은 해당 원자의 크기, 표면적, 또는 체적에 비례하는 잔기 소수성의 비율일 수 있다. 예를 들어, 산소 원자가 아미노산 잔기 체적의 5%를 구성한다면, 산소 원자의 원자 소수성은 아미노산 잔기의 소수성의 5%일 것이다. 다른 구체예에서, 원자 소수성은 그 원자가 아미노산 잔기에 기여하는 표면적의 비율과 동등하거나 그에 비례하는 잔기 소수성의 비율일 수 있다. 관련된 구체예에서, 원자에 배정되는 소수성 가중치(즉, 잔기 소수성의 비율)는 잔기에서 원자가 차지하는 체적 비율, 잔기에서 원자의 질량 중량, 원자의 소수성 기여도 등을 반영할 수 있다. 상기 설명된 대로, 아미노산 소수성은 본 분야에 공지된 소수성 등급에 따라서 결정된다.
본원에서 논의된 용어 "응집 경향 영역"은 다른 단백질과 결합하는 경향을 가짐으로 응집체 형성 가능성을 증가시키는 단백질 구조 상의 영역이다. 응집 경향 영역은 본원에 설명된 SAP 점수에 의해 확인된 소수성 성격을 나타낸다. 다른 구체예에서, 응집 경향 영역은 주변 영역보다 더 소수성인 영역이다. 특정 구체예에서, 응집 경향 영역은 3-차원의 한정된 공간 영역일 수 있으며, 예를 들어 원자를 둘러싼 반경 R의 구체(또는 달리, 반경 R 이내에 적어도 하나의 원자를 가진 모든 아미노산 잔기)이며, 여기서 소수성 성격은 SAP 점수이다. 다른 구체예에서, "응집 경향 영역"은 SAP 점수에 의해 계산되었을 때 소수성 성격을 나타내는 잔기들 또는 원자들의 어떤 클러스터 또는 집단을 포함한다. 또는 달리, "응집 경향 영역"은 어떤 역치보다 높은 SAP 점수, 예를 들어 > -0.5, > 0, > 0.5 등을 가진 근처의 원자들 또는 잔기들을 포함할 수 있거나, 유사한 구체예에서는, 어떤 역치를 넘는 계산된 곡선하면적(하기 설명된 SAP 점수의 플롯에서), 예를 들어 > -0.5, > 0, > 0.5, > 1, > 1.5, > 2, > 2.5 등을 가진 원자들 또는 잔기들을 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명의 방법은 단백질 구조 모델을 사전-처리하고 및/또는 단백질 내의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 분자 시뮬레이션 기술을 채택한다. 예를 들어, SAP 또는 SAA를 계산하기 전에 분자 역학 시뮬레이션이 채택될 수 있다. 실제로, 입체구조적 공간을 샘플링하는 모든 시뮬레이션 기술/패키지가 본원에 설명된 방법에 따라서 사용될 수 있다. 바람직한 분자 시뮬레이션 방식은 분자 역학 시뮬레이션(MDS)이다. MDS는 수학적 시뮬레이션으로서, 분자 구조에 있는 원자들이 물리학의 법칙을 따라 이동하여 상호작용하는 것이 가능하며, 예를 들어 단백질 내의 화학 결합들이 화학 및 물리학의 법칙에 의해 허용되는 만큼 구부러지나, 회전하거나, 휘거나, 또는 진동할 수 있게 된다. 또한, 정전기적 힘, 소수성 힘, 반데르발스 상호작용, 용매 및 다른 것들과의 상호작용과 같은 상호작용들이 MDS 시뮬레이션에서 모델링될 수 있다. 이러한 시뮬레이션은 당업자로 하여금 단백질 구조를 용매화된 상태에서 보이는 대로 관찰할 수 있도록 하거나, 또는 시뮬레이션 동안 여러 지점에서의 다수의 측정치들을 평균 냄으로써 단백질 구조에 대한 더욱 정확한 측정치를 얻는 것이 가능하다. 바람직한 구체예에서, 분자 시뮬레이션은 CHARMM 시뮬레이션 패키지(Brooks et al . J. Comput. Chem., 1983, 4, 187)를 사용하여 수행된다. 다른 바람직한 구체예에서, 분자 시뮬레이션은 NAMD 패키지(Phillips et al . Journal of Computational Chemistry. 2005, 26, 1781)를 사용하여 수행된다. 당업자는 다수의 패키지가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이며, 예를 들어 CHARMM 패키지가 단백질 구조 모델을 셋업하거나 사전-처리, 구조의 용매화 등을 위해 채택될 수 있고, NAMD 패키지는 공간-응집-경향 계산의 일부가 되는 시뮬레이션을 위해 채택될 수 있다. MDS 시뮬레이션을 수행하기 위해 본 분야에 공지된 다수의 방법 중 어느 것이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 본원에 참고로서 포함되는 다음의 간행물들에 채택될 수 있는 다수의 방법들이 설명된다: Guvench and MacKerell, Methods Mol Biol. 2008;443:63-88; Norberg and Nilsson, Q Rev Biophys. 2003 Aug; 36(3):257-306; U.S. Pat. Nos. 5424963; 7096167, 및 U.S. Pat. Appln. Nos. 11/520,588; 및 10/723,594. 특히, 다음의 소프트웨어 플랫폼들이 분자 역학 시뮬레이션을 위해서 채택될 수 있다: ABINIT(Gonze, et al ., Comput. Mat. Science. 2002, 25, 478; Gonze, et al ., Kristallogr. 2005, 220, 558; abinit.org/); AMBER(Duan, et al ., Journal of Computational Chemistry. 2003,24(16):1999-2012;amber.scripps.edu); Ascalaph(agilemolecule.com/Products. html, June 19, 2008); CASTEP(Segall, et al., J. Phys.: Cond. Matt. 2002, 14(11):2717-2743; Clark, et al ., Zeitschrift fur Kristallographie. 2005, 220(5-6) pp. 567-570; castep.org); CPMD(CMPD 버전3.11.0 CMPD 매뉴얼, March 29, 2006; cpmd.org/manual.pdf); CHARMM(Brooks, et al., J Comp Chem. 1983, 4:187-217; charmm.org); DL_POLY(Todorov & Smith, THE DL POLY 3 USER MANUAL. STFC Daresbury Laboratory. Version 3.09.3, February 2008;cse.scitech.ac.uk/ccg/software/DL_POLY/MANUALS/USRMAN3.09.pdf); FIREBALL(fireball.phys.wvu.edu/LewisGroup/fireballHome.html); GROMACS(Van Der Spoel, et al. J Comput Chem 2005, 26(16): 1701-18. Hess, et al. J Chem Theory Comput. 2008, 4(2):435; gromacs.org); GROMOS(Schuler, Daura, van Gunsteren. Journal of Computational Chemistry. 2001, 22(11):1205-18; igc.ethz.ch/GROMOS/ index); LAMMPS(Plimpton, J Comp Phys. 1995, 117, 1-19; lammps.sandia.gov); MDynaMix(Lyubartsev and Laaksonen. Computer Physics Communications 2000, 128, 565-589; fos.su.se/~sasha/mdynamix/); MOLDY(Moldy: 일렬 및 병렬 컴퓨터들을 위한 휴대 분자 역학 시뮬레이션 프로그램, Computer Physics Communications. 2000, 126(3):309-328; earth.ox.ac.uk/~keithr/moldy.html); MOSCITO(Dietmar Paschek and Alfons Geiger. 사용자 가이드 및 매뉴얼, MOSCITO 4, Performing Molecular Dynamics Simulations, April 7, 2003, ganter.chemie.uni-dortmund.de/MOSCITO/ manual4.pdf); NAMD(Kumar, et al ., IBM Journal of Research and Development. 2007, Volume 52, No. 1/2; Phillips, et al., Proceedings of SC 2002; charm.cs. uiuc.edu/research/moldyn/); Newton-X(M Barbatti, G. Granucci, M. Ruckenbauer, M. Persico, H. Lischka, Newton-X: 크로싱 심에 가까운 뉴턴 역학 패키지, 버전 0.15b, 2007; univie.ac.at/newtonx; Barbatti, et al., J Photochem Photobio. A 190, 228(2007)); ProtoMol(Matthey, et al ., ACM Trans. Math. Softw., 2004, 30 (3):237-265; protomol.sourceforge.net/); PWscf(Quantum-ESPRESSO 버전 3.2 사용자 가이드, pwscf.org/guide/3.2.3/users-guide-3.2.3.pdf); SIESTA(Soler, et al . Journal of Physics: Condensed Matter. 2002, 14:2745-79; uam.es/departamentos/ ciencias/fismateriac/siesta/); VASP(Jurgen Furthmuller and Georg Kresse, VASP the GUIDE, Institut fur Materialphysik, Universitat Wien, Sensengasse 8, A-1130 Austria, Vienna, March 1, 2007; cms.mpi.univie.ac.at/vasp/); TINKER(Ren and Ponder. J Phys Chem. B. 2003, 107, 5933-5947; dasher.wustl.edu/tinker/); YASARA(Krieger E, Koraimann G, Vriend G.Proteins. 2002, 47(3):393-402); ORAC (Procacci, et al., Phys. Chem. 1996, 100, 10464-10469; chim.unifi.it/orac/); XMD(XMD 온라인 매뉴얼, XMD-Molecular Dynamics Program Jon Rifkin, v2.5.30 20 Jan 2002).
본원에서 사용된 용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기" 및 "잔기"는, 어떤 구체예에서, 분리된 상태로 존재하는, 예를 들어 용액 중에서 미결합 아미노 및 카르복시 말단 기를 가진 상태로 존재하거나, 또는 단백질로 존재하는, 예를 들어 아미노산 잔기가 펩티드 결합을 통해 적어도 하나의 다른 아미노산에 공유 결합된 상태로 존재하는 아미노산을 말하기 위해 동의어로서 사용될 수 있다. 당업자는 목적하는 바의 단백질 화학을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 "비천연 아미노산"은 자연에서 발생한다고 알려지지 않은 아미노산이다. 용어 "비천연 아미노산"은 아미노산 유사체들을 포함한다. 이 용어는 또한 알킬기, 아릴기, 아실기, 아지도기, 시아노기, 할로기, 히드라진기, 히드라지드기, 히드록실기, 알케닐기, 일키닐기, 에테르기, 티올기, 술포닐기, 셀레노기, 에스테르기, 티오애시드기, 보레이트기, 보로네이트기, 포스포기, 포스포노기, 포스핀기, 헤테로고리기, 에논기, 이민기, 알데히드기, 히드록실아미노기, 케토기, 당기, 알파-히드록시기, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 2-니트로벤질기, 3,5-디메톡시-2-니트로벤질기, 3,5-디메톡시-2-니트로베라트롤 카르바메이트기, 니트로벤질기, 3,5-디메톡시-2-니트로벤질기, 및 아미노기를 포함하는 기로부터 선택된 치환 또는 부가를 포함하는 천연 아미노산의 유도체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 비천연 아미노산은, 제한은 아니지만, 다음 아미노산들 중 어느 것일 수 있다: 히드록시 메티오닌, 노르발린, O-메틸세린, 크로틸글리신, 히드록시 류신, 알로-이소류신, 노르류신, α-아미노부티르산, t-부틸알라닌, 히드록시 글리신, 히드록시 세린, F-알라닌, 히드록시 티로신, 호모티로신, 2-F-티로신, 3-F-티로신, 4-메틸-페닐알라닌, 4-메톡시-페닐알라닌, 3-히드록시-페닐알라닌, 4-NH2-페닐알라닌, 3-메톡시-페닐알라닌, 2-F-페닐알라닌, 3-F-페닐알라닌, 4-F-페닐알라닌, 2-Br-페닐알라닌, 3-Br-페닐알라닌, 4-Br-페닐알라닌, 2-Cl-페닐알라닌, 3-Cl-페닐알라닌, 4-Cl-페닐알라닌, 4-CN-페닐알라닌, 2,3-F2-페닐알라닌, 2,4-F2-페닐알라닌, 2,5-F2-페닐알라닌, 2,6-F2-페닐알라닌, 3,4-F2-페닐알라닌, 3,5-F2-페닐알라닌, 2,3-Br2-페닐알라닌, 2,4-Br2-페닐알라닌, 2,5-Br2-페닐알라닌, 2,6-Br2-페닐알라닌, 3,4-Br2-페닐알라닌, 3,5-Br2-페닐알라닌, 2,3-Cl2-페닐알라닌, 2,4-Cl.sub.2-페닐알라닌, 2,5-Cl2-페닐알라닌, 2,6-Cl2-페닐알라닌, 3,4-Cl.sub.2-페닐알라닌, 2,3,4-F3-페닐알라닌, 2,3,5-F3-페닐알라닌, 2,3,6-F3-페닐알라닌, 2,4,6-F3-페닐알라닌, 3,4,5-F3-페닐알라닌, 2,3,4-Br.sub.3-페닐알라닌, 2,3,5-Br3-페닐알라닌, 2,3,6-Br3-페닐알라닌, 2,4,6-Br.sub.3-페닐알라닌, 3,4,5-Br3-페닐알라닌, 2,3,4-Cl3-페닐알라닌, 2,3,5-Cl3-페닐알라닌, 2,3,6-Cl3-페닐알라닌, 2,4,6-Cl3-페닐알라닌, 3,4,5-Cl3-페닐알라닌, 2,3,4,5-F4-페닐알라닌, 2,3,4,5-Br.sub.4-페닐알라닌, 2,3,4,5-Cl4-페닐알라닌, 2,3,4,5,6-F5-페닐알라닌, 2,3,4,5,6-Br5-페닐알라닌, 2,3,4,5,6-Cl5-페닐알라닌, 시클로헥실알라닌, 헥사히드로티로신, 시클로헥사놀-알라닌, 히드록시 알라닌, 히드록시 페닐알라닌, 히드록시 발린, 히드록시 이소류신, 히드록실 글루타민, 티에닐알라닌, 피롤 알라닌, NT-메틸-히스티딘, 2-아미노-5-옥소헥산산, 노르발린, 노르류신, 3,5-F2-페닐알라닌, 시클로헥실알라닌, 4-Cl-페닐알라닌, p-아지도-페닐알라닌, o-아지도-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 2-아미노-4-펜탄산, 및 2-아미노-5-옥소헥산산. 적어도 상기 열거된 비천연 아미노산들에 대해서와 Ambrx ReCODE™ 기술(ambrx.com/wt/page/technology)에서 사용된 것들에 대해서, 이 비천연 아미노산들은, 예를 들어 Black 및 Mould에 설명된 대로, 흔한 20개 아미노산의 소수성 등급과 유사한 소수성 등급을 따를 것이다. 또는 달리, 어떤 비천연 또는 희귀 아미노산의 소수성은 본 분야에 잘 공지된 다양한 기술에 의해서, 예를 들어 Biswas 등(J. Chromatogr. A 1000 (2003) 637-655)에서 참고 리뷰된 것들에 의해서 결정될 수 있다.
용어 "아미노산 유사체"는 C-말단 카르복시기, N-말단 아미노기 또는 측쇄 작용기가 다른 작용기로 화학적으로 변형된 아미노산을 말한다. 예를 들어, 아스파르트산-(베타-메틸 에스테르)는 아스파르트산의 아미노산 유사체이고, N-에틸글리신은 글리신의 아미노산 유사체이고, 알라닌 카르복사미드는 알라닌의 아미노산 유사체이다.
용어 "희귀 아미노산"은 드물게 보이는 천연 아미노산이나, 가장 흔한 아미노산들에 들어가지 않는 천연 아미노산을 말하며, 여기서 흔한 아미노산은 셀레노시스테인, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린이다.
본 발명의 방법에 따라서 단백질로 치환되어 들어갈 수 있는 변형, 희귀(즉, 드문), 비천연, 또는 유사체 아미노산들의 다른 비제한적 예들은 O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)-알라닌, 3-메틸-L-페닐알라닌, 플루오로화 페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-요도-L-페닐알라닌, p-브로모-L-페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 3,4-디히드록시-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아세틸-L-페닐알라닌, m-아세틸-L-페닐알라닌, 4-(2-옥소-프로폭시)-L-페닐알라닌, 및 다음 간행물들에 설명된 아미노산들(및 그것을 편입시키는 방법)이다: US Pat. Nos. 7,083,970; 7,045,337; US Pat. Appl. Nos. 10/126,931; 11/002,387; 11/254,170; 11/009,635; 11/670,354; 11/284,259; 10/563,686; 11/326,970; 10/563,656; 10/563,655; 11/715,672; 11/671,036; 11/255,601; 11/580,223; 11/137,850; 11/233,508; 10/575,991; 11/232,425; Wipo 공보 WO/2007/094916; WO/2007/130453; 및 간행물들 Liao J. Biotechnol Prog. 2007 Jan-Feb; 23(1):28-31; Rajesh, and Iqbal. Curr Pharm Biotechnol. 2006 Aug; 7(4):247-59. Cardillo et al. Mini Rev Med Chem. 2006 Mar; 6(3):293-304; Wang et al. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2006; 35:225-49; Chakraborty et al., Glycoconj J. 2005 Mar; 22(3):83-93, 모두 본원에 참고로서 포함된다. 비천연 아미노산들의 다른 예들은, 예를 들어 다음의 공보들에서 찾을 수 있다: U.S. 특허 공보 2003-0082575, 2005-0250183, 2003-0108885, 2005-0208536 및 2005-0009049, 모두 그 내용이 본원에 참고로서 포함된다.
I. 공간-응집-경향
본원 발명은 단백질 표면의 응집 경향 영역을 확인하고, 단백질의 응집을 방지하거나 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 감소된 응집 경향을 가진 면역글로불린을 생성하는데 적용될 수 있으며, 즉 농축 용액 중의 면역글로불린이 고도로 응집된 멀티머보다는 주로 모노머 형태로 유지된다. 본원 방법은 단백질의 응집 경향이 감소되도록 변형될 수 있는 단백질 영역을 확인하기 위한 컴퓨터 계산 방법의 능력에 있어서 어떤 진보를 나타낸다. 특히, 본 방법은 단백질의 표면을 특성화하기 위한 본 분야에 알려진 SAA(용매 접근가능한 면적)의 계산에 적어도 부분적으로 기초한다. SAA는 각 아미노산 또는 단백질 구조에서 용매와 접촉하고 있는 표면적을 제공한다. SAA는 전형적으로 프로브 구체가 단백질 표면, 즉 단백질 구조 모델의 표면 위를 굴러감에 따라서 프로브 구체 중심의 궤적을 컴퓨터로 계산함으로써 계산될 수 있다. 프로브 구체는 물 분자의 반경과 동일한 반경, 즉 R = 1.4Å을 가진다. 하기 설명되는 SAA를 계산하는 다른 방법도 본 분야에 알려져 있으며, 본원에 설명된 방법과 양립가능하다. SAA는 단백질 표면을 특성화하는데 아주 유용하지만, 다음 단점들 때문에 잠재적으로 응집 경향이 있는 단백질 표면의 소수성 패치를 특성화하는 데는 충분하지 않은 것으로 판명되었다:
1. SAA는 소수성 영역과 친수성 영역을 구별하지 못한다.
2. SAA는 잔기의 소수성에 직접 비례하지 않는다(예를 들어, MET는 LEU보다 표면적이 더 크지만 덜 소수성이다).
3. SAA는 몇 개의 소수성 잔기들이 나란히 있는지 나타내지 못하며, 따라서 어떤 영역의 소수성을 증진시킬 수 있다. 이들 잔기는 일차 서열에서 나란히 있을 수 있거나, 또는 일차 서열에서는 멀리 떨어져 있어도 3차 구조에서는 나란히 있을 수 있다. 어느 쪽이든지 이들은 항체 표면에서 어떤 패치의 소수성을 증진시킬 수 있다.
본원에 설명한 한 척도인 유효-SAA는 하기 식에 따라서 노출된 아미노산 분획의 소수성을 계산함으로써 발생된다:
Figure pct00001
유효-SAA의 추가의 구체예는 일차 단백질 서열에서 인접해 있는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 등)의 아미노산 잔기에 걸쳐 유효-SAA를 합계 내는 것을 포함한다. 유효-SAA는 기본 SAA를 능가하는 개선을 나타내지만, 접힌 단백질의 구조와, 단백질 서열에서 인접해 있지 않은 아미노산들이 단백질의 접힌 2차, 3차, 또는 4차 구조에서는 서로 근접해 있을 수 있다는 사실을 충분히 설명할 수 있는 능력이 부족하다. 이러한 단백질 폴딩은 일차 구조에서는 나타나지 않거나, 또는 접힌 단백질 구조의 더욱 면밀한 분석에 의해서만 검출될 수 있는 응집 경향 영역을 형성할 수 있다.
본 발명은 단백질 표면의 어떤 패치나 영역의 유효 소수성을 강조하는, 공간-응집-경향이라고 부르는 새로운 더욱 진보된 척도를 제공한다. 공간-응집-경향은 단백질 구조 모델의 원자들 상의 또는 근처의 한정된 공간 영역에 대해 계산된다.
이와 관련하여, "한정된 공간 영역"은 단백질 구조 상의 또는 근처의 물리적 국소 구조 및/또는 화학적 환경을 포착하도록 선택된 3-차원 공간 또는 부피이다. 특히 바람직한 구체예에서, 공간-응집-경향은 반경 R이 단백질에 있는 원자들(예를 들어, 단백질 구조 모델의 원자들)의 중심에 있는 구체 영역에 대해 계산된다. 또한, 공간-응집-경향은 반경 R이 화학적 결합들의 중심에 있거나, 또는 구조 모델 근처의 공간에 위치된 구체 영역에 대해 계산될 수 있다. 따라서, 다른 바람직한 구체예에서, SAP는 원자 근처에 중심이 있는, 예를 들어 특정 원자 또는 화학 결합의 중심으로부터 1-10Å, 더 바람직하게는 1-5Å, 더 바람직하게는 1-2Å 사이에 있는 공간 내의 지점에 중심이 있는 한정된 공간 영역에 대해 계산될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 선택된 반경 R은 1Å 내지 50Å, 더 바람직하게는 1Å 내지 50Å이다. 특정 구체예에서, 선택된 반경은 적어도 1Å, 적어도 3Å, 적어도 4Å, 적어도 5Å, 적어도 6Å, 적어도 7Å, 적어도 8Å , 적어도 9Å, 적어도 10Å, 적어도 11Å, 적어도 12Å, 적어도 15Å, 적어도 20Å, 적어도 25Å, 또는 적어도 30Å이다. 특히 바람직한 구체예에서, 선택된 반경은 5Å 내지 15Å, 더 바람직하게는 5Å 내지 12Å, 더 바람직하게는 5Å 내지 10Å이다. 특정 구체예에서, 선택된 반경은 5Å 또는 10Å이다.
다른 구체예에서, 공간-응집 경향이 계산되는 영역은 구체가 아니다. 이 영역의 가능한 모양은 입방체, 원통, 원뿔, 타원형 회전타원체, 피라미드, 반구, 또는 공간의 일부분의 감싸는데 사용될 수 있는 어떤 다른 모양을 더 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 영역의 크기는 반경 이외의 다른 척도, 예를 들어 그 모양의 중심에서부터 표면 또는 꼭지점까지의 거리를 사용하여 선택될 수 있다.
바람직한 구체예에서, SAP는 단백질에서 치환됨으로써 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있는 잔기를 선택하는데 사용될 수 있다. 선행 연구에서 단백질을 안정화하는 두 가지 주요 시험관내 접근법은 (1) 단백질 서열 자체를 유전조작하는 것과 (2) 액체 제제에 첨가제를 포함시키는 것이었다. 두 접근법이 모두 조사되었고, 유의한 결과가 얻어졌다. 첫 번째 접근법은 가상의 또는 실험적인 무작위 변이체들의 광범한 라이브러리를 스크리닝하는데 기초한다. 두 번째 접근법에서는, 안정화 첨가제뿐만 아니라 첨가제의 합리적 디자인을 위한 고-처리량 스크리닝이 치료 단백질의 최적 제제의 확인을 허용한다.
본 발명은 컴퓨터에 의해서 응집의 기존 핫-스폿을 확인하고, 실험적으로 이들 부위에 치환을 가진 변이체를 분석함으로써 안정성 증진 과정을 능률화할 수 있을 것으로 기대된다.
따라서, 일반적인 관점에서, 단백질에서 특정 원자의 공간-응집-경향을 계산하기 위한 방법은 (a) 단백질을 표시하는 구조 모델에서 하나 이상의 원자를 확인하는 단계, 여기서 하나 이상의 원자는 특정 원자 상에 또는 근처에 중심이 있는 한정된 공간 영역 내에 있고; (b) 한정된 공간 영역 내의 하나 이상의 원자 각각에 대해, 이 원자들에서의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 완전히 노출된 동일한 잔기에서의 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계; (c) 각 비에 하나 이상의 원자들의 원자 소수성을 곱하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 적들을 합계 내는 단계를 포함하며, 이때 합계가 특정 원자의 SAP이다.
관련된 구체예에서, SAP는 (a) 단백질을 표시하는 구조 모델에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 특정 원자 상에 또는 근처에 중심이 있는 한정된 공간 영역 내에 적어도 하나의 원자를 가지고; (b) 확인된 하나 이상의 아미노산 잔기 각각에 대해, 이 아미노산에서의 원자들의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 완전히 노출된 동일한 잔기에서의 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계; (c) 각 비에 아미노산 소수성 등급에 의해 결정된 하나 이상의 아미노산 잔기의 소수성을 곱하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 적들을 합계 내는 단계를 포함하는 상이한 방법에 따라서 계산될 수 있으며, 이때 합계가 특정 원자의 SAP이다. 바람직한 구체예에서, 구조 모델은 분자 역학 시뮬레이션에서 구조 모델이 용매와 상호작용하도록 허용함으로써 단계 (a) 전에 처리된다. 아미노산이 한정된 공간 영역 내에 적어도 하나의 원자를 갖는 것으로 확인된 경우, 적어도 하나의 원자는 오로지 아미노산 측쇄에 있는 원자이기 위해서 필요할 수 있다. 또는 달리, 그것은 주쇄 원자이기 위해 필요한 원자일 수 있다.
다른 구체예에서, 이 방법은 선택적으로 단계 (a) 전에 분자 역학 시뮬레이션을 수행하는 단계, 복수의 시간 단계에서 추가의 분자 역학 시뮬레이션이 수행될 때마다 단계 (a)-(d)를 반복하는 단계, 이로써 단계 (d)에서와 같이 다수의 합계를 얻는 단계, 및 합계들의 평균을 계산하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 계산된 평균이 특정 원자의 SAP이다.
다른 바람직한 구체예에서, SAP는 단백질에서 치환됨으로써 거대분자에 대한 단백질을 결합 친화성을 감소시킬 수 있는 잔기를 선택하는데 사용될 수 있다.
당업자는 분자 역학 시뮬레이션에서 계산된 값들의 평균을 채택하는 본 발명의 구체예가 컴퓨터 계산상 더욱 집약적일 거라는 점을 인정할 것이다. 이러한 구체예는 또한, 어떤 경우에는 더욱 정확한 또는 높은 해상도의 공간-응집-경향 맵을 제공할 것이다. 그러나, 본원에서 논의된 실험들은 본 방법이 분자 역학 평균화가 채택되지 않은 경우에도 여전히 매우 정확하다는 것을 나타낸다. 한 바람직한 구체예에서, 공간-응집-경향 값은 데이터베이스, 예를 들어 단백질 데이터 뱅크(PDB)의 모든 단백질 구조에 대해 계산될 수 있으며, 이로써 모든 공지된 단백질 구조 상의 소수성 잔기 및 패치를 신속하게 확인할 수 있다. 이 방법은 대규모 단백질 집단의 신속한 스크리닝과 그에 따른 잠재적 응집 경향 영역 및/또는 단백질 상호작용 부위의 확인을 허용한다.
바람직한 적용에서, 공간-응집-경향은 하기 식에 의해 설명되며;
Figure pct00002
여기서,
1) 반경 R 내에 있는 측쇄 원자들의 SAA가 각 시뮬레이션 스냅샷에서 컴퓨터 계산된다. SAA는 바람직하게 프로브 구체가 단백질 표면 위를 굴러감에 따라서 프로브 구체 중심의 궤적을 컴퓨터로 계산함으로써 시뮬레이션 모델에서 계산될 수 있다. 프로브 구체는 물 분자의 반경과 동일한 반경, 즉 R = 1.4Å을 가진다. 당업자는 SAA를 계산하는 다른 방법들고 SAP를 계산하기 위해 본원에 설명된 방법들과 양립될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 예를 들어, SAA는 오직 아미노산 측쇄 원자들에 대해서만 계산될 수 있다. 또한, SAA는 오직 아미노산 주쇄 원자들(즉, 펩티드 백본의 원자들과 관련 수소들)에 대해서만 계산될 수 있다. 또는 달리, SAA는 관련된 수소들은 제외한 채로 오직 아미노산 주쇄 원자들에 대해서만 계산될 수 있다;
2) 완전히 노출된 잔기(아미노산 'X'라고 하자)의 측쇄의 SAA가, 바람직한 구체예에서, 트리펩티드 'Ala-X-Ala'의 완전히 펼쳐진 입체형태에서 중앙부 잔기의 측쇄들의 SAA를 계산함으로써 얻어진다; 및
3) 원자 소수성은 Black 및 Mould(Black and Mould, Anal. Biochem. 1991, 193, 72-82)의 소수성 등급을 사용하여 상기 설명된 대로 얻어진다.
"완전히 노출된" 잔기는 트리펩티드 Ala-X-Ala의 완전히 펼쳐진 입체형태에서의 잔기 X이다. 당업자는 이 배열이, 이러한 잔기 X에 대한 SAA의 계산에 의해 이용할 수 있는 최대 용매 접근가능한 면적이 산출되도록 디자인된다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 알라닌 이외의 다른 잔기들도 결과의 완전한 혼란이나 변경 없이 계산에 사용될 수 있다는 것이 고려된다.
상기 설명된 대로, 본 발명의 방법은 어떤 단백질 구조 모델에도 적용될 수 있다. 따라서, X-선 구조에만 기초한 SAP는 다음과 같이 제시될 수 있다:
Figure pct00003
유사하게, X-선 구조를 이용할 수 없는 경우, 동일한 공간-응집-경향 파라미터가 상동성 모델링을 통해 생성된 구조에 적용될 수 있으며, SAP 파라미터는 다음과 같이 제시될 수 있다:
Figure pct00004
바람직한 구체예에서, 공간-응집-경향은 단백질 구조 모델에 있는 모든 원자에 대해 계산된다. 어떤 구체예에서, 원자과학적 공간-응집-경향 값은 각 개별 단백질 잔기에 대해, 또는 소규모 잔기 그룹에 대해 평균 내어질 수 있다.
II . 본 발명의 사용
한 양태에서, 본 발명은 단백질에서 소수성 아미노산 잔기, 영역 또는 패치를 확인하기 위해 상기 설명된 대로 사용될 수 있다. 특정 역치 값에 고정되는 것을 바라지는 않지만, > 0의 공간-응집-경향을 갖는 원자 또는 아미노산 잔기가 소수성인 것으로, 또는 응집 경향 영역에 있는 것으로 간주된다. 단백질 타입, 특정 구조, 및 그것이 존재하고 있는 용매에 따라서, 0 약간 아래의 컷오프를 사용하여, 예를 들어 -0.1, -0.15, -0.2, 등을 초과하는 공간-응집-경향을 갖는 원자 또는 잔기를 선택함으로써, 원자 또는 잔기를 확인하는 것이 바람직할 수 있다. 또는 달리, 더 강한 소수성 원자, 잔기, 또는 패치를 선택하려면, 예를 들어 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 등의 더 엄격한 컷오프를 채택하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 구체예에서, 공간적으로(즉, 단백질 서열을 따라서), 또는 바람직한 구체예에서는 공간적으로(즉, 3-차원 구조에서) 가까이 위치하는 원자 또는 잔기들보다 더 큰 공간-응집-경향을 갖는 원자 또는 잔기를 선택하는 것이 간단히 유리할 수 있다. 소수성 패치 내의 원자 또는 잔기를 선택하기 위한 한 바람직한 방법은, 예를 들어 이들이 유래하는 단백질 구조 모델 위에, 컬러 코딩 또는 숫자 코딩을 사용하여 계산된 공간-응집-경향 값들을 지도화하는 것이며, 이로써 단백질 표면 전체에서 공간-응집-경향의 차이가 시각화되고, 소수성 패치 또는 잔기의 선택이 용이해진다. 특히 바람직한 구체예에서, 공간-응집-경향의 계산은 더 높은 해상도의 반경, 예를 들어 5Å와 더 낮은 해상도의 반경, 예를 들어 10Å의 반경에 대해 선택된 두 개의 값을 사용하여 별도로 수행된다. 이러한 구체예에서, 더 큰 또는 더 넓은 소수성 패치가 해상도가 더 낮은 맵에 의해 단백질 구조에 보일 수 있다. 일단 관심 대상의 소수성 패치가 낮은 해상도 맵에서 선택되며, 이들 패치는 해상도가 더 높은 맵에서 더 상세히 조망될 수 있으며, 이것은 어떤 구체예에서는 당업자로 하여금 더욱 쉽게 또는 더욱 정확히 돌연변이되거나 변형될 잔기를 선택할 수 있도록 한다. 예를 들어, 해상도가 더 높은 맵에서 소수성 패치를 볼 때는, SAP 점수가 가장 높거나, 또는 가장 소수성(예를 들어, Black and Mould, Anal. Biochem. 1991, 193, 72-82의 등급에 따라 패치에서 가장 소수성인 잔기)인 잔기를 돌연변이를 위해 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 구체예에서, 단백질에서 응집 경향 영역을 확인하기 위한 방법은 (a) 단백질 내의 원자들에 대해 본원에 설명된 방법 중 어느 것에 따라서 계산된 SAP를 구조 모델 위에 지도화하는 단계; 및 (b) > 0의 SAP를 갖는 복수의 원자를 가진 단백질 내의 영역을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 응집 경향 영역은 상기 복수의 원자를 포함하는 아미노산을 포함한다. 이러한 구체예에서, SAP는 단백질에 있는 모든 원자에 대해, 또는 일부 원자에 대해 계산될 수 있다. 오직 관심 대상의 특정 잔기 또는 잔기 그룹에 대한 SAP만을 계산할 수 있다는 것도 고려된다.
유사한 구체예에서, 원자들의 SAP 점수(또는 아미노산 잔기들에 걸쳐 평균된 SAP 점수)를 플롯으로 나타내는 것이 유익할 수 있다. 단백질 내의 원자 또는 잔기에 따른 SAP 점수를 나타내는 이러한 플롯은 대체 후보들을 나타낼 수 있는 피크의 용이한 확인을 허용한다. 특히 바람직한 구체예에서, 단백질 내의 원자 또는 잔기에 따른 SAP 점수는 그래프로 그려지고, 곡선하면적(AUC)이 그래프의 피크에 대해 계산된다. 이러한 구체예에서, 더 큰 AUC를 가진 피크는 더 큰 또는 더 많은 소수성 응집 경향 영역을 표시한다. 특정 구체예에서, 피크, 또는 더 바람직하게는 더 큰 AUC를 가진 피크에 존재한다고 확인된 하나 이상의 잔기를 대체를 위해 선택하는 것이 바람직할 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 본원에 설명된 방법 중 어느 것에 의해서 확인된 단백질에서 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환될 잔기보다 더 친수성인 아미노산 잔기로 치환함으로써 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체를 제조하는데 사용될 수 있으며, 이로써 변이체의 응집 경향이 감소된다. 본원에서 사용되었을 때, 아미노산 잔기가 "더" 또는 "덜" 친수성 또는 소수성이라고 언급되는 경우, 이것이 예를 들어 Black 및 Mould의 소수성 등급 등, 본 분야에 알려진 소수성(친수성)의 척도에 따라서 다른 아미노산과 비교했을 때 더 소수성이거나 덜 소수성인 것을 의미한다는 것이 당업자에 의해 인정될 것이다.
유사한 구체예에서, 본 발명은 각 변이체에서, 단백질에서 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 잔기를 치환하여 복수의 단백질 변이체를 생성하는 단계; (b) 감소된 응집 경향을 나타내는 단계 (a)에서 제조된 단백질 변이체를 선택하는 단계에 의해서 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체를 제조하는데 사용될 수 있으며, 이때 응집 경향 영역은 본원에 설명된 방법에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 하나의 잔기나 상이한 잔기들, 또는 잔기들의 상이한 조합이 각 변이체에서 치환되며, 적어도 하나의 잔기가 더 친수성인 잔기로 치환된다.
이에 더하여, 응집 경향 영역에 있는 아미노산 잔기가 치환되기 보다는 결실될 수도 있다. 다중 아미노산 잔기가 대체를 위해 선택된 어떤 단백질에서는 일부 잔기는 치환되고 다른 잔기는 결실될 수 있다.
추가의 구체예에서, 다중 응집 경향 영역 또는 잔기들이 상기 설명된 방법에 의해서 초기 단백질에서 확인될 수 있다(예를 들어, 공간-응집-경향 컷오프를 사용하여 그 이상의 값을 가진 잔기들을 선택한다). 이어서, 상기 초기 단백질에서 하나 이상의 선택된 아미노산 잔기(또는 선택된 패치에 들어 있는 하나 이상의 잔기)를 더 친수성인 아미노산 잔기로 치환함으로써 복수의 단백질 변이체가 생성될 수 있으며, 이로써 여러 상이한 아미노산 치환을 나타내는 복수의 단백질 변이체들이 창조된다. 다음에, 이 집단을 스크리닝하여 감소된 응집 경향을 갖는 하나 이상의 단백질 변이체를 선택할 수 있다. 당업자는 다중 응집 경향이 확인될 수 있으며, 하나 이상의 응집 경향 영역에서 하나 이상의 치환 및/또는 결실이 만들어질 수 있다는 것을 인정할 것이다. 아미노산들의 상대적 소수성은 상기 설명된 Black 및 Mould의 소수성 등급에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 치환될 아미노산은 Phe, Leu, He, Tyr, Trp, Val, Met, Pro, Cys, Ala, 또는 Gly을 포함하거나 이들로 구성되는 군으로부터 선택된다. 관련된 구체예에서, 단백질로 치환되어 들어갈 더 친수성인 아미노산은 Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, Asp, 및 Arg를 포함하거나 이들로 구성되는 군으로부터 선택될 것이다.
단백질 변이체는 부위-지정 돌연변이유발 및 다른 재조합 DNA 기술을 포함하는 본 분야에 알려진 어떤 방법에 의해서 제조될 수 있으며, 예를 들어 US Pat. Nos. 5284760; 5556747; 5789166; 6878531, 5932419; 및 6391548를 참조한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 본원에 설명된 방법 중 어느 것에 의해서 확인된 단백질에서 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환될 잔기보다 더 친수성인 천연 아미노산 잔기, 변형된 아미노산 잔기, 희귀한 아미노산 잔기, 비천연 아미노산 잔기, 또는 아미노산 잔기 유사체 또는 유도체로 치환함으로써 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체를 제조하는데 사용될 수 있으며, 이로써 변이체의 응집 경향이 감소된다.
비천연 아미노산의 합성은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 U.S. 특허공개 No. 2003-0082575에 더 설명된다. 일반적으로, 비천연, 변형, 또는 희귀한 아미노산을 단백질에서 합성하거나 통합할 수 있는 본 분야에 알려진 어떤 방법도 사용될 수 있으며, 제한은 아니지만 Liao J. Biotechnol Prog. 2007 Jan-Feb; 23 (1): 28-31; Rajesh and Iqbal. Curr Pharm Biotechnol. 2006 Aug; 7(4): 247-59; Cardillo et al. Mini Rev Med Chem. 2006 Mar; 6(3): 293-304; Wang et al. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2006; 35: 225-49; Chakraborty et al, and Glycoconj J. 2005 Mar; 22(3): 83-93에 설명되거나 참조된 방법들이 있으며, 이들은 모두 본원에 참고로서 포함된다. 추가의 예로서, 본원에 설명된 방법에서 지시된 비천연 아미노산, 또는 희귀한 아미노산을 단백질에서 발생시키고 통합하기 위해서 Ambrx ReCODE™ 기술이 채택될 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 변이체는, 예를 들어 가속된 안정성 연구에 의해 결정되었을 때 증진된 또는 개선된 안정성을 나타낼 수 있다. 전형적인 가속된 안정성 연구는, 제한은 아니지만 증가된 저장 온도를 특징으로 하는 연구를 포함한다. 야생형 또는 초기 단백질과 비교하여 단백질 변이체에 대해 관찰된 응집체 형성의 감소가 증가된 안정성을 나타낸다. 또한, 단백질 변이체의 안정성은 야생형 또는 초기 단백질과 비교하여 변이체의 용융 온도 추이의 변화를 측정함으로써 시험될 수 있다. 이러한 구체예에서, 증가된 안정성은 변이체에서 용융 온도 추이의 증가로서 증명될 수 있다. 단백질 응집을 측정하기 위한 추가의 방법이 U.S. Pat. Appl. No. 10/176,809에 설명되며, 이것은 본원에 참고로서 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 단백질 구조의 표면에서 단백질-단백질 상호작용 부위를 확인하기 위해 계산된 공간-응집-경향이 사용될 수 있다. 단백질 상호작용 부위는 소수성 잔기 또는 소수성 패치를 주로 함유한다고 본 분야에 알려져 있다. 본원에 설명된 방법이 소수성 패치를 확인함으로써 결합 부위를 위치시키는데 유용할 거라는 것이 예상된다. 다음에, 이러한 소수성 패치는 단백질-단백질 또는 단백질-리간드 인식 부위의 후보가 될 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 또한 단백질 상의 거대분자 결합 영역을 확인하기 위한 방법을 포함하며, 이 방법은 (a) 단백질 내의 원자들에 대해 선행 양태들 중 어느 하나에 따라서 계산된 SAP를 단백질의 구조 모델 상에 지도화하는 단계; 및 (b) SAP > 0을 갖는 복수의 원자를 갖는 단백질 내의 영역을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 상기 복수의 원자를 포함하는 아미노산들을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 선택된 역치를 초과하는 SAP를 갖는 하나 이상의 원자를 함유하는 하나 이상의 아미노산을 확인하는 단계를 포함하는, 단백질 상의 거대분자 결합 영역을 확인하기 위한 방법을 포함하며, 여기서 SAP는 선행 양태들 중 어느 하나의 방법에 따라서 계산되고, 거대분자 결합 영역은 확인된 아미노산들을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 선행 양태들 중 어느 하나에서 계산된 SAP 값들의 플롯을 작성하는 단계, 플롯의 피크들에 대해서 곡선하면적(AUC)을 계산하는 단계, 및 양의 AUC를 가진 하나 이상의 단백질 영역을 확인하는 단계를 포함하는, 단백질 상의 거대분자 결합 영역을 확인하기 위한 방법을 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 확인된 단백질 영역들을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 거대분자에 대해 감소된 결합 친화성을 나타내는 단백질 변이체를 제조하는데 사용될 수 있으며, 이 방법은 단백질에서 거대분자에 대한 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하거나 결실시키는 단계를 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 선행 양태들 중 어느 하나에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 이때 만일 아미노산 잔기가 치환된다면, 그것은 더 친수성인 아미노산 잔기로 치환되며, 이로써 변이체의 거대분자에 대한 결합 친화성이 감소된다. 어떤 구체예에서, 적어도 하나의 잔기가 치환되고, 적어도 하나의 잔기가 결실된다. 다른 양태로서, 본 발명은 또한 (a) 각 변이체에서, 단백질에서 거대분자에 대한 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 하나의 잔기를 치환함으로써 복수의 단백질 변이체를 생성하는 단계; 및 (b) 거대분자에 대해 변경된 결합 친화성을 나타내는 (a)에서와 같이 제조된 단백질 변이체를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 선행 양태들 중 어느 하나에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 하나 또는 상이한 잔기, 또는 잔기들의 상이한 조합이 각 변이체에서 치환된다. 어떤 구체예에서, 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 거대분자 결합 영역에서 가장 소수성인 잔기이다. 어떤 구체예에서, 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp, Val, Met, Pro, Cys, Ala, 또는 Gly이다. 어떤 구체예에서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, Asp, 및 Arg로 구성되는 군으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 희귀, 비천연, 또는 변형 아미노산이다. 어떤 구체예에서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 Black 및 Mould 소수성 등급에 따라서 결정된다. 어떤 구체예에서, 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 2개의 아미노산 잔기가 치환된다. 어떤 구체예에서, 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 3개의 아미노산 잔기가 치환된다. 어떤 구체예에서, 적어도 하나의 잔기가 단백질 내의 하나보다 많은 응집 경향 영역 내에서 치환된다. 어떤 구체예에서, 응집 경향 영역은 단백질 상의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 선행 양태들 중 어느 하나의 방법에 따라서 확인된다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 거대분자는 다른 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 다당이다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 단백질은 항체, Fab 단편, Fab'단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, 및 Fc 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 단백질은 사이토카인, 케모카인, 리포카인, 미오카인, 신경전달물질, 뉴로트로핀, 인터류킨, 또는 인터페론이다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 단백질은 단백질은 호르몬 또는 성장인자이다. 어떤 구체예에서, 거대분자는 호르몬 수용체 또는 성장인자 수용체이다. 어떤 구체예에서, 단백질은 수용체 또는 수용체 도메인이다. 어떤 구체예에서, 거대분자는 수용체 또는 수용체 도메인의 수용체 아고니스트 또는 수용체 길항제이다. 선행 구체예들과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 단백질은 신경전달물질 또는 뉴로트로핀이다. 어떤 구체예에서, 거대분자는 신경전달물질 수용체 또는 뉴로트로핀 수용체이다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라서 SAP를 결정하기 위한 컴퓨터 코드에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하도록 전용화된 컴퓨터, 수퍼컴퓨터, 또는 컴퓨터 클러스터에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 단백질 상의 응집 경향 영역을 결정하기 위한 웹-기반, 서버-기반, 또는 인터넷-기반 서비스를 제공하며, 이 서비스는 사용자(예를 들어, 인터넷 상의)로부터 단백질에 대한 데이터(예를 들어, 단백질 구조 모델)를 어셉트하거나, 또는 데이터베이스로부터 이러한 데이터를 검색함으로써, 서비스 사용자가 선택적으로 단백질의 분자 역학 모델링을 포함해서 단백질의 정적 구조를 생성하거나, 검색하거나, 또는 접근할 수 있어서 단백질의 동태적 구조를 제공할 수 있는 단계, 및 이렇게 생성된 정적 또는 동태적 구조에 기초하여 단백질의 원자 또는 잔기에 대한 SAP를 결정하는 단계, 및 SAP 데이터를, 예를 들어 서비스 제공자가 사용자에게 상기 SAP 데이터를 사용하여 지도화된 구조적 모델로서 되돌려 보내는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 사용자는 사람이다. 다른 구체예에서, 사용자는 컴퓨터 시스템 또는 자동화된 컴퓨터 알고리즘이다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 인터넷을 통해 사용자 단말기에 SAP를 계산하기 위한 웹 서비스를 제공하기 위한 웹 서버; 계산 방법, 아미노산 소수성 등에 대한 일반적인 정보를 저장하기 위한 데이터베이스; 및 데이터베이스의 정보 및 사용자가 인터넷을 통해 제공하거나 전송한 정보에 기초하여 SAP 계산을 수행하기 위한 계산 서버를 포함하는 SAP 계산 시스템을 제공한다.
어떤 구체예에서, 웹 서버와 계산 서버는 동일한 컴퓨터 시스템이다. 어떤 구체예에서, 컴퓨터 시스템은 수퍼컴퓨터, 클러스터 컴퓨터, 또는 단일 워크스테이션 또는 서버이다.
관련된 구체예에서, SAP 계산 시스템의 웹 서버는 전체 작업을 제어하기 위한 컨트롤러, 인터넷에 접속하기 위한 네트워크 접속 유닛, 및 인터넷을 통해 접속된 사용자 단말기에 SAP를 계산하기 위한 웹 서비스를 제공하기 위한 웹 서비스 유닛을 더 포함한다.
이에 더하여, 본 발명의 구체예는 또한 다양한 컴퓨터-도구화된 작업을 수행하기 위한, 예를 들어 구조적 모델의 SAP를 계산하고, SAA를 계산하고, 유효-SAA를 계산하고, 구조적 모델을 조작하고, 분자 역학 시뮬레이션을 실행하고, 관련 데이터를 구조화하여 저장하고, 또는 본원에 설명된 다른 작업을 수행하기 위한 프로그램 코드를 함유하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 가진 컴퓨터 저장 제품에 관한 것이다. 컴퓨터-판독가능한 매체는 데이터를 저장할 수 있고, 그 후 컴퓨터 시스템에 의해 판독될 수 있는 어떤 데이터 저장 장치이다. 컴퓨터-판독가능한 매체의 예들은, 제한은 아니지만 하드디스크, 플로피디스크, 플래시 드라이브, 광 디스크(예를 들어, CD, DVD, HD-DVD, 블루레이 디스크 등), 및 특별히 구성된 하드웨어 장치, 예를 들어 어플리케이션 특정 집적회로(ASIC) 또는 프로그램가능한 로직 장치(PLD)를 포함한다. 또한, 컴퓨터-판독가능한 매체는 짝을 이룬 컴퓨터 시스템의 네트워크 상의 캐리어 웨이브에 매립된 데이터 신호로서 분포될 수 있으며, 이로써 컴퓨터-판독가능한 코드가 분포된 방식으로 저장되고 실행된다. 상기 설명된 하드웨어 및 소프트웨어 요소는 표준 디자인 및 구조를 가진다는 것이 당업자에게 인정될 것이다. 상기 설명된 컴퓨터, 인터넷, 서버 및 서비스 관련 구체예들은 또한 SAA 및 유효-SAA뿐만 아니라 SAP에도 적용할 수 있다.
III . 본 발명의 펩티드 및 펩티드 변이체를 함유하는 제약 조성물
다른 양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 조제된, 본 발명의 방법에 의해서 생산된 하나 이상의 단백질 변이체를 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 제약 조성물은 조합 치료법으로, 즉 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 치료법은 적어도 하나의 다른 항암제와 조합된 본 발명의 단백질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "제약학적으로 허용되는 담체"는 어떤 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수지연제를 포함하며, 이들은 생리학적으로 적합해야 한다. 바람직하게, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다(예를 들어, 주사 또는 주입에 의한). 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉 본 발명의 단백질 또는 그것의 변이체가 화합물을 비활성화할 수 있는 산이나 다른 천연 조건들의 작용으로부터 이 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약학적 화합물은 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성은 보유하면서 어떤 바람직하지 않은 독성 효과는 부여하지 않는 염을 말한다(예를 들어, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19 참조). 이러한 염의 예들은 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것들뿐만 아니라, 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것들을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것들뿐만 아니라, 비독성 유기아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 제약학적으로 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약학적으로 허용되는 항산화제의 예들은 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 염산염, 나트륨 바이술페이트, 나트륨 메타바이술파이트, 나트륨 술파이트 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물에 채택될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예들은 물, 에탄올, 폴리올류(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산물의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 애쥬번트를 함유할 수 있다. 멸균 과정과 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르빈산 등을 포함시키는 것에 의해서 미생물 존재의 확실한 방지가 가능하다. 또한, 당류, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 이에 더하여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킴으로써 주사가능한 제약 형태의 연장된 흡수가 가능해질 수 있다.
제약학적으로 허용되는 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산물, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제들의 사용은 본 분야에 알려져 있다. 어떤 종래의 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우만 제외하고, 본 발명의 제약 조성물에서 이들의 사용이 고려된다. 또한, 보충적 활성 화합물도 조성물에 혼입될 수 있다.
전형적인 제제는 본 발명의 적어도 하나의 단백질 변이체를 포함하고, 본원에 개시된 방법에 더하여, 단백질의 응집을 방지하거나 줄일 수 있는 안정제(또는 응집방지제)를 더 낮은 농도로 포함할 수 있다. 따라서, 응집을 방지하기 위해 사용된 종래의 방법이 본 발명의 방법에 의해 생산된 단백질 변이체를 함유하는 제약 조성물의 개발에서 채택될 수 있다. 예를 들어, 여러 안정화 또는 응집방지 화합물이 의도된 용도 및 생물학적 독성에 따라서 본 발명의 제약 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 안정화 화합물은, 예를 들어 시클로덱스트린 및 그 유도체들(U.S. Pat. No. 5730969), 알킬글리코시드 조성물(U.S. Pat. Appl. No. 11/474,049), 샤프롱 분자의 사용(예를 들어, LEA(Goyal et al, Biochem J. 2005, 388(Pt l):151-7; US. Pat. No. 5688651의 방법), 베타인 화합물(Xiao, Burn, Tolbert, Bioconjug Chem. 2008 May 23), 계면활성제(예를 들어, Pluronic F127, Pluronic F68, Tween 20(Wei et al. International Journal of Pharmaceutics, 2007, 338(1-2):125-132)), 및 US. Pat. Nos. 5696090, 5688651, 및 6420122에 설명된 방법을 포함하며, 이들은 본원에 참고로서 포함된다.
또한, 전형적인 제제는 제약학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트 및/또는 부형제와 함께 결합 파트너와의 변경된 상호작용 경향을 나타내는 본 발명의 단백질 변이체를 포함한다.
이에 더하여, 단백질, 특히 항체는 상이한 부류의 부형제들의 조합을 사용하여 제제 중에서 안정화되며, 예들 들어 (1) 이당류(예를 들어, 사카로오스, 트레할로스) 또는 폴리올류(예를 들어, 소르비톨, 만니톨)는 우선적 배제에 의해 안정제로서 작용하며, 또한 동결건조 동안 세포보호제로서 작용할 수 있고, (2) 계면활성제(예를 들어, Polysorbat 80, Polysorbat 20)는 액체/얼음, 액체/물질-표면 및/또는 액체/공기 계면과 같은 계면에서 단백질의 상호작용을 최소화함으로써 작용하고, (3) 버퍼(예를 들어, 포스페이트 버퍼, 시트레이트 버퍼, 히스티딘)은 제제의 pH를 조절하고 유지하는데 도움을 준다. 따라서, 이러한 이당류, 폴리올, 계면활성제 및 버퍼는 본 발명의 방법에 더하여 단백질을 더 안정화하고 이들의 응집을 방지하기 위하여 사용될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 멸균되어야 하고, 제조 및 저장 조건에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도를 위해 적합한 다른 정돈된 구조로서 조제될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산물의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 예를 들어 당류, 폴리알코올류, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킴으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수가 가능해질 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적합한 용매에 필요한 양으로 활성 화합물을 혼합한 후, 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 나열된 것들로부터 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼합함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액 제조용의 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조(동결건조)이며, 이로써 이미 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 어떤 추가의 바람직한 성분의 분말이 얻어진다.
하나의 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 피험자, 및 특정 투여 방식에 따라서 변할 것이다. 하나의 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 야기하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중, 이 양은 제약학적으로 허용되는 담체와 조합된 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분의 범위일 것이다.
최적의 바람직한 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 용량 섭생이 조정된다. 예를 들어, 1회의 일시주사가 투여될 수 있거나, 몇 번으로 나눠진 분량이 시간을 두고 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급도에 따라서 분량이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 용량 균일성을 위해서 단위 제형으로 비경구 조성물을 조제하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 단위 제형은 치료될 피험자를 위한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각 단위는 필요한 제약 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 야기하도록 계산된 정해진 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 명세는 (a) 활성 화합물 특유의 특성 및 달성되어야 할 특정 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 화합하는 기술에 있어서의 고유한 제한에 직접적으로 의존하여 지시된다.
단백질의 투여에 대해서, 용량은 숙주 체중을 기준으로 약 0.0001 내지 100mg/kg, 더 일반적으로는 0.01 내지 5mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 용량은 0.3mg/kg 체중, 1mg/kg 체중, 3mg/kg 체중, 5mg/kg 체중 또는 10mg/kg 체중이거나, 또는 1-10mg/kg 범위 내이다. 전형적인 치료 섭생은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 3개월마다 1회, 또는 3-6개월마다 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 단백질의 바람직한 용량 섭생은 정맥내 투여에 의한 1mg/kg 체중 또는 3mg/kg 체중을 포함하며, 이때 항체는 다음 투약 일정 중 하나를 사용하여 제공된다: (i) 6회 용량을 4주마다, 이후 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3mg/kg 체중 1회, 이후 3주마다 1mg/kg 체중.
또는 달리, 본 발명의 단백질은 지속 방출 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우 더 적은 빈도의 투여가 필요하다. 용량 및 빈도는 환자에게 투여된 물질의 반감기에 따라서 변한다. 일반적으로, 사람 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 이어서 인간화된 항체, 키메라 항체, 및 비-사람 항체 순이다. 용량 및 투여 빈도는 치료가 예방적 치료인지 또는 치료적 치료인지에 따라 변할 수 있다. 예방적 적용에서는 비교적 낮은 용량이 장기간에 걸쳐서 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 남은 일생 동안 계속 치료받을 수 있다. 치료적 적용에서는 질환의 진행이 감소되거나 멈출 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 나타낼 때까지 비교적 높은 용량이 비교적 짧은 간격으로 때로는 필요하다. 이후, 환자에게 예방적 섭생이 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물에서 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 따라 바람직한 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분 양을 얻을 수 있도록 변화될 수 있다. 선택된 용량 수준은 채택된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그것의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시기, 채택된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 채택된 특정 조성물과 조합하여 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의료 분야에 잘 알려진 유사한 요인들을 포함하는 여러 약동학적 요인들에 따를 것이다.
본 발명의 단백질의 "치료적 유효 용량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 시기의 빈도 및 기간의 증가, 또는 질환으로 인한 장애나 무능력의 방지를 가져온다. 예를 들어, 종양의 치료에서, "치료적 유효 용량"은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 미치료 피험자에 비하여 적어도 약 20%까지, 더 바람직하게는 적어도 약 40%까지, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%까지, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 80%까지 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 사람 종양에서의 효능이 예측되는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 또는 달리, 조성물의 이런 특성은 당업자에게 알려진 분석법에 의해서 시험관내에서 이러한 억제를 나타내는 화합물의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 종양 크기를 감소시킬 수 있거나, 또는 피험자에서 증상을 완화할 수 있다. 당업자는 피험자의 크기, 피험자의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인들에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물은 본 분야에 알려진 여러 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 인정되는 대로, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라서 변할 것이다. 본 발명의 결합 부분에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입을 포함한다. 본원에서 사용된 문구 "비경구 투여"는 장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 일반적으로 주사에 의한 투여를 말하고, 제한은 아니지만 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 낭하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
또는 달리, 본 발명의 단백질은 비-비경구 경로, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 경로로 투여될 수 있다.
활성 화합물은, 삽입물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 송달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 같이, 빠른 방출로부터 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 많은 방법들이 특허를 취득하였고, 본 분야에 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조한다.
치료 조성물은 본 분야에 알려진 의료 장치에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은, U.S. 특허 Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치와 같은, 무바늘 피하주사 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명에서 유용한 잘 알려진 삽입물 및 모듈의 예들은, 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 삽입형 마이크로-주입 펌프를 개시하는 U.S. 특허 No. 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치를 개시하는 U.S. 특허 No. 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 송달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시하는 U.S.특허 No. 4,447,233; 연속적 약물 송달을 위한 가변 유속 삽입형 주입 장치를 개시하는 U.S. 특허 No. 4,447,224; 멀티-챔버 구획들을 가진 삼투 약물 송달 시스템을 개시하는 U.S. 특허 No. 4,439,196; 및 삼투 약물 송달 시스템을 개시하는 U.S. 특허 No. 4,475,196을 포함한다. 이들 특허는 본원에 참고로서 포함된다. 다른 많은 이러한 삽입물, 송달 시스템, 및 방법들이 본 분야에 공지되어 있다.
실시예
실시예의 서론
응집 경향 영역을 예측하고 응집 메커니즘을 연구하기 위한 분자 시뮬레이션 기술은 본 발명에서 채택될 수 있는 상세한 원자적 모델과는 달리 대부분 단순 비교 시뮬레이션 모델을 채택하고 있다(Ma and Nussinov. Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, 10, 445-452; Cellmer, et al, TRENDS in Biotechnology 2007, 25(6), 254). 채택된 시뮬레이션 모델의 최소 상세 모델은 격자 모델이었으며, 이것이 많은 단백질 응집 연구에서 사용되었다(Harrison et al. J. Mol. Biol. 1999, 286, 593-606; Dima and Thirumalai. Protein Sci. 2002, 11, 1036-49; Leonhard et al. Protein Sci. 2004, 13, 358-369; Patro and Przybycien. Biophys. J. 1994, 66, 1274-89; Patro and Przybycien. Biophys. J. 1996, 70, 2888-2902; Broglia et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95, 12930-12933; Istrail et al. Comput. Biol. 1999, 6, 143-162; Giugliarelli et al. Chem. Phys. 2000, 113, 5072-77; Bratko et al. J. Chem. Phys. 2001, 114, 561-569; Bratko and Blanch J. Chem. Phys. 2003, 118, 5185-94; Combe and Frenkel Chem. Phys. 2003, 118, 9015-9022; Toma and Toma. Biomacromolecules 2000, 1, 232-238; Gupta et al. Protein Sci. 1998, 7, 2642-2652; 및 Nguyen and Hall Biotechnol. Bioeng. 2002, 80, 823-834). 여기서, 각 잔기는 3-차원 격자 상에서 단일 부위를 점유한 비드로서 표시된다. 그것의 단순성으로 인해 격자 모델은 컴퓨터 계산상의 요구가 적으며, 장기적인 계획으로 대규모 시스템을 시뮬레이션하는데 사용되었다. 이들 격자 모델에 의해서는 단백질 응집의 기초를 이루는 기본적인 물리적 현상을 통찰할 수 있지만, 이들은 2차 및 3차 구조를 정확히 나타내지 못하며, 수소 결합과 같은 상이한 원자적 수준의 상호작용을 충분히 설명할 수 없다.
격자 모델과 비교하여 더 상세한 모델은 몇 개의 원자가 일반적으로 하나의 비드에 조합되는 중간 해상도 모델이며, 백본 결합 각도 및 이성질화 상태를 유지하기 위해서 가상-결합이 때로 도입된다(Smith and Hall, Mol. Biol. 2001, 312, 187-202; Smith and Hall. Proteins: Struct., Fund., Genet. 2001, 44, 344-360; Smith and Hall. Proteins: Struct., Funct., Genet. 2001, 44, 376-391; Nguyen, et al., Protein Sci. 2004, 13, 2909-2924; Nguyen and Hall, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2004, 101(46), 16180-16185; Nguyen and Hall, J. Am. Chem. Soc, 2006, 128, 1890-1901; Jang, et al., Biophys. J. 2004, 86, 31-49; Jang, et al., Protein Sci. 2004, 13, 40-53). 이 모델은 무작위 상태로부터 시작하여 12 내지 96개 폴리알라닌 펩티드(각 16-잔기)를 함유하는 시스템으로부터 원섬유 형성을 시뮬레이션하는데 성공적으로 사용되었다(Nguyen and Hall, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2004, 101(46), 16180-16185; Nguyen and Hall, J. Am. Chem. Soc, 2006, 128, 1890-1901). Dokholyan과 동료들은 이러한 모델을 적용하여 8개 모델 Src SH3 도메인 단백질에 의한(Ding, et al., Mol. Biol. 2002, 324, 851-857), 또는 28개 모델 A β(1-40) 펩티드에 의한(Peng, et al., Phys. Rev. E: Stat. Ph. Interdiscip. Top. 2004, 69, 41908-41914) 원섬유성 β-시트 구조 형성을 연구했다.
단순한 모델과는 달리, 원자적 모델은 수소 결합과 같은 원자적 세부사항을 모두 포함하고, 따라서 격자 모델이나 중간 해상도 모델보다 더 정확하다. 이러한 원자적 모델은 드러난 용매, 또는 숨겨진 용매와 함께 사용되었으며, 용매는 연속체로서 처리된다. 드러난 모델이 숨겨진 모델보다 더 정확하지만, 컴퓨터 계산상의 요구도 더욱 많다. 숨겨진 용매를 사용한 원자적 모델은 효모 단백질 Sup35의 일부인 헵타펩티드 GNNQQNY(SEQ ID NO: 1)의 응집 초기 단계를 연구하는데 사용되었다(Gsponer, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100, 5154-5159). 유사한 모델이 역평형 β 시트로 Ab16-22 아밀로이드 펩티드(KLVFFAE(SEQ ID NO: 2))가 응집하는 것에 대해 사용되었다(Klimov and Thirumalai, Structure 2003, 11, 295-307). Dokholyan와 동료들(Khare, et al., Proteins. 2005, 61, 617-632)은 드러난 원자적 모델을 사용하여 효소 Cu, Zn 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD1)의 서열에 따른 정연한 응집 경향을 조사했다. 이들은 SOD1 서열을 중복된 헵타펩티드들로 분해했고, 모노머, 다이머 및 테트라머 세그먼트에 대한 드러난 물 분자 역학 시뮬레이션(각 0.5 ns)을 여러 번 수행했다. 여기서 이들은 SOD1 서열의 아밀로이드 형성 영역이 2개의 말단, β-가닥 4 및 7, 그리고 2개의 크로스오버 루프로 이루어진다는 것을 확인했다.
유사한 분자 역학 시뮬레이션 프로토콜이 아밀로이드 형성 폴리펩티드의 규칙적인 β-응집에 대한 구조적 정보를 얻기 위해 개발되었다(Cecchini et al., J Mol Biol. 2006, 357, 1306-1321). 이 과정은 폴리펩티드 사슬의 중복된 세그먼트들로의 분해와 각 세그먼트에 대한 소수의 카피의 평형 분자 역학(MD) 시뮬레이션에 기초한다. 알쯔하이머의 Aβ(1-42) 펩티드의 서열에 따른 β-응집 경향은 매우 불균질한 것으로 판명되었는데, 세그먼트 V12HHQKLVFFAA22(SEQ ID NO: 3)에서 최대였고, 4개의 턴-유사 디펩티드에서 최소였다. 이 기술에 의해 효모 프리온 Ura2p의 N-말단 도메인의 이중-포인트 돌연변이의 응집 경향의 예측된 변화가 티오플라빈 T 결합 분석을 사용하여 시험관내 검증되었다. 폴리펩티드 사슬을 중복된 세그먼트들로 분해하는 이러한 과정은 항체와 같은 시스템에 대해서는 이들의 거대한 크기 때문에 매우 수행하기 어려울 수 있었다. 드러난 용매 중에서 하나의 전체 항체를 원자적 시뮬레이션하는 것도 항체의 거대한 크기로 인해 매우 많은 컴퓨터 계산을 요구한다. 따라서, 문헌상에서 전체 항체의 원자적 시뮬레이션은 보이지 않는다.
그러나, 항체의 일부분에 대한, 대부분은 Fab 단편에 대한 원자적 시뮬레이션은 존재했다(Noon, et al, PNAS. 2002, 99, 6466; Sinha and Smith-Gill, Cell Biochemistry and Biophysics. 2005, 43, 253). 현재 작업에서는 용매를 드러낸 상태에서 전체 항체 분자의 원자적 시뮬레이션이 수행되었다. 이들 시뮬레이션에 기초하여, 이 항체에 대한 응집 경향 영역이 본원에 설명된 '공간-응집-경향' 파라미터를 사용하여 확인되었다. 다음에, 이들 응집 경향 영역에 돌연변이를 도입하여 증진된 안정성을 가진 항체를 디자인했다. 본원에 설명된 예들은 본 발명의 특정 구체예를 말한다.
실시예 1: 분자 역학 시뮬레이션 방법
분자 역학 시뮬레이션을 모든 원자 모델을 사용하여 전체 항체에 대해 수행했다. 전체 항체에 대한 시뮬레이션의 초기 구조는 각 Fab 및 Fc 단편의 X-선 구조로부터 얻어졌다. 개념 증명(POC) Fab 단편의 X-선 구조를 IgG1 항체 IHZH로부터 얻어진 Fc의 X-선 구조 위에서 모델링하기 위해 선택했다(Saphire, et al., Science. 2001, 293, 1155). X-선 구조가 전체 항체에 대해 알려져 있고, Fc 구조가 IgG1 부류의 모든 항체와 동일하기 때문에 IHZH를 선택했다. 다음에, 모델 주형으로서 IHZH 구조를 사용하여 Fab와 Fc 단편을 정렬시켜서 전체 POC 항체의 구조를 얻었다. 정확한 거리와 배향으로 단편들을 정렬하기 위해서, RMSD(제곱근 평균 평방 편차)가 이 단편들의 공통 CYS 잔기와 전체 항체 주형(IHZH) 사이에서 최소화되었다. 각 항체 서브-도메인(CH1, CH2 등)이 이황화 결합을 함유하며, 이로써 CYS 잔기가 전체 항체 구조에 광범하게 분포되어 있기 때문에 CYS 잔기가 선택되었다. 다음에, 결과의 전체 항체 구조를 사용하여 30 ns 동안 드러난 원자 시뮬레이션을 수행했다. 항체들에서 관찰되는 가장 흔한 글리코실화 패턴인 G0 글리코실화 패턴을 시뮬레이션에 사용했다.
셋업과 분석에는 CHARMM 시뮬레이션 패키지(Brooks et al. J. Comput. Chem. 1983, 4, 187)를 사용했고, 시뮬레이션을 수행하는 데는 NAMD 패키지(Phillips et al. Journal of Computational oChemistry. 2005, 26, 1781)를 사용했다. CHARMM 전체 원자력장(MacKerell et al. J. Phys Chem. B. 1998, 102, 3586)을 단백질에 대해 사용했고, TIP3P 용매 모델(Jorgensen et al. J. Chem. Phys. 1983, 79, 926)을 물에 대해 사용했다. NPT 앙상블에서 298K 및 1 atm에서 시뮬레이션을 수행했다. Fc 단편의 글리코실화에 수반된 당 기들에 대한 변수들을 CHARMM 힘의 장과 일치되도록 유도했고, 그 후 CSFF 힘의 장(Kuttel et al. J. Comput. Chem., 2002, 23, 1236)으로부터 유도했다. pH 7에서 히스티딘 잔기의 양성자화 상태를 전기-음성 기들의 공간적 근접성에 기초하여 선택했다. 필요한 물 분자의 수를 최소화하고, 따라서 컴퓨터 계산 시간이 최소화되는 사방정계형 상자에서 전체 항체를 용매화했다. 주기적 경계 조건을 3 방향에서 모두 사용했다. 8Å의 물 용매화 외피를 사방정계형 상자의 각 방향에서 사용했다. 얻어진 전체 시스템 크기는 202130개 원자였다. 충분한 이온을 추가하여 시스템의 총 전하를 중성으로 만들었다. 전하 중성도는 시스템에서 정전기적 상호작용의 기여도를 계산하기 위해 채택된 Ewald 합계 기술에서 필요하다.
항체가 용매화된 후, 단백질을 고정시켜서 초기 에너지를 SD(급하강)에 의해 최소화하여 물이 단백질 주위를 느슨하게 둘러쌀 수 있도록 했다. 다음에, 속박력을 제거하고, SD 및 ABNR(채택된 기본 뉴튼-랩손)에 의해 구조를 더 최소화했다. 다음에, 더 적은 시간 단계를 사용하여 0.5 ps마다 5℃씩 증가시켜 시스템을 서서히 실온까지 가열했다. 다음에, 시스템을 1 ns 동안 평형화한 후, 시뮬레이션으로부터 관심 대상의 특성을 컴퓨터 계산했다. 추가의 통계 분석을 위해 시뮬레이션 동안 구조를 0.1 ps마다 저장했다.
실시예 2: 공간-응집-경향( SAP )의 계산
SAA의 단점을 극복하기 위해, 상기 설명된 '공간-응집-경향'이라고 하는 새로운 파라미터가 정의되었다.
이 실시예에서, 실시예 1에 설명된 항체의 모든 원자에 중심을 두고 반경 R의 구체 영역들에 대한 '공간-응집-경향'을 계산했다. 따라서, 공간-응집-경향의 값을 두 상이한 반경의 패치(R = 5Å, 10Å)에 대해 항체의 Fc-단편에 대한 30 ns 시뮬레이션 평균을 사용하여 평가했다(당업자는 이용할 수 있는 컴퓨터 자원 및 결과물의 바람직한 해상도에 따라서 다양한 시뮬레이션 시간 단계가 선택될 수 있다는 것을 인정할 것이다). 두 경우 모두, 대부분의 값이 음의 값이었음이 주지되었으며, 이것은 대부분의 노출된 영역이 친수성임을 나타낸다. 이것은 예상된 대로 노출된 단백질 표면의 대부분이 일반적으로 친수성이기 때문이었다. 또한, 몇 개의 영역은 공간-응집-경향에 대해 양의 피크를 가진다는 것이 관찰되었으며, 이것은 높은 소수성이 노출된 것을 나타낸다. 반경이 작은 패치(5Å)에서 반경이 큰 패치(10Å)로 갈수록 일부 피크는 제거되지만, 다른 일부 피크는 강화된다. 일부 피크는 이들 영역에서 작은 소수성 패치(반경 5Å 미만)가 친수성 패치에 의해 둘러싸이기 때문에 제거되었으며, 따라서 10Å에 걸친 평균은 이 영역에서 소수성의 유효한 감소를 초래한다. 반면에, 일부 다른 영역에서는 R = 10Å에서 공간-응집-경향이 유사한 소수성 패치를 둘러싸고 있는 소수성 패치 때문에 강화된다.
상기, 공간-응집-경향은 30 ns 시뮬레이션 실시 동안의 평균으로서 계산되었다. 다음에, 시뮬레이션을 사용하여 계산된 결과를 분자 시뮬레이션 없는 X-선 구조만의 공간-응집-경향과 비교했다. 공간-응집-경향(X-선)은 시뮬레이션-평균된 값의 것과 유사했으며, 동일한 위치에 피크를 가졌지만, 피크의 크기에는 차이가 있었다. 이 차이는 반경이 더 큰 R = 10Å의 패치에서 더 높았다. 이것은 아마도 큰 패치 사이즈를 볼 때 차이들이 추가되기 때문일 것이다. 이들 차이는 역학적 시뮬레이션 실시 동안 잔기들의 표면 노출이 변화되기 때문에 생긴다. 그렇지만, 이 비교는, 특히 반경이 작은 패치 R에 대해, 공간-응집-경향의 우수한 초기 추산치가 X-선 구조 자체로부터 얻어질 수 있다는 것을 나타낸다.
R = 5Å 및 10Å에 대한 시뮬레이션으로부터 얻은 공간-응집-경향 값들을 항체 구조 위에 지도화했다. 두 경우 모두, 항체 표면을 공간-응집-경향 값에 따라서 채색했다. 양의 값의 공간-응집-경향(소수성)은 회색 또는 검은색으로 표시하고, 음의 값의 공간-응집-경향(친수성)은 연회색 또는 흰색으로 표시한다. 색체 강도는 SES의 크기에 비례한다. 따라서, 많이 노출된 소수성 패치는 짙은 검은색이 되고, 유사하게 많이 노출된 친수성 패치는 더 밝은 흰색이 될 것이다. 또한, 항체의 구조 표시는 각 잔기의 용매 접근가능한 면적에 기초한다. 공간-응집-경향의 계산에 사용된 두 반경(5Å 및 10Å)에서 모두 표면에서 흰색 지배적이라는 것이 관찰되었으며, 이것은 표면이 대부분 친수성이라는 것을 나타낸다. 이것은 또한 예상된 대로 단백질 표면의 대부분이 일반적으로 친수성이기 때문이다. 그러나, 몇 개의 검은색 영역도 알아챌 수 있었으며, 이것은 노출된 소수성 영역을 나타낸다. 검은색 영역과 흰색 영역의 콘트라스트는 SAP의 계산에 사용된 R = 10Å의 반경이 더 큰 패치에서 더욱 두드러졌다. 이들 검은색(소수성) 영역은 다른 단백질과 상호작용한다고 알려진 항체의 영역들과 우수한 상관성을 가진다. 힌지 영역에 있는 짙은 검은색 영역은 Fc-수용체가 상호작용하는 영역이고, Fc 단편에 있는 검은색 영역은 단백질 A와 단백질 G가 상호작용하는 영역이고, Fab 단편의 단부에 있는 검은색 패치는 항체가 항원과 결합하는 영역이다. R = 5Å 및 10Å 각각에 대한 공간-응집-경향 플롯을 작성했다. 단백질 상호작용 부위들이 단백질 복합체인 PDB 엔트리 1T89, 1FC2, 및 1FCC의 X-선 구조로부터 얻어졌다(Radaev, J Biol Chem. 2001, 276 (19) 16469; Deisenhofer et al. Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem. 1978. 359, 975-985; Deisenhofer, J. Biochemistry. 1981, 20, 2361-2370; Sauer-Eriksson et al. Structure. 1995, 3, 265). 소수성 상호작용은 양의 피크와 매우 잘 상관되고, 친수성 상호작용은 음의 피크와 잘 상관된다. 따라서, 공간-응집-경향 파라미터를 사용해서도 단백질의 결합 부위를 예측할 수 있다. 공간-응집-경향이 낮은 잔기(즉, 양의 값이나 음의 값에서 0에 가까운)들도 상호작용한다는 몇 가지 예외에서, 상호작용이 측쇄와 이루어지는 대신에 실제로는 주 백본 사슬의 원자들과 이루어진다는 것이 관찰되었다.
상기 논의된 다른 단백질과 상호작용하는 것으로 이미 알려진 검은색 패치와는 별도로, 항체 표면에서 추가의 검은색 패치가 확인되었다. Fc 하부에 있는 한 패치는 상당히 소수성이지만, 내부에 다소 매장되어 있고, 친수성 영역이 그 경계에 존재한다. 유사하게, 2개의 패치가 소수성이며, 용매 노출되어 있지만, 이들은 항체의 내부와 마주하고 있다. 이들 패치는 항체의 유의한 입체형태적 변화나 펼쳐짐으로 인해 이들이 노출된다면 다른 단백질과의 상호작용에 연루될 가능성을 가질 수 있다. 또한, 모든 소수성 패치는 더 작은 패치 반경(R = 5Å)에서 관찰할 수 있었고, 더 큰 패치 반경(R = 10Å)과 비교하여 콘트라스트는 더 낮았다.
또한, X-선 구조에만 기초한 공간-응집-경향(X-선) 값들을 항체 표면 위에 지도화하여 시뮬레이션-평균된 값과 비교했다. 검은색의 소수성 응집 경향 패치는 시뮬레이션을 통해 계산된 공간-응집-경향이나 X-선 구조만을 사용하여 계산된 공간-응집-경향이 아주 유사하다. 물론 단백질 A 및 G가 상호작용하는 영역에 있는 패치의 강도 등, 약간의 차이는 있다. 그렇지만, 이 비교는 X-선 구조에만 기초한 공간-응집-경향(X-선)을 사용하여 표면에서 소수성 패치의 분포에 관한 우수한 설명을 얻을 수 있다는 것을 증명한다. 이것은 전체 항체의 원자적 시뮬레이션이 컴퓨터 계산을 요구하기 때문에 중요하다. X-선 구조 모델이 없는 단백질에 대해서는 동일한 공간-응집-경향 파라미터가 상동성 모델링 또는 최초 구조 예측을 통해 생성된 구조에 적용될 수 있다. 상동성 구조는 X-선 구조와 매우 유사한 것으로 관찰되었으며, 그것의 공간-응집-경향 값들도 X-선 구조와 유사하다.
이와 같이, 공간-응집-경향은 항체의 표면에서 소수성 패치를 확인한다. 이들 패치는 원래 노출되어 있거나, 또는 항체의 동태적 변동이나 부분적 펼쳐짐으로 인해 노출될 수 있다. 또한, 이들 소수성 패치의 일부는 다른 단백질과 상호작용하는 영역과 잘 상관된다. 공간-응집-경향에 의해서 예측된 이들 소수성 패치가 응집에도 관련되는지 시험하기 위해서, 이들 특정 영역에 돌연변이를 도입하여 소수성 잔기를 친수성 잔기로 변화시켰다. 결과의 항체는 더 적은 응집 거동 및 개선된 안정성을 나타냈다. 응집 경향 잔기를 확인하는 것과는 별도로, SAP 방법에 의해서 다른 단백질과 결합하는 경향을 가진 항체 영역을 정확히 확인된다는 것도 관찰되었다. 따라서, 이 방법은 모든 단백질에 광범하게 적용될 수 있으며, 응집 경향 영역이나 다른 단백질과의 결합 영역을 확인할 수 있다.
실시예 3: 안정성 유전조작을 위한 항체 부위의 선택
항체 안정성을 증진시키기 위해 유전조작할 부위를 SAP 파라미터에 기초하여 선택했다. 이 공간적 파라미터는 (1) 각 잔기의 용매 접근가능한 면적(SAA), (2) 잔기의 소수성, 및 (3) 어떤 반경 이내에 있는 모든 잔기의 공간 기여도를 설명한다. 이 예에서, CH2에서 양의 피크들에 상응하는 소수성 잔기들을 비-소수성 잔기로 변경시켜다. 이로써 전체적인 단백질 안정성을 개선될 것으로 기대했다. 두 선택된 부위(A1 및 A2)는 2개의 매우 소수성인 잔기에 상응한다. 이들 잔기를 양으로 하전된 측쇄를 가진 매우 친수성 아미노산인 리신으로 치환한 것에 대해 분석을 수행했다. 변이체 A1 및 변이체 A2는 단일 아미노산 치환의 점에서 야생형과 차이를 나타낸다.
실시예 4: 항체 변이체의 발현 및 정제
부위-지정 돌연변이유발에 의해 항체 변이체들을 생성했다. 모든 구성물을 DNA 서열화에 의해 확인했다. 박테리아 배양물로부터 플라스미드 DNA를 mg 규모로 정제하고, HEK293 세포에 일시적으로 트랜스펙션했다. 항체 야생형과 변이체를 단백질 A 칼럼에서 조직 배양 상청액으로부터 정제하고, Q 세파로스 칼럼을 통과시켜 음으로 하전된 불순물들을 제거했다. pH 7.0 이하에서 항체들은 양으로 하전되므로 그대로 통과되지만, 음으로 하전된 불순물들은 Q 세파로스 칼럼의 양으로 하전된 매트릭스에 결합된다. 정제된 항체 용액을 농축하고, 버퍼를 20mM His 버퍼 pH 6.5로 교환하여 최종 농도를 150mg/ml로 만들었다.
품질관리로서, 정제되어 농축된 샘플의 알리쿼트를 SDS-PAGE와 원형 이색성에 의해 분석했다. 단백질 겔에는 환원 조건과 비환원 조건을 둘 다 사용했다. 또한, 원형 이색성에 의해 야생형 항체와 변이체 A1의 2차 구조를 비교했다.
실시예 5: 생물물리학적 특성
변이체 A1의 안정성을 가속 응집 실험에서 야생형과 비교했다. 20mM His 버퍼 pH 6.5 중의 150mg/ml 샘플을 58℃에서 12시간까지 인큐베이션했다. 인큐베이션을 중단하고, 15mM K-포스페이트 버퍼 pH 6.5로 10mg/ml까지 샘플을 희석한 다음, SEC-HPLC로 응집 퍼센트를 결정했다. 응집은 모든 피크의 총 면적으로 나눈 모든 비-모노머 피크의 면적 합계로서 계산했다. 각 시간 지점마다 2-4개 샘플의 평균을 나타낸다. 변이체 A1의 응집은 야생형 응집의 80% 정도로 낮다. 따라서, 단일 점 돌연변이는 응집체 형성을 20%까지 감소시킨다.
야생형과 변이체 A1을 차등 주사 마이크로열량계(DSC, Microcal)에 의해 비교했다. 전체 항체는 다중-도메인 단백질이다. DSC 분석은 상이한 도메인들이 상이한 용융 온도를 가진다는 것을 나타낸다(Ionescu, R.M., et al., J Pharm Sci. 2008, 97(4): p. 1414-26; Mimura, Y., et al., J Biol Chem. 2001, 276(49): p. 45539-47). 사람 IgG1 Fc의 불변 CH2 및 CH 도메인은 중성 pH에서 각각 70℃ 및 82℃ 근처의 용융 온도를 가진다(Ionescu, R.M., et al., J Pharm Sci. 2008, 97(4): p. 1414-26; Mimura, Y., et al., Role of oligosaccharide residues of IgG1-Fc in Fc gamma RIIb binding. J Biol Chem, 2001. 276(49): p. 45539-47.). 항체 가변 도메인의 서열에 따라서, Fab 단편은 CH2 및 CH3와 관련하여 상이한 용융 온도를 가질 수 있다. 항체 C는 CH2와 CH3의 변이 사이에 들어가는 언폴딩 변이를 가진 Fab 도메인을 함유한다. 따라서, CH2가 용융 온도가 가장 낮은 항체 도메인이다.
야생형과 변이체 A1을 15mM His pH 6.5 버퍼 중의 2mg/ml의 농도에서 분당 1.5도의 가열 속도로 가열하면서 분석했다. 기준 데이터의 차감, 단백질 농도 및 DSC 셀 체적에 따른 정규화, 및 3차 곡선 베이스라인의 삽입에 의해 샘플 데이터를 분석했다. 써모그램의 비교는 야생형과 비교하여 변이체 A1에서 CH2 용융 전이가 증가한 것을 나타낸다.
역시 공간-응집-경향 값에 기초하여 안정성을 위해 유전조작된 변이체 A2의 분석에서도 변이체 A1에 대한 발견이 반복된다.
요약하면, 유전조작된 항체 변이체의 생물물리학적 분석에서 감소된 응집과 증진된 안정성이 증명되었다. 유전조작된 부위, 변이체 안정성, 및 DSC 프로파일 사이의 강한 상관성이 치료 단백질을 안정화하기 위한 본 방법의 유효성을 증명하는 증거이다.
실시예 6: 유효- SAA
유효-SAA(3개 잔기 평균) 내의 피크들을 단백질 구조에서 응집 경향 영역과 상관시킬 수 있다는 것이 관찰되었다. 따라서, 덜 강력하기는 하지만 유효-SAA가 단백질의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 별도의 방법으로서 사용될 수 있다. 높은 유효-SAA(3개 잔기 평균) 값은 가장 소수성인 영역을 나타내고, 낮은 값은 가장 친수성인 영역을 나타낸다. 응집체 형성 경향을 가진 시험 단백질에 대한 데이터를 1.2 ns(폴딩) 및 1 ns(미스-폴딩)의 짧은 분자 시뮬레이션으로부터 얻었다. 유효-SAA를 단백질 잔기에 대응시켜 플롯을 작성했으며, 유효-SAA의 피크와 단백질 구조의 결합 네트워크에 존재하는 미스-매치 사이에 우수한 상관성이 있다는 것을 관찰하였다. 이것은 유효-SAA가 단백질 미스-폴딩 또는 응집을 촉진하는 단백질 구조의 잔기들을 정확히 확인했음을 시사한다. 시험 단백질의 돌연변이체를 몇 개 제조했으며, 적어도 하나는 적절히 폴딩된 단백질 구조를 보유하는데 있어서 유망한 결과를 나타냈다.
실시예 7: SAP 를 사용한 단백질 결합 영역의 예측
SAP 방법을 사용하여 단백질 결합 부위를 예측했다. 두 상이한 단백질, 즉 IgG1과 EGFR에 대해 결합 영역을 예측했다. IgG1 항체는 Fc-수용체, 단백질-A 및 단백질-G와 같은 단백질과 결합한다고 알려져 있다. EGFR은 표피 성장인자(EGF), 형질전환 성장인자(TGFα)와 결합하며, 또한 스스로와도 결합하여 다이머를 형성한다. IgG1 항체 및 EGFR의 결합 영역들을 결합 영역을 예측하는데 있어서 SAP 도구의 능력을 증명하기 위한 모델로서 사용했다.
분자 시뮬레이션 방법
분자 역학 시뮬레이션을 용매를 드러낸 상태에서 모든 원자 모델을 사용하여 전체 IgG1 항체에 대해 수행했다. 시뮬레이션 출발 구조는 항체의 개별 Fab 및 Fc 단편의 X-선 구조를 붙여서 얻었다. Fab 단편의 X-선 구조는 Novartis Pharma AG에서 얻었다. Fc 단편의 X-선 구조는 유사한 서열의 또 다른 IgG1 항체인 1HZH의 것으로부터 얻었다(Saphire et al., Science. 2001, 293, 1155). 다음에, 모델 주형으로서 1HZH 구조를 사용하여 Fab와 Fc 단편을 정렬시켜서 전체 항체의 구조를 얻었다. 이 항체 구조를 항체-A라고 칭했다. 정확한 거리와 배향으로 단편들을 정렬시키기 위해서, 단편들의 공통 CYS 잔기와 전체 항체 주형(1HZH) 사이의 RMSD(제곱근 평균 제곱편차)를 최소화했다. 다음에, 이 구조를 사용하여 30 ns 동안 드러낸 원자 시뮬레이션을 수행했다. 얻어진 항체-A에 있는 CYS 잔기들은 힌지 영역에 있는 한 개를 포함하여 모두 이황화 결합에 연루되었다. 항체에서 관찰되는 가장 흔한 글리코실화 패턴 중 하나인 G0 글리코실화 패턴을 시뮬레이션에 사용했다.
CHARMM 시뮬레이션 패키지(Brooks et al. J. Comput. Chem., 1983, 4, 187)를 셋업과 분석에 사용했고, NAMD 패키지(Phillips et al. Journal of Computational Chemistry., 2005, 26, 1781)로 시뮬레이션을 수행했다. CHARMM 전체 원자력장(Phillips et al. Journal of Computational Chemistry. 2005, 26, 1781)을 단백질에 대해 사용했고, TIP3P(Jorgensen et al. J. Chem. Phys., 1983, 79, 926) 용매 모델을 물에 대해 사용했다. NPT 앙상블 안에서 298K 및 1atm에서 시뮬레이션을 수행했다. Fc 단편의 글리코실화에 연루되는 당 기들에 대한 변수들을 CHARMM 힘의 장과 일치되도록 하고, 그 후 CSFF 힘의 장(Kuttel et al. J. Comput. Chem., 2002, 23, 1236)으로부터 유도하였다. pH 7에서 히스티딘 잔기의 양성자화 상태를 전기음성기의 공간 접근성에 기초하여 결정했다. 필요한 물 분자의 수가 최소화되고, 그에 따라 컴퓨터 상의 필요 시간도 최소화되도록 전체 항체를 사방정계형 상자에서 용매화했다. 세 방향 모두에서 주기적 경계 조건을 사용했다. 사방정계형 상자의 각 방향에서 8Å 물 용매화 외피를 사용했다. 얻어진 전체 시스템 크기는 202,130개 원자였다. 세 축 모두에서 상자 치수에 어떤 유의한 변화 없이 사방정계형 상자가 30 ns 시뮬레이션 동안 안정하게 유지되었음이 관찰되었다. 초기 상자 치수는 각각 161.9Å, 145.4Å 및 83.2Å였다. 이들은 30 ns 시뮬레이션 동안 아주 약간 변하였으며, 최종적으로 각각 161.2Å, 144.7Å 및 82.8Å이 되었다. 항체는 30 ns 시뮬레이션 동안 유의하게 회전하지 않았으며, 이로써 항체와 그것의 주기적 이미지 사이의 최소 거리인 14Å이 유지되었다. 시스템의 총 전하를 중성으로 만들기 위해 충분한 이온을 첨가했다. 전하 중성도는 Ewald 합계 기술에서 필요했으며, 이것을 정전기적 상호작용으로 인한 기여도를 계산하는데 사용하였다.
항체가 용매화된 후, 단백질을 고정시켜 SD(최대 경사법)에 따라 초기 에너지를 최소화하여 물이 단백질 주위를 느슨하게 둘러싸도록 했다. 다음에, 구속력을 제거하고, SD와 ABNR(변형 기본 뉴턴-랩슨법)에 따라 구조를 더 최소화했다. 다음에, 1 fs 시간 단계를 사용하여 0.5 ps마다 5℃씩 증가시켜 시스템을 실온까지 서서히 가열했다. 다음에, 시뮬레이션으로부터 여러 특성들에 대한 컴퓨터 작업을 시작하기 전에 시스템을 1 ns 동안 평형화했다. 추가의 통계 분석을 위해 시뮬레이션하는 동안 구조를 0.1 ps마다 저장했다.
IgG1 항체의 결합 영역을 예측하기 위한 SAP 도구
SAP 도구를 분자 시뮬레이션으로부터 얻어진 단백질 구조에 적용했다. 고 처리량 적용에서 신속한 예측을 위하여, SAP 도구는 또한 단백질 X-선 구조 또는 상동성 유래 구조에도 적용될 수 있지만, 정확성이 손실될 수 있다는 문제가 있다. 단백질 내 각 원자에 대한 SAP 값을 다음과 같이 정의하였다:
Figure pct00005
여기서,
1) 반경 R 이내에 있는 측쇄 원자의 SAA가 각 시뮬레이션 스냅샷에서 컴퓨터 계산된다.
2) 완전히 노출된 잔기(아미노산 'X'라고 하자)의 측쇄의 SAA가 트리펩티드 'Ala-X-Ala'의 완전히 확장된 입체구조에서 중앙에 있는 잔기의 측쇄의 SAA를 계산함으로써 얻어진다.
3) 잔기 소수성은 Black 및 Mould의 소수성 등급으로부터 얻어진다(S. D. Black and D. R. Mould, Anal. Biochem. 193, 72 (1991)). 이 등급은 글리신이 0의 소수성을 가지도록 정규화된다. 따라서, 소수성 등급에서 글리신보다 더 소수성인 아미노산들은 양의 값을 가지고, 글리신보다 덜 소수성인 잔기들은 음의 값을 가진다.
SAP는 단백질 표면 상의 주어진 원자에 중심을 둔 어떤 패치의 동태적으로 노출된 소수성을 제공한다. SAP는 단백질 내의 모든 원자에 중심을 둔 반경 R을 가진 구체 영역들에 대해 계산된다. 이것은 각 원자마다 특유한 SAP 값을 제공한다. 다음에, 잔기의 모든 구성 원자의 SAP를 평균 냄으로써 잔기의 SAP가 얻어진다. 따라서, SAP 값을 IgG1 항체에 대해 R = 10Å을 사용하여 평가하였고, 이 값들을 색채 등급을 사용하여 항체 표면 위에 지도화하여 -0.5 ~ +0.5 범위 내에서 SAP 값을 나타냈다. 이들 SAP 값은 30 ns 전체 항체 원자적 시뮬레이션을 평균 냄으로써 계산되었다. 각 잔기에서 SAP 값은, 단일 잔기에 대한 소수성만을 제공하는 것이 아니라, 잔기에 중심을 둔 패치의 전체 노출된 소수성을 제공한다는 것이 주목된다. 또한, 비교를 위해 소수성 등급(S. D. Black and D. R. Mould, Anal. Biochem. 193, 72 (1991))을 표면 위에 직접 지도화했다. 소수성 지도를 볼 때, 소수성 영역들은 표면 전체에 무작위로 분포된 것처럼 보였으며, 다른 것과 비교하여 더 우세한 어떤 소수성 영역을 선별하는 것은 어려웠다. 그러나, 동일한 구조의 SAP 지도를 시험했을 때는, 동태적으로 노출된 소수성 영역을 나타내는 고 SAP 영역을 쉽게 집어낼 수 있었다. 이들 패치는 소수성 성질 때문에 물에 노출되는 것이 열역학적으로 불리하다. 따라서, 이들은 용매 노출을 줄이기 위해서 단백질 결합에 포함될 수 있었다. 이들 고 SAP 영역은 '1' 내지 '6'으로서 확인되었다. 패치 '1' 및 '6'은 Fab 단편에 위치했고, 패치 '2'에서 '5'는 Fc 단편에 위치했다. 패치 '1' 내지 '3'은 개방 노출되었으며, 따라서 다른 단백질과 쉽게 상호작용할 수 있었다. 한편, 패치 '4' 내지 '6'은 용매가 접근할 수는 있었지만, 단백질 내부로 마주하고 있어서 이들이 언폴딩으로 인해 더 개방 노출되지 않는 이상은 다른 단백질과 상호작용하는 것이 어려웠다.
다음에, 노출된 소수성 패치를 나타내는 고 SAP 영역과 단백질 결합 영역의 상관성을 시험했다. 항체의 Fc 수용체, 단백질-A 및 단백질-G와의 결합 영역을 SAP 값 위에 지도화했다. 단백질 결합 부위는 단백질 복합체인 PDB 엔트리, 즉 1T89, 1FC2, 및 1FCC의 X-선 구조로부터 얻었다(S. Radaev, et al., J. Biol. Chem, 276 (19) 16469 (2001); Deisenhofer, J., et al. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359, 975-985 (1978); Deisenhofer, J, Biochemistry 20, 2361-2370 (1981); Sauer-Eriksson A. E. et al, Structure, 3, 265 (1995)). SAP를 통해 확인된 소수성 패치와 단백질 결합 영역 간에 강한 상관성이 발견되었다. 항원은 SAP 패치 '1'을 표시된 CDR 루프 영역과 결합되었고, Fc 수용체는 SAP 패치 '2'와 결합되며, 단백질-A 및 단백질-G는 SAP 패치 '3'과 결합된다. 또한, DeLano 등(DeLano W. L., et al., Science 287, 1279 (2000))은 단백질-A와 단백질-G가 결합된 영역(SAP 패치 '3')이 친화성으로 시험관내 선택된 무작위 펩티드와의 결합에서 우세한 컨센서스 결합 영역이라는 것을 밝혔냈다. 패치 '3'은 또한 류마티스 인자 및 신생아 Fc-수용체와도 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서, SAP를 통해 표시된 패치 '3'의 소수성 접근성은 그것을 다수의 단백질과의 결합에 유리한 영역으로 만든다. 매우 주목할 점은 개방 노출된 3개 패치(SAP 패치 '1' 내지 '3')가 모두 결합에 포함되었다는 것이다. 패치의 중심은 소수성 상호작용에 연루되고, 가장자리는 극성 상호작용에 연루된다.
R = 10Å에서 SAP를 분석하여 다른 단백질과의 결합에 연루되는 광범한 소수성 패치들을 찾아냈다. 이들 패치는 해상도가 더 높은 SAP, 즉 SAP 계산에서 사용된 반경 R을 더 적게 한 SAP를 사용하여 더 상세히 조사될 수 있다. 따라서, SAP 값을 항체에 대해 R = 5Å에서 계산했다. 이들 SAP 값을 항체 표면 위에 지도화했다. 여기서, 양의 SAP 값은 동태적으로 노출된 소수성 패치를 나타내고, 음의 SAP 값은 동태적으로 노출된 친수성 패치를 나타낸다. Fc-수용체, 단백질-A 및 단백질-G와 결합하는 영역들도 확인되었다. R = 10Å SAP에서 얻은 결과와 유사하게, R = 5Å SAP도 단백질 결합 영역과 SAP 값들의 피크 간에 강한 상관성을 나타냈다. 소수성 결합 영역은 양의 피크와 잘 상관되었고, 친수성(극성) 결합 영역은 음의 피크와 잘 상관되었다. 낮은 SAP(즉, 양의 값이든 음의 값이든 0에 가까운)를 가진 잔기도 상호작용했던 몇몇 예외에서는, 측쇄와 상호작용하는 대신에 실제로는 상호작용이 주 백본 사슬 자체의 원자와 이루어졌다는 것이 관찰되었다.
SAP 는 결합 영역과 응집 경향 영역을 모두 예측한다
SAP의 피크들은 또한 단백질 자체-응집 경향이 있는 영역들에 상응한다는 것이 증명되었다(Chennamsetty, N., et al. Design of therapeutic antibodies with enhanced stability(제출됨)). 응집은 치료 단백질의 주된 변성 경로로서, 활성 및 잠재적 면역원성의 손실을 초래한다. SAP피크 상에서 유전조작된 돌연변이는 응집 경향이 줄어든 안정한 항체를 만들었다(Chennamsetty, N., et al. Design of therapeutic antibodies with enhanced stability(제출됨)). SAP 피크에서 소수성 잔기를 친수성 잔기로 변경시킴으로써 생성된 8개 돌연변이체는 A1(L235K), A2(I253K), A3(L309K), A4(L235K L309K), A5(L234K L235K), A6(L235S), A7(V282K), 및 A8(L235K V282K L309K)이었다. 다음에, 이 돌연변이체들을 150mg/ml에서 열 스트레스 하에 가속 응집 실험을 사용하여 응집 거동에 대해 시험했다. SEC-HPLC(크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피) 결과는 모노머가 야생형 91%에서 변이체 92-97%로 증가한 것을 나타냈으며, 이것은 돌연변이체의 응집 경향이 줄어든 것을 시사한다. 따라서, 고 SAP를 가진 부위는 또한 응집 경향이 높은 영역을 나타낸다.
이와 같이, SAP 도구는 단백질 결합 영역과 응집 경향 영역을 모두 예측했다. 가능한 설명은 단백질 응집 역시, 동일한 종류의 단백질 내에서 일어나는 것은 아니지만, 단백질-단백질 결합의 한 형태라는 것이다. 또한, 응집 경향 영역과 단백질 결합 영역의 일부가 중첩되는 것으로 나타났다. 이 중첩은 단백질 결합과 응집에 모두 연루된 L235와 I253 잔기로부터 증명되었다. 유사한 SAP 분석 및 단백질 유전조작을 응집 경향 영역과 단백질 결합 영역이 중첩된 것으로 나타난 또 다른 IgG1 항체에 대해 수행했다(Chennamsetty, N., et al. Design of therapeutic antibodies with enhanced stability(제출됨)). 이 경우, 돌연변이는 항체가 항원과 결합하는 CDR 영역에서 수행했다. 결과의 CDR 영역 내 돌연변이체는 더 적은 응집 경향을 나타냈지만, 항원과 결합하지 않거나 활성을 잃을 수 있었다. 이와 같이, 단백질 결합 영역과 응집 경향 영역에는 공통된 특징들이 있다. 이것은 단백질 결합 영역과 응집 경향 영역이 중첩되는 서열들에서 이루어진 다른 컴퓨터 상의 예측과 일치한다(Wang, X. et al., mAbs, 1, 1-14 (2009)). 이와 같이, SAP를 통해 확인된 동태적으로 노출된 소수성 패치들은 단백질 결합과 단백질 자체-응집에 모두 연루된다.
그러나, 단백질 결합 부위와 응집 경향 부위 간 중첩은 치료 단백질 디자인에 있어서 새로운 도전과제를 제시하는데, 그것은 단백질의 기능에 필요한 단백질 결합을 보존하면서 동시에 응집은 방지해야 한다는 것이다. 이 과제를 해결하기 위해서, 더 높은 해상도의 SAP 분석(R = 5Å)을 사용하여 단백질 결합을 교란시키지 않고 결합 영역 주위에 응집 경향 부위들을 배치하고 변형시킬 수 있다. 예를 들어, IgG1 항체에 대한 SAP 분석을 사용하여, 부위 I253, L309 및 V282가 응집에 연루된 브로드 패치(SAP 영역 '3')의 모든 부분이라고 판단되었다(Chennamsetty, N., et al. Design of therapeutic antibodies with enhanced stability(제출됨)). 단백질-A와의 결합에 포함되었던 부위 I253은 그대로 두고 부위 L309과 V282를 포함하는 돌연변이체들{A3(L309K), A4(L235K L309K), A7(V282K), 및 A8(L235K V282K L309K)}을 디자인했다. 결과의 돌연변이체들은 여전히 단백질-A와 결합하면서 더 적은 응집 경향을 나타냈다. 이와 같이, SAP 기술은 단백질 결합 활성을 보존하면서 더 적은 응집 경향을 갖는 단백질을 디자인하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
SAP 는 EGFR 의 결합 영역을 예측한다
항체에 더하여, 표피 성장인자 수용체(EGFR)라고 부르는 또 다른 단백질에 대해서 SAP 분석을 수행하여 그것의 결합 영역을 예측했다. EGFR은 표피 성장인자(EGF)와 형질전환 성장인자 β(TGFβ)를 포함하는 특이적 리간드의 결합에 의해 활성화되는 세포 표면 수용체이다. EGFR 과발현 또는 과활성은 폐암 및 뇌암과 같은 많은 암들과 관련되었다. 또한, EGFR은 스스로와 결합하여 다이머를 형성한다. EGFR에 대해 SAP 분석을 수행하여 예측된 결합 영역들이 EGF, TGFα 결합 영역과, 그리고 다이머 형태의 또 다른 EGFR과 일치하는지를 알아 보았다.
R = 10Å에서 EGFR에 대해 평가된 SAP 값들을 EGFR 표면 위에 지도화했다. 이들 SAP 값은 PDB 엔트리 1IVO로부터 얻은 EGFR의 X-선 구조를 직접 분석하여 계산되었다(Ogiso, H.et al., Cell, 110: 775-787 (2002)). 비교를 위해 소수성 등급(S. D. Black and D. R. Mould, Anal. Biochem. 193, 72 (1991))도 EGFR 표면 위에 지도화했다. 앞서 항체의 경우에 보았던 대로, EGFR의 소수성 잔기들도 표면 전체에 분포되어 있었고, 결합에 잠재적으로 포함되는 것들을 분리하는 것이 어려웠다. 그러나, 공간적으로 노출된 소수성 영역을 나타내는 고 SAP 영역들을 집어 내는 것은 비교적 용이했다. 2개의 이러한 주요 패치가 확인되었으며, '1' 및 '2'로 표시했다.
EGF, TGFα 및 다이머 형태의 다른 EGFR과 함께 EGFR의 기지의 결합 영역을 SAP 값 위에 지도화했다. 이들 단백질 결합 부위는 단백질 복합체인 PDB 엔트리 1IVO 및 1MOX의 X-선 구조로부터 얻었다(Ogiso, H., et al. Cell, 110: 775-787 (2002); Garrett, T.P.J., et al. Cell, 110: 763-773 (2002)). 지도화는 SAP를 통해 확인된 소수성 패치와 단백질 결합 영역 간의 강한 상관성을 나타냈다. EGFR은 SAP 패치 '1' 및 다른 더 작은 패치에서 EGF 및 TGFα와 결합한다. 또한, 그것은 SAP 패치 '2'에서 다른 EGFR과도 결합한다. 따라서, 2개의 주요 SAP 패치가 결합에 모두 포함된다. 항체의 경우와 마찬가지로, 패치의 중심은 소수성 상호작용에 연루되고, 가장자리는 극성 상호작용에 연루된다. 이와 같이, SAP는 EGFR의 결합 영역을 정확하게 예측했다.
결론
단백질 결합 영역을 예측하는데 사용될 수 있는 소수성 패치의 동태적 노출의 척도를 제공하는 SAP라고 부르는 컴퓨터 상의 도구가 설명되었다. 2개의 단백질 모델, 즉 IgG1 항체와 EGFR을 사용하여, SAP가 단백질 결합 영역을 정확히 예측한다는 것을 알아냈다. IgG1 항체의 경우, Fc 수용체, 단백질-A 및 단백질-G와의 결합 영역이 SAP 피크와 잘 상관되었다. EGFR의 경우, EGF, TGFα 및 다른 EGFR과의 결합 영역이 SAP 피크와 잘 상관되었다. 이와 같이, SAP는 결합 영역을 예측하는데 있어서 정확한 것으로 나타났으며, 단백질-단백질 결합에서 노출된 소수성 패치의 중요성이 증명되었다. 동일한 SAP 분석이 다른 단백질들에 대해서도 수행될 수 있으며, 이들의 결합 영역을 예측할 수 있다. 또한, 단백질 결합 영역의 일부는 응집 경향 영역과 중첩되는 것으로 나타났다. 이것은 단백질 기능에 필요한 단백질 결합은 보존하면서 동시에 바람직하지 않은 응집이 방지되어야 한다는 점에서 치료 단백질 디자인에 있어서 도전과제를 제시한다. 이 과제는 SAP 분석을 사용하고, 그에 따라 단백질을 유전조작함으로써 극복될 수 있는 것으로 나타났다. SAP를 사용하여, 응집에 연루되는 결합 부위 근처의 부위들이 결합은 보존하면서 응집 경향은 감소되도록 결실되고 변형될 수 있다. 이것은 단백질-A 결합 부위 근처의 응집 경향 영역들이 결합 능력은 보존하면서 응집은 감소되도록 변형된 IgG1 항체를 사용하여 증명되었다. SAP에 기초한 유사한 단백질 유전조작을 항원 결합 영역들 근처에서도 수행하여 활성은 보존하면서 응집 경향은 감소시킬 수 있었다. 이와 같이, 본원에 설명된 SAP 도구는 결합 부위는 보존하면서 동시에 안정한 치료 단백질을 디자인하는데 사용될 수 있었다. 또한, SAP 도구는 선도적인 구조 유전학에서 벗어나 있는 많은 단백질에 대해 아직 불명인 결합 부위들을 결정하는데도 사용될 수 있으며, 이로써 이들의 기능에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있다.
등가물
당업자는 통상의 실험을 사용하여 본원에 설명된 발명의 특정 구체예들의 많은 등가물을 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물들도 다음 청구범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG Massachusetts Institute of Technology CHENNAMSETTY, NARESH HELK, BERNHARD TROUT, BERNHARDT L. <120> METHODS TO IDENTIFY MACROMOLECULE BINDING AND AGGREGATION PRONE REGIONS IN PROTEINS AND USES THEREFOR <130> 61967-2000340 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 61/074,466 <151> 2008-06-20 <160> 3 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Gly Asn Asn Gln Gln Asn Tyr 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Ala 1 5 10

Claims (89)

  1. 단백질 내 특정 원자의 공간-응집-경향(SAP)을 계산하기 위한 방법으로서,
    (a) 단백질을 나타내는 구조 모델에서 하나 이상의 원자를 확인하는 단계, 이때 하나 이상의 원자는 특정 원자에 또는 특정 원자 근처에 중심을 둔 한정된 공간 영역 내에 있고;
    (b) 한정된 공간 영역 내의 하나 이상의 원자에 대해, 이 원자들의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 동일한 잔기에서 완전히 노출되는 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계;
    (c) 각 비에 하나 이상의 원자의 원자 소수성을 곱하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)의 곱들을 합계 내는 단계
    를 포함하며, 여기서 합계가 특정 원자의 SAP인 방법.
  2. 단백질 내 특정 원자의 공간-응집-경향(SAP)을 계산하기 위한 방법으로서,
    (a) 단백질을 나타내는 구조 모델에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 이때 하나 이상의 아미노산 잔기는 특정 원자에 또는 특정 원자 근처에 중심을 둔 한정된 공간 영역 내에 적어도 하나의 원자를 가지고;
    (b) 한정된 공간 영역 내의 하나 이상의 원자들에 대해, 이 원자들의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 동일한 잔기에서 완전히 노출되는 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계;
    (c) 각 비에 아미노산 소수성 등급에 의해 결정된 하나 이상의 아미노산 잔기의 소수성을 곱하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)의 곱들을 합계 내는 단계를 포함하며, 여기서 합계가 특정 원자의 SAP인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 단계 (a)의 하나 이상의 원자는 하나 이상의 아미노산의 측쇄에 있는 원자인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 단계 (a)의 하나 이상의 원자는 하나 이상의 아미노산의 주쇄 원자인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 한정된 공간 영역은 구체, 입방체, 원통형, 피라미드, 및 타원형 회전타원체를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 한정된 공간 영역은 1-30Å의 반경을 가진 구체와 동등한 체적을 갖는 영역인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 한정된 공간 영역은 1-30Å의 반경을 가진 구체인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 한정된 공간 영역의 중심이 특정 원자에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 한정된 공간 영역의 중심이 화학 결합에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 한정된 공간 영역의 중심이 특정 원자로부터 30Å 이내에 있는 공간 내의 어떤 지점에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 한정된 공간 영역의 중심이 특정 원자로부터 20Å 이내에 있는 공간 내의 어떤 지점에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 한정된 공간 영역의 중심이 특정 원자로부터 10Å 이내에 있는 공간 내의 어떤 지점에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 한정된 공간 영역의 중심이 특정 원자로부터 5Å 이내에 있는 공간 내의 어떤 지점에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 한정된 공간 영역의 중심이 특정 원자로부터 2Å 이내에 있는 공간 내의 어떤 지점에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 한정된 공간 영역의 중심이 특정 원자로부터 1Å 이내에 있는 공간 내의 어떤 지점에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SAA는 아미노산 측쇄에 있는 원자들에 대해서만 계산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SAA는 주쇄 원자들에 대해서만 계산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SAA는 부착된 수소 원자들을 제외한 주쇄 원자들에 대해서만 계산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 구조 모델은 단계 (a) 전에, 선택적으로 용매를 포함하는 분자 역학 시뮬레이션을 수행함으로써 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 용매는 물인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 분자 역학 시뮬레이션은 ABINIT, AMBER, Ascalaph, CASTEP, CPMD, CHARMM, DL_POLY, FIREBALL, GROMACS, GROMOS, LAMMPS, MDynaMix, MOLDY, MOSCITO, NAMD, Newton-X, ProtoMol, PWscf, SIESTA, VASP, TINKER, YASARA, ORAC, 및 XMD를 포함하는 군으로부터 선택된 시뮬레이션 패키지를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 분자 역학 시뮬레이션은 CHARMM 시뮬레이션 패키지를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 분자 역학 시뮬레이션은 NAMD 시뮬레이션 패키지를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 특정 원자의 SAP는 단계 (a) 전에 분자 역학 시뮬레이션을 수행하고, 복수의 시간 단계에서 추가의 분자 역학 시뮬레이션이 수행될 때마다 단계 (a)-(d)를 반복하며, 이로써 단계 (d)에서와 같은 합계를 다수 얻고, 이 합계들의 평균을 계산함으로써 계산되며, 여기서 계산된 평균이 특정 원자의 SAP인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 분자 역학 시뮬레이션은 ABINIT, AMBER, Ascalaph, CASTEP, CPMD, CHARMM, DL_POLY, FIREBALL, GROMACS, GROMOS, LAMMPS, MDynaMix, MOLDY, MOSCITO, NAMD, Newton-X, ProtoMol, PWscf, SIESTA, VASP, TINKER, YASARA, ORAC, 및 XMD를 포함하는 군으로부터 선택된 시뮬레이션 패키지를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 분자 역학 시뮬레이션은 CHARMM 시뮬레이션 패키지를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 분자 역학 시뮬레이션은 NAMD 시뮬레이션 패키지를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 1-5개 아미노산에 대한 SAP 점수를 합계 내는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 아미노산들은 단백질 서열을 따라 순서대로 인접해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 아미노산들은 단백질 구조 모델에서 공간적으로 인접해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 구조 모델은 단백질, 또는 그 일부분의 X-선 결정 구조 모델인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 구조 모델은 단백질, 또는 그 일부분의 이론적 단백질 구조 모델인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 구조 모델은 단백질, 또는 그 일부분의 상동성 모델인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 구조 모델은 단백질, 또는 그 일부분의 순이론적 단백질 구조 모델인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 반경은 1Å 내지 30Å인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 반경은 5Å인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35 항에 있어서, 반경은 10Å인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 단백질 상의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 방법으로서
    (a) 단백질 내의 원자들에 대해 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 따라서 계산된 SAP를 단백질의 구조 모델 위에 지도화하는 단계; 및
    (b) 복수의 원자가 SAP > 0을 갖는 단백질 내의 영역을 확인하는 단계
    를 포함하며, 여기서 응집 경향 영역은 상기 복수의 원자를 포함하는 아미노산을 포함하는 방법.
  39. 단백질 상의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 방법으로서, 선택된 역치를 초과하는 SAP를 갖는 하나 이상의 원자를 함유하는 하나 이상의 아미노산을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 SAP는 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 따라서 계산되고, 응집 경향 영역은 확인된 아미노산을 포함하는 방법.
  40. 단백질 상의 응집 경향 영역을 확인하기 위한 방법으로서, 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 따라서 계산된 SAP 값들의 플롯을 작성하는 단계, 플롯의 피크들에 대해서 곡선하면적(AUC)을 계산하는 단계, 및 양의 AUC를 가진 하나 이상의 단백질 영역을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 응집 경향 영역은 확인된 단백질 영역을 포함하는 방법.
  41. 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체를 제조하는 방법으로서, 단백질에서 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하거나 결실시키는 단계를 포함하며, 여기서 응집 경향 영역은 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 이때 만일 아미노산 잔기가 치환된다면, 그것은 더 친수성인 아미노산 잔기로 치환되며, 이로써 변이체의 응집 경향이 감소되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 적어도 하나의 잔기는 치환되고, 적어도 하나의 잔기는 결실되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체의 제조 방법으로서,
    (a) 단백질에서 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 잔기를 각 변이체에서 치환함으로써 복수의 단백질 변이체를 생성하는 단계, 여기서 응집 경향 영역은 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 하나 또는 상이한 잔기, 또는 잔기들의 상이한 조합이 각 변이체에서 치환되며, 적어도 하나의 잔기는 더 친수성인 잔기로 치환되고; 및
    (b) 감소된 응집 경향을 나타내는 (a)에서와 같이 제조된 단백질 변이체를 선택하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 응집 경향 영역에서 가장 소수성인 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp, Val, Met, Pro, Cys, Ala, 또는 Gly인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, Asp, 및 Arg로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 희귀, 비천연, 또는 변형 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 Black 및 Mould 소수성 등급에 따라서 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 2개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 3개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 잔기는 단백질 내의 하나보다 많은 응집 경향 영역 내에서 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 응집 경향 영역은 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 항체, Fab 단편, Fab' 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, 및 Fc 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 사이토카인, 케모카인, 리포카인, 미오카인, 신경전달물질, 뉴로트로핀, 인터류킨, 또는 인터페론인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 호르몬 또는 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 수용체 또는 수용체 도메인인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 신경전달물질 또는 뉴로트로핀인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 펩티도미메틱, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 또는 희귀 아미노산을 포함하는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 단백질 내 아미노산 잔기의 유효-SAA를 계산하기 위한 방법으로서,
    (a) 아미노산에 대해, 아미노산에 있는 원자들의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 동일한 잔기에서 완전히 노출되는 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계;
    (b) 아미노산 소수성 등급에 의해 결정된 상기 아미노산의 소수성을 비에 곱하는 단계
    를 포함하며, 여기서 곱이 아미노산의 유효-SAA인 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 단백질 서열에서 인접한 적어도 2개 아미노산에 대한 유효-SAA를 합계 내는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 59 항에 있어서, 단백질 서열에서 인접한 3개 아미노산에 대한 유효-SAA를 합계 내는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 59 항에 있어서, 단백질 서열에서 인접한 4개 아미노산에 대한 유효-SAA를 합계 내는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 59 항에 있어서, 단백질 서열에서 인접한 5개 아미노산에 대한 유효-SAA를 합계 내는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 41 항 또는 제 43 항의 방법에 따라서 얻어진 단백질 변이체를 제약학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트 및/또는 부형제와 함께 조제하는 단계를 포함하는, 감소된 응집 경향을 나타내는 단백질 변이체를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법.
  65. 단백질 상의 거대분자 결합 영역을 확인하기 위한 방법으로서,
    (a) 단백질 내의 원자들에 대해 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 따라서 계산된 SAP를 단백질의 구조 모델 위에 지도화하는 단계; 및
    (b) 복수의 원자가 SAP > 0을 갖는 단백질 내의 영역을 확인하는 단계
    를 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 상기 복수의 원자를 포함하는 아미노산을 포함하는 단계.
  66. 단백질 상의 거대분자 결합 영역을 확인하기 위한 방법으로서, 선택된 역치를 초과하는 SAP를 갖는 하나 이상의 원자를 함유하는 하나 이상의 아미노산을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 SAP는 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 따라서 계산되고, 거대분자 결합 영역은 확인된 아미노산을 포함하는 방법.
  67. 단백질 상의 거대분자 결합 영역을 확인하기 위한 방법으로서, 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에서 계산된 SAP 값들의 플롯을 작성하는 단계, 플롯의 피크들에 대해서 곡선하면적(AUC)을 계산하는 단계, 및 양의 AUC를 가진 하나 이상의 단백질 영역을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 확인된 단백질 영역을 포함하는 방법.
  68. 거대분자에 대해 감소된 결합 친화성을 나타내는 단백질 변이체를 제조하는 방법으로서, 단백질에서 거대분자에 대한 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하거나 결실시키는 단계를 포함하며, 여기서 거대분자 결합 영역은 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 이때 만일 아미노산 잔기가 치환된다면, 그것은 더 친수성인 아미노산 잔기로 치환되며, 이로써 변이체의 거대분자에 대한 결합 친화성이 감소되는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 적어도 하나의 잔기는 치환되고, 적어도 하나의 잔기는 결실되는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 거대분자에 대한 변경된 결합 친화성을 나타내는 단백질 변이체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 단백질에서 거대분자에 대한 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 하나의 잔기를 각 변이체에서 치환함으로써 복수의 단백질 변이체를 생성하는 단계, 여기서 거대분자 결합 영역은 제 1 항, 제 2 항, 및 제 24 항 중 어느 한 항에 따라서 계산된 SAP 점수를 사용하여 확인되고, 하나 또는 상이한 잔기, 또는 잔기들의 상이한 조합이 각 변이체에서 치환되고; 및
    (b) 거대분자에 대해 변경된 결합 친화성을 나타내는 (a)에서와 같이 제조된 단백질 변이체를 선택하는 단계
    를 포함하는 방법.
  71. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 거대분자 결합 영역에서 가장 소수성인 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 응집 경향 영역 내에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp, Val, Met, Pro, Cys, Ala, 또는 Gly인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, Asp, 및 Arg로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 68 항에 있어서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 희귀, 비천연, 또는 변형 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 68 항에 있어서, 더 친수성인 아미노산 잔기는 Black 및 Mould 소수성 등급에 따라서 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 2개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 거대분자 결합 영역 내에 있는 적어도 3개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 잔기는 단백질 내의 하나보다 많은 거대분자 결합 영역 내에서 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 거대분자 결합 영역은 제 65 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 68 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서, 거대분자는 다른 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 다당인 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 68 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 항체, Fab 단편, Fab' 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, 및 Fc 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 68 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 사이토카인, 케모카인, 리포카인, 미오카인, 신경전달물질, 뉴로트로핀, 인터류킨, 또는 인터페론인 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 68 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 호르몬 또는 성장인자인 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 83 항에 있어서, 거대분자는 호르몬 수용체 또는 성장인자 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 수용체 또는 수용체 도메인인 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 85 항에 있어서, 거대분자는 수용체 또는 수용체 도메인의 수용체 아고니스트 또는 수용체 길항제인 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 68 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 신경전달물질 또는 뉴로트로핀인 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제 87 항에 있어서, 거대분자는 신경전달물질 수용체 또는 뉴로트로핀 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제 68 항 또는 제 70 항의 방법에 따라서 얻어진 단백질 변이체를 제약학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트 및/또는 부형제와 함께 조제하는 단계를 포함하는, 결합 파트너와의 변경된 상호작용 경향을 나타내는 단백질 변이체를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법.
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