KR20230038490A - 물리 기반 시뮬레이션을 통한 폴리펩티드 내 펩티드 절단의 예측 - Google Patents

물리 기반 시뮬레이션을 통한 폴리펩티드 내 펩티드 절단의 예측 Download PDF

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카르티칸 라자고팔
니사나 마리 안데르센
사에드 이자디
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 개시는 폴리펩티드 분해에 관한 것으로서, 특히 주어진 폴리펩티드 분자에 대한 펩티드 결합이 절단 반응에 민감할 가능성을 예측하는 기술에 관한 것이다. 특히, 본 개시의 양태들은 폴리펩티드의 표현을 생성하는 단계, 상기 표현을 사용한 분자 역학 시뮬레이션을 실시하여 일련의 폴리펩티드 형태를 수득하는 단계, 각 폴리펩티드 형태에 대해 아미노산의 공간적 특성을 결정하는 단계, 상기 공간적 특성을 기반으로 각 폴리펩티드 형태의 친핵성 공격 거리를 추정하는 단계, 각각의 폴리펩티드 형태의 친핵성 공격 거리를 기반으로 절단 반응에 민감한 반응성 형태를 식별하는 단계, 상기 반응성 형태에서 아미노산의 공간적 특성의 자유 에너지를 결정하는 단계; 및 상기 자유 에너지를 기반으로 상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계에 관한 것이다.

Description

물리 기반 시뮬레이션을 통한 폴리펩티드 내 펩티드 절단의 예측
우선권 주장
본 출원은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 원용되는 2020년 06월 13일에 출원한 미합중국 가출원 제63/051,166호의 우선권의 이익을 주장한다.
본 개시는 폴리펩티드 분해에 관한 것으로서, 특히 주어진 폴리펩티드 분자에 대한 펩티드 결합이 절단 반응에 민감할 가능성을 예측하는 기술에 관한 것이다.
폴리펩티드 치료법은 성공적이었고 현재 신약 승인의 유의적 부분을 차지한다. 부분적으로, 이러한 성공은 중요한 질병 표적에 대한 단일클론 항체(mAb)와 같은 폴리펩티드에 대해 달성될 수 있는 높은 친화도 및 특이성에 기인할 수 있다. 또한, mAb는 단편 결정가능 영역(Fc 영역)(항체의 꼬리 영역)과 Fc 영역 재순환 수용체(FcRn)의 상호작용을 통해 긴 혈청 반감기를 가질 수 있으므로, 투약 빈도를 줄일 수 있다. 일부 질병 환경에서, 예를 들어, 긴 반감기가 바람직하지 않은 급성 치료 또는 FcRn 재순환이 활성화되지 않은 안구와 같은 조직 환경에서 항원 결합 단편(Fab)이 원형 mAb보다 선호될 수 있다.
치료제로서의 이러한 이점에도 불구하고, mAb 및 항체 단편은 폴리펩티드의 분해를 발생시키고 궁극적으로 이들의 유용성을 제한할 수 있는 화학적 및 물리적 불안정성에 민감할 수 있다. 물리적 불안정성은 용해성 응집, 침전 및 겔 형성으로 나타날 수 있다. 화학적 불안정성은, 일부 예를 들면, 탈아미드화(예컨대, 아스파라긴(Asn) 탈아미드화), 이성체화(예컨대, 아스파르트산(Asp) 이성질체화) 및 산화(예컨대, 트립토판(Trp) 및 메티오닌(Met) 잔기의 산화)으로 나타날 수 있다. 생물학적 제제의 맥락에서, 분해는 폴리펩티드 치료법의 이용가능성을 감소시키고, 그리고/또는 표적 생물학적 효과를 촉발할 가능성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, Asp 이성질체화는 폴리펩티드 치료법의 효능 상실을 발생시킬 수 있으며 Asp 이성질체화로부터의 이소아스파르테이트 형성은 알츠하이머병과 관련이 있다. 치료제 개발 과정 동안 초기에 주어진 폴리펩티드에 대한 분해 가능성을 검출할 수 있는 것이 유리할 것이다.
다양한 구현예들에서, 컴퓨터 구현 방법이 제공되며, 상기 컴퓨터 구현 방법은: 측쇄 및 주쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 폴리펩티드 형태에 대해, 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각을 결정하는 단계; 상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각을 기초로 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 2개의 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이의 친핵성 공격 거리를 결정하는 단계로서, 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 하나는 상기 아미노산의 측쇄에 있고 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 다른 하나는 상기 아미노산의 주쇄에 있는, 단계; 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 친핵성 공격 거리를 기초로 상기 폴리펩티드 형태가 절단 반응에 민감한 반응성 형태임을 결정하는 단계; 상기 폴리펩티드 형태가 상기 반응성 형태임을 결정하는 단계에 반응하여, 상기 반응성 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 결정하는 단계; 및 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 기초로 상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 컴퓨터 구현 방법은 상기 폴리펩티드의 표현을 생성하는 단계; 및 상기 표현을 사용한 분자 역학 시뮬레이션을 실시하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 분자 역학 시뮬레이션을 실시한 결과는 상기 폴리펩티드 형태를 포함한 폴리펩티드에 대한 일련의 폴리펩티드 형태를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 컴퓨터 구현 방법은 상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇히는 결과로서 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 컴퓨터 구현 방법은 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 출력하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 컴퓨터 구현 방법은 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초하여 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드의 목록으로부터 상기 폴리펩티드를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 컴퓨터 구현 방법은 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초하여 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드의 목록에서 상기 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드보다 낮게 순위를 매기는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 다른 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률이 상기 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률보다 적다.
일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계는: 만족 시, 상기 폴리펩티드의 아미드기가 주변 용매로부터의 용매 분자와 결합할 수 있는 임계값 초과의 공간적 접근성을 가짐을 나타내는 접근성 제약조건을 식별하는 단계; 및
상기 반응성 형태에 대하여, 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 공간적 특성을 평가하는 것에 기초하여 상기 접근성 제약조건이 충족됨을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드 형태가 상기 반응성 형태임을 결정하는 단계는: 만족 시, 상기 측쇄 내의 원자가 상기 주쇄 내의 다른 원자의 소정의 거리 임계값 내에 있음을 나타내는 거리 기준을 결정하는 단계; 및 상기 반응성 형태의 아미노산의 친핵성 공격 거리와 상기 소정의 거리 임계값 사이의 비교를 기준으로 상기 반응성 형태에 대해 상기 거리 기준이 충족됨을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 자유 에너지는 상기 반응성 형태 내에서 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지 프로파일의 분석을 기반으로 결정되고, 상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각의 공간에서 자유 에너지 프로파일은 빈(bin) 모집단으로부터 계산된다.
일부 구현예들에서, 상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계는: 만족 시, 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지가 소정의 에너지 임계값 내에 있음을 나타내는 에너지 기준을 결정하는 단계; 및 상기 반응성 형태 내에서 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지와 상기 소정의 에너지 임계값 사이의 비교를 기준으로 상기 에너지 기준이 상기 반응성 형태에 대해 만족함을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 하나 이상의 데이터 프로세서와, 하나 이상의 데이터 프로세서 상에서 실행될 때 하나 이상의 데이터 프로세서로 하여금 여기에 개시된 하나 이상의 방법의 일부 또는 전부를 수행하게 하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체를 포함하는 시스템이 제공된다.
일부 구현예들에서, 비일시적 기계-판독 가능 저장 매체에 유형으로 구현된, 그리고, 여기서 개시되는 하나 이상의 방법들의 전부 또는 일부를 하나 이상의 데이터 프로세서로 하여금 수행하게 하도록 구성된 명령어를 포함하는, 컴퓨터 프로그램 제품이 제공된다.
본 개시의 일부 구현예들은 하나 이상의 데이터 프로세서를 포함하는 시스템을 포함한다. 일부 구현예들에서, 시스템은 하나 이상의 데이터 프로세서 상에서 실행될 때 하나 이상의 데이터 프로세서로 하여금 여기서 개시된 하나 이상의 방법 중 일부 또는 전부 및/또는 하나 이상의 프로세서 중 일부 또는 전부를 수행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독형 저장 매체를 포함한다. 본 개시의 일부 구현예들은 하나 이상의 데이터 프로세서 상에서 실행될 때 하나 이상의 데이터 프로세서로 하여금 여기서 개시된 하나 이상의 방법 중 일부 또는 전부 및/또는 여기서 개시된 하나 이상의 프로세스의 일부 또는 전부를 수행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 기계 판독형 저장 매체로 유형으로 구현되는 컴퓨터-프로그램 프로덕트를 포함한다.
사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로 사용되며 제한이 없으며, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 도시 및 설명된 특징 또는 그 일부의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 수정이 가능하다는 것이 인정된다. 따라서, 청구된 바와 같은 본 발명이 실시예 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 여기에 개시된 개념의 수정 및 변형이 당업자에 의해 의지될 수 있고, 그러한 수정 및 변형이 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 이해해야 한다.
본 개시는 첨부된 도면과 함께 설명된다.
도 1은 다양한 구현예들에 따른 예시적인 절단 반응의 표현을 도시한다.
도 2a 및 도 2b는 2개의 이상화된 반응성 형태(A 및 B) 및 다양한 구현예들에 따른 주쇄 카르보닐 상의 아스파라긴(Asn) 측쇄 질소의 친핵성 공격을 위한 거리를 최소화하는 2면각을 도시한다.
도 3a-도 3f는 주쇄 2면각
Figure pct00001
을 따른 자유 에너지 프로파일 및 측쇄 2면각
Figure pct00002
및
Figure pct00003
에 따른 2차원 자유 에너지계(energy landscape)를 나타내며, 이는 다양한 구현예들에에 따라 1.5 us 분자 역학 궤적으로부터 계산된다.
도 4는 다양한 구현예들에 따라 분자 역학 시뮬레이션 및 분자 공간 특성의 평가를 기반으로 절단 반응의 확률을 생성하기 위한 공정을 도시한다.
도 5는 다양한 구현예들에 따라 분자 역학 시뮬레이션을 위한 시스템 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 예시적인 컴퓨팅 장치를 도시한다.
도 6a-도 6c는 다양한 구현예들에 따라 CDR-L3 서열(도 6a), N 말단 가수분해 생성물(도 6b), 및 C 말단 가수분해 생성물(도 6c)을 수반하는 천연 펩티드에 대한 추출 이온 크로마토그램을 도시한다.
도 7a-도 7d는 다양한 구현예들에 따라 98.0분에서 용출되는 N 말단 가수분해 생성물에 대한 MS1 스펙트럼(도 7a), 98.8분에서 용출되는 N 말단 가수분해 생성물에 대한 MS1 스펙트럼(도 7b), Asn N 말단 가수분해 생성물에 대한 이론적 MS1 스펙트럼(도 7c), 및 Asp N 말단 가수분해 생성물에 대한 이론적 MS1 스펙트럼(도 7c)을 도시한다.
도 8a 및 도 8b는 다양한 구현예들에 따라 Fab2에서 Asn-Pro 펩티드 결합 가수분해를 도시한다.
도 9는 다양한 구현예들에 따라 시험 항체에서 Asn-Pro 펩티드 가수분해의 속도를 도시한다.
첨부된 도면에서, 유사한 구성요소 및/또는 특징은 동일한 참조 라벨을 가질 수 있다. 추가로, 동일한 유형의 다양한 구성요소는 대시에 의한 참조 라벨에 따라 그리고 유사한 구성 요소를 구별하는 제2 라벨을 사용하여 구별할 수 있다. 명세서에서 제1 참조 라벨만 사용되는 경우, 설명은 제2 참조 라벨과 상관없이 동일한 제1 참조 라벨을 갖는 유사한 구성 요소들 중 어느 하나에 적용 가능하다.
I. 개요
본 개시는 주어진 폴리펩티드 분자에 대한 펩티드 결합(예컨대, 아스파라긴(Asn)과 프롤린(Pro)과 같은 벌크 잔기 사이의 펩티드 결합)이 절단 반응에 민감할 가능성을 예측하기 위한 기술을 기재한다. 주어진 폴리펩티드는 임의의 다수의 다중 형태를 가질 수 있으며, 그 중 일부는 반응성 형태이고 일부는 비반응성 형태이다. 폴리펩티드의 분해를 발생시킬 절단 반응은 다중 원자 사이의 반응(예컨대, 주쇄 카르보닐에 대한 측쇄 질소의 친핵성 공격 또는 측쇄의
Figure pct00004
-탄소에 대한 주쇄의 질소의 친핵성 공격)을 포함할 수 있다. 원자가 절단 반응에서 반응할 수 있도록 폴리펩티드가 반응성 형태를 취하는지의 여부는 원자의 물리적 근접성(예컨대, 친핵성 공격 거리(dN)), 폴리펩티드의 2면각에 대한 자유 에너지, 입체 부피로 인한 입체 장애, 및 pH 및 용매 접근성과 같은 환경 조건을 포함한 다수의 요인에 따라 달라질 수 있다.
I.A. 원자간 거리 반응 제약조건
분자의 두 원자 사이의 반응(예컨대, 두 원자 중 하나에 대한 친핵성 공격)이 발생하는지의 여부는 두 원자의 근접성에 따라 달라질 수 있다. 일부 경우들에서, 펩티드 형태의 공간적 특성은 절대적 또는 상대적 원자 위치 및/또는 두 원자 사이의 거리를 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 공간적 특성은 분자 내 두 원자가 서로 얼마나 가까운지(따라서, 반응이 발생할 수 있는지의 여부)에 영향을 미치거나 결정할 수 있는 다른 기하학 관련 정보, 예컨대, 다중 원자 사이의 각도 또는 반응에 관련된 일부 또는 모든 원자에 관한 2면각(예컨대, 민감한 가수분해 부위와 같은 민감한 부위에 인접한 아미노산의 다중 2면각)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 공간 특성은 하기의: (i) 주쇄의 4개 원자(
Figure pct00005
원자로 구성됨)에 의해 정의되는 단일 주쇄 2면각
Figure pct00006
, 및 (ii) 측쇄의 4개 원자(
Figure pct00007
원자로 구성됨)에 의해 정의되는 측쇄 2면각
Figure pct00008
및 측쇄의 4개 원자(
Figure pct00009
원자로 구성됨)에 의해 정의되는
Figure pct00010
를 포함할 수 있고, 이는 측쇄 질소 원자와 주쇄의
Figure pct00011
-탄소 사이의 거리를 추정하는 데 사용할 수 있다.
2면각은 공간의 한 축을 따른 하나의 2면각(예컨대, ψ), 공간의 다른 축을 따른 다른 2면각(예컨대,
Figure pct00012
), 및 공간의 다른 축을 따른 다른 2면각(예컨대,
Figure pct00013
)에 해당하는 공간을 정의함으로써 추정할 수 있다. 공간 내의 다중 영역은 공간적 특성에 기초하여 정의될 수 있으며, 각각의 영역은 수치적 확률, 범주적 확률(예컨대, 매우 낮음, 낮음, 중간, 높음) 또는 이진 확률을 포함할 수 있는 예측된 반응 확률과 연관된다. 예를 들어, 제1 영역은 폴리펩티드를 구성하는 2면각(예컨대, ψ,
Figure pct00014
및
Figure pct00015
)의 특정 범위에 해당함으로써, 친핵성 공격에 참여할 수 있는 두 원자 사이의 거리가 최소화되거나 임계값 미만일 수 있다(예컨대, 2 옹스트롬 또는 3 옹스트롬). 한편, 제2(예컨대, 나머지) 영역은 두 원자가 임계값을 초과하여 분리되고, 따라서 친핵성 공격에 참여할 가능성이 없도록 폴리펩티드를 구성할 2면각의 특정 범위에 해당할 수 있다.
I.B. 입체 장애 및 자유 에너지 제약조건
절단 반응의 확률은 분자 역학 모델 시뮬레이션에서 측쇄 형태를 결정함으로써 탐색할 수 있다. 폴리펩티드의 3차원 구조가 비반응성 형태의 측쇄를 제한하는 경우, 상기 측쇄가 반응성 형태에 접근하는 것은 에너지적으로 불리할 것이다. 따라서, 입체 장애의 존재는 상기 반응성 형태에 접근하기 위한 엄청나게 높은 자유 에너지 장벽을 발생시킬 수 있다. 측쇄 2면각에 따른 자유 에너지 분석은 반응성 형태를 향한 2면각 주위의 회전이 입체 장애에 의해 제한되고, 따라서 분해가 비활성화되는지 여부를 밝힐 수 있다. 인실리코(in silico) 접근 방식은 실험 데이터가 입수 불가능할 때 위험 평가에 특히 유용할 수 있다. 하지만, 반응성 형태를 식별하고 접근하는 능력이 절단 반응이 발생할 가능성이 있는지 여부를 결정하는 데 중요하지만, 상기 절단 반응이 발생할지 여부를 절대적으로 결정하는 것은 아니다. 즉, 측쇄는 반응성 형태에 접근할 수 있지만, 절단 반응이 에너지적으로 유리하지 않을 수 있기 때문에 반응하지 않는다.
따라서, 하나 이상의 영역(반응 확률에 해당함)은 입체 효과 및/또는 에너지 프로파일 범위를 통해 정의되어 에너지 장벽 특성(예컨대, 반응성 형태에 접근하기 위한 엄청나게 높은 자유 에너지 장벽을 발생시킬 수 있는 충분한 입체 장애의 존재)을 나타냄으로써, 앞서 언급한 구조적 형태와 결합하여 분해 반응을 예측할 수 있다. 입체 장애 및/또는 자유 에너지 제약조건을 나타내기 위해 영역이 개별적으로 정의될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드가 절단 반응을 겪을 가능성이 있는 반응성 형태로 전이할 가능성을 예측하는 분자 역학 시뮬레이션이 실시될 수 있다. 이러한 예측은 폴리펩티드를 특정 절단 반응에 민감하게 만드는 공간적 특성을 식별하고, 정의된 입체 장애 및/또는 자유 에너지를 갖는 분자 역학 시뮬레이션을 사용하여 폴리펩티드가 그러한 공간적 특성을 갖는 형태로 전이할 가능성을 예측하는 것을 포함할 수 있다.
I.C. 용매 접근성 반응 제약조건
원자간 거리 기준을 만족하고(예컨대, 주쇄 및 측쇄의 2면각 평가에 기초하여) 자유 에너지 기준을 만족하더라도(예컨대, 주쇄 및 측쇄의 2면각에 대한 자유 에너지 프로파일의 평가에 기초하여), 용매 없이는 화학적 분해가 일어나지 않는다. 따라서, 추가적인 화학적 분해 제약조건은 물 분자(또는 다른 용매)가 가수분해에 접근 가능할 것을 요구할 수 있다. 제약조건은 시뮬레이션 전체에서 물 분자의 양을 추적하여 구현할 수 있다. 따라서, 상기 시뮬레이션은 폴리펩티드의 개별 원자의 위치를 추적하는 것에 더하여 다중 용매 분자 각각의 위치(예컨대, 잠재적으로 다중 용매 분자 각각의 각 원자)를 추적할 수 있다. 각 시간 단계에서, 용매 분자가 폴리펩티드 상의 특정 부위(예컨대, 폴리펩티드 분자의 주쇄 아미드 부위)로부터 미리 정의된 거리 내에 있는지 여부를 결정할 수 있다. 일부 형태는 (예를 들어)폴리펩티드 내의 접힘의 결과로서 용매 분자가 특정 폴리펩티드 부위에 접근하는 것을 억제할 수 있다.
I.D. 환경 제약조건
mAb 및 항체 단편과 같은 치료제는 이의 유용성을 제한할 수 있는 화학적 및 물리적 불안정성에 취약할 수 있다. 상보성 결정 영역(CDR)의 잔류물이 불안정한 경우, 이러한 부위의 화학적 변화가 효능에 영향을 미칠 가능성이 더 높기 때문에 이는 상당히 우려할 만하다. 단백질 치료법을 사용하여 효과적인 질병 치료제를 개발하려면 치료제가 제제와 생리학적 조건 모두에서 유용할 만큼 충분한 안정성을 보여야 한다. 인 실리코 시험에서 발전이 이루어졌지만, 추가적인 개발을 위한 후보 분자의 적합성을 평가하기 위해 더 자주 열 응력 문제가 시험관 내에서 적용된다. mAb는 일반적으로 기본 등전점을 갖고, pH에 따라 탈아미드화 속도가 증가하기 때문에, 항체는 일반적으로 용해도를 높이고 분해를 늦추기 위해 약산성(pH 5-6) 조건하에서 안정성을 위해 제형화하고 시험한다.
이러한 접근법은 전형적인 제형화 조건하에서 보관 수명이 양호한 후보를 선택하는 데 유용할 수 있지만; 생리학적 이온 강도 및 pH(약 7.4) 조건하에서 안정성이 낮은 분자를 놓칠 수 있다. 따라서, 추가적인 화학적 분해 제약조건은 특정 pH 또는 pH 범위가 존재할 것을 요구할 수 있다. 제약조건은 시뮬레이션 전체에서 반응의 pH를 추적하여 구현할 수 있다. 따라서, 상기 시뮬레이션은 폴리펩티드의 개별 원자 위치를 추적하는 것 외에도 pH 조건을 추적할 수 있다. 각 시간 단계에서, pH가 사전 정의된 범위 내에 있는지 여부를 결정할 수 있다. 일부 형태(반응성 또는 기타)는 (예를 들어)반응이 발생하는 환경의 현재 pH의 결과로서 다소 우세할 수 있다. 형태에 영향을 미치는 다른 변수를 추론하기 위해 다른 유형의 환경 요인이 고려된다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 대안적으로 또는 추가적으로, 폴리펩티드가 절단 반응을 겪을 가능성이 있는 반응성 형태로 전이할 가능성을 예측하기 위해 pH 및 공간적 특성과 같은 다른 요인과 조합하여 온도 제약조건이 사용될 수 있다.
I.F. 시뮬레이션 및 제약 조건 사용
폴리펩티드의 예측된 분해를 검출함으로써, 상기 폴리펩티드는 유사한 치료 효과를 갖지만, 상기 분해에 불리한 조건 없이 다른 폴리펩티드에 유리하게 넘어갈 수 있거나, 폴리펩티드는 분해의 바람직하지 않은 효과를 완화시키기 위한 접근법과 결합될 수 있다. 주어진 분자가 분해될지 여부를 예측하는 한 가지 접근 방식은 시뮬레이션을 실행하는 것이다. 하지만, 화학적 분해은 아원자 상호작용, 공유 결합 형성 및 공유 결합 파손을 수반할 수 있다. 기존 분자 역학을 사용하여 이러한 유형의 사례를 시뮬레이션하는 것은 불가능하다. 일부 기술은 어떤 아미노산 모티프가 분자 내에 존재하는지를 기반으로 반응 확률을 예측하였다. 반응 확률은 모티프에 따라 크게 상이할 수 있지만, 모티프의 영향은 분자 내 위치에 따라 달라질 수 있다(예컨대, 상기 모티프가 중쇄 또는 경쇄 및 사슬 내 이의 위치 상에 있는지의 여부). 매우 안정적이라고 생각되는 모티프의 경우에도, 실험 데이터는 상대적인 일반 안정성에도 불구하고 모티프에서 반응이 일어나는 경우를 식별한다.
이러한 한계와 문제를 해결하기 위해, 본원에 기재된 기술은 분자 역학 시뮬레이션 기술과 분자 기하학 기술을 구현하여 반응 확률을 생성한다. 분자 역학 시뮬레이션을 한 번 이상 반복하면, 폴리펩티드의 형태가 시간에 따라 어떻게 변하는지 시뮬레이션할 수 있다. 반응 확률은 공간적 특성(예컨대, 다양한 반응 제약조건이 충족되는지 여부를 결정할 수 있음)을 기반으로 하나 이상의 형태에 대해 생성될 수 있다. 예를 들어, 분자 역학 시뮬레이션에 의해 생성된 각각의 형태에 대해, 상기 형태 내의 폴리펩티드의 공간적 특성은 원자간 거리 반응 제약조건 및 에너지 프로파일 제약조건이 충족되는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 이후에 상기 형태를 갖는 폴리펩티드가 절단 반응에 참여할 만큼 충분히 성숙될 것을 나타낼 수 있다. 용매 및 환경 포함 모델링은 용매 분자에 접근하여 반응하는 반응을 위해 유리하게 구성된 폴리펩티드 분자의 비율을 추정하는 데 사용할 수 있다. 이에 각각의 제약조건이 충족되는 시뮬레이션 생성 폴리펩티드 형태의 일부에 기초하여, 주어진 폴리펩티드가 관심 있는 특정 생성물로 화학적으로 분해되는지 여부, 정도 및/또는 속도를 나타내는 출력이 생성될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 시뮬레이션 기반 기술은 (예컨대, 폴리펩티드 내 아미노기의 동일성에 상응하는 형태 독립적 데이터보다는)분자 역학 및 폴리펩티드의 다양한 형태의 3차원 구조 분석에 기초하여 예측된 반응 감수성을 생성할 수 있다.
본 개시의 일 예시적인 구현예는 컴퓨터 구현 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: 측쇄 및 주쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 폴리펩티드 형태에 대해, 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각을 결정하는 단계; 상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각을 기초로 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 2개의 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이의 친핵성 공격 거리를 결정하는 단계로서, 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 하나는 상기 아미노산의 측쇄에 있고 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 다른 하나는 상기 아미노산의 주쇄에 있는, 단계; 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 친핵성 공격 거리를 기초로 상기 폴리펩티드 형태가 절단 반응에 민감한 반응성 형태임을 결정하는 단계; 상기 폴리펩티드 형태가 상기 반응성 형태임을 결정하는 단계에 반응하여, 상기 반응성 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 결정하는 단계; 및 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 기초로 상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계를 포함한다. 일부 경우들에서, 상기 방법은 상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇히는 결과로서 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시의 다른 예시적인 구현예는 컴퓨터 구현 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: 측쇄 및 주쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 표현을 생성하는 단계; 상기 표현을 사용한 분자 역학 시뮬레이션을 실시하는 단계로서, 상기 분자 역학 시뮬레이션을 실시한 결과는 상기 폴리펩티드에 대한 일련의 폴리펩티드 형태를 포함하는 단계; 상기 일련의 폴리펩티드 형태 중 각각의 폴리펩티드 형태에 대하여, 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 공간적 특성을 결정하는 단계로서, 상기 공간적 특성은 상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각을 포함하는, 단계; 상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각의 조합을 기반으로 각 폴리펩티드 형태의 아미노산의 두 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이의 친핵성 공격 거리를 추정하는 단계로서, 여기서 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 하나는 상기 아미노산의 측쇄에 있고 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 다른 하나는 상기 아미노산의 주쇄에 있는, 단계; 각각의 폴리펩티드 형태의 아미노산의 친핵성 공격 거리를 기초로 절단 반응에 민감한 적어도 하나의 반응성 형태를 식별하는 단계; 상기 적어도 하나의 반응성 형태에서 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 결정하는 단계; 및 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 기초로 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계를 포함한다. 일부 경우들에서, 상기 방법은 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇히는 결과로서 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계를 추가로 포함한다.
II. 정의
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하는데 사용되며 단백질, DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 상기 중합체는 치환된 아미노산(비천연 아미노산), 대체 당화, 단백질, DNA 복합체 및/또는 바이러스 표면 코트 단백질과 같은 임의의 단백질 양상을 포함하는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 중합체는 직쇄이거나 또는 분지쇄일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산이 끼어들 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대, 표지화 성분으로 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 상기 정의에는, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비자연적인 아미노산 등을 포함)뿐만 아니라 당해 분야에서 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "화학적 분해"는 이로 인해 분자(예컨대, 폴리펩티드 분자)가 2개 이상의 단편으로 분해되는 과정을 지칭하기 위해 사용된다. 중합체의 맥락에서, 화학적 분해는 상응하는 단량체로의 중합체의 완전한 해중합 또는 부분 해중합(예컨대, 하나 이상의 올리고머 및 잠재적으로 하나 이상의 다른 화학 물질에 대한)을 포함할 수 있다. 화학적 분해은 트립토판 산화, 메티오닌 산화, ASN-PRO 클리핑, 아스파라긴 탈아미드화 또는 아스파르트산 이성질체화와 같은 특정 유형의 화학 공정이 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "친핵성 치환 또는 공격"은 전자가 풍부한 친핵체가 원자 또는 원자단의 양전하 또는 부분적 양전하(예컨대, 작용기)와 선택적으로 결합하거나 공격하여 이탈기를 대체하는 기본적인 분류의 반응들이다. 양성 또는 부분적으로 양성인 원자를 친전자체라고 한다.
본원에서 사용되는 용어 "친핵성 공격 거리"는 전자가 풍부한 친핵체와 양전하 또는 부분적 양전하를 갖는 원자 또는 원자단(예컨대, 작용기) 사이의 평균(또는 평균 또는 중앙 또는 기타 유사한 메트릭) 거리(예컨대, 옹스트롬)이다.
본원에서 사용되는 용어 "다중 형태"는 주어진 폴리펩티드가 이의 일부는 반응성 형태이고 이의 일부는 비반응성 형태인 원자의 임의의 수의 공간적 배열을 가질 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "반응성 형태"는 아미노산 또는 폴리펩티드의 형태이며, 여기서 상기 아미노산 또는 폴리펩티드는 친핵성 치환 또는 공격을 받기 쉽거나 민감하다.
본원에서 사용되는 용어 "비반응성 형태"는 아미노산 또는 폴리펩티드의 형태이고, 여기서 상기 아미노산 또는 폴리펩티드는, 예컨대, 입체 장애로 인해 친핵성 치환 또는 공격을 받기 쉽거나 민감하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 동작이 어떤 것에 "기반"하는 경우, 이는 상기 동작이 적어도 부분적으로 상기 어떤 것의 적어도 일부에 기반한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로", "대략" 및 "약"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 대체로 명시된 것이지만 반드시 전부는 아닌 것으로 정의된다(및 명시된 모든 것을 포함함). 임의의 개시된 구현예에서, "실질적으로", "대략" 또는 "약"이라는 용어는 명시된 것의 "[백분율] 이내"로 대체될 수 있으며, 여기서 상기 백분율은 0.1, 1, 5 및 10 퍼센트를 포함한다.
III. 반응 발생의 예시적인 의존성
생리학적 조건하에서 아스파라긴(Asn) 잔기는 탈아미드화되기 쉽고, 여기서 아미드 측쇄는 가수분해되어 유리 카르복실산을 형성한다. 상기 반응의 속도 제한 단계는 5원 숙신이미드 고리 중간체의 형성이다. 하지만, 프롤린(Pro)과 같은 벌크(bulk) 잔기가 뒤따르는 Asn을 함유하는 펩티드는 두 잔기 사이의 펩티드 주쇄의 가수분해 절단에 민감한 것으로 나타났다. 적어도 하나의 mAb의 경쇄 CDR-L3의 상보성 결정 영역 3에서 확인된 Asn-Pro 부위에 대한 질량 스펙트럼 데이터는 상기 부위와 관련된 3개의 펩티드를 확인하였다: Asn-Pro 부위를 함유하는 천연 트립신 펩티드, Asn 및 이소-Asn을 함유하는 N 말단 가수분해 생성물 펩티드, 및 C 말단 가수분해 생성물 펩티드. Asp 및 이소-Asp가 아닌 Asn 및 이소-Asn을 함유하는 N 말단 가수분해 생성물의 확인은 석신이미드 중간체의 형성이 펩티드 결합 카르보닐에 대한 측쇄 아미드 질소의 공격의 결과임을 시사한다. 이후, 이러한 COOH 말단 숙신이미드 중간체는 개방되어 Asn 또는 이소 Asn을 함유하는 관찰된 N 말단 가수분해 생성물을 형성할 수 있다.
도 1은 화학적으로 분해된 생성물을 생성할 수 있는 이러한 예시적인 분해 반응을 도시한다. 더 구체적으로, 도 1은 주쇄를 갖는 측쇄를 포함하는 Asn 잔기의 표현을 도시한다. 측쇄 질소 원자와 주쇄의
Figure pct00016
-탄소가 충분히 근접하고 주쇄와 측쇄의 2면각의 자유 에너지 프로파일이 반응성 형태로의 전이에 유리한 경우, 폴리펩티드 분자는 펩티드 결합 카르보닐에 대한 측쇄 아미드 질소의 친핵성 공격에 민감하다. 준안정 COOH 말단 석신이미드(고리 이미드) 중간체는 친핵성 공격의 결과로서 생성될 수 있다. 이후, 상기 숙신이미드 중간체는 개방될 수 있고 용매가 숙신이미드 중간체에 접근 가능한 경우, 상기 숙신이미드는 아스파라긴과 이소-아스파라긴 결합의 혼합물로 가수분해된다. 아스파라긴 잔기와 관련하여, 폴리펩티드는 이의 표적 특성을 유지할 수 있다. 하지만, 이소-아스파라긴 잔기의 경우, 원래의 폴리펩티드에 비해 단백질의 형태 및 이의 정전기적 특성이 변할 수 있다. 시뮬레이션이 폴리펩티드가 바람직하지 않은 생성물로 화학적으로 분해될 확률을 신뢰성 있게 예측할 수 있다면, 이에 따라 바람직하지 않은 화학적 분해를 최소화하고 표적 기능성을 갖는 활성 폴리펩티드를 유지하기 위해 폴리펩티드 및/또는 제제가 선택될 수 있다.
IV 원자간 거리 및 에너지 프로파일 제약조건의 구현
본원에 기재된 바와 같이, Asn-Pro 가수분해에서의 분해 경로는 주쇄 카르보닐에 대한 Asn 측쇄 질소의 친핵성 공격을 통해 진행된다. 이러한 공정의 전제 조건은 Asn 측쇄 질소와 측쇄 카르보닐 사이의 친핵성 공격 거리(dN)를 줄이는 반응성 형태를 채택하는 Asn 측쇄에 대한 것이다. 거리
Figure pct00017
는 주로 주쇄 2면각
Figure pct00018
(
Figure pct00019
원자로 구성됨)과 측쇄 2면각
Figure pct00020
(
Figure pct00021
원자로 구성되고,
Figure pct00022
로 구성된 측쇄 2면각을 전형적으로 지칭하는 통상적인 chi1와 상이하다는 점에 유의함) 및
Figure pct00023
(
Figure pct00024
원자로 구성됨)의 조합을 특징으로 한다. 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이(도 2a는 단백질 구조 내의 ASN-PRO 펩티드를 도시하고; 도 2b는 단백질 구조 내 ASN-PRO 펩티드를 도시하며 프롤린 고리는 가시적임), Asn 잔기의 경우, 거리
Figure pct00025
는 2면각의 두 가지 특정 조합에서 최소화할 수 있다; 첫째, 주쇄 2면각은
Figure pct00026
>120으로 연장되고 측쇄 2면각은
Figure pct00027
및
Figure pct00028
이고(도 2a 및 도 2b의 형태 A); 둘째, 주쇄 2면각은
Figure pct00029
<-60 및
Figure pct00030
및
Figure pct00031
의 조밀한 각도일 때(도 2a 및 도 2b의 형태 B). 더 구체적으로, 주어진 원자가 다른 원자를 공격하거나 반응할지의 여부는 서로에 대한 근접성(친핵성 공격 거리(dN))에 따라 달라진다. 일부 경우들에서, 원자의 위치 및 서로에 대한 각도를 시뮬레이션 전체를 통해 추적할 수 있고, 따라서 거리
Figure pct00032
를 또한 추적할 수 있다. 다른 경우들에서, 2면각은 시뮬레이션 전체를 통해 추적할 수 있고, 이는 원자가 반응하기에 충분히 가까운지 여부를 추론하거나 추정하는 데 사용할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는 3개의 2면각인 ψ,
Figure pct00033
및
Figure pct00034
가 측쇄 질소 원자와 주쇄의
Figure pct00035
-탄소 사이의 거리
Figure pct00036
에 어떻게 영향을 미치는지 도시한다.
일부 경우들에서, 하나 이상의 측쇄를 갖는 폴리펩티드의 표현을 사용하여 분자 역학 시뮬레이션을 실시할 수 있다. 상기 분자 역학 시뮬레이션의 실시 결과는 일련의 폴리펩티드 형태를 포함할 수 있으며, 상기 일련의 폴리펩티드 형태의 각각의 폴리펩티드 형태는 상기 폴리펩티드 내 각 원자에 대하여 상기 원자의 위치를 식별할 수 있다. 상기 일련의 폴리펩티드 형태의 각각의 폴리펩티드 형태에 대하여, 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 폴리펩티드의 아미노산(예컨대, Asn)에 대하여 하나 이상의 공간적 특성이 결정된다. 상기 하나 이상의 공간적 특성은 다수의 원자간 거리, 다수의 각도, 및/또는 다수의 2면각을 포함할 수 있다. 특정 경우들에서, 상기 공간적 특성은 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 아미노산의 측쇄에 대한 2개의 2면각을 포함한다. 친핵성 공격 거리 dN은 공간적 특성에 기초하여 각 폴리펩티드 형태의 아미노산의 두 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이에서 계산 또는 추정할 수 있다(예컨대, 주쇄에 대한 2면각과 측쇄에 대한 2개의 2면각의 조합). 일단 각각의 폴리펩티드 형태의 아미노산의 친핵성 공격 거리가 계산되거나 추정되면, 친핵성 치환 또는 공격을 받기 쉽거나 민감한 적어도 하나의 반응성 형태가 폴리펩티드에 대해 확인될 수 있다.
적어도 하나의 반응성 형태를 확인하기 위해 2면각 및 친핵성 공격 거리 dN을 사용하기 위해, 공간 특성에 대한 값의 조합에 걸쳐 임계 친핵성 공격 거리에 상응하는 거리 기준이 결정될 수 있다(예컨대, 2면각 ψ,
Figure pct00037
및
Figure pct00038
). 예를 들어, 거리 기준을 만족하는지 여부를 판단하기 위해 소정의 거리 임계값(예컨대, 최소 친핵성 공격 거리)가 1.0
Figure pct00039
내지 4.0
Figure pct00040
(예컨대, 2.5
Figure pct00041
) 사이에서 정의될 수 있다. 상기 거리 기준은 공간적 특성(예컨대, 2면각 ψ, χ1 및 χ2)이 소정의 거리 임계값 이하인 친핵성 공격 거리 dN을 발생시킨 경우 충족될 수 있다. 상기 거리 기준이 만족되면, 소정의 거리 임계값을 만족하는 형태를 반응성 형태로서 식별한다. 상기 거리 기준은 공간적 특성(예컨대, 2면각 ψ,
Figure pct00042
및
Figure pct00043
)이 소정의 거리 임계값 초과인 친핵성 공격 거리 dN을 발생시킨 경우 충족되지 않을 수 있다. 상기 거리 기준이 충족되지 않으면, 형태는 비반응성 형태로서 식별된다. 적어도 하나의 반응성 형태를 식별하기 위한 거리 기준의 만족은 대체 기술을 사용함으로써, 예를 들어, 공간 특성(예컨대, 2면각 ψ,
Figure pct00044
및
Figure pct00045
)에 대한 값을 폴리펩티드 주쇄 내의 원자 또는 작용기가 측쇄의 원자 또는 작용기의 소정의 거리 내에 있음을 나타내는 독립적인 범위 또는 임계값과 비교함으로써 결정할 수 있음을 이해할 것이다.
일부 경우들에서, 2면각에 따른 측쇄의 자유 에너지는 가수분해 속도에 대한 측쇄 형태의 역할에 대한 기계적 통찰력을 얻기 위해 계산할 수 있다. 자유 에너지 값은 분자 역학 모델을 통해 생성할 수 있다. 도 3a-도 3f는 분자 역학 모델 시뮬레이션으로부터 수득한 주쇄 2면각(
Figure pct00046
) 및 측쇄 2면각(
Figure pct00047
및
Figure pct00048
)에 대한 자유 에너지 프로파일(빈(bin) 모집단으로부터 계산됨)을 도시한다. 자유 에너지 값이 낮은(어두운 음영으로 표시됨) 형태는 자유 에너지 값이 높은(밝은 음영으로 표시됨) 형태보다 더 안정적이므로, 분자가 형태 내에 있을 가능성이 더 크다. 더 낮은 자유 에너지는 더 높은 모집단(확인이 반응성 형태인 경우 시뮬레이션의 프레임 수)에 해당하므로, 반응성 형태에 대한 2면각의 주어진 조합에서 측쇄를 찾을 확률이 더 높다. 원은 측쇄의 질소와 주쇄의
Figure pct00049
-탄소를 최소화된 친핵성 공격 거리(예컨대, 2 또는 3 옹스트롬) 내에 기하학적으로 배치하는 특정 2면각 범위를 식별한다. 상기 원으로 표시된 영역이 낮은 자유 에너지 값과 관련된 형태를 포함하지 않는 경우, 출력은 폴리펩티드 분자의 형태가 상기 사슬 질소 원자를 주쇄의
Figure pct00050
-탄소에 반응하도록 충분히 가깝게 가져오지 못하는 결과로서 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 가능성이 없음을 나타낸다.
도 3a-도 3f의 각각의 자유 에너지 프로파일은 특정 폴리펩티드 구조를 사용한 시뮬레이션에 해당한다. 특히, 도 3a-도 3d에 대한 자유 에너지 프로파일은 해당 폴리펩티드(Fab1, Fab2, Mab3 및 Mab4)는 측쇄의 질소와 주쇄의
Figure pct00051
-탄소 사이의 거리가 최소 친핵성 공격 거리에 있는 형태를 가질 가능성이 있음을 나타낸다. 한편, 도 3e 및 도 3f의 자유 에너지 프로파일에 해당하는 폴리펩티드(Mab5 및 Fab6)는 원자가 상기 근처에 있는 형태일 가능성이 없음을 나타낸다. 더 구체적으로,
Figure pct00052
에 따른 자유 에너지 프로파일은 Fab2가 주로 작은 주쇄 2면각(
Figure pct00053
<-60)을 채택하는 반면, 다른 구조 Fab1, Fab6, Mab3, Mab4 및 Mab5는 확장된 형태(
Figure pct00054
>120)을 채택함을 도시한다. 따라서, 반응성 형태는 Fab2의 형태 B 및 구조 Fab1, Mab3, Mab4, Mab5 및 Fab6의 형태 A에 해당한다. 형태 A에 대한 자유 에너지는 Fab1, Mab3 및 Mab4(각각 0.94, 0.96 및 1.06 kcal/mol)에 대해 매우 낮으며, 이는 이러한 구조에 대해 관찰된 높은 실험적 가수분해 속도(각각 13, 15 및 15%/주)와 일치한다. 이와 대조적으로, 형태 A의 자유 에너지는 Mab5(1.56 kcal/mol)에서 상대적으로 높고, Fab6(2.66 kcal/mol)에서 가장 높으며, 이는 이들 분자들에 대해 관찰된 낮은 실험 속도와 잘 일치한다(각각 5 및 0%/주). 하지만, 반응성 형태의 자유 에너지와 실험 속도와의 일치는 Fab2에 대해 더 열악한 반면, 반응성 형태의 자유 에너지는 매우 작고(0.75 kcal/mol), 실험 속도는 높지 않다(9%/주). 측쇄가 반응성 형태를 채택하더라도 화학 반응은 이 경우에 에너지적으로 유리하지 않은 것으로 의심된다. 따라서, 어떤 경우들에서, 분자 역학 모델 시뮬레이션 내에서 제약조건으로 반응 에너지를 포함하는 것이 유리할 수 있다.
일부 경우들에서, 폴리펩티드의 아미노산 측쇄가 반응성 입체 내에 갇힐 확률은 아미노산의 주쇄 및/또는 측쇄에 대한 하나 이상의 2면각의 자유 에너지 프로파일에 기초하여 예측한다. 폴리펩티드의 3차원 구조가 비반응성 형태의 측쇄를 제한하는 경우, 상기 측쇄가 반응성 형태에 접근하는 것은 에너지적으로 불리할 것이다. 따라서, 입체 장애의 존재는 상기 반응성 형태에 접근하기 위한 엄청나게 높은 자유 에너지 장벽을 발생시킬 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드의 3차원 구조가 반응성 형태에 대한 2면각의 주어진 조합에서 측쇄를 제한하는 경우, 상기 측쇄는 반응성 형태에 갇힐 수 있다. 따라서, 2면각에 따른 자유 에너지 분석 및 친핵성 공격 거리 분석은 반응성 형태를 향한 2면각 주위의 회전이 입체 장애에 의해 제한되고, 따라서 분해가 비활성화되는지 여부를 밝힐 수 있다.
2면각 및 친핵성 공격 거리와 함께 자유 에너지 분석을 사용하기 위해, 공간 특성에 대한 값의 조합(예, 2면각 ψ,
Figure pct00055
및
Figure pct00056
)에 걸쳐 소정의 임계값(예컨대, 최소 친핵성 공격 거리)과 관련된 반응성 형태에 해당하는 자유 에너지 기준을 결정할 수 있다. 예를 들어, 제1 소정의 에너지 임계값(최소 자유 에너지 값)은 주쇄 2면각이
Figure pct00057
>120°으로 확장되고 측쇄 2면각이
Figure pct00058
및
Figure pct00059
이 되는 제1 형태에 해당하는 1.0 kcal/mol 내지 2.0 kcal/mol 사이에서(예컨대, 1.5 kcal/mol) 정의될 수 있다. 이와는 별도로, 제2 소정의 에너지 임계값(최소 자유 에너지 값)은 주쇄 2면각이
Figure pct00060
< -60으로 작고 측쇄 2면각이
Figure pct00061
및
Figure pct00062
이 되는 제2 형태에 해당하는 1.0 kcal/mol 내지 2.5 kcal/mol 사이에서(예컨대, 2.5 Kcal/mol) 정의될 수 있다. 대안적으로, 전역 소정의 에너지 임계값(최소 자유 에너지 값)은 친핵성 공격 거리를 최소화하는 아미노산의 주쇄에 대한 2면각을 갖고 아미노산의 측쇄에 대한 2개의 2면각을 갖는 모든 형태에 해당하는 1.0 kcal/mol 내지 2.5 kcal/mol 사이에서(예컨대, 2.0 kcal/mol에서) 정의될 수 있다. 일부 경우들에서, 전역 소정의 에너지 임계값(최소 자유 에너지 값)은 주쇄 2면각
Figure pct00063
이 120° 내지 -60° 사이이고, 측쇄 2면각
Figure pct00064
이 -60° 내지 +60° 사이이며,
Figure pct00065
이 -90° 내지 +90° 사이인 모든 형태에 해당하는 1.0 kcal/mol 내지 2.5 kcal/mol 사이에서(예컨대, 2.0 kcal/mol에서) 정의될 수 있다. 자유 에너지 기준은 공간적 특성(예컨대, 2면각 ψ,
Figure pct00066
및
Figure pct00067
)이 최소 자유 에너지 값(예컨대, 전역 소정의 에너지 임계값) 이하인 자유 에너지를 가질 때 충족된다. 자유 에너지 기준은 공간적 특성(예컨대, 2면각 ψ,
Figure pct00068
및
Figure pct00069
)이 최소 자유 에너지 값(예컨대, 전역 소정의 에너지 임계값) 초과인 자유 에너지를 가질 때 충족되지 않는다. 적어도 하나의 반응성 형태를 식별하기 위한 자유 에너지 기준의 만족은 대체 기술을 사용함으로써, 예를 들어, 공간 특성(예컨대, 2면각 ψ,
Figure pct00070
및
Figure pct00071
)에 대한 값을 아미노산의 주쇄 및/또는 측쇄의 자유 에너지가 소정의 자유 에너지 값 내에 있음을 나타내는 독립적인 범위 또는 임계값과 비교함으로써 결정할 수 있음을 이해할 것이다.
폴리펩티드 아미노산의 측쇄가 반응성 형태 내에 갇힐 확률은 아미노산의 주쇄 및/또는 측쇄에 대한 하나 이상의 2면각의 자유 에너지 프로필을 기반으로 하는 수치적 확률, 범주적 확률(예컨대, 매우 낮음, 낮음, 중간, 높음) 또는 이진 확률로서 정의할 수 있다. 예를 들어, 거리 기준에 의해 식별된 반응성 형태가 자유 에너지 기준에 의해 결정된 낮은 자유 에너지 값과 연관되어 있는 경우, 출력은 폴리펩티드의 아미노산 측쇄가 반응성 형태 내에 갇힐 가능성이 있음을 나타낼 수 있다(측쇄는 반응성 형태에 접근할 수 있음). 대안적으로, 거리 기준에 의해 식별된 반응성 형태가 자유 에너지 기준에 의해 결정된 높은 자유 에너지 값과 연관되어 있는 경우, 출력은 에너지 장벽이 너무 높고 폴리펩티드가 비반응성 형태를 유지할 가능성이 가장 높음을 나타낸다.
폴리펩티드의 아미노산 측쇄가 반응성 형태 내에 갇힐 확률이 결정되면, 폴리펩티드 분자의 형태가 상기 측쇄 질소 원자를 주쇄의
Figure pct00072
-탄소에 반응하도록 충분히 가깝게 가져오는 결과로서 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측할 수 있다. 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률(예컨대, 친핵성 공격 및 가수분해 반응을 겪음)은 폴리펩티드의 아미노산 측쇄가 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 기반으로 하는 수치적 확률, 범주적 확률(예컨대, 매우 낮음, 낮음, 중간, 높음) 또는 이진 확률로서 정의할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 측쇄가 반응성 형태 내에 갇힐 가능성이 있는 경우, 출력은 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자의 반응성 형태가 상기 측쇄 질소 원자를 주쇄의
Figure pct00073
-탄소에 반응하도록 충분히 가깝게 가져오는 결과로서 화학적으로 분해될 가능성이 있음을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 에너지 장벽이 너무 높고 폴리펩티드가 비반응성 형태를 유지할 가능성이 가장 높은 경우, 출력은 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 가능성이 없거나 상기 분해가 불활성화됨을 나타낼 수 있다. 하지만, 상기 폴리펩티드가 반응성 형태를 취할 수 있더라도, 반응성 형태의 가능성에 더하여 다른 인자가 존재하지 않는 한(예컨대, 용매가 접근 가능함), 폴리펩티드는 분해되지 않을 수 있다. 이에 따라, 일부 경우들에서, 형태적 거동 및 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하기 위한 인자로서 추가적인 제약조건이 포함될 수 있다.
V. 환경 및 접근성 제약조건의 구현
pH, 온도, 형태적 거동 및/또는 폴리펩티드의 화학적 분해에 대한 용매의 접근성과 같은 환경 요인의 역할은 분자 역학 시뮬레이션으로 조사할 수 있다. pH 및 온도와 같은 환경 요인은 시뮬레이션 내에서 상수로서 정의할 수 있다. 일부 경우들에서, 구성 분자에 대한 모든 관련 pKa 값을 계산하고 주어진 pH에서 지배적인 양성자화 상태를 지정하여 pH를 정의할 수 있다. 통상적인 분자 역학 프로토콜이 본원에서 사용되었지만, 시뮬레이션 중에 양성자화 상태가 고정되는 반면, 시뮬레이션에서 양성자화 상태의 변화를 허용하는 일정한 pH 분자 역학과 같은 방법을 대안적으로 사용할 수 있다. 대안적으로, 양자 역학/분자 역학(QM/MM) 방법을 사용하여 pH 값을 조정하기 위해 H3O+ 및 OH- 이온을 추가할 수 있다. 친핵성 공격이 발생하더라도, 환경이 올바른 조건을 갖추고 용매 분자에 접근 가능하지 않는 한, 폴리펩티드는 분해되지 않는다. 분자 역학 시뮬레이션은 용매(예컨대, 명시적 용매 또는 암시적 용매로서)에서 폴리펩티드를 시뮬레이션하도록 추가로 구성될 수 있다. 용매 차단 메트릭은 아미드기가 비용매군과 결합하는 프레임 수에서 아미드기가 용매 분자(예컨대, 물 분자)와 결합하는 프레임 수를 뺀 값으로 정의할 수 있다. 따라서, 음성 메트릭은 양성 메트릭과 비교할 때 더 큰 용매 접근성에 해당한다. 양성 메트릭은 폴리펩티드의 기하학적 구조가 용매 분자가 아미드기에 도달하는 것을 차단함을 나타낼 수 있다.
VI. 폴리펩티드에 대한 반응 유형을 예측하는 공정
도 4는 분자 역학 시뮬레이션 및 분자 공간 특성의 평가를 기반으로 절단 반응의 확률을 생성하기 위한 공정 400을 도시한다. 공정(400)은 측쇄 및 주쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 표현이 생성되는 블록(405)에서 시작한다. 상기 표현은 폴리펩티드(및 잠재적으로 용매)에 대한 원자, 질량, 전하 및 원자간 연결의 식별이 포함할 수 있다. 상기 표현은 폴리펩티드의 각 원자(및 잠재적으로 용매)에 대한 시작 좌표를 추가로 포함할 수 있다. 상기 표현은 각도 또는 이면체, 반 데르 발(Van der Wahl) 항, 자유 에너지, pH 등에 대한 제한과 같이 시뮬레이션 전체에 계산적으로 적용되는 제약조건을 추가로 포함할 수 있다.
블록(410)에서, 일련의 폴리펩티드 형태를 생성하기 위해 표현을 사용하여 하나 이상의 분자 역학 시뮬레이션을 실시한다. 상기 일련의 폴리펩티드 형태들 중 각각의 폴리펩티드 형태는 시뮬레이션(들)의 시간 단계에 해당할 수 있다. 상기 일련의 폴리펩티드 형태들 중 각각의 폴리펩티드 형태는 폴리펩티드의 각 원자에 대해 상기 원자의 위치를 포함할 수 있다. 상기 일련의 폴리펩티드 형태는 입자 위치로부터 힘을 계산하고 수치적으로 운동 방정식을 풀어 결정할 수 있다. 각 시간 단계에서, 각 원자의 위치를 결정하는 것 외에도 각 원자의 운동량을 더 추정할 수 있다.
블록 415에서, 상기 일련의 폴리펩티드 형태들 중 각각의 폴리펩티드 형태에 대해, 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 아미노산의 하나 이상의 공간적 특성을 결정한다. 상기 하나 이상의 공간적 특성은 각도 및/또는 2면각(예컨대, 민감한 부위에 이웃하는 아미노산의 ψ,
Figure pct00074
및
Figure pct00075
주쇄 및/또는 측쇄 2면각)을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 공간적 특성은 주쇄에 대한 2면각(ψ) 및 측쇄에 대한 2면각(
Figure pct00076
또는
Figure pct00077
)을 포함한다. 다른 경우들에서, 상기 공간적 특성은 주쇄에 대한 2면각(ψ), 측쇄에 대한 제1 2면각(
Figure pct00078
), 및 측쇄에 대한 제2 2면각(
Figure pct00079
)을 포함한다.
블록(420)에서, 각각의 폴리펩티드 형태의 아미노산의 두 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이의 친핵성 공격 거리는 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 아미노산의 하나 이상의 공간적 특성에 기초하여 추정한다. 예를 들어, 두 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이의 친핵성 공격 거리는 각 원자 또는 작용기의 위치, 원자 또는 작용기 사이의 각 원자의 운동량, 각 폴리펩티드 형태에 대해 2면각들의 조합을 사용하여 추정할 수 있다. 일부 경우들에서, 각 폴리펩티드 형태의 아미노산의 두 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이의 친핵성 공격 거리는 각도, 2면각 또는 2면각들의 조합(예컨대, 주쇄에 대한 2면각 및 측쇄에 대한 2면각)에 기초하여 추정한다. 일부 경우들에서, 두 원자 또는 작용기 중 하나는 아미노산의 측쇄에 있고 두 원자 또는 작용기 중 다른 하나는 아미노산의 주쇄에 있다.
블록 425에서, 절단 반응에 민감한 적어도 하나의 반응성 형태는 각 폴리펩티드 형태의 아미노산의 친핵성 공격 거리에 기초하여 확인한다. 일부 경우들에서, 상기 적어도 하나의 반응성 형태를 식별하는 데 사용될 수 있는 거리 기준이 결정된다. 상기 거리 기준은 반응성 형태를 식별하는 공간적 특성(예컨대, 2면각 ψ, χ1 및 χ2)에 대한 값의 조합에 걸친 최소 친핵성 공격 거리에 해당할 수 있다. 예를 들어, 거리 기준을 만족하는지 여부를 결정하기 위해 소정의 거리 임계값(최소 친핵성 공격 거리)이 0.0
Figure pct00080
내지 3.0
Figure pct00081
사이에서(예컨대, 약 1.5
Figure pct00082
) 정의될 수 있다. 상기 거리 기준이 상기 적어도 하나의 반응성 형태에 대하여 충족하는지 여부를 결정하는 단계는 상기 적어도 하나의 반응성 형태의 아미노산의 친핵성 공격 거리를 상기 소정의 거리 임계값과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 거리 기준은 상기 친핵성 공격 거리가 소정의 거리 임계값 이하일 때 만족한다. 상기 거리 기준이 만족되면, 상기 거리 기준을 만족하는 형태를 반응성 형태로서 식별한다. 상기 거리 기준은 상기 친핵성 공격 거리가 소정의 거리 임계값 초과일 때 만족하지 않는다. 상기 거리 기준이 만족되지 않으면, 상기 거리 기준을 만족하지 않는 형태를 비반응성 형태로서 식별한다.
블록(430)에서, 상기 적어도 하나의 반응성 형태에서 각도, 2면각, 또는 2면각들의 조합(예컨대, 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 아미노산의 측쇄에 대한 2면각)에 대하여 자유 에너지가 결정된다. 상기 자유 에너지는 각도, 2면각 또는 2면각들의 조합에 대한 자유 에너지 프로파일의 분석에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 경우들에서, 각도, 2면각 또는 2면각들의 조합의 공간에서 자유 에너지 프로파일 및 전경(landscape)은
Figure pct00083
을 사용하여 빈(bin) 모집단으로부터 계산된다. 여기서
Figure pct00084
는 볼츠만 상수이고, T는 온도이고,
Figure pct00085
는 빈 i의 모집단이며,
Figure pct00086
는 가장 밀집된 빈의 모집단이다. 모집단이 없는 빈에는 0.5의 모집단에 상당하는 인공 장벽이 주어질 수 있다. 각 시간 단계에서, 각 원자의 위치를 결정하는 것 외에도 자유 에너지를 추가로 추정할 수 있다. 특정 경우들에서, QM/MM 방법을 사용하여 자유 에너지를 모델링할 수 있다.
블록(435)에서, 아미노산의 측쇄가 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률은 각도, 2면각 또는 2면각들의 조합(예컨대, 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 아미노산의 측쇄에 대한 2면각)에 대한 자유 에너지에 기초하여 예측할 수 있다. 일부 경우들에서, 아미노산의 측쇄가 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하기 위해 사용될 수 있는 자유 에너지 기준이 결정된다. 예를 들어, 모든 반응성 형태에 해당하는 0.0 kcal/mol 내지 1.0 kcal/mol 사이에서 소정의 에너지 임계값(최소 자유 에너지 값)이 정의될 수 있다. 상기 적어도 하나의 반응성 형태에 대해 에너지 기준이 충족되는지 여부를 결정하는 것은 상기 적어도 하나의 반응성 형태에서 각도, 2면각, 또는 2면각들의 조합(예컨대, 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 아미노산의 측쇄에 대한 2면각)에 대한 2면각을 소정의 에너지 임계값과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 자유 에너지 기준은 공간적 특성(예컨대, 2면각 ψ,
Figure pct00087
및
Figure pct00088
)이 소정의 에너지 임계값 이하의 자유 에너지를 가질 때 만족된다. 자유 에너지 기준이 충족되면, 아미노산의 측쇄가 반응성 형태에 갇힐 가능성이 있다고 예측할 수 있다(측쇄는 반응성 형태에 접근할 수 있음). 자유 에너지 기준은 공간적 특성(예컨대, 2면각 ψ,
Figure pct00089
및
Figure pct00090
)이 소정의 에너지 임계값 초과의 자유 에너지를 가질 때 만족되지 않는다. 자유 에너지 기준이 충족되지 않으면, 아미노산의 측쇄가 너무 높은 에너지 장벽에 부딪혀 폴리펩티드가 비반응성 형태를 유지할 가능성이 있다고 예측할 수 있다.
선택적 블럭(440)에서, 만족 시, 상기 폴리펩티드의 아미드기가 주변 용매로부터의 용매 분자와 결합할 수 있는 임계값 초과의 공간적 접근성을 가짐을 나타내는 환경 및 접근성 제약조건을 식별할 수 있다. 환경 및 접근성 제약조건은 적어도 하나의 반응성 형태, 하나 이상의 환경 요인(예컨대, pH 또는 온도), 용매 분자의 가용성, 또는 이들의 조합에서 폴리펩티드의 하나 이상의 공간 특성을 평가하는 것을 기반으로 충족된다.
블록(445)에서, 아미노산의 측쇄가 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇히는 결과로서 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 가능성을 예측할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 측쇄가 반응성 형태 내에 갇힐 가능성이 있는 경우, 폴리펩티드는 반응성 형태의 결과로서 화학적 분해를 겪을 가능성이 있는 것으로 예측할 수 있다. 대안적으로, 에너지 장벽이 너무 높고 폴리펩티드가 비반응성 형태를 유지할 가능성이 가장 높다면, 상기 폴리펩티드는 화학적 분해를 겪지 않을 것으로 예측할 수 있다. 특정 경우들에서, 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률은 반응성 형태 및 환경 및 접근성 제약조건의 결과로서 예측할 수 있다.
블럭(450)에서, 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 출력한다. 블럭(450)에서, 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 디스플레이하고 다른 장치로 전송한다. 일부 경우들에서, 아미노산의 측쇄가 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률은 특정 방식으로 사용될 폴리펩티드를 선택하고(예컨대, 특정 조건을 위한 치료법을 개발), 그리고/또는 폴리펩티드에 대한 특정 제형을 선택하는데 사용할 수 있다(예컨대, 폴리펩티드에 접근하는 물을 제한).
일부 경우들에서, 아미노산의 측쇄가 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇될 확률 및/또는 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률은 아미노산의 측쇄가 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇될 확률 및/또는 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초한 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드들의 목록에서 상기 폴리펩티드를 제거하는 데 사용한다.
일부 경우들에서, 아미노산의 측쇄가 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇될 확률 및/또는 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률은 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초하여 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드의 목록에서 상기 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드보다 낮게 순위를 매기는데 사용하고, 여기서 상기 다른 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률이 상기 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률보다 적다.
VII. 예시적 컴퓨팅 환경
도 5는 본 개시에 따라 분자 역학 시뮬레이션을 위한 시스템 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 예시적인 컴퓨팅 장치(500)를 도시한다. 예시적인 컴퓨팅 장치(500)는 하나 이상의 통신 버스(515)를 사용하여 메모리(510) 및 컴퓨팅 장치(500)의 다른 구성요소와 통신하는 프로세서(505)를 포함한다. 프로세서(505)는 메모리(510)에 저장된 프로세서 실행 가능 명령을 실행하여 상이한 실시예에 따라 분자 역학 시뮬레이션을 위한 하나 이상의 방법, 예컨대 도 4와 관련하여 본원에 기재된 예시 방법(400)의 일부 또는 전부를 실시하도록 구성된다. 본 예에서, 메모리(510)는 도 1, 도 2, 도 3a-도 3f, 및 도 4와 관련하여 앞서 논의된 바와 같이 하나 이상의 관심 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 데이터 분석(520) 및 예측 분석(525)을 제공하는 프로세서 실행 가능 명령을 저장한다.
폴리펩티드 데이터 분석(520) 및 예측 분석(525)은 폴리펩티드 표현(530)을 생성하고 반응 확률을 생성하기 위해 하나 이상의 분자 역학 시뮬레이션에서 입력으로 사용하도록 구성될 수 있다. 분자 역학 시뮬레이션(들)은 고정될 시스템의 변수(예컨대, 입자 수(N), 부피(V), 에너지(E), 온도(T) 및 압력(P)) 중 둘 이상의 조합)을 식별하는 분자 시뮬레이션 앙상블(535)을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 앙상블은 마이크로 정준 앙상블(NVE), 정준 앙상블(NVT) 또는 등온선 등압 앙상블(NPT)를 포함할 수 있다. 분자 역학 시뮬레이션(들)은 적분기를 사용하여 운동 방정식을 통합하고 온도 조절기 또는 기압 조절기를 사용하여 시뮬레이션 전체에서 온도 또는 압력을 제어할 수 있다. 분자 역학 시뮬레이션을 한 번 이상 반복하면, 폴리펩티드의 형태가 시간에 따라 어떻게 변하는지 시뮬레이션할 수 있다. 시뮬레이션(들)은 특정 개수의 시간 단계 동안 또는 목표 평형에 도달할 때까지 실시할 수 있다.
반응 확률은 공간적 특성(예컨대, 다양한 반응 제약조건이 충족되는지 여부를 결정할 수 있음)을 기반으로 다수의 형태의 각각에 대해 생성될 수 있다. 예를 들어, 분자 역학 앙상블(535)에 의해 생성된 각각의 형태에 대해, 상기 형태 내의 폴리펩티드의 공간적 특성은 원자간 거리 반응 제약조건(540) 및 자유 에너지 제약조건(545)이 충족되는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 이후에 상기 형태를 갖는 폴리펩티드가 절단 반응에 민감할 것을 나타낼 수 있다. 환경 및 접근성 제약조건(550)은 용매 분자에 접근하여 반응하는 반응을 위해 유리하게 구성된 폴리펩티드를 추정하는데 사용할 수 있다. 각각의 제약조건이 충족되는 시뮬레이션 생성 폴리펩티드 형태의 일부에 기초하여, 폴리펩티드의 측쇄가 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 수 있는지 여부, 및/또는 주어진 폴리펩티드가 화학적으로 분해되는 정도 및/또는 속도를 나타내는 출력이 생성될 수 있다. (상기 시뮬레이션은 고유하게 고려될 수 있는 동일한 형태 또는 동일한 공간 특성을 갖는 다중 출력을 생성할 수 있음을 이해할 것이다.)
본 예에서, 컴퓨팅 장치(500)는 또한 사용자 입력을 받아들이기 위해 키보드, 마우스, 터치스크린, 마이크 등과 같은 하나 이상의 사용자 입력 장치(555)를 포함한다. 컴퓨팅 장치(500)는 또한 사용자 인터페이스와 같은 시각적 출력을 사용자에게 제공하기 위한 디스플레이(560)를 포함한다. 컴퓨팅 장치(500)는 또한 통신 인터페이스(565)를 포함한다. 일부 예들에서, 통신 인터페이스(540)는 근거리 통신망("LAN"); 인터넷과 같은 광역 통신망("WAN"); 대도시권 네트워크("MAN"); 포인트-투-포인트 또는 피어-투-피어 연결; 등을 포함한 하나 이상의 네트워크를 사용하여 통싱을 가능하게 할 수 있다. 기타 장치와의 통신은 임의의 적절한 네트워킹 프로토콜을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 네트워킹 프로토콜은 인터넷 프로토콜("IP"), 전송 제어 프로토콜("TCP"), 사용자 데이터그램 프로토콜("UDP") 또는 TCP/IP 또는 UDP/IP와 같은 이들의 조합을 포함할 수 있다.
VIII. 실시예
다양한 구현예들에서 구현되는 시스템 및 방법은 다음의 예를 참조하여 더 잘 이해할 수 있다.
VIII.A. 실시예 1. - 항체에서 Asn-Pro 펩티드 결합 가수분해: CDR-L3의 형태는 반응을 촉진한다
안구 질환의 치료를 위한 후보로서 2개의 항체 Fab 단편을 스크리닝하는 동안, 중성 pH 및 37℃에서 배양시 항원 결합의 부수적인 손실과 함께 단편화가 관찰되었다. 펩티드 매핑은 경쇄(CDR-L3)의 상보성 결정 영역 내의 Asn-Pro 부위에서 발생한 단편화를 나타내었다. 펩티드에서 이전에 관찰된 바와 같이, 질량 분광법에 의한 분석은 절단이 펩티드 카르보닐 상의 Asn 측쇄의 공격으로 발생한 가수분해 반응임을 나타낸다. 5개의 시험 항체에서 CDR-L3 Asn-Pro 가수분해 속도를 비교한 결과, 일반적으로 절단 속도가 짧고 구조화되지 않은 펩티드에서보다 빠르며 속도가 분절의 형태적 선호도에 의해 결정된다는 것을 시사한다. 이러한 결과와 대조적으로, 중쇄의 상보성 결정 영역 2(CDR-H2)에서 발견되고, 생식계열 유전자로부터 유래된 Asn-Pro는 이러한 절단 반응에 민감하지 않았다. 분자 역학 시뮬레이션은 민감한 부위의 Asn 잔기가 펩티드 카르보닐에 대한 측쇄의 공격과 일치하는 2면각을 채우는 반면, 내성 부위의 Asn은 그렇지 않음을 나타낸다. 이러한 발견으로부터 본원에서 논의된 다양한 구현예들은 이러한 불안정성을 피하기 위한 항체 공학 기술 및 절단 반응의 위험 평가를 위한 인실리코 도구를 포함하여 유도되었다.
VIII.B. 재료 및 방법
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 다이오드 어레이 검출기(DAD)가 장착된 애질런트(Agilent) 1200 시리즈 HPLC 시스템(산타 클라라, CA)을 사용하여 실시하였다. TSK-GEL G2000SWxl(7.8x300mm) 컬럼(Tosoh Bioscience, 사우스 샌프란시스코, CA)을 사용하여 G6.31을 분리하였다. Fab2 샘플을 이동상(0.2 M 인산칼륨, 0.25 M 염화칼륨 pH 6.2)에서 대략 0.5 mg/mL로 희석하였다. 샘플 70 μL를 컬럼에 주입하고 25°C에서 등용매 모드로 0.5 mL/분의 유속으로 30분 동안 용리하고 280 nm에서 UV 흡수를 검출에 사용하였다. SEC 피크는 단량체, 고분자량 종(HMWS) 및 단편으로 구분되었다. 백분율 피크 면적은 각 시점에서 각 군의 피크 면적을 총 피크 면적으로 나누어 계산하였다.
이온 교환 크로마토그래피(IEC)를 디오넥스 프로팍(Dionex Propac) WCX-10 컬럼(4x250)(Tosoh Bioscience, 사우스 샌프란시스코, CA)에서 애질런트 1200 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 실시하였다. 이동상 A(pH 5.7에서 20 mM MES) 및 B(이동상 A의 200 mM 염화나트륨)를 분리에 사용하였다. 85분에 92% 용매 A에서 34% 용매 A로 시작한 선형 구배에 이어 95분에 34% 용매 A에서 0% 용매 A로의 구배를 사용하여 총 약 100분 실행 시간에서 Fab2 전하 변이체를 분리하였다. 샘플 75 μL를 컬럼에 주입하고 25°C에서 등용매 모드로 0.8 mL/분의 유속으로 용리하고 280 nm에서 UV 흡수를 검출에 사용하였다. IEC 피크는 주피크, 산성피크, 염기성 피크로 구분하였다. 백분율 피크 면적은 각 피크 면적을 총 피크 면적으로 나누어 계산하였다.
Fab2의 항원 결합능은 기재된 바와 유사한 프로토콜을 사용하여 비아코어(Biacore) T200 기기(GE Healthcare, 피츠버그, PA)에서 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 측정하였다(Tesar et al., 2017, mAbs). 간략하게, 항원은 아민 커플링 키트(GE Healthcare, 피츠버그, PA)를 사용하여 2000-3000 반응 단위(RU) 범위에서 카르복실 메틸화 덱스트란 센서 칩(CM5)에 직접 고정화되었다. 항원에 대한 항체 Fab 단편의 결합은 180초 동안 주사 전후에 RU의 변화를 모니터링함으로써 결정하였다. 센서 칩은 30초 동안 pH 2.1 및 30 μL/분의 유속에서 10 mM 글리신-HCl 완충액으로 재생하였다. 모든 결합 검정은 HEPES 완충액(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005%(v/v) 계면활성제 P20, pH 7.4)에서 주위 온도에서 실시하였다. 항원 결합 농도는 4개 매개변수 맞춤을 사용하여 표준 보정 곡선(0.158-5 μg/mL)에서 계산되었다. 각 시점에서의 항원 결합능을 t0에서의 항원 결합능으로 정규화하였다.
IV.C. 분자 역학 시뮬레이션 세부사항
모델링 빌더 소프트웨어(예컨대, MODELLER의 수정된 버전)를 사용하여 서열로부터 Fab 구조를 구성하였다. Fab 구조는 입체 충돌을 제거하기 위해 에너지를 최소화하였다. 이후 이완된 구조를 분석하여 pH=7.4에서 이온화 가능한 잔류물에 대한 양성자화 상태를 결정하였다. Fab 구조는 TIP3P 물의 8면체 용매 상자에서 주기적인 경계 조건으로 상자 가장자리까지 최소 10
Figure pct00091
의 거리를 두고 용매화되었다. 용질 구조는 FF14SB 역장(force field)으로 매개변수화되었다. 시스템 전하는 Na+ 및 Cl- 반대 이온으로 중화되었다. 수소 질량 재분할(Hydrogen Mass Repartitioning)은 4fs의 시뮬레이션 시간 단계를 가능하게 하기 위해 용질 원자에 대해 실시하였다.
예시적인 시뮬레이션 프로토콜은 다음 단계를 포함하였다. 먼저, 용질을 초기 구조로 억제하기 위해 힘 상수 10(kcal/mol/
Figure pct00092
)의 조화 억제 전위를 사용하여 2000단계의 공액 구배 에너지 최소화로 구조를 완화하였다. 이후, 압력을 1atm으로 유지하고 서모스탯 온도를 200 ps에 걸쳐 300K로 증가시키면서, 강도 10(kcal/mol/
Figure pct00093
)의 하모닉 위치 제한을 단백질 구조에 적용하였다. 이어서, 시스템은 구속력 상수 1(kcal/mol/)로 500 ps 동안 평형을 유지하였다. 생산 단계를 위해 모든 제한(구속)을 제거하였다. 시뮬레이션 시간 단계는 4fs이었다. 9
Figure pct00094
의 컷오프 반경은 장거리 상호 작용을 위한 입자 메쉬 정전기와 함께 범위 제한 상호 작용에 사용하였다. 생산 시뮬레이션은 NPT 조건을 사용하여 실시하였다. 랑제방(Langevin) 역학은
Figure pct00095
= 1
Figure pct00096
의 충돌 빈도로 온도를 300K로 유지하는 데 사용하였다. 분자 역학 시뮬레이션의 생산 단계는 500 ns 동안 실시하였다. 역학 동안 SHAKE 알고리즘은 수소 원자와 관련된 모든 결합을 제한하는 데 사용하였다. 아래 제시된 분석을 위해, 분자 역학 궤적의 스냅샷이 10 ps마다 저장되었다.
다른 모든 시뮬레이션 매개변수에는 기본값을 사용하였다. SPFP 정밀 모델을 사용한 Amber 2015 분자 역학 시뮬레이션 소프트웨어 패키지의 GPU 구현은 예시적인 분자 역학 시뮬레이션에 사용하였다. 앞서 기재된 분자 역학 시뮬레이션 프로토콜을 반복하여 분자당 3개의 독립적인 500 ns 분자 역학 시뮬레이션을 실행하였다. 이후, 세 가지 시뮬레이션의 궤적을 결합하여(최대 1.5 ms 추가) 분석에 사용하였다. AmberTools의 CPPTRAJ 소프트웨어를 사용하여 궤적을 분석하였다. 각도, 2면각의 공간에서 자유 에너지 프로파일 및 전경(landscape)은
Figure pct00097
을 사용하여 빈(bin) 모집단으로부터 계산된다. 여기서
Figure pct00098
는 볼츠만 상수이고, T는 온도이고,
Figure pct00099
는 빈 i의 모집단이며,
Figure pct00100
는 가장 밀집된 빈의 모집단이다. 모집단이 없는 빈에는 0.5의 모집단에 상당하는 인공 장벽이 주어졌다.
VIII.D. 결과
정제된 Fab1은 4주 동안 37℃에서 PBS에서 스트레스를 받았다. 이후, 대조군과 스트레스 샘플을 트립신 소화에 적용한 후, 역상 크로마토그래피 분리 및 질량 분광 분석을 실시하여 잠재적인 분해 생성물을 확인하였다. 가수분해되기 쉬운 불안정한 Asn-Pro 부위는 Fab1의 CDR-L3에서 확인하였다(예컨대, 도 6a-도 6c를 참조). 추출된 이온 크로마토그램(XIC)은 Asn-Pro 부위를 포함하는 천연 트립신 펩티드(도 6a), N 말단 가수분해 생성물 펩티드(도 6b), 및 C 말단 가수분해 생성물 펩티드(도 6c)에 대해 표시되었다. 2개의 N 말단 가수분해 생성물이 C 말단에서 Asp 및 Iso-Asp가 아니라 펩티드의 C 말단에서 Asn 및 Iso-Asn에 대응하여 관찰되었다(도 6b). N 말단 가수분해 생성물 펩티드의 C 말단에서 Asn의 관찰은 도 7a 및 도 7b에서 볼 수 있고, 이는 각각 98.0분 및 98.8분에서 용리되는 2개의 N 말단 가수분해 생성물에 상응하는 질량 스펙트럼을 나타낸다. 펩티드의 C 말단에서 Asn 또는 Asp에 해당하는 N 말단 가수분해 생성물에 대한 이론적인 질량 스펙트럼은 도 7c 및 도 7d에 각각 도시되어 있다. N 말단 가수분해 생성물의 탠덤 질량 스펙트럼은 펩티드의 C 말단에서 Asn을 확인한다.
Fab2의 장기 안정성은 37°C에서 PBS(pH 7.4)에서 평가하였다. 도 8a는 36주 기간 동안 Fab 안정성의 변화를 요약한 것이다. SEC를 사용한 응집 측정은 전체 응력 기간 동안 Fab가 단량체로 남아 있음을 보여준다. 하지만, 각각 IEC 및 CE-SDS를 사용한 측쇄 화학적 분해 및 주쇄 단편화의 측정은 Fab가 느리고 꾸준한 분해를 겪는다는 것을 시사한다. IEC 및 CE-SDS에 의해 측정된 36주 후 주요 피크 부분의 감소는 각각 32.7% 및 36%이다. 결과적으로, SPR로 측정한 항원 결합능은 같은 기간 동안 27% 감소하였다. 이온 교환 크로마토그램은 IEC 메인 피크의 감소가 아마도 탈아미드화 반응으로 인한 산성 전하 변형의 증가 때문임을 보여준다. 변성 조건하에서 실시된 겔 전기영동은 CE-SDS 메인 피크의 감소가 주쇄 단편화에 기인함을 명확하게 보여준다(도 8b). 스트레스를 받은 샘플의 질량 분석은 단편화가 Asn-Pro 가수분해로 인한 것임을 확인하였다. 하지만, SEC 데이터는 비변성 조건하에서 Asn-Pro 가수분해로 인한 단편화에도 불구하고 Fab가 원형 그대로 남아 있음을 보여준다. 광범위한 스펙트럼의 프로테아제 억제제 칵테일(cOmpleteTM, 로슈)을 배양 혼합물에 첨가해도 미량의 단백질 분해 효소 오염이 아닌 자가분해 반응으로 인해 발생하는 가수분해와 일치하는 Fab2 경쇄 단편화 속도에 영향을 미치지 않았다. Fab2의 중성 pH 제형에 스파이크(spike)되고 37°C에서 배양된 Asn-Pro 서열을 함유하는 구조화되지 않은 17-mer 펩티드의 절단은 검출되지 않았다. 이는 또한 프로테아제 촉매 단편화와 일치하지 않는다.
항체 집합의 서열 비교는 CDR-L3에서 Asn-Pro 모티프를 갖는 몇 가지 잠재적인 치료 후보를 확인하였다. 이들 항체 모두에서 Asn-Pro는 위치 6-7에 고정되어 있지만 CDR-L3의 나머지 위치는 다양하다. 이들 중 4개, 1개의 항체 Fab 단편 및 3개의 전장 항체는 PBS에서 제형화된 단백질 용액의 열 스트레스(37°C)에 따른 Asn-Pro 가수분해 속도 분석을 위해 선택되었다. 모두 도 9에 도시된 절단 동역학으로 가수분해에 대한 Asn-Pro 펩티드 결합의 민감성을 나타내었다. Mab3 및 Mab4는 Fab1에 대해 관찰된 것보다 더 높은 가장 높은 가수분해 속도(표 1)를 나타낸 반면, 가수분해 속도는 Fab2에 대해 더 느리고 Mab5가 가장 느린 속도를 가졌다. Mab3는 아마도 항체가 이전에 중성 pH 완충액에 저장되었기 때문에 출발 물질에 유의적 양의 가수분해된 Asn-Pro를 함유하였다. 이러한 데이터 세트는 가수분해 속도에 대한 인접 서열 효과를 기술하기에는 너무 작지만, CDR-L3의 서열 변이가 가수분해에서 3배 범위를 초래한다는 점은 주목할 만하다. 또한, Fab2의 CDR 서열을 대안적인 비인간 프레임워크에 이식한 Fab4는 Fab2(8%/주)에 비해 Asn-Pro 가수분해율이 4배 더 낮은(2%/주) 것으로 나타났다. 이들 결과와 대조적으로, CDR-H2에 Asn-Pro를 갖는 항체 패널의 분석은 상기 위치가 가수분해되기 민감하지 않음을 나타내었다. 예를 들어, PBS에서 제형화된 단백질의 열 스트레스(40℃)에서 Fab3(표 1)의 CDR-H2에서 Asn-Pro에 대해 가수분해가 검출되지 않았다.
단백질 CDR-L3 서열 가수분해율(%/주)
Fab1 QQWSSNPWT(서열번호 1) 13
Fab2 QQGYGNPFT(서열번호 2) 8
Mab3 QQWSSNPYT(서열번호 3) 15
Mab4 QQGINNPLT(서열번호 4) 15
Mab5 QQWSFNPPT(서열번호 5) 5
Fab3 CDR-H2EINPTSGGTNFNEKFKS(서열번호 6) ~0 (가수분해 미검출)
Fab4
[비인간 프레임워크 내 Fab2 CDRs]		 QQGYGNPFT(서열번호 7) 2
훈련 세트 항체의 pH 7.4에서 CDR-L3 서열 및 Asn-Pro 가수분해율
Asn-Pro 가수분해 속도에 대한 항체 구조의 영향을 조사하기 위해, Fab1 및 Mab3의 CDR-L3 서열을 나타내는 구조화되지 않은 선형 펩티드에 대해 열 스트레스를 실시하였다. 이전에 37°C에서 배양된 구조화되지 않은 펩타이드의 가수분해 속도가 느린 것으로 나타났기 때문에, 가속 온도 조건(90 및 70°C)을 실시하고 온도 의존성을 외삽하여 37°C에서 속도를 계산하였다. 매우 느린 펩티드 가수분해 속도(표 2)는 37°C에서 계산된 반감기가 2000일 초과인 것으로 관찰되었다. 예상한 바와 같이, 가수분해 속도는 pH 5 완충액에서 실시된 배양의 경우 약 3배 더 느렸다.
펩티드 명칭 서열 90°C에서 % Pro 피크 형성/일
Mab3 QQWSSNPYTFGQ(서열번호 3) 2.9
Fab1 QQWSSNPWTFGQ(서열번호 1) 1.0
Fab2 QQGYGNPFTFGQ(서열번호 2) 2.9
Mab4 QQGINNPLTFGQ(서열번호 4) 1.9
Mab5 QQWSFNPPTFGQ(서열번호 5) ND
ND=미검출
pH 7.4, 90°C에서 선택된 항체 CDR-L3 분절의 펩티드 모방체에서 Asn-Pro 가수분해 속도
Asn-Pro 가수분해 속도에 대한 단백질 구조의 영향을 추가로 조사하기 위해, Fab 구조의 분자 역학 시뮬레이션을 실시하였다. 본원에 논의된 바와 같이, Asn-Pro 가수분해에서의 분해 경로는 주쇄 카르보닐에 대한 Asn 측쇄 질소의 친핵성 공격을 통해 진행된다. 이러한 공정의 전제 조건은 ASN 측쇄 질소와 측쇄 카르보닐 사이의 친핵성 공격 거리(dN)를 최소화하는 형태를 채택하는 Asn 측쇄에 대한 것이다(도 2a 및 도 2b). 거리
Figure pct00101
는 2면각의 2가지 특정 조합에서 최소화된다: 첫째, 주쇄 2면각이
Figure pct00102
>120으로 연장되고 측쇄 2면각이
Figure pct00103
및
Figure pct00104
이고(즉, 도 2a 및 도 2b의 형태 A); 둘째, 주쇄 2면각이
Figure pct00105
<-60 및
Figure pct00106
및
Figure pct00107
의 조밀한 각도일 때(도 2a 및 도 2b). 2면각에 따른 측쇄의 자유 에너지는 가수분해 속도에 대한 측쇄 형태의 역할에 대한 기계적 통찰력을 얻기 위해 계산하였다.
도 3a-도 3f는 1.5 마이크로초 MD 시뮬레이션으로부터 수득한 주쇄 2면각(
Figure pct00108
) 및 측쇄 2면각(
Figure pct00109
및
Figure pct00110
)에 대한 자유 에너지 프로파일(빈(bin) 모집단으로부터 계산됨, 분자 역학 시뮬레이션 세부사항 섹션을 참조)을 도시한다. 자유 에너지가 낮을수록 주어진 2면각 조합에서 측쇄를 찾을 확률이 높아진다.
Figure pct00111
에 따른 자유 에너지 프로파일은 Fab2가 주로 작은 주쇄 2면각(
Figure pct00112
Figure pct00113
<-60)을 채택하는 반면, 다른 구조들은 확장된 형태(
Figure pct00114
>120)을 채택함을 도시한다. 따라서, 반응성 형태는 도 3a-도 3f의 원에 의해 표시된 바와 같이 Fab2의 형태 B 및 다른 분자의 형태 A에 해당한다. 형태 A에 대한 자유 에너지는 Fab1, Mab3 및 Mab4(각각 0.94, 0.96 및 1.06 kcal/mol)에 대해 매우 낮으며, 이는 이러한 구조에 대해 높은 실험적 가수분해 속도(각각 13, 15 및 15%/주)와 일치한다. 이와 대조적으로, 형태 A의 자유 에너지는 Mab5(1.56 kcal/mol)에서 상대적으로 높고, Fab6(2.66 kcal/mol)에서 가장 높으며, 이는 이들 분자들에 대해 낮은 실험 속도와 잘 일치한다(각각 5 및 0%/주). 하지만, 반응성 형태의 자유 에너지와 실험 속도와의 일치는 Fab2에 대해 더 열악한 반면, 반응성 형태의 자유 에너지는 매우 작고(0.75 kcal/mol), 실험 속도는 높지 않다(9%/주). 측쇄가 반응성 형태를 채택하더라도 화학 반응은 이 경우에 에너지적으로 유리하지 않은 것으로 의심된다.
VIII.E. 논의
생리학적 조건하에서 Asn 잔기는 탈아미드화되기 쉽고, 여기서 아미드 측쇄는 가수분해되어 유리 카르복실산을 형성한다. 상기 반응의 속도 제한 단계는 5원 숙신이미드 고리 중간체의 형성이다. 하지만, 프롤린과 같은 벌크(bulk) 잔기가 뒤따르는 Asn을 함유하는 펩티드는 두 잔기 사이의 펩티드 주쇄의 가수분해 절단에 민감한 것으로 나타났다. 본원에서 펩티드 주쇄의 가수분해 절단에 민감한 Asn-Pro 모티프의 증거가 제공된다. CDR-L3에서 확인된 Asn-Pro 부위에 대한 질량 스펙트럼 데이터는 상기 부위와 관련된 3개의 펩티드를 확인하였다: Asn-Pro 부위를 함유하는 천연 트립신 펩티드, Asn 및 이소-Asn을 함유하는 N 말단 가수분해 생성물 펩티드, 및 C 말단 가수분해 생성물 펩티드. Asp 및 이소-Asp가 아닌 Asn 및 이소-Asn을 함유하는 N 말단 가수분해 생성물의 확인은 석신이미드 중간체의 형성이 펩티드 결합 카르보닐에 대한 b-측쇄 아미드 질소의 공격의 결과임을 시사한다. 이후, 이러한 COOH 말단 숙신이미드 중간체는 개방되어 Asn 또는 이소 Asn을 함유하는 관찰된 N 말단 가수분해 생성물을 형성할 수 있다.
뮤린 항체 또는 뮤린 항체의 인간화에 기초한 항체의 경우, 경쇄 위치 94-95(카바트 넘버링)의 Asn-Pro는 IGKV4 마우스 생식계열 유전자의 선택으로부터 발생할 수 있고, 이는 상기 계열의 일부 구성요소들이 Asn-Pro를 재조합되지 않은 유전자에서 부호화하기 때문이다. 이와 대조적으로, 인간 항체의 경우 이러한 모티프가 재조합의 V-J 연결 과정으로부터 또는 체세포 과돌연변이를 통해 발생하도록 인간 경쇄 유전자에는 생식계열 부호화된 94Asn-Pro95가 없다. 마찬가지로, 중쇄 위치 52-52a(CDR-2)의 Asn-Pro는 IGHV1 계열의 인간 및 마우스 생식계열 유전자 모두에서 발견된다. 그 결과, 항체 집합체에서 CDR-H2의 52Asn-Pro52a가 CDR-L3의 94Asn-Pro95보다 더 자주 발견된다. CDR-H2의 모티프는 Asn-Pro가 항원 결합에서 직접적인 역할을 할 가능성이 더 높은 좀 더 용매 접근 가능한 CDR-L3 위치와 비교하여 용매 접근 가능성이 더 적고 CDR 형태 유지에 더 많이 관여하는 경향이 있다. 이는 CDR-L3의 Asn-Pro를 표적 결합에 영향을 미칠 가능성이 더 큰 절단으로 가수분해에 더 민감하게 만든다.
최근 Jain et al. (PNAS, 2017)는 "개발 가능성"에 대한 메트릭 설정을 목표로 하는 임상 단계 항체의 생물물리학적 특성에 대한 보고서를 발표하였다. 137개의 항체 모음에는 CDR-L3에 94Asn-Pro95를 갖는 8개의 항체가 있다. 이들은 무로모나브, mAb5, 오틀러투주맙, 리툭시맙, 테플리주맙, 토베투맙, 벨투주맙 및 비실리주맙이다. 10개의 잔기 CDR에 대한 P95a 삽입을 가지는 토베투맙을 제외하고 모두 9개의 잔기 CDR-L3 서열을 가지고 있다. 테플리주맙은 무로모나브의 인간화 버전으로 보이는 반면, 벨투주맙은 인간화 버전의 리툭시맙과 일치하는 기능을 가지고 있다. 특히, 테플리주맙 및 비실리주맙은 또한 CDR-H2에 Asn-Pro를 갖는다. 후속 간행물(Lu et al., 2018)에서는 Jain et al.이 기재한 131개 항체에 대한 탈아미드화 및 이성질체화 민감성을 시험하였고, CDR-L3에서 94Asn-Pro95를 갖는 8개 항체에 대한 pH 8.5 스트레스 시험을 포함하였다. 상기 부위에서 이들 항체의 절단에 대한 증거는 보고되지 않았다. 본원에 기재된 인 실리코 기술을 사용하여, 항체 토베투맙 및 비실리주맙의 경쇄가 절단 민감성 결합을 갖는 반면 다른 것들은 절단에 덜 민감함을 예측하는 것이 가능하였다(표 3).
표 1 및 도 9의 Mab5에 대해 나타낸 데이터에 더하여, 중성 pH, 37°C 안정성 데이터는 무로모나브, 테플리주맙, 토베투맙 및 비실리주맙을 제외한 모든 것에 대해 생성되었다. PBS(pH 7.4)에서 제형화된 항체를 37°C에서 최대 4주 동안 배양하고 단편화에 대한 증거를 원형 샘플과 환원된 샘플 모두에 대해 질량 분광법 및 모세관 전기영동 소듐 도데실 설페이트(CE-SDS)로 수득하였다. 속도는 결정되지 않았지만, CDR-L3에서 Asn-Pro에서의 가수분해는 벨투주맙에 대해 검출되었지만 리툭시맙 또는 오틀러투주맙에 대해서는 검출되지 않았다(표 3). 리툭시맙과 오틀러투주맙에서는 결합의 안정성이 예상되었지만 벨투주맙에서는 불안정성이 없었다. 이러한 결과는 벨투주맙과 리툭시맙이 CDR-L3에서 동일한 아미노산 서열을 가지고 있기 때문에 항체 프레임워크가 가수분해 속도에 영향을 미칠 수 있다는 결론을 뒷받침한다.
단백질 CDR-L3 서열 경쇄 단편이 관찰되었는가?
무로모나브 QQWSSNPFT(서열번호 8) NT
오틀러투주맙 QHHSDNPWT(서열번호 9) 없음
리툭시맙 QQWTSNPPT(서열번호 10) 없음
벨투주맙 QQWTSNPPT(서열번호 11) 있음
테플리주맙 QQWSSNPFT(서열번호 12) NT
토베투맙 QQTYSNPPIT(서열번호 13) NT
비실리주맙 QQWSSNPPT(서열번호 14) NT
NT = 시험되지 않음
CDR-L3 내 Asn-Pro를 갖는 상용 항체
따라서, pH 7.4에서 연장된 열 스트레스에 따른 Asn-Pro 펩티드 결합의 가수분해는 Fab2에 대한 항원 결합의 손실을 초래한다는 것이 입증되었다. 많은 치료용 항체 및 항체 단편이 Asn-Pro 절단의 동역학이 더 느린 약산성 조건에서 제형화되기 때문에, 이 반응은 항체 제형의 저장 수명을 결정하기 위한 연구에서 과소 평가되었을 수 있다. 더 낮은 pH 액체 또는 동결건조 제형을 사용하여 민감한 항체에서 Asn-Pro 절단에 대해 안정화시킬 수 있지만, 이는 중성 pH의 생리학적 조건하에서 잠재적인 분해를 제거하지 못할 것이다. 일부 경우들에서, 불안정한 Asn 잔기의 아미노산 치환에 의해 항체를 재조작하는 것이 바람직할 수 있다. 실제로, 임상 후보는 분해 속도에 영향을 줄 수 있는 Asn-94 치환을 통해 Fab1 및 Fab2에서 생성되었다. 따라서, Asn 잔기가 항원 결합에 밀접하게 관련되어 잔기가 불변인 경우, 서열 맥락을 변경하면 표적 결합 친화도를 유지하면서 분자를 안정화시킬 수 있다. 이는 모항체 Fab2보다 불안정한 결합의 가수분해 속도가 4배 더 느린 비인간 프레임워크에 CDR이 이식된 Fab4 분자로 입증되었다. 대안적으로, 후보는 이 서열 모티프가 결여된 개발을 위해 선택될 수 있거나, Asn-Pro를 갖는 분자의 경우, 이 절단 반응에 대한 인실리코 위험 평가를 받게 된다.
IX. 추가 고려 사항
본 개시내용의 일부 실시예는 하나 이상의 데이터 프로세서를 포함하는 시스템을 포함한다. 일부 실시예에서, 시스템은 하나 이상의 데이터 프로세서 상에서 실행될 때 하나 이상의 데이터 프로세서로 하여금 여기서 개시된 하나 이상의 방법 중 일부 또는 전부 및/또는 하나 이상의 프로세서 중 일부 또는 전부를 수행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독형 저장 매체를 포함한다. 본 개시내용의 일부 실시예는 하나 이상의 데이터 프로세서 상에서 실행될 때 하나 이상의 데이터 프로세서로 하여금 여기서 개시된 하나 이상의 방법 중 일부 또는 전부 및/또는 여기서 개시된 하나 이상의 프로세스의 일부 또는 전부를 수행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 기계 판독형 저장 매체로 유형으로 구현되는 컴퓨터-프로그램 프로덕트를 포함한다.
사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로 사용되며 제한이 없으며, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 도시 및 설명된 특징 또는 그 일부의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 수정이 가능하다는 것이 인정된다. 따라서, 청구된 바와 같은 본 발명이 실시예 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 여기에 개시된 개념의 수정 및 변형이 당업자에 의해 의지될 수 있고, 그러한 수정 및 변형이 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 이해해야 한다.
뒤 이은 설명은 단지 바람직한 예시적인 실시 형태를 제공하며, 본 개시내용의 범위, 적용 가능성 또는 구성을 제한하도록 의도되지 않는다. 오히려, 바람직한 예시적인 실시예의 뒤 이은 설명은 다양한 실시예를 구현하기 위한 가능한 설명을 통상의 기술자에게 제공할 것이다. 첨부된 특허청구범위에 기재된 정신 및 범위를 벗어나지 않고 요소의 기능 및 배열에 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
실시예의 완전한 이해를 제공하기 위해 다음 설명에서 특정 세부사항이 제공된다. 그러나, 이러한 특정 세부사항 없이 실시예가 실시될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 회로, 시스템, 네트워크, 프로세스 및 그 밖의 다른 구성요소는 실시예를 불필요한 세부 사항으로 모호하게 하지 않기 위해 블록도 형태의 구성요소로 표시될 수 있다. 또 다른 예에서, 잘 알려진 회로, 프로세스, 알고리즘, 구조 및 기술은 실시예를 모호하게 하는 것을 피하기 위해 불필요한 세부 사항 없이 표시될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> PREDICTION OF PEPTIDE CLEAVAGE IN POLYPEPTIDES THROUGH PHYSICS-BASED SIMULATIONS <130> 105253-1248272 (P35708-WO) <150> US 63/051,166 <151> 2020-07-13 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Gln Gln Gly Tyr Gly Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gln Gln Gly Ile Asn Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Glu Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Gln Gln Gly Tyr Gly Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Gln His His Ser Asp Asn Pro Trp Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Gln Gln Thr Tyr Ser Asn Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5

Claims (30)

  1. 측쇄 및 주쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 폴리펩티드 형태에 대해, 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각을 결정하는 단계,
    상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각을 기초로 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 2개의 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이의 친핵성 공격 거리를 결정하는 단계이며, 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 하나는 상기 아미노산의 측쇄에 있고 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 다른 하나는 상기 아미노산의 주쇄에 있는 것인 단계,
    상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 친핵성 공격 거리를 기초로 상기 폴리펩티드 형태가 절단 반응에 민감한 반응성 형태임을 결정하는 단계,
    상기 폴리펩티드 형태가 반응성 형태임을 결정하는 단계에 반응하여, 상기 반응성 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 결정하는 단계, 및
    상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 기초로 상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계
    를 포함하는 컴퓨터-구현 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 표현을 생성하는 단계, 및
    상기 표현을 사용한 분자 역학 시뮬레이션을 실시하는 단계
    를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 분자 역학 시뮬레이션을 실시한 결과는 상기 폴리펩티드 형태를 포함한 폴리펩티드에 대한 일련의 폴리펩티드 형태를 포함하는 것인 컴퓨터-구현 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇히는 결과로서 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 컴퓨터-구현 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 출력하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 컴퓨터-구현 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초하여 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드의 목록으로부터 상기 폴리펩티드를 제거하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 컴퓨터-구현 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초하여 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드의 목록에서 상기 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드보다 낮게 순위를 매기는 단계
    를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 다른 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률이 상기 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률보다 적은 것인 컴퓨터-구현 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계는
    만족 시, 상기 폴리펩티드의 아미드기가 주변 용매로부터의 용매 분자와 결합할 수 있는 임계값 초과의 공간적 접근성을 갖는 것을 나타내는 접근성 제약조건을 식별하는 단계, 및
    상기 반응성 형태에 대하여, 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 공간적 특성을 평가하는 것에 기초하여 상기 접근성 제약조건이 충족됨을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터-구현 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 형태가 반응성 형태임을 결정하는 단계는
    만족 시, 상기 측쇄 내의 원자가 상기 주쇄 내의 다른 원자의 소정의 거리 임계값 내에 있음을 나타내는 거리 기준을 결정하는 단계, 및
    상기 반응성 형태의 아미노산의 친핵성 공격 거리와 상기 소정의 거리 임계값 사이의 비교를 기준으로 상기 반응성 형태에 대해 상기 거리 기준이 충족됨을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터-구현 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 자유 에너지는 상기 반응성 형태 내에서 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지 프로파일의 분석을 기반으로 결정되고,
    상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각의 공간에서 자유 에너지 프로파일은 빈(bin) 모집단으로부터 계산되는 것인 컴퓨터-구현 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계는
    만족 시, 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지가 소정의 에너지 임계값 내에 있음을 나타내는 에너지 기준을 결정하는 단계, 및
    상기 반응성 형태 내에서 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지와 상기 소정의 에너지 임계값 사이의 비교를 기준으로 상기 에너지 기준이 상기 반응성 형태에 대해 만족함을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터-구현 방법.
  11. 하나 이상의 데이터 프로세서, 및
    상기 하나 이상의 데이터 프로세서 상에서 실행될 때, 상기 하나 이상의 데이터 프로세서로 하여금 동작을 수행하게 하는 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독형 저장 매체
    를 포함하며,
    상기 동작은:
    측쇄 및 주쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 폴리펩티드 형태에 대해, 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각을 결정하는 단계,
    상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각을 기초로 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 2개의 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이의 친핵성 공격 거리를 결정하는 단계이며, 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 하나는 상기 아미노산의 측쇄에 있고 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 다른 하나는 상기 아미노산의 주쇄에 있는 것인 단계,
    상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 친핵성 공격 거리를 기초로 상기 폴리펩티드 형태가 절단 반응에 민감한 반응성 형태임을 결정하는 단계,
    상기 폴리펩티드 형태가 반응성 형태임을 결정하는 단계에 반응하여, 상기 반응성 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 결정하는 단계, 및
    상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 기초로 상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계
    를 포함하는 것인 시스템.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 폴리펩티드의 표현을 생성하는 단계, 및
    상기 표현을 사용한 분자 역학 시뮬레이션을 실시하는 단계
    를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 분자 역학 시뮬레이션을 실시한 결과는 상기 폴리펩티드 형태를 포함한 폴리펩티드에 대한 일련의 폴리펩티드 형태를 포함하는 것인 시스템.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇히는 결과로서 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 시스템.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 출력하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 시스템.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초하여 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드의 목록으로부터 상기 폴리펩티드를 제거하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 시스템.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초하여 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드의 목록에서 상기 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드보다 낮게 순위를 매기는 단계
    를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 다른 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률이 상기 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률보다 적은 것인 시스템.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계는
    만족 시, 상기 폴리펩티드의 아미드기가 주변 용매로부터의 용매 분자와 결합할 수 있는 임계값 초과의 공간적 접근성을 가짐을 나타내는 접근성 제약조건을 식별하는 단계, 및
    상기 반응성 형태에 대하여, 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 공간적 특성을 평가하는 것에 기초하여 상기 접근성 제약조건이 충족됨을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 시스템.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 형태가 반응성 형태임을 결정하는 단계는
    만족 시, 상기 측쇄 내의 원자가 상기 주쇄 내의 다른 원자의 소정의 거리 임계값 내에 있음을 나타내는 거리 기준을 결정하는 단계, 및
    상기 반응성 형태의 아미노산의 친핵성 공격 거리와 상기 소정의 거리 임계값 사이의 비교를 기준으로 상기 반응성 형태에 대해 상기 거리 기준이 충족됨을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 시스템.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 자유 에너지는 상기 반응성 형태 내에서 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지 프로파일의 분석을 기반으로 결정되고,
    상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각의 공간에서 자유 에너지 프로파일은 빈 모집단으로부터 계산되는 것인 시스템.
  20. 제11항에 있어서,
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계는
    만족 시, 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지가 소정의 에너지 임계값 내에 있음을 나타내는 에너지 기준을 결정하는 단계, 및
    상기 반응성 형태 내에서 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지와 상기 소정의 에너지 임계값 사이의 비교를 기준으로 상기 에너지 기준이 상기 반응성 형태에 대해 만족함을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 시스템.
  21. 하나 이상의 데이터 프로세서로 하여금 동작을 수행하게 하도록 구성된 명령을 포함하는 비일시적 기계 판독형 저장 매체에서 유형적으로 구현되는 컴퓨터 프로그램 제품이며,
    상기 동작은
    측쇄 및 주쇄를 갖는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 폴리펩티드 형태에 대해, 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각을 결정하는 단계,
    상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각을 기초로 상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 2개의 원자, 작용기 또는 이들의 조합 사이의 친핵성 공격 거리를 결정하는 단계이며, 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 하나는 상기 아미노산의 측쇄에 있고 상기 2개의 원자 또는 작용기 중 다른 하나는 상기 아미노산의 주쇄에 있는 것인 단계,
    상기 폴리펩티드 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 친핵성 공격 거리를 기초로 상기 폴리펩티드 형태가 절단 반응에 민감한 반응성 형태임을 결정하는 단계,
    상기 폴리펩티드 형태가 반응성 형태임을 결정하는 단계에 반응하여, 상기 반응성 형태 내에 있는 동안 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 결정하는 단계, 및
    상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지를 기초로 상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 폴리펩티드의 표현을 생성하는 단계, 및
    상기 표현을 사용한 분자 역학 시뮬레이션을 실시하는 단계
    를 포함하고,
    여기서 상기 분자 역학 시뮬레이션을 실시한 결과는 상기 폴리펩티드 형태를 포함한 폴리펩티드에 대한 일련의 폴리펩티드 형태를 포함하는 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇히는 결과로서 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 출력하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초하여 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드의 목록으로부터 상기 폴리펩티드를 제거하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 동작은
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률에 기초하여 치료제의 적어도 일부로서 사용될 가능성이 있는 폴리펩티드의 목록에서 상기 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드보다 낮게 순위를 매기는 단계
    를 포함하고,
    여기서 상기 다른 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률이 상기 폴리펩티드에 대하여 상기 아미노산의 측쇄가 상기 적어도 하나의 반응성 형태 내에 갇힐 확률 및/또는 상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률보다 적은 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
  27. 제23항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 화학적으로 분해될 확률을 예측하는 단계는
    만족 시, 상기 폴리펩티드의 아미드기가 주변 용매로부터의 용매 분자와 결합할 수 있는 임계값 초과의 공간적 접근성을 가짐을 나타내는 접근성 제약조건을 식별하는 단계, 및
    상기 반응성 형태에 대하여, 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 공간적 특성을 평가하는 것에 기초하여 상기 접근성 제약조건이 충족되는지를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
  28. 제21항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 형태가 반응성 형태임을 결정하는 단계는
    만족 시, 상기 측쇄 내의 원자가 상기 주쇄 내의 다른 원자의 소정의 거리 임계값 내에 있음을 나타내는 거리 기준을 결정하는 단계, 및
    상기 반응성 형태의 아미노산의 친핵성 공격 거리와 상기 소정의 거리 임계값 사이의 비교를 기준으로 상기 반응성 형태에 대해 상기 거리 기준이 충족됨을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
  29. 제21항에 있어서,
    상기 자유 에너지는 상기 반응성 형태 내에서 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지 프로파일의 분석을 기반으로 결정되고,
    상기 주쇄에 대한 2면각 및 상기 측쇄에 대한 2면각의 공간에서 자유 에너지 프로파일은 빈 모집단으로부터 계산되는 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
  30. 제21항에 있어서,
    상기 아미노산의 측쇄가 상기 반응성 형태 내에 갇힐 확률을 예측하는 단계는
    만족 시, 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지가 소정의 에너지 임계값 내에 있음을 나타내는 에너지 기준을 결정하는 단계, 및
    상기 반응성 형태 내에서 상기 아미노산의 주쇄에 대한 2면각 및 상기 아미노산의 측쇄에 대한 2면각의 자유 에너지와 상기 소정의 에너지 임계값 사이의 비교를 기준으로 상기 에너지 기준이 상기 반응성 형태에 대해 만족함을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터 프로그램 제품.
KR1020237002111A 2020-07-13 2021-07-12 물리 기반 시뮬레이션을 통한 폴리펩티드 내 펩티드 절단의 예측 KR20230038490A (ko)

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