JP2008543810A - 抗原コンジュゲート及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、医学の分野、公衆衛生、免疫学、分子生物学及びウイルス学におけるものである。本発明は、本発明の少なくとも１の抗原に連結されるウイルス様粒子(ＶＬＰ)を含んでなる組成物であり、本発明の該抗原は本発明のＣＣＲ５、本発明のガストリン、本発明のＣＸＣＲ４、本発明のＣＥＴＰ又は本発明のＣ５ａである組成物を提供する。また、本発明は組成物の生産方法を提供する。本発明の組成物は、特に、本発明の抗原が症状を媒介するか又は症状に関与する疾患の治療のため、特にＡＩＤＳ、胃腸癌、冠状動脈性心臓病又は炎症性疾患の治療のための、ワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、免疫応答、特に抗体応答を効率的に誘導する。さらに、本発明の組成物は、示された前後関係の範囲内で自己特異的な免疫応答を効率的に誘導するために特に有用である。

Description

(発明の背景)
発明の分野
本発明は、医学、公衆衛生、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分野おけるものである。本発明は、本発明の少なくとも１の抗原に結合されるウイルス様粒子(ＶＬＰ)を含んでなる組成物であり、本発明の該抗原が本発明のＣＣＲ５、本発明のガストリン、本発明のＣＸＣＲ４、本発明のＣＥＴＰ又は本発明のＣ５ａである組成物を提供する。
また、本発明は、組成物の生産方法を提供する。本発明の組成物は、特に、本発明の抗原が症状を媒介するか又は症状に関与する疾患の治療のため、特にエイズ、胃腸癌、冠状動脈性心臓病又は炎症性疾患の治療のための、ワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、免疫応答、特に抗体応答を効率的に誘導する。さらに、本発明の組成物は、示された前後関係の範囲内で自己特異的な免疫応答を効率的に誘導するために特に有用である。

関連技術
背景
ＨＩＶ Ｒ５株は、マクロファージ及びＣＤ４＋Ｔ細胞への接着及び侵入のために細胞表面分子ＣＤ４及びＣＣＲ５を使用する。ＣＣＲ５は、それぞれ、順にＰＮｔ、ＥＣＬ-１、ＥＣＬ-２及びＥＣＬ-３と称される、細胞外間隙に露出したＮ末端配列と３つのループを有する７膜貫通レセプターである。天然のＣＣＲ５リガンド、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１β及びその類似体はウイルス-コレセプター相互作用をブロックすることができ、さらに、ＣＣＲ５の内部移行を引き起こす(Lederman等, 2004, Science 306, p485)。ＣＣＲ５特異的自己抗体は、ＨＩＶに繰り返し曝されたが感染してない１２．５％の女性において発見された(Lopalco等, 2000, J. Immunology 164, 3426)。これらの抗体は、ＣＣＲ５の第一細胞外ループ(ＥＣＬ-１)を結合することが示され、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)のＲ５親和性ＨＩＶ感染を阻害することができた。女性の同種異系免疫化により、Ｒ５-ＨＩＶ感染をインビトロで阻害することができるＣＣＲ５特異的抗体が生じた(Wang等, 2002, Clin. Exp. Immunol. 129, 493)。

モノクローナルα-ＣＣＲ５抗体はインビトロでＨＩＶ感染を予防することが可能である(Olson等, 1999, J. Virol. 73, 4145；Wu and LaRosa等, 1997, J. Exp. Med. 186, 1373)。小細胞外ループＥＣＬ-２Ａに対応する環状ペプチド(Ａｒｇ１６８-Ｃｙｓ１７８)に対する抗体結合は、ＨＩＶ−１ Ｒ５の感染を抑制した(Misumi等, 2001, J. Virol. 75, 11614)。線形ＣＣＲ５ペプチド(Ｎ末端、ＥＣＬ-１又はＥＣＬ-２配列から)によりサルを免疫化をすることによって生産される抗体は、インビトロでのウイルス阻害作用を有する(Lehner等, 2001, J. Immunology 166, 7446)。ＣＣＲ５のＮ末端ドメインは、パピローマウイルス様粒子上に提示され、サルを免疫化した(Chackerian等, 2004, J. Virol. 78, 4037)。
ＬＥＳＴＲ又はフーシンとも称されるケモカインレセプターＣＸＣＲ４は、７-膜貫通ドメインＧ-タンパク質カップリングレセプターのファミリーに属する(Federsppiel等 (1993), Genomics 16:707)。ＣＸＣＲ４は、すべてのＢ細胞及び単球、大多数のＴリンパ球サブセット、内皮細胞及び上皮細胞を含むほとんどの白血球群の細胞表面上に発現される(Murdoch, (2000) Immunol. Rev. 177: 175)。ＣＸＣＲ４の唯一公知のリガンドはＳＤＦ-１である(Pelchen-Mattews,等 (1999) Immunol. Rev. 168: 33)。

後にＣＸＣＲ４はＨＩＶのコレセプターとして同定された (Feng等 (1996) Science 272:872)。したがって、細胞内に侵入するために必要なＣＸＣＲ４がＸ４株として分類され、この侵入がＳＤＦ-１によってブロックされうるＨＩＶ株は、ＨＩＶ−１侵入をブロックすることが示されている(Oberlin等 (1996), Nature 382:833；Bleul,等 (1996) Nature 382:829。
いくつかのＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニストが同定されており、Ｘ４ ＨＩＶ−１株の侵入及び感染を阻害することが示されている(Murakami等 (1997) J Exp Med 186:1389；Arakaki等 (1999). J Virol 73:1719；Doranz等 (2001) AIDS Res Hum Retroviruses 17:475；Doranz,等 (1997) J Exp Med 186:1395；Schols, D. (2004), Curr Top Med Chem 4:883。加えて、ＨＩＶ-１及びＨＩＶ-２複製の強力かつ選択的な阻害剤である小化学化合物ＡＭＤ３１００は、ＣＸＣＲ４に特異的であることが示されている(De Clercq (2003) Nat Rev Drug Discov 2:581)。さらに、ＣＸＣＲ４の異なる細胞外ドメインを標的とする抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体は、ＨＩＶ-１感染を阻害することが示された(Endres等 (1996) Cell 87:745；Brelot等 (1997), J Virol 71:4744；Misumi等 (2003), J Biol Chem 278:32335；Xiao等 (2000), Exp Mol Pathol 68:139)。

ガストリン(Ｇ１７)は、大腸及び膵臓の微量な典型的な腸ペプチドホルモンの一群である(Koh, Regulatory Peptides. 93, 37-44 (2000))。ガストリンはその前駆体プロガストリン(Ｇ３４)からプロセシングされる。ガストリン及びプロガストリンは、Ｃ末端グリシン伸長形態及びＣ末端フェニルアラニンアミド化形態で存在する。(Steel. IDrugs. 5, 689-695 (2002))。
ガストリンは、胃酸分泌を刺激する能力がよく知られている(Pharmacol Ther. 98, 109-127 (2003))。ガストリンとしてＣ末端テトラペプチドアミドを有する、関連したホルモンコレシストキニン(ＣＣＫ)は、十二指腸において合成され、膵酵素分泌を担う。アミド化Ｇ１７がＣＣＫ-２レセプターと結合するのに対して、ＣＣＫはＣＣＫ-１レセプター及びＣＣＫ-２レセプターの両方に結合する(Steel. IDrugs. 5, 689-695 (2002))。グリシン伸長ガストリンのレセプターは不明なままである。近年のデータから、ガストリンが胃腸管の癌の発達を促進しうることが示唆される(Watson. Aliment Pharmacol Ther. 14, 1231-1247 (2000)；Watson. Aliment Pharmacol Ther. 14, 1231-1247 (2000))。

補体系の活性化は多くの強力な生体学的な影響を誘導し、その多くはアナフィラトキシンＣ５ａに媒介される。補体の第５の構成成分(Ｃ５)は、Ｃ５転換酵素によってＣ５ａ及びＣ５ｂの２つの断片に切断する。
７４-アミノ酸、４-ヘリックス束糖タンパク質であるＣ５ａ(Fernandez及びHugli, J. Biol. Chem. 253, 6955-6964, 1978)は、細胞系、特に好中球、内皮細胞及びマクロファージに対する多くの多様な作用の生成を担い、局所的な炎症を誘導し、感染性の微生物と戦う(Ward P., Nat.Rev. Immunol. 4:133, 2004)。しかしながら、そのうえ、敗血症におけるＣ５ａの過剰な生成は好中球の深刻な機能的欠損につながる(Czermak等, Nat. Med. 5: 788, 1999；Huber-Lang等, J. Immunol. 166:1193, 2001)。

また、Ｃ５ａの高い活性化は、多くの原発性及び／又は慢性炎症性疾患、例えば関節リウマチ(Jose P. Ann Rheum. Dis. 49: 747, 1990)、乾癬(Takematsu H., Arch. Dermatol. 129:74, 1993)、成人呼吸窮迫症候群(Langlois P., Heart Lung 18:71, 1989)、再灌流障害(Homeister, J. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34:17, 1994)、ループス腎炎及び類天疱瘡に関係していた。
Ｃ５に結合してその切断を遮断してＣ５ａとＣ５ｂの生成を減少させる抗体は、例えば、糸球体腎炎(国際公開第9529697号)、喘息(国際公開第04022096号)、コラーゲン誘導性関節炎(Wang等, Proc. Natl. Acad. Sci., 92:8955, 1995)及び血清転移関節炎(Ji等, Immunity, 16:157, 2002)などの症状の治療への使用が提案されている。Ｃ５ａに特異的に結合する抗体は、成人呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)(国際公開第8605692号)及び有害な血管内補体活性化(欧州特許第245993号)の治療への使用が提案されている。また、Ｃ５ａＲの細胞外ループに反応性があり、これによっておそらくＣ５ａＲによるＣ５ａの結合を低減するか又は阻害するモノクローナル抗体の、免疫病理学的な疾患(国際公開第2003062278号)の治療への使用が提案されている。

コレステロールエステル転移タンパク質(ＣＥＴＰ)は、高密度リポタンパク質(ＨＤＬ)粒子とアポＢ豊富な粒子、例えば超低密度リポタンパク質(ＶＬＤＬ)粒子又は低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)粒子間のコレステロールエステル(ＣＥ)及びトリグリセライド(ＴＧ)の転移を媒介する血漿糖タンパク質である。ＣＥＴＰもリン脂質(ＰＬ)を転移する。ヒトＣＥＴＰｃＤＮＡは、４７６のアミノ酸のタンパク質をコードする。
ＨＤＬコレステロールレベルと冠状動脈性心臓病(ＣＨＤ)との負の相互関係が観察されているので(Barter P.J.及びRye K.-A. (1996) Atherosclerosis 121: 1-12)、ＨＤＬは抗アテローム生成性であると考えられる。
国際公開第９６／３９１６８号は、ＣＥＴＰの活性を阻害する免疫応答を刺激することによるＨＤＬ-ｃの増加方法を開示している。また、ＣＥＴＰ抗原に対する免疫化は、米国公開特許第２００３／００２６８０８号に記述されている。ＣＥＴＰポリペプチドは「ＭＡＰ」に融合させて、ウサギの免疫化のためにフロイント完全アジュバント(ＣＦＡ)に乳化した。また、Ｂ型肝炎コア抗原(ＨＢｃＡｇ)へのＣＥＴＰペプチドの融合は、米国公開特許第２００３／００２６８０８号に開示されているが、コンストラクトの免疫原性は報告されなかった。

(発明の概要)
現在のところ我々は、驚くべきことに、少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメイン又は少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメイン断片を含んでなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、免疫応答、特に抗体応答を誘導することが可能であり、ＣＣＲ５に対して高い抗体価が生じたことを発見した。さらに、我々は驚くべきことに、少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメイン又は少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメイン断片を含んでなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、免疫応答、特に抗体応答を誘導することが可能であり、ＨＩＶ感染に対して防護的及び／又は治療的効果を有することを発見した。したがって、これは、発明の組成物及びワクチンそれぞれによって生成される免疫応答、特に抗体が、インビボでＣＣＲ５を特異的に認識して、ＨＩＶコレセプターとしてその機能を干渉することができることを示す。
ゆえに、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原とを含んでなる組成物であり、このとき該少なくとも１の抗原がＣＣＲ５細胞外ドメインないしはＣＣＲ５細胞外ドメイン断片又はその何れかの組合せであり、そして(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位で連結され、好ましくは規則的で反復性の抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な一実施態様では、本発明の使用のために好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んでなる。

好適な実施態様では、本発明は、(a) 少なくとも２の第一付着部位を有するＲＮＡ-バクテリオファージのウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、(b) 少なくとも２の第二付着部位を有する少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔ；とを含んでなり、このとき該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔが、(i) Ｎｔａドメイン又はＮｔａドメイン断片、と、(ii) 配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７を含んでなるＮｔｂドメイン(配列番号：５６)又は配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７を含んでなるＮｔｂドメイン断片を含んでなり、このとき該Ｎｔａドメインないしは該Ｎｔａドメイン断片のＣ末端が該Ｎｔｂドメインないしは該Ｎｔｂドメイン断片のＮ末端に好ましくは直接融合しており、少なくとも２の第二付着部位の一つ目又は二つ目がスルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含んでなるかスルフヒドリル基そのものであり、そして、該少なくとも２の第二付着部位の一つ目は、配列番号：２７の該アミノ酸２３〜２７のＮ末端の上流位置し；そして、該少なくとも２の第二付着部位の二つ目は、該配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７のＣ末端の下流、好ましくは該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔのＣ末端の下流に位置し；そして、該ＲＮＡ-バクテリオファージの該VLPと該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔが少なくとも１の非ペプチド共有結合によって連結されるものである組成物を提供する。

他の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染を予防及び／又は治療する方法であって、本発明の組成物又は本発明のワクチン組成物のそれぞれがヒトに投与されることを含んでなり、このとき本発明の抗原が本発明のＣＣＲ５である方法を提供する。
現在のところ我々は、驚くべきことに、少なくとも１のＣＸＣＲ４細胞外ドメイン又は少なくとも１のＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片を含んでなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することが可能であり、ＣＸＣＲ４に対して高い抗体価が生じたことを発見した。
ゆえに、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原とを含んでなる組成物であり、このとき該少なくとも１の抗原がＣＸＣＲ４細胞外ドメインないしはＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片又はその何れかの組合せであり、そして(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位で連結され、好ましくは規則的で反復性の抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な一実施態様では、本発明の使用のために好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んでなる。

現在のところ我々は、驚くべきことに、少なくとも１のＣＥＴＰタンパク質又は少なくとも１のＣＥＴＰタンパク質断片を含んでなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することが可能であり、ＣＥＴＰに対して高い抗体価が生じたことを発見した。
ゆえに、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原とを含んでなる組成物であり、このとき該少なくとも１の抗原がＣＥＴＰタンパク質ないしはＣＥＴＰ断片であり、そして(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位で連結され、好ましくは規則的で反復性の抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な一実施態様では、本発明の使用のために好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んでなる。

現在のところ我々は、驚くべきことに、少なくとも１のＣ５ａタンパク質又は少なくとも１のＣ５ａ断片を含んでなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することが可能であり、Ｃ５ａに対して高い抗体価が生じたことを発見した。さらに、我々は驚くべきことに、少なくとも１のＣ５ａタンパク質又は少なくとも１のＣ５ａ断片を含んでなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することが可能であり、Ｃ５ａが重要な役割を担う関節炎などの原発性及び／又は慢性の炎症性疾患に対して防護的及び／又は治療的効果を有することを発見した。したがって、これは、発明の組成物及びワクチンそれぞれによって生成される免疫応答、特に抗体が、インビボでＣ５ａを特異的に認識して、その機能を干渉することができることを示す。
ゆえに、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原とを含んでなる組成物であり、このとき該少なくとも１の抗原がＣ５ａタンパク質ないしはＣ５ａ断片であり、そして(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位で連結され、好ましくは規則的で反復性の抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な一実施態様では、本発明の使用のために好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んでなる。

本発明は、疾患を治療するためにＣ５ａに対するモノクローナル抗体を用いる従来技術よりも有益である。モノクローナル抗体療法の欠点には、大量の抗体を繰り返し注入する必要性があることなどである(Kaplan, Curr Opin Invest. Drugs. 2002; 3:1017-23)。高用量の抗体は注入疾患などの副作用を引き起こしうる。ヒト又はヒト化抗体が用いられる場合であっても、抗抗体はまた、アロタイプ応答の患者において生成され得、治療効果の減退又は潜在的な副作用を引き起こす。さらに、ヒト化モノクローナル抗体の産生費用の高さと度重なる受診の必要性にかかわる出費によって、この抗体治療が困っている多くの患者に利用できなくなる。
一態様では、本発明は、原発性及び／又は慢性炎症性疾患を予防及び／又は治療する方法であって、本発明の組成物又は本発明のワクチン組成物それぞれが動物又はヒトに投与されることを含んでなり、このとき本発明の抗原は本発明のＣ５ａである方法を提供する。Ｃ５ａが症状を媒介又は関与する原発性及び／又は慢性炎症性疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、喘息及び類天疱瘡を含むが、これに限定されるものではない。

一態様では、本発明は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原とを含んでなる組成物であり、このとき該少なくとも１の抗原が本発明のブラジキニンであり、そして(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位で連結され、好ましくは規則的で反復性の抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な一実施態様では、本発明の使用のために好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んでなる。
一態様では、本発明は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原とを含んでなる組成物であり、このとき該少なくとも１の抗原が本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンであり、そして(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位で連結され、好ましくは規則的で反復性の抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な一実施態様では、本発明の使用のために好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んでなる。

現在のところ我々は、驚くべきことに、少なくとも１のガストリンＧ１７、ガストリンＧ１７の少なくとも１の断片、プロガストリンＧ３４、又はプロガストリンＧ３４の少なくとも１の断片を含んでなる本発明の組成物及びワクチンそれぞれが、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することが可能であり、ガストリン又はプロガストリンに対して高い抗体価が生じたことを発見した。
ゆえに、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原とを含んでなる組成物であり、このとき該少なくとも１の抗原がガストリンＧ１７、ガストリンＧ１７の断片、プロガストリンＧ３４、又はプロガストリンＧ３４の断片であり、そして(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位で連結され、好ましくは規則的で反復性の抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な一実施態様では、本発明の使用のために好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んでなる。

他の態様では、本発明はワクチンの組成物であり、該ワクチンの組成物は本発明の少なくとも１の抗原を含んでなる組成物を提供する。さらに、本発明は、ヒト又は動物、好ましくは哺乳動物にワクチン組成物が投与される方法を提供する。本発明のワクチン組成物は、少なくとも１のアジュバントなしで、強力な免疫応答、特に抗体応答を誘導することが可能である。ゆえに、好適な一実施態様では、ワクチン組成物はアジュバントを欠いている。アジュバントの使用の回避により、望ましくない炎症性Ｔ細胞応答の発生可能性を低減しうる。
更なる態様では、本発明は、本発明の組成物と受容可能な製薬的担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
より更なる態様では、本発明は、本発明の組成物の産生方法であって、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するＶＬＰを供給すること；(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原を供給すること；そして、(c) 前記組成物を生産するために該ＶＬＰと該少なくとも１の抗原を連結することを含んでなり、ここで該少なくとも１の抗原と該ＶＬＰが該少なくとも１の第一付着部位と該少なくとも１の第二付着部位により連結される、方法を提供する。

(発明の詳細な説明)
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと、同じ意味を有する。
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示された場合に、抗体又はＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)に結合されうる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するようにＴ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系に認識されることができ、及び／又は、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に存在することが必要でありうる。抗原は、１つ又は複数のエピトープ(Ｂ及びＴエピトープ)を有しうる。上記の特異的な反応とは、抗原が、好ましくは典型的には非常に選択的な様式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発されうる多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意図する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。
抗原性部位：本明細書中において相互に交換可能に用いられる「抗原性部位」なる用語及び「抗原性エピトープ」なる用語は、ＭＨＣ分子の関係においてＴ細胞レセプター又は抗体によって免疫特異的に結合されうるポリペプチドの連続的な又は非連続的な部位を意味する。免疫特異的な結合は、非特異的な結合が除外されるが必ずしも交差反応を除外するものではない。典型的に、抗原性部位は、抗原性部位に特有の空間的な立体構造内に５〜１０のアミノ酸を含有する。

本発明の抗原：本明細書中で用いられる「本発明の抗原」なる用語は、ａ) 本発明のＣＣＲ５；ｂ) 本発明のＣＸＣＲ４；ｃ) 本発明のＣＥＴＰ；ｄ) 本発明のＣ５ａ；ｅ) 本発明のガストリン；ｆ) 本発明のブラジキニン；及び、ｇ) 本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンからなる群から選択される抗原を指す。
本発明のＣＣＲ５：本明細書中で用いられる「本発明のＣＣＲ５」なる用語は、本明細書で定義される少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメイン、少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメイン断片又はその任意の組合せに関する。
ＣＣＲ５細胞外ドメイン：本明細書中で用いられる「ＣＣＲ５細胞外ドメイン」なる用語は、配列番号：２４のヒトＣＣＲ５の４つの細胞外ドメインの何れか一つ又は任意の他の動物、好ましくは哺乳動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、本明細書中で用いる「ＣＣＲ５細胞外ドメイン」なる用語は、上記のＣＣＲ５細胞外ドメインと７０％以上、好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意の天然ないしは人工的に操作した変異体を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、本明細書中で用いる「ＣＣＲ５細胞外ドメイン」なる用語は、限定するものではないが、上記のＣＣＲ５細胞外ドメインのグリコシル化、アセチル化、リン酸化を含む翻訳後修飾を包含する。本明細書中で定義するように、ＣＣＲ５細胞外ドメインは、好ましくは最大２００、さらにより好ましくは最大１００アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、ＣＣＲ５細胞外ドメインは、ＣＣＲ５に特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片：本明細書中で用いる「ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片」なる用語は、本明細書中で定義されるＣＣＲ５細胞外ドメインの少なくとも４、５、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２５又は３０の近接するアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにこれらに６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、本明細書中で用いる「ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片」なる用語は、本明細書中で定義されるＣＣＲ５細胞外ドメインの少なくとも６の近接するアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにこれらに６５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。本明細書中で定義するように、ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片は、好ましくは最大５０、さらにより好ましくは最大３０アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片は、ＣＣＲ５に特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。
ＣＣＲ５細胞外ドメイン及び／又はＣＣＲ５細胞外ドメイン断片の組合せ：「ＣＣＲ５細胞外ドメイン及び／又はＣＣＲ５細胞外ドメイン断片の組合せ」なる用語は、上記のＣＣＲ５細胞外ドメイン及び／又はＣＣＲ５細胞外ドメイン断片の任意の組合せを含んでなるかあるいはこれらからなる任意の実体を包含する。好ましくは、ＣＣＲ５細胞外ドメイン及び／又はＣＣＲ５細胞外ドメイン断片は、１つのポリペプチドへの融合によって結合される。ゆえに、「ＣＣＲ５細胞外ドメイン及び／又はＣＣＲ５細胞外ドメイン断片の組合せ」なる用語は、付加的なアミノ酸をスペーサーとして更に含んでなり、該スペーサーが通常１０、好ましくは６未満のアミノ酸であり、該スペーサーは２つのＣＣＲ５細胞外ドメイン及び／又はＣＣＲ５細胞外ドメイン断片の間にあるものである。

本発明のＣＸＣＲ４：本明細書中で用いる「本発明のＣＸＣＲ４」なる用語は、本明細書で定義される少なくとも１のＣＸＣＲ４細胞外ドメイン、少なくとも１のＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片又はその任意の組合せを指す。
ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン：本明細書中で用いる「ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン」なる用語は、配列番号：２８のヒトＣＸＣＲ４の４つの細胞外ドメインの何れか一つ又は任意の他の動物、好ましくは哺乳動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらにまた、本明細書中で用いる「ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン」なる用語は、上記のＣＸＣＲ４細胞外ドメインと７０％以上、好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意の天然ないしは人工的に操作した変異体を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、本明細書中で用いる「ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン」なる用語は、限定するものではないが、上記のＣＸＣＲ４細胞外ドメインのグリコシル化、アセチル化、リン酸化を含む翻訳後修飾を包含する。本明細書中で定義するように、ＣＸＣＲ４細胞外ドメインは、好ましくは最大２００、さらにより好ましくは最大１００アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、ＣＸＣＲ４細胞外ドメインは、ＣＸＣＲ４に特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片：本明細書中で用いる「ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片」なる用語は、本明細書中で定義されるＣＸＣＲ４細胞外ドメインの少なくとも４、５、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２５又は３０の近接するアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにこれらに６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、本明細書中で用いる「ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片」なる用語は、本明細書中で定義されるＣＸＣＲ４細胞外ドメインの少なくとも６の近接するアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにこれらに６５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。本明細書中で定義するように、ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片は、好ましくは最大５０、さらにより好ましくは最大３０アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。
ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン及び／又はＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片の組合せ：「ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン及び／又はＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片の組合せ」なる用語は、上記のＣＸＣＲ４細胞外ドメイン及び／又はＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片の任意の組合せを含んでなるかあるいはこれらからなる任意の実体を包含する。好ましくは、ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン及び／又はＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片は、１つのポリペプチドへの融合によって結合される。ゆえに、「ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン及び／又はＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片の組合せ」なる用語は、付加的なアミノ酸をスペーサーとして更に含んでなり、該スペーサーが通常１０、好ましくは６未満のアミノ酸であり、該スペーサーは２つのＣＸＣＲ４細胞外ドメイン及び／又はＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片の間にあるものである。

本発明のＣ５ａ：本明細書中で用いる「本発明のＣ５ａ」なる用語は、本明細書で定義される少なくとも１のＣ５ａタンパク質ないしは少なくとも１のＣ５ａ断片又はその任意の組合せに関する。
Ｃ５ａタンパク質：本明細書中で用いる「Ｃ５ａタンパク質」なる用語は、配列番号：４５のヒトＣ５ａ又は任意の他の動物、好ましくは哺乳動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、本明細書中で用いる「Ｃ５ａタンパク質」なる用語は、配列番号：４５のヒトＣ５ａ又は任意の他の動物由来の対応するオルソログと７０％以上、好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意の天然ないしは人工的に操作した変異体を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、本明細書中で用いる「Ｃ５ａタンパク質」なる用語は、限定するものではないが、上記のＣ５ａタンパク質のグリコシル化、アセチル化、リン酸化を含む翻訳後修飾を包含する。本明細書中で定義するように、Ｃ５ａタンパク質は、好ましくは最大２００、さらにより好ましくは最大１００アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、Ｃ５ａタンパク質は、Ｃ５ａに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

Ｃ５ａ断片：本明細書中で用いる「Ｃ５ａ断片」なる用語は、本明細書中で定義されるＣ５ａタンパク質の少なくとも４、５、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２５又は３０の近接するアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにこれらに６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、本明細書中で用いる「Ｃ５ａ断片」なる用語は、本明細書中で定義されるＣ５ａタンパク質の少なくとも６の近接するアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにこれらに６５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。本明細書中で定義するように、Ｃ５ａ断片は、好ましくは最大５０、さらにより好ましくは最大３０アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、Ｃ５ａ断片は、Ｃ５ａに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

本発明のＣＥＴＰ：本明細書中で用いる「本発明のＣＥＴＰ」なる用語は、本明細書で定義される少なくとも１のＣＥＴＰタンパク質ないしは少なくとも１のＣＥＴＰ断片又はその任意の組合せに関する。
ＣＥＴＰタンパク質：本明細書中で用いる「ＣＥＴＰタンパク質」なる用語は、配列番号：３１のヒトＣＥＴＰ又は任意の他の動物、好ましくは哺乳動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、本明細書中で用いる「ＣＥＴＰタンパク質」なる用語は、配列番号：３１のヒトＣＥＴＰ又は任意の他の動物由来の対応するオルソログと７０％以上、好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意の天然ないしは人工的に操作した変異体を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、本明細書中で用いる「ＣＥＴＰタンパク質」なる用語は、限定するものではないが、上記のＣＥＴＰタンパク質のグリコシル化、アセチル化、リン酸化を含む翻訳後修飾を包含する。本明細書中で定義するように、ＣＥＴＰタンパク質は、好ましくは最大５００アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、ＣＥＴＰタンパク質は、ＣＥＴＰに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

ＣＥＴＰ断片：本明細書中で用いる「ＣＥＴＰ断片」なる用語は、本明細書中で定義されるＣＥＴＰタンパク質の少なくとも４、５、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２５又は３０の近接するアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにこれらに６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、本明細書中で用いる「ＣＥＴＰ断片」なる用語は、本明細書中で定義されるＣＥＴＰタンパク質の少なくとも６の近接するアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにこれらに８０％以上、好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。本明細書中で定義するように、ＣＥＴＰ断片は、好ましくは最大５０、さらにより好ましくは最大３０アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、ＣＥＴＰ断片は、ＣＥＴＰに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

本発明のガストリン：本明細書中で用いる「本発明のガストリン」なる用語は、本明細書で定義される少なくとも１のガストリンＧ１７、少なくとも１のガストリンＧ１７の断片、少なくとも１のプロガストリンＧ３４ないしは少なくとも１のプロガストリンＧ３４の断片又はその任意の組合せに関する。
ガストリンＧ１７：本明細書中で用いる「ガストリンＧ１７」なる用語は、Ｃ末端のフェニルアラニンがアミド化された配列番号：３４のガストリン１-１７、配列番号：３４、配列番号：３６のヒトガストリン１-１７又は任意の他の動物、好ましくは哺乳動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、「ガストリンＧ１７」なる用語は、Ｃ末端のフェニルアラニンがアミド化された配列番号：３４のガストリン１-１７、配列番号：３４、配列番号：３６のヒトガストリン１-１７又は任意の他の動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなり、最大３つ、好ましくは最大２つ、より好ましくは１つのアミノ酸が欠失、付加又は置換されている任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、置換は保存的なアミノ酸置換である。ガストリンＧ１７の長さは、５０未満、より好ましくは３０未満のアミノ酸である。典型的かつ好ましくは、ガストリンＧ１７は、ガストリンに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

ガストリンＧ１７の断片：本明細書中で用いる「ガストリンＧ１７の断片」なる用語は、ガストリンＧ１７の少なくとも４、５、好ましくは少なくとも６、７、８、９又は１０の近接するアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、「ガストリンＧ１７の断片」なる用語は、上記のガストリンＧ１７の断片を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなり、少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは最大３つ、更により好ましくは最大２つ、更により好ましくは１つのアミノ酸が欠失、付加又は他のアミノ酸に置換されている任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、置換は保存的なアミノ酸置換である。ガストリンＧ１７の断片の長さは、３０未満、より好ましくは２０未満のアミノ酸である。典型的かつ好ましくは、ガストリンＧ１７の断片は、ガストリンに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

プロガストリンＧ３４：本明細書中で用いる「プロガストリンＧ３４」なる用語は、Ｃ末端のフェニルアラニンがアミド化されたガストリン１-３４、配列番号：３５、配列番号：３７のヒトガストリン１-３４又は任意の他の動物、好ましくは哺乳動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。「プロガストリンＧ３４」なる用語は、Ｃ末端のフェニルアラニンがアミド化されたガストリン１-３４、配列番号：３５、配列番号：３７のヒトガストリン１-３４又は任意の他の動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなり、最大５つ、好ましくは最大４つ、より好ましくは最大３つ、好ましくは最大２つ、より好ましくは１つのアミノ酸が欠失、付加又は置換されている任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、置換は保存的なアミノ酸置換である。プロガストリンＧ３４の長さは、６０未満、より好ましくは４０未満のアミノ酸である。典型的かつ好ましくは、プロガストリンＧ３４は、プロガストリンに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

プロガストリンＧ３４の断片：本明細書中で用いる「プロガストリンＧ３４の断片」なる用語は、プロガストリンＧ３４の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のアミノ酸を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、「ガストリンＧ３４の断片」なる用語は、上記のプロガストリンＧ３４の断片を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなり、少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは最大３つ、更により好ましくは最大２つ、更により好ましくは１つのアミノ酸が欠失、付加又は他のアミノ酸に置換されている任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、置換は保存的なアミノ酸置換である。プロガストリンＧ３４の断片の長さは、４０未満、より好ましくは２０未満のアミノ酸である。典型的かつ好ましくは、プロガストリンＧ３４の断片は、プロガストリンに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

本発明のブラジキニン：本明細書中で用いる「本発明のブラジキニン」なる用語は、配列番号：２２のヒトブラジキニン又は任意の他の動物、好ましくは哺乳動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、「本発明のブラジキニン」なる用語は、配列番号：２２のヒトブラジキニン又は任意の他の動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなり、最大２つ、好ましくは１つのアミノ酸が欠失、付加又は他のアミノ酸に置換されている任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、置換は保存的なアミノ酸置換である。本発明のブラジキニンの長さは、好ましくは３０未満、より好ましくは２０未満のアミノ酸である。典型的かつ好ましくは、本発明のブラジキニンは、ブラジキニンに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。
本発明のＤｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニン：本明細書中で用いる「本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニン」なる用語は、配列番号：２３のヒトｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニン又は任意の他の動物、好ましくは哺乳動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなる任意のポリペプチドを包含する。さらに、「本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニン」なる用語は、配列番号：２３のヒトｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニン又は任意の他の動物由来の対応するオルソログを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなり、最大２つ、好ましくは１つのアミノ酸が欠失、付加又は他のアミノ酸に置換されている任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、置換は保存的なアミノ酸置換である。本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンの長さは、好ましくは３０未満、より好ましくは２０未満のアミノ酸である。典型的かつ好ましくは、本発明のブラジキニンは、ｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンに特異的に結合する抗体のインビボでの産生を誘導することが可能である。

結合(以下、会合ともいう) (associated)：本明細書中で用いられる「結合(会合) (associated)」なる用語は、２つの分子がともに結合するすべての可能な方法、好ましくは化学的な相互作用を指す。化学的な相互作用には共有的相互作用及び非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、又は水素結合であり、一方、共有的相互作用は、例として共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−イオウ結合、例えばチオエーテル、又はイミド結合ベースである。

第一付着部位：ここで用いる「第一付着部位」なる用語は、ＶＬＰに天然に生じる又はＶＬＰに人工的に付加される成分であり、第二付着部位が結合する部位を指す。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第一付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、リジンなどのアミノ酸のアミノ基である。第一付着部位は、典型的にはＶＬＰの表面上、好ましくはＶＬＰの外表面上に位置する。多数の第一付着部位が、典型的には反復形状で、ウイルス様粒子の表面上、好ましくは外表面上に存在する。好適な実施態様では、第一付着部位は、少なくとも１の共有結合を介して、好ましくは少なくとも１のペプチド結合を介してＶＬＰと会合(以下、結合ともいう)する。さらに好適な実施態様では、第一付着部位はＶＬＰに天然に生じる。あるいは、他の実施態様では、第一付着部位はＶＬＰに人工的に付加されている。

第二付着部位：ここで用いる「第二付着部位」なる用語は、本発明の抗原に天然に生じる又は本発明の抗原に人工的に付加される成分であり、第一付着部位が結合する部位を指す。本発明の抗原の第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第二付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、好ましくはシステインなどのアミノ酸のスルフヒドリル基である。本発明中で用いる「少なくとも１の第二付着部位を有する本発明の抗原」は、本発明の抗原と少なくとも１の第二付着部位とを含んでなるコンストラクトを指す。好適な一実施態様では、第二付着部位は本発明の抗原内で天然に生じる。他の好適な実施態様では、第二付着部位は本発明の抗原に人工的に付加される。好適な一実施態様では、第二付着部位は、少なくとも１つの共有結合により、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合により本発明の抗原と結合している。好適な一実施態様では、少なくとも１の第二付着部位を有する本発明の抗原はリンカーをさらに含んでなり、好ましくは該リンカーは少なくとも１の第二付着部位を含んでなり、好ましくは該リンカーはペプチド結合によって本発明の抗原に融合する。

コートタンパク質：本出願において、「コートタンパク質」なる用語と交換可能に用いられる「キャプシドタンパク質」なる用語は、ウイルスキャプシド又はＶＬＰ内に内包されうるウイルスタンパク質を指す。典型的かつ好ましくは、「コートタンパク質」なる用語は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのゲノム、又はウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの変異体のゲノムによってコードされるコートタンパク質を指す。より好ましくは、例として、「ＡＰ２０５のコートタンパク質」なる用語は、配列番号１４又は、第一メチオニンが配列番号１４から切断されているアミノ酸配列を指す。より好ましくは、例として、「Ｑβのコートタンパク質」はＮ末端のメチオニンの有無にかかわらず、配列番号１(「Ｑβ ＣＰ」)と配列番号２(Ａ１)を指す。バクテリオファージＱβのキャプシドは主にＱβ ＣＰと少量のＡ１タンパク質からなる。

結合(linked)：ここで用いられる「結合された(以下、連結されたともいう)(その名詞：結合)」なる用語は、可能であれば、好ましくは少なくとも第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位がともに連結する化学的な相互作用を意味する。化学的な相互作用には共有的相互作用や非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用又は水素結合であるのに対して、共有的相互作用は、共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素-リン結合、炭素-イオウ結合、例えばチオエーテル、又はイミド結合ベースのものである。ある好適な実施態様では、第一付着部位と第二付着部位は、少なくとも１の共有結合、好ましくは少なくとも１の非ペプチド結合、よりさらに好ましくは、非ペプチド結合のみを介して結合される。しかしながら、ここで用いられる「結合」なる用語は、少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位の直接結合を包含するだけでなく、選択的に好ましくは、中間分子、及びこれによって典型的かつ好ましくは、少なくとも１の、好ましくは一のヘテロ二官能性架橋剤を介して、少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位との間接的な結合も包含する。

リンカー：本明細書で使用する「リンカー」は、第二付着部位と本発明の抗原を結合させるか、あるいは第二付着部位を既に含むか、実質的に第二付着部位からなるか、第二付着部位からなる。好ましくは、本明細書中で用いる「リンカー」は第二付着部位を、典型的かつ好ましくは、限定するものではないが、一アミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として既に含む。また、本明細書中で用いる「リンカー」は、特に本発明のリンカーが少なくとも１のアミノ酸残基を含有する場合、「アミノ酸リンカー」と称する。したがって、「リンカー」と「アミノ酸リンカー」なる用語は、本明細書中において相互に交換可能に用いられる。しかしながら、この用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好適な実施態様である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを示すことを意味するものではない。リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。したがって、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含有する分子は本発明のリンカーの好適な実施態様であり、このような分子も本発明内に含まれる。さらに、本発明に有用なリンカーは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル、例えばシクロペンチル又はシクロヘキシル、シクロアルケニル、アリール又はヘテロアリール分子を含有する分子である。さらに好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル(Ｃ５、Ｃ６)、アリール、又はヘテロアリール部分と付加的なアミノ酸を含んでなるリンカーも本発明のためのリンカーとして使用可能であり、本発明の範囲内である。本発明の抗原とリンカーの間の会合(結合)は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。本発明の抗原によって天然に第二付着部位が生じない場合には、リンカーは、好ましくは少なくとも１の共有結合により、より好ましくは少なくとも１のペプチド結合により、少なくとも１の第二付着部位、例えばシステインに結合される。

規則的で反復性の抗原アレイ：本明細書で用いる「規則的で反復性の抗原アレイ」なる用語は、一般的に、それぞれウイルス様粒子との関係で抗原中に、典型的に好ましくは非常に規則的に均一に空間的に配置していることに特徴がある、抗原の反復パターンを指す。本発明の一実施態様では、反復パターンは幾何学的パターンである。ＲＮＡファージのＶＬＰなどの本発明の特定の実施態様では、好ましくは１から３０ナノメーターの間隔、好ましくは２から１５ナノメーターの間隔、より好ましくは２から１０ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは２から８ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する、抗原の準結晶性の、厳密に反復的な順序配列を持つ、好適に規則的で反復性の抗原の典型的かつ好ましい例である。
パッケージ化(packaged)(以下、封入ともいう)：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰとの関係でのポリ陰イオン性高分子の状態を指す。本明細書中で用いる「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的カップリング、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などでありうる結合を含む。また、この用語にはポリ陰イオン性高分子の封入ないしは部分的な封入が含まれる。したがって、ポリ陰イオン性高分子を、実際に結合、特に共有結合しなくても、ＶＬＰによって封入することができる。好適な実施態様では、少なくとも１のポリ陰イオン性高分子はＶＬＰ内に、最も好ましくは非共有的様式にてパッケージ化される。

ポリペプチド：本明細書中で用いる「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合(ペプチド結合ともいう)によって、線形に連結される単量体(アミノ酸)からなる分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの産物を指すわけではない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。
組み換えＶＬＰ：本明細書中で用いる「組み換えＶＬＰ」は、組み換えＤＮＡ技術の少なくとも１工程を含んでなる方法によって得られるＶＬＰを指す。本明細書中で用いる「組み換えて生産されるＶＬＰ」なる用語は、組み換えＤＮＡ技術の少なくとも１工程を含んでなる方法によって得られるＶＬＰを指す。ゆえに、「組み換えＶＬＰ」及び「組み換えて生産されるＶＬＰ」なる用語は交換可能に用いられ、同一の意味を有するものである。

ウイルス粒子：本明細書中で用いられる「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形状を意味する。いくつかのウイルス型には、タンパク質キャプシドに囲まれるゲノムを含むものがあり、他のものは付加的な構造(例えばエンベロープ、テイルなど)を有する。
ここで用いられるウイルス様粒子(ＶＬＰ)は、非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指し、又はウイルス粒子、好ましくはウイルスのキャプシドに類似する非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造を指す。本明細書中で用いる「非複製性」なる用語は、ＶＬＰに含まれるゲノムを複製することができないことを意味する。本明細書中で用いる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に侵入できないことを意味する。好ましくは、本発明のウイルス様粒子は、ウイルスゲノムないしはウイルスゲノム機能の全て又は一部を欠いているため、非複製性及び／又は非感染性である。一実施態様では、ウイルス様粒子はウイルス粒子であり、このウイルスゲノムは物理的又は化学的に不活性化されている。典型的かつより好ましくは、ウイルス様粒子はウイルスゲノムの複製性及び感染性の相等物のすべて又は一部を欠いている。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含みうる。本発明のウイルス様粒子の典型的かつ好適な実施態様では、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡファージのウイルスキャプシド等の、ウイルスキャプシドである。「ウイルスキャプシド」又は「キャプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質のサブユニットから構成される巨大分子の集合体を指す。典型的には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウイルスタンパク質サブユニットである。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復して組織化される、ウイルスキャプシド又はウイルスキャプシド様構造が形成される。前記構造は典型的には球状又は管状である。

ウイルス粒子とウイルス様粒子の一つの共通した特徴は、高度に規則的かつ反復性をもって配列したサブユニットである。
ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書中で用いる「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしは断片を含んでなる、好ましくは基本的にこれからなる、あるいはこれからなるウイルス様粒子を指す。さらに、ＲＮＡバクテリオファージの構造に類似するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は非複製性及び／又は非感染性であり、ＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも１の遺伝子、好ましくは複数の遺伝子を欠損しており、及び典型的には、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子を欠損する。しかしながらまた、この定義には、前述の遺伝子又は遺伝子群が存在するが不活性であるため、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子が非複製性及び／又は非感染性となる、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子が包含される。本開示の範囲内で、「サブユニット」及び「単量体」なる用語は、この文脈において相互に交換可能に同等に用いられる。

Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１」、又は「一又は複数」を意味する。
この出願において、抗体は、１０^６Ｍ^−１又はそれ以上、好ましくは１０^７Ｍ^−１又はそれ以上、より好ましくは１０^８Ｍ^−１又はそれ以上、最も好ましくは１０^９Ｍ^−１又はそれ以上の結合親和性(Ｋａ)で抗原と結合するならば、特異的に結合するものと定義される。抗体の親和性は、(例えばスキャッチャード分析により)通常の当業者によって容易に測定され得る。
ポリペプチドのアミノ酸同一性は、ベストフィット(Bestfit)プログラムなどの公知のコンピュータプログラムを用いて常套的に測定することができる。ベストフィットないしは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、好ましくはベストフィットを用いて、特定の配列が例えば参照するアミノ酸配列に対して９５％の同一性があるかどうかを決定するために、参照アミノ酸配列の完全長に対する同一性の割合が算出され、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％以下の相同性にギャップが挿入されるようにパラメータを設定する。ポリペプチド間の同一性の割合を測定する前述の方法は、本発明に開示するすべてのタンパク質、ポリペプチドないしはその断片に適するものである。
当業者に理解されるように、保存的アミノ酸置換には等配性の置換、アミノ酸の荷電、極性、芳香族、脂肪族又は疎水性性質が維持される置換が含まれる。代表的な保存的アミノ酸置換は、以下のグループのうちの１グループ内のアミノ酸間の置換である：Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及び、ＰｈｅとＴｙｒ。

本発明は、動物又はヒトにおける本発明の抗原に対する免疫応答を亢進するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子；と(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原であり、このとき該少なくとも１の抗原が本発明の抗原であり、(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と該少なくとも１の第二付着部位を介して連結しているものである。好ましくは、本発明の抗原はＶＬＰに連結しており、規則的で反復性の抗原-ＶＬＰアレイを形成する。本発明の好適な実施態様では、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも６０、さらにより好ましくは少なくとも１２０及びさらにより好ましくは少なくとも１８０の本発明の抗原がＶＬＰに結合する。
規則的で反復性の構造を有する当分野で公知の任意のウイルスは、本発明のＶＬＰとして選択してもよい。ＶＬＰの調整のために使用されうる具体的なＤＮＡないしＲＮＡウイルスのコート又はキャプシドタンパク質は、国際公開第２００４／００９１２４号の２５頁の１０−２１行目、２６頁の１１−２８行目及び２８頁の４行目から３１頁の４行目に開示されている。これらの開示内容は出典明記により本明細書中に援用される。

ウイルス又はウイルス様粒子は、ウイルス感染した細胞培養物から生産され、精製することができる。ワクチンの目的のために結果として生じるウイルス又はウイルス様粒子は病原性を欠いていることを必要とする。遺伝子工学の他に、物理的方法又は化学的方法、例えばＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理を用いて、ウイルスゲノム機能を不活性化することができる。
好適な一実施態様では、ＶＬＰは組み換えＶＬＰである。ほとんどすべての一般的に公知のウイルスは配列決定されており、公的に容易に入手可能である。コートタンパク質をコードする遺伝子は当業者に容易に同定されうる。宿主内でコートタンパク質を組み換え発現させることによるＶＬＰの調製は、当業者の共通の知識の範囲内である。

好適な一実施態様では、ウイルス様粒子は、a) ＲＮＡファージ；b) バクテリオファージ；c) Ｂ型肝炎ウイルス、好ましくはそのキャプシドタンパク質(Ulrich, 等, Virus Res. 50: 141-182 (1998))又はその表面タンパク質(国際公開公報92/11291)；d) はしかウイルス(Warnes, 等, Gene 160:173-178 (1995))；e) シンドビスウイルス；f) ロタウイルス(米国特許第5,071,651号及び米国特許第5,374,426号)；g) 口蹄疫ウイルス(Twomey, 等, Vaccine 13:1603 1610, (1995))；h) ノーウォークウイルス(Jiang, X., 等, Science 250:1580 1583 (1990)；Matsui, S.M., 等, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))；i) アルファウイルス属；j) レトロウイルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質(国際公開公報96/30523)；k) レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；l) ヒトパピローマウイルス(国際公開公報98/15631)；m) ポリオーマウイルス；n) タバコモザイク病ウイルス；及びo) Ｆｌｏｃｋハウスウイルスからなる群から選択されるウイルスの組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、あるいはこれからなる。
好適な一実施態様では、ＶＬＰは、その組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、これらからなる。一以上のアミノ酸配列を含むかそれらからなるＶＬＰを、本出願ではモザイクＶＬＰと称する。

ここで使用される「組み換えタンパク質の断片」なる用語又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％であり、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、少なくとも１の内部欠失、少なくとも１の切断、又はそれらの少なくとも１の組合せから得られる。「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、上で定義した「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」のそれぞれと、少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子内に集合体化(以下「アセンブリ」ともいう)することができるポリペプチドをさらに包含する。
本発明で交換可能に使用される「変異組み換えタンパク質」なる用語又は「組み換えタンパク質の変異体」なる用語、本発明で交換可能に使用される「変異コートタンパク質」なる用語又は「コートタンパク質の変異体」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれに由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、該アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であり、好ましくはＶＬＰ内に集合化する能力を保持している。

好適な一実施態様では、本発明のウイルス様粒子はＢ型肝炎ウイルスである。Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の調整は、特に国際公開公報00/32227、同01/85208及び同01/056905に開示されている。これら３つすべての文書は出典明記によって本明細書中に特別に援用される。本発明の実施における使用に好適なＨＢｃＡｇの他の変異体は国際公開公報01/056905の３４−３９頁に開示されている。
本発明の更なる好適な一実施態様では、リジン残基はＨＢｃＡｇポリペプチドに導入され、本発明の抗原のＨＢｃＡｇのＶＬＰへの結合を媒介する。好適な実施態様では、本発明の組成物及びＶＬＰは、配列番号２０のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含むか、あるいはこれからなる、ＨＢｃＡｇを用いて調製される。このＨＢｃＡｇは修飾されており、７９番目と８０番目のアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Glyのアミノ酸配列を有するペプチドに置き換わっている。この修飾により配列番号２０から配列番号２１に変化する。更なる好適な実施態様では、配列番号２１又はその対応する断片、好ましくは１−１４４又は１−１４９の４８番目と１１０番目のシステイン残基がセリンに変異される。さらに、本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するＢ型肝炎コアタンパク質変異を含有する組成物を包含する。さらに、本発明は、配列番号２１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含有する組成物及びワクチンのそれぞれを包含する。

好適な一実施態様では、ウイルス様粒子は、ササゲクロロティックモットルウイルス、ササゲモザイクウイルス又はアルファルファ‐モザイクウイルスのものである。これらのウイルスのＶＬＰの生産方法は、米国公開特許第２００５／０２６０７５８号及び国際公開第０５０６７４７８号に記載されている。
本発明の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージのものである。好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージは、a)バクテリオファージＱβ；b)バクテリオファージＲ１７；c)バクテリオファージｆｒ；d)バクテリオファージＧＡ；e)バクテリオファージＳＰ；f)バクテリオファージＭＳ２；g)バクテリオファージＭ１１；h)バクテリオファージＭＸ１；i)バクテリオファージＮＬ９５；k)バクテリオファージｆ２；l)バクテリオファージＰＰ７、及びm)バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有し、該コートタンパク質は、(a) 配列番号：１(Ｑβ ＣＰを指す)；(b) 配列番号：１と配列番号：２の混合物(Ｑβ Ａ１タンパク質を指す)；(c) 配列番号：３；(d) 配列番号：４；(e) 配列番号：５；(f) 配列番号：６、(g) 配列番号：６と配列番号：７の混合物；(h) 配列番号：８；(i) 配列番号：９；(j) 配列番号：１０；(k) 配列番号：１１；(l) 配列番号：１２；(m) 配列番号：１３；及び(n) 配列番号：１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一般的に、上記のコートタンパク質はＮ末端メチオニンの存在の有無にかかわらずＶＬＰ内に集合体化することができる。

本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるモザイクＶＬＰである。
非常に好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージの２つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれらからなるものであり、該２つのコートタンパク質は配列番号：１と配列番号：２、又は配列番号：６と配列番号：７のアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡ-バクテリオファージＱβ、ｆｒ、ＡＰ２０５又はＧＡの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰはＲＮＡファージＱβである。さらに好適な本発明のＲＮＡファージ、特にＱβ及びｆｒのウイルス様粒子は国際公開公報02/056905に開示されており、この開示内容は出典明記により本明細書中に援用される。特に、国際公開公報02/056905の実施例１８にＱβのＶＬＰ粒子の調製について詳しく記載されている。

他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ＲＮＡファージＡＰ２０５のＶＬＰである。また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに、アミノ酸１４のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰのコンピテントアセンブリ変異体型を本発明の実施に使用してもよく、本発明の他の好適な実施態様となる。国際公開公報2004/007538の特に実施例１及び実施例２には、ＡＰ２０５コートタンパク質を含有するＶＬＰの入手方法、とりわけその発現と精製について記載されている。国際公開公報2004/007538は出典明記によって本明細書中に援用される。
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージの変異コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異コートタンパク質は置換及び／又は欠失によって少なくとも１のリジン残基が除去されて修飾されている。他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージの変異コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異コートタンパク質は置換及び／又は挿入によって少なくとも１のリジン残基が付加されて修飾されている。非常に好適な一実施態様では、変異コートタンパク質はＲＮＡファージＱβのものであり、このとき少なくとも１つ、あるいは少なくとも２つのリジン残基が置換又は欠失によって取り除かれている。代替的な実施態様では、変異コートタンパク質はＲＮＡファージＱβのものであり、このとき少なくとも１つ、あるいは少なくとも２つのリジン残基が置換又は挿入によって付加されている。更なる好適な一実施態様では、ＲＮＡファージＱβの変異コートタンパク質は、配列番号：１５〜１９のいずれか一から選択されるアミノ酸配列を有する。

好適な実施態様では、本発明の組成物及びワクチンは、０．５、好ましくは１．０、好ましくは１．２、好ましくは１．６、好ましくは１．９、好ましくは２．２から４．０の抗原密度を有する。ここで使用される「抗原密度」なる用語は、サブユニット当たり、好ましくはＶＬＰのコートタンパク質当たり、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのコートタンパク質当たりに結合する本発明の抗原の平均数を意味するものである。よって、この値は、本発明の組成物又はワクチン中での、ＶＬＰ、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰの単量体又はサブユニット全体の平均として算出される。
さらにまた、ＲＮＡファージコートタンパク質は、細菌宿主内で発現すると自己集合体化することが示されている(Kastelein, RA. 等, Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM. 等, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR. 等, Virology 170:238-242 (1989)、Priano, C. 等, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、ＧＡ (Ni, CZ., 等, Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Tars, K 等, J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及び、ｆｒ (Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)、Liljas, L 等 J Mol. Biol. 244:279-290, (1994))の生物学的及び生化学的性質は開示されている。いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R. 等, Structure 4:543-554 (1996))。そのような情報を用いて、表面に曝された残基を同定して、ＲＮＡファージコートタンパク質を修飾して、一又は複数の反応性のアミノ酸残基を挿入又は置換によって挿入することができる。ＲＮＡファージ由来のＶＬＰの他の利点は、安価で大量の物質を産生することが可能となる細菌での発現回収率が高いことである。

好適な実施態様では、本発明の抗原は、ＣＣＲ５細胞外ドメイン、ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片又は任意の組合せである。本発明の一実施態様では、少なくとも１の抗原はＣＣＲ５細胞外ドメイン断片である。好適な一実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片は、ＣＣＲ５細胞外ドメインＥＣＬ２断片、好ましくはＥＣＬ２Ａを含んでなるか、基本的にこれからなるかあるいはこれからなる。当分野で一般的に理解されるように、ＥＣＬ２Ａは、好ましくはＥＣＬ２のＮ末端の第一アミノ酸から始まり、好ましくはスレオニンで止まり、ヒトＥＣＬ２配列のシステインの直前にあるものである。更に好適な一実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片は配列番号：２５を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。好適な実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片は、環状化されたＣＬ２Ａを含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。更に好適な実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片は環状化された配列番号：２５を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。更に好適な実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片は、環状化された配列番号：２６又は配列番号：５２を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなり、このペプチドが両端のＣ及びＧ残基によって環状化されるものである。本明細書中で用いるように、環状化された配列番号：２５は配列番号.２５を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなり、該アミノ酸配列の最初のアミノ酸残基と最後のアミノ酸残基が少なくとも１の化学結合によって、好ましくは少なくとも１の共有結合によって相互作用するものである。好ましくは、前記アミノ酸配列の最初のアミノ酸残基と最後のアミノ酸残基は、すべての共有結合によって各々の他のアミノ酸残基と相互作用する。好ましくは、前記アミノ酸配列の最初のアミノ酸残基と最後のアミノ酸残基は１つのペプチド結合によって各々の他のアミノ酸残基と相互作用して、円形のペプチドとなる。

本発明の好適な一実施態様では、少なくとも１の抗原はＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔである。更なる好適な一実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは配列番号：２７を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。更なる好適な一実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは、配列番号：２７のＣ末端ないしはＮ末端のいずれかに、好ましくは配列番号：２７のＣ末端に付加的なリンカー、好ましくはシステインが融合している配列番号：２７を含んでなるか、これからなる。なお更なる好適な実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは、配列番号：２７のＣ末端ないしはＮ末端のいずれかに、好ましくは配列番号：２７のＣ末端に付加的なリンカー、好ましくはシステインが融合している配列番号：２７を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなり、配列番号：２７の天然に生じるシステインが他のアミノ酸、好ましくはセリンに置換しているものである。これは、均一なかつ明確な抗原提示を確認するためである。

好適な実施態様では、本発明は、(a) 少なくとも２の第一付着部位を有するＲＮＡ-バクテリオファージのウイルス様粒子；と、(b) 少なくとも２の第二付着部位を有する少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔ；とを含んでなり、このとき該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔが、(i) Ｎｔａドメイン又はＮｔａドメイン断片、と(ii) 配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７を含んでなるＮｔｂドメイン(配列番号：５６)又は配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７を含んでなるＮｔｂドメイン断片を含んでなり、このとき該Ｎｔａドメインないしは該Ｎｔａドメイン断片のＣ末端が該Ｎｔｂドメインないしは該Ｎｔｂドメイン断片のＮ末端に好ましくは直接融合しており、少なくとも２の第二付着部位の一つ目又は二つ目がスルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含んでなるかスルフヒドリル基そのものであり、そして、該少なくとも２の第二付着部位の一つ目は、配列番号：２７の該アミノ酸２３〜２７のＮ末端の上流位置し；そして、該少なくとも２の第二付着部位の二つ目は、該配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７のＣ末端の下流、好ましくは該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔのＣ末端の下流に位置し；そして、該ＲＮＡ-バクテリオファージの該ＶＬＰと該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔが少なくとも１の非ペプチド共有結合によって連結されるものである組成物を提供する。

Ｎｔａドメイン：本明細書中で用いる「Ｎｔａドメイン」なる用語は、配列番号：５７のアミノ酸配列を有する天然のＮｔａドメイン又は任意の他の動物、好ましくは霊長類(真猿亜目及び原猿亜目を含む)、より好ましくは真猿亜目由来のＣＣＲ５オルソログの対応する配列を指す。さらに、本明細書中で用いる「Ｎｔａドメイン」なる用語は修飾Ｎｔａドメインを指し、このとき本明細書中で定義するように、天然のＮｔａドメインの３つ、好ましくは２つ、より好ましくは１つのアミノ酸が、該修飾Ｎｔａドメインを含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がヒトＣＣＲ５に特異的に結合するという条件の下に、欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保存的置換によって修飾されている。
Ｎｔａドメイン断片：本明細書中で用いる「Ｎｔａドメイン断片」なる用語は、該Ｎｔａドメイン断片を含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がヒトＣＣＲ５に特異的に結合するという条件の下に、本明細書中で定義するＮｔａドメインの少なくとも８、好ましくは少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は、１６の連続したアミノ酸配列を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなる任意のポリペプチドを指す。

Ｎｔｂドメイン：本明細書中で用いる「Ｎｔｂドメイン」なる用語は、配列番号：５８のアミノ酸配列を有する天然のＮｔｂドメイン又は任意の他の動物、好ましくは霊長類(真猿亜目及び原猿亜目を含む)、より好ましくは真猿亜目由来のＣＣＲ５オルソログの対応する配列を指す。さらに、本明細書中で用いる「Ｎｔｂドメイン」なる用語は修飾Ｎｔｂドメインを指し、このとき本明細書中で定義するように、天然のＮｔｂドメインの２つ、好ましくは１つのアミノ酸が、該修飾Ｎｔａドメインを含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がヒトＣＣＲ５に特異的に結合するという条件の下に、欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保存的置換によって修飾されている。
Ｎｔｂドメイン断片：本明細書中で用いる「Ｎｔｂドメイン断片」なる用語は、該Ｎｔｂドメイン断片を含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がヒトＣＣＲ５に特異的に結合するという条件の下に、本明細書中で定義するＮｔｂドメインの少なくとも６、好ましくは少なくとも７、８、９、１０の連続したアミノ酸配列を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなる任意のポリペプチドを指す。好ましくは、前記Ｎｔｂドメイン断片は、アミノ酸配列CQKINVK(配列番号：５９)、より好ましくはCQKINVKQ(配列番号：６０)を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなる。さらに、前記Ｎｔｂドメイン断片は、アミノ酸配列CQKINVK、より好ましくはCQKINVKQを含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなり、該Ｎｔｂドメイン断片を含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がヒトＣＣＲ５に特異的に結合するという条件の下に、CQKINVK又はCQKINVKQの１つのアミノ酸が欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保守的な置換によって修飾されている。

好適な実施態様では、少なくとも２の第二付着部位を有するＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは、該少なくとも２の第二付着部位の一つ目及び二つ目に含まれる、一つ目及び二つ目そのものである２つのスルフヒドリル基、好ましくは前記システイン残基の２つのスルフヒドリル基に加えて、更なるシステインのスルフヒドリル基、好ましくは更なるスルフヒドリル基を含んでいない。
好適な一実施態様では、前記少なくとも２の第二付着部位の一つ目は、Ｎｔａドメイン又はＮｔａドメイン断片のＮ末端の上流に位置しない。これは、ＣＣＲ５の天然の配位が自由に可動するＮ末端を有するので、宿主免疫系へのＮｔａドメイン又はＮｔａドメイン断片のＮ末端の自由なアクセスを確認するためである。好ましくは、前記少なくとも２の第二付着部位の一つ目は、Ｎｔａドメイン又はＮｔａドメイン断片のＣ末端の下流に位置する。
好適な一実施態様では、前記少なくとも２の第二付着部位の一つ目は、前記ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔ内の天然に生じるシステイン残基である。好適な実施態様では、前記少なくとも２の第二付着部位の一つ目は、配列番号：２７のシステイン残基のスルフヒドリル基に対応する。

代替的な一実施態様では、前記少なくとも２の第二付着部位の一つ目は前記の天然に生じるシステインの上流の１、２又は３のアミノ酸位、又は下流の１又は２のアミノ酸位に位置し、好ましくは該少なくとも２の第二付着部位の一つ目はシステイン内に位置する天然に生じるアミノ酸残基の挿入又は置換によって生成されており、そして、好ましくはＰＮｔドメイン内の天然に生じるシステイン残基が欠失されているか又は、好ましくはセリンないしはアラニン置換によって置換されている。
好適な一実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは、配列番号：２７を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなる。好適な一実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは、配列番号：２７由来のアミノ酸配列を含んでなる、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなり、この配列番号：２７由来のアミノ酸配列を含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がヒトＣＣＲ５に特異的に結合するという条件の下に、配列番号：２７の３つ、好ましくは２つ、好ましくは１つのアミノ酸が欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保守的な置換によって修飾されている。

好適な一実施態様では、組成物はリンカーを更に含み、該リンカーは前記ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔのＣ末端に融合し、該リンカーは前記少なくとも２の第二付着部位の二つ目を含むか、二つ目そのものである。Ｎｔｂドメイン又はＮｔｂドメイン断片のフレキシビリティが異なるＶＬＰにより効率的にカップリングするため、又は、天然のＮｔｂドメインの天然の配位をよりよく模倣するために調整されうるように、リンカーの長さを変えることができる。
好適な実施態様では、リンカーは、(a) GGC；(b) GGC-CONH2；(c) GC；(d) GC-CONH2；(e) C；及び(f) C-CONH2からなる群から選択される。更なる好適な一実施態様では、リンカーはシステインないしはアミド化されたシステインである。好適な一実施態様では、少なくとも２の第二付着部位を有するＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは、配列番号：４４のアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれからなるか、好ましくはこれからなる。
好適な一実施態様では、前記少なくとも２の第二付着部位の一つ目と二つ目は、少なくとも２の非ペプチド共有結合によって少なくとも２の第一付着部位と結合する。更なる好適な一実施態様では、前記少なくとも２の第二付着部位の一つ目と二つ目は、少なくとも２の非ペプチド共有結合によって少なくとも２の第一付着部位と結合して、典型的かつ好ましくはＮｔｂドメイン又はＮｔｂドメイン断片の「架橋様」構造が生じる。提唱された理論に結びつくものではないが、この架橋様構造が天然のＮｔｂドメインの天然の配位を模倣すると思われており、そのＮ末端はＥＣＬ３ループの他のシステインとジスルフィド結合で結合し、そのＣ末端は細胞膜に繋留されている。

好適な一実施態様では、少なくとも２の第一付着部位は同一の反応性官能基を含んでなる。好ましくは、少なくとも２の第一付着部位の各々はアミノ基を含んでなる。より好ましくは、少なくとも２の第一付着部位の各々はリジン残基のアミノ基を含んでなる。
好適な一実施態様では、組成物は少なくとも２のヘテロ-二官能分子を更に含み、該少なくとも２のヘテロ-二官能分子は前記少なくとも２の第一付着部位と前記少なくとも２の第二付着部位を連結し、好ましくは該少なくとも２のヘテロ-二官能分子の各々はＳＭＰＨである。
好適な一実施態様では、ＲＮＡ-バクテリオファージのウイルス様粒子は、Ｑβ、ＡＰ２０５、ｆｒ又はＧＡである。好適な実施態様では、ＲＮＡ-バクテリオファージのウイルス様粒子はＱβである。少なくとも４つのリジン残基はＱβコートタンパク質のＶＬＰの表面に露出する。このリジン密度により、少なくとも２の第二付着部位の一方が少なくとも１の非ペプチド共有結合によって１つの第一付着部位を連結した後、少なくとも２の第二付着部位の他方が迅速に第一付着部位を見つけて確実に連結する。同様に、他のＲＮＡ-バクテリオファージのＶＬＰもまた本発明に適する。

一態様では、本発明は、(a) 少なくとも２の第一付着部位を有するＲＮＡ-バクテリオファージのウイルス様粒子を提供する；このときＲＮＡ-バクテリオファージの該ウイルス様粒子(ＶＬＰ)は、該ＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含んでなるか、これからなり；好ましくは該少なくとも２の第一付着部位の各々は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含んでなるか、又はそのものであり；(ｂ) 少なくとも２の第二付着部位を有する少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔを提供する；このとき該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは、(i) Ｎｔａドメイン又はＮｔａドメイン断片、と、(ii) 配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７を含んでなるＮｔｂドメイン(配列番号：５６)又は配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７を含んでなるＮｔｂドメイン断片を含んでなり、このとき該Ｎｔａドメインないしは該Ｎｔａドメイン断片のＣ末端が該Ｎｔｂドメインないしは該Ｎｔｂドメイン断片のＮ末端に好ましくは直接融合しており、少なくとも２の第二付着部位の一つ目又は二つ目がスルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含んでなるかスルフヒドリル基そのものであり、そして、該少なくとも２の第二付着部位の一つ目は、配列番号：２７の該アミノ酸２３〜２７のＮ末端の上流に位置し；そして、該少なくとも２の第二付着部位の二つ目は、配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７のＣ末端の下流、好ましくは該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔのＣ末端の下流に位置し；(ｃ) 該ＲＮＡ-バクテリオファージのＶＬＰと該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔとを少なくとも１の非ペプチド共有結合によって連結させる、という工程を含んでなる、組成物の生産方法を提供する。

好適な実施態様では、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰのコートタンパク質に対するＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔの分子比率は、８:１から０．５：１、好ましくは４：１から１：１、より好ましくは４:１から２：１、更により好ましくは２:１である。
好適な一実施態様では、工程(ａ)はヘテロ二官能リンカーをＲＮＡ-バクテリオファージの前記ウイルス様粒子(ＶＬＰ)に付加することを更に含んでなり、好ましくは前記ヘテロ二官能リンカーがＳＭＰＨである。好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰのコートタンパク質に対するＳＭＰＨの分子比率は、４０:１から２：１、好ましくは２０:１から４：１、より好ましくは１０：１である。
好適な一実施態様では、ＲＮＡバクテリオファージ及び前記ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔ部位の前記ＶＬＰの連結は、１５０ｍＭ以下、好ましくは１００ｍＭ以下、好ましくは７５ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下のイオン強度を有する溶液において実施される。
好適な一実施態様では、ＲＮＡ-バクテリオファージのウイルス様粒子は、Ｑβ、ＡＰ２０５、ｆｒ又はＧＡ、好ましくはＱβである。

好適な実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは配列番号：２７のアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれからなるか、好ましくはこれからなる。好適な一実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは配列番号：２７由来のアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれからなるか、好ましくはこれからなり、配列番号：２７の３つ、好ましくは２つ、好ましくは１つのアミノ酸が、配列番号：２７由来の該アミノ酸配列を含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がヒトＣＣＲ５に特異的に結合するという条件の下に、欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保存的置換によって修飾されている。
好適な実施態様では、少なくとも２の第二付着部位を有するＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは配列番号：４４のアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれからなるか、好ましくはこれからなる。

一態様では、本発明は、本発明の方法に従って入手できるか、好ましくは入手した組成物を提供する。
好適な一実施態様では、本発明の抗原はＣＸＣＲ４細胞外ドメイン、ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片又は任意の組合せである。好適な一実施態様では、ＣＸＣＲ４細胞外ドメインがＣＸＣＲ４ Ｎ末端の細胞外ドメインである。好適な一実施態様では、ＣＸＣＲ４ Ｎ末端の細胞外ドメインはそのＣ末端を介してウイルス様粒子にカップリングされる。
好適な一実施態様では、ＣＸＣＲ４ Ｎ末端の細胞外ドメインは配列番号：３０ないしは配列番号：３０由来のアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれからなるか、これからなり、配列番号：３０の３つ、好ましくは２つ、好ましくは１つのアミノ酸が、配列番号：３０由来の該アミノ酸配列を含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合するという条件の下に、欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保存的置換によって修飾されている。更なる好適な一実施態様では、配列番号：３０を含んでなるか、基本的にこれを含むか、これからなるＣＸＣＲ４ Ｎ末端の細胞外ドメインはそのＣ末端を介してウイルス様粒子にカップリングされる。

好適な一実施態様では、ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片はＣＸＣＲ４細胞外ドメインＥＣＬ２断片である。更に好適な一実施態様では、ＣＸＣＲ４細胞外ドメインＥＣＬ２ドメイン断片は、配列番号：２９ないしは配列番号：２９由来のアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれからなるか、これからなり、配列番号：２９の２つ、好ましくは１つのアミノ酸が、配列番号：２９由来の該アミノ酸配列を含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合するという条件の下に、欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保存的置換によって修飾されている。好適な一実施態様では、ＣＸＣＲ４細胞外ＥＣＬ２ドメイン断片は、線状、すなわち環状でないアミノ酸配列：２９又は配列番号：２９由来のアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれを含むか、これからなる。更なる好適な一実施態様では、前記線状の配列番号：２９は、そのＮ末端又はそのＣ末端、好ましくはそのＣ末端を介して、ウイルス様粒子にカップリングされる。

好適な実施態様では、ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片は、環状化したＣＸＣＲ４細胞外ＥＣＬ２ドメイン断片を含んでなるか、これからなる。更なる好適な実施態様では、ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン断片は、環状化した配列番号：２９又はアミノ酸配列：２９由来の環状化したアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。本明細書中で用いるように、環状化した配列番号：２９は配列番号.２９を含んでなるか配列番号.２９からなるアミノ酸配列を指し、該アミノ酸配列の最初のアミノ酸残基と最後のアミノ酸残基が少なくとも１の化学結合によって、好ましくは少なくとも１の共有結合によって各々の他のアミノ酸残基と相互作用する。好ましくは、前記アミノ酸配列の最初のアミノ酸残基と最後のアミノ酸残基は、すべての共有結合によって各々の他のアミノ酸残基と相互作用する。好ましくは、前記アミノ酸配列の最初のアミノ酸残基と最後のアミノ酸残基は１つのペプチド結合によって各々の他のアミノ酸残基と相互作用して、円形のペプチドとなる。更に好適な実施態様では、ＣＸＣＲ４細胞外ＥＣＬ２ドメイン断片は、環状化された配列番号：４９又は配列番号：５３を含んでなるか、あるいはこれからなり、このペプチドが両端のＣ及びＧ残基によって環状化されるものである。

好適な一実施態様では、少なくとも１の抗原は本発明のガストリンである。一実施態様では、少なくとも１の抗原はガストリンＧ１７である。好適な一実施態様では、ガストリンＧ１７は、配列番号：３４を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。更なる好適な一実施態様では、ガストリンＧ１７は、配列番号：３６を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。代替的な好適な一実施態様では、ガストリンＧ１７は、最後のアミノ酸Ｆがアミド化されている配列番号：３４を含んでなるか、基本的にこれからなるか、好ましくはこれからなる。
好適な一実施態様では、少なくとも１の抗原はプロガストリンＧ３４である。好適な実施態様では、プロガストリンＧ３４は、配列番号：３５を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。更なる好適な一実施態様では、プロガストリンＧ３４は、配列番号：３７を含んでなるか、これからなる。代替的な更なる好適な一実施態様では、プロガストリンＧ３４は、最後のアミノ酸Ｆがアミド化されている配列番号：３５を含んでなるか、基本的にこれからなるか、これからなる。
好適な一実施態様では、少なくとも１の抗原は、ガストリンＧ１７ １-９断片(配列番号：３３)、好ましくはそのＣ末端にリンカー配列が融合したもの、より好ましくはＣ末端(配列番号：３９)にリンカー配列SSPPPPCが融合したものを含んでなるか、基本的にこれからなるか、これからなる。

非常に好適な一実施態様では、リンカーと融合した本発明のガストリンは、配列番号：３８を含んでなるか、基本的にこれからなるか、これからなる。
好適な一実施態様では、少なくとも１の第二付着部位を有する本発明のガストリンは、配列番号：３８；配列番号：３９；配列番号：４０；配列番号：４１；配列番号：４２；及び配列番号：４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。
ガストリン配列の一部としての配列EGPWLEEEEのうちの一つの位置のＥがＥ、ピロＥ又はＱであることを注記する。付加的なアミノ酸がEGPWLEEEEのＮ末端に融合する場合、配列EGPWLEEEEのうちの一つの位置一つのＥがＥ又は好ましくはＱでもよい。
好適な一実施態様では、本発明の少なくとも１の抗原はＣＥＴＰ断片である。更なる好適な一実施態様では、ＣＥＴＰ断片は、配列番号：３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号：３２由来のポリペプチドを含んでなる、基本的にこれらからなるか、あるいはこれらからなり、配列番号：３２の２つ、好ましくは１つのアミノ酸が、該配列番号：３２由来のポリペプチドを含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がＣＥＴＰ、好ましくはヒトのＣＥＴＰに特異的に結合するという条件の下に、欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保存的置換によって修飾されている。

好適な実施態様では、少なくとも１の抗原はＣ５ａタンパク質である。好適な一実施態様では、Ｃ５ａタンパク質は、配列番号：４５のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号：４５由来のポリペプチドを含んでなる、基本的にこれらからなるか、あるいはこれらからなり、配列番号：４５の５つ、４つ、好ましくは３つ、好ましくは２つ、好ましくは１つのアミノ酸が、該配列番号：４５由来のポリペプチドを含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がＣ５ａ、好ましくはヒトのＣ５ａに特異的に結合するという条件の下に、欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保存的置換によって修飾されている。好適な一実施態様では、少なくとも１の抗原はＣ５ａ断片である。更なる好適な一実施態様では、Ｃ５ａ断片は、配列番号：４６のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号：４６由来のポリペプチドを含んでなる、基本的にこれらからなるか、あるいはこれらからなり、配列番号：４６の２つ、好ましくは１つのアミノ酸が、該配列番号：４６由来のポリペプチドを含んでなる本発明の組成物によって誘発される抗体がＣ５ａ、好ましくはヒトのＣ５ａに特異的に結合するという条件の下に、欠失、挿入及び／又は置換、好ましくは保存的置換によって修飾されている。

好適な一実施態様では、本発明の抗原は本発明のブラジキニンである。ブラジキニン(ＢＫ、KRPPGFSPFR、配列番号：５０)は、主要な血管拡張因子ペプチドであって、血圧、血流及び血管透過性の局所的調節機能に重要な役割がある(Margolius H.S,等, Hypertension, 1995)。ブラジキニンはＢ２-レセプターを介してその効果を発揮する。
ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫ(KRPPGFSPF、配列番号：５１)はオーバーラップしている、ブラジキニンと異なった機能を有する。所見から、ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫが組織損傷の後に急速に生成され、血管拡張作用、血管透過性の増大、血漿管外遊出、細胞移動、疼痛及び痛覚過敏(Calixto J.B.等, Pain 2000)を含む炎症過程の間に観察される多くの現象を調整することが示唆される。ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫはＢ１-レセプターを介してその効果を発揮する。
ＢＫ及びｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫはいくつかの炎症性疾患で役割を果たすことが報告されている(Cruwys S.C.等, Br J Pharmacol, 1994；Cassim B.等, Immunopharmacology 1997)。実験的所見から、ＢＫ及びｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫはともに喘息の発症の間に役割を果たすことが示唆される(Christiansen S.C.等, Am. Rev. Dis. 1992；Barnes P.J.等, Thorax, 1992)；Fuller R.W.et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1987)。

更なる好適な一実施態様では、本発明のブラジキニンは本発明のブラジキニンのＮ末端に融合したリンカーをさらに含んでなり、好ましくは該リンカー配列はシステインである。更なる好適な一実施態様では、本発明のブラジキニンは、本発明のブラジキニンのＣ末端に融合したリンカーをさらに含んでなり、好ましくは該リンカー配列はシステインである。更なる好適な一実施態様では、本発明のブラジキニンは配列番号：５０を含んでなるか、これからなる。
好適な実施態様では、本発明の抗原は本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンである。更なる好適な一実施態様では、本発明の組成物は、本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンのＮ末端に融合したリンカーをさらに含んでなり、好ましくはリンカー配列はシステインである。更なる好適な一実施態様では、本発明の組成物は、本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンのＣ末端に融合したリンカーをさらに含んでなり、好ましくはリンカー配列はシステインである。更なる好適な一実施態様では、本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンは配列番号：５１からなるか、あるいはこれからなる。

さらに他の好適な実施態様では、少なくとも１の抗原は本発明の抗原の少なくとも１の抗原性部位を含んでなるか、あるいはこれからなる。
免疫原性を有することは、通常タンパク質の完全長を必要とするものではなく、通常、タンパク質は複数の抗原エピトープ、すなわち抗原性部位を含有することが知られている。断片又は短いペプチドは、抗体によって、又はＭＨＣ分子との関係でＴ細胞レセプターによって免疫特異的に結合されうる少なくとも１の抗原性部位を含有するために十分でありうる。抗原性部位(一又は複数)は、当業者に一般に公知の多くの技術で測定することができる。タンパク質の抗原性部位(一又は複数)の決定方法は当業者に公知である。国際公開第２００５／１０８４２５号は、段落[００９９]から[０１０３]にこれらのいくつかの方法を詳述しており、これらの開示内容は出典明記によって本明細書中に援用される。これらの方法が通常、他のポリペプチド抗原に適用でき、したがって、国際公開第２００５／１０８４２５号にて開示したようにＩＬ-２３ ｐ１９に限定するものでないことを注記する。

本発明の好適な一実施態様では、少なくとも１の第一付着部位を有するＶＬＰは、少なくとも１のペプチド結合により少なくとも１の第二付着部位を有する本発明の抗原に連結される。本発明の抗原、好ましくは７５アミノ酸以下、好ましくは５０アミノ酸以下、更により好ましくは３０アミノ酸以下の本発明の抗原をコードする遺伝子は、ＶＬＰのコートタンパク質をコードする遺伝子の内部又は好ましくはＮ末端ないしはＣ末端のいずれかにインフレームに連結される。また、融合は、本発明の抗原の配列を、コートタンパク質配列の一部が欠失しているコートタンパク質の変異体に挿入することによって生じてもよく、これをトランケーション変異体とさらに称する。トランケーション変異体は、コートタンパク質の配列の一部のＮ末端ないしはＣ末端又は内部に欠失を有してもよい。例えば特定のＶＬＰ ＨＢｃＡｇのために、アミノ酸７９-８０を外来性エピトープと置換する。好ましくは、融合タンパク質は発現の際のＶＬＰへの集合体化能を保持するであろう。これは電子顕微鏡法によって調べることができる。
側方アミノ酸残基は、コートタンパク質と外来性エピトープの間の距離を増やすために加えられてもよい。グリシン及びセリン残基は、隣接配列に使用するために特に好ましいアミノ酸である。このような隣接配列は更なるフレキシビリティを与え、これによって、ＶＬＰサブユニットの配列への外来性配列の融合の潜在的な不安定作用を低減し、外来性エピトープの存在による集合体化の干渉を低減しうる。

好適な一実施態様では、修飾ＶＬＰはモザイクＶＬＰであり、好ましくは該モザイクＶＬＰは少なくとも１の融合タンパク質と少なくとも１のウイルスコートタンパク質を含んでなるか、あるいはこれらからなる。
他の実施態様では、本発明の少なくとも１の抗原、好ましくは５０未満のアミノ酸からなる本発明の抗原は、多くの他のウイルスコートタンパク質、例えばＱβのＡ１タンパク質のトランケート型のＣ末端(Kozlovska, T. M.,等, Intervirology 39:9-15 (1996))に融合されうるか、又は、ＣＰ伸展の位置７２と７３の間で挿入される。例えば、Kozlovska等, (Intervirology, 39: 9-15 (1996))は、エピトープが位置１９でトランケートされているＱβ ＣＰ伸展のＣ末端に融合しているＱβ Ａ１タンパク質融合を記載する。
別の例では、本発明の抗原は、ｆｒ ＣＰのアミノ酸２と３の間で挿入されうる(Pushko P.等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993))。さらに、本発明の抗原は、ＲＮＡファージＭＳ-２のコートタンパク質のＮ末端の突出したβ-ヘアピンに融合されうる(国際公開第９２／１３０８１号)。これに対して、本発明の抗原はパピローマウイルスのキャプシドタンパク質、好ましくはウシパピローマウイルス１型(ＢＰＶ-１)の主要なキャプシドタンパク質Ｌ１に融合されうる(Chackerian, B.等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999)、国際公開第００／２３９５５号)。また、本発明の抗原とＢＰＶ-１ Ｌ１のアミノ酸１３０−１３６の置換も本発明の実施態様である。さらに、ウイルスのコートタンパク質、その変異体ないしその断片に本発明の抗原を融合させる実施態様は、国際公開第２００４／００９１２４号の６２頁の２０行目から６８頁の１７行目に開示されており、出典明記によって本明細書中に援用される。

好適な他の実施態様では、本発明の少なくとも１の抗原、好ましくは７０未満のアミノ酸、好ましくは５０未満のアミノ酸からなる本発明の抗原を、ＲＮＡファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体ないしはその断片のＮ末端又はＣ末端に融合する。更なる好適な一実施態様では、融合タンパク質はスペーサーをさらに含有するものであり、該スペーサーはＡＰ２０５及び本発明の抗原のコートタンパク質、その断片ないしはその変異体に融合されるものである。好ましくは前記スペーサーは、３０未満、好ましくは２０未満、さらにより好ましくは１０未満、更により好ましくは５未満のアミノ酸からなる。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、少なくとも１の共有結合を介して少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の本発明の抗原に結合した少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子を含有するか、あるいは本質的にこれらからなるものであり、好ましくは該共有結合は非ペプチド結合である。好ましくは、第一付着部位はシステインのスルフヒドリル基を含まないか、あるいはそのものでない。さらに好ましくは、第一付着部位はスルフヒドリル基を含まないか、あるいはそのものでない。本発明の好適な実施態様では、第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそのものである。本発明の他の好適な実施態様では、第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそのものである。

本発明の非常に好適な実施態様では、少なくとも１の第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含んでなるか、好ましくはそのものであり、少なくとも１の第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含んでなるか、好ましくはそのものである。
本発明の好適な一実施態様では、本発明の抗原は、典型的にかつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用して、化学的架橋によりＶＬＰに結合している。好適な実施態様では、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましくはアミノ基、より好ましくはＶＬＰのリジン残基(一又は複数)のアミノ基を有する好適な第一付着部位と反応可能な官能基と、好適な第二付着部位、すなわち本発明の抗原に元もとあるかないしは人工的に付加され、場合によっては還元による反応に利用される、好ましくはシステイン(一又は複数)残基のスルフヒドリル基と反応可能なさらなる官能基を含む。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当該分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤であるＳＭＰＨ(Pierce)、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えばPierce Chemical Companyから入手可能な他の架橋剤が含まれ、アミノ基に対して反応可能な一官能基とスルフヒドリル基に対して反応可能な一官能基を有する。上述した全ての架橋剤により、アミノ基との反応後にアミド結合が、またスルフヒドリル基とチオエーテル結合が形成される。本発明の実施に適した他のクラスの架橋剤は、カップリング時に本発明の抗原とＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することにより特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰ及びスルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ(Pierce)が含まれる。

好適な実施態様では、本発明の組成物はリンカーをさらに含有している。本発明の抗原における第二の付着部位の操作は、この発明の開示に従い、好ましくは第二の付着部位として適切な少なくとも１のアミノ酸を含むリンカーとの結合により達成される。よって、本発明の好適な実施態様では、リンカーは少なくとも１の共有結合、好ましくは典型的には少なくとも１のペプチド結合により、本発明の抗原に結合している。好ましくは、リンカーは、第二の付着部位を含むかあるいはそれからなる。さらに好適な実施態様では、リンカーは好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好適な実施態様では、リンカーはシステイン残基である。
リンカーの選別は、国際公開第２００５／１０８４２５号Ａ１の３２〜３３に開示されており、これは出典明記によって本明細書中に援用される。

上記の好適な方法によるヘテロ二官能性架橋剤を用いることによるＶＬＰへの本発明の抗原の結合により、正方向の様式でＶＬＰに本発明の抗原をカップリングさせることができる。ＶＬＰに本発明の抗原を連結させるための他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、及びＮＨＳを使用し、本発明の抗原をＶＬＰに架橋させる方法が含まれる。本発明の抗原は、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオランを用いた反応を介して、まずチオラート化されてもよい。次いで、必要であれば脱保護化した後に本発明の抗原を以下のようにＶＬＰにカップリングしてもよい。過剰なチオラート化剤を分離した後、本発明の抗原を、システイン反応基を含有し、システイン残基に対して反応可能な少なくとも１又はいくつかの官能基を表出するヘテロ二官能性架橋剤にて予め活性化させた、ＶＬＰと反応させる。このとき本発明のチオラート化抗原は上記に記載のようにそのシステイン残基と反応させることができる。場合によっては、少量の還元剤が反応混合物中に含まれる。さらなる方法では、ホモ二官能性架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ[ＰＥＯ]４、ＢＳ３、(Pierce)、又はＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基に対して反応する官能基を有する他の既知のホモ二官能性架橋剤を使用して、本発明の抗原をＶＬＰに付着させる。
本発明の他の実施態様では、組成物は、化学的な相互作用を介して本発明の抗原に結合したウイルス様粒子を含むか、ないしは本質的にそれからなるものであり、このときこの相互作用の少なくとも１は共有結合ではないものである。このような相互作用には、抗原-抗体相互作用、レセプター-リガンド相互作用が含まれるが、これらに限定するものではない。 ＶＬＰをビオチン化してストレプトアビジン-融合タンパク質として本発明の抗原を発現することによって本発明の抗原へのＶＬＰの結合が起こる。

本発明の好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰは宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。更なる好適な一実施態様では、組成物は、ＶＬＰに結合した、好ましくはＶＬＰ内にパッケージ化ないしは封入された少なくとも１のポリ陰イオン性高分子を更に含有する。より更なる好適な実施態様では、ポリ陰イオン性高分子はポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸である。
本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠く：本明細書中で用いられる「本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠く」なる用語は、ＶＬＰに含有される宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸の量を意味し、その量は典型的かつ好ましくは、ＶＬＰｍｇ当たり３０μｇより少ない、好ましくは２０μｇより少ない、より好ましくは１０μｇより少ない、さらにより好ましくは８μｇより少ない、さらにより好ましくは６μｇより少ない、さらにより好ましくは４μｇより少ない、最も好ましくは２μｇより少ない。上記の範囲内で用いられる宿主は、ＶＬＰが組み換えて産生される宿主を意味する。ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する従来の方法は当業者に周知である。本発明によって、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する典型的かつ好適な方法は、同出願人により２００５年１０月５日に出願した国際公開第２００６／０３７７８７号Ａ２の実施例１７に記載される。典型的かつ好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰを含んでなる本発明の組成物についてＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定するためには、同一、同種又は類似の条件を用いる。最終的に必要とされる条件の変更は当業者の知識の範囲内である。典型的かつ好ましくは、決定した量の数値は、示した数値の±１０％の偏差、好ましくは±５％の偏差を有する値と比較して理解されるであろう。

ポリ陰イオン性高分子：本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、陰性電荷の反復性基を含んでなる相対的に高い質量の分子を指すものであり、その構造は、実際のところ又は概念的には、相対的に低い質量の分子から得られるユニットの複数の繰り返しを基本的に含んでなる。ポリ陰イオン性高分子は、少なくとも２０００のダルトン、好ましくは少なくとも３０００のダルトン、そしてさらにより好ましくは少なくとも５０００のダルトンの分子量を有するものである。本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、典型的かつ好ましくは、ｔｏｌｌ様レセプターを活性化することができない分子を指す。ゆえに、「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、典型的かつ好ましくはＴｏｌｌ様レセプターリガンドを除く、さらにより好ましくはさらに、免疫賦活性物質、例えばＴｏｌｌ様レセプターリガンド、免疫賦活性核酸およびリポポリサッカリド(ＬＰＳ)を除くものである。より好ましくは、本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、サイトカイン産生を誘導することができない分子を指す。さらにより好ましくは、「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は免疫賦活性物質を除くものである。本明細書中で用いる「免疫賦活性物質」なる用語は、本発明中に含有される抗原に対して特異的な免疫応答を誘導及び／又は亢進することができる分子を指す。

宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸：本明細書中で用いる「宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸」なる用語、又は「二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸」なる用語は、宿主が本来合成するＲＮＡ又は好ましくは核酸を指す。しかしながら、ＲＮＡ、好ましくは核酸は、典型的かつ好ましくは、本発明の方法による、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を少なくするかないしは除去する工程の間に、化学的及び／又は物理的な変化が起こりうる。例えばＲＮＡ、好ましくは核酸の大きさが短くなったり、その二次構造が変化しうる。しかしながら、この結果として生じるＲＮＡ又は核酸でも、宿主ＲＮＡ又は宿主核酸とみなす。
ＲＮＡの量を決定するための方法及びＶＬＰによって包含されるＲＮＡの量を減少する方法は、同出願人により２００５年１０月５日に出願した国際公開第２００６／０３７７８７号Ａ２に開示されており、その出願全体、特に実施例４、５及び１７は出典明記によって本明細書中に援用される。ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を少なくするかないしは除去することにより、抗原に特異的な抗体応答が強いままで、炎症性Ｔ細胞応答及び障害性Ｔ細胞応答などの望ましくないＴ細胞応答や、発熱などの他の望ましくない副作用を最小限にするか、又は低減する。

一態様では、本発明は、本発明の組成物を含んでなるか、基本的にこれからなるか、これからなるワクチン組成物を提供する。好適な一実施態様では、ワクチン組成物中のＶＬＰに連結される本発明の抗原は、動物、好ましくは哺乳動物又はヒトのものでありうる。好適な実施態様では、本発明の抗原は、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ又はウマ起源のものである。
好適な一実施態様では、ワクチン組成物はさらに少なくとも１のアジュバントを含有する。少なくとも１のアジュバントの投与は、本発明の組成物の投与の前、あるいはそれと同時、あるいはその後であってもよい。本明細書中で用いられる「アジュバント」なる用語は、免疫応答の非特異的刺激因子、もしくは、本発明のワクチン及び薬剤組成物のそれぞれと組み合わせるとより亢進した免疫応答を供給しうる、貯蔵物の宿主内での生成を可能にする物質を意味する。

他の好適な実施態様では、ワクチン組成物はアジュバントを欠く。本発明の有利な特性は、アジュバントを含まない場合でさえ、組成物の免疫原性が高いことである。アジュバントを使用しないので、アジュバントの使用に関連する副作用の発生の頻度を減少しうる。よって、本発明のワクチンの患者への投与は、好ましくはワクチンの投与前、投与と同時、又は投与後に同じ患者に少なくとも１のアジュバントを投与することなく、なされるであろう。ＶＬＰは通常アジュバントとして記載されている。しかしながら、本出願の関係で用いられるように、「アジュバント」なる用語は本発明の組成物に用いられるＶＬＰではなく、該ＶＬＰ以外のアジュバントを指す。
さらに、本発明は、本発明のワクチンが動物又はヒトに投与されることを含む免疫化方法を開示する。動物は、好ましくは哺乳動物、例えばネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ラット、マウス及び特にヒトである。ワクチンは、当分野で公知の様々な方法によって投与されてもよいが、通常、注射、注入、吸入、経口投与又は他の適切な理学的方法によって投与されうる。コンジュゲートは、選択的に、筋肉内、静脈内、粘膜経由、経皮、鼻腔内、腹膜内又は皮下投与されてもよい。投与のためのコンジュゲート成分は、滅菌水(例えば、生理食塩液)又は非水溶液及び懸濁液などである。非水溶性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどがある。担体又は密封包帯を、皮膚透過性を増やして、抗原吸収を上げるために用いてもよい。

レシピエントの個体に投与が合っていれば、本発明のワクチンは「薬剤的に受容可能」であるといえる。さらに、本発明のワクチンは、「治療的に有効な量」(すなわち、所望の生理学的効果を示す量)で投与されうる。免疫応答の性質又は種類は本発明で開示される因子に限定するものではない。以下のメカニズムの説明によって本発明が限定されるものではなく、発明のワクチンは、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ガストリン、プロガストリン、ＣＥＴＰ、Ｃ５ａ、ブラジキニン又はｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンに結合し、それによってその濃度を低減する及び／又はその生理学的機能ないしは病理学的機能を干渉する抗体を誘導しうる。
一態様では、本発明は、本発明で述べられる組成物と受容可能な製薬的担体を含有する薬剤組成物を提供する。本発明のワクチンが個体に投与される場合、コンジュゲートの有効性を改善するために望ましい他の物質、アジュバント、バッファ又は塩類を含有する形態でありうる。薬剤組成物の調整における使用に好適な材料の例は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, 編集, Mack Publishing Co., (1990))を含む多くの情報源に示される。

本発明は、本発明の組成物の産生方法であって、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するＶＬＰを供給する；(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する本発明の抗原を供給する；そして(c) 該ＶＬＰと該本発明の抗原を結合させて、該第一付着部位と該第二付着部位を介して該本発明の抗原と該ＶＬＰが結合している組成物を産生する、工程を含む産生方法を教示する。好適な実施態様では、少なくとも１の第二付着部位を有する本発明の少なくとも１の抗原は、発現による、好ましくは細菌系、好ましくは大腸菌内での発現によるものである。通常、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグなどのタグを付加して、精製工程を促す。他の方法では、特に、５０未満のアミノ酸を有する本発明の少なくとも１の抗原は化学的に合成することができる。
更なる好適な実施態様では、少なくとも１の第一付着部位を有するＶＬＰを提供する工程は、(a) 該ウイルス様粒子を該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片に分解して；(b) 該コートタンパク質、その変異体ないしはその断片を精製して；(c) 該精製された該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片をウイルス様粒子に再集合体化させる工程をさらに含むものであり、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである。より更なる好適な実施態様では、前記の精製したコートタンパク質の再集合体化は、少なくとも１のポリ陰イオン性高分子の存在下にて影響を受ける。

好適な一実施態様では、本発明はＨＩＶ感染を予防及び／又は治療する方法であって、該方法が、発明の組成物又は発明のワクチン組成物のそれぞれがヒトに投与されることを含んでなり、本発明の抗原が本発明のＣＣＲ５である方法を提供する。
好適な一実施態様では、本発明はＨＩＶ感染を予防及び／又は治療する方法であって、該方法が、本発明の組成物又は本発明のワクチン組成物のそれぞれがヒトに投与されることを含んでなり、本発明の抗原が本発明のＣＸＣＲ４である方法を提供する。
好適な一実施態様では、本発明はアテローム性動脈硬化症を予防及び／又は治療する方法であって、該方法が、本発明の組成物又は本発明のワクチン組成物のそれぞれが動物又はヒトに投与されることを含んでなり、本発明の抗原が本発明のＣＥＴＰである方法を提供する。アテローム性動脈硬化症は、冠状動脈性心臓病、冠状動脈疾患、頸動脈疾患及び脳血管疾患を含むが、これに限定されるものではない動脈の疾患である。
好適な一実施態様では、本発明は、原発性及び／又は慢性の炎症性疾患の予防方法及び／又は治療方法であって、該方法が、本発明の組成物又は本発明のワクチン組成物のそれぞれが動物又はヒトに投与されることを含んでなり、本発明の抗原が本発明のＣ５ａである方法を提供する。Ｃ５ａが症状を媒介する又は症状に関与する原発性及び／又は慢性の炎症性疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、喘息及び類天疱瘡が含まれるがこれらに限定するものではない。

好適な一実施態様では、本発明は、原発性及び／又は慢性の炎症性疾患の予防方法及び／又は治療方法であって、該方法が、本発明の組成物又は本発明のワクチン組成物のそれぞれが動物又はヒトに投与されることを含んでなり、本発明の抗原が本発明のブラジキニンである方法を提供する。ブラジキニンが症状を媒介する又は症状に関与する原発性及び／又は慢性の炎症性疾患には、関節炎及び喘息が含まれるがこれらに限定するものではない。
好適な一実施態様では、本発明は、原発性及び／又は慢性の炎症性疾患の予防方法及び／又は治療方法であって、該方法が、本発明の組成物又は本発明のワクチン組成物のそれぞれが動物又はヒトに投与されることを含んでなり、本発明の抗原が本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンである方法を提供する。ｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンが症状を媒介する又は症状に関与する原発性及び／又は慢性の炎症性疾患には、関節炎及び喘息が含まれるがこれらに限定するものではない。
好適な一実施態様では、本発明は、癌、特に消化管癌の予防方法及び／又は治療方法であって、該方法が、本発明の組成物又は本発明のワクチン組成物のそれぞれが動物又はヒトに投与されることを含んでなり、本発明の抗原が本発明のガストリンである方法を提供する。消化管の癌には、胃上皮癌、大腸癌、直腸癌及び膵癌が含まれるがこれらに限定するものではない。

他の態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明の組成物であって、本発明の抗原がそれぞれ本発明のＣＣＲ５、本発明のＣＸＣＲ４、本発明のガストリン、本発明のＣＥＴＰ、本発明のＣ５ａ、本発明のブラジキニン又は本発明のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンである組成物を提供する。
好適な一実施態様では、本発明は、ヒトのＨＩＶ感染の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が本発明の少なくとも１のＣＣＲ５を含んでなる使用を提供する。
好適な一実施態様では、本発明は、ヒトのＨＩＶ感染の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が本発明の少なくとも１のＣＸＣＲ４を含んでなる使用を提供する。
好適な一実施態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が本発明の少なくとも１のＣＥＴＰを含んでなる使用を提供する。アテローム性動脈硬化症は、冠状動脈性心臓病、冠状動脈疾患、頸動脈疾患及び脳血管疾患を含むが、これに限定されるものではない動脈の疾患である。

好適な一実施態様では、本発明は、原発性及び／又は慢性の炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が本発明の少なくとも１のＣ５ａを含んでなる使用を提供する。Ｃ５ａが症状を媒介する又は症状に関与する原発性及び／又は慢性の炎症性疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、喘息及び類天疱瘡が含まれるがこれらに限定するものではない。
好適な一実施態様では、本発明は、原発性及び／又は慢性の炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が本発明の少なくとも１のブラジキニンを含んでなる使用を提供する。ブラジキニンが症状を媒介する又は症状に関与する原発性及び／又は慢性の炎症性疾患には、関節炎及び喘息が含まれるがこれらに限定するものではない。
好適な一実施態様では、本発明は、原発性及び／又は慢性の炎症性疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が本発明の少なくとも１のｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンを含んでなる使用を提供する。ｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンが症状を媒介する又は症状に関与する原発性及び／又は慢性の炎症性疾患には、関節炎及び喘息が含まれるがこれらに限定するものではない。
好適な一実施態様では、本発明は、癌、特に消化管癌の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が本発明の少なくとも１のガストリンを含んでなる使用を提供する。消化管の癌には、胃上皮癌、大腸癌、直腸癌及び膵癌が含まれるがこれらに限定するものではない。

実施例１
Ｑβ ＶＬＰへのＣＣＲ５ ＰＮｔペプチド又はＥＣＬ２Ａのカップリング
２ｇ／ｌのＱβ ＶＬＰ(１４３μＭ Ｑβコートタンパク質)を、１．４３ｍＭのＳＭＰＨ(Pierce)にて２５℃で３０分間かけて誘導体化し、次いで２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。０．２８６ｍＭのアミド化したＣ末端システインを有するペプチドＰＮｔ-ＣＣ(配列番号：４４、ＤＭＳＯ中３ｍＭの貯蔵液)と１ｇ／ｌの誘導体化したＱβ粒子を２５℃で２時間インキュベートした。
第二の方法として、２ｇ／ｌのＱβ ＶＬＰを、１．４３ｍＭのＳＭＰＨにて２５℃で３０分間かけて誘導体化し、次いで２０ｍＭ リン酸塩 ｐＨ７．４に対して透析した。０．１４３ｍＭのアミド化したＣ末端システインを有するペプチドＰＮｔ-ＣＣ(配列番号：４４、ＤＭＳＯ中５０ｍＭの貯蔵液)と１ｇ／ｌの誘導体化したＱβ粒子を２５℃で２時間インキュベートした。カップリング産物は２０ｍＭ リン酸塩 ｐＨ７．４に対して透析した。

２ｇ／ｌのＱβを、１．４３ｍＭのＳＭＰＨにて２５℃で３０分間かけて誘導体化し、次いで２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。０．２８６ｍＭのアミド化したＣ末端システインを有するペプチドＰＮｔ-ＣＣ(配列番号：５４、ＤＭＳＯ中５ｍＭの貯蔵液)と１ｇ／ｌの誘導体化したＱβ粒子を２５℃で２時間インキュベートした。カップリング産物は２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。
２ｇ／ｌのＱβを、１．４３ｍＭのＳＭＰＨにて２５℃で３０分間かけて誘導体化し、次いで２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。０．１４３ｍＭのアミド化したＣ末端システインを有するペプチドＰＮｔ-ＣＣ(配列番号：５５、ＤＭＳＯ中５ｍＭの貯蔵液)と１ｇ／ｌの誘導体化したＱβ粒子を２５℃で２時間インキュベートした。カップリング産物は２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。
２ｇ／ｌのＱβを、１．４３ｍＭのＳＭＰＨにて２５℃で３０分間かけて誘導体化し、次いで２０ｍＭ リン酸塩 ｐＨ７．５に対して透析した。１ｇ／ｌの誘導体化したＱβ粒子を２０％アセトニトリルに溶解し、０．２８６ｍＭの環状ＥＣＬ２Ａ(配列番号：２６、ＤＭＳＯ中５ｍＭの貯蔵液)を加えて、２０ｍＭ リン酸塩 ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、２５℃で２時間インキュベートした。カップリング産物は２０ｍＭ リン酸塩 ｐＨ７．５に対して透析した。

実施例２
免疫化
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目に５０μｇのＱβ-ＰＮｔＣＣ、Ｑβ-ＰＮｔＣＮ、Ｑβ-ＰＮｔＳＣ又はＱβ-ＥＣＬ２Ａ(実施例１から入手)にて抗原刺激し(皮下、０．２ｍｌの２０ｍＭ リン酸塩 ｐＨ７．５中)、５０μｇのＱβのみにて抗原刺激したＢａｌｂ／Ｃマウスと比較した。１４日目に同じワクチンにて追加刺激し、１４日目及び２１日目にＥＬＩＳＡによってα-Ｑβ及びα-ＣＣＲ５ペプチド抗体価を調べた(表１)。
表１

これに対して、ニュージランドホワイト種ウサギを、０日目に、完全フロインドアジュバントにて等量(ｖ／ｖ)にした１００μｇのＱβ-ＰＮｔＣＣ(実施例１の第二の方法から入手)にて抗原刺激した(ウサギの背部の皮下、１０箇所)。以下の３回の追加刺激(１４、２８、５６日目に１００μｇ Ｑβ-ＰＮｔＣＣ)を等量(ｖ／ｖ)の不完全フロイントアジュバントにて行った。３７日目及び５６日目にＥＬＩＳＡによってα-Ｑβ及びα-ＣＣＲ５ペプチド抗体価を調べ、常に１２０００であることを確認した。

実施例３
ポリクローナルマウス又はウサギＩｇＧの精製
５つのＱβ-ＰＮｔＣＣ、Ｑβ-ＰＮｔＣＮ、Ｑβ-ＰＮｔＳＣ又はＱβ-ＥＣＬ２Ａにて免疫化したマウス(又は２匹のウサギ)(実施例４から入手)のそれぞれからプールした血清を、１４０００回転数／分で５分間遠心分離した。上清を３．３ｍｌの予洗したプロテインＧセファロース(Amersham)のカラムに流した。次いでカラムをＰＢＳにて洗浄し、１００ｍＭ グリシン ｐＨ２．８にて溶出した。１ｍｌの分画を、１１２μｌの１Ｍ トリスｐＨ８を予め入れたチューブに集めた。２８０ｎｍで吸光度がピークになる分画をプールした。

実施例４
ポリクローナルウサギＩｇＧの親和性精製
製造業者(GE Healthcare Europe)の指示に従って、１ｍｇのＱβ又はＱβ-ＰＮｔＣＣを、Ｎ-ヒドロキシサクシンイミド活性化セファロースカラムに固定した。５ｍｇのウサギＩｇＧ(実施例３から)を含むＰＢＳを、０．５ｍｌ／分の流速にてＱβ親和性カラムに流した。流出分画を、更なるＰＮｔＣＣ特異的な精製のために集めた。Ｑβ特異的ＩｇＧを、１００ｍＭ グリシン ｐＨ２．６にてＱβカラムから溶出させ、１２０ｍＭ トリス ｐＨ８にて中和した。流出分画中のＰＮｔＣＣ特異的ＩｇＧをＱβ-ＰＮｔＣＣカラムにてさらに精製した。溶出して中和したＩｇＧを、遠心フィルタ装置(Amicon Ultra-4, 10'000 MWCO)を用いてＰＢＳにて４回洗浄した。

実施例５
マウスポリクローナルＩｇＧによる細胞性ＣＣＲ５のＦＡＣＳ染色
ＣＥＭ.ＮＫＲ-ＣＣＲ５は、ＣＤ４を自然に発現するヒトの系統であるＣＥＭ.ＮＫＲ細胞株(Trkola等, J. Virol., 1999, page 8966)のＣＣＲ５発現変異体である。ＣＥＭ.ＮＫＲ-ＣＣＲ５細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培養液(１０％ＦＣＳ、グルタミン及び抗生物質を含む)中で生育させた。細胞をペレット化し、１％ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)を含有するリン酸塩緩衝食塩水(ＰＢＳ)中に再懸濁して、２．３×１０^６／ｍｌを得た。ヒトＩｇＧ (Miltenyi Biotec)の[１:２５０]希釈物をブロック剤として加えて、２０分間インキュベートした。細胞を１％のＦＣＳ／ＰＢＳで１回洗浄し、０．１ｍｌ(２．３×１０^５細胞／ウェル)をプレートに播き、実施例３(６０ｍｇ／ｌ；プロテインＧカラムから溶出；１％のＦＣＳ／ＰＢＳにて希釈)から精製したＣＣＲ５ポリクローナル抗体とともにインキュベートした。４℃で３０分間後に、細胞を１％ＦＣＳ／ＰＢＳで１回洗浄して、１５ｍｇ／ｌのＦＩＴＣ-ヤギ-α-マウス-ＩｇＧ(Jackson)を有する１％ＦＣＳ／ＰＢＳにて４℃で２０分間染色した。１％ＦＣＳ／ＰＢＳにて２回洗浄した後、５０００〜１００００の染色した細胞をフローサイトメトリーによって分析した。各々の染色の相乗平均は、「細胞クエスト」フローサイトメトリーソフトウェアを用いて決定した。

表２は、ＰＮｔＣＣ又はＥＣＬ２Ａ特異的抗体がＣＥＭ.ＮＫＲの細胞表面上に発現したＣＣＲ５分子に特異的に結合するのに対して、ＰＮｔＳＣ及びＰＮｔＣＮ特異的抗体並びにＱβ特異的抗体が細胞表面上に発現されたＣＣＲ５分子に結合しないことを示す。
表２

実施例６
ＨＩＶ中和アッセイ
簡単に言えば、３体の健康な血液ドナーから入手したバフィーコート中のＣＤ８＋Ｔ細胞をRosette Sep反応混液(StemCell Technologies Inc)を用いて枯渇させ、ＰＢＭＣをFicoll-Hypaque遠心(Amersham-Pharmacia Biotech)によって単離した。細胞を、培養液(ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２、グルタミン及び抗生物質)中に４×１０^６／ｍｌに調整し、３つに分け、５μｇ／ｍｌ フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)、０．５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ又は１ｍｇ／ｌ 抗ＣＤ３ ＭＡｂ ＯＫＴ３にて刺激した。７２時間後、３つすべての刺激細胞を組み合わせて、感染及びウイルス中和実験のために刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞の供与源として用いた。
基本的に既に記載のあるように(Trkola等, J. Virol., 1999, page 8966)、ＨＩＶ中和アッセイを行った。Ｒ５ウイルス(ＣＣＲ５コレセプター特異的細胞株)、ＪＲ-ＦＬ及びＳＦ１６２は既に記載されている(O'Brien等, Nature 1990, 348, page 69；及びShioda等, Nature 1991, 349, page 167)。簡単に言えば、細胞を、精製したポリクローナルウサギＩｇＧ(２５μｇ／ｍｌ−２５ｎｇ／ｍｌ、実施例５又は実施例６から入手)の階段希釈液又はポジティブコントロールＨＩＶインヒビターＲａｎｔｅｓとともに、９６ウェル培養プレート中で３７℃で１時間インキュベートした。

ＨＩＶ-１種菌を、アッセイ培地(ＴＣＩＤ_５０：５０％組織培養感染用量、Trkola等, J. Virol., 1999, page 8966)中におよそ１０００〜４０００のＴＣＩＤ_５０／ｍｌを含むように調整した。ウイルス種菌(１００ＴＣＩＤ_５０；５０％組織培養感染用量)を添加し、７日間プレートを培養した。総感染容量は２００ｍｌであった。次いで、既に記載のあるように(Moore等, 1990. Science 250, page 1139)、上清培養物をイムノアッセイを用いてＨＩＶ−１ ｐ２４抗原産生についてアッセイした。
表３は、精製された抗体が低抗体濃度(例えば０．５６μｇ／ｍｌ)で７０％まで効率的にＨＩＶを中和することを示す。
表３
ＨＩＶを阻害する抗体濃度

ＣＥＭ５．２５細胞によるＨＩＶ中和アッセイ
ウイルス単離ＪＲ-ＦＬに対する精製したマウス血清免疫グロブリン試料の中和活性を、記載のように(Montefiori, D.C. (2004)、ＪＲ-ＦＬエンベロープ偽型ルシフェラーゼリポーターウイルスを用いてＣＥＭ ５.２５.ＥＧＦＰ.ｌｕｃ.Ｍ７細胞(Nathaniel Landau)にて評価した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイのＨＩＶ、ＳＩＶ及びＳＨＩＶに対する中和抗体の評価。Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, 12.11.1-12.11.15.、及びWei, X.,等, Nature 422:307-12)。ＣＥＭ ５.２５.ＥＧＦＰ.ｌｕｃ.Ｍ７細胞を段階希釈したマウス抗体(実施例３から入手)とともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ウイルス種菌(１５０ＴＣＩＤ_５０)及びポリブレン(終濃度１０μｇ／ｍｌ)を加えた。総感染容量は２００ｍｌであった。７２時間後のルシフェラーゼレポーター遺伝子産生において５０％減少(ＮＴ_５０)を引き起すＩｇ濃度を回帰分析によって測定した。
表４は、ＰＮｔＣＣ特異的総ＩｇＧが低濃度でＨＩＶ感染を阻害したのに対して、ＰＮｔＣＮ特異的ＩｇＧが測定したいずれの濃度でもＨＩＶ感染を阻害しなかったことを示す。
表４
ＨＩＶを阻害する抗体濃度

実施例７
Ｑβ-ＰＮｔＣＣのゲル中消化及びＬＣ／ＭＳ分析
Ｑβ-ＰＮｔＣＣ、Ｑβ-ＰＮｔＳＣ及び誘導体化したＱβ( 実施例１から入手)の試料を、還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに流した。１ペプチド当たりＱβ単量体及び１ペプチド当たりＱβ二量体(又は、誘導体化したＱβの場合Ｑβ単量体及びＱβ二量体)に対応するゲルバンドは小さく分かれており、１００μｌの１００ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、５０％アセトニトリルにて２回洗浄し、５０μｌのアセトニトリルにて１回洗浄した。３つすべての上清は廃棄した。次いで、１０μｌ プロテアーゼＧｌｕ-Ｃ(１０ｍＭ トリス ｐＨ８．２中に０．０１ｎｇ／μｌ)及び１０μｌのバッファ(１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．２)を加えて、３７℃で終夜インキュベートした。上清を貯蔵し、ゲル部分を１００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリルにて２回抽出した。３つすべての上清を組み合わせて乾燥させた。試料は、１５μｌの０．１％ギ酸に溶解した。６μｌをＨＰＬＣカラムに注入して、ペプチドの質量をＬＣ／ＭＳによって測定した。

実施例８
ＣＸＣＲ４断片(ａａ１-３９)及び(ａａ１７６-１８５)の化学合と、Ｑβ ＶＬＰへのカップリング
ＣＸＣＲ４断片１-３９のＮ末端ないしＣ末端のいずれかにＣＧＧリンカー配列ないしＧＧＣリンカー配列が融合しているＣＸＣＲ４断片１-３９(配列番号：３０)、Ｎ末端ないしＣ末端のいずれかにＣＧＧリンカー配列ないしＧＧＣリンカー配列が融合しているＣＸＣＲ４断片１７６-１８５(配列番号：２９)、又はＣ末端に付加したＧとＮ末端に付加したＣが結合することによって環状になったＣＸＣＲ４断片１７６-１８５(配列番号：２９)を、標準的な方法(Peter Henklein, Charite)に従って化学的に合成した。
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２による３ｍｌ(１．０ｍｇ／ｍｌ)のＱβ ＶＬＰの溶液を、８５μｌのＳＭＰＨ(ＤＭＳＯ中に５０ｍＭ、Pierce)にて２５℃で３０分間反応させた。透析して、誘導体化したＱβ ＶＬＰを順に用いて、ペプチド類ＣＸＣＲ４-ＣＧＧ-１-３９、ＣＸＣＲ４-１-３９-ＧＧＣ、ＣＸＣＲ４-ＣＧＧ-１７６-１８５、ＣＸＣＲ４-１７６-１８５-ＧＧＣ又はＣＸＣＲ４-Ｃ-１７６-１８５-Ｇをカップリングした。簡単に言うと、１ｍｇ／ｍｌの濃度の１ｍｌの誘導体化したＱβ ＶＬＰを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２中で、７０μｌの５ｍＭ ペプチド溶液と反応させた。
カップリング効率は、１Ｑβ単量体当たり０．２４〜０．５のＣＸＣＲ４断片であることが推測された。

実施例９
ＣＸＣＲ４断片によるマウスの免疫化
成体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり３匹)にＱβ-ＣＸＣＲ４-断片(実施例８にて入手)をワクチン接種し、Ｑβ ＶＬＰをコントロールとして用いた。各試料から透析したワクチン １００μｇをＰＢＳにて２００μｌの容量に希釈し、０日目及び１４日目に皮下注射した(腹部側の２箇所に１００μｌ)。アジュバントのある場合又はない場合のワクチンを投与した(アルハイドロゲル、１ｍｇ／注射)。１４、２１、２８日目にマウスの後眼窩から採血し、ペプチド-特異的抗体応答を、コーティングバッファ(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６)中１０μｇ／ｍｌの濃度のＲＮアーゼにカップリングさせたＣＸＣＲ４-ペプチドをコートすることによってＥＬＩＳＡにて測定した。ＣＸＣＲ４はＲＮアーゼにカップリングした。簡単に言えば、以下の通りである：５ｍｇ／ｍｌ ＲＮアーゼを、０．２ｍＭ ＳＰＤＰ(SIGMA)中で室温で１時間かけて誘導体化した。次いで、誘導体化したＲＮアーゼ溶液をＰＤ１０カラム(Amersham)にて精製した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ペプチドを誘導体化したＲＮアーゼ溶液に加えて、１時間インキュベートして反応させた。
表５

１グループ当たり３匹のマウスの血清の平均ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ力価を示す。

実施例１０
ヒトＴ細胞株ジャーカット及びＣＥＭ.ＮＫＲ-ＣＣＲ５の表面染色によるＣＸＣＲ４-特異的抗体の検出
ジャーカット細胞又はＣＥＭ.ＮＫＲ-ＣＣＲ５細胞は、１０％ＦＣＳ、グルタミン及び抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０培養液中で生育させた。細胞を回収して、洗浄し、１％ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)を含有するリン酸塩緩衝食塩水(ＰＢＳ)に再懸濁した。Ｆｃ-レセプター媒介結合を予防するために、初めに細胞を、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ中でラット-α-マウス-ＣＤ１６／ＣＤ３２(BD Pharmingen)にて４℃で３０分間インキュベートした。洗浄の後、細胞(１×１０^５)を、段階希釈したマウス血清(実施例１０から入手)とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／１％ＦＣＳにて洗浄し、ＦＩＴＣ-α-マウス-ＩｇＧ(BD Pharmingen)とともに４℃で３０分間インキュベートし、次いで細胞をＦＡＣＳ Caliburにて分析し、抗体の特異的結合をCellQuestソフトウェア(BD Biosciences)を用いて定量化した。結果を以下の表にまとめる。
表６

* １:２００の希釈の第一免疫化の２１日後の血清を細胞の染色に用いた。

実施例１１
Ｒ４ ＨＩＶ−１株中和アッセイ
簡単に言えば、３体の健康な血液ドナーから入手したバフィーコート中のＣＤ８＋Ｔ細胞をRosette Sep反応混液(StemCell Technologies Inc)を用いて枯渇させ、末梢血単核細胞をFicoll-Hypaque遠心(Amersham-Pharmacia Biotech)によって回収した。精製した細胞を、培養液(ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２、グルタミン及び抗生物質)中に４×１０^６／ｍｌに調整し、３つの試料に分け、５μｇ／ｍｌ フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)、０．５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ又は１ｍｇ／ｌ 抗ＣＤ３ ＭＡｂ ＯＫＴ３にて刺激した。７２時間後、細胞を組み合わせて、感染及びウイルス中和実験のために刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞として用いた。
中和の可能性を試験するために、細胞を、精製したポリクローナルマウスＩｇＧ(上記のもの)の階段希釈液又はコントロール抗体１２Ｇ５(２５μｇ／ｍｌ−２５ｎｇ／ｍｌ：Pharmingen)とともに、９６ウェル培養プレート中で３７℃で１時間インキュベートした。
Ｘ４株ＮＬ４-３及び２０４４は既に記載されている(Trkola等 (1998), J. Virol. 72:396；Trkoly等 (1998), J. Virol 72-1876)。そして、ウイルス種菌(１００ＴＣＩＤ_５０；５０％組織培養感染用量；Trkola等, J. Virol., 1999, page 8966)を加えて、細胞を更に４〜１４日間培養した。総感染容量は２００μｌである。感染の６日後、既に記載のあるように(Moore等, 1990. Science 250, page 1139)、イムノアッセイを用いて上清をＨＩＶ−１ ｐ２４抗原産生の量についてアッセイした。

実施例１２
Ｑβ ＶＬＰへのＣＥＴＰ断片のカップリング
ヒトＣＥＴＰのアミノ酸４６１-４７６(配列番号：３２)の範囲の、ＶＬＰにカップリングするためのトリペプチドＣＧＧによってそのＮ末端で融合したカルボキシ末端配列を有するＣＥＴＰペプチドＣＥＴＰ１を、EMC microcollections GmbHの固相化学によって合成した。ペプチドはそのＣ末端でアミド化されていた。
Ｑβ ＶＬＰを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４ ７５０μｌ(４．０ｍｇ／ｍｌ)の溶液を、１０倍量のＳＭＰＨ(ＤＭＳＯ中に１００ｍＭ貯蔵液 ２１．４μｌ、Pierce)と２５℃で３０分間反応させた。２ｍｇ／ｍｌの濃度の誘導体化したＱβ ＶＬＰ １．５ｍｌを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で、２１μｌの５０ｍＭ ＣＥＴＰペプチド溶液と反応させた。

実施例１３
Ｑβ-ＣＥＴＰ１及びＥＬＩＳＡによるマウスの免疫化
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス(ｎ＝３)に、Ｑβ ＶＬＰにカップリングさせたＣＥＴＰ１をワクチン接種した。５０μｇの透析したワクチンをＰＢＳにて２００μｌの容量にまで希釈し、０、１４、５０及び７３日目に皮下に注射した(腹部側の２箇所に１００μｌ)。ワクチンはアジュバントなしで投与した。抗体価は、０、７０及び８０日目にマウスの後眼窩血液の血清にて決定した。
ＣＥＴＰ１は、ＥＬＩＳＡプレートにコートするためにＡＰ２０５ ＶＬＰ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４)にカップリングさせた。簡単に言うと、１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ ＡＰ２０５ ＶＬＰを、７．１μｌの５０ｍＭ ＳＭＰＨ(Pierce)貯蔵液(ＤＭＳＯ中)にて室温で３０分かけて誘導体化した。誘導体化したＡＰ２０５溶液(１ｍｌ)を、７．１μｌの５０ｍＭ貯蔵液のＣＥＴＰ１(ＤＭＳＯ中)と反応させて、１５℃で２時間インキュベートした。また、ＣＥＴＰ１を、ＥＬＩＳＡプレートにコートするためにＢＳＡにカップリングした。
ＥＬＩＳＡプレートは、コーティングバッファ(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６)中５μｇ／ｍｌの濃度の、ＡＰ２０５ ＶＬＰ又はＢＳＡにカップリングさせたＣＥＴＰペプチドにて、４℃で終夜をかけてコートした。

表７ Ｑβ-ＣＥＴＰ１にて０、１４、５０及び７３日目に免疫化したマウスにおける、平均抗ＣＥＴＰ１特異的ＩｇＧ抗体力価(ＥＬＩＳＡアッセイ中で最大半量の結合を示す血清希釈物の逆数として表す)。

実施例１４
ＡＰ２０５ ＶＬＰのＣ末端に融合するＣＥＴＰ１のクローニング、発現及び精製
クローニング
ＣＥＴＰ１ペプチド(配列番号：３２)をコードするＤＮＡ断片を、ＣＥＴＰ１のペプチド配列をコードし、Ｋｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉ制限部位をそれぞれ含有している２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニールすることによって作製した。得られた断片を、Ｋｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉにて消化し、大腸菌トリプトファンオペロンプロモーターの制御下にあるベクターｐＡＰ４０５-６１(国際公開第２００６／０３２６７４号の実施例１に記載)の同じ制限部位にクローニングした。
結果として生じるプラスミドによってコードされるタンパク質ＡＰ２０５-ｌｌ-ＣＥＴＰ１は以下の通りである。ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG - FGFPEHLLVDFLQSLS。
基本的に国際公開第０４／００７５３８号に記載のようにＡＰ２０５-ｌｌ-ＣＥＴＰ１は発現され、精製される。

実施例１５
コレステロール肥育のアテローム性動脈硬化のウサギモデルにおけるＣＥＴＰワクチンの試験
ニュージランドホワイト種ウサギ(１グループ当たりｎ＝１２)に、０日目に２００μｇのＶＬＰ-ＣＥＴＰワクチン又はＶＬＰを皮下注射してワクチン接種し、３、６、９、１２、１５、１９、２３及び２７週目に追加免役した。ウサギは、１９週目に高コレステロール食餌(０．２５％)下におき、さらに１６週間この食餌を与えた。断食させたウサギの血漿試料を、抗体価、リポタンパク質、コレステロール及びＣＥＴＰ活性測定のために一定間隔で採取した。動物は３２週目に屠殺して、アテローム性動脈硬化病変分析のために大動脈を取り出した。大動脈の「en face」調整の後、大動脈をオイルレッドＯにて染色し、各動物について病変に覆われる大動脈の割合を算出した。

実施例１６
Ｑβ ＶＬＰへのブラジキニン及びｄｅｓ-Ａｒｇ９-ブラジキニンのカップリングとマウスの免疫化
Ｃ末端に融合したＣｙｓにて両配列又はブラジキニン(ＢＫ)のＮ末端に融合したＣｙｓを有するブラジキニン(ＢＫ)(配列番号：２２)及びｄｅｓ-Ａｒｇ９-ブラジキニン(配列番号：２３)を、標準的方法に従って化学的に合成した。ペプチドはＱβ ＶＬＰにカップリングした。
成体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり１０匹)に、０、１４及び２８日目に、５０μｇの、ＱβにカップリングしたＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫ又はＱβ-ＢＫの何れかを皮下注射にてワクチン接種した(腹部側の２箇所に１００μｌ)。ワクチンはアジュバントなしで投与した。０、１４、２１及び３０日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、ＢＫ又はｄｅｓ-ＢＫに特異的な抗体を標準的なプロトコールに従ったＥＬＩＳＡによって測定した。
初めに、ＢＫ又はｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫをＲＮアーゼ(SIGMA)にカップリングした。ＥＬＩＳＡプレートを、コーティングバッファ(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６)中１０μｇ／ｍｌの濃度のＲＮアーゼにカップリングしたブラジキニンペプチドにてコートした。

表８ Ｑβ-ＢＫ又はＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫそれぞれにて０及び１４日目に免疫化したマウスにおける、平均抗ＢＫ及び抗ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫ特異的ＩｇＧ抗体力価(希釈因子として表す)。

実施例１７
コラーゲン誘導性関節炎の治療のためのＱβ-ＢＫ、Ｑβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫに対するワクチン接種の有効性
１グループ当たり１０匹の雄ＤＢＡ／１マウスに、５０μｇのＱβ-ＢＫ、Ｑβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫ又はＱβ単独にて３回皮下に免疫化した(０、１４及び２８日目)。次いで、マウスに、完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシコラーゲンＩＩ型を２回皮下注射した(３４及び５５日目)。
２回目のコラーゲン／ＣＦＡ注射マウスを定期的に調べ、赤色化及び腫脹の観察の程度によって０から３の範囲の臨床スコアを各肢に割り当てた。２回目のコラーゲン／ＣＦＡ注射の３週後に、肢ごとの平均臨床スコアは３通りの実験群において決定した。

実施例１８
アレルギー性気道炎症(ＡＡＩ)の治療のためのＱβ-ＢＫ及びＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫに対するワクチン接種の有効性
アレルギー性気道炎症の実験的喘息モデルを用いて、肺への好酸球流入、サイトカイン(ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-１３)産生、ＩｇＥ抗体及び粘液産生と気管支過敏症(ＢＨＲ)に特徴があるＴｈ媒介性免疫応答に対する、ブラジキニン(ＢＫ)及びｄｅｓ-Ａｒｇ９-ブラジキニン(ｄｅｓ-Ａｒｇ９-Ｂｋ)に対するワクチン接種の効果を評価する。Ｂａｌｂ／ｃマウス(１グループ当たり５匹)を、実施例１６に記載のＱβ-ＢＫ又はＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫのいずれかにて免疫化するか、又はＱβ単独を注射する。第一免疫化の３５日後に、マウスに、アジュバント(Alhydrogel)を含む又は含まない５０μｇの卵白アルブミン(ＯＶＡ)を腹腔内投与する。１０日後(すなわち４５日目)に、すべてのマウスに、５０μｇのＯＶＡを含むＰＢＳを連続する４日間、鼻腔内投与して、毎日抗原刺激する。最後の抗原投与の２４時間後に、全身phlegtismographによってＢＨＲを決定する。次いで、マウスを特定の時点で屠殺し、肺炎症及びＴｈ２媒介性免疫応答を分析する。ＰＢＳ／１％ＢＳＡにて肺洗浄を行う。気管支肺胞洗浄(ＢＡＬ)に含まれる細胞をCoulter計算機(Instrumenten Gesellschaft AG)にて計数し、既に記載のあるように(Trifilieff A,等 Clin Exp Allergy. 2001 Jun; 31(6): 934-42)、Maigrunwald-Giemsa染色にて区別した。

実施例１９
Ｑβ ＶＬＰへのガストリン又はガストリン断片のカップリング
以下のガストリンペプチド類は標準的方法に従って合成した。

透析して、誘導体化したＱβ ＶＬＰを続いて用いてｃ１Ｇ１７をカップリングした。簡単に言うと、１ｍｌの誘導体化したＱβ ＶＬＰ(２ｍｇ／ｍｌの濃度)を、１６７μｌの１０ｍＭ ペプチドＤＭＳＯ溶液及び１００μｌのアセトニトリルと、１５℃で２時間反応させた。カップリング産物をＱβ-ｃ１Ｇ１７と称した。カップリング効率[すなわちモルＱβ-ガストリン／モルＱβ単量体(総)]を、クーマシーブルー染色したＳＤＳ-ＰＡＧＥの濃度測定分析によって推定すると、１Ｑβ単量体当たり２．４のｃ１Ｇ１７断片であった。
透析して、誘導体化したＱβＶＬＰを続けて用いて、ｎＧ１７アミド、ｎＧ１７-Ｇ、ｎＧ３４アミド又はｎＧ３４-Ｇをカップリングした。簡単に言うと、８４μｌの誘導体化したＱβ ＶＬＰ(２ｍｇ／ｍｌの濃度)を、１２μｌの１０ｍＭ ペプチド溶液及び４μｌのＨ_２Ｏと１５℃で２時間反応させた。カップリング産物はそれぞれ、Ｑβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミド及びＱβ-ｎＧ３４-Ｇと称した。

実施例２０
ジフテリアトキソイド(ＤＴ)及びＱβへのＧ１７(１-９)Ｃ２(配列番号：３９)のカップリング
ＤＴへのＧ１７(１-９)Ｃ２のカップリングのために用いるプロトコールは、米国特許第５８６６１２８号の実施例１と同じであった。簡単に言うと、ＤＴ(List Biological Laboratories)を、１００μｌの０．２Ｍ リン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ６．６に１ｍｇのＤＴを溶解することによって活性化した。別に、２ｍｇのＳＭＰＨを８０μｌのＤＭＳＯに溶解した。１２μｌのＳＭＰＨを１００μｌのＤＴに加えた。室温で２時間インキュベーションした後、混合物を、２Ｌの０．１Ｍ クエン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ６．０に対して、２時間、２回透析した。カップリング産物はＤＴ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２と称した。
透析して、誘導体化したＱβ ＶＬＰを続いて用いてＧ１７(１-９)Ｃ２をカップリングした。簡単に言うと、８４μｌの誘導体化したＱβ ＶＬＰを、６μｌの１０ｍＭ ペプチドＤＭＳＯ溶液及び６μｌのＨ_２Ｏと１８℃で２時間反応させた。カップリング産物はＱβ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２と称した。

実施例２１
Ｑβ-ｃ１Ｇ１７、Ｑβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミド、Ｑβ-ｎＧ３４-Ｇ、Ｑβ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２及びＤＴ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２によるマウスの免疫化
成体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｑβ-ｃ１Ｇ１７(１グループ当たり５匹のマウス)、Ｑβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミド及びＱβ-ｎＧ３４-Ｇ(１グループ当たり３匹のマウス)をワクチン接種した。５０μｇのＱβ-ｃ１Ｇ１７又は２５μｇのＱβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミド及びＱβ-ｎＧ３４-Ｇ(実施例２４にて入手)を、ＰＢＳにて２００μｌの容量に希釈し、０日目及び１４日目に皮下注射した(腹部側の２箇所に１００μｌ)。ワクチンはアジュバントなしで投与した。コントロールとして、１グループのマウスに５０μｇのＱβを注射した。Ｑβ-Ｃ１Ｇ１７にて免疫化したマウスは０、１４、２１、２８、４２、６９及び１０１日目に後眼窩から採血し、Ｑβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミド及びＱβ-ｎＧ３４-Ｇにて免疫化したマウスは０、１４、２１、２８、４２、５６及び７７日目に後眼窩から採血した。
成体雌Ｃ５７／ＢＬ６を、１マウスにつき１ｍｇのミョウバンを有するＱβ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２、又は１マウスにつき１ｍｇのミョウバンを有さないＱβ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２、及び１マウスにつき１ｍｇのミョウバンを有するＤＴ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２(１グループ当たり５匹のマウス)にて免疫化した。５０μｇのＱβ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２及びＤＴ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２をＰＢＳにて２００μｌの容量に希釈し、０日目及び１４日目に皮下注射した(腹部側の２箇所に１００μｌ)。０日目と１４日目にマウスの後眼窩から採血した。これらガストリン断片に特異的な抗体の力価は、コーティングバッファ(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６)中１０μｇ／ｍｌの濃度のＲＮアーゼにカップリングしたｃ１Ｇ１７又はｎＧ１７アミド、ｎＧ１７-Ｇ、ｎＧ３４アミド、ｎＧ３４-Ｇにて、ＥＬＩＳＡプレート(９６ウェルMAXIsorp、ＮＵＮＣイムノプレート)をコートすることによってＥＬＩＳＡにて測定した。

表９ ０日目及び１４日目にＱβ-ｃ１Ｇ１７、Ｑβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミド及びＱβ-ｎＧ３４-Ｇそれぞれにて免疫化したマウスにおける、平均抗-ｃ１Ｇ１７-、ｎＧ１７アミド、ｎＧ１７-Ｇ、ｎＧ３４アミド又はｎＧ３４-Ｇ特異的ＩｇＧ抗体力価(希釈因子として表す)。これは、ガストリン-ＶＬＰコンジュゲートがガストリン断片に対して高い抗体価を誘導することできることを明らかに示唆する。
表９

表１０は、Ｇ１７(１-９)Ｃ２-特異的抗体の平均力価を示す。ＥＬＩＳＡ力価は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて最大半量のＯＤとなる血清希釈物として表す。ミョウバン又はＤＴ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２のある場合又はない場合のＱβ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２によって免疫化したマウスにおいて、１４日目までにそれぞれおよそ１:４２４２、１:５８３８及び１:７８８の平均的な力価に達した。最大半量のＯＤ力価は１００未満であり、それはアッセイのカットオフより下であると考えられた。これは、Ｑβ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２がＤＴ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２より早くてより高い抗体応答を誘導することが可能なことを明らかに示唆する。
表１０

実施例２２
ｃ１Ｇ１７に対して生じた血清のＣＣＫ８への交差反応性の調査
ＥＬＩＳＡプレートは、コーティングバッファ(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６)中０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のｃ１Ｇ１７又はＣＣＫ８(SIGMA)にて４℃で終夜をかけてコートした。ｃ１Ｇ１７コートプレートからのＥＬＩＳＡ力価が１２５０であったのに対して、ＣＣＫに対する明らかな反応性は観察されなかった(図１Ａ)。
また、阻害ＥＬＩＳＡにおいて交差活性を調べた。ＥＬＩＳＡプレートは、コーティングバッファ(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６)中０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のｃ１Ｇ１７又はＣＣＫ８(SIGMA)にて４℃で終夜をかけてコートした。Ｑβ-ｃ１Ｇ１７(実施例２１から入手)に対して生じたマウス血清(免疫処置の１４日後)を、段階的に希釈したｎＧ１７アミド又はＣＣＫ８のいずれかとともに、６００回転数／分で振とうしながら保温ブロック上で３７℃で２時間インキュベートした。次いで、これらの血清をＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。ｎＧ１７アミドのプレインキュベーションによりコートしたｎＧ１７アミドへの血清の認識を阻害したのに対して、ＣＣＫの阻害活性は観察されなかった。これら２つの実験は、Ｑβ-ｃ１Ｇ１７によって生じた抗体がＣＣＫ８と交差反応しなかったことを示した(図１Ｂ)。

実施例２３
ＱβへのＣ５ａ及びＣ５ａ断片のカップリング
Ｎ末端ＣＧＳＧＧリンカーを含有するマウスのＣ５ａアミノ酸配列(配列番号：４７、以降ｍＣ５ａｃｙｓと称する)をDictagene SAによって化学的に合成した。マウスのＣ５ａ配列のＣ末端の１９アミノ酸は、Ｎ末端の付加的なＣＧＧリンカーにより化学的に合成した(EMC Microcollections)(配列番号：４８、以降ｍＣ５ａｃｙｓ^{５９-７７}と称する)。
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中の１４３μＭ Ｑβ ＶＬＰ溶液を、２倍モル過剰(２８６μＭ)のＳＭＰＨ(Pierce)と、振とうしながら２５℃で３０分間反応させた。透析の後、等モル量のｍＣ５ａｃｙｓを、ＳＭＰＨ誘導体化Ｑβ ＶＬＰの３６μＭ溶液に加えた。反応容量は１００μｌであり、反応は振とうしながら１５℃で２時間インキュベートした。
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中の２００μＭ Ｑβ ＶＬＰ溶液を、５倍モル過剰(１ｍＭ)のＳＭＰＨ(Pierce)と、振とうしながら２５℃で３０分間反応させた。透析の後、５倍モル過剰のｍＣ５ａｃｙｓ^{５９-７７}を、ＳＭＰＨ誘導体化Ｑβ ＶＬＰの１０７μＭ溶液に加えた。反応は振とうしながら１５℃で２時間インキュベートした。

実施例２４
Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓワクチンによるマウスの免疫化とｍＣ５ａｃｙｓ-特異的抗体の検出
必要であれば０及び１４日目に実施例２３に記載のように調製した５０μｇのＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓワクチンをマウスの皮下に投与して免疫化した。１４日目及び２１日目及び続くタイムポイントでマウスの後眼窩又は尾静脈から採血した。これらの血液から血清を確保し、Ｃ５ａ特異的ＥＬＩＳＡによって分析した。ネガティブコントロールとして、マウスに５０μｇのＱβ-ＶＬＰ又はＰＢＳのみを投与した。抗ｍＣ５ａｃｙｓ ＩｇＧ抗体力価は、０．１Ｍ 炭酸塩バッファ(ｐＨ９．６)中の１μｇ／ｍｌのｍＣ５ａｃｙｓにて終夜コートすることによってＥＬＩＳＡにて測定した。
表１１は、予めＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓ、Ｑβ ＶＬＰ単独又は無処理のいずれかにて免疫化して２４日目のマウスの血清を用いたアッセイの代表的な結果を示す。Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓワクチンを投与したマウスは、プレートコートｍＣ５ａｃｙｓに対するＩｇＧ抗体応答を確実に示した。
表１１

実質的に上記と同じように、マウスに５０μｇのＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓ^{５９-７７}を皮下投与して免疫化する。

実施例２５
全身ｍＣ５ａｃｙｓのインビボ効果を中和するＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓワクチン免疫化
ｍＣ５ａｃｙｓの生物活性は、少量のｍＣ５ａｃｙｓの静脈内投与の後の血液顆粒球数の見かけの低下を測定することによって、好中球減少症アッセイにおいてインビボで決定した。
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(６〜８週齢)を麻酔して、側方尾静脈から１００μｌ溶液を注射した。マウスに、ＰＢＳ、ｍＣ５ａｃｙｓを含むＰＢＳ又はＱβキャプシドを含むＰＢＳのいずれかを投与した。３分後に、マウスの後眼窩から採血し、抗凝血物質ヘパリン(Roche)を含有する２ｍｌのＰＢＳへ１００μｌの全血液を移した。細胞を、室温で、１０分間、４５０×ｇで遠心してペレット状にした。上清を吸引した後に、細胞ペレットを、室温で、５分間かけて２ｍｌのトリスアンモニウムクロライド(ＴＡＣ)溶液(１７ｍＭ トリス、１２６ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、ｐＨ７．２)に再懸濁して、赤血球を溶解した。残りの細胞を遠心によってペレット状にし、ＴＡＣ処理を繰り返した。残りの細胞を遠心によって再びペレット状にし、５０μｌのフローサイトメトリー洗浄バッファ(２％(ｖ／ｖ)ウシ胎児血清及び０．１％ＮａＮ_３を含有するダルベッコＰＢＳ)に再懸濁した。細胞をフローサイトメーター(FACSCalibur, Becton Dickenson)に通し、前方及び側方の光散乱ゲーティングによって顆粒球の分画を測定した。

ｍＣａ５ｃｙｓが好中球減少症を誘導することを示す代表的な実験を表６に示す。この場合、１ｎｍｏｌのｍＣ５ａｃｙｓが、ＰＢＳ処理マウス及びμｇのＱβキャプシドタンパク質を投与したマウスと比較して、統計学的に有意な好中球減少症を誘導したことは、合成されたｍＣ５ａｃｙが生物学的活性を有することを示唆する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ダルベッコＰＢＳにて希釈した５０μｇのＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓを横腹の皮下に投与して免疫化した。コントロールマウスはＱβ単独を投与するか、無処理とした。実験の０日目及び１４日目に免疫処置を行った。初めの免疫処置の２２日後に、５０ｐｍｏｌのｍＣ５ａｃｙｓを側方尾静脈から静注して、全身性好中球減少症を誘導した。Ｑβ ＶＬＰ単独にて免疫化したマウス又は無処置のマウスにおいて、５０ｐｍｏｌのｍＣ５ａｃｙｓ投与の３分後に血中の顆粒球の割合が低下した。Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓにてワクチン接種したマウスにおいて、血中顆粒球の割合の低下は予防された。したがって、Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓによる免疫化によりマウスに生じた抗ｍＣ５ａ抗体は、静脈内ｍＣ５ａｃｙｓの投与によって誘導される全身好中球減少症応答を中和することが可能である(表１２)。

表１２

実施例２６
Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓ ＶＬＰによる免疫化によるコラーゲン誘導性関節炎モデルマウスの疾患の軽減
雄６週齢のＤＢＡ／１ＪＣｒｌマウス(Charles River, Deutschland)を、ともにダルベッコＰＢＳにて希釈した５０μｇのＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓ(ｎ＝８)又は５０μｇのＱβ ＶＬＰ(ｎ＝８)を横腹の皮下に投与して免疫化した。初めの免疫処置の１５及び２４日後に、３０μｇのＱβ-ｍＣ５ａ又は３０μｇのＱβ ＶＬＰの皮下投与により、更に２回追加免疫処置した。初めの免疫処置の３５及び５７日後に、完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ)にて１：１の比でガラスシリンジを用いて乳化した１００μｇのウシＩＩ型コラーゲン(MD Biosciences)を、マウスの尾基部の皮下に２回投与して免疫化した。ＣＦＡは、５ｍｇ／ｍｌの熱処理した結核菌株Ｈ３７ＲＡ (Difco Laboratories)を含有する不完全フロイントアジュバント(Difco Laboratories)から調製した。次いで、マウスは、前肢及び後肢の関節厚を毎日測定して、関節臨床スコアを毎日評価することによってコラーゲン誘導性関節炎の誘導及び重症度をモニターした。関節厚は、一定張力測径器(constant-tension calipers)を用いて測定した。臨床スコアは、以下のスケールに基づいて割り当てた：スコア０− 腫脹なし、関節正常；スコア１− 指／足の軽度の赤み及び／又は腫脹；スコア２− 全ての足／関節に赤み及び腫脹を伴う；スコア３−重度腫脹、強直を有する足／関節の変形。実験の診察は、最終コラーゲン／ＣＦＡ投与の１５日後(初めの免疫処置から７２日目)まで続けた。
表１３は、最終コラーゲン／ＣＦＡ投与後の四肢全体の関節厚の平均増加を示す。関節厚の平均増加は、Ｑβコントロールと比較してＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓワクチン接種グループについてほとんどの日において低く、最終コラーゲン／ＣＦＡ投与の５、７及び１０日後にｐ値＜０．１(両側ｔ検定による)を有する相違であった。

表１３

図２ａは、最終コラーゲン／ＣＦＡ投与後の四肢全体の平均臨床スコア合計を示す。平均臨床スコア合計は、Ｑβ ＶＬＰコントロールと比較してＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓワクチン接種グループにおいて一貫して低く、最終コラーゲン／ＣＦＡ投与の６、８、１２及び１４日後にｐ値＜０．１(両側ｔ検定による)であり、７、９及び１０日後にｐ値＜０．０５(両側ｔ検定による)を有する相違であった。この結果は、Ｑβ保因ワクチン接種動物と比較した場合に、Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓによるワクチン接種によりマウスのコラーゲン誘導性関節炎の重症度が軽減されることを意味する。

実施例２７
Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓ ＶＬＰによる免疫化による抗コラーゲン-モノクローナル抗体-反応混液誘導性関節炎モデルマウスの疾患の軽減
雌６〜８週齢のｂａｌｂ／ｃマウス(Charles River)を、すべてダルベッコＰＢＳにて希釈した５０μｇのＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓ(ｎ＝５)又は５０μｇのＱβ ＶＬＰ(ｎ＝５)を横腹の皮下に投与して免疫化した。初めの免疫処置の２１及び３５日後に、５０μｇのＱβ-ｍＣ５ａ又は５０μｇのＱβ ＶＬＰのいずれかの皮下投与により、更に２回追加免疫処置した。初めの免疫処置の４１日後に、２００μｌの抗コラーゲンモノクローナル抗体反応混液(MDBiosciences)を静注し、その１日後に１００μｌのＬＰＳ溶液(MDBiosciences)を腹膜内投与してマウスを免疫化した。実質的には実施例２６に記載されるのと同様に、マウスの抗コラーゲンモノクローナル抗体誘導性関節炎の誘導と重症度についてモニターした。実験の診察は、抗コラーゲンモノクローナル抗体反応混液投与の１４日後(初めの免疫処置の５５日後)まで続けた。
図２ｂは、抗コラーゲンモノクローナル抗体反応混液投与後の四肢全体の平均臨床スコア合計を示す。平均臨床スコア合計は、Ｑβ ＶＬＰコントロールと比較してＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓワクチン接種グループにおいて一貫して低く、最終コラーゲン／ＣＦＡ投与の３、４、７、８、９、１０、１１及び１３日後にｐ値＜０．１(両側ｔ検定による)であり、１２及び１４日後にｐ値＜０．０５(両側ｔ検定による)を有する相違であった。この結果は、Ｑβ保因ワクチン接種動物と比較した場合に、Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓによるワクチン接種によりマウスの抗コラーゲン-モノクローナル抗体誘導性関節炎の重症度が軽減されることを意味する。

実施例２８
Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓ ＶＬＰによる免疫化と、全身性エリテマトーデスのニュージーランドブラック／ニュージランドホワイト種Ｆ１交雑モデル
ＮＺＢ／ＮＺＷ Ｆ１マウスは、自然発生的に、ヒトの全身性エリテマトーデスに著しく似た自己免疫性疾患を発症する(Andrews等 J. Exp. Med., 148: 1198, 1978)。雌１６週齢のＮＺＢ／ＮＺＷ Ｆ１マウス(Charles River)を、すべてダルベッコＰＢＳにて希釈した５０μｇのＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓ(ｎ＝２０)又は５０μｇのＱβ ＶＬＰ(ｎ＝２０)を横腹の皮下に投与して免疫化した。初めの免疫処置の１４及び２８日後に、５０μｇのＱβ-ｍＣ５ａ又は５０μｇのＱβ ＶＬＰのいずれかの皮下投与により、更に２回追加免疫処置した。５８日目に、５０μｇのＱβ-ｍＣ５ａ又は５０μｇのＱβ ＶＬＰいずれかとミョウバンにより更に追加免疫した。尿(タンパク尿症)に排出されるタンパク質の量を、尿試験紙(Roche)による色彩計量的分析により、１６週齢(０日目)から２９週齢(９１日目)まで週ごとに測定した。タンパク尿症は更に５２週齢まで毎週測定して、必要に応じて更なる追加免疫により抗体価を高く保った。
図３は、タンパク尿症値が３００ｍｇ／ｄＬに達するマウスの割合を示す。これらのデータは、Ｑβ処置グループの３０％のマウスが２９週齢までに３００μｇ／ｍｌ以上のタンパク尿症値を有したことを示す。ＱβＣ５ａｃｙｓ処置グループの１匹のマウスだけは、この週齢で３００μｇ／ｍｌを超える値を有した。この特定のマウスは、ＥＬＩＳＡにて測定するところの低Ｃ５ａｃｙｓ抗体価を有した。この結果は、Ｑβ保因ワクチン接種動物と比較して、Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓを有するワクチン接種により、全身性エリテマトーデスのニュージーランドブラック／ニュージーランドホワイトＦ１モデルにおけるタンパク尿症の発症率が下がるか、ないしは発症が遅延することを意味する。

Ａは、ｎＧ１７アミド又はＣＣＫ８の何れかによりコートして、段階希釈したマウス血清とインキュベート(免疫化後１４日間)したプレートのＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｂは、阻害性ＥＬＩＳＡの結果を示す。このとき、血清は、段階的に希釈したｎＧ１７アミド又はＣＣＫ８とともに予めインキュベートして、コートしたプレートに添加した。 Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓ又はＱβ ＶＬＰによって免疫化されたマウスの最終コラーゲン／ＣＦＡ投与の後(Ａ)、又は、最終抗コラーゲン-モノクローナル抗体混合液投与の後(Ｂ)の、四肢すべての平均臨床スコア合計を示す。ｘ軸はコラーゲン投与後の日数、ｙ軸はすべての肢の臨床スコアの平均合計を表す。 ３００μｇ／ｍｌを超えるタンパク尿症を示した、Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓ又はＱβ ＶＬＰの何れかによって免疫化したマウスの割合を示す。

Claims (25)

1. (a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、
   (b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原とを含んでなる組成物であり、このとき該少なくとも１の抗原が：
   a) 本発明のＣＣＲ５；
   b) 本発明のＣ５ａ；
   c) 本発明のＣＸＣＲ４；
   d) 本発明のガストリン；及び、
   e) 本発明のＣＥＴＰ；からなる群から選択されるものであり、
   そして(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位で連結される、組成物。
2. (a) 少なくとも２の第一付着部位を有するＲＮＡ-バクテリオファージのウイルス様粒子；と、
   (b) 少なくとも２の第二付着部位を有する少なくとも１のＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔ；とを含んでなり、
   このとき該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔが、
   (i) Ｎｔａドメイン又はＮｔａドメイン断片、と、
   (ii) 配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７を含んでなるＮｔｂドメイン(配列番号：５６)又は配列番号：２７のアミノ酸２３〜２７を含んでなるＮｔｂドメイン断片を含んでなり、
   このとき少なくとも２の第二付着部位の一つ目又は二つ目がスルフヒドリル基を含んでなり、
   該少なくとも２の第二付着部位の一つ目は、配列番号：２７の該アミノ酸２３〜２７のＮ末端の上流位置し；そして、
   該少なくとも２の第二付着部位の二つ目は、該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔのＣ末端の下流に位置し；そして、
   該ＲＮＡ-バクテリオファージの該VLPと該ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔが少なくとも１の非ペプチド共有結合によって連結されるものである、請求項１に記載の組成物。
3. 少なくとも２の第二付着部位を有する前記ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔは、少なくとも２の第二付着部位の一つ目と二つ目が含有する該２つのスルフヒドリル基の他に、更なるスルフヒドリル基を含んでなる、請求項２に記載の組成物。
4. 前記少なくとも２の第二付着部位の一つ目は、配列番号：２７のシステイン残基のスルフヒドリル基に対応する、請求項２又は３に記載の組成物。
5. 前記ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔが配列番号：２７のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２から４の何れか一に記載の組成物。
6. さらに、リンカーを含んでなり、該リンカーが前記ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔのＣ末端に融合し、該リンカーが前記少なくとも２の第二付着部位の二つ目を含んでなり、好ましくは該リンカーがシステイン又はアミド化されたシステインである、請求項２から５の何れか一に記載の組成物。
7. 前記少なくとも２の第二付着部位の一つ目及び二つ目が、少なくとも２の非ペプチド共有結合により前記少なくとも２の第一付着部位と結合する、請求項２から６の何れか一に記載の組成物。
8. 前記ＲＮＡ-バクテリオファージがＱβ又はＡＰ２０５である、請求項２から７の何れか一に記載の組成物。
9. 前記少なくとも２の第一付着部位の各々がアミノ基を含んでなる、請求項２から８の何れか一に記載の組成物。
10. 前記ＣＣＲ５がＣＣＲ５細胞外ドメインであり、好ましくは該ＣＣＲ５細胞外ドメインがＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔであり、さらに好ましくは該ＰＮｔドメインが配列番号：２７のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
11. 前記ＣＣＲ５がＣＣＲ５細胞外ドメイン断片であり、好ましくは該ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片がＣＣＲ５細胞外ドメインＥＣＬ２Ａ断片であり、さらに好ましくは該ＣＣＲ５細胞外ドメインＥＣＬ２断片が
    (a) 配列番号：２５；及び、
    (b) 配列番号：２６
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
12. 前記ガストリンが、
    a) 配列番号：３３
    b) 配列番号：３４；
    c) 配列番号：３５；
    d) 配列番号：３６；
    e) 配列番号：３７；
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、これから基本的になるか、あるいはこれからなる、請求項１に記載の方法。
13. 前記Ｃ５ａがＣ５ａタンパク質であり、好ましくは該Ｃ５ａタンパク質が、
    (a) 配列番号：４５；及び、
    (b) 配列番号：４５から得られるポリペプチドであって配列番号：４５の３、好ましくは２、好ましくは１のアミノ酸が挿入、欠失及び／又は置換により修飾されているポリペプチド
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、これから基本的になるか、あるいはこれからなる、請求項１に記載の組成物。
14. 前記ＶＬＰがＲＮＡ-バクテリオファージのものである、請求項１又は請求項１０から１３の何れか一に記載の組成物。
15. 前記ＲＮＡ-バクテリオファージがＱβ、ｆｒ、ＧＡ又はＡＰ２０５である、請求項１４に記載の組成物。
16. 第一付着部位を有する前記ＶＬＰが、少なくとも１の共有結合によって第二付着部位を有する前記抗原に連結され、このとき好ましくは該共有結合がペプチド結合であり、該ＶＬＰがＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のものである、請求項１又は請求項１０から１５の何れか一に記載の組成物。
17. 前記第一付着部位が少なくとも１の共有結合により前記第二付着部位に連結され、このとき好ましくは前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項１又は請求項１０から１５の何れか一に記載の組成物。
18. 前記第一付着部位が、好ましくはリジンのアミノ基を含んでなる、請求項１から１７の何れか一に記載の組成物。
19. 前記第二付着部位がスルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含んでなる、請求項１から１８の何れか一に記載の組成物。
20. 請求項１から１９の何れか一に記載の組成物を含んでなるワクチンであって、好ましくは該ワクチンがアジュバントのないものである、ワクチン。
21. (a) 請求項１から１９の何れか一に記載の組成物又は請求項２０のワクチン；と、
    (b) 受容可能な製薬的担体
    を含んでなる医薬組成物。
22. 請求項１又は請求項１０から１９の何れか一に記載の組成物、又は請求項２０に記載のワクチンの生産方法であって、
    (a) 少なくとも１の第一付着部位を有するＶＬＰを供給すること；
    (b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原を供給すること；そして、
    (c) 前記組成物を生産するために該ＶＬＰと該少なくとも１の抗原を連結すること
    を含んでなり、該少なくとも１の抗原と該ＶＬＰが該少なくとも１の第一付着部位と該少なくとも１の第二付着部位により連結される、方法。
23. ＡＩＤＳの治療のための医薬の製造のための請求項２から１１の何れか一に記載の組成物の使用。
24. 胃腸癌の治療のための医薬の製造のための請求項１２に記載の組成物の使用。
25. 関節炎の治療のための医薬の製造のための請求項１３に記載の組成物の使用。

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