JP2015518852A - 補体成分Ｃ５ａベースのワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、アミノ酸配列［式中、Ｘ１は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Ｘ２は、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、Ｘ３は、（Ｘ４）ｎＡＮＩＳＸ５（配列番号：１００）または１ないし４個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、Ｘ４は、ＶＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０１）または１ないし６個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、Ｘ５は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、イソロイシン、リシン、メチオニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、ｍは、０または１であり、そしてｎは、０または１である。］で示される７ないし１９個のアミノ酸残基からなる少なくとも１種のペプチドを含むワクチンであって、該少なくとも１種のペプチドが、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む担体と結合または融合されているワクチンに関する。

Description

本発明は、補体成分Ｃ５ａ誘導性慢性炎症性疾患を予防および／または処置するための、医学、免疫学、および分子生物学の分野において使用されるべき医薬に関する。
補体とは、ウイルス、細菌、ならびに他の外来および異常細胞のような微生物から宿主を保護する、自然免疫系の主要な成分である。しかしながら、補体系の不適切または過剰な活性化は、宿主自身に対する破壊力に結びつき得る。無制御の補体活性化は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、加齢黄斑変性、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、喘息、血管炎、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症のような多くの慢性炎症性疾患、乾癬および慢性蕁麻疹のような炎症性皮膚炎、ギランバレー症候群、ならびに溶血性尿毒症症候群に関わる。
無制御の補体活性化はまた、癌、妊娠高血圧腎症および抗リン脂質抗体症候群のような妊娠合併症、ならびに敗血症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および虚血再灌流傷害を含む急性の病状でも起こり得る。大量の補体活性化はまた、人工物表面でも起こり、血液透析に関係する血栓症の原因となる。
これらの病状で見られる多くの毒性作用は、炎症性反応を促進し、長期化させるアナフィラトキシンＣ５ａの過剰生産に起因する。Ｃ５ａの主な機能は、免疫因子の放出を仲介する顆粒球、肥満細胞、および可溶性のマクロファージの走化性および活性化である。従って、補体活性の阻害または調節は、長年治療的戦略に有望なものとして認識されてきた。
ほとんどの補体タンパク質は、３種の異なるメカニズム：古典経路、レクチン経路、および補体活性化第２経路（alternative pathway）に応答してタンパク質分解カスケードにおいて互いに切断および活性化する複数の不活性前駆体として血漿中に存在する。３つすべての活性化カスケードの最終的な結果は、アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａならびに細胞膜に孔を形成して細胞を溶解させる細胞致死性膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の反応および形成の大幅な増幅である。
補体成分Ｃ５は、１９０ｋＤａのタンパク質であり、２本のポリペプチド鎖（α １１５ｋＤａおよびβ ７５ｋＤａ）を含む。何れかの補体経路の活性化は、Ｃ５をＣ５ｂおよび強力なアナフィラトキシンＣ５ａに切断し得るＣ５転換酵素を生じ得る。Ｃ５の切断により、Ｃ５ａ断片上のＣ−末端の新生エピトープが暴露される。
ヒトＣ５ａは、１２−１４．５ｋＤａの分子量を有する７４−アミノ酸長の糖タンパク質である。該分子は、３つの内部ジスルフィド架橋により安定化される４つのα−ヘリックスにより構成されている。アスパラギンは位置６４に位置し、生物学的活性に必須ではないが、インビボでＣ５ａ活性を調節する可能性が極めて高い、Ｎ−結合した炭水化物部分を有する。Ｃ５転換酵素によるＣ５ａ断片の切断後すぐに、７４−アミノ酸長のＣ５ａタンパク質のＣ−末端アルギニン残基が、血清および細胞表面のカルボキシペプチダーゼによって取り除かれ、不活性型Ｃ５ａ ｄｅｓＡＲＧ分子が形成される。Ｃ５ａタンパク質の両方の形態Ｃ５ａ ＡＲＧおよびＣ５ａ ｄｅｓＡＲＧは、種々の細胞上に、特に、マクロファージ、好中球、肥満細胞、およびＴ細胞のような免疫細胞の表面上にユビキタスに発現される、７回膜貫通ドメイン受容体であるＣ５ａＲ（ＣＤ８８）およびあまり特徴付けされていないＣ５Ｌ２（ｇｐｒ７７）に結合する。Ｃ５ａＲのリガンド結合部位は、少なくとも２つの物理的に分離可能な結合ドメインから構成される。一方は、Ｃ５ａジスルフィド結合コア（アミノ酸１５−４６）に結合し、もう一方は、Ｃ５ａカルボキシ末端（アミノ酸６７−７４）に結合する。Ｃ５ａＲのリガンドＣ５ａに対するその結合親和性は、著しく高く、約１ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有する。
補体成分Ｃ５ａ誘導性疾患または病状の処置のための手段および方法を提供することが、本発明の目的である。
本発明は、アミノ酸配列
Figure 2015518852
 ［式中、
Ｘ１は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ２は、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ３は、（Ｘ４）ｎＡＮＩＳＸ５（配列番号：１００）または１ないし４個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
Ｘ４は、ＶＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０１）または１ないし６個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
Ｘ５は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、イソロイシン、リシン、メチオニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ｍは、０または１であり、そして
ｎは、０または１である。］
で示される７ないし１９個、好ましくは７ないし１４個のアミノ酸残基からなる少なくとも１種のペプチドを含むワクチンであって、ここで、該少なくとも１種のペプチドが、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む担体と結合または融合されている、ワクチンに関する。
本発明は、種々の慢性炎症性疾患において上方制御される、自身のＣ５ａに対する能動免疫化に関する。Ｃ５分子の切断により接近可能となるＣ５ａのＣ末端上の新生エピトープは、本発明の免疫化標的である。従って、宿主防御に主要な役割を果たすＣ５ｂ断片の生成および機能は、影響を受けないと考えられる。
より詳細には、本発明は、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む担体と結合または融合されるオリジナルのｈＣ５ａ Ｃ−末端エピトープのペプチド変異体（いわゆる、ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ）に基づくワクチンに関し、ここで、該ＶＡＲＩＯＴＯＰＥは、オリジナルのｈＣ５ａのＣ−末端配列に少なくとも１個のアミノ酸残基置換を含む。
ＶＡＲＩＯＴＯＰＥは、それと同一性のない目的のエピトープを模倣し、故に、ＶＡＲＩＯＴＯＰＥワクチンの利点は、自己抗原に対する自己耐容性を回避することである。さらに、ＶＡＲＩＯＴＯＰＥの使用は、自己抗原の使用により多く見られる意図しない副作用の危険性を軽減する。
ｈＣ５ａ Ｃ−末端エピトープのＶＡＲＩＯＴＯＰＥは、例えば、“アラニンスキャニング”法を用いて識別および選択可能である。アラニンスキャニング変異誘発は、任意の位置の機能的役割を決定するために、あるタンパク質またはペプチド領域内の個々のアミノ酸をアラニン残基により体系的置換することを意味する。アラニンは、β炭素上の副鎖がなく、主鎖の立体構造が変化せず、かつ極端な静電効果または立体効果を及ぼさないため、最適な置換基である。
この技術を用いて、ｈＣ５ａに対する体液性免疫応答の誘導に重要か、または重要ではないｈＣ５ａ Ｃ−末端エピトープのアミノ酸残基を同定することができる。次の工程において、ｈＣ５ａに対する体液性免疫応答の誘導を低下させることなく置換可能であることが見出された位置は、オリジナルのエピトープと比較したとき、ヒトＣ５ａに対してより高いか、または少なくとも等しい阻害活性を有する抗体を誘導可能であるＶＡＲＩＯＴＯＰＥを決定するために、異なる特徴を有するアミノ酸残基により体系的に置換され得る。その後、ｈＣ５ａのＣ−末端エピトープ内の２個または３個のアミノ酸置換の組み合わせが、それらの免疫原性および機能的活性について試験され得る。オリジナルのＣ−末端エピトープと比較して、ヒトＣ５ａに対してより高いか、または少なくとも等しい阻害活性を示す抗体を誘導し得るＶＡＲＩＯＴＯＰＥは、本発明の目的である。
驚くことに、ペプチドは、満足のいく免疫応答を引き起こすために、配列番号：９９の位置２、３、５、６および７それぞれのリシン、アスパラギン酸、グルタミン、ロイシンおよびグリシン残基の存在を必要とすることが見出された（図１Ａおよび１Ｂ）。さらに驚いたことは、最後の位置（配列番号：９９のＸ１；Ｘ１は、野生型Ｃ５ａ Ｃ−末端領域におけるアルギニン残基である。配列番号：１ないし４を参照のこと）にアミノ酸置換を有するペプチドは、配列番号：１ないし４を含む野生型Ｃ５ａ断片により誘導される免疫応答より顕著に高く、Ｃ５ａタンパク質に対する体液性免疫応答を誘導し得るという事実である（図１Ａないし１Ｄ）。重要なことには、図２Ａないし２Ｄに記載の通り、より高い体液性免疫応答が、Ｃ５ａ活性の顕著に高い阻害ももたらした。野生型Ｃ５ａ Ｃ−末端領域の最後から５番目の位置でのＭ残基のアミノ酸置換を含むペプチド（例えば、配列番号：１０または１８を参照のこと）または野生型Ｃ５ａ Ｃ−末端エピトープの最後から８番目の位置でのＨ残基のアミノ酸置換を含むペプチド（例えば、配列番号：７または１７を参照のこと）を免疫化に用いるときも、同様の結果が観察され得る（図１および図２）。上記のアミノ酸のアミノ酸置換によって生じるペプチド（野生型Ｃ５ａ Ｃ−末端エピトープのそれぞれ最後、最後から５番目および８番目でのＲ、ＭまたはＨ；例えば、配列番号：１ないし４を参照のこと）が、配列番号：１ないし４を含む野生型Ｃ５ａ断片により誘導される免疫応答よりも高いか、またはより強力な、Ｃ５ａ特異的抗体免疫応答を誘導する能力を有するというこの驚くべき効果は、図３ないし図６に示される結果により支持される。本発明により、該ペプチドが、対応する野生型Ｃ５ａ断片と比較してより高いＣ５ａ阻害能を示すことが示唆される。
本発明とは別に、ＷＯ９０／０９１６２には、ヒト野生型Ｃ５ａ断片と相同性を示し、Ｃ５ａ活性のアゴニストとして使用される数種のペプチドが記載されている。しかしながら、そこに記載されるペプチドは、可溶性ペプチドとして用いられており、担体タンパク質と結合されることはなく、従って、それらはＣ５ａ活性を阻害する抗体の形成を誘導し得ないため、本発明の目的のために使用され得ない。例えば、ＷＯ９０／０９１６２の実施例４２６において、ペプチドは、位置１にフェニルアラニン残基を含むことが記載されている。本発明において、そのような置換は、Ｃ５ａ阻害活性を顕著に低減させることが示されている（例えば、配列番号：５４、図４を参照のこと）。
本発明のワクチンに含まれる少なくとも１種のペプチドは、７個、好ましくは８個、好ましくは９個、好ましくは１０個、好ましくは１１個、好ましくは１２個、好ましくは１３個、好ましくは１４個、好ましくは１５個、好ましくは１６個、好ましくは１７個、好ましくは１８個、好ましくは１９個のアミノ酸残基を含むか、またはそれらから構成される。
本発明によれば、Ｘ３は、（Ｘ４）ｎＡＮＩＳＸ５（配列番号：１００）またはそのＮ−末端短縮フラグメントである。その結果、このＮ−末端短縮フラグメントは、ＡＮＩＳＸ５（配列番号：１０２）、ＮＩＳＸ５（配列番号：１０３）、ＩＳＸ５、ＳＸ５またはＸ５より構成され得る。このことは、本発明のワクチンが、ｍ＝１のとき、アミノ酸配列ＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１０４）、ＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１０５）、ＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１０６）、ＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１０７）またはＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１０８）を有する少なくとも１種のペプチドを含み得ることを意味する。
本発明によれば、Ｘ４は、ＶＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０１）またはそのＮ−末端短縮フラグメントである。ＶＶＡＳＱＬＲ断片は、以下のアミノ酸配列：ＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０９）、ＡＳＱＬＲ（配列番号：１１０）、ＳＱＬＲ（配列番号：１１１）、ＱＬＲ、ＬＲ、またはＲのうちの１つより構成されていてよい。その結果、本発明のワクチンに使用した少なくとも１種のペプチドは、ｍおよびｎが１のとき、以下のアミノ酸配列：ＶＶＡＳＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１１２）、ＶＡＳＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１１３）、ＡＳＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１１４）、ＳＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１１５）、ＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１１６）、ＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１１７）、またはＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＸ１（配列番号：１１８）のうちの１つを有し得る。
本発明のワクチンは、２以上の配列番号：９９のペプチドを含み得る。ワクチンが、配列番号：９９のアミノ酸配列を有する少なくとも１種のペプチドを含むことが、特に好ましい。しかしながら、本発明のワクチンはまた、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個の配列番号：９９のアミノ酸配列を有するペプチドを含み得る。もちろん、本発明の少なくとも１種のペプチドを、本発明の疾患と同様の病状を処置するために使用され得る他のペプチドまたは活性成分を含むと組み合わせることも可能である。
ペプチド／担体の組み合わせは、本発明のペプチドが、担体と結合されずに注射されたとき、適切な量の抗体を誘導する能力を有しないために、重要である。さらに、担体は、長時間作用性抗体反応の誘導を容易にする。従って、ｈＣ５ａに対する能動免疫化の本発明は、Ｃ５ａに基づく疾患を処置するためのモノクローナル抗体療法よりも有利性を提供する。従って、大量の抗体の反復注射の必要性、患者の頻繁な通院、およびヒト化抗体の作製のための高コストを含むモノクローナルＣ５ａ抗体療法の欠点が、回避され得る。
本発明の少なくとも１種のペプチドは、単離ペプチドまたは別のペプチドもしくはポリペプチドの一部として、当技術分野で公知の化学合成法により合成され得る。あるいは、少なくとも１種のペプチドは、細菌、酵母または菌類のような微生物、哺乳動物または昆虫細胞のような真核細胞、または化合物／ペプチドを製造し、その後単離され、所望により、さらに精製されるアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスまたはセンダイウイルスのような組み換えウイルスベクター中で製造され得る。化合物／ペプチドを製造するのに好適な細菌には、大腸菌、枯草菌またはペプチドを発現可能な他の細菌が含まれる。該化合物／ペプチドを発現するのに好適な酵母タイプには、Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe、Candida spp., pichia pastorisまたはペプチドを発現し得る他の酵母が含まれる。対応する方法は、当技術分野で公知である。組み換え製造されたペプチドの単離および精製方法もまた、当技術分野で公知であり、例えば、ゲル濾過、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどが含まれる。
化合物／ペプチドの単離を容易にするために、融合ポリペプチドが形成されてもよく、ここで、該化合物／ペプチドは、親和性クロマトグラフィーによる単離を可能にする異種ポリペプチドに翻訳融合(共有結合)されている。典型的な異種ポリペプチドは、Ｈｉｓ−タグ（例えば、Ｈｉｓ６；６つのヒスチジン残基）、ＧＳＴ−タグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などである。融合ポリペプチドは、化合物／ペプチドの精製を促進するだけでなく、精製中の該化合物／ペプチドの分解を阻止し得る。精製後に異種ポリペプチドを除去することが望ましいとき、融合ポリペプチドは、化合物／ペプチドと異種ポリペプチドの間の結合点に切断部位を含んでいてよい。切断部位は、該部位でアミノ酸配列に特異的な酵素（例えば、プロテアーゼ）を用いて切断されるアミノ酸配列からなる。
Ｘ１は、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、ＭまたはＩのような非極性の脂肪族アミノ酸残基；Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱのような極性の無電荷アミノ酸残基；ＫまたはＨのような正電荷アミノ酸残基；または、Ｙのような極性芳香族性アミノ酸残基であってよい。Ｘ２は、Ａ、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＴおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基であってよい。Ｘ５は、Ａ、Ｍ、Ｉのような非極性の脂肪族アミノ酸残基；Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱのような極性の無電荷アミノ酸残基；またはＫ、Ｒ、ＨまたはＥのような電荷アミノ酸残基であってよい。
本発明の好ましい態様によれば、Ｘ１は、トレオニン、グルタミン、チロシン、メチオニン、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
本発明のさらに好ましい態様によれば、ｍが１であり、Ｘ５が、アラニン、ヒスチジン、メチオニンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であるとき、Ｘ１は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、メチオニン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、および／またはＸ２は、メチオニン、アラニン、リシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
本発明の特に好ましい態様によれば、ｍは１であり、Ｘ５は、アラニン、メチオニンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
本発明の好ましい態様によれば、Ｘ２は、メチオニン、アラニン、リシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
本発明のさらに好ましい態様によれば、少なくとも１種のペプチドは、ＩＳＨＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：１４）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：２１）、ＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：２２）、ＶＶＡＳＱＬＲＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：２３）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＴ（配列番号：２４）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＱ（配列番号：２５）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＹ（配列番号：２６）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＭ（配列番号：２７）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＧ（配列番号：２８）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＶ（配列番号：２９）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＫ（配列番号：３０）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＳ（配列番号：３１）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＨ（配列番号：３２）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＮ（配列番号：３３）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＬ（配列番号：３４）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号．７０）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＱ（配列番号：７１）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＳ（配列番号：７２）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＭ（配列番号：７３）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＮ（配列番号：７４）、ＡＮＩＳＴＫＤＫＱＬＧＭ（配列番号：７５）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＨ（配列番号：７６）、ＡＮＩＳＡＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：７７）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：７８）、ＡＮＩＳＴＫＤＫＱＬＧＡ（配列番号：７９）、ＡＮＩＳＴＫＤＡＱＬＧＡ（配列番号：８０）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＳ（配列番号：８１）、ＡＮＩＳＴＫＤＶＱＬＧＡ（配列番号：８２）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＮ（配列番号：８３）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＫ（配列番号：８４）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＭ（配列番号：８５）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＴ（配列番号：８６）、ＡＮＩＳＨＫＤＫＱＬＧＫ（配列番号：８７）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＨ（配列番号：８８）、およびＡＮＩＳＡＫＤＡＱＬＧＡ（配列番号：８９）からなる群より選択される。
特に好ましい態様によれば、配列番号：９９のアミノ酸配列からなる少なくとも１種のペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端に、直接またはスペーサー配列を介してそれに結合された少なくとも１個のシステイン残基を含む。
このシステイン残基は、ペプチドを別の分子または担体に結合させるために、反応性基としての役割を果たし得る。例えば、この基は、ペプチドを担体タンパク質に結合させるために使用されてもよい。システイン残基は、本発明のペプチドに直接またはスペーサー配列を介して結合され得る。スペーサー配列は、好ましくは少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、さらにより好ましくは少なくとも４個、および所望により最大１０個まで、好ましくは最低５個の、グリシンのような小さい非極性アミノ酸残基を含む。
本発明の好ましい態様によれば、担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、破傷風毒素（ＴＴ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、プロテインＤまたは何れかの他のタンパク質もしくはＴ細胞エピトープを含むペプチドからなる群より選択される。
本発明によれば、ペプチドは、薬学的に許容される担体、好ましくはＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、破傷風毒素、アルブミン結合タンパク質、ウシ血清アルブミン、デンドリマー、ペプチドリンカー（または、フランキング領域）、ならびにSingh et al. (Singh et al., Nat. Biotech. 17, (1999): 1075-1081 (特に、その表１))およびO'Hagan et al.(O'Hagan and Valiante, Nature Reviews, Drug Dis-covery 2 (9); (2003): 727-735 (特に、それに記載の内因性免疫増強化合物および送達系))に記載のアジュバント物質、またはそれらの混合物に結合または融合されている。この文脈における共役化学（例えば、ＧＭＢＳのようなヘテロ二官能性化合物およびもちろん“Bioconjugate Techniques”, Greg T. Hermansonに記載のような他のもの）は、当業者に公知の反応から選択することができる。
あるいは、本発明の少なくとも１種のペプチドを、当技術分野で公知の方法によりタンパク質担体に融合させることもできる。かかるタンパク質は、本明細書に記載のペプチドを、関連のない免疫原性タンパク質と共に含む。好ましくは、免疫原性タンパク質は、リコール応答（recall response）を誘発することができる。そのようなタンパク質の例は、破傷風、結核、肝炎タンパク質および、グラム陰性菌ヘモフィルスインフルエンザＢ（ＷＯ９１／１８９２６）の表面タンパク質であるプロテインＤを含む。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、該タンパク質のおよそ最初の１／３（例えば、最初のＮ末端の１００〜１１０アミノ酸）を含み、脂質化されていてもよいものが使用される。融合タンパク質を提供するために使用され得る別の担体は、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその一部（好ましくは、Ｃ末端部分）であってよい。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコード化される； Gene 43; (1986):265-292）としても公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成する肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）から誘導される。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン主鎖内の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。好ましい態様内で、ＬＹＴＡの反復部分は、融合タンパク質内に組み込まれていてよい。反復部分は、残基１７８から始まるＣ−末端領域に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８−３０５を組み込む。
本発明の好ましい態様によれば、ペプチドは、アジュバントと共に、好ましくはalumに吸着して製剤され得る。
本発明のワクチンは、アジュバント、好ましくは、低溶解性アルミニウム組成物、特に水酸化アルミニウムと共に製剤されてよい。もちろん、ＭＦ５９、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サポニン（例えば、ＱＳ２１）、ＭＤＰ誘導体、ＣｐＧオリゴ、ＬＰＳ、ＭＰＬ、ポリホスファゼン、エマルジョン（例えば、Freundの、ＳＡＦ）、リポソーム、ビロソーム、イスコム、コクリエート、ＰＬＧ微粒子、ポロキサマー粒子状物質、ウイルス様粒子、易熱性毒素（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、突然変異体毒素（例えば、ＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２）、微粒子および／または重合化リポソームのようなアジュバントもまた、使用されてもよい。
好適なアジュバントは、例えば、ＡＳ０１Ｂ、ＡＳ０２Ａ、ＡＳ１５、ＡＳ−２およびその誘導体（GlaxoSmithKline, Philadelphia, PA）；ＣＷＳ、ＴＤＭ、Ｌｅｉｆ、水酸化アルミニウムゲル（alum）またはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩類；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンまたはアニオン的に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン類；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリル脂質Ａおよびｑｕｉｌ Ａとして市販されている。ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７もしくは−１２のようなサイトカインもまた、アジュバントとして使用できる。
本発明で提供するワクチン内に、アジュバント組成物は、好ましくは、Ｔｈ１タイプのサイトカインに主に免疫応答を誘導するために設計される。高レベルのＴｈ１タイプのサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−ｙ、ＴＮＦｃｔ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対して細胞仲介免疫応答の誘導に有利な傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２タイプのサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導に有利な傾向がある。
本発明で提供されるワクチンの適用後に、患者は、Ｔｈ１およびＴｈ２タイプの応答を含む免疫応答を示し得る。好ましい態様内で、応答が主にＴｈ１タイプであるとき、Ｔｈ１タイプのサイトカインのレベルは増大し、Ｔｈ２タイプのサイトカインのレベルを顕著に超え得る。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを用いて容易に評価することができる。サイトカインファミリーのレビューとしては、Janeway et al., Immunobiology, 5th Edition, 2001を参照のこと。
主にＴｈ１タイプの応答を誘導するための使用に好ましいアジュバントには、例えば、モノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）の、所望によりアルミニウム塩との組み合わせが含まれる（例えば、Ribi et al., Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, (1986)： 407-419；ＧＢ２１２２２０４Ｂ；ＧＢ２２２０２１１；および、ＵＳ４，９１２，０９４を参照のこと）。３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２ｍｍ未満の小さい粒子サイズを有するエマルジョンであり、その製造方法は、ＷＯ９４／２１２９２に記載されている。モノホスホリル脂質Ａおよび界面活性剤を含む水性製剤は、ＷＯ９８／４３６７０に記載されている。好ましいアジュバントの例としては、ＡＳ０１Ｂ（リポソーム製剤中のＭＰＬおよびＱＳ２１）、リポソーム製剤中の３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１、ＡＳ０２Ａ（ＭＰＬおよびＱＳ２１および水中油型エマルジョン）、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１および水中油型エマルジョン、ならびにＡＳ１５（GlaxoSmithKlineから入手可能）が含まれる。ＭＰＬアジュバントは、GlaxoSmithKlineから入手可能である（ＵＳ４，４３６，７２７；ＵＳ４，８７７，６１１；ＵＳ４，８６６，０３４およびＵＳ４，９１２，０９４を参照のこと）。
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、該ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、主にＴｈ１応答を誘導する。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。かかるオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８、ＵＳ６，００８，２００およびＵＳ５，８５６，４６２に記載されている。また、免疫活性化ＤＮＡ配列は、例えば、Sato et al., Science 273; (1996):352に記載されている。ワクチンに製剤されるとき、ＣｐＧは、一般的に、遊離溶液中で遊離抗原と共に投与される（ＷＯ９６／０２５５５； McCluskie and Davis, supra）か、または抗原と共有結合により複合体形成されて投与される（ＷＯ９８／１６２４７）か、または、水酸化アルミニウムのような担体と共に製剤されて投与される（（肝炎表面抗原）Davis et al., supra; Brazolot-Millan et al., PNAS USA, 95(26), (1998):15553-8）。ＣｐＧは、全身および粘膜経路の両方により投与され得るアジュバントとして当技術分野で公知である（ＷＯ９６／０２５５５、ＥＰ０４６８５２０、Davis et al., J.lmmunol, 160(2), (1998):870-876; McCluskie and Davis, J.Immunol., 161(9), (1998):4463-6）。
別の好ましいアジュバントは、サポニンまたはサポニン模倣体もしくは誘導体、好ましくはＱＳ２１（Aquila Biopharmaceuticals Inc.）であり、それは単独で、または他のアジュバントと組み合わせて使用されてよい。例えば、強化された系には、モノホスホリル脂質Ａおよびサポニン誘導体の組み合わせ、例えばＷＯ９４／００１５３に記載のＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載のＱＳ２１がコレステロールでクエンチされる低反応原性組成物が含まれる。他の好ましい製剤には、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールが含まれる。水中油型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤が、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。本発明で用いるさらなるサポニンアジュバントには、ＱＳ７（ＷＯ９６／３３７３９およびＷＯ９６／１１７１１に記載）およびＱＳ１７（ＵＳ５，０５７，５４０およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載）が含まれる。
他の好ましいアジュバントには、Montanide ISA 720（Seppic, France）、SAF（Chiron, California, United States）、ISCOMS（CSL）、MF-59（Chiron）、SBASシリーズのアジュバント（例えばSBAS-2、AS2'、AS2、SBAS-4、またはSBAS6（GlaxoSmithKline, Rixensart, Belgiumから入手可能））、Detox（Corixa）、RC-529（Corixa, Hamilton, MT）および他のアミノ−アルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）が含まれる。さらなるアジュバントの例には、合成ＭＰＬおよび志賀毒素Ｂサブユニットベースのアジュバントが含まれる（ＷＯ２００５／１１２９９１を参照のこと）。
本発明のワクチンは、皮下、筋肉内、皮内、静脈内に投与され得る（例えば、“Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations”, Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004を参照のこと）。投与ルートによって、薬物はそれぞれの担体、アジュバントおよび／または添加剤を含んでいてよい。
本発明のワクチンは、本発明の化合物を０．１ｎｇないし１０ｍｇ、好ましくは１０ｎｇないし１ｍｇ、特に１００ｎｇないし１００μｇ、あるいは、例えば１００ｆｍｏｌないし１０μｍｏｌ、好ましくは１０ｐｍｏｌないし１μｍｏｌ、特に１００ｐｍｏｌないし１００ｎｍｏｌ含む。本発明の化合物またはペプチドは、１投与量当たり、好ましくは１００ｎｇないし１ｍｇ、より好ましくは１μｇないし５００μｇ、さらにより好ましくは１０μｇないし１００μｇ、特に２０ないし４０または３０μｇの量で哺乳動物に投与される。典型的に、ワクチンは、補助物質、例えばバッファー、安定化剤などの含んでいてよい。本発明のワクチンは、２週ないし２ヶ月までの時間間隔で３ないし６回適用される。抗Ｃ５ａ抗体が存在すれば、ワクチンは、約６ヶ月の一定間隔で適用される。
本発明の好ましい態様によれば、ワクチンは、補体依存性障害（ＣＤＣ）の処置に使用される（例えば、Allegretti M et al, Curr Med Chem 12(2005):217-236を参照のこと）。従って、本発明はまた、本発明のワクチンを投与することにより、補体依存性障害を有する個体を処置するための方法にも関する。
補体依存性障害は、好ましくは炎症性疾患、好ましくは慢性炎症性疾患である。
炎症性疾患は、好ましくは、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、神経変性障害、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン病、アレルギー性喘息、アテローム性動脈硬化症、ギランバレー症候群、血管炎、炎症性皮膚炎、好ましくは乾癬および蕁麻疹、関節リウマチ、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、多発性硬化症、溶血性尿毒症症候群、ならびに全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
補体依存性障害は、好ましくは虚血再潅流傷害、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、敗血症、癌、妊娠高血圧腎症のような妊娠合併症、反復自然流産、子宮内胎児発育遅延およびＡＰＳが好適である。
本発明による補体依存性障害はまた、望ましくないか、または不適当な補体活性(血液透析に関係する血栓症など)を含む疾患である。この活性は、当技術分野で既知の方法により決定することができる。本発明のワクチンで処置され得る疾患は、増加したＣ５ａ活性により特徴付けられる。
ＡＭＤは、通常、高齢者が罹患し、網膜への損傷のために視野（黄斑）の中心における視力の低下をもたらす病状である。それは、“乾燥型（ドライ）”および“滲出型（ウエット）”があり、乾燥型は、全てのＡＭＤ事例の９０％を占める。滲出型および乾燥型ＡＭＤの最も早い臨床的ホールマークは、網膜色素上皮に近い領域で細胞外に蓄積するアモルファスなリポタンパク性沈澱物の出現である。これらの病原性成分はドルーセン(drusen)と呼ばれる。最近の研究は、局所炎症とドルーセン（乾燥型ＡＭＤのホールマーク）の形成における補体カスケードの活性化を関連付けている。これは、他の分子に加えて、補体成分Ｃ５がこれらのドルーセン内に蓄積することを示す他の研究に一致する。
さらに、ＶＥＧＦ（Ｃ５ａは、ＶＥＧＦの放出を伴う）に加えて、Ｃ５ａは、滲出型ＡＭＤで起こる脈絡膜血管新生の誘導に重要な役割を果たすことが示されている。最も重要場ことには、Ｃ５ａに対する中和抗体は、動物モデルにおける疾患の進行を停止させ得ることを示すことができた。
纏めると、滲出型および乾燥型ＡＭＤにおける補体依存性疾患に対する強力な証拠があり、従って、Ｃ５ａは、ＡＭＤの両タイプの処置の最適な標的であると考えられている。
Ｃ５ａによって主に引き起こされる補体依存性炎症は、アルツハイマー病の加速または進行に重要な役割を果たすことが提唱されている。延長された補体活性は、アルツハイマー病の脳中の原線維性のＡβプラークにより引き起こされ、疾患の多くの症状が、炎症性事象を促進する、Ｃ５ａに捕捉され活性化されたグリアを一因とし得る。同様の事象は、パーキンソン病およびハンチントン病に当てはまり得る。さらに、予備的データは、最終的に麻痺および死をもたらす進行性の運動ニューロン死を引き起こす変性疾患群である、運動ニューロン疾患における補体Ｃ５（Ｃ５ａ）の活性化断片に特定の病原性の役割を示す。
Ｃ５ａＲの遮断は、実験的アレルギー性喘息において気道炎症および気道過敏反応性を明白に軽減する。しかしながら、喘息における補体成分Ｃ５の役割は、依然として議論が分かれている。Ｃ５は、実験的アレルギー性喘息における気道過敏反応性に対して促進または防御することが報告されており、アレルギー性喘息におけるＣ５ａの二重の役割が示唆されている。１つの仮説は、アレルゲン感作中のＣ５ａＲシグナル伝達は、アレルギー性肺炎の発症から保護するが、エフェクター段階中に炎症を起こした肺環境でのアレルギー性表現型を増強するということである。従って、Ｃ５ａＲ遮断は、確立された喘息の処置に治療上有益であるかもしれない。
Ｃ５ａは、アテローム性動脈硬化症においても役割を果たす。Ｃ３ａおよびＣ５ａは、ヒト冠血管プラークで発現される。さらに、Ｃ５ａは、重度のアテローム性動脈硬化症を有する患者における心血管事象を予測し、Ｃ５ａの上昇した血清レベルは、浅大腿動脈のバルーン血管形成術後の再狭窄の発生に関係することが、最近示された。
血管炎は、血管壁の炎症および線維素様の壊死により組織病理学的に特徴付けられる、血管の炎症過程である。血管炎のこの形態の臨床的スペクトルは、紫斑病から重度の増殖性糸球体腎炎まで多様に亘り、補体系がこれらの工程に強く関与することが支持される。例えば、Ｃ５ａは、抗好中球細胞質自己抗体（ＡＮＣＡ）と関連する血管炎、比較的珍しいが潜在的に生命に危険のある全身性自己免疫疾患において重要な役割を果たす。ＡＮＣＡにより誘導される壊死性半月体形成性糸球体腎炎は、その病原への補体の関与を必要とする。Ｃ５ａおよび好中球Ｃ５ａＲは、ＡＮＣＡにより仲介される好中球活性化のための増幅ループを構成していてよい。Ｃ５ａＲは、ＡＮＣＡにより誘発される壊死性半月体形成性糸球体腎炎の治療所の目標を提供し得る。
補体活性化は、類天疱瘡（ＢＰ）、尋常性乾癬、および慢性蕁麻疹を含む自己免疫性皮膚炎における炎症性変化の病因に関係する。天疱瘡において、表皮における天疱瘡抗体による補体活性化は、好酸球性海綿状態(eosinophilic spongiosis)と呼ばれる特徴的な炎症性変化の発生の原因であるように見える。乾癬の鱗屑において、高レベルのＣ５ａが見出され、補体活性化がこの疾患に関与することが示されている。乾癬は、Ｔ細胞媒介性疾患として公知であるが、しかしながら、好中球および脂肪細胞もまた、該疾患の病因に関係しているかもしれない。Ｔ細胞および好中球は、Ｃ５ａによって化学誘引され、故に、Ｃ５ａは、乾癬の処置のための重要な治療上の目的であり得る。
補体活性化はまた、自己免疫性炎症性疾患、関節リウマチにも関与する。膜侵襲複合体の堆積ならびにＣ３ｂの断片でのオプソニン作用も重要であるが、アナフィラトキシンＣ５ａが、関節リウマチにおける組織損傷の原因である補体活性化の主産物であることが明らかである。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の病因における補体の役割は、依然として議論が分かれている。一方、補体成分は、自己抗体により誘発される組織損傷を仲介すると考えられる。一方、補体系は、いくつかの補体の遺伝的欠失がＳＬＥの増加した危険と関係するため、保護機能を有すると考えられる。ＳＬＥを有する患者はしばしば、低補体血症を有することが知られている。さらに、Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲシグナル伝達が、血液脳関門の完全性の調節により中枢神経系狼瘡の病因に重要な役割を果たすことが証明された。Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ遮断の可能性が、ＳＬＥにおける見込みのある治療上の戦略として強調された。
虚血（Ｉ）ではなく、組織再灌流（Ｒ）が、補体を活性化し、炎症により誘導される損傷をもたらすと思われる。Ｉ／Ｒ傷害における補体活性化の正確な関与が未だ不明であったとしても、いくつかの実験的研究が、補体とＩ／Ｒ傷害の病因との関連を示し、有力な療法として補体阻害を示唆している。例えば、マウスの心筋のＩ／Ｒ傷害モデルにおいて、全身性Ｃ５阻害は、再灌流の３０分前に、マウスを心筋のＩ／Ｒ傷害から顕著に保護した。
補体活性化は、急性肺傷害の多くの形態で証明されている。Ｃ５ａ濃度は、酸撒布（acid instillation）により誘導される急性肺傷害において気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中で増大し、Ｃ５ａ濃度はまた、ヒトの移植された肺でも上昇する。Ｃ５ａは、肺へ好中球を誘引し、直接、好中球、マクロファージ、および内皮細胞を活性化する。抗Ｃ５ａの防御的役割は、ＴＮＦ−αのＢＡＬＦレベルの顕著な低減、ならびに肺血管細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１発現の大幅な減少と関連しており、このことは、Ｃ５ａが、炎症性ネットワークの構築ならびに炎症性メディエーターの発現および接着分子の発現の制御に不可欠であることを示唆している。
急性肺傷害および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、肺胞内の空間のフィブリンに富んだ炎症性滲出液の存在、および肺の肺胞中への好中球の広範な移動により特徴付けられる。健常なボランティア由来の好中球におけるＴＮＦ−αおよびＣ５ａシグナル伝達の薬理学的遮断は、これらのそうしなければ正常な細胞のＢＡＬＦ誘発性凝固促進活性を顕著に低減させ、組織因子（ＴＦ）発現の付随的損失を引き起こすことができた。これらの結果は、Ｃ５ａおよびＴＮＦ−αシグナル伝達が、ＡＲＤＳの影響を受ける肺の肺胞中に蓄積する好中球におけるＴＦ発現の減少に寄与することを示唆する。
敗血症の発症中、細胞性および体液性の両方の防御機構を含む炎症系は活動亢進になる。ヒト敗血症における補体活性化は、とりわけ高レベルのＣ５ａに反映される通り、比較的軽度の敗血症患者および生存者と比較したとき、多臓器不全と共に顕著に低下した生存率に関係することが示されている。さらに、Ｃ５ａまたはＣ５ａＲの何れかの遮断は、げっ歯動物の実験的敗血症中の生存率を大幅に改善する。故に、Ｃ５ａは、敗血症の進行に重要な役割を果たすように思われ、Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ結合の阻止は、敗血症を発症する危険性の高い患者の予防的処置のための有力な臨床的アプローチを提示し得る。
心肺バイパス術および血液透析において、Ｃ５ａは、ヒト血液が、臓−肺機械または腎臓透析機の人工表面と接触するとき、補体活性化第２経路の活性化の結果として製造される。Ｃ５ａは、増加した毛細血管透過性および浮腫、気管支収縮、肺血管収縮、白血球および血小板活性化ならびに組織、特に肺へのそれらの浸潤を引き起こす。抗Ｃ５ａモノクローナル抗体の投与は、心肺バイパス術および心臓麻痺誘発性冠血管内皮機能不全を低減させることが示された。
腫瘍により引き起こされる補体活性化は、腫瘍増殖を促進し得る。腫瘍微小環境における補体Ｃ５ａの製造は、抗腫瘍ＣＤ８＋ Ｔ細胞仲介反応を抑制することにより腫瘍増殖を増強する。腫瘍増殖のマウスモデルの使用は、Ｃ５ａＲの欠失または阻害が、腫瘍増殖の遅延と関係することを明らかにした。故に、補体阻害は、抗癌療法における効果的かつ有望な方法であると見なされている。
補体活性の顕著な増加は、種々の異常妊娠の結果、すなわち妊娠高血圧腎症、反復自然流産、子宮内胎児発育遅延、および抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）と関連していた。妊娠高血圧腎症を有する女性は、正常な妊婦と比較して、Ｃ５ａの高血漿濃度を示した。ＡＰＳに関して、抗リン脂質抗体および補体活性化（Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、およびＭＡＣを介する）は、局所的炎症過程を引き起こし、最終的に、胎盤血栓症、低酸素症、および好中球浸潤を引き起こし得る。組織因子（ＴＦ）は、抗リン脂質抗体誘発性胎児損傷においてＣ５ａと好中球活性化との関連性を示す。
まとめると、Ｃ５ａに対するペプチド誘導性免疫応答は、アルツハイマー病（例えば、Fonseca, M.I. et al. (2009), J Immunol “Treatment with a C5aR Antagonist Decreases Pathology and Enhances Behavioral Performance in Murine Models of Alzheimer's Disease.” および Klos, A. et al. (2009), Mol Immunol “The role of the anaphylatoxins in health and disease.”を参照のこと）、パーキンソン病（例えば、McGeer, P. L. et al. (2004), Parkinsonism Relat Disord “Inflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease.” を参照のこと）、ハンチントン病（例えば、Singhrao, S. K. et al. (1999), Exp Neurol “Increased complement biosynthesis by microglia and complement activation on neurons in Huntington's disease.” を参照のこと）、および加齢黄斑変性症（例えば、Nozaki, M. et al. (2006), Proc Natl Acad Sci “Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.” を参照のこと）のような神経変性疾患、関節リウマチ（例えば、Okroj, M. et al. (2007), Ann Med “Rheumatoid arthritis and the complement system.” を参照のこと)、全身性エリテマトーデス (SLE)(例えば、Chen, M. et al. (2009), J Autoimmun “The complement system in systemic autoimmune disease.”; Jacob, A. et al. (2010), J Neuroimmunol “Inhibition of C5a receptor alleviates experimental CNS lupus.” and Jacob, A, et al. (2010), FASEB J “C5a alters blood-brain barrier integrity in experimental lupus.” を参照のこと）、喘息（例えば、Kohl, J. et al. (2006), J Clin Invest “A regulatory role for the C5a anaphylatoxin in type 2 immunity in asthma.” を参照のこと）、血管炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、アテローム性動脈硬化症、乾癬および慢性蕁麻疹のような炎症性皮膚炎、ギランバレー症候群、溶血性尿毒症症候群、ならびに多発性硬化症を含むＣ５ａ仲介性（慢性炎症性）疾患のための有効な治療をもたらす。無制御のｈＣ５ａ放出が、虚血および再潅流傷害、敗血症、急性肺傷害、血液透析に関連した合併症、癌、妊娠高血圧腎症およびＡＰＳのような妊娠合併症のような他の病的状態に寄与するため、能動免疫化によるＣ５ａの中和は、これらの病理学的合併症に同様に有効な治療法を提供し得る。
本明細書で用いる“処置する”は、処置を提供すること、すなわち、あらゆるタイプの対象の内科的または外科的治療を提供することを意味する。処置とは、疾患、障害または病状の進行を阻止、軽減、阻害するため、疾患、障害または病状の可能性を阻止または低減するため、あるいは疾患、障害または病状の１またはそれ以上の症状もしくは徴候を阻止、軽減、阻害または防止するため、疾患、障害または病状の１またはそれ以上の症状もしくは徴候の可能性を阻止または低減するために提供され得る。“阻止”は、少なくともある個体における少なくともある期間、疾患、障害、病状、または症状もしくは徴候を引き起こさないことを意味する。処置は、補体依存性状態を示す１またはそれ以上の症状または徴候の発症後に、例えば、病状の重症度を阻止、軽減、減少するため、および／または病状の進行の阻害もしくは阻止、および／または病状の１もしくはそれ以上の症状もしくは徴候の阻止、軽減、重症度の減少および／もしくは阻害のために、対象へ薬剤を投与することを含み得る。本発明の組成物は、補体依存性障害を発症した対象または一般集団のメンバーと比較してそのような障害を発症する危険性の高い対象に投与され得る。本発明の組成物は、予防的に、すなわち、病状のいかなる症状または徴候の発症前に投与され得る。典型的に、この場合、対象は、病状を発症する危険性があるだろう。
本発明の別の面は、アミノ酸配列
Figure 2015518852
 ［式中、
Ｘ１は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ２は、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘ３は、（Ｘ４）ｎＡＮＩＳＸ５（配列番号：１００）または１ないし４個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
Ｘ４は、ＶＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０１）または１ないし６個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
Ｘ５は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、イソロイシン、リシン、メチオニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
ｍは、０または１であり、そして
ｎは、０または１である。］
で示される７ないし１９個のアミノ酸残基からなる少なくとも１種のペプチド（該少なくとも１種のペプチドが、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む担体と結合または融合されている）に関する。
本発明の好ましい態様によれば、Ｘ１は、トレオニン、グルタミン、チロシン、メチオニン、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
ｍが１であり、Ｘ５が、アラニン、ヒスチジン、メチオニンおよびトレオニン、好ましくはアラニン、トレオニンまたはメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であるとき、Ｘ１は、好ましくは、アラニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、メチオニン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、および／またはＸ２は、メチオニン、アラニン、リシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
本発明の特に好ましい態様によれば、ｍは１であり、Ｘ５は、アラニン、ヒスチジン、メチオニンおよびトレオニン、好ましくはアラニン、トレオニン、またはメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
本発明の別の好ましい態様によれば、Ｘ２は、メチオニン、アラニン、リシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基である。
本発明の特に好ましい態様によれば、ペプチドは、ＩＳＨＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：１４）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：２１）、ＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：２２）、ＶＶＡＳＱＬＲＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：２３）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＴ（配列番号：２４）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＱ（配列番号：２５）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＹ（配列番号：２６）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＭ（配列番号：２７）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＧ（配列番号：２８）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＶ（配列番号：２９）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＫ（配列番号：３０）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＳ（配列番号：３１）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＨ（配列番号：３２）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＮ（配列番号：３３）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＬ（配列番号：３４）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：７０）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＱ（配列番号：７１）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＳ（配列番号：７２）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＭ（配列番号：７３）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＮ（配列番号：７４）、ＡＮＩＳＴＫＤＫＱＬＧＭ（配列番号：７５）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＨ（配列番号：７６）、ＡＮＩＳＡＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：７７）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：７８）、ＡＮＩＳＴＫＤＫＱＬＧＡ（配列番号：７９）、ＡＮＩＳＴＫＤＡＱＬＧＡ（配列番号：８０）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＳ（配列番号：８１）、ＡＮＩＳＴＫＤＶＱＬＧＡ（配列番号：８２）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＮ（配列番号：８３）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＫ（配列番号：８４）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＭ（配列番号：８５）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＴ（配列番号：８６）、ＡＮＩＳＨＫＤＫＱＬＧＫ（配列番号：８７）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＨ（配列番号：８８）、およびＡＮＩＳＡＫＤＡＱＬＧＡ（配列番号：８９）からなる群より選択される。
本発明の別の面は、アミノ酸配列
Figure 2015518852
 ［式中、
Ｘ１は、アルギニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、最も好ましくはアルギニンであり、
Ｘ２は、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン、バリン、トレオニン、チロシンまたはロイシン、より好ましくはバリンであり、
Ｘ３は、（Ｘ４）ｎＡＮＩＳＸ５（配列番号：１００）または１ないし４個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
Ｘ４は、ＶＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０１）または１ないし６個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
Ｘ５は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、イソロイシン、リシン、メチオニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、最も好ましくはヒスチジンであり、
ｍは、０または１であり、そして
ｎは、０または１である。］
で示される７ないし１９個のアミノ酸残基からなる少なくとも１種のペプチドを含むワクチンであって、該少なくとも１種のペプチドが、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む担体と結合または融合されているワクチンに関する。
本発明のさらに別の面は、アミノ酸配列
Figure 2015518852
 ［式中、
Ｘ１は、アルギニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、最も好ましくはアルギニンであり、
Ｘ２は、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、好ましくはメチオニンであり、
Ｘ３は、（Ｘ４）ｎＡＮＩＳＸ５（配列番号：１００）または１ないし４個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
Ｘ４は、ＶＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０１）または１ないし６個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
Ｘ５は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、イソロイシン、リシン、メチオニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、好ましくはトレオニン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、リシンまたはアスパラギンであり、より好ましくはトレオニンまたはグルタミンであり、
ｍは０または１であり、そして
ｎは０または１である。］
で示される７ないし１９個のアミノ酸残基からなる少なくとも１種のペプチドを含むワクチンであって、該少なくとも１種のペプチドが、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む担体と結合または融合されているワクチンに関する。
本発明の好ましい態様によれば、Ｘ３は、（Ｘ４）ｎＡＮＩＳＸ５（配列番号：１００）またはそのＮ−末端短縮フラグメントであり、Ｘ１はアルギニンである。それ故に、このＮ−末端短縮フラグメントは、ＡＮＩＳＸ５（配列番号：１０２）、ＮＩＳＸ５（配列番号：１０３）、ＩＳＸ５、ＳＸ５またはＸ５であってよい。このことは、本発明のワクチンが、ｍ＝１のとき、アミノ酸配列 ＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１１９）、ＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２０）、ＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２１）、ＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２２）またはＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２３）を有する少なくとも１種のペプチドを含み得ることを意味する。
本発明の好ましい態様によれば、Ｘ４は、ＶＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０１）またはそのＮ−末端短縮フラグメントである。ＶＶＡＳＱＬＲの断片は、以下のアミノ酸配列：ＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０９）、ＡＳＱＬＲ（配列番号：１１０）、ＳＱＬＲ（配列番号：１１１）、ＱＬＲ、ＬＲ、またはＲのうち１つであり得る。それ故に、本発明のワクチンに用いる少なくとも１種のペプチドは、ｍおよびｎが１のとき、以下のアミノ酸配列：ＶＶＡＳＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２４）、ＶＡＳＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２５）、ＡＳＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２６）、ＳＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２７）、ＱＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２８）、ＬＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１２９）、またはＲＡＮＩＳＸ５ＫＤＸ２ＱＬＧＲ（配列番号：１３０）のうち１つを有し得る。
本発明の特に好ましい態様において、配列番号：１１９ないし１３０のＸ５は、Ｘ２が上記のアミノ酸残基であり、メチオニンではないとき、ヒスチジンである。
本発明のさらなる好ましい態様において、配列番号：１１９ないし１３０のＸ２は、Ｘ５が上記のアミノ酸残基であり、ヒスチジンではないとき、メチオニンである。
本発明の特定の好ましい態様によれば、ペプチドは、ＡＮＩＳＨＫＤＶＱＬＧＲ（配列番号：５６）、ＡＮＩＳＨＫＤＴＱＬＧＲ（配列番号：５７）、ＡＮＩＳＨＫＤＹＱＬＧＲ（配列番号：５８）、ＡＮＩＳＨＫＤＬＱＬＧＲ（配列番号：５９）、ＡＮＩＳＨＫＤＡＱＬＧＲ（配列番号：１８）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：３９）、ＡＮＩＳＱＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４０）、ＡＮＩＳＥＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４１）、ＡＮＩＳＳＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４２）、ＡＮＩＳＫＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４３）およびＡＮＩＳＮＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４４）からなる群より選択され、好ましくはＡＮＩＳＨＫＤＶＱＬＧＲ（配列番号：５６）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：３９）およびＡＮＩＳＱＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４０）からなる群より選択される。
本発明のさらなる面は、ＡＮＩＳＨＫＤＶＱＬＧＲ（配列番号：５６）、ＡＮＩＳＨＫＤＴＱＬＧＲ（配列番号：５７）、ＡＮＩＳＨＫＤＹＱＬＧＲ（配列番号：５８）、ＡＮＩＳＨＫＤＬＱＬＧＲ（配列番号：５９）、ＡＮＩＳＨＫＤＡＱＬＧＲ（配列番号：１８）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：３９）、ＡＮＩＳＱＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４０）、ＡＮＩＳＥＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４１）、ＡＮＩＳＳＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４２）、ＡＮＩＳＫＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４３）およびＡＮＩＳＮＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４４）からなる群より選択されるペプチド、好ましくはＡＮＩＳＨＫＤＶＱＬＧＲ（配列番号：５６）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：３９）およびＡＮＩＳＱＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号：４０）からなる群より選択されるペプチドに関する。
本発明は、図面および以下の実施例によりさらに説明されるが、それらに限定されることはない。
図１は、免疫原性およびｈＣ５ａに対する抗体を誘導する能力をなくすことなく置換可能な位置を定義するための、種々の長さのｈＣ５ａ（配列番号：１−４）のＣ−末端断片のアラニンスキャン（配列番号：５−２３）を示す。図１（Ａ）は、オリジナルのエピトープ ｈＣ５ａの位置６５−７４（配列番号：１）およびそのＶＡＲＩＯＴＯＰＥ、（Ｂ）オリジナルのエピトープ ｈＣ５ａの位置６３−７４（配列番号：２）およびそのＶＡＲＩＯＴＯＰＥ、（Ｃ）オリジナルのエピトープ ｈＣ５ａの位置６８−７４（配列番号：３）およびそのＶＡＲＩＯＴＯＰＥ、（Ｄ）オリジナルのエピトープ ｈＣ５ａの位置５５−７４（配列番号：４）およびそのＶＡＲＩＯＴＯＰＥの免疫原性（力価で示す）を示す。 図２は、オリジナルのエピトープ配列（それを、１００％（配列番号：１−４）と示す）と比較して、ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（配列番号：５−２３）でワクチン接種したマウスの免疫血清の阻害活性を示す。図２（Ａ）は、オリジナルのエピトープ ｈＣ５ａの位置６５−７４（配列番号：１）およびそのＶＡＲＩＯＴＯＰＥ、（Ｂ）オリジナルのエピトープ ｈＣ５ａの位置６３−７４（配列番号：２）およびそのＶＡＲＩＯＴＯＰＥ、（Ｃ）オリジナルのエピトープ ｈＣ５ａの位置６８−７４（配列番号：３）およびそのＶＡＲＩＯＴＯＰＥ、（Ｄ）オリジナルのエピトープ ｈＣ５ａの位置５５−７４（配列番号：４）およびそのＶＡＲＩＯＴＯＰＥにより誘導される免疫血清の阻害を示す。 図３は、ｈＣ５ａの１２アミノ酸長のＣ−末端断片（配列番号：２）のＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（ここで、ｈＣ５ａの位置７４のＲは、異なる特徴のアミノ酸残基に置換されている）（配列番号：２１、２４−３８）により誘導される抗体の阻害活性の評価を示す。
図４は、ｈＣ５ａの１２アミノ酸長のＣ−末端断片（配列番号：２）のＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（ここで、ｈＣ５ａの位置６７のＨは、異なる特徴のアミノ酸残基により置換されている）（配列番号：１７、３９−５５）により誘導される抗体の阻害活性の評価を示す。 図５は、ｈＣ５ａの１２アミノ酸長のＣ−末端断片（配列番号：２）のＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（ここで、ｈＣ５ａの位置６７のＨは、異なる特徴のアミノ酸残基により置換されている）（配列番号：１８、５６−６９）により誘導される抗体の阻害活性の評価を示す。 図６は、ｈＣ５ａの１２アミノ酸長のＣ−末端断片（配列番号：２）のＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（ここで、ｈＣ５ａの位置７４のＲおよび位置６７または７０の１または２個のさらなるアミノ酸は、他のアミノ酸残基により置換されている）（配列番号：７０−９８）により誘導される抗体の阻害活性を示す。
実施例：
本発明の１つの目的は、慢性炎症性疾患または急性の病的状態における過剰のヒトＣ５ａの病理学的活性を回避するために、過剰のヒトＣ５ａに対する能動的免疫応答を中和する物質を開発することである。
この目的を達成するために、所謂ＶＡＲＩＯＴＯＰＥは、ヒトＣ５ａ分子のＣ−末端の新生エピトープに対する抗体を誘導するために設計され、免疫化のために使用された。このＣ５ａ上の新生エピトープは、細胞膜傷害複合体の一部である小さなアナフィラキシー性断片Ｃ５ａおよびＣ５ｂを結果として生じるＣ５転換酵素によるＣ５タンパク質の切断によりアクセス可能になる。ＶＡＲＩＯＴＯＰＥは、標的タンパク質上のエピトープに似せることにより目的タンパク質に対して体液性免疫応答を誘導することができる、免疫原性のペプチドである。従って、ＶＡＲＩＯＴＯＰＥワクチンの利点は、自己抗原に対する自己寛容を回避しつつ、自己抗原の使用により高頻度に見出される意図しない副作用の危険性を軽減することである。
全てのペプチドは、Ｎ−末端にてシステイン残基を介してタンパク質担体キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）へ化学的に結合され、アジュバントとしての水酸化アルミニウム（Alum）と共にマウスに投与された。ＶＡＲＩＯＴＯＰＥまたはｈＣ５ａのオリジナルのＣ−末端配列で免疫化されたマウスから得られた全ての免疫血清を、抗体力価およびｈＣ５ａに対して機能的に活性な抗体を誘導するそれらの能力について分析した。
材料および方法：
マウスの免疫化
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ｈＣ５ａ−ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ免疫化実験のためのモデル系として用いた。メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６ないし８週齢）を、ＫＬＨを結合したＶＡＲＩＯＴＯＰＥワクチンを（リン酸バッファー ｐＨ＝７．４中、２００μｌを皮下に）初回免疫し、二週に一回の間隔で４回追加免疫した。水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとして用いた。５ないし６匹のマウスを代表的ＶＡＲＩＯＴＯＰＥワクチンでの免疫化に用いた。
免疫原性アッセイ
ワクチン接種を受けたマウスの免疫血清を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、注入されたペプチド（データ示さず）およびヒトＣ５ａタンパク質に対するそれらの抗体反応について分析した。抗体力価を、最大半量の結合を与える血清希釈率（すなわち、ＯＤｍａｘ／２）として決定し、１群当たりの全てのマウスの平均力価を示した。
Ｃ５ａ阻害アッセイ
ペプチドまたはＶＡＲＩＯＴＯＰＥにより誘発されたｈＣ５ａに対する抗体の阻害活性を、ヒトＵ９３７細胞を用いてグルクロニダーゼ酵素遊離分析によって評価した。Ｕ９３７細胞を、サイクリックアデノシン ３’, ５’−モノフォスフェート刺激により分化させ、ヒト組み換えＣ５ａタンパク質で刺激することにより、β−グルクロニダーゼを放出させる。この作用は、ｈＣ５ａ特異的抗体またはペプチドにより誘発された抗ｈＣ５ａ免疫血清の添加により阻止され得る。
より詳細には、Ｕ９３７細胞を、ＲＰＭＩ中、０．５ｍＭのサイクリックアデノシン ３’, ５’−モノホスフェート（ｃＡＭＰ）、１０％ＦＣＳを用いて５日間分化させた。５日目、細胞を、３７℃にて１０分間、サイトカラシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ）で予め処理した。それぞれのアプローチのために、１．８ｘ１０５の予め処理した細胞を、最終容量１２０μｌのＨＡＧ−ＣＭバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ＝７．４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ グルコース、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５％ ＢＳＡ）中、１０ｎＭのｈＣ５ａのみで、または１０ｎＭのＣ５ａ＋種々のペプチドまたはＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（表１および２に配列番号：１−９８で示した）で免疫化したマウス由来の８％の加熱不活性化した血清（５６℃で１時間）で刺激した。３７℃にて１０分間インキュベーション後、細胞を沈殿させ、上清を９６ウェル マイクロタイタープレートに移し、全量１５０μｌの０．０１ＭのＰ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（０．１Ｍ 酢酸ナトリウム ｐＨ＝４．０中に溶解した）で１：１希釈した。該マイクロタイタープレートを、暗闇下、３７℃にて１時間インキュベートした。その後、反応を０．４Ｍ グリシンバッファー（ｐＨ＝１０．０）の添加により停止させた。β−グルクロニダーゼは、Ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを、４０５ｎｍで測定される黄色がかった色に変換する。
Figure 2015518852
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実施例１：免疫原性およびｈＣ５ａに対する抗体の中和を誘導する能力が維持されるか、または増大するような、置換可能な位置を定義するための、ｈＣ５ａのＣ−末端エピトープ（配列番号：１−４）（表１）のアラニンスキャニング
ｈＣ５ａ Ｃ−末端エピトープの各アミノ酸を、アラニン残基で置換し、オリジナルのエピトープ配列と比較してそれらの免疫原性を試験した。全てのＶＡＲＩＯＴＯＰＥは、注入ペプチドに結合する特異的抗体を明らかに誘導したが、タンパク質ｈＣ５ａに対する力価は異なる。ｈＣ５ａの位置６６のアラニン置換（Ｓ６６Ａ）、位置６８のＫのアラニン置換（Ｋ６８Ａ）、位置７１のＱのアラニン置換（Ｑ７１Ａ）、位置７２のＬのアラニン置換（Ｌ７２Ａ）、および位置７３のＧのアラニン置換（Ｇ７３Ａ）は、ｈＣ５ａを認識する抗体の誘導を明らかに無効にした（図１Ａおよび１Ｂ；配列番号：６、８、１１、１２、１３、１９、および２０）。オリジナルの配列（配列番号：１−３）は、比較的高い力価を誘導し、一方、ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（配列番号：６、８、１１、１２、１３、１９、および２０）により誘導される力価は、１３．０００ ＯＤｍａｘ／２未満に低下した。このことは、アミノ酸Ｓ、Ｋ、Ｑ、Ｌ、およびＧ（ｈＣ５ａ 位置６６、６８、７１、７２、および７３）が、ｈＣ５ａ特異的抗体の誘導に重要であることを示唆する（図１Ａおよび１Ｂ、表１−２）。
これに対して、位置７４のＲのアラニン置換は、抗ｈＣ５ａ反応抗体の強い増加を示した。これは、ｈＣ５ａの１０および１２アミノ酸長のＣ−末端断片のみで示されることではなく（図１Ａおよび１Ｂ；配列番号：１４、２１）、試験した異なる長さおよび置換Ｒ７４Ａを有する全てのＣ−末端 ｈＣ５ａ ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（図１Ｃおよび１Ｄ、配列番号：２２−２３）で見られた。ＶＡＲＩＯＴＯＰＥＳ Ｒ７４Ａの力価は、５６．０００ないし８８．０００の範囲であり、オリジナルの配列で得られる力価と比較したとき、５．５倍増まで達した（図１Ｄ、配列番号：４および２３）。Ｎ６４Ａ、Ｉ６５Ａ、Ｈ６７Ａ、Ｄ６９Ａ、およびＭ７０Ａ置換を有するＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（配列番号：５、７、９、１０、１５−１８）は、オリジナルのエピトープ（配列番号：１−２）と同程度のｈＣ５ａに対する力価を示す（図１Ａおよび１Ｂ、表１および２）。纏めると、種々の長さのｈＣ５ａ Ｃ−末端エピトープ内の単一アミノ酸の置換は、類似の結果が得られ、ｈＣ５ａに対する免疫原性に特定のアミノ酸残基が与える影響は、ペプチドの長さにそれほど影響を受けないことが示唆される。とりわけ、位置７４のＲがＡで置換されたｈＣ５ａ Ｃ−末端断片での免疫化は、結果として、オリジナルのエピトープと比較したとき、ｈＣ５ａに対する顕著に増加した力価を生じた。ワクチン接種に使用されるペプチド断片は、免疫原性を確実にするために、少なくともｈＣ５ａの最後の７個のＣ−末端アミノ酸を含み、ｈＣ５ａ Ｃ−末端 新生エピトープの定義された長さである１９アミノ酸を超えることはない。
個々のアミノ酸がアラニン残基により置換されたＶＡＲＩＯＴＯＰＥの阻害活性を、グルクロニダーゼ酵素遊離分析により評価した。簡単には、β-グルクロニダーゼは、ｈＣ５ａでの刺激により分化したヒトＵ９３７細胞から放出され、この効果は抗ｈＣ５ａ免疫血清の添加により阻止され得る。
ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ Ｒ７４Ａにより誘導された免疫血清は、最大の阻害活性を示し、オリジナルの配列（配列番号：１−４）と比較して、２倍増までの阻害活性が得られた（図２Ａ−Ｄ、配列番号：１４、２１、２２、および２３）。さらに、配列番号：５、７、１０、１７、および１８により誘導される免疫血清は、オリジナルのエピトープにより得られるシグナルより高いか、またはそれと同程度の阻害活性であることが明らかにされた（図２Ａおよび２Ｂ）。従って、置換Ｈ６７Ａ（配列番号：７、１７）、Ｍ７０Ａ（配列番号：１０、１８）、およびＩ６５Ａ（ここで、ｈＣａ Ｃ−末端 ＶＡＲＩＯＴＯＰＥの１０アミノ酸長（配列番号：５）でのみ見られ、１２アミノ酸長（配列番号：１６）では見られない）は、ｈＣ５ａに対する機能的に活性な抗体の誘導に好ましいが、置換Ｒ７４Ａは、異なる長さのＶＡＲＩＯＴＯＰＥで顕著に高い活性を示した（図２Ａ−Ｄ）。
グルクロニダーゼ遊離分析に基づくｈＣ５ａに対する得られたタンパク質力価および機能的活性データは、相関関係を示す。以下の実施例において、オリジナルのエピトープおよびそのＶＡＲＩＯＴＯＰＥにより誘導される免疫血清（抗体）の阻害活性のみが示され、それは、本質的に、抗体力価単独よりも有効性をより直接的に示唆する。
実施例２：
アラニンスキャニング法により同定された重要なアミノ酸は、ｈＣ５ａの位置７４のＲであり、それは、結果として、ｈＣ５ａの阻害活性の２倍増までを生じた（図２を参照のこと）。従って、次の研究において、この位置を、アルギニン残基と同様か、または反対の特徴を有するアミノ酸種により体系的に置換した（表３を参照のこと）。この研究に関して、１２アミノ酸長のＣ−末端 エピトープをテンプレートとして選択した。なぜなら、この断片（図１Ｂ）が、１０または２０アミノ酸長の断片よりもｈＣ５ａに対してより高い力価を生じ（図１ＡおよびＤ）、７アミノ酸長のｈＣ５ａ Ｃ−末端断片よりも高い阻害活性を示したためである。
ｈＣ５ａの１２アミノ酸長のＣ−末端 エピトープの１６種のＶＡＲＩＯＴＯＰＥ Ｒ７４Ｘを、それらの免疫原性および機能的に活性な抗体を誘導するそれらの能力について試験した。置換Ｒ７４ＴおよびＲ７４Ｑを含むＶＡＲＩＯＴＯＰＥから得られた免疫血清は、グルクロニダーゼ遊離分析において最大阻害を示し（図３、配列番号：２４および２５）、次いで置換Ｒ７４Ｙ（図３、配列番号：２６）およびＲを非極性、脂肪族アミノ酸残基であるＭ、Ａ、ＧおよびＶで置換したもの（図３、配列番号：２７、２１、２８、２９）が阻害活性を示した。Ｒが負電荷アミノ酸（Ｒ７４Ｄと示される）または芳香族性、非極性アミノ酸（ＷおよびＦ）および構造中断的（structural disruptor）アミノ酸であるＰで置換されたＶＡＲＩＯＴＯＰＥは、ｈＣ５ａ阻害抗体を誘導しない（図４、配列番号：３５−３８）。
実施例３：
ｈＣ５ａの位置６７のヒスチジンは、アラニンスキャニング法により同定された別の好ましい置換可能な位置であった。この位置を、さらに、ヒスチジン残基と同様か、または反対の特徴を有するアミノ酸種により体系的に置換した（表３を参照のこと）。ｈＣ５ａの１２アミノ酸長のＣ−末端 エピトープの１８種のＶＡＲＩＯＴＯＰＥ Ｈ６７Ｘを、それらの免疫原性および機能的に活性な抗体を誘導するそれらの能力について試験した（配列番号：１７、３９−５５）。
置換Ｈ６７ＴおよびＨ６７Ｑを含むＶＡＲＩＯＴＯＰＥから得られた免疫血清は、グルクロニダーゼ遊離分析において最大阻害を示し（図４、配列番号：３９および４０）、オリジナルの配列と比較したとき、２０％の増加を有した（配列番号：２）（図４）。ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（配列番号：４１−４７）により誘導された免疫血清は、オリジナルの配列（配列番号：２）より顕著に高いか、またはそれに相当する阻害活性を示す。ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（配列番号：５１−５５）により誘導される免疫血清で見出されたｈＣ５ａの阻害に対する明らかな負の効果は、オリジナルの配列（配列番号：２）と比較したとき、２０％以上の減少を示した（図４）。
実施例４：
ｈＣ５ａの位置７０のメチオニンは、ｈＣ５ａのオリジナルの１２アミノ酸長のＣ−末端エピトープよりも高いｈＣ５ａに対する阻害活性を誘導し得るＶＡＲＩＯＴＯＰＥを定義するために、体系的に置換された、第２のアミノ酸であった。１５種のＶＡＲＩＯＴＯＰＥを、グルクロニダーゼ遊離分析によりそれらの機能的活性について試験および分析した。ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（配列番号：１８および５６−６２）により誘導される免疫血清は、オリジナルのエピトープ（配列番号：２）により誘導される免疫血清より高いか、またはそれに相当する阻害シグナルを示した（図５）。しかしながら、ＶＡＲＩＴＯＰＥ（配列番号：６３−６９）は、段階的に減少した阻害活性を示し、ｈＣ５ａに対する機能的に活性な抗体を誘導しない。
実施例５：
ｈＣ５ａの位置７４でのアミノ酸置換は、Ｃ−末端 ｈＣ５ａ断片の免疫原性に大きな影響を与え、結果として、誘導された抗体の機能的活性にも影響を与える（図３を参照のこと）。しかしながら、この効果は、ｈＣ５ａ Ｃ−末端 エピトープの位置６７もしくは７０またはこれらの両方の位置が、位置７４での好ましい置換に加えて置換されたとき、より増大した。以下の実験において、Ｒ７４Ｘおよび位置６７もしくは７０、または両方の位置でのさらなる置換を含むＶＡＲＩＯＴＯＰＥを作製し、それらの免疫原性について試験した。位置７４でのＲの小さい非極性（Ａ、Ｍ）、極性 無電荷（Ｑ、Ｓ、Ｎ）、および正電荷 Ｈ アミノ酸残基での置換と共に、置換Ｈ６７Ｔ、Ｈ６７Ｍ、およびＨ６７Ａは、高い力価を示し、オリジナルのエピトープ（配列番号：２）と比較したとき、ｈＣ５ａに対して１．５倍以上の反応性抗体を生じた（図６、配列番号：７０−８０）。Ｈ６７Ｔ、Ｈ６７ＭおよびＨ６７Ａのような位置６７、またはＭ７０Ｋ、Ｍ７０ＡおよびＭ７０Ｖのような位置７０での何れかの好ましい置換と合わせて、位置７４での有利な置換は、オリジナルの配列（配列番号：２）と比較したとき、より高い阻害活性をもたらした（図６）。ＶＡＲＩＯＴＯＰＥ（配列番号：９０−９８）により誘導される免疫血清は、オリジナルの配列と比較したとき、好ましくなく、減少した阻害活性が示される（図６）。

Claims (14)

  1. アミノ酸配列
    Figure 2015518852
     ［式中、
    Ｘ１は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
    Ｘ２は、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
    Ｘ３は、（Ｘ４）ｎＡＮＩＳＸ５（配列番号：１００）または１ないし４個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
    Ｘ４は、ＶＶＡＳＱＬＲ（配列番号：１０１）または１ないし６個のアミノ酸残基からなるそのＮ−末端短縮フラグメントであり、
    Ｘ５は、アラニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、イソロイシン、リシン、メチオニン、セリンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
    ｍは、０または１であり、そして
    ｎは、０または１である。］
    で示される７ないし１９個のアミノ酸残基からなる少なくとも１種のペプチドを含むワクチンであって、ここで、該少なくとも１種のペプチドが、少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む担体と結合または融合されている、ワクチン。
  2. Ｘ１が、トレオニン、グルタミン、チロシン、メチオニン、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、請求項１に記載のワクチン。
  3. ｍが１であり、Ｘ５が、アラニン、ヒスチジン、メチオニンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはアラニン、トレオニンまたはメチオニンであるとき、Ｘ１が、アラニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、メチオニン、セリン、およびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、および／またはＸ２が、メチオニン、アラニン、リシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、請求項１に記載のワクチン。
  4. ｍが１であり、Ｘ５が、アラニン、ヒスチジン、メチオニンおよびトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはアラニン、トレオニンまたはメチオニンである、請求項１または２に記載のワクチン。
  5. Ｘ２が、メチオニン、アラニン、リシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基である、請求項１、２または４に記載のワクチン。
  6. 該少なくとも１種のペプチドが、ＩＳＨＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：１４）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：２１）、ＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：２２）、ＶＶＡＳＱＬＲＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：２３）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＴ（配列番号：２４）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＱ（配列番号：２５）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＹ（配列番号：２６）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＭ（配列番号：２７）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＧ（配列番号：２８）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＶ（配列番号：２９）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＫ（配列番号：３０）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＳ（配列番号：３１）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＨ（配列番号：３２）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＮ（配列番号：３３）、ＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＬ（配列番号：３４）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：７０）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＱ（配列番号：７１）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＳ（配列番号：７２）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＭ（配列番号：７３）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＮ（配列番号：７４）、ＡＮＩＳＴＫＤＫＱＬＧＭ（配列番号：７５）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＨ（配列番号：７６）、ＡＮＩＳＡＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：７７）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＡ（配列番号：７８）、ＡＮＩＳＴＫＤＫＱＬＧＡ（配列番号：７９）、ＡＮＩＳＴＫＤＡＱＬＧＡ（配列番号：８０）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＳ（配列番号：８１）、ＡＮＩＳＴＫＤＶＱＬＧＡ（配列番号：８２）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＮ（配列番号：８３）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＫ（配列番号：８４）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＭ（配列番号：８５）、ＡＮＩＳＴＫＤＭＱＬＧＴ（配列番号：８６）、ＡＮＩＳＨＫＤＫＱＬＧＫ（配列番号：８７）、ＡＮＩＳＭＫＤＭＱＬＧＨ（配列番号：８８）、およびＡＮＩＳＡＫＤＡＱＬＧＡ（配列番号：８９）からなる群より選択される、請求項１ないし５のいずれか一項に記載のワクチン。
  7. 該少なくとも１種のペプチドが、そのＮ末端に、直接またはスペーサー配列を介して結合した少なくとも１個のシステイン残基を含むことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一項に記載のワクチン。
  8. 該少なくとも１個のＴ細胞エピトープを含む担体が、タンパク質担体であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか一項に記載のワクチン。
  9. タンパク質担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、破傷風毒素（ＴＴ）、プロテインＤまたはジフテリア毒素（ＤＴ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項８に記載のワクチン。
  10. 化合物が、アジュバントと共に、好ましくはalumに吸着されて製剤されることを特徴とする、請求項１ないし９のいずれか一項に記載のワクチン。
  11. 補体依存性障害を処置および／または予防するための方法において使用するための、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載のワクチン。
  12. 補体依存性障害が、炎症性疾患、好ましくは慢性炎症性疾患であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
  13. 炎症性疾患が、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、神経変性障害、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン病、喘息、アテローム性動脈硬化症、血管炎、皮膚炎、好ましくは乾癬および蕁麻疹、溶血性尿毒症症候群、関節リウマチ、ギランバレー症候群、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、溶血性尿毒症症候群、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
  14. 補体依存性障害が、虚血／再潅流傷害、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、敗血症、癌、妊娠高血圧腎症のような妊娠合併症、反復自然流産、子宮内胎児発育遅延および血液透析に関係する血栓症からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン。
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