JP2011513369A - 糖尿病の治療におけるインターロイキン−１コンジュゲートの使用技術分野 - Google Patents

糖尿病の治療におけるインターロイキン−１コンジュゲートの使用技術分野 Download PDF

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Abstract

本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善及び／又は予防のための、組成物、医薬組成物及びワクチンを提供する。本発明の組成物、医薬組成物及びワクチンは、コア粒子と抗原を含み、前記抗原はインターロイキン-１（ＩＬ-１）分子を含む。動物に、好ましくはヒトに投与された場合、前記組成物、医薬組成物及びワクチンは、特定の抗体反応において、有効な免疫応答を誘導し、典型的に且つ好ましくは、前記抗体反応をＩＬ-１を目的とする。従って、本発明は、ＩＬ-１に対する能動免疫を経由して、糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療するか、改善するかまたは、予防する方法を提供する。

Description

本発明は、医学、公衆衛生、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分野にある。本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善及び／又は予防のための組成物、医薬組成物及びワクチンを提供する。本発明の組成物、医薬組成物及びワクチンは、コア粒子と抗原とを含み、前記抗原はインターロイキン-１（ＩＬ-１）分子を含む。動物に、好ましくはヒトに投与された場合、前記組成物、医薬組成物及びワクチンは、特定の抗体反応において、有効な免疫応答を誘導し、典型的に及び好ましくは、前記抗体反応はＩＬ-１に対するものである。したがって、本発明は、ＩＬ-１に対する能動免疫を経由して、糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療するか、改善するか、又は予防する方法を提供する。
２型糖尿病は、不完全なインシュリン分泌、インシュリン作用又は両方の組合せによる高血糖の存在により特徴づけられる慢性的な代謝異常である。２型糖尿病の膵臓β細胞不全の機構は十分に解明されないが、ストレス及び炎症性経路は関係していることが示されている。反復的高血糖（glucose excursion）、脂質異常症及びアディポカインによって生じる代謝ストレスは、局所的サイトカイン分泌、膵島免疫細胞浸入、β細胞アポトーシス、アミロイド沈着及び線維形成によって特徴づけられるすい臓の炎症反応を誘導しうる。ＩＬ-１βはマスター・サイトカインとして発現し、膵島ケモカイン産生を調整して、障害のあるインスリン産生とβ細胞死を生じる。組換え体ＩＬ-１受容体アンタゴニストまたは中和モノクローナル抗体の投与によるＩＬ-１シグナルの遮断は、２型糖尿病の動物モデルの血糖コントロールを改良することが示されている (Sauter et al., 2008, Osborn et al., 2008)。さらにまた、組換え体ヒトＩＬ-１受容体アンタゴニスト（Anakinra）による２型糖尿病患者の治療は、糖化ヘモグロビン濃度の減少（長期間の血糖症についての確実な情報）及び改良されたβ細胞機能 (Larsen et al., 2007)に結果としてなる。
我々は、少なくとも一つのＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１変異タンパク質を含む発明の組成物をそれぞれ含む、本発明の組成物及びワクチンが、ＩＬ-１に対する免疫応答、特に抗体反応を誘導できるだけでなく、さらにインビボでＩＬ-１の炎症性活性を中和することができることを見いだした。更には、我々は、驚くべきことに、本発明の組成物による能動免疫が糖尿病のマウスモデルの食餌性糖尿病表現型 (参照、Surwit et al., DIABETES, Vol. 37, 1988, 1163-1167)の改善に結果としてなったことを見いだした。このことは、ＩＬ-１α分子（実施例９を参照）、更にはＩＬ-１β分子（実施例１２及び１３を参照）を含むいろいろなＩＬ-１分子で観察された。
従って、ある態様では、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療、改善または予防するための組成物であって、前記組成物は：（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するコア粒子であって、前記コア粒子がウイルス様粒子（ＶＬＰ）又はウィルス粒子、好ましくはウイルス様粒子であるコア粒子；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、少なくとも一つの抗原は、好ましくはＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド及びＩＬ-１変異タンパク質からなる群から選択されるＩＬ-１分子を含み、（ａ）と（ｂ）は少なくとも一つの第１の及び少なくとも一つの第２の付着部位を介して、好ましくは共有結合して結合する、組成物を提供する。
更なる態様において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原とを含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ-１は分子を含むか、それからなるか、又はそれであり、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位及び前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して結合する組成物を提供する。好ましい実施態様において、少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は、（ｉ）ＩＬ-１分子；及び（ｉｉ）リンカーを含むか又は好ましくはそれから成る。
更に好ましい実施態様において、前記第１の付着部位が、少なくとも一つの共有結合を経て前記第２の付着部位に結合され、好ましくは前記少なくとも一つの共有結合は、非ペプチド結合である。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、（ｉ）ＩＬ-１β分子であって、配列番号１６５又は配列番号１３６であるか、好ましくは配列番号１３６であるＩＬ-１β分子；及び（ｉｉ）リンカーであって、前記第２の付着部位を含むリンカーであって、好ましくはＧＧＣ（配列番号１７８）又はＧＧＣＧ（配列番号１８８）、好ましくはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか又は好ましくはそれから成るリンカーを含むか、又は好ましくはそれから成り、更に好ましくは前記リンカーは、ペプチド結合を経由して前記ＩＬ-１β分子のＣ末端に共有結合する。
更に好ましい実施態様において、少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は（ｉ）ＩＬ-１α分子であって、配列番号２０３又は２１０、好ましくは配列番号２０３である前記ＩＬ-１α分子；及び（ｉｉ）リンカーであって、前記第２の付着部位を含むリンカーであって、好ましくはＧＧＣ（配列番号１７８）又はＧＧＣＧ（配列番号１８８）、好ましくはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか又は好ましくはそれから成るリンカーから成り、更に好ましくは前記リンカーは、ペプチド結合を経由して前記ＩＬ-１α分子のＣ末端に共有結合する。
更に好ましい実施態様において、前記ウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であって、好ましくは前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＱβである。
更なる好ましい実施態様において、前記第２の付着部位のただ一つが、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して、前記第１の付着部位に会合して、それにより前記抗原の前記ウイルス様粒子への結合が単一且つ均一型式となり、前記第１の付着部位と結合する前記ただ一つの第２の付着部位はスルフヒドリル基であり、前記抗原と前記ウイルス様粒子は、前記会合を介して相互作用し規則正しい反復性抗原アレイを形成する。
更なる態様において、本発明は糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療するためのワクチンであって、本発明の組成物を好ましくは有効量において含むか、あるいはそれからなる組成物を提供する。
更なる態様において、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病治療のための医薬組成物であって、（ａ）本発明の組成物又は本発明のワクチン；及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
更なる態様において、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療する方法であって、本発明の組成物の、本発明のワクチンの、および／または本発明の医薬組成物の免疫学的に有効量を、動物に、好ましくはヒトに投与すること含んで成る方法を提供する。
更なる態様において、本発明は、動物の、好ましくはヒトの、糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療するための医薬の製造における、本発明の組成物、本発明のワクチン、および／または本発明の医薬組成物の使用を提供する。
（発明の詳細な説明）
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
アジュバント：本明細書中で用いられる「アジュバント」なる用語は、本発明のワクチン及び医薬組成物のそれぞれと組み合わせると、より増大した免疫応答を供給しうる、宿主内の貯蔵所となる物質ないしは免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。好ましいアジュバントは、完全及び不完全なフロイントアジュバント、アルミニウム水酸化物及び修飾ムラミルジペプチドなどがある。更に好ましいアジュバントは、酸化アルミニウム三水和物のようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ (ウシ型弱毒結核菌ワクチン)及びコリネバクテリウムパルバムである。このようなアジュバントも当分野で公知である。
本発明の組成物とともに投与されうる更なるアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫修飾物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ-２１、ＱＳ-１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩類(ミョウバン)、ＭＦ-５９、ＯＭ-１７４、ＯＭ-１９７、ＯＭ-２９４及びＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術が含まれるが、これらに限定するものではない。また、アジュバントは、これらの物質の混合物を含んでもよい。ＶＬＰは一般的にアジュバントとして記載されている。しかしながら、本明細書中の文脈で用いる「アジュバント」なる用語は、本発明の組成物に用いたＶＬＰでないアジュバントを指すものであり、むしろそれは追加の、異なった成分に関する。
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示された場合、抗体又はＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)に結合可能な分子を指す。
「抗原」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞エピトープをも含む。抗原は、加えて、免疫系に認識されること、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することが可能である。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に存在することが必要である。抗原は、１つ又は複数のエピトープ (Ｂ及びＴエピトープ)を有してもよい。上記の特異的な反応とは、抗原が、好ましくは、典型的には高度に選択性のある様式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって引き起されることがある他の抗体又はＴＣＲの多数とは反応しないことを示すものである。また、ここで使用する抗原は、複数の別々の抗原の混合物であってもよい。本願明細書において使用する「抗原」なる用語は、好ましくは、ＩＬ-１分子、ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１断片、ＩＬ-１ペプチド及びＩＬ-１変異タンパク質を指し、最も好ましくは「抗原」はＩＬ-１変異タンパク質を指す。
他で示されない限り、本願明細書において使用される「抗原」なる用語は、ウイルス粒子に又はウイルス様粒子を示すものではない。
エピトープ：「エピトープ」なる用語は、ＭＨＣ分子の環境におけるＴ細胞レセプター又は抗体によって免疫特異的に結合されるポリペプチドの連続的な又は非連続的な部分を示す。抗体に関して、免疫特異的な結合は、非特異的な結合が除外されるが、交差反応が除外されることを要しない。典型的に、エピトープは、エピトープに固有の空間的な立体構造内に５−１０アミノ酸を含む。
特異的な結合(抗体／抗原)：本出願において、抗体は、１０６Ｍ−１又はそれより優れているか、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれより優れているか、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれより優れているか、及び最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれより優れている結合親和性(Ｋａ)で抗原に結合する場合、特異的に結合していると定義される。
抗体の親和性は当業者によって容易に測定されうる(例えばスキャッチャード分析、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ分析によって)。
特異的な結合(ＩＬ-１／ＩＬ-１レセプター)：レセプターとレセプターリガンドとの相互作用は、一般に当分野で公知の生物物理学的な方法、例えばＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒｅ分析によって特徴付けすることができる。
ＩＬ-１分子はＩＬ-１レセプターを特異的に結合することができるとみなすのは、前記ＩＬ-１の前記ＩＬ-１レセプターへの結合親和性(Ｋａ)が少なくとも１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０６Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、さらにより好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、及び最も好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１であり、好ましくは該ＩＬ-１レセプターがマウス又はヒト、最も好ましくはヒトのＩＬ-１レセプターである場合である。さらに好ましくは、前記ＩＬ-１レセプターは、配列番号１６６から配列番号１６９のいずれか一つの配列を含むか、より好ましくはこれからなり、最も好ましくは前記ＩＬ-１レセプターは配列番号１６６か配列番号１６７のいずれかの配列を含むか、好ましくはこれからなる。
会合(associated)：本明細書中で用いられる「会合した」又は「会合」なる用語は、２つの分子が一緒につながる全ての可能な方法、好ましくは化学的な相互作用を指す。化学的な相互作用には共有結合性相互作用及び非共有結合性相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、又は水素結合であり、一方、共有結合性相互作用は、例として共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−イオウ結合、例えばチオエーテル、又はイミド結合ベースである。
第１の付着部位：ここで用いる「第１の付着部位」なる用語は、ＶＬＰ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰに天然に存在するか、又はＶＬＰに、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰに人工的に付加されるエレメントであって、そこへ第２の付着部位が結合されうるものを指す。第１の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであるのが好ましい。第１の付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、アミノ酸の、好ましくはリジンのアミノ基である。好ましい実施態様では、上記第１の付着部位は、リジン残基のアミノ基であり、好ましくは上記リジン残基は、上記ＶＬＰに、好ましくは上記ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰに天然に存在するリジン残基である。
第１の付着部位は、ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰの、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰの表面上に、好ましくはＶＬＰの外側表面上に、典型的には位置する。多数の第１の付着部位は、典型的に及び好適には反復的な配置で、ウイルス様粒子の、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰの、最も好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰの表面上、好ましくは外側表面上に存在する。好適な実施態様では、第１の付着部位は、少なくとも一つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも一つのペプチド結合を介して、ＶＬＰと会合する。更に好適な実施態様では、第１の付着部位はＶＬＰに天然に存在する。あるいは、好適な実施態様では、第１の付着部位はＶＬＰに人工的に付加される。好ましい実施態様において、第１の付着部位は、少なくとも一つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも一つのペプチド結合を介して、上記ＶＬＰと会合し、上記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージの、好ましくはＲＮＡバクテリオファージQβのＶＰＬである。更に好ましい実施態様において、上記第１の付着部位は、リジン残基のアミノ基であり、上記リジン残基は、コートタンパク質の、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの、最も好ましくはＲＮＡバクテリオファージQβのコートタンパク質のリジン残基である。更に好ましい実施態様において、上記第１の付着部位は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質のリジン残基のアミノ基であり、好ましく上記コートタンパク質は配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれから成る。更に好ましい実施態様において、上記第１の付着部位はリジン残基であり、好ましくは上記リジン残基は、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質の、最も好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。更に好ましい実施態様において、上記第１の付着部位は、ＲＮＡバクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。
第２の付着部位：ここで用いる「第２の付着部位」なる用語は、ＩＬ-１分子に天然に存在するか、又はＩＬ-１分子に人工的に付加されたエレメントであり、そこへ第１の付着部位が結合されるものを指す。ＩＬ-１分子の第２の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであるのが好ましい。第２の付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、スルフヒドリル基である。更に好ましい実施態様において、上記第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基である。したがって、「少なくとも一つの第２の付着部位を有するＩＬ-１分子」なる用語は、ＩＬ-１分子と少なくとも一つの第２の付着部位とを含むコンストラクトを指す。しかしながら、特にＩＬ-１分子内に天然に存在しない第２の付着部位については、典型的かつ好ましくは、そのようなコンストラクトはさらに「リンカー」を含む。他の好適な実施態様では、第２の付着部位は、少なくとも一つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも一つのペプチド結合を介して、ＩＬ-１分子と会合される。更に実施態様では、第２の付着部位はＩＬ-１分子に天然に存在する。さらに他の好適な実施態様では、第２の付着部位は、好ましくはリンカーを介して、ＩＬ-１分子に人工的に付加され、このリンカーはシステインを含むか、あるいはシステインからなるものである。非常に好ましくは、上記リンカーはペプチド結合によりＩＬ-１分子に融合される。
コートタンパク質：「コートタンパク質」なる用語は、ウイルスカプシド又はＶＬＰに含まれることができる、ウイルスタンパク質、好ましくはウイルス、好ましくはＲＮＡファージの天然カプシドのサブユニットを指す。
コートタンパク質はカプシドタンパク質としても、知られている。
結合(linked)：ここで使用される「結合した」又は「結合」なる用語は、少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位とが一緒につながれる、全ての可能な方法、好ましくは化学的相互作用を意味する。化学的相互作用には共有結合性相互作用や非共有結合性相互作用が含まれる。非共有結合性相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用又は水素結合であるのに対して、共有結合性相互作用は、共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素-リン結合、炭素-イオウ結合、例えばチオエーテル又はイミド結合ベースのものである。ある好適な実施態様では、第１の付着部位と第２の付着部位は、少なくとも一つの共有結合、好ましくは少なくとも一つの非ペプチド結合、よりさらに好ましくは、非ペプチド結合のみを介して結合される。しかしながら、ここで用いられる「結合」なる用語は、少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位との直接的結合を指すだけでなく、選択的に好ましくは、少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位との中間分子を介した間接的結合であって、典型的かつ好ましくは、少なくとも一つの、好ましくは一つのヘテロ二官能性架橋剤を介するものも指す。従って、好ましい実施態様において、上記少なくとも一つの第１の付着部位と上記少なくとも一つの第２の付着部位は少なくとも一つの、好ましくは正確に一つのヘテロ二官能性架橋剤を介して共有結合で結合され、好ましくは上記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であり、更に好ましくは上記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基である。他の好適な実施態様では、第１の付着部位及び第２の付着部位は、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも一つのペプチド結合により、さらにより好ましくはペプチド結合(一又は複数)のみにより結合する。非常に好適な実施態様では、第１の付着部位及び第２の付着部位は、ペプチド結合のみによって、好ましくは遺伝子融合によって、直接あるいは好ましくはペプチドリンカーによって結合する。更に好適な実施態様では、第２の付着部位は、ペプチド結合によってのみ、好ましくは遺伝的融合によって前記第１の付着部位のＣ末端に結合する。
リンカー：本明細書で使用する「リンカー」は、第２の付着部位とＩＬ-１分子と会合するか、第２の付着部位を含むか、本質的にそれからなるか、又は第２の付着部位からなる。好ましくは、本明細書中で用いる「リンカー」は第２の付着部位を、典型的かつ好ましくは、しかし必然的ではないが、一つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として含む。好ましい実施態様において、前記リンカーはアミノ酸リンカーである。非常に好ましい実施態様において、前記リンカーは正確に一つのシステイン残基からなる。更に好ましい実施態様において、前記リンカーは、正確に１つのシステイン残基からなり、前記第２の付着部位は正確に１つのシステイン残基のスルフヒドリル基である。さらに、本発明に有用なリンカーは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル、例えばシクロペンチル又はシクロヘキシル、シクロアルケニル、アリール又はヘテロアリール部分を含有する分子である。さらに、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル(Ｃ５、Ｃ６)、アリール、又はヘテロアリール部分と追加のアミノ酸を含んでなるリンカーも本発明のためのリンカーとして使用可能であり、本発明の範囲内である。ＩＬ-１分子とリンカーの間の会合は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。遺伝子融合による結合において、リンカーは無くてもよいか、又は好ましくはアミノ酸リンカー、より好ましくはアミノ酸残基のみからなるアミノ酸リンカーである。遺伝子融合のために非常に好適なリンカーは、フレキシブルなアミノ酸リンカーである。遺伝子融合による結合において、好適なリンカーは、１〜２０、より好ましくは２〜１５、さらにより好ましくは２〜１０、さらにより好ましくは２〜５、最も好ましくは３のアミノ酸からなる。遺伝子融合に非常に好適なリンカーはGSG(配列番号１８９)を含むか、好ましくはこれからなる。
アミノ酸リンカー：「アミノ酸リンカー」なる用語は、少なくとも一つのアミノ酸残基を含んで成るリンカーに関連する。一般には、「アミノ酸リンカー」なる用語は、アミノ酸残基から独占的になるリンカーを意味するものではない。しかしながら、好ましい実施態様で、前記アミノ酸リンカーは、アミノ酸残基だけから成る。リンカーのアミノ酸残基は、好ましくは天然に存在するアミノ酸又は当該分野で公知の非天然アミノ酸の、all-Ｌ又はall-Ｄ又はそれらの混合物、最も好ましくはall-Ｌを含む。本発明に記載のリンカーの更なる好ましい実施態様は、スルフヒドリル基またはシステイン残基を含む分子であり、上記の分子も本発明の範囲に含まれる。
規則正しい反復性抗原アレイ：本明細書で用いる「規則正しい反復性抗原アレイ」なる用語は、一般的に、それぞれウイルス様粒子との関係で、典型的に好ましくは非常に規則的で均一な抗原の空間配置によって特徴付けられた構造又は抗原の反復パターンを指す。本発明の一実施態様では、反復パターンは幾何学的パターンである。本発明の特定の実施態様では、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰにカップリングした抗原のように、好ましくは１から３０ナノメーターの間隔、好ましくは２から１５ナノメーターの間隔、より好ましくは２から１０ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは２から８ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する、抗原の、厳密に反復的な準結晶構造の順序配列を持つ、適切に規則正しい反復性抗原アレイの典型的かつ好ましい例である。
ＩＬ-１分子：本明細書中で用いる「ＩＬ-１分子」又は単に「ＩＬ-１」なる用語は、配列番号３６から配列番号１１６、配列番号１３０から配列番号１４０及び配列番号１６３から配列番号１６５からなる群から選択されるいずれか一の配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを指す。本明細書中で用いる「ＩＬ-１-分子」は好ましくは、配列番号３６から配列番号１１６、配列番号１３０から配列番号１４０及び配列番号１６３から配列番号１６５からなる群から選択されるいずれか一の配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなる任意のＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質を指す。また典型的及び好ましくは、本明細書中で用いるＩＬ-１分子なる用語は、任意の動物種のＩＬ-１タンパク質のオルソログを指す。必須ではないが好ましくは、ＩＬ-１分子はＩＬ-１レセプターに結合可能であり、さらに好ましくは生物学的な活性を含む。
ＩＬ-１α分子：本明細書中で用いる「ＩＬ-１α分子」又は単に「ＩＬ-１α」なる用語は、配列番号３６から４８、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７から配列番号８８及び配列番号１６３からなる群から選択されるいずれか一の配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなるＩＬ-１αタンパク質、ＩＬ-１α断片、ＩＬ-１α成熟断片、ＩＬ-１αペプチド又はＩＬ-１α変異タンパク質を指す。ＩＬ-１αの特に好適な実施態様は、ヒトＩＬ-１α１１９−２７１(配列番号６３)である。
ＩＬ-１β分子：本明細書中で用いる「ＩＬ-１β分子」又は単に「ＩＬ-１β」なる用語は、配列番号４９から６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号８９から配列番号１１６、配列番号１３０から配列番号１４０、配列番号１６４及び配列番号１６５からなる群から選択されるいずれか一の配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなるＩＬ-１βタンパク質、ＩＬ-１β断片、ＩＬ-１β成熟断片、ＩＬ-１βペプチド又はＩＬ-１β変異タンパク質を指す。ＩＬ-１βの特に好適な実施態様は、ヒトＩＬ-１β１１７−２６９(配列番号６４)である。
ＩＬ-１タンパク質：本明細書中で用いる「ＩＬ-１タンパク質」なる用語は天然に存在するタンパク質を指し、天然に存在しないタンパク質は配列番号３６から配列番号６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有すか、又は該天然に生じるタンパク質がＩＬ-１レセプターを結合することができ、好ましくは生物学的な活性を含むものである。本明細書中で用いる「ＩＬ-１タンパク質」なる用語は天然に存在するタンパク質を指し、該天然に存在するタンパク質は配列番号３６から配列番号６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ該天然に存在するタンパク質がＩＬ-１レセプターを結合することができ、好ましくは生物学的な活性を含むものである。典型的及び好ましくは、本明細書中で用いる「ＩＬ-１タンパク質」なる用語は少なくとも１の天然に存在するタンパク質を指し、該タンパク質はＩＬ-１レセプターを結合することができ、生物学的な活性を含むものであり、さらに該タンパク質は配列番号３６から配列番号６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなる。したがって、「ＩＬ-１αタンパク質」は、配列番号３６から配列番号４８のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなるＩＬ-１タンパク質を指し、一方、「ＩＬ-１βタンパク質」は、配列番号４９から配列番号６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなるＩＬ-１タンパク質を指す。
ＩＬ-１断片：本明細書中で用いる「ＩＬ-１断片」なる用語は、ＩＬ-１タンパク質の連続的な範囲を含むポリペプチドを指し、該ポリペプチドは少なくとも５０、好ましくは少なくとも１００、最も好ましくは少なくとも１５０のアミノ酸の長さである。典型的及び好ましくは、前記ＩＬ-１断片は、多くても３００、より好ましくは多くても２５０、最も好ましくは多くても２００のアミノ酸の長さである。典型的及び好ましくは、ＩＬ-１断片は、ＩＬ-１レセプターを結合することが可能で、さらに好ましくは生物学的な活性を含む。したがって、「ＩＬ-１α断片」及び「ＩＬ-１β断片」なる用語は、定義のＩＬ-１断片を指し、該ＩＬ-１タンパク質はそれぞれＩＬ-１αタンパク質又はＩＬ-１βタンパク質である。
ＩＬ-１成熟断片：本明細書中で用いる「ＩＬ-１成熟断片」なる用語はＩＬ-１断片を指し、該ＩＬ-１断片はＩＬ-１タンパク質の天然に生じる成熟生成物である。したがって、本明細書中で用いる「ＩＬ-１α成熟断片」及び「ＩＬ-１β成熟断片」なる用語は定義されるＩＬ-１成熟断片を指し、該ＩＬ-１タンパク質はそれぞれＩＬ-１αタンパク質又はＩＬ-１βタンパク質である。ＩＬ-１α成熟断片の好適な実施態様は、配列番号６３、配列番号６５及び配列番号１６３である。ＩＬ-１β成熟断片の好適な実施態様は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号１３０、配列番号１６４及び配列番号１６５である。
好適なＩＬ-１α成熟断片は、(a) ヒトＩＬ-１α１１９−２７１(配列番号６３)；(b) マウスＩＬ-１α１１７−２７０(配列番号６５)；(c) マウスＩＬ−１α１１７-２７０ｓ(配列番号１６３)；及び、(e) 配列番号６３、配列番号６５及び配列番号１６３のいずれか一に、少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９９％の同一性があるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれからなる。
好適なＩＬ-１β成熟断片は、(a) ヒトＩＬ-１β１１７−２６９(配列番号６４)；(b) ヒトＩＬ-１β１１６−２６９(配列番号１６５)；(c) マウスＩＬ-１β１１９−２６９(配列番号６６)；(d) マウスＩＬ-１β１１９−２６９ｓ(配列番号１６４)；及び、(e) 配列番号６４、配列番号６６、配列番号１６４及び配列番号１６５のいずれか一つに対し、少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９９％の同一性があるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれからなる。
ＩＬ-１ペプチド：本明細書中で用いる「ＩＬ-１ペプチド」なる用語は、天然に生じるタンパク質の連続的な範囲を含むポリペプチドを指し、該タンパク質はＩＬ-１レセプターを結合することができ、好ましくは生物学的な活性を含み、該ポリペプチドは４〜４９、好ましくは６〜３５、最も好ましくは１０〜２５のアミノ酸の長さである。ＩＬ-１ペプチドはＩＬ-１レセプターを結合するかもしれないが典型的にはすることができず、典型的には生物学的な活性を持たない。したがって、本明細書中で用いる「ＩＬ-１αペプチド」及び「ＩＬ-１βペプチド」なる用語は、定義されるＩＬ-１ペプチドを指し、該天然に存在するタンパク質はそれぞれＩＬ-１αタンパク質又はＩＬ-１βタンパク質である。好適なＩＬ-１ペプチドは、配列番号８２から配列番号１１６である。
ＩＬ-１変異タンパク質：本明細書中で用いる「ＩＬ-１変異タンパク質」なる用語は、ＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１α又はＩＬ-１βタンパク質、ＩＬ-１α又はＩＬ-１β断片、ＩＬ-１α又はＩＬ-１β成熟断片、又はＩＬ-１α又はＩＬ-１βペプチド由来の任意のポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、好ましくは該ポリペプチドは由来するＩＬ-１分子と比較して、生物学的な活性が低減している。したがって、ＩＬ-１α変異タンパク質及びＩＬ-１β変異タンパク質は定義されるＩＬ-１変異タンパク質であり、該ポリペプチドはそれぞれＩＬ-１α分子又はＩＬ-１β分子由来のものである。
非常に好適なＩＬ-１β変異タンパク質は、ＩＬ−１β成熟断片に、好ましくはＩＬ-１β117-269（配列番号６４）に由来する。非常に好適なＩＬ-１α変異タンパク質は、ＩＬ−１α成熟断片に、好ましくはＩＬ-１α119-271（配列番号６３）に由来する。
好適なＩＬ-１変異タンパク質では、前記生物学的活性は、それが由来するＩＬ-１分子の生物学的な活性の８０％未満、より好ましくは６０％未満、さらにより好ましくは４０％未満、さらにより好ましくは２０％未満であり、更に好ましくは前記生物学的活性は、ヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ−６を誘導するための前記ＩＬ−１変異タンパク質の能力によって決定され、最も好ましくは前記生物学的活性は実施例８Ｂに記載の通り本質的に測定される。
好適なＩＬ-１β変異タンパク質では、前記生物学的活性は、それが由来するＩＬ-１β分子の生物学的な活性の８０％未満、より好ましくは６０％未満、さらにより好ましくは４０％未満、さらにより好ましくは２０％未満であり、好ましくは前記ＩＬ-１β分子はＩＬ-１β成熟断片、好ましくはヒトＩＬ-１β117-269（配列番号６４）であり、更に好ましくは前記生物学的活性は、ヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ−６を誘導するための前記ＩＬ−１変異タンパク質の能力によって決定され、最も好ましくは前記生物学的活性は実施例８Ｂに記載の通り本質的に測定される。
好適なＩＬ-１α変異タンパク質では、前記生物学的活性は、それが由来するＩＬ-１β分子の生物学的な活性の８０％未満、より好ましくは６０％未満、さらにより好ましくは４０％未満、さらにより好ましくは２０％未満であり、好ましくは前記ＩＬ-１α分子はＩＬ-１α成熟断片、好ましくはヒトＩＬ-１α119-271（配列番号６３）であり、更に好ましくは前記生物学的活性は、ヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ−６を誘導するための前記ＩＬ−１変異タンパク質の能力によって決定され、最も好ましくは前記生物学的活性は実施例１１に記載の通り本質的に測定される。
更に好適なＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１成熟断片に由来し、前記ＩＬ-１変異タンパク質の生物学的活性は、前記ＩＬ-１変異タンパク質が由来するＩＬ-１成熟断片の生物学的な活性の８０％未満、より好ましくは６０％未満、さらにより好ましくは４０％未満、さらにより好ましくは２０％未満である。非常に好ましいＩＬ-１変異タンパク質は、生物学的活性を示さす、好ましくは前記生物学的活性は実施例８Ｂ又は１１に記載のとおり本質的に測定される。
好ましくは、しかし必然的にでなく、ＩＬ-１変異タンパク質は特異的にＩＬ-１受容体を結合することができる。
唯一の抗原として好適なＩＬ-１変異タンパク質を含む組成物は、前記ＩＬ-１変異タンパク質が由来するＩＬ-１分子に特異的に結合することができる抗体の力価を誘導し、前記力価は、唯一の抗原としてＩＬ-１変異タンパク質が由来するＩＬ-１分子を含む組成物により得られた力価の、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、またより好ましくは６０％、またより好ましくは８０％及び最も好ましくは少なくとも１００％であり、好ましくは前記力価は実施例９Ｄに記載のとおり本質的に測定される。
動物に導入された場合、唯一の抗原として好適なＩＬ-１β変異タンパク質を含む組成物は、前記ＩＬ-１β変異タンパク質が由来するＩＬ-１β分子に特異的に結合することができる抗体の力価を誘導し、好ましくは前記ＩＬ-１β分子は、ＩＬ-１β成熟断片であり、最も好ましくはヒトＩＬ-１β117-269（配列番号６４）であり、前記力価は、唯一の抗原としてＩＬ-１β変異タンパク質が由来するＩＬ-１β分子を含む組成物により得られた力価の、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、またより好ましくは６０％、またより好ましくは８０％及び最も好ましくは少なくとも１００％であり、唯一の抗原としてＩＬ-１β成熟断片であり、最も好ましくはヒトＩＬ-１β117-269（配列番号６４）であり、好ましくは前記力価は実施例９Ｄに記載のとおり本質的に測定される。
動物に導入された場合、唯一の抗原として好適なＩＬ-１α変異タンパク質を含む組成物は、前記ＩＬ-１α変異タンパク質が由来するＩＬ-１α分子に特異的に結合することができる抗体の力価を誘導し、好ましくは前記ＩＬ-１α分子は、ＩＬ-１α成熟断片であり、最も好ましくはヒトＩＬ-１α119-271（配列番号６３）であり、前記力価は、唯一の抗原としてＩＬ-１α変異タンパク質が由来するＩＬ-１α分子を含む組成物により得られた力価の、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、またより好ましくは６０％、またより好ましくは８０％及び最も好ましくは少なくとも１００％であり、唯一の抗原としてＩＬ-１α成熟断片であり、最も好ましくはヒトＩＬ-１α119-271（配列番号６３）であり、好ましくは前記力価は実施例９Ｄに記載のとおり本質的に測定される。
非常に好適なＩＬ-１変異タンパク質は、それが由来するＩＬ-１分子の生物学的活性の８０％未満、より好ましくは６０％未満、更により好ましくは４０％未満、更により好ましくは２０％未満である生物学的活性を有するＩＬ-１変異タンパク質であり、更に好ましくは、前記生物学的活性はヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ−６を誘導するための前記ＩＬ−１変異タンパク質の能力によって決定され、最も好ましくは前記生物学的活性は実施例８Ｂに記載の通り本質的に測定され、加えて前記非常に好適なＩＬ-１変異タンパク質を含む組成物は前記非常に好適なＩＬ-１変異タンパク質が由来したＩＬ-１分子に特異的に結合することができる抗体の力価を誘導し、前記力価は、唯一の抗原として前記非常に好適なＩＬ-１変異タンパク質が由来するＩＬ-分子を含む組成物により得られた力価の、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、またより好ましくは６０％、またより好ましくは８０％及び最も好ましくは少なくとも１００％であり、好ましくは前記力価は実施例９Ｄに記載のとおり本質的に測定される。
(i) ＩＬ-１タンパク質、好ましくは配列番号３６から配列番号６２；又は、(ii) より好ましくはＩＬ-１成熟断片、好ましくは配列番号６３から配列番号６６、配列番号１３０、及び配列番号１６３から配列番号１６５のいずれかに由来するＩＬ-１変異タンパク質が非常に好ましい。
本明細書中で有用なＩＬ-１変異タンパク質は、Kamogashira等 (1988) J. Biochem. 104:837-840；Gehrke等 (1990) The Journal of Biological Chemistry 265(11): 5922-5925；Conca等 (1991) The Journal of Biological Chemistry 266(25): 16265-16268；Ju等 (1991) PNAS 88:2658-2662；Auron等 (1992) Biochemistry 31:6632-6638；Guinet等 (1993) Eur. J. Biochem 211:583-590；Camacho (1993) Biochemistry 32:8749-8757；Baumann (1993) Journal of Recepror Research 13(1-4): 245-262；Simon (1993) The Journal of Biological Chemistry 268(13): 9771-9779；及び、Simoncsits (1994) Cytokine 6(2): 206-214に記載されており、これらの開示内容は出典明記によって本明細書中に援用される。
好適なＩＬ-１変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)がＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、ＩＬ-１成熟断片又はＩＬ-１ペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数) は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。好適な実施態様では、前記アミノ酸残基は１つの連続的な範囲にあるものである。さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)がＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、又はＩＬ-１成熟断片、好ましくはＩＬ-１成熟断片のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数) は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。
さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が配列番号３６から配列番号４８及び配列番号４９から配列番号６２のいずれか一のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、より好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数) が、(i) 配列番号６３、配列番号６５及び配列番号１６３のいずれか一、最も好ましくは配列番号６３；又は(ii) 配列番号６４、配列番号６６、配列番号１３０、配列番号１６４、及び配列番号１６５からなる群から選択されるいずれか一つ、最も好ましくは配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、より好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。
さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１α変異タンパク質であり、該ＩＬ-１α変異タンパク質は、１〜６、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が配列番号３６から配列番号４８のいずれか一のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、より好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。さらに好適なＩＬ-１α変異タンパク質は、１〜６、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が、(i) 配列番号６３、配列番号６５及び配列番号１６３のいずれか一、最も好ましくは配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。
非常に好適なＩＬ-１α変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が、配列番号６３のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。更により好適なＩＬ-１α変異タンパク質は、ポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２１０から配列番号２１８から成る群から選択されるポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる。
さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１β変異タンパク質であり、該ＩＬ-１β変異タンパク質は、１〜６、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が配列番号４９から配列番号６２のいずれか一のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、より好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。さらに好適なＩＬ-１β変異タンパク質は、１〜６、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が、配列番号６４、配列番号６６、配列番号１３０、配列番号１６４及び配列番号１６５からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。非常に好適なＩＬ-１β変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が、配列番号６４のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。さらにより好適なＩＬ-１β変異タンパク質は、配列番号１３１から配列番号１４０及び配列番号２０５から配列番号２０９からなる群のいずれか一から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなる。
「由来した」：本発明の文章において、別のアミノ酸配列に「由来した」アミノ酸配列なる表現は、(i)アミノ酸置換、(ii)欠失、(iii)挿入及び（iv）(i)から(iii)の任意の組合せからなる群から選択される突然変異、好ましくは(i)アミノ酸置換と(ii)欠失とから選択される突然変異を除いて、前記アミノ酸配列がそれが由来したアミノ酸配列と本質的に同一であることを意味しする。特に、野生型のアミノ酸配列に由来する突然変異アミノ酸配列は、好ましくは、前記アミノ酸配列と１から１０、好ましくは１から６、より好ましくは１から５、更に好ましくは１から４、より更に好ましくは１から３、より更に好ましくは１から２、最も好ましくは正確に１アミノ酸残基が異なり、好ましくは、前記アミノ酸残基は、(i)別のアミノ酸による置換、(ii)野生型アミノ酸の欠失、(iii)前記野生型配列への挿入及び（iv）(i)から(iii)の任意の組合せであり、最も好ましくは(i)別のアミノ酸による置換、又は(ii)野生型アミノ酸の欠失である。１より多いアミノ酸残基の欠失は、好ましくは前記野生型アミノ酸配列のアミノ酸残基の連続的な範囲の欠失として生じる。野生型アミノ酸配列に由来する突然変異アミノ酸配列は、前記野生型アミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
同様に、「ＩＬ-１分子に由来する変異タンパク質」なる表現は、前記変異タンパク質が、(i)アミノ酸置換、(ii)欠失、(iii)挿入及び（iv）(i)から(iii)の任意の組合せからなる群から選択される突然変異、好ましくは(i)アミノ酸置換と(ii)欠失とから選択される突然変異を除いて、それが由来したＩＬ-１分子のアミノ酸配列に実質的に同一であることを意味する。特に、ＩＬ-１分子に由来するＩＬ-１変異タンパク質は、好ましくは、前記アミノ酸配列と１から１０、好ましくは１から６、より好ましくは１から５、更に好ましくは１から４、より更に好ましくは１から３、より更に好ましくは１から２、最も好ましくは正確に１アミノ酸残基が異なり、好ましくは、前記アミノ酸残基は、(i)別のアミノ酸による置換、(ii)野生型アミノ酸の欠失、(iii)前記野生型配列への挿入及び（iv）(i)から(iii)の任意の組合せであり、最も好ましくは(i)別のアミノ酸による置換、又は(ii)野生型アミノ酸の欠失である。１より多いアミノ酸残基の欠失は、好ましくは前記ＩＬ-１変異タンパク質が由来したＩＬ-１分子のアミノ酸残基の連続的な範囲の欠失として生じる。野生型アミノ酸配列に由来する変異タンパク質は、前記ＩＬ-１変異タンパク質が由来したＩＬ-１分子に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
アミノ酸置換：アミノ酸置換なる表現は、他の任意のアミノ酸残基による、アミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸残基の交換を指す。
ＩＬ-１のアゴニスト効果／生物学的な活性：ＩＬ-１に関して本明細書中で用いる「生物学的な活性」又は「生物学的に活性な」なる用語は、好ましくは実施例２Ｅ及び実施例３Ｅに概説するように、動物に全身投与された後にＩＬ-６の産生を誘導するＩＬ-１分子の能力を指す。また、ＩＬ-１分子の生物学的な活性は、胸腺細胞の増殖誘導能(Epps等, Cytokine 9(3): 149-156 (1997)、Ｄ１０.Ｇ４.１ Ｔヘルパー細胞の増殖誘導能(Orencole and Dinarello, Cytokine 1(1): 14-22 (1989)、又はＭＧ６４細胞又はＨａＣａＴ細胞(Boraschi等, J. Immunol. 155:4719-4725 (1995)又は線維芽細胞(Dinarello等, Current Protocols in Immunology 6.2.1-6-2-7 (2000))からのＩＬ-６産生誘導能、ＥＬ-４胸腺腫細胞からのＩＬ-２産生誘導能(Simon等, J. Immunol. Methods 84(1-2): 85-94 (1985))、又はヒトのメラノーマ細胞株Ａ３７５の増殖抑制能(Nakai等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 154:1189-1196 (1988))を指す。非常に好ましくは、ＩＬ-１分子の生物学的活性又はＩＬ-１変異タンパク質なる用語は、ヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ−６を誘導するための前記ＩＬ−１分子又は前記ＩＬ−１変異タンパク質であり、好ましくは前記ＩＬ−１分子又は前記ＩＬ−１変異タンパク質は前記ＩＬ-１組成物中でただ一つの抗原であり、最も好ましくは前記生物学的活性は本質的に実施例８Ｂに記載のとおり測定される。
パッケージ化：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰとの関係でのポリアニオン性巨大分子又は免疫賦活性物質の状態を指す。本明細書中で用いる「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的カップリング、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などでありうる結合を含む。好ましい実施態様において、「パッケージ化」なる用語は、ＶＬＰによる、ポリアニオン性巨大分子の封入ないしは部分的な封入をさす。したがって、ポリアニオン性巨大分子又は免疫賦活性物質を、実際に結合、特に共有結合しなくても、ＶＬＰによって封入することができる。好適な実施態様では、少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子又は免疫賦活性物質はＶＬＰ内に、最も好ましくは非共有的様式にてパッケージ化される。ポリグルタミン酸のようなポリアニオン性巨大分子のＶＬＰへの、特にＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰへのパッケージ化の方法は、WO2006/037787に開示されている。特にWO2006/037787の実施例４を引用する。免疫賦活性物質、好ましくは免疫賦活性核酸、最も好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの、ＶＬＰへのパッケージ化の方法は、WO2003/024481A2に記載されている。前記免疫賦活性物質が核酸、好ましくはＤＮＡ、最も好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである場合、パッケージ化なる用語は、前記核酸がヌクレアーゼ加水分解に影響されない、好ましくはＤＮアーゼ加水分解(例えばＤＮアーゼI又はベンゾナーゼ(Benzonase))に影響されないことを意味し、好ましくはこの影響されやすさはWO2003/024481A2の実施例１１〜１７に記載のとおりにアッセイされる。
ポリアニオン性巨大分子：本願明細書において使われる「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、負の電荷の反復性の基を含む高い相対分子質量の分子であって、その構造は基本的に、実際にまたは概念的に低い相対分子質量の分子に由来する単位の多重反復を含む分子を指す。本願明細書において使用する「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、ｔｏｌｌ様受容体を活性化することができない分子を指す。したがって、「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドを除外するものであり、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドのような免疫応答を誘発および／または改良することができる物質、免疫応答を誘導および／または改良することができる核酸及びリポ多糖体（ＬＰＳ）を除外する。より好ましくは、本願明細書において使われる「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、サイトカイン産生を誘導することができない分子を指す。好ましくは、ポリアニオン性巨大分子は、ポリアニオン性ポリペプチドまたはアニオン性デキストランである。好ましい実施態様において、前記ポリアニオン性巨大分子は、ポリアニオン性ポリペプチドであって、好ましくは前記ポリアニオン性ポリペプチドは、以下からなるグループから選択される：（ａ）ポリグルタミン酸；（ｂ）ポリアスパラギン酸；（ｃ）ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）及び（ｄ）（ａ）から（ｃ）の任意の化学修飾。化学修飾の例は、グリコシル化、アセチル化及びリン酸化を含むが、これに限定されるものではない。更なる好ましい実施態様において、前記ポリアニオン性巨大分子は、以下からなるグループから選択されるアニオン性デキストランである：（ａ）デキストラン硫酸；（ｂ）カルボキシルメチルデキストラン；（ｃ）スルホプロピルデキストラン；（ｄ）メチルスルホナートデキストラン；及び（ｅ）デキストランホスフェート。
ポリアスパラギン酸：本願明細書において使われる「ポリアスパラギン酸」なる用語は、前記ポリペプチドによって含まれるアミノ酸残基の総数から少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％のアスパラギン酸残基を含むポリペプチドを指す。前記ポリペプチドのアスパラギン酸残基は、ａｌｌ−Ｌ、ａｌｌ−Ｄのどちらか又はＬ−とＤ−アスパラギン酸の混合物である。最も好ましくは前記ポリペプチドは、Ｌ−アスパラギン酸残基のみを含む。
ポリグルタミン酸：本願明細書において使われる「ポリグルタミン酸」なる用語は、前記ポリペプチドによって含まれるアミノ酸残基の総数から少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％のグルタミン酸残基を含むポリペプチドを指す。前記ポリペプチドのグルタミン酸残基は、ａｌｌ−Ｌ、ａｌｌ−Ｄのどちらか又はＬ−とＤ−グルタミン酸の混合物である。最も好ましくは、前記ポリペプチドは、Ｌ−グルタミン酸残基のみを含む。
ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）：本願明細書において使われる「ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）」なる用語は、前記ポリペプチドによって含まれるアミノ酸残基の総数から少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％のグルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基を含むポリペプチドを指す。グルタミン酸分子とアスパラギン酸分子は、ａｌｌ−Ｌ又はａｌｌ−Ｄのどちらか、又はそれらの混合物である。最も好ましくは、前記ポリペプチドは、Ｌ−グルタミン酸残基及びＬ−アスパラギン酸残基を含む。
ポリペプチド：本願明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合（ペプチド結合ともいう）によって、直線的に連結されるモノマー（アミノ酸）から成る分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、産生物の特定の長さを指すわけではない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、公知のコンピュータプログラム（例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラム）を使用して、従来通り決定されうる。対照標準アミノ酸配列に対して、例えば９５％同一性を有するかを決定するために、他の任意の配列配列プログラムも使用する場合、好ましくはＢｅｓｔｆｉｔを使用する場合、同一性のパーセンテージは対照標準アミノ酸配列の完全長に対して算出され、対照標準配列におけるアミノ酸残基の総数の多くとも５％の相同性におけるギャップが許可されるように、パラメータは設定される。ポリペプチド間の同一性のパーセンテージを決定における上述の方法は、本発明において開示される全てのタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの断片に適用できる。
組換えＶＬＰ：本願明細書において使われる「組換えＶＬＰ」なる用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも一つの工程を含む方法によって得られるＶＬＰを指す。
ウイルス粒子：本明細書中で用いられる「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形状を指す。いくつかのウイルス型では、タンパク質カプシドに囲まれるゲノムを含まれ、他のものは付加的な構造（例えばエンベロープ、テイルなど）を有する。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で用いられる「ウイルス様粒子」なる用語は、非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性又は非感染性のウイルス粒子、又は非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性又は非感染性のウイルス粒子に類似した構造、好ましくはウイルスのカプシドを指す。本願明細書において使われる「非複製性」なる用語は、ＶＬＰによって含まれるゲノムを繰り返すことができないことを指す。本願明細書において使われる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に入ることができないことを指す。好ましくは、本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルスゲノムまたはゲノム機能の全部または一部を欠いているので、非複製性でおよび／または非感染性である。ある実施態様では、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムが物理的に及び化学的に不活性化されているウイルス粒子である。典型的には及び好ましくは、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの反復可能性及び感染性構成部分の全部または一部を欠いている。本発明に係るウイルス様粒子は、それらのゲノムとは別の核酸を含むことができる。本発明のウイルス様粒子の典型的及び好適な実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのウイルスカプシドのようなウイルスカプシドである。「ウイルスカプシド」または「カプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質サブユニットから成る巨大分子アセンブリをさす。通常は、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウィルスタンパク質サブユニットがある。典型的には及び好ましくは、これらのサブユニットの相互作用は、本来の反復性の構成を有するウイルスカプシド又はウイルスカプシド様の構造の形成につながり、前記構造は、典型的には球状又は管状である。例えば、ＲＮＡバクテリオファージ又はＨＢｃＡｇのカプシドは、正二十面体対称の球面形態を有する。本願明細書において使われる「カプシド様構造」なる用語は、上に定義のカプシド形態学に似ているウイルスタンパク質サブユニットから成る巨大分子アセンブリを指すが、典型的対称形アセンブリから逸脱して、規則性と反復性の十分な程度を維持する。ウイルス粒子及びウイルス様粒子の共通の特徴は、そのサブユニットの高度に規則正しい反復性の配列である。
ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子：本願明細書において使われる「ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、又は好ましくはそれから本質的になるか、又はそれから成る。加えて、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの構造に似ている。さらにまた、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子は、非複製性で非感染性である。典型的に及び好ましくは、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージ複製装置をコードする遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは全てを欠如している。更に好ましくは、宿主へのウイルス付着又は侵入の役割を果たしているタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは全てを欠如するＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子を指す。しかしながら、この定義は、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子を含み、上述の遺伝子は、依然として存在するが不活性であり、従って、ＲＮＡ−バクテリオファージの非複製性で非感染性のウイルス様粒子を導く。ＲＮＡバクテリオファージに由来する好適なＶＬＰは、正二十面体対称を呈する１８０のサブユニットから成る。従って、最も広い定義では、非複製性で非感染性のＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子を生成する好適な方法は、物理的不活性化、ＵＶ照射のような化学的不活性か、アルムアルデヒド処理、典型的及び好適には遺伝子操作による。
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一つ」、又は「一又は複数」を意味する。
糖尿病：糖尿病なる用語は、任意の種類の真正糖尿病に関連する。好ましくは、糖尿病は、１型糖尿病および／または２型糖尿病を指す。最も好ましくは、糖尿病は、２型糖尿病を指す。
本願明細書に記載の組成物は、動物のまたはヒトのＩＬ-１に対して免疫応答を誘導するかまたは増強することができる。驚くべきことに、ＩＬ-１分子による、すなわちＩＬ-１α分子による、又はＩＬ-１β分子による、又は両方の組合せによる免疫化は、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの食餌性糖尿病性表現型のはっきりした改善に結果としてなったことが、発見された。
従って、本発明は、糖尿病の、好ましくは２型糖尿病の治療、改善または予防のための組成物であって、(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するコア粒子であって、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）又はウイルス粒子、好ましくはウイルス様粒子であるコア粒子；及び(b)少なくとも第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、少なくとも一つの抗原が好ましくはＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド及びＩＬ-１変異タンパク質から成る群から選択され、(a)と(b)は少なくと一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位を介して共有結合により結合される、組成物を提供する。
好ましい実施態様において、前記組成物は、(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）；及び（b）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含み、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ-１分子を含み、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して(a)と(b)は結合される組成物である。更に好ましい実施態様において、前記少なくとも第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、(i)ＩＬ-１分子及び(ii)リンカーを含み、好ましくは前記リンカーは好ましくは前記第２の付着部位を含むか、好ましくはそれから成る。
好ましくは、前記ＩＬ-１はコア粒子に結合され、それにより規則正しい反復性抗原-ＶＬＰアレイを形成する。本発明の好ましい実施態様では、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも６０、またより好ましくは少なくとも１２０及び更により好ましくは少なくとも１８０のＩＬ-１分子は、コア粒子に結合される。
規則正しい反復性の構造を有する当分野で公知の任意のウイルスは、本発明のＶＬＰ又はウイルス粒子として選択してもよい。ＶＬＰの調整のために使用されうる具体的なＤＮＡないしＲＮＡウイルスのコート又はカプシドタンパク質は、国際公開第２００４／００９１２４号の２５頁の１０−２１行目、２６頁の１１−２８行目及び２８頁の４行目から３１頁の４行目に開示されている。これらの開示内容は出典明記により本明細書中に援用される。
ウイルス又はウイルス様粒子は、ウイルス感染した細胞培養物から産生されて精製されうる。ワクチンの目的のために結果として生じたウイルス又はウイルス様粒子は、好ましくは非複製性又は非感染性、より好ましくは非複製性かつ非感染性であるべきである。ＵＶ照射、ホルムアルデヒドやクロロホルムなどによる化学的処理は、当業者に公知の、ウイルスを不活性化させるための一般的な方法である。
好適な実施態様では、コア粒子はウイルス粒子であり、好ましくは該ウイルス粒子はバクテリオファージであり、さらに好ましくは該バクテリオファージはＲＮＡバクテリオファージであり、よりさらに好ましくは該ＲＮＡバクテリオファージは、Ｑβ、ｆｒ、ＧＡ又はＡＰ２０５から選択されるＲＮＡバクテリオファージである。
好ましい一実施態様において、コア粒子はＶＬＰである。別の好ましい実施態様では、ＶＬＰは組換ＶＬＰである。ほとんど全ての一般に知られているウイルスは、配列決定されており、一般に公開されている。コートタンパク質をコードする遺伝子は、当業者によって容易に同定されうる。宿主でコートタンパク質を発現するＶＬＰの組換えによる調製は、当業者の知識の範囲にある。
好適な一実施態様では、ウイルス様粒子は、(a) ＲＮＡバクテリオファージ；(b) バクテリオファージ；(c) Ｂ型肝炎ウイルス、好ましくはそのカプシドタンパク質(Ulrich, et al., Virus Res. 50: 141-182 (1998)) 又はその表面タンパク質(WO 92/11291)；(d) 麻疹ウイルス(Warnes, et al., Gene 160: 173-178 (1995));(e)シンドビスウイルス;(f) ロタウイルス (US 5,071,651及びUS 5,374,426);(g) 足口病ウイルス(Twomey, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995));(h) ノーウォークウイルス (Jiang, X., et al., Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991));（i) アルファウイルス；（j) レトロウイルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質(国際公開公報96/30523)；（k) レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；（l) ヒトパピローマウイルス(国際公開公報98/15631)；（m) ポリオーマウイルス；（n) タバコモザイク病ウイルス；及び（o) Ｆｌｏｃｋハウスウイルスからなる群から選択されるウイルスの組換えタンパク質、その変異体又はその断片を含むか、あるいはこれからなる。
１種より多くの組換えタンパク質を含むＶＬＰを本出願では概してモザイクＶＬＰとする。一実施態様では、ＶＬＰはモザイクＶＬＰであり、該モザイクＶＬＰは、１より多くの組換えタンパク質、好ましくは２の組換えタンパク質、最も好ましくは２の組換えカプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はこれからなる。
ここで使用される「組換えタンパク質の断片」なる用語又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％であり、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、少なくとも一つの内部欠失、少なくとも一つの切断、又はそれらの少なくとも一つの組合せから得られる。さらに好ましくは、最大５、４、３又は２の内部欠失、最大２の切断又はそれらのただ１つの組合せにより得られる。
さらに、「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、上で定義した「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」のそれぞれと、少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子に組み立てられることができるポリペプチドを指す。
「変異体コートタンパク質」なる用語は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれに由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、該アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であり、好ましくはＶＬＰに組み立てられる能力を保持している。
好適な一実施態様では、本発明のウイルス様粒子はＢ型肝炎ウイルスである。Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の調整は、特に国際公開第００／３２２２７号、同第０１／８５２０８号及び同第０１／０５６９０５号に開示されている。これら３つすべての文書は出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる。本発明の実施における使用に好適なＨＢｃＡｇの他の変異体は国際公開公報０１／０５６９０５の３４−３９頁に開示されている。
本発明の更なる好適な一実施態様では、リジン残基はＨＢｃＡｇポリペプチドに導入され、ＩＬ-１分子のＨＢｃＡｇのＶＬＰへの結合を媒介する。好適な実施態様では、本発明の組成物及びＶＬＰは、配列番号１のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇを用いて調整される。このアミノ酸は修飾されており、７９番目と８０番目のアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Gly(配列番号１７０)のアミノ酸配列を有するペプチドに置き換わっている。この修飾により配列番号１から配列番号２に変化する。更なる好適な実施態様では、配列番号２の４８番目と１１０番目のシステイン残基、又はその対応する断片、好ましくは１−１４４又は１−１４９がセリンに変異される。さらに、本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するＢ型肝炎コアタンパク質変異を含有する組成物を包含する。さらに、本発明は、配列番号２に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含有する組成物及びワクチンのそれぞれを包含する。
本発明のある実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージは、（ａ)バクテリオファージＱβ；（ｂ)バクテリオファージＲ１７；（ｃ)バクテリオファージｆｒ；（ｄ)バクテリオファージＧＡ；（ｅ)バクテリオファージＳＰ；（ｆ)バクテリオファージＭＳ２；（ｇ)バクテリオファージＭ１１；（ｈ)バクテリオファージＭＸ１；（ｉ)バクテリオファージＮＬ９５；（ｋ)バクテリオファージｆ２；（ｌ)バクテリオファージＰＰ７、（ｍ)バクテリオファージＰＲＲ１及び（ｎ)バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
本発明のある好適な実施態様では、組成物はＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又はその断片を含み、該コートタンパク質は (a) Ｑβ ＣＰと称する配列番号３；(b) 配列番号３及び配列番号４(Ｑβ Ａ１タンパク質)の混合物；(c) 配列番号５(Ｒ１７カプシドタンパク質)；(d) 配列番号６(ｆｒカプシドタンパク質)；(e) 配列番号７(ＧＡカプシドタンパク質)；(f) 配列番号８(ＳＰカプシドタンパク質)；(g) 配列番号８及び配列番号９の混合物；(h) 配列番号１０(ＭＳ２カプシドタンパク質)；(i) 配列番号１１(Ｍ１１カプシドタンパク質)；(j) 配列番号１２(ＭＸ１カプシドタンパク質)；(k) 配列番号１３(ＮＬ９５カプシドタンパク質)；(l) 配列番号１４(ｆ２カプシドタンパク質)；(m) 配列番号１５(ＰＰ７カプシドタンパク質)；及び(n) 配列番号２１(ＡＰ２０５カプシドタンパク質)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又はその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるモザイクＶＬＰである。非常に好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージの２つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれらからなるものであり、該２つのコートタンパク質はＣＰ Ｑβ(配列番号３)とＣＰ Ｑβ Ａ１(配列番号４)、又はＣＰ ＳＰ(配列番号８)とＣＰ ＳＰ Ａ１(配列番号９)のアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ-バクテリオファージの組換えコートタンパク質、その変異体又はその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなっており、好ましくは前記ＲＮＡバクテリオファージは、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＡＰ２０５又はバクテリオファージＧＡから選択される。
好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰである。Ｑβのカプシドまたはウイルス様粒子は、直径２５ｎｍ及びＴ＝３見かけ対称性を有する正二十面体のファージ様カプシド構造を示す。カプシドは１８０コピーのコートタンパク質を含み、それはジスルフィド架橋(Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-5554 (1996))によって共有結合性五量体と六量体に連結され、Ｑβカプシドの顕著な安定性を導く。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作成されるカプシドまたはＶＬＰは、カプシド中の他のサブユニットにジスルフィド結合を経て連結されないサブユニットか、または不完全に連結したサブユニットを含むことができる。ＱβのカプシドまたはＶＬＰは、有機溶媒及び変性剤に通常でない耐性を示す。驚くべきことに、３０％と同じ高さのＤＭＳＯ及びアセトニトリル濃度、１Ｍと同じ高さのグアニジニウム濃度はカプシドの安定性に影響を及ぼさないことが観察された。Ｑβのカプシド及びＶＬＰの高い安定性は、特に、本発明に係る哺乳類及びヒトの免疫化及びワクチン接種におけるその使用に有利な特徴である。
本発明に係るＲＮＡ−バクテリオファージ、特にＲＮＡ−バクテリオファージＱβとＲＮＡ−バクテリオファージｆｒの更なる好適なウイルス様粒子はＷＯ０２／０５６９０５において開示され、その開示は参照により完全に本願明細書に援用される。特に、ＷＯ０２／０５６９０５の実施例１８は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの調製の詳細な説明を提供する。
他の好ましい例として、前記ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである。アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換されたＡＰ２０５コートタンパク質又はアミノ酸１４のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されたＡＰ２０５コートタンパク質を含むＡＰ２０５ ＶＬＰの組み立て可能な変異体の形態は、本発明の実行に使用されてもよく、本発明の好ましい他の実施形態につながる。ＷＯ２００４／００７５３８は、特に実施例１と実施例２において、ＡＰ２０５コートタンパク質を含むＶＬＰをどのように得るかについて、及び特にその発現と精製を記載する。ＷＯ２００４／００７５３８は、参照により本願明細書に援用される。ＡＰ２０５ ＶＬＰは高度に免疫原性であり、典型的には及び好ましくは、配向性及び反復性の様式でＩＬ-１を提示するワクチン・コンストラクトを生成するために、抗原に連結されることができる。
好ましい一実施態様において、ＶＬＰは、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの、ウイルスの変異体コートタンパク質を含むかまたはそれから成り、変異体コートタンパク質は、置換の方法でおよび／または欠失の方法で、少なくとも一つのリジン残基が除去されることによって修飾されている。他の好ましい実施態様において、ＶＬＰは、ウイルスの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの変異体コートタンパク質を含むか、又はそれから成り、変異体コートタンパク質は、置換の方法でおよび／または欠失の方法で、少なくとも一つのリジン残基が付加されることによって修飾されている。少なくとも一つのリジン残基の欠失、置換または付加は、カップリングの程度を変化させてることを可能にし、すなわち、ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのサブユニットにつき結合しているＩＬ-１量を変化させることを可能にする。
好ましい一実施形態において、本発明の組成物とワクチンは、０．５から４．０の抗原密度を有する。本願明細書において使われる「抗原密度」なる用語は、ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのサブユニット、好ましくはコートタンパク質につき連結されるＩＬ-１分子の、平均数を指す。したがって、この値は、本発明の組成物またはワクチンにおいて、前記ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの前記ＶＬＰの、全てのサブユニットにおける平均として算出される。
Ｑβコートタンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、定まった数のリジン残基をそれらの表面に提示し、３つのリジン残基がカプシドの内部を向いておりＲＮＡと相互作用し、４つの別のリジン残基がカプシドの外側に曝らされる定まったトポロジーを有する。好ましくは、少なくとも一つの第１の付着部位は、ＶＬＰの外側を向いているか又はそこに存在するリジン残基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、配列番号３のリジン残基のアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、配列番号３の位置２、１３、１６、４６、６０、６３及び６７のリジン残基のうちの任意の一つのアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、カプシドの外側に露出している、好ましくは配列番号３のコートタンパク質のリジン残基の任意の一つのアミノ基である。
露出したリジン残基がアルギニンと交換されたＱβ変異体が、本発明のために使われてもよい。したがって、別の本発明の好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、変異体Ｑβのコートタンパク質を含むか、基本的にそれから成るか、またはそれから成る。好ましくは、これらの変異体コートタンパク質は、（ａ）Ｑβ−２４０（配列番号１６、配列番号３のＬｙｓ１３−Ａｒｇ）；（ｂ）Ｑβ−２４３（配列番号１７、配列番号３のＡｓｎ１０−Ｌｙｓ）；（ｃ）Ｑβ−２５０（配列番号１８、配列番号３のＬｙｓ２−Ａｒｇ）；（ｄ）Ｑβ−２５１（配列番号１９、配列番号３のＬｙｓ１６−Ａｒｇ）；及び（ｅ）Ｑβ−２５９（配列番号２０、配列番号３のＬｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ）からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成る。上記のＱβ変異体コートタンパク質、変異体Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ及びカプシドのコンストラクト、発現及び精製は、それぞれＷＯ０２／０５６９０５に記載されている。特に、ＷＯ０２／０５６９０５の実施例１８はここに援用される。
別の本発明の好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、変異体コートタンパク質Ｑβまたは変異体または断片及び対応するＡ１タンパク質を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。更なる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、変異体コートタンパク質からを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、前記変異体コートタンパク質は、配列番号１６、１７、１８、１９及び２０及び対応するＡ１タンパク質の任意の一つから選択される。
更なるＲＮＡ−バクテリオファージ・コートタンパク質はバクテリア宿主の発現において自己集合することが示されている(Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、ＧＡ(Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996), Tars, K et al., J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及びｆｒ(Pushko P. et al., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993), Liljas, L et al. J Mol. Biol. 244:279-290,(1994))の生物学的及び生化学的特性が開示されている。複数のＲＮＡ−バクテリオファージの結晶構造が決定されている (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996))。このような情報を用いて、表面露出した残基は同定されることができ、したがって、一つ以上の反応性のアミノ酸残基が挿入または置換により挿入されることができるように、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質は修飾されることができる。ＲＮＡ−バクテリオファージに由来するＶＬＰの別の有利な点は、手頃なコストで大量の物質の産生を可能にするバクテリアにおける、高い発現生産量である。
ある好適な実施態様では、本発明の組成物は、少なくとも１の抗原、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、最も好ましくは正確に１の抗原を含み、該抗原はＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質であり、該ＩＬ-１分子は配列番号３６から配列番号１１６、配列番号１３０から配列番号１４０及び配列番号１６３から配列番号１６５のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記抗原は、(a) ヒト；(b) 霊長類；(c) 齧歯動物；(d) ウマ；(e) ヒツジ；(f) ネコ；(g) ウシ；(h) ブタ；(i) ウサギ；(j) イヌ；(k) マウス；及び、(l) ラットからなる群から選択される生物由来のＩＬ-１分子である。最も好ましくは、前記ＩＬ-１分子はヒト由来である。非常に好ましい実施態様では、ＩＬ-１分子はヒトＩＬ-１分子である。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子は、配列番号３６、配列番号４９、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６７から１１０のいずれか一つ、及び配列番号１３０から１４０のいずれか一つ及び配列番号１６５からなる群から選択される配列のいずれか一つに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はラット又はマウス、好ましくはマウス由来であり、該ＩＬ-１分子は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５３、配列番号５４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号１１１から１１６のいずれか一つ、配列番号１６３、及び配列番号１６４のいずれか一つに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１分子は、ＩＬ-１α分子、好ましくはＩＬ-１αタンパク質、ＩＬ-１α断片、ＩＬ-１α成熟断片、ＩＬ-１αペプチド又はＩＬ-１α変異タンパク質であり、該ＩＬ-１α分子は、配列番号３６から４８、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７から８８、及び配列番号１６５からなる群から選択される配列のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。ＩＬ-１α分子の特に好適な実施態様は、ヒトＩＬ-１α分子、好ましくはヒトＩＬ-１αタンパク質、ヒトＩＬ-１α断片又はヒトＩＬ-１α成熟断片であり、該ＩＬ-１α分子は、配列番号３６、配列番号６３、及び配列番号１６３のいずれか一つ、最も好ましくは配列番号６３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子は、ＩＬ-１β分子、好ましくはＩＬ-１βタンパク質、ＩＬ-１β断片、ＩＬ-１β成熟断片、ＩＬ-１βペプチド又はＩＬ-１β変異タンパク質であり、該ＩＬ-１β分子は、配列番号４９から６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号８９から１１６、配列番号１３０から配列番号１４０、配列番号１６４、及び配列番号１６５からなる群から選択される配列のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。ＩＬ-１β分子の特に好適な実施態様は、ヒトＩＬ-１β分子、好ましくはヒトＩＬ-１βタンパク質、ヒトＩＬ-１β断片又はヒトＩＬ-１β成熟断片であり、該ＩＬ-１β分子は、配列番号４９、配列番号６４、配列番号１３０から配列番号１４０及び配列番号１６５のいずれか一つ、最も好ましくは配列番号６４に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子は、ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片又は、好ましくはＩＬ-１成熟断片であり、該ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片又はＩＬ-１成熟断片は好ましくはＩＬ-１レセプターに結合可能であり、またさらにより好ましくは、加えて生物学的な活性を含む。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１タンパク質であり、該ＩＬ-１タンパク質は、配列番号３６から６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１タンパク質はＩＬ-１αタンパク質であり、該ＩＬ-１αタンパク質は、配列番号３６から４８からなる群から選択される配列のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。最も好ましくは、前記ＩＬ-１αタンパク質はヒトＩＬ-１αタンパク質であり、該ヒトＩＬ-１αタンパク質は、配列番号３６に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１タンパク質はＩＬ-１βタンパク質であり、該ＩＬ-１βタンパク質は、配列番号４９から６２からなる群から選択される配列のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。最も好ましくは、前記ＩＬ-１βタンパク質はヒトＩＬ-１βタンパク質であり、該ヒトＩＬ-１βタンパク質は、配列番号４９に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１断片、好ましくはＩＬ-１成熟断片であり、該ＩＬ-１断片又は該ＩＬ-１成熟断片は好ましくはマウス又はヒト、最も好ましくはヒト由来である。好ましくは前記ＩＬ-１断片又は前記ＩＬ-１成熟断片は、配列番号６３から配列番号６６、配列番号１３０、及び配列番号１６３から配列番号１６５のいずれか一つに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１成熟断片はＩＬ-１α成熟断片であり、該ＩＬ-１α成熟断片は好ましくは生物学的な活性を含み、さらに該ＩＬ-１α成熟断片は、配列番号６３又は配列番号６５、最も好ましくは配列番号６３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１成熟断片はＩＬ-１β成熟断片であり、該ＩＬ-１β成熟断片は好ましくは生物学的な活性を含み、さらに該ＩＬ-１β成熟断片は、配列番号６４、配列番号６６及び配列番号１３０のいずれか一、最も好ましくは配列番号６４に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１ペプチドであり、該ＩＬ-１ペプチドはマウス、ラット又はヒト、最も好ましくはヒト由来である。
好ましくは前記ＩＬ-１ペプチドは、配列番号６７から配列番号１１６のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１変異タンパク質であり、好ましくは該ＩＬ-１変異タンパク質は生物学的な活性を低減しているか、より好ましくは生物学的な活性を持たず、さらに該ＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１レセプターを結合することができる。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１変異タンパク質は１〜３、より好ましくは１〜２、最も好ましくはちょうど１のアミノ酸残基がＩＬ-１成熟断片のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１変異タンパク質は、野生型アミノ酸配列に由来した、少なくとも一つの、好ましくは一つの変異したアミノ酸配列を含み、前記野生型アミノ酸配列は、(1)配列番号６４の位置３から１１; (2)配列番号６４の位置４６から５６; (3)配列番号６４の位置８８から１０９;及び(4)配列番号６４の位置１４３から１５３から成る群から選択されるＩＬ-１βアミノ酸配列であるか、又は前記野生型アミノ酸配列は、ＩＬ-１αアミノ酸配列は、(5)配列番号６３の位置９から２０; (6)配列番号６３の位置５２から６２; (7)配列番号６３の位置９４から１１３;及び(8)配列番号６３の位置１４３から１５３から成る群から選択されるか、又は前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、それが由来した野生型アミノ酸配列と比較すると、１から４位置、好ましくは１、２又は３位置、より好ましくは１又は２位置のアミノ酸置換によって特徴付けられ、前記少なくとも一つの突然変異するアミノ酸配列は、それが由来した前記野生型アミノ酸配列の１から４の連続的なアミノ酸の欠失によって特徴づけられる。
更に好ましい実施態様において、前記ＩＬ-１変異タンパク質は、各々の前記ＩＬ-１βアミノ酸配列(1)から(4)に由来する多くても一つの変異したアミノ酸配列を含むか；又は前記ＩＬ-１変異タンパク質は、前記ＩＬ-１αアミノ酸配列(5)から(8)おのおのに由来する多くても一つの変異したアミノ酸配列から含む。
非常に好ましい実施態様において、前記ＩＬ-１変異タンパク質は正確に前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列の一つを含み、好ましくは前記正確に一つの変異したアミノ酸配列は野生型アミノ酸配列に由来し、前記野生型アミノ酸配列は配列番号６４の位置１４３から１５３または配列番号６３の位置１４３から１５３である。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸は、それが由来した前記野生型アミノ酸配列の１から３、好ましくは１から２の連続的アミノ酸の欠失によって特徴付けられる。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、それが由来した前記野生型アミノ酸配列の正確に一つのアミノ酸の欠失によって特徴付けられる。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列に由来し、前記野生型アミノ酸配列は配列番号６４の位置１４３から１５３または配列番号６３の位置１４３から１５３である。最も好ましくは、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、配列番号６４の位置１４３から１５３に由来する。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列に由来し、前記野生型アミノ酸配列は配列番号６４の位置４６から５６または配列番号６３の位置５２から６２であり、最も好ましくは、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、それが由来した前記野生型アミノ酸配列の１から４、好ましくは２から３の連続的アミノ酸の欠失によって特徴付けられる。非常に好ましい実施態様では、前記ＩＬ-１変異タンパク質はこのましくはポリペプチドからなり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１３７又は配列番号１３８である。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列に由来し、前記野生型アミノ酸配列は配列番号６４の位置８８から１０９または配列番号６３の位置９４から１１３であり、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、それが由来した前記野生型アミノ酸配列の１から４、好ましくは１から３、最も好ましくは１又は２の連続的アミノ酸の欠失によって特徴付けられる。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、それが由来した前記野生型アミノ酸配列と比較して、１又は２の位置の、好ましくは正確に１つの位置のアミノ酸の置換によって特徴付けられる。
更に好ましい実施態様において、前記アミノ酸配列は、配列番号６４の位置１４３から１５３又は配列番号６３の位置１４３から１５３であり、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、それが由来した前記野生型アミノ酸配列と比較して、１又は２の位置の、好ましくは正確に１つの位置のアミノ酸の置換によって特徴付けられ、更に好ましくは前記正確に一つの位置は配列番号６４の位置１４５又は配列番号６３の位置１４５であり、また更に好ましくは前記アミノ酸の置換はアスパラギン酸（Ｄ）の、リジン（Ｋ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン(Ｆ)、アスパラギン（Ｎ）及びアルギニン(Ｒ)からなる基から選択されるアミノ酸への変化である。
非常に好ましい実施態様では、前記アミノ酸の置換は、アスパラギン酸（Ｄ）のリジン（Ｋ）への変化である。
更に好ましい実施態様において、前記アミノ酸配列は、配列番号６４の位置１４３から１５３又は配列番号６３の位置１４３から１５３であり、前記少なくとも一つの変異したアミノ酸配列は、それが由来した前記野生型アミノ酸配列と比較して正確に１つの位置のアミノ酸の置換によって特徴付けられ、更に好ましくは前記正確に一つの位置は配列番号６４の位置１４６又は配列番号６３の位置１４６であり、また更に好ましくは前記アミノ酸の置換はフェニルアラニン(Ｆ)の、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）及びセリン（Ｓ）からなる基から選択されるアミノ酸への変化である。
更に好ましい実施態様において、前記ＩＬ-１変異タンパク質は、ＩＬ-１β変異タンパク質、好ましくはヒトＩＬ-１β変異タンパク質であり、最も好ましくは配列番号１３１から配列番号１４０から選択されたヒトＩＬ-１β変異タンパク質であり、最も好ましくは前記ＩＬ-１変異タンパク質は配列番号１３６である。
更に好ましい実施態様において、前記ＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１β変異タンパク質であり、好ましくは前記ＩＬ-１β変異タンパク質はポリペプチドを含むか又は好ましくはそれから成り、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６４のアミノ酸配列とは、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、１から４、１から３又は１から２のアミノ酸残基が異なる。最も好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号６４のアミノ酸配列とは正確に一つアミノ酸残基が異なる。非常に好ましい実施態様において、前記ＩＬ-１β変異タンパク質は、ポリペプチドから含むか、又は好ましくはそれから成り、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１３１から配列番号１４０及び配列番号２０５から配列番号２０９から選択され、最も好ましくは、前記ＩＬ-１β変異タンパク質はポリペプチドを含むか、又は好ましくはそれから成り、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１３６である。
非常に好ましい実施態様では、前記ＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１β変異タンパク質は、配列番号１３６を含むか、又はそれから成る。
更なる好ましい実施態様において、前記ＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１α変異タンパク質であり、、好ましくは前記ＩＬ-１α変異タンパク質はポリペプチドを含むか又は好ましくはそれからなり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号６３のアミノ酸配列とは、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、１から４、１から３又は１から２アミノ酸残基で異なる。最も好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号６３のアミノ酸配列から、正確に１最も好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号６４のアミノ酸配列とは正確に一つアミノ酸残基が異なる。非常に好ましい実施態様において、前記ＩＬ-１α変異タンパク質は、ポリペプチドから含むか、又は好ましくはそれから成り、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２１０から配列番号２１８から選択され、最も好ましくは、前記ＩＬ-１α変異タンパク質はポリペプチドを含むか、又は好ましくはそれから成り、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２１０である。
非常に好ましい実施態様において、前記ＩＬ-１分子、好ましくは前記ＩＬ-１α変異タンパク質は、配列番号２０１を含むか、または好ましくはそれからなる。
更に、本発明の組成物を産生する方法を開示し、該方法は、(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するＶＬＰを提供すること；(b)ＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、好ましくはＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチドまたはＩＬ-１変異タンパク質を含むか又はそれからなる、少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を提供すること；及び(c)前記組成物を産生するために、前記ＶＬＰと前記少なくとも一つの抗原を有する少なくとも一つの第２の付着部位を結合させ、前記少なくとも一つの抗原と前記ＶＬＰが第１のおよび第２の付着部位で連結されることを含む、方法を提供する。好ましい実施形態において、前記ＩＬ-１分子、前記ＩＬ-１タンパク質、前記ＩＬ-１断片、好ましくはＩＬ-１成熟断片、前記ＩＬ-１ペプチド又は前記ＩＬ-１変異タンパク質を含んで成る少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原の提供は、発現の方法により、好ましくは細菌系、好ましくは大腸菌における発現の方法による。通常、精製タグ、例えばＨｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦｃタグまたはＨＡタグは、精製プロセスを容易にするために加えられる。別のアプローチでは、特に５０アミノ酸より短いＩＬ-１ペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質は化学的に合成される。
本発明の一実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位を有するＶＬＰは、少なくとも一つのペプチド結合を経て少なくとも一つの第２の付着部位を有する抗原に結合される。ＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１変異タンパク質をコードする遺伝子は、内部に、または好ましくはＶＬＰのコートタンパク質をコードする遺伝子のＮ−またはＣ−末端にインフレームでライゲーションされる。また、融合は、ＩＬ-１分子の配列を、コートタンパク質配列の部分が欠失したコートタンパク質の変異体に挿入することによって遂行されることができる。このようなコンストラクトはトランケーション変異体と呼ぶ。トランケーション変異体は、コートタンパク質の配列の一部のＮ−またはＣ末端欠失、又は内部欠失を有することができる。例えば特異的なＶＬＰＨＢｃＡｇは、アミノ酸７９−８０は、外来エピトープに置き換えられる。融合タンパク質は、好ましくは発現に応じてＶＬＰへと組み立てられる能力を保持し、それは電子顕微鏡によって調べられることができる。
隣接するアミノ酸残基は、コートタンパク質と外来エピトープとの間の距離を増大させるために、付加されてもよい。グリシンとセリン残基は、隣接配列において使用される特に好ましいアミノ酸残基である。このような隣接配列は、融合コンスストラクトに追加的な柔軟性を与え、ＶＬＰサブユニットの配列に融合した外来配列を不安定にする効果の可能性を減少し、従って外来エピトープの存在によるアセンブリの干渉を減少させる。
他の実施態様において、ＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１変異タンパク質は多くの他のウイルスコートタンパク質に、例えばＱβのＡ１タンパク質の切断型のＣ末端に融合されてもよく(Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39:9-15 (1996))。あるいはＣＰ伸長の位置７２と７３の間に挿入されてもよい。別の例として、ＩＬ-１分子は、ｆｒ ＣＰのアミノ酸２と３との間に挿入されてもよい(Pushko P. et al., Prot. 883-891 (1993))。さらにまた、ＩＬ-１分子は、ＲＮＡ−バクテリオファージＭＳ−２（ＷＯ９２／１３０８１）のコートタンパク質のＮ末端基突出したβヘアピンに融合されてもよい。あるいは、ＩＬ-１分子は、パピローマウイルスのコートタンパク質に、ウシパピローマウイルス・タイプ１のコートタンパク質の主要コートタンパク質Ｌ１（ＢＰＶ−１）に融合させることができる(Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO00/23955)。また、ＩＬ-１を有するＢＰＶ−１Ｌ１のアミノ酸１３０−１３６の置換も、本発明の実施態様である。ウイルスのコートタンパク質、その変異体又は断片に、ＩＬ-１分子を融合する更なる実施形態は、ＷＯ２００４／００９１２４の６２頁２０行目から６８頁１７行目に開示されており、引用により本願明細書に組み込まれる。
米国特許第5698424号には、カプシドを形成可能なバクテリオファージＭＳ-２の修飾コートタンパク質が記載されており、ここでコートタンパク質はＮ-末端ヘアピン領域にシステイン残基を挿入し、非システインアミノ酸残基により、Ｎ-末端ヘアピン領域の外側に位置する各システイン残基を置換することにより修飾される。挿入されたシステイン残基は、所望される分子種に直接結合し、エピトープ又は抗原性タンパク質等として提示される。
しかしながら、カプシドに露出した遊離のシステイン残基が存在すると、ジスルフィド架橋の形成により、カプシドのオリゴマー化につながることに注目すべきである。さらに、ジスルフィド結合によるカプシドと抗原性タンパク質との結合は、特にスルフヒドリル-部分含有分子に対して不安定であり、さらに、チオエーテル付着よりも血清中で安定性が低下する(Martin FJ. 及び Papahadjopoulos D.(1982) Irreversible Coupling of Immunoglobulin Fragments to Preformed Vesicles. J. Biol. Chem. 257：286-288)。
よって、さらに非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一つの抗原との会合又は結合は含むか又はそれからなる、ＩＬ-１分子はジスルフィド結合を含まない。さらに好ましくは、少なくとも一つの第２の付着は、スルフヒドリル基を含むか、又は該基である。さらにまた本発明の非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一つの抗原との会合又は結合は、硫黄- 硫黄結合を含まない。更に好ましくは、少なくとも一つの第２の付着はスルフヒドリル基を含むか、又は該基である。さらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一つの第１の付着部位は、スルフヒドリル基でないか、又は該基を含まない。またさらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一つの第１の付着部位は、システインのスルフヒドリル基ではないか、又は該基を含まない。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第１の付着はアミノ基を含み、前記第２の付着はスルフヒドリル基を含む。
別の好ましい実施態様では、前記第１の付着はアミノ基であり、前記第２の付着部位はスルフヒドリル基である。なお更に好ましい実施態様において、前記第１の付着はリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基である。
更に好ましい実施態様では、前記第２の付着部位のうちの1つだけが、第１の付着部位に、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して会合し、それにより前記コア粒子への、好ましくは前記ウイルス様粒子への抗原の単一且つ均一型結合となり、前記第１の付着部位が会合する前記ただ一つの第２の付着部位はスルフヒドリル基であり、前記抗原及び前記コア粒子、好ましくは前記ウイルス様粒子が前記会合を介して相互作用して規則正しい反復性抗原アレイを形成し、更に好ましくは前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基である。
更は好ましい実施態様において、前記ウイルス様粒子は、ウイルスの、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰ組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、本質的にそれから成るか、あるいはそれから成り、前記少なくとも一つの抗原は前記組換えコートタンパク質、その変異体又は断片のＮ-又はＣ-末端に融合する。
更に好ましい実施態様において、前記ウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、好ましくは前記ＲＮＡバクテリオファージは(a)バクテリオファージＡＰ２０５；(b)バクテリオファージｆｒ；及び(c)バクテリオファージＧＡから成る群から選択され、前記少なくとも一つの抗原は、前記組換えコートタンパク質、その変異体又は断片のＮ-末端又はＣ-末端、好ましくはＣ-末端に融合され、更に好ましくは前記少なくとも一つの抗原はポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１３６又は配列番号２１０、好ましくは配列番号１３６である。
さらに好適な実施態様では、ＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１タンパク質、より好ましくはＩＬ-１成熟断片、さらにより好ましくは配列番号６３から配列番号６６、最も好ましくは配列番号６３又は配列番号６４のアミノ酸配列を含むかこれからなるＩＬ-１成熟断片は、ＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体又はその断片のＮ-末端又はＣ-末端のいずれか、好ましくはＣ-末端に融合する。
非常に好ましい実施態様において、前記ウイルス様粒子は、バクテリオファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、本質的にそれから成るか、あるいはそれからなり、前記少なくとも一つの抗原は、組換えコートタンパク質、その変異体又は断片のＣ末端に融合し、前記少なくとも一つの抗原はポリペプチドを含むか、好ましくはそれから成り、前記ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１３６又は配列番号２１０であり、好ましくは配列番号１３６である。
抗原とのバクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質の融合タンパク質を含むＶＬＰは、通常、出典明記によって本明細書に援用される国際公報第２００６／０３２６７４Ａ１号に開示される。ある更なる好適な実施態様では、融合タンパク質はさらにリンカーを含み、該リンカーはＡＰ２０５及びＩＬ-１分子のコートタンパク質、その断片ないしはその変異体に融合する。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子は、前記リンカーを介してＡＰ２０５の前記コートタンパク質、その断片ないしはその変異体のＣ末端に融合する。
ＩＬ-１分子、特に少なくとも１００から３００までのアミノ酸、典型的及び好ましくはおよそ１４０〜１６０のアミノ酸、最も好ましくはおよそ１５５のアミノ酸を含むＩＬ-１タンパク質及びＩＬ-１断片は、バクテリオファージのコートタンパク質、好ましくはＡＰ２０５のコートタンパク質に融合しながら、コートタンパク質のＶＬＰへの自己組織化の機能を維持することができる。
ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片及びＩＬ-１成熟断片の大きさが大きく、また立体的な理由から、ＩＬ-１分子に融合したＡＰ２０５コートタンパク質並びにｗｔコートタンパク質サブユニットを含むモザイクＶＬＰを産生する発現システムを構築した。このシステムにおいて、停止コドンを抑制するとＡＰ２０５-ＩＬ-１コートタンパク質融合が生じる一方で、適切な終止によりｗｔ ＡＰ２０５コートタンパク質が生じる。両タンパク質は細胞内で同時に生産されて、モザイクＶＬＰ内に組み立てられる。このようなシステムの利点は、巨大タンパク質がＶＬＰの組み立てを干渉することなく提示されるということである。モザイクＶＬＰへのＡＰ２０５-ＩＬ-１融合タンパク質の取込みのレベルは抑制のレベルに依存するので、ＡＰ２０５-ＩＬ-１は、サプレッサーｔＲＮＡを過剰発現するプラスミドを既に含有している大腸菌細胞において発現される。オパール抑制に関して、オパール停止コドンを認識してＴｒｐを導入するサプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミドｐＩＳＭ３００１(Smiley, B.K., Minion, F.C. (1993) Enhanced readthrough of opal (UGA) stop codons and production of Mycoplasma pneumoniae P1 epitopes in Escherichia coli. Gene 134, 33-40)が用いられる。アンバー終結の抑制はプラスミドｐＩＳＭ５７９を用いて増加してもよく、アンバー停止コドンを認識して、同様にＴｒｐを導入するサプレッサーｔＲＮＡを過剰発現させる。プラスミドｐＩＳＭ５７９は、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲIによりｔｒｐＴ１７６遺伝子をｐＩＳＭ３００１から切り出し、アンバーｔＲＮＡサプレッサー遺伝子を含むプラスミドｐＭＹ５７９(Michael Yarusから贈与)のＥｃｏＲI断片によって置換することによって生成された。このｔＲＮＡサプレッサー遺伝子は、ｔｒｐＴ１７５の変異体であり (Raftery LA. Et al. (1984) J. Bacteriol. 158:849-859)、Ｇ３３、Ａ２４及びＴ３５の３つの位置がｔｒｐＴと異なる。大腸菌ＪＭ１０９などのアンバー抑制(ｓｕｐＥ又はｇｌｎＶ)による大腸菌株におけるＡＰ２０５-インターロイキン-１α融合タンパク質の発現は、アンバー停止コドンに導入されたＴｒｐによるＡＰ２０５-ＩＬ-１融合タンパク質に加えて、アンバー停止コドンに導入されたＴｒｐでなくＧｌｎによるＡＰ２０５-ＩＬ-１融合タンパク質を一部生成しうる。したがって、停止コドンで翻訳されるアミノ酸の同定は、過剰発現するサプレッサーｔＲＮＡと株の表現型の組合せに依存しうる。Miller JH等 ((1983) J. Mol. 59-71)によって記載され、当分野で周知であるように、抑制の効率は状況に依存する。特に、停止コドンのコドン３'と停止コドンから初めの塩基３'が特に重要である。例えば、停止コドンの後のプリン塩基は、通常は十分に抑制される。
ゆえに、好適な実施態様では、前記ＶＬＰはモザイクＶＬＰであり、該モザイクＶＬＰは少なくとも１、好ましくは１の第１のポリペプチドと、少なくとも１、好ましくは１の第２のポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、該第１のポリペプチドは組み換えカプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片であり、該第２のポリペプチドは、好ましくは該第１のポリペプチドの組み換えカプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片とＩＬ-１分子の遺伝的融合生成物である。更なる好適な実施態様では、前記第１のポリペプチドは、バクテリオファージＡＰ２０５の組み換えカプシドタンパク質又はその変異体ないしはその断片である。更なる好適な実施態様では、前記第１のポリペプチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３から選択される。非常に好適な実施態様では、前記第１のポリペプチドは配列番号２１である。抗原を含むバクテリオファージＡＰ２０５のモザイクＶＬＰは、通常、国際公報第２００６／０３２６７４Ａ１号の、特に１０７段落に開示される。更なる好適な実施態様では、前記第２のポリペプチドは、好ましくは前記第１のポリペプチドの組み換えカプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片とＩＬ-１分子の遺伝的融合生成物であり、前記ＩＬ-１分子は好ましくはアミノ酸リンカーにより該組み換えカプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片のＣ末端に融合する。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子は、１００から３００のアミノ酸、典型的及び好ましくはおよそ１４０〜１６０のアミノ酸、最も好ましくはおよそ１５５のアミノ酸を含むか、好ましくはこれからなる。非常に好適な実施態様では、前記モザイクＶＬＰ中の前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドのモル比は、１０:１から５：１、好ましくは８:１から６:１、最も好ましくはおよそ７:１である。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、少なくとも一つの共有結合を介して少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原、すなわちＩＬ-１分子に結合した少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子を含有するか、あるいは本質的にこれらからなるものであり、好ましくは該共有結合は非ペプチド結合である。本発明の好適な実施態様では、第１の付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそのものである。本発明の他の好適な実施態様では、第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそのものである。
本発明の非常に好適な実施態様では、少なくとも一つの第１の付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基であり、少なくとも一つの第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基である。
本発明の好適な一実施形態において、抗原は、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、化学的架橋結合を経由してＶＬＰに連結される。好ましい実施態様において、ヘテロ二官能性架橋剤は、好適な第１の付着部位、好ましくはアミノ基、より好ましくはＶＬＰのリジン残基のアミノ基と反応できる官能基と、好適な第２の付着部位、すなわちスルフヒドリル基、好ましくはＩＬ-１分子に本来からあるか又は人工的に付加されたシステイン残基のスルフヒドリル基と反応することができ、場合により還元による反応に利用される更なる官能基を含む。複数のヘテロ二官能性架橋剤が当該分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤であるＳＭＰＨ(Pierce)、スルホ-ＭＢＳ、スルホ -ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えばPierce Chemical Companyから入手可能な他の架橋剤が含まれ、アミノ基に対して反応可能な一官能基とスルフヒドリル基に対して反応可能な一官能基を有する。上述した全ての架橋剤により、アミノ基との反応後にアミド結合が、またスルフヒドリル基とチオエーテル結合が形成される。最も好ましくは、前記ヘテロ二官能性架橋剤は、スクシンイミジル-6-［β-マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）である。本発明の実施に適した他のクラスの架橋剤は、カップリング時にＩＬ-１分子とＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することにより特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰ及びスルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ(Pierce)が含まれる。
好ましい実施態様では、本発明の組成物はリンカーを更に含む。本発明の更に好ましい実施態様では、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原はリンカーを含み、前記リンカーは一つのペプチド結合を介して前記抗原に会合し、好ましくは前記リンカーはシステインである。ＩＬ-１分子への第２の付着部位のエンジニアリングはリンカーの会合によって達成され、好ましくは本発明の開示に従って第２の付着部位として適切な少なくとも一つのアミノ酸を含む。従って、本発明の好ましい実施態様において、リンカーは少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも１つの、典型的には１つのペプチド結合をにより、ＩＬ-１分子に会合する。好ましくは、リンカーは第２の付着部位を含むか、又はそれから成る。別の好ましい実施形態では、リンカーは、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好ましい実施形態として、アミノ酸リンカーは、システイン残基である。
リンカーの選択は、ＩＬ-１分子の性質、その生化学的特性、例えばｐＩ、電荷分布、及びグリコシル化に依存するであろう。一般的に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好まれる。本発明のさらに好ましい実施態様では、リンカーはアミノ酸からなり、さらに好ましくは、リンカーは最大で２５、好ましくは最大で２０、より好ましくは最大で１５のアミノ酸からなる。本発明のさらに好適な実施態様では、アミノ酸リンカーは１〜１０のアミノ酸を含有する。リンカーの好適な実施態様は、(a) CGG(配列番号１７１)；(b) Ｎ末端γ１-リンカー、好ましくはCGDKTHTSPP(配列番号１７２)；(c) Ｎ末端γ３-リンカー、好ましくはCGGPKPSTPPGSSGGAP(配列番号１７３)；(d) Ｉｇヒンジ領域；(e) Ｎ末端グリシンリンカー、好ましくはGCGGGG(配列番号１７４)；(f) ｎ＝０〜１２及びｋ＝０〜５の(Ｇ)ｋＣ(Ｇ)ｎ(配列番号１７５)；(g) １つの更なるシステインを有するＮ末端グリシン-セリンリンカー、好ましくは(GGGGS)ｎ、ｎ＝１〜３(配列番号１７６)；(h) ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２の(Ｇ)ｋＣ(Ｇ)ｍ(Ｓ)ｌ(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号１７７)；(i) GGC(配列番号１７８)；(k) GGC-NH2(配列番号１７９)；(l) Ｃ末端γ１-リンカー、好ましくはDKTHTSPPCG(配列番号１８０)；(m) Ｃ末端γ３-リンカー、好ましくはPKPSTPPGSSGGAPGGCG(配列番号１８１)；(n) Ｃ末端グリシンリンカー、好ましくはGGGGCG(配列番号１８２)；(o) ｎ＝０〜１２及びｋ＝０〜５の(Ｇ)ｎＣ(Ｇ)ｋ(配列番号１８３)；(p) １つの更なるシステインを有するＣ末端グリシン-セリンリンカー、好ましくは(SGGGG)ｎ、ｎ＝１〜３(配列番号１８４)；(q) ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２及びｏ＝０〜８の(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k(配列番号１８５)からなる群から選択される。さらに好適な実施態様では、リンカーはＩＬ-１分子のＮ-末端に融合している。本発明の他の好適な実施態様では、リンカーはＩＬ-１分子のＣ-末端に融合している。
本発明に係る好ましいリンカーは、第２の付着部位としてシステイン残基をさらに含むグリシンリンカー(Ｇ)ｎ、例えばＮ-末端グリシンリンカー(ＧＣＧＧＧＧ、配列番号１７４)及びＣ-末端グリシンリンカー(ＧＧＧＧＣＧ、配列番号１８２)である。さらに好ましい実施態様は、Ｃ-末端グリシン-リジンリンカー(ＧＧＫＫＧＣ、配列番号１８６)及びＮ-末端グリシン-リジンリンカー(ＣＧＫＫＧＧ、配列番号１８７)、ペプチドのＣ-末端のＧＧＣＧ(配列番号１８８)、ＧＧＣ(配列番号１７８)又はＧＧＣ-ＮＨ２(配列番号１７９、「ＮＨ２」はアミド化を表す)リンカー、又はそのＮ-末端のＣＧＧ(配列番号１７１)のリンカーである。一般的に、グリシン残基は、第２の付着部位として使用されるシステインと大きなアミノ酸との間に挿入されて、カップリング反応中での、より大きなアミノ酸の潜在的な立体障害が回避される。更に好ましい実施形態では、前記リンカーはＨｉｓ-ｔａｇを含む。非常に好ましいリンカーは、ＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号２０１）又はＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧ （配列番号２１９）であり、好ましくはリンカーはＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧ (配列番号２１９)である。
上述の好適な方法によるヘテロ二官能性架橋剤を使用したＶＬＰへの抗原の結合は、配向性の様式でＶＬＰへＩＬ-１分子を結合することを可能にする。抗原をＶＬＰに連結する他の方法は、カルボジイミドＥＤＣ及びＮＨＳを使用して、ＩＬ-１分子が、ＶＬＰに架橋結合する方法を含む。また、ＩＬ-１分子は、最初に、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰまたはイミノチオランとの反応によってチオール化されてもよい。次に、抗原は、必要であれば脱保護の後で、以下の通りにＶＬＰに結合することができる。過剰なチオール化試薬の分離後、抗原はＶＬＰ（システイン反応の部分を含むヘテロ二官能性架橋剤によって前もって活性化されたもの）と反応させ、その結果、システイン残基に反応性である少なくとも１つ又は複数の官能基であって、そこに上述のようにチオール化された抗原が反応することができる官能基を提示する。場合により、低量の還元剤は、反応混合物に含まれる。更なる方法において、抗原は、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（ピアス）のようなホモ二官能性架橋剤又はＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基に反応性である官能基を有する他の公知のホモ二官能性架橋剤を使用してＶＬＰに取り付けられる。
本発明の他の実施態様において、組成物は、化学的相互作用を経て、抗原に連結されたウイルス様粒子を含むかまたは本質的にそれから成り、これらの相互作用のうちの少なくとも１つは共有結合でない。
抗原へのＶＬＰの結合は、ＶＬＰをビオチン化すること、及びストレプトアビジン−融合タンパク質としてＩＬ-１分子を発現することによって遂行されることができる。
立体配置的に許容可能であるならば、１または複数の抗原分子（すなわちＩＬ-１分子）は、ＶＬＰの１つのサブユニット、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質に、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのコートタンパク質の露出したリジン残基を介して、取り付けられることができる。ＲＮＡ−バクテリオファージ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰの特殊な特徴は、したがって、サブユニットにつき複数の抗原を結合させるという可能性である。これは、密度の高い抗原アレイの生成を可能にする。
本発明の非常に好適な実施態様において、少なくとも一つの第２の付着部位を有する抗原は、ＩＬ-１分子のＮ末端基かＣ末端に付加されたシステイン残基を介して又はＩＬ-１分子の天然システイン残基を介して、ＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのコートタンパク質の、特にＱβのコートタンパク質のリジン残基に連結される。
上記の通り、４つのリジン残基は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰの表面に露出する。典型的に及び好ましくは、これらの残基は、架橋剤分子との反応により誘導体化される。露出したリジン残基の全てが抗原に接続することができるというわけでない例として、架橋剤と反応したリジン残基は、誘導体化工程の後、ε−アミノ基に取り付けられた架橋剤分子をあとに残す。これは１または複数の正の電荷の消失につながり、それはＶＬＰの溶解性と安定性に有害である可能性がある。開示されたＱβコートタンパク質変異体の場合のように、いくつかのリジン残基をアルギニンと交換することによって、アルギニン残基が好適な架橋剤と反応しないことにより、正電荷の過剰な消失を妨げる。さらに、より少ない部位が抗原と反応可能である場合に、アルギニン残基によるリジン残基の置換は、より多くの形成された抗原アレイを導くことができる。
したがって、露出したリジン残基は、以下のＱβコートタンパク質変異体のアルギニンと置き換えられた：Ｑβ−２４０（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号１６）、Ｑβ−２５０（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号１８）、Ｑβ−２５９（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ，Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２０）及びＱβ−２５１；（Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ、配列番号１９）。さらなる実施態様において、抗原のより高い密度のアレイすら得ることに適している１つの追加のリジン残基Ｑβ−２４３を有するＲＮＡ−バクテリオファージＱβの変異体コートタンパク質を開示する（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号１７）。
好ましい実施形態において、ＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰは、宿主によって組換えにより生産され、前記ＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。さらに好ましい実施形態において、組成物は、ＶＬＰに結合されているか、パッケージ化されているか、封入されている少なくとも１つのポリアニオン性巨大分子を含む。更に非常に好ましい実施態様において、前記ポリアニオン性巨大分子は、ポリグルタミン酸および／またはポリアスパラギン酸である。
別の好ましい実施形態において、組成物は、ＶＬＰに結合されているか、好ましくはパッケージ化されているか、封入されている少なくとも１つの免疫賦活性物質を含む。なお更なる好ましい実施態様において、免疫賦活性物質は、核酸、好ましくはＤＮＡ、最も好ましくは非メチル化オリゴヌクレオチドを含む。
この記載において、本願明細書で使用される「本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を含まない」なる用語は、ＶＬＰにより含まれる宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量を指し、典型的に及び好ましくはＶＬＰの１ｍｇにつき、３０μｇ未満、好ましくは２０μｇ未満、より好ましくは１０μｇ未満、更により好ましくは８μｇ未満であり、更により好ましくは６μｇ、更に好ましくは４μｇ未満であり、最も好ましくは２μｇ未満である。前述の記載において使われているように、宿主はＶＬＰが組換えにより産生される宿主を指す。ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を決定する従来法は、当業者に知られている。本発明に係る、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を決定する典型的及び好適な方法は、ＷＯ２００６／０３７７８７Ａ２の実施例１７に記載されている。同一、類似または相似の条件が、典型的に及び好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰを含む本発明の組成物のために、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量の測定のために使われる。最終的に必要とされる条件の変更は、当業者の知識の範囲内である。決定される量の数値は、典型的に及び好ましくは、示された値の±１０％の偏差、好ましくは±５％の偏差を有する値を含むものとして理解されるべきである。
宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸：「宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸」なる用語は、もともと宿主によって合成されたＲＮＡまたは好ましくは核酸を指す。しかしながら、ＲＮＡ、好ましくは核酸は、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を減らすか又は取り除く手順において、化学的および／または物理的変化を被る可能性があり、典型的に及び好ましくは本発明の方法により、例えば、ＲＮＡ、好ましくは核酸のサイズが短く成る可能性やその二次構造が変えられる可能性がある。宿主ＲＮＡまたは核酸なる用語はこれらの分解生成物を含む。しかしながら、当該結果として生じたＲＮＡ又は核酸でさえも、宿主ＲＮＡ又は宿主核酸として考慮される。
ＲＮＡの量を決定するための方法及びＶＬＰによって包含されるＲＮＡの量を減少する方法は、同出願人により２００４年１０月５日に出願した米国仮出願に開示されており、その出願全体は出典明記によって本明細書中に援用される。ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を少なくするか、又は除去することにより、ＩＬ-１に対して特異的な強い抗体応答を維持して、炎症性Ｔ細胞応答及び障害性Ｔ細胞応答などの望ましくないＴ細胞応答や、発熱などの他の望ましくない副作用を最小限にするか、又は低減する。
ある好適な実施態様では、本発明は、本発明の組成物と本発明のＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰの調製方法であって、該ＶＬＰが宿主によって組換えにより産生され、該ＶＬＰが本質的に宿主のＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠いているものであり、(a) 少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)を宿主によって組換えにより産生する工程、このときの該ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又はその断片を含むものである；(b) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又はその断片へのウイルス様粒子を分解させる工程；(c) 該コートタンパク質、その変異体又ははその断片を精製する工程；(d) 精製した該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又はその断片をウイルス様粒子に再構築させる工程、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである；そして(e) 少なくとも１の第２の付着部位を有する少なくとも１の本発明の抗原を工程(d)より得た該ＶＬＰに結合させる工程を含む方法を提供する。更なる好適な実施態様では、前記精製されたコートタンパク質、その変異体又はその断片の再構築は、少なくとも１のポリアニオン巨大分子の存在下で生じる。
一態様では、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防するためのワクチンであって、好ましくは有効量の本発明の組成物を含むワクチンを提供する。したがって、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防するためのワクチンであって、好ましくは有効量の（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含み、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ-１分子を含むか、又はそれから成り、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と第２の付着部位を介して結合される、ワクチンを提供する。
本発明の組成物の有効量は、治療された患者、好ましくはヒトにおいて、免疫応答を誘導することができる量であり、好ましくは糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療又は予防効果に結果としてなる量である。
好ましい実施形態において、前記ワクチンは、(i)好ましくは有効量の第１の組成物であって、前記第１の組成物に含まれるＩＬ-１分子はＩＬ-１β分子、好ましくは配列番号１３６又は配列番号１６５である組成物である、第１の組成物；及び(ii)好ましくは有効量の第２の組成物であって、前記第２の組成物に含まれるＩＬ-１分子はＩＬ-１α分子、好ましくは配列番号２０３又は配列番号２１０である組成物である、第２の組成物を含む。
好適な一実施態様では、ワクチンに含まれる組成物中のＶＬＰに結合したＩＬ-１分子は、動物、好ましくは哺乳動物又はヒト起源のものでもよい。好適な実施態様では、本発明のＩＬ-１はヒト、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ又はウマのものである。
一実施態様では、ワクチンはさらに少なくとも一つのアジュバントを含む。
本発明の有利な特徴は、アジュバントを含まない場合でさえ、組成物の免疫原性が高いことである。そのため、好ましい実施態様では、ワクチン組成物はアジュバントを欠く。さらにアジュバントの欠如は、自己抗原に対するワクチン接種上の安全上の問題を呈する、望まない炎症性Ｔ細胞反応の発生を最小化する。よって、本発明のワクチンの患者への投与は、好ましくはワクチンの投与前、投与と同時、又は投与後に同じ患者に少なくとも一つのアジュバントを投与することなく、実施されるであろう。
しかしながら、アジュバントが投与される場合、少なくとも一つのアジュバント投与は本発明の組成物又はワクチンのアジュバントの投与前、投与と同時、又は投与後に実施される。
本発明の本発明の組成物及び／又はワクチンを個体に投与するとき、それらは、塩類、緩衝液、アジュバント又はコンジュゲートの有効性を改善するために望ましい他の物質を含む形態としてであってよい。ワクチン又は医薬組成物を調製する際の使用に適した物質の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Osol A編、Mack Publishing Co.(1990))などの多数の情報源に示されている。これは、滅菌水溶液（例えば、生理食塩水）又は非水溶液及び懸濁液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体又は密封包帯を使用して、皮膚の浸透性を高め、抗原吸着を増大させることができる。
本発明のワクチンは、その投与が受容個体によって許容されることができる場合、「薬学的に許容可能である」と言われている。更に、本発明のワクチンは、「治療上の有効量」（すなわち所望の生理作用を産生する量）において投与される。免疫応答の性質及び種類は、本明細書の開示の限定要因ではない。本発明のワクチンは、ＩＬ-１と結合し、それによりその濃度を減少させ、及び／又はその生理学的又は病理学的の働きを妨げる抗体を誘導するが、この機序の説明は本発明の制限を意図するものではない。
従って、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防するための医薬組成物であって、(1)(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と(b)少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原とを含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原は、ＩＬ-１分子を含むか又はそれから成り、(a)と(b)とは前記少なくとも一つの第１の及び第２の付着部位を介して結合する、組成物；及び(2)薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。
また、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防するための医薬組成物であって、(1)(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と(b)少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原とを含むワクチンであって、前記少なくとも一つの抗原は、ＩＬ-１分子を含むか又はそれから成り、(a)と(b)とは前記少なくとも一つの第１の及び第２の付着部位を介して結合する、ワクチン；及び(2)薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。
更に本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防する方法であって、前記方法は、本発明の組成物、ワクチンまたは医薬組成物を、動物、好ましくはヒトに投与することを含む方法を提供する。更に、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防する方法であって、(i)好ましくは有効量の、第１の組成物であって、第１の組成物に含まれるＩＬ-１分子は、ＩＬ-１β分子、好ましくは配列番号１３６又は配列番号１６５である、本発明の組成物である、第１の組成物；及び(ii)好ましくは有効量の、第２の組成物であって、第１の組成物に含まれるＩＬ-１分子は、ＩＬ-１α分子、好ましくは配列番号２０３又は配列番号２１０である、本発明の組成物である、第２の組成物を、動物に、好ましくはヒトに投与することを含む方法を提供する。
従って、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防する方法であって、(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と(b)少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原とを含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原は、ＩＬ-１分子を含むか又はそれから成り、(a)と(b)とは前記少なくとも一つの第１の及び第２の付着部位を介して結合する、組成物を、動物に、好ましくはヒトに投与することを含む方法を提供する。
更に、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防する方法であって、(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と(b)少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原とを含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原は、ＩＬ-１分子を含むか又はそれから成り、(a)と(b)とは前記少なくとも一つの第１の及び第２の付着部位を介して結合する、組成物を含むワクチンを、動物に、好ましくはヒトに投与することを含む方法を提供する。
更に、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防する方法であって、(1)(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と(b)少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原とを含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原は、ＩＬ-１分子を含むか又はそれから成り、(a)と(b)とは前記少なくとも一つの第１の及び第２の付着部位を介して結合する組成物と(2)薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、動物に、好ましくはヒトに投与することを含む方法を提供する。
更に、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防する方法であって、(1)(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と(b)少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原とを含むワクチンであって、前記少なくとも一つの抗原は、ＩＬ-１分子を含むか又はそれから成り、(a)と(b)とは前記少なくとも一つの第１の及び第２の付着部位を介して結合するワクチンと(2)薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、動物に、好ましくはヒトに投与することを含む方法を提供する。
本発明の方法に関して、前記組成物、前記ワクチン及び／又は前記医薬組成物は、前記動物、好ましくは前記ヒトに、免疫学的有用量で投与される。
好ましい実施態様において、前記動物は哺乳動物であり、好ましくはネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ラット、マウスから選択され、最も好ましくはヒトである。
ある実施態様において、ワクチン／医薬組成物は、前記動物に、好ましくはヒトに、注射、注入、吸入、経口投与又は他の適切な物理学的方法によって投与されうる。好ましい実施態様において、ワクチン／医薬組成物は、前記動物に、好ましくはヒトに、筋肉内、静脈内、粘膜経由、経皮、鼻腔内、腹膜内、皮下、又はリンパ節に直接投与されてもよい。
本発明の更なる態様は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防するための組成物の使用である。より詳細には、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防するための組成物の使用であって、(1)(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と(b)少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原とを含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原は、ＩＬ-１分子を含むか、それからなるり、(a)と(b)とは前記少なくとも一つの第１の及び第２の付着部位を介して結合する、組成物の使用を提供する。
本発明の更なる態様は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防するための組成物、ワクチン及び／又は医薬組成物の使用である。より詳細には、本発明は、糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療、改善および／または予防するための組成物、ワクチン及び／又は医薬組成物の使用であって、(1)(a)少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）と(b)少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原とを含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原は、ＩＬ-１分子を含むか、それからなるり、(a)と(b)とは前記少なくとも一つの第１の及び第２の付着部位を介して結合する、組成物、ワクチン及び／又は医薬組成物の使用を提供する。
本明細書に記載の全ての技術的特徴及び実施態様、特に本発明の組成物について記載されているものは、本発明の全ての態様、特に任意の可能な組合せの又は単独のワクチン、医薬組成物、方法及び使用に適用されてもよい。これに関連して、以下の実施態様の前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原が特に好適であることを、明確に強調する。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、(i)配列番号１６５、及び配列番号１３１から１４０の何れか一つから選択されるＩＬ-１β分子と(ii)第２の付着部位を含むリンカーであって、ＧＧＣ（配列番号１７８）またはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか、好ましくはそれからなるリンカーとを含むか、好ましくはそれらから成る。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、(i)配列番号１６５又は配列番号１３６、好ましくは配列番号１３６であるＩＬ-１β分子と(ii)第２の付着部位を含むリンカーであって、ＧＧＣ（配列番号１７８）またはＧＧＣＧ（配列番号１８８）、好ましくはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか、好ましくはそれからなるリンカーとを含むか、好ましくはそれらから成る。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、(i)配列番号１６５又は配列番号１３６、好ましくは配列番号１３６であるＩＬ-１β分子と(ii)第２の付着部位を含むリンカーであって、前記ＩＬ-１β分子のＣ末端にペプチド結合により共有結合するリンカーであって、ＧＧＣ（配列番号１７８）またはＧＧＣＧ（配列番号１８８）、好ましくはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか、好ましくはそれからなるリンカーとを含むか、好ましくはそれらから成る。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、(i)配列番号１６５又は配列番号１３６、好ましくは配列番号１３６であるＩＬ-１β分子と(ii)第２の付着部位を含むリンカーであって、前記ＩＬ-１β分子のＣ末端にペプチド結合により共有結合するリンカーであって、ＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧ （配列番号２１９）からなるリンカーとを含むか、好ましくはそれらから成る。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、配列番号２２０から２２３の何れか一つ、好ましくは配列番号２２０である。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、(i)配列番号２０３から２１８の何れか一つから選択されるＩＬ-１α分子と(ii)第２の付着部位を含むリンカーであって、ＧＧＣ（配列番号１７８）またはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか、好ましくはそれからなるリンカーとを含むか、好ましくはそれらから成る。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、(i)配列番号２０３又は配列番号２１０、好ましくは配列番号２０３であるＩＬ-１α分子と(ii)第２の付着部位を含むリンカーであって、ＧＧＣ（配列番号１７８）またはＧＧＣＧ（配列番号１８８）、好ましくはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか、好ましくはそれからなるリンカーとを含むか、好ましくはそれらから成る。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、(i)配列番号２０３又は配列番号２１０、好ましくは配列番号２０３であるＩＬ-１α分子と(ii)第２の付着部位を含むリンカーであって、前記ＩＬ-１α分子のＣ末端にペプチド結合により共有結合するリンカーであって、ＧＧＣ（配列番号１７８）またはＧＧＣＧ（配列番号１８８）、好ましくはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか、好ましくはそれからなるリンカーとを含むか、好ましくはそれらから成る。
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、配列番号２２４又は２２５の何れか一つ、好ましくは配列番号２２４である。
実施例１
マウスＩＬ１α117-270及びＩＬ-１β119-269のクローニング、発現及び精製

オリゴヌクレオチドＩＬ１α１(5'-ATATATGCTAGCCCCTTACACCTACCAGAGTGATTTG-3'；配列番号２４)及びＩＬ１α２(5'-ATATATCTCGAGTGATATCTGGAAGTCTGTCATAGAG-3'；配列番号２５)を用いて、ＴＮＦα活性化マウスのマクロファージのｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲによってマウスＩＬ-１αのアミノ酸117-270をコードするヌクレオチド配列を増幅した。同じｃＤＮＡライブラリーを用いて、オリゴヌクレオチドＩＬ１β１(5'-ATATATGCTAGCCCCCATTAGACAGCTGCACTACAGG-3'；配列番号２６)及びＩＬ１β２(5'-ATATATCTCGAGGGAAGACACAGATTCCATGGTGAAG-3'；配列番号２７)によりマウスＩＬ-１β前駆体のアミノ酸119-269をコードするヌクレオチド配列を増幅した。両ＤＮＡ断片を、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、発現ベクターｐＭｏｄＥＣ１(配列番号２９)にクローニングした。
ベクターｐＭｏｄＥＣ１(配列番号２９)は、ｐＥＴ２２ｂ(＋) (Novagen Inc.)の誘導体であって、２つの工程で構築した。第一の工程では、ＮｈｅＩとＸｈｏＩ部位の間の元の配列をアニールしたオリゴプライマーＭＣＳ-１Ｆ(5'-TATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTA AACGGCGGCCGCAT-3'；配列番号３０)及びプライマーＭＣＳ-１Ｒ(5'-TCGAATGCGGCCG CCGTTTAAACCCTCGAGCGCTAGCCGGATCCA-3'；配列番号３１)(１５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８バッファ中でアニール)に置き換えることによって、ｐＥＴ２２ｂ(＋)のマルチプルクローニングサイトを変えた。結果として生じるプラスミドをｐＭｏｄ００と称し、そのマルチクローニングサイトにＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｍｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位を有していた。オリゴＢａｍｈｉｓ６-ＥＫ-Ｎｈｅ-Ｆ(5'-GATCCACACCACCACCACCACCACGG TTCTGGTGACGACGATGACAAAGCGCTAGCCC-3'；配列番号３２)とＢａｍｈｉｓ６-ＥＫＮｈｅ-Ｒ(5'-TCGAGGGCTAGCGCTTTGTCATCGTCGTCACCAGAACCGTGGT GGTGGTGGTGGTGTG-3'；配列番号３３)とのアニールした対と、オリゴ１Ｆ-Ｃ-グリシン-リンカー(5'-TCGAGGGTGGTGGTGGTGGTTGCGGTTAATAAGTTTAAACGC-3'；配列番号３４)とオリゴ１Ｒ-Ｃ-グリシン-リンカー(5'-GGCCGCGTTTAAACTTATTA ACCGCAACCACCACCACCACCC-3'；配列番号３５)とのアニールした対を一緒に、ＢａｍＨＩ-ＮｏｔＩ消化のｐＭｏｄ００プラスミドにライゲーションして、ｐＭｏｄＥＣ１を得た。このｐＭｏｄＥＣ１はＮ末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及び１つのシステイン残基を含有するＣ末端グリシンリンカーをコードしている。
ｐＭｏｄＥＣ１への上述の断片のクローニングによりそれぞれ、プラスミドｐＭｏｄＥＣ１-Ｈｉｓ-ＥＫ-ｍＩＬ１α117-270及びｐＭｏｄＥＣ１-Ｈｉｓ-ＥＫ-ｍＩＬ１β119-269が生じた。これらのプラスミドは、Ｎ末端Ｈｉｓ-タグ、エンテロキナーゼ切断部位、成熟したマウスのＩＬ-１α又はＩＬ-１βのそれぞれ、及びＣ末端システイン含有リンカー(ＧＧＧＧＧＣＧ、配列番号２８)からなる融合タンパク質をコードする。発現のために、いずれかのプラスミドを有する大腸菌(Escherichia coli)ＢＬ２１を３７℃で６００ｎｍで１．０ＯＤまで増殖させ、次いで、１ｍＭの濃度のイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドを加えて誘導した。細菌を３７℃でさらに４時間生育させ、遠心によって回収し、８０ｍｌの溶解バッファ(１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０)に再懸濁した。次いで、細胞を超音波処理し、６４μｌの２Ｍ ＭｇＣｌ２及び１０μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅと共に室温で３０分間インキュベートして細胞のＤＮＡ及びＲＮＡを消化した。細胞のデブリを遠心によって除去し(ＳＳ３４ローター、２００００ｒｐｍ、４℃、６０分)、クリアになった可溶化液をＮｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム(Qiagen, Hilden, Germany)にアプライした。洗浄バッファ(５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０)にてカラムを十分に洗浄した後、タンパク質を、溶出バッファ(５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０)にて溶出した。精製したタンパク質をＰＢＳ ｐＨ７．２にて透析し、液体窒素中で瞬時に凍結し、後の使用まで−８０℃で保存した。
実施例２

Ａ．Ｑβウイルス様粒子へのマウスＩＬ-１β119-269のカップリング

実施例１の精製されたマウスＩＬ-１β119-269タンパク質(配列番号６６)を１．３ｍｇ／ｍｌ含むＰＢＳ ｐＨ７．２の溶液を、等モル量のＴＣＥＰとともに室温で６０分間インキュベートして、Ｃ末端システイン残基の還元を行った。
次いで、ＰＢＳ ｐＨ７．２に２ｍｇ／ｍｌのＱβカプシドタンパク質を含む６ｍｌの溶液を、１３１μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯに６５ｍＭ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を、２４時間にわたって、４℃で、３Ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌｐＨ７．２にて３回交換して、透析した。誘導体化して透析した７５μｌのＱβ溶液を、１１７μｌのＨ２Ｏと３０８μｌの精製して予め還元したマウスＩＬ-１β119-269タンパク質と混合し、１５℃で終夜インキュベートして化学的な架橋を行った。３０００００Ｄａの分子量カットオフを有するセルロースエステル膜を用いて、ＰＢＳに対するタンジェンシャルフロー濾過によって非カップリングタンパク質を除去した。
カップリングした生成物を、還元条件下の１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。クーマシー染色したゲルを図１に示す。Ｑβカプシド単量体に関していくつかのバンドの増加した分子量が観察され、これによって、マウスＩＬ-１β119-269タンパク質のＱβカプシドへの架橋結合の成功が明らかに示された。
Ｂ．ＱβカプシドにカップリングされたマウスＩＬ-１β119-269タンパク質(Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269)によるマウスの免疫化

５匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269(配列番号６６)にて免疫化した。５０μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０及び第２１日目に皮下に接種した(１００μｌを腹部の２か所に)。第０、第２１及び第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＩＬ-１β119-269特異的ＥＬＩＳＡを用いて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ

ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＩＬ-１β119-269タンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第０、第２１及び第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均的な抗マウスＩＬ-１β119-269力価は、第２１日目に１:２２２６２、第３５日目に１:３０９２７６であった。これにより、マウスＩＬ-１β119-269タンパク質にカップリングしたＱβによる免疫化により免疫寛容が克服され、ＩＬ-１β119-269を特異的に認識する高力価の抗体が産生されうることが示唆される。
Ｄ．ＩＬ-１βのインビトロ中和

Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269(配列番号６６)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスＩＬ-１βタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、ＱβカプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１β119-269又はＱβカプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１α117-270のいずれかにて免疫化したマウス血清の段階希釈と１００ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ-１β119-269とともにインキュベートした。固定したｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するＩＬ-１β119-269の結合をビオチン化抗マウスＩＬ-１β抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出した。マウスＩＬ-１β119-269に対して免疫化したマウスのすべての血清が０．４％以上の濃度でマウスＩＬ-１β119-269のそのレセプターに対する結合を完全に阻害したのに対して、マウスＩＬ-１α117-270に対して免疫化したマウスの血清は高濃度に用いても阻害効果を示さなかった(３．３％)。これらのデータから、ＱβカプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１β119-269による免疫化によりマウスＩＬ-１β119-269とそのレセプターとの相互作用を中和することができる抗体を得ることができることが示唆される。
Ｅ．ＩＬ-１βのインビボ中和

次に、Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269による免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べた。したがって、４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269にて第０日目及び第１４日目に２度免疫化し、４匹のマウスをＱβカプシド単独で同時に免疫化した。第２１日目に、すべてのマウスの静脈内に１μｇのフリーＩＬ-１β119-269を注射した。注射したＩＬ-１β119-269の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の３時間後に分析して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加として求めた。Ｑβ-免疫化マウスは、血清ＩＬ-６濃度で１．０１±０．６１ｎｇ／ｍｌの平均増加を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269にて免疫化したマウスはたった０．１１±０．３０ｎｇ／ｍｌの平均増加を示した。第２８日目のコントロールとして、すべてのマウスに１μｇのｍＩＬ-１αを注射した。注射の３時間後、Ｑβキャリア単独にて免疫化したマウスは血清ＩＬ-６濃度において、４０．２４±８．０６ｎｇ／ｍｌの平均増加を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269にて免疫化したマウスは５７．９８±２９．９２ｎｇ／ｍｌの増加を示した(ｐ＝０．３０)。これらのデータから、Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269による免疫化によって生産される抗体がＩＬ-１βの炎症誘発性活性を特異的かつ効果的に中和することが可能であったことが示された。
実施例３

Ａ．Ｑβウイルス様粒子へのマウスＩＬ-１α117-270のカップリング

実施例１の精製されたマウスＩＬ-１α117-270タンパク質(配列番号６５)を１．８ｍｇ／ｍｌ含むＰＢＳ ｐＨ７．２の溶液を、等モル量のＴＣＥＰとともに室温で６０分間インキュベートして、Ｃ末端システイン残基の還元を行った。
次いで、ＰＢＳ ｐＨ７．２に２ｍｇ／ｍｌのＱβカプシドタンパク質を含む６ｍｌの溶液を、１３１μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯに６５ｍＭ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を、２４時間にわたって３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌｐＨ７．２にて３回交換して、４℃で透析した。誘導体化して透析した７５μｌのＱβ溶液を、１９２μｌのＨ２Ｏと２３３μｌの精製して予め還元したマウスＩＬ-１α117-270タンパク質と混合し、１５℃で終夜インキュベートして化学的な架橋を行った。３０００００Ｄａの分子量カットオフを有するセルロースエステル膜を用いて、ＰＢＳに対するタンジェンシャルフロー濾過によって非カップリングタンパク質を除去した。
カップリングした生成物を、還元条件下の１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。クーマシー染色したゲルを図２に示す。Ｑβカプシド単量体に関していくつかのバンドの増加した分子量が観察され、これによって、マウスＩＬ-１α117-270タンパク質のＱβカプシドへの架橋結合の成功が明らかに示された。
Ｂ．ＱβカプシドにカップリングされたマウスＩＬ-１β119-269タンパク質(Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269)によるマウスの免疫化

５匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270にて免疫化した。５０μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０及び第２１日目に皮下に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第０、第２１及び第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＩＬ-１α117-270特異的ＥＬＩＳＡを用いて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ

ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＩＬ-１α117-270タンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第０、第２１及び第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均的な抗マウスＩＬ-１α117-270力価は、第２１日目に１:９２５２、第３５日目に１:７３６９１２であった。これにより、マウスＩＬ-１α117-270タンパク質にカップリングしたＱβによる免疫化により免疫寛容が克服され、ＩＬ-１α117-270を特異的に認識する高力価の抗体が産生されうる。
Ｄ．ＩＬ-１αのインビトロ中和

Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270にて免疫化したマウスの血清を、マウスＩＬ-１αタンパク質のそれぞれのレセプターへの結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、ＱβカプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１α117-270又はＱβカプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１β119-269のいずれかにて免疫化したマウス血清の段階希釈と５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ-１α117-270とともにインキュベートした。固定したｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するＩＬ-１α117-270の結合をビオチン化抗マウスＩＬ-１α抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出した。マウスＩＬ-１α117-270に対して免疫化したマウスのすべての血清が０．４％以上の濃度でマウスＩＬ-１α117-270のそのレセプターに対する結合を完全に阻害したのに対して、マウスＩＬ-１β119-269に対して免疫化したマウスの血清は高濃度に用いても阻害効果を示さなかった(３．３％)。これらのデータから、ＱβカプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１α117-270による免疫化によりマウスＩＬ-１α117-270とそのレセプターとの相互作用を中和することができる抗体を得ることができることが示唆される。
Ｅ．ＩＬ-１αのインビボ中和

次に、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270による免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べた。したがって、４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270にて第０日目及び第１４日目に２回免疫化し、４匹のマウスをＱβカプシド単独で同時に免疫化した。第２１日目に、すべてのマウスの静脈内に１μｇのフリーＩＬ-１α117-270を注射した。注射したＩＬ-１α117-270の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の３時間後に分析して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加として求めた。Ｑβ-免疫化マウスは８．１６±２．３３ｎｇ／ｍｌの血清ＩＬ-６濃度において平均増加を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270にて免疫化したマウスはたった０．１５±０．２７ｎｇ／ｍｌの平均増加を示した(ｐ＝０．０００５)。第２８日目のコントロールとして、すべてのマウスに１μｇのｍＩＬ-１βを注射した。注射の３時間後、Ｑβキャリア単独にて免疫化したマウスは９．５２±７．３３ｎｇ／ｍｌの血清ＩＬ-６濃度の平均増加を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270にて免疫化したマウスは２１．４６±２７．３６ｎｇ／ｍｌの増加を示した(ｐ＝０．４３)。これらのデータから、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270による免疫化によって生産される抗体がＩＬ-１αの炎症誘発性活性を特異的かつ効果的に中和することが可能であったことが示された。
実施例４

関節リウマチのマウスモデルにおけるＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)処置に対するＱβ-ｍＩＬ-１α117-270とＱβ-ｍＩＬ-１β119-269の免疫化の比較

Ｋｉｎｅｒｅｔ(登録商標)(Anakinra, Amgen)は、ヒトの関節リウマチの治療の承認を得ているヒトＩＬ-１レセプターアンタゴニストの組み換え型である。臨床的な有用性を満たすために、比較的高い用量(１００ｍｇ)を皮下投与により毎日投与する必要がある。コラーゲン誘発性関節炎モデルを用いて、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270及びＱβ-ｍＩＬ-１β119-269の免疫化の有効性を異なる用量のＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)の毎日適用と比較した。雄のＤＢＡ／１マウスに、５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１α117-270(ｎ＝８)、Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269(ｎ＝８)又はＱβ単独(ｎ＝３２)のいずれかを３回(第０、１４及び２８日目)皮下投与して免疫化し、次いで第４２日目に完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを皮内に注射した。第４２日目から、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270及びＱβ-ｍＩＬ-１β119-269にて免疫化したマウス、及び１群のＱβ-免疫化マウス(ｎ＝８)に２００μｌのＰＢＳを毎日腹腔内投与したのに対して、更なる３つのＱβ-免疫化群に３７．５μｇ(ｎ＝８)、３７５μｇ(ｎ＝８)又は３．７５ｍｇ(ｎ＝８)のいずれかのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)を毎日腹腔内投与した。１マウスにつき３７．５μｇのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)の連日投与はおよそ１．５ｍｇ／ｋｇの用量に相当し、これはヒトに推奨される効果的な量の範囲内である(１００ｍｇ)。すべてのマウスに、不完全フロイントアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを６３日目に皮内投与して追加免役し、関節炎症状の発達について毎日調べた。
２回目のコラーゲン投与の４週間後、Ｑβ-免疫化コントロールマウスは３．７５の平均的累積臨床スコア(WO2008/037504A1の実施例２Ｆに定義する)を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270及びＱβ-ｍＩＬ-１β119-269-免疫化マウスはそれぞれたった０．８１及び１．４４の平均スコアを示した(表１を参照)。３７．５μｇ又は３７５μｇのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)にて処置したマウスはそれぞれ２．４４及び２．６３の平均スコアに達したのに対して、３．７５ｍｇのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)にて処置したマウスは大部分が無症候性のままであり、たった０．１９の最大スコアに達した。
炎症反応の追加的な読み出し値として、全ての動物の後足関節の厚みが定期的に計量された。第２回目のコラーゲン注射の４週間後、Qβ免疫化の対照マウスは、後足関節厚が平均１６％増大し、一方でＱβ-ｍＩＬ-１α117-270免疫化マウスは２％の増大を、Ｑβ-ｍＩＬ-１β119-269免疫化マウスは６％の増大を示した。３７．５μｇ又は３７５μｇのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)で処置したマウスはそれぞれ１３％及び１０％の増大を示し、３．７５ｍｇのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)で処置したマウスは後足関節の厚みの増大を示さなかった。
結論として、驚くべきことに、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270又はＱβ-ｍＩＬ-１β119-269のいずれかの３回の注射は、ヒトの投与量又はヒトに１０倍の投与量に相当する量のＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)の毎日の注射よりも、関節炎症の進行から、マウスをより良く保護した。Ｋｉｎｅｒｅｔ(登録商標)のヒトの１００倍の投与量の適用だけが、Ｑβ-ｍＩＬ-１α117-270又はＱβ-ｍＩＬ-１β119-269のワクチン化に関して増大した恩恵を示した。

表１：コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける臨床疾患症状
Figure 2011513369
実施例５

Ａ．マウスＩＬ-１α117-270に遺伝的に融合したＡＰ２０５コートタンパク質(ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270)からなるウイルス様粒子のクローニング、発現及び精製

インターロイキン-１αのサイズが大きく、立体の問題から、インターロイキン-１αに融合したＡＰ２０５コートタンパク質並びにｗｔコートタンパク質サブユニットを含む、いわゆるモザイク粒子を産生する発現系を構築した。このシステムでは、停止コドンの抑制によりＡＰ２０５-インターロイキン-１αコートタンパク質融合体が生じるのに対して、適当な終止によりｗｔ ＡＰ２０５コートタンパク質が生じる。両タンパク質は細胞内で同時に生産され、モザイクウイルス様粒子内に集合する。サプレッサーコドンＴＡＧ(アンバー、ｐＡＰ５９０)又はＴＧＡ(オパール、ｐＡＰ５９２)により終止するＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子をコードする２つの中間プラスミドｐＡＰ５９０及びｐＡＰ５９２を作製した。トリペプチドＧｌｙ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙ(配列番号１８９)をコードするリンカー配列をコートタンパク質遺伝子の下流とインフレームに付加した。Ｋｐｎ２I及びＨｉｎｄIII部位を、ＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端であるＧｌｙ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙアミノ酸リンカーのＣ末端に外来性のアミノ酸配列をコードする配列をクローニングするために付加した。結果として生じるコンストラクトは以下の通りであった。ＡＰ５９０(配列番号１１７)：ＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子−アンバーコドン−ＧＳＧ(Ｋｐｎ２I − ＨｉｎｄIII)；及び、ＡＰ５９２(配列番号１１８)：ＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子−オパールコドン−ＧＳＧ(Ｋｐｎ２I−ＨｉｎｄIII)プラスミドｐＡＰ５９０の構築のために、オリゴヌクレオチドｐ１．４４(5'-NNCCATGGCAAATAAGCCAATGCAACCG-3'；配列番号１１９)及びｐＩＮＣ-３６(5'-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGA TCCCTAAGCAGTAGTATCAGACGATACG-3'；配列番号１２０)にて得たＰＣＲ断片をＮｃｏIとＨｉｎｄIIIにて消化して、同じ制限酵素にて消化したベクターｐＱｂ１８５にクローニングした。ｐＱｂ１８５はｐＧＥＭベクター由来のベクターである。このベクター内でのクローニングした遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターにて制御する(Kozlovska, T. M.等, Gene 137:133-37 (1993))。同様に、プラスミドｐＡＰ５９２は、オリゴヌクレオチドｐ１．４４及びｐＩＮＣ-４０(5'-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGATCCTCAAGCAGTAGTA TCAGACGATACG-3'；配列番号１２１)にて得たＮｃｏI／ＨｉｎｄIII消化ＰＣＲ断片をクローニングすることによって構築した。
マウスＩＬ-１αのアミノ酸117-270をコードする配列は、５'及び３'末端のそれぞれにＫｐｎ２I及びＨｉｎｄIII制限酵素部位を付加した、プライマーｐＩＮＣ-３４(5'-GGTCCGGAGCGCTAGCCCCTTACAC-3'；配列番号１２２)及びｐＩＮＣ-３５(5'-GTAAGCTTATGCATTATGATATCTGGAAGTCTGTCATAGA-3'；配列番号１２３)を用いて、プラスミドｐＭｏｄＥＣ１-Ｈｉｓ-ＥＫ-ｍＩＬ１α117-270(実施例１を参照)からＰＣＲによって増加した。得たＤＮＡ断片をＫｐｎ２I及びＨｉｎｄIIIにて消化し、プラスミドｐＡＰ５９４(アンバー終止)を作製するベクターｐＡＰ５９０と、プラスミドｐＡＰ５９６(オパール終止)を作製するベクターｐＡＰ５９２のそれぞれにクローニングした。
表面上にマウスＩＬ-１αをディスプレイするモザイクＡＰ２０５ ＶＬＰを発現させるために、プラスミドｐＩＳＭ５７９又はｐＩＳＭ３００１を含む大腸菌ＪＭ１０９細胞をそれぞれプラスミドｐＡＰ５９４又はｐＡＰ５９６にて形質転換させた。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲIにてｐＩＳＭ３００１からｔｒｐＴ１７６遺伝子を切り出し、アンバーｔＲＮＡサプレッサー遺伝子を含むプラスミドｐＭＹ５７９(Michael Yarusから贈与)のＥｃｏＲI断片に置換することによってプラスミドｐＩＳＭ５７９を生成した。このｔＲＮＡサプレッサー遺伝子はｔｒｐＴ１７５の変異体であり(Raftery LA.等 (1984) J. Bacteriol. 158:849-859)、３つの位置：Ｇ３３、Ａ２４及びＴ３５がｔｒｐＴと異なる。２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に、単一のコロニーを播いて、振盪せずに３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。調製された種菌は、２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＭ９培地にて５０倍に希釈し、振とう器上で３７℃で終夜インキュベートした。細胞を遠心して回収した。
細胞(１ｇ、プラスミドｐＡＰ５９４にて形質転換、ｐＩＳＭ５７９を含有)を、溶解バッファ(２０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８、０．１％トゥイーン２０)にて超音波処理して溶解した。溶解物は遠心によってクリアにし、細胞片を溶解バッファにて洗浄した。プールした上清を、ＴＥＮバッファ(２０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８)にて溶出したセファロースＣＬ-４Ｂカラムに流した。洗浄した溶解物及び洗浄上清中のカプシドの有無は、アガロースゲル電気泳動(１％ＴＡＥ、エチジウムブロマイド染色ゲル及びＵＶ検出)によって確認した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ又は３１０ｎｍの光散乱のＵＶ分光測定分析にて測定すると、カラムから２つのピークが溶出された。カプシドを含む２つ目のピークの分画をプールし、セファロースＣＬ-６Ｂカラムに流した。ＣＬ-６Ｂカラムのピーク分画をプールし、遠心濾過ユニット(Amiconウルトラ１５ ＭＷＣＯ３００００、Millipore)を用いて濃縮した。タンパク質は更なる１つによってさらに精製された。そして、上としての単位はＣＬ-４Ｂカラム及び生じているピークの分画上のゲル濾過の中でプールされて、遠心濾過機に濃縮された。バッファを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５に交換し、グリセロールを５０％の終濃度まで加えた。
Ｂ. ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270によるマウスの免疫化

４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスをＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270にて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０、第１４及び第２８日目に皮下に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第０、第１４、第２８及び第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＩＬ-１α117-270特異的ＥＬＩＳＡを用いて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ

ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＩＬ-１α117-270タンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第１４、第２８及び第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均的な抗マウスＩＬ-１α117-270力価は、第１４日目に１:４４１２、第２８日目に１：２７９５５、第３５日目に１:３４８２４であった。これにより、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270による免疫化により免疫寛容が克服され、ＩＬ-１α117-270を特異的に認識する高力価の抗体が産生されうることが示唆される。
Ｄ．ＩＬ-１αのインビトロ中和

ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270にて免疫化したマウスの血清を、マウスＩＬ-１αタンパク質のそれぞれのレセプターへの結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270又はＡＰ２０５単独のいずれかにて免疫化したマウス血清の段階希釈と１００ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ-１α117-270とともにインキュベートした。固定したｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するＩＬ-１α117-270の結合をビオチン化抗マウスＩＬ-１α抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出した。ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270免疫化マウスのすべての血清が３．３％以上の濃度でマウスＩＬ-１α117-270のそのレセプターへの結合を完全に阻害したのに対して、ＡＰ２０５にて免疫化したマウスの血清は用いたいずれの濃度においても有意な阻害効果を示さなかった。これらのデータから、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270による免疫化によりマウスＩＬ-１α117-270とそのレセプターとの相互作用を特異的に中和することができる抗体を得ることができることが示唆される。
Ｅ．ＩＬ-１αのインビボ中和

次に、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270による免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べた。したがって、４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270にて第０、１４及び２８日目に３度免疫化し、４匹のマウスをＡＰ２０５単独で同時に免疫化した。第４２日目に、すべてのマウスの静脈内に１μｇのフリーＩＬ-１α117-270を注射した。注射したＩＬ-１α117-270の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の前と３時間後に回収して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加について分析した。ＡＰ２０５-免疫化マウスは１２．９２±３．９５ｎｇ／ｍｌの血清ＩＬ-６濃度の平均増加を示したのに対して、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270にて免疫化したマウスはたった０．０６±０．０５ｎｇ／ｍｌの平均増加を示した(ｐ＜０．０１)。これらのデータから、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270による免疫化によって生産される抗体がＩＬ-１αの炎症誘発性活性を特異的かつ効果的に中和することが可能であったことが示される。
実施例６

Ａ．マウスＩＬ-１β119-269に遺伝的に融合させたＡＰ２０５コートタンパク質(ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269)からなるウイルス様粒子のクローニング及び発現

基本的には実施例５のＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α117-270について記載したように、マウスＩＬ-１β119-269に遺伝的に融合させたＡＰ２０５コートタンパク質からなるウイルス様粒子のクローニング、発現及び精製を行った。プライマーｐＩＮＣ-７５(5'-GATCCGGAGGTGGTGTCCCCATTAGACAGCT-3'、配列番号１９２)及びｐＩＮＣ-７７(5'-GTAAGCTTAGGAAGACACAGATTCCAT-3'、配列番号１９３)を用いて、マウスインターロイキン１βをコードするプラスミドｐＭｏｄＥＣ１-Ｈｉｓ-ＥＫ-ｍＩＬ１(119-269からマウスインターロイキン１βの配列を増幅した。これらのプライマーは、５'のＫｐｎ２Iと３'のＨｉｎｄ IIIの部位を有し、マウスインターロイキン１βのN末端にアミノ酸配列Ｇｌｙ-Ｇｌｙをさらにコードするマウスインターロイキン-１β遺伝子を増幅する。得られたｍｕｒ-ＩＬ-１β断片をＫｐｎ２I及びＨｉｎｄIIIにて消化し、プラスミドｐＡＰ６３０を作製するベクターｐＡＰ５９０(アンバー終止)内の同じ制限酵素部位にクローニングした。アンバー終止を示すプラスミドｐＩＳＭ５７９を含む大腸菌ＪＭ１０９を、プラスミドｐＡＰ６３０にて形質転換した。２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に、単一のコロニーを播いて、振盪せずに３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。調製された種菌は、２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＭ９培地にて５０倍に希釈し、振とう器上で３７℃で終夜インキュベートした。細胞を遠心して回収した。
Ｂ．ヒトＩＬ-１β116-269に遺伝的に融合させたＡＰ２０５コートタンパク質(ＡＰ２０５＿ｈＩＬ-１β116-269)からなるウイルス様粒子のクローニング及び発現

それぞれ５'にＫｐｎ２I部位と３'にＭｐｈ１１０３I部位を導入するプライマーｐＩＮＣ-７４(5'- GA TCC GGA GGT GGT GCC CCT GTA CGA TCA CTG AAC TG -3'、配列番号１９４)及びｐＩＮＣ-７６(5'-GTATGCATTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAGTC-3、配列番号１９５)を用いて、ヒトインターロイキン１βをコードするプラスミドｐＥＴ４２Ｔ-ｈＩＬ-１β116-269からヒトインターロイキン１βの配列を増幅した。得られたヒト-ＩＬ-１β断片をＫｐｎ２I及びＭｐｈ１１０３Iにて消化し、プラスミドｐＡＰ６４９を作製するベクターｐＡＰ５９０(アンバー終止)内の同じ制限酵素部位にクローニングした。プラスミドｐＩＳＭ５７９(アンバー終止を示す)を含む大腸菌ＪＭ１０９を、プラスミドｐＡＰ６４９にて形質転換した。２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に、単一のコロニーを播いて、振盪せずに３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。調製された種菌は、２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＭ９培地にて５０倍に希釈し、振とう器上で３７℃で終夜インキュベートした。細胞を遠心して回収した。
Ｃ．ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269によるマウスの免疫化

４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスをＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269にて免疫化する。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０、第１４及び第２８日目に皮下に接種する(１００μｌを２か所の腹部に)。第０、第１４、第２８及び第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＩＬ-１β119-269特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析する。
Ｄ．ＥＬＩＳＡ

ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＩＬ-１β119-269タンパク質にてコートする。プレートの反応を止めて、第０、１４、２８及び３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートする。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出する。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出する。ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269による免疫化により高度に特異的な抗マウスＩＬ-１β119-269力価が生じる。これにより、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269による免疫化により免疫寛容が克服され、ＩＬ-１β119-269を特異的に認識する高力価の抗体が産生されうることが示唆される。
Ｅ．ＩＬ-１βのインビトロ中和

次いで、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269にて免疫化したマウスの血清を、マウスＩＬ-１βタンパク質のレセプターへの結合を阻害する能力について試験する。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269又はＡＰ２０５単独のいずれかにて免疫化したマウス血清の段階希釈と１００ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ-１β119-269とともにインキュベートする。固定したｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するＩＬ-１β119-269の結合をビオチン化抗マウスＩＬ-１β抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出する。ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269免疫化マウスのすべての血清がマウスＩＬ-１β119-269のレセプターへの結合を強く阻害するのに対して、ＡＰ２０５単独にて免疫化したマウスの血清は全く阻害効果を示さない。これらのデータから、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269による免疫化によりマウスＩＬ-１β119-269とそのレセプターとの相互作用を中和することができる抗体を生じさせることができることが示唆される。
Ｆ．ＩＬ-１βのインビボ中和

次に、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269による免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べる。したがって、４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269にて第０、１４及び２８日目に３度免疫化し、４匹のマウスをＡＰ２０５単独で同時に免疫化する。第３５日目に、すべてのマウスの静脈内に１μｇのフリーＩＬ-１β119-269を注射する。注射したＩＬ-１β119-269の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の前と３時間後に回収して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加について分析する。ＡＰ２０５-免疫化マウスは血清ＩＬ-６濃度の強い増加を示すのに対して、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269にて免疫化したマウスは非常にわずかな増加のみを示す。これらのデータから、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β119-269による免疫化によって生産される抗体がＩＬ-１βの炎症誘発性活性を特異的かつ効果的に中和することが可能であることが示される。
Ｈ．ＡＰ２０５＿ｈＩＬ-１β119-269によるマウスの免疫化

４匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスはＡＰ２０５＿ｈＩＬ-１β119-269で免疫化された。２５μの総タンパク質をＰＢＳに希釈して２００μＬとし、日０、１４、及び２８に、皮下に注射した（腹側の２箇所に１００μＬ）。マウスは日０、１４、２８及び３５に眼窩後から採血し、血清はヒトＩＬ−１β116-269特異的ＥＬＩＳＡを使用して解析した。

Ｉ．ＥＬＩＳＡ

ＥＬＩＳＡプレートは、１μｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１β116-269タンパク質で被覆した。プレートはブロックされ、日０、１４、２８、及び３５の連続希釈マウス血清と共にインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。マウス血清の抗体力価は、４５０ｎｍの最適濃度の最大値の半分を導く、それらの希釈の平均として計算した。抗ヒトＩＬ−１β116-269力価は、日１４で１：３９６００、日２８で１：５８３００及び日３５で１：６５６００だった。これは、ＡＰ２０５＿ｈＩＬ-１β119-269は、マウスでｈＩＬ-１β119-269抗体の高い力価を誘導することを示す。
実施例７

ヒトＩＬ-１β116-269のクローニング、発現及び精製

オリゴヌクレオチドＨＩＬ-１(5'- ATATATGATATCCCTGTACGATCACTGAACTGCACG-3'、配列番号１２４)及びＨＩＬ-２(5'-ATATATCTCGAGGGAAGACA CAAATTGCATGGTGAAG-3'、配列番号１２５)を用いて、ヒト肝臓組織のｃＤＮＡライブラリからＰＣＲにてヒトＩＬ-１βのアミノ酸116-269(ｈＩＬ-１β116-269)をコードするヌクレオチド配列を増幅し、ＸｈｏI及びＥｃｏＲVにて消化し、発現ベクターｐＥＴ４２Ｔ(＋)にクローニングした。
ｐＥＴ-４２ａ(＋) (Novagen)のＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターの間の全領域を新たなリンカー配列に２工程で置き換えて、プラスミドｐＥＴ-４２Ｔ(＋)を構築し、Ｈｉｓ-タグ及びシステイン含有リンカーを含むＣ末端タグ(配列番号１９０)を有する融合体として対象のタンパク質の発現を促した。第一工程では、プラスミドｐＥＴ-４２ａ(＋)を制限酵素ＮｄｅI及びＡｖｒIIにて消化し、ＧＳＴ-タグ、Ｓ-タグの２つのＨｉｓ-タグとマルチクローニングサイトからなるＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターとの間の９５８ｂｐの断片を遊離させた。ｐＥＴ-４２ａ(＋)のベクターバックボーンを含む残りの４９７２ｂｐの断片を単離し、アニールさせた相補的なオリゴヌクレオチド４２-１(5´-TATGGATATCGAATTCAAGCTTCTGCAGCTGCTCGAGTAA TTGATTAC-3´；配列番号１２６)及び４２-２(5'-CTAGGTAATC AATTACTCGA GCAGCTGCAGAAGCTTGAATTCGATATCCA-3'；配列番号１２７)にライゲーションしプラスミドｐＥＴ-４２Ｓ(＋)を生じさせた。第二の工程では、プラスミドｐＥＴ-４２Ｓ(＋)を制限酵素ＸｈｏI及びＡｖｒIIにて消化して線状化し、相補的なアニールさせたオリゴヌクレオチド４２Ｔ-１(5'-TCGAGCACCACCACCACCACCACGGTGGTT GCTAATAATAATTGATTAATAC-3'；配列番号１２８)及び４２Ｔ-２(5'-CTAGGTATTAATCAATTATTATTAGCAACCACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGC-3'；配列番号１２９)にライゲーションし、プラスミドｐＥＴ-４２Ｔ(＋)を生じさせた。
上記の断片ｈＩＬ-１β116-269をｐＥＴ-４２Ｔ(＋)にクローニングしてプラスミドｐＥＴ４２Ｔ-ｈＩＬ-１β116-269を生じさせた。このプラスミドは、成熟ヒトＩＬ-１β及びＨｉｓ-タグ及びＣ末端システイン含有リンカー(GGC、配列番号１７８)に相当する融合タンパク質をコードする。ゆえに、融合タンパク質は、配列番号１６５にＣ末端で融合させた配列番号１９０からなる。ヒトＩＬ-１βの位置１１７の元のアラニン残基をこの融合タンパク質ではイソロイシンに変更した。基本的には実施例１のマウスｍＩＬ１β119-269タンパク質についての記載のように、ヒトＩＬ-１β116-269タンパク質の発現及び精製を行った。
Ｂ．ＩＬ-１β116-269変異タンパク質のクローニング、発現及び精製

プラスミドｐＥＴ４２Ｔ-ｈＩＬ-１β116-269の部位特異的突然変異誘発によって、１０の異なる変異体ヒトＩＬ-１β116-269融合タンパク質のための発現ベクターを構築した。この目的のために、Quik-Change(登録商標)部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を製造者の指示に従って用いた。変異体ＩＬ-１β119-269タンパク質の発現ベクターをその構築に用いたオリゴヌクレオチド対とともに表３に挙げる。実施例１に記載のように異なるヒトＩＬ-１β116-269変異タンパク質の発現及び精製を行った。
表２：ＩＬ-１変異タンパク質、発現ベクター及びこれらの構築に用いたオリゴヌクレオチドについての概説
Figure 2011513369
Figure 2011513369
実施例８

Ａ．ヒトＩＬ-１β116-269とヒトＩＬ-１β116-269変異タンパク質の生物学的活性

１群につき３匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスに、１０μｇの野生型ヒトＩＬ-１β116-269タンパク質又は実施例７のヒトＩＬ-１β116-269タンパク質変異体の１つのいずれかを静脈内投与する。血清試料を注射の前と３時間後に回収して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加について分析した。表３に示すように、野生型ヒトＩＬ-１β119-269タンパク質を投与したマウスは血清ＩＬ-６濃度の２．３８ｎｇ／ｍｌの増加を示した。野生型ヒトＩＬ-１β119-269と類似の血清ＩＬ−６濃度を示した変異タンパク質ｈＩＬ-１β116-269（Ｄ５４Ｒ）及びｈＩＬ-１β116-269（Ｋ６３Ｓ／Ｋ６５Ｓ）を除いて、試験した全ての変異タンパク質は低量のＩＬ−６を誘導し、生物学活性が減少したことを示した。

表３：マウスにおけるヒトＩＬ−１β116-269及びヒトＩＬ−１β116-269変異タンパク質の生物学的活性
Figure 2011513369

Ｂ．ヒトＰＢＭＣにおけるヒトＩＬ−１β116-269及びヒトＩＬ−１β116-269変異タンパク質の生物学的活性

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール密度勾配遠心法によって健康な提供者のヘパリン添加血からの分離された。ウェルにつき５×１０５細胞を、野生型ヒトＩＬ-１β119-269タンパク質か、実施例７のヒトＩＬ-１β119-269変異蛋白質の１つの何れかの滴定量と共に暖められた。一晩のインキュベーション後、細胞培養上清のＩＬ-６の量は、生物学的活性の読み出しとして測定された。
表４は変異タンパク質ｈＩＬ-１β116-269（Ｄ５４Ｒ）及びｈＩＬ-１β116-269(K63S/K65S)を除いて全ての変異体は、非常により高い量が、野生型ヒトＩＬ-１β119-269と同じＩＬ−６分泌を誘導するために必要であり、生理活性の減少を示した。生物学的活性が減少した率は、変異タンパク質ｈＩＬ-１β116-269（Ｒ１１Ｇ）に対して１３倍から、変異タンパク質ｈＩＬ-１β116-269（ΔSND52-54）に対して３８１倍まで変動した。

表４：ヒトＰＢＭＣにおけるヒトＩＬ−１β116-269及びヒトＩＬ−１β116-269変異タンパク質の生物学的活性
Figure 2011513369
実施例９

Ａ．Ｑβウイルス様粒子へのヒトＩＬ-１β116-269及びヒトＩＬ-１β116-269変異タンパク質のカップリング

Ｑβウイルス様粒子への野生型ヒトＩＬ-１β119-269タンパク質及び実施例１０のヒトＩＬ-１β119-269変異タンパク質の化学的な架橋は基本的に実施例２Ａに記載のように行った。
Ｂ．ＱβカプシドにカップリングさせたヒトＩＬ-１β116-269及びヒトＩＬ-１β116-269変異タンパク質によるマウスの免疫化

１群につき４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを野生型ｈＩＬ-１β116-269タンパク質又はｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質のうちの１つのいずれかにカップリングさせたＱβにて免疫化した。５０μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０、１４及び２８日目に皮下に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、抗原として用いたそれぞれのヒトＩＬ-１β116-269変異タンパク質又は野生型ヒトＩＬ-１β116-269タンパク質のいずれかに特異的なＥＬＩＳＡを用いて血清を分析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ

ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の野生型ｈＩＬ-１β116-269タンパク質又はそれぞれのｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質のいずれかにてコートした。プレートの反応を止めて、第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出し、表５に示す。
表５：Ｑβ-ｈＩＬ-１β116-269又はQβ-ｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質ワクチンによる免疫化によって生じる抗-ｈＩＬ-１β116-269(野生型及び変異タンパク質)-特異的ＩｇＧ力価
Figure 2011513369
Ｑβ-ｈＩＬ-１β116-269-免疫化によりｈＩＬ-１β116-269に対して高力価のＩｇＧ抗体が誘導された。さらに、いずれかのＱβ-ｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質ワクチンによるワクチン接種により、抗原として用いたそれぞれのｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質及び野生型ｈＩＬ-１β116-269タンパク質の両方に対して高いＩｇＧ力価が誘導された。
Ｄ．ヒトＩＬ-１βのインビトロ中和

野生型ｈＩＬ-１β116-269タンパク質又はｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質のうちの１つのいずれかにカップリングさせたＱβにて免疫化したマウスの血清を、マウスＩＬ-１βタンパク質のレセプターへの結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えヒトＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、上記の血清の段階希釈と１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ-１β116-269タンパク質とともにインキュベートした。固定したヒトＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するｈＩＬ-１β116-269の結合をビオチン化抗ヒトＩＬ-１β抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出した。Ｑβ-ｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質ワクチンに対して生じたすべての血清が、３．３％以上の血清濃度で１００ｎｇ／ｍｌの野生型ｈＩＬ-１β116-269のｈＩＬ-１ＲIへの結合を完全に阻害した。
また、同じ血清は、ヒト細胞からのＩＬ−６のｈＩＬー１β116-269誘導化分泌を阻害するそれらの能力について試験された。そのため、ヒトＰＢＭＣは実施例８Ｂにて説明したように調製されて、上記の血清の滴定濃度と共に使用前に混合された１０ｎｇ／ｍｌの野生型ｈＩＬ−１β116-269と共にインキュベートされた。一晩のインキュベーション後、細胞培養上清は、ＩＬ−６の存在について分析された。血清の中和能力は、ＩＬ−６分泌の最大値の半分の阻害を導くそれらの希釈度として表された。野生型ｈＩＬ-１β116-269に対して増大した血清の中和能と直接比較を可能にするために、ｈＩＬ-１β116-269の変異タンパク質に対して増大した全ての血清の中和能は、野生型ｈＩＬ-１β116-269に対して測定されたそれぞれのELISAタイターにより修正された（表５を参照）。表６に示すように、ｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質に対して増大した全ての血清は、野生型ｈＩＬ-１β116-269によって誘導されるIL-6の分泌を阻害することが可能だった。中和力価は、Qβ-ｈＩＬ-１β116-269（Ｒ１１Ｇ）に対して増大した血清についての１：１１３から、Qβ-ｈＩＬ-１β116-269（Ｄ５４Ｒ）に対する増大した血清の１：４５３２まで変動した。
表６：さまざまなＩＬ-１β変異タンパク質によって免疫化されたマウス血清において決定された中和力価
Figure 2011513369
Ｅ．ＩＬ-１βのインビボ中和

野生型ｈＩＬ-１β116-269タンパク質又はｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質のうちの１つのいずれかにカップリングさせたＱβによる免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べる。したがって、１群につき３匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを、５０μｇのいずれかのワクチンにて第０、１４及び２８日目に３度免疫化する。第３５日目に、すべての免疫化したマウスの静脈内に１μｇのフリー野生型ｈＩＬ-１β116-269を注射する。コントロールとして３匹のナイーブマウスに同量の野生型ｈＩＬ-１β116-269を同時に投与する。注射したｈＩＬ-１β116-269の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の直前と３時間後に回収して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加について分析した。ナイーブマウスはｈＩＬ-１β116-269の投与の３時間後に血清ＩＬ-６濃度の強い増加を示すのに対して、野生型ｈＩＬ-１β116-269タンパク質又はｈＩＬ-１β116-269変異タンパク質のうちの１つにカップリングさせたＱβにて免疫化したすべてのマウスは血清ＩＬ-６の増加を全く示さない。このことから、投与したｈＩＬ-１β116-269はワクチンに誘導される抗体によって効果的に中和されることが示唆される。
実施例１０

Ａ．マウスＩＬ−１α115-270及びマウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）のクローニング、発現及び精製

野生型マウスＩＬ−１αのアミノ酸115-270をコードするヌクレオチド配列は、ＰＣＲによって、ＴＮＦα活性化マウス・マクロファージのライブラリーから、オリゴヌクレオチドＩＬ１α１Ｃ（５’−ＡＴＡＴＡＴＣＡＴＡ ＴＧＴＣＴＧＣＣＣＣ ＴＴＡＣＡＣＣＴＡＣ ＣＡＧＡＧＴＧ−３’：配列番号１９６）及びＩＬ１α２（５’−ＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧ ＡＧＴＧＡＴＡＴＣＴ ＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴ ＣＡＴＡＧＡＧ−３’；配列番号２５）を使用して増幅した。ＤＮＡ断片はＮｈｅｌとＸｈｏｌによって消化されて、発現ベクターｐＥＴ４２Ｔ（＋）にクローニングされ、発現プラスミドｐＥＴ４２Ｔ−ｍＩＬ−１α115-270を生じた。
後者のプラスミドの部位指定変異導入によって、変異タンパク質ｍＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）の発現ベクターを構成した。オリゴヌクレオチドのペアのαＤ１４５Ｋ−１（５’−ＧＧＡＣＴＧＣＣＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＴＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧ−３； 配列番号１９７）、αＤ１４５Ｋ−２（５’−ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＡＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＧＣＡＧＴＣＣ−３’；配列番号１９８）及びＱｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位指定変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、Ｄ１４５Ｋ変異を導入した。野生型マウスＩＬ−１α115-270及び変異タンパク質マウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）の発現及び精製は、実施例１にて説明したように実施された。
Ｂ．ヒトＩＬ−１α119-271及びヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）のクローニング、発現及び精製

野生型ヒトＩＬ−１αのアミノ酸119-271をコードするヌクレオチド配列は、ＰＣＲによって、ＬＰＳ活性化ヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、オリゴヌクレオチドＨＩＬ−３（５’−ＡＴＡＴＡＴＣＡＴＡ ＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡ ＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣ
ＡＡＣＴＴＴＡＴＧ−３’；配列番号１４１）及びＨＩＬ−４（５’−ＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧ ＡＧＣＧＣＣＴＧＧＴ ＴＴＴＣＣＡＧＴＡＴ ＣＴＧＡＡＡＧ−３’；配列番号１４２）を使用して増幅した。ＤＮＡ断片はＮｈｅｌとＸｈｏｌによって消化されて、発現ベクターｐＥＴ４２Ｔ（＋）にクローニングされ、発現プラスミドｐＥＴ４２Ｔ−ｈＩＬ−１α119-271を生じた。
後者のプラスミドの部位指定変異導入によって、変異タンパク質ｍＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）の発現ベクターを構成した。オリゴヌクレオチドのペアのｈαＤ１４５Ｋ−１（５’−ＧＧＧＣＣＡＣＣＣＴ ＣＴＡＴＣＡＣＴＡＡ ＡＴＴＴＣＡＧＡＴＡ ＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣ−３’：配列番号１９９）、ｈαＤ１４５Ｋ−２（５’−ＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧ ＴＡＴＣＴＧＡＡＡＴ ＴＴＡＧＴＧＡＴＡＧ ＡＧＧＧＴＧＧＣＣＣ−３’； 配列番号２００）及びＱｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位指定変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、Ｄ１４５Ｋ変異を導入した。野生型ヒトＩＬ−１α119-271及びヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質の発現と精製は、実施例１にて説明したように実施された。
実施例１１

Ａ．ヒトＰＢＭＣにおけるヒトＩＬ−１α119-271、ヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）、マウスＩＬ−１α115-270及びマウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）の生物学的活性

健康な提供者からのＰＢＭＣ（ウェルにつき５×１０５細胞）を野生型ヒトＩＬ−１α119-271タンパク質、ヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質、野生型マウスＩＬ−１α115-270タンパク質、またはマウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質の何れかの滴定量と共にインキュベートした。一晩のインキュベーション後、細胞培養上清のＩＬ−６量は、様々なタンパク質の生物学的活性の読み出しとして、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定された。表９は、２１倍高い量のマウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質が、対応する野生型マウスＩＬ−１α115-270タンパク質と同量のＩＬ−６を誘導するために必要だったことを示す。ヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質の場合、野生型ヒトＩＬ−１α119-271タンパク質より４６倍高い量が必要だった。これは、ヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質及びマウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質の両方が、それらの野生型相対物と比較してヒト細胞において減少した生理活性を有することを示す。

表７：ＩＬ−６誘導によって測定された、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬー１α野生型タンパク質及び変異タンパク質の生物学的活性
Figure 2011513369
Ｂ．マウスにおけるヒトＩＬ−１α119-271、ヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）、マウスＩＬ−１α115-270タンパク質、及びマウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）の生物学的活性

１群につき４匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの静脈内に、野生型ヒトＩＬ−１α119-271タンパク質、ヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質、野生型マウスＩＬ−１α115-270タンパク質、またはマウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質の何れかの１０ｎｇを注射した。注射の３時間後に、それぞれのタンパク質の生理活性の読み出しとして、注射されたマウスの血清において血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）が計量された。表８に示すように、マウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質は、対応する野生型マウスＩＬ−１α115-270タンパク質よりも５３％少ないＳＡＡを誘導し（ｐ＜０．０５、ステューデントのｔ検定）、ヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質は、対応する野生型ヒトＩＬ−１α119-271タンパク質より６７％少ないＳＡＡを誘導した（ｐ＜０．００１、ステューデントのｔ検定）。これは、ヒトＩＬ−１α119-271（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質及びマウスＩＬ−１α115-270（Ｄ１４５Ｋ）変異タンパク質の両方が、それらの野生型相対物と比較して、マウスにおいて減少した生理活性を有することを証明する。
表８：ＳＡＡによって測定された、マウスにおけるＩＬ−１α野生型タンパク質及び変異タンパク質の生物学的活性
Figure 2011513369
表９：好適なヒトＩＬ−１β変異タンパク質（配列番号１３１から１４０及び配列番号２０５〜２０９）及びヒトＩＬ−１α変異タンパク質（配列番号２１０から２１８）に対応するマウスＩＬー１β及びマウスＩＬ−１α変異タンパク質は、この表に従って作成されて、リウマチ様関節炎のマウスモデルにおいて試験された。
Figure 2011513369
実施例１２

雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける食餌性２型糖尿病の改善（予防セッティング）

雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、５０μｇのＱβ、Ｑβ−ｍＩＬ−１α115-270、Ｑβ−ｍＩＬ−１β119-269の何れかの５０μｇか、又は５０μｇのＱβ−ｍＩＬ−１α115-270と５０μｇのＱβ−ｍＩＬ−１βとの混合物によって、日０、１４及び２８に免疫化された（１群につきｎ＝１６）。全マウスは、免疫化期間の間、通常の齧歯目の食事（Ｐｒｏｖｉｍｉ Ｋｌｉｂａ ｎｏ． ３４３６：１８．５％のタンパク質、４．５％の脂肪、４．５％の繊維、６．５％の灰、５４％の糖質）を与えられた。日３５に、この餌は、各群のマウスの半数（＜＜＝８）に対して、高脂肪食餌（Provimi Kliba no．２１２７：２３．９％のタンパク質、３５％の脂肪、４．９％の繊維、５％の灰、２３．２％の糖質）と交換され、一方残りの半分（＜＜＝８）は通常の餌のままにされた。最後の免疫化から５ヵ月後、高脂肪食餌を与えられたマウスは肥満となり（平均体重＞４５ｇ）、空腹時血糖値が上昇していた（表１０、０’）。
これらのマウスの糖尿病の表現型に調査するために、経口グルコース負荷試験は、Ｄ−グルコースの体重に対し２ｍｇ／ｇの投与量を胃内に投与し、Ａｃｃｕ−検査の血中グルコース計測器（ロシュ）を使用して、通常の間隔で血中グルコース濃度を測定することによって実施された。表１０は、Ｑβ免疫化マウスが、正常な食餌で、１５分後に血中グルコース濃度２９１．５ｍｇ／ｄｌの初期ピークを示し、急な降下が続き、９０分以内にチャレンジ前の濃度に完全に戻ることを示した。この反応のピーク濃度及び動態は、正常な食餌で飼育された全てのマウス群において、本質的に同一だった（表１０）。一方では高脂肪食餌のＱβ免疫化マウスは、より高い濃度を示し（３６７．９ｍｇ／ｄｌ）、チャレンジ後６０分まで有意な減少を示すことが出来なかった；その後で血中グルコース濃度は減少し始めたが、しかしながら２時間の観察期間内に基線レベルに戻らなかった。グルコース・クリアランスにおけるこの重症の障害は、肥満Ｑβ−免疫マウスが糖尿病の表現型を発病したことを示す。肥満のＱβ−ｍＩＬ−１α、Ｑβ−ｍＩＬ−１β−、又は二重免疫マウスは、血中グルコース濃度−３５０ｍｇ／ｄｌまでの初期増加を示し、直ちに持続性の減少が続き、結果として肥満Ｑβ免疫化の対照マウスよりも一貫して低いグルコール濃度になった。表１０に示す反復グルコース測定の結果から曲線下面積を計算する場合、肥満のＱβ−ｍＩＬ−１α、Ｑβ−ｍＩＬ−１β−、又は二重免疫マウスは、肥満Ｑβ免疫化の対照マウスに比べて改良されたグルコース・クリアランスを示すことが明らかになった（表１１）。これらのデータをまとめると、Ｑβ−ｍＩＬ−１α又はＱβ−ｍＩＬ−１β又は両方の組合せによる免疫化は、食餌性糖尿病の表現型の明白な改善に結果としてなることを示した。

表１０：２ｍｇ／ｇグルコースの胃内投与の前の、及びその後の様々な時間ポイントにおける血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄｌ；平均±ＳＥＭ）。（実験前の５時間の間、マウスは絶食させられる）
Figure 2011513369

表１１：免疫マウスのグルコース・クリアランス。表１０に示される連続的なグルコース測定の結果である曲線下面積（ＡＵＣ）は、個々のマウスについて算出された。ＡＵＣのグループ平均はＳＥＭと共に示す。
Figure 2011513369
実施例１３

雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける食餌性２型糖尿病の改善

マウスＩＬ−１βのアミノ酸119-269をコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲによって、ＴＮＦα−活性化マウス・マクロファージのｃＤＮＡから、オリゴヌクレオチドＩＬ１β−３（５'−ＡＴＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴＡＣＡＧＧ−３'；配列番号２２６）及びＩＬ１β−２（５'−ＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧ−３'；配列番号２２７）を使用して増幅し、ベクターｐＥＴ４２Ｔにクローニングした（実施例７）。結果として生じたプラスミドｐＥＴ４２Ｔ−ｍＩＬ−１β119-269は、Ｃ末端にシステインを含むリンカー及びヘキサヒスチジン・タグに融合させた成熟マウスＩＬ−１βタンパク質をコードする。ＥｃｏＲＶ制限部位の導入により、マウスＩＬ−１βのＮ末端におけるバリン残基は、３つのアミノ酸（ＭＤＩ）からなる短いＮ末端基伸長によって置換される。プラスミドｐＥＴ４２Ｔ−ｍＩＬ−１β116-269の部位指定変異によって、配列番号２０１のＣ末端タグを有するヒトＩＬ−１β変異タンパク質ｈＩＬ−１β116-269（Ｄ１４５Ｋ）（配列番号１３６）のマウスのバージョン、すなわちｍＩＬ−１β116-269（Ｄ１４５Ｋ）（配列番号２２８）をコードする発現ベクターを構築した。突然変異は、Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位指定変異キット（ストラタジーン）とオリゴヌクレオチドＤ１４３Ｋ−１（５’−ＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧ ＧＡＣＡＴＡＡＴＴＡ ＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴ ＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣ−３’； 配列番号２２９）及びＤ１４３Ｋ−２（５’−ＧＡＣＡＣＡＧＡＴＴ ＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡ ＴＴＴＡＡＴＴＡＴＧ ＴＣＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧ−３’；配列番号２３０）を使用して導入された。変異タンパク質ｍＩＬ−１β116-269（Ｄ１４５Ｋ）の発現及び精製は、実施例１にて説明したように実施され、Ｑβへの結合は実施例２にて説明したように実施された。
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、ｎ＝８）のグループは、日０、１４、２８、４２及び１４７に、ＱβかＱβ−ｍＩＬ−１β119-269（Ｄ１４５Ｋ）の何れかの５０μｇによって、皮下に免疫化された。日０から開始し、実験を通して、マウス（ｎ＝１６）の半分は高脂肪食餌（Provimi Kliba no.２１２７：２３．９％のタンパク質、３５％の脂肪、４．９％の繊維、５％の灰、２３．２％の糖質）を与えられ、残りの半分は（ｎ＝１６）は正常な食餌（Provimi Kliba no.３４３６：１８．５％のタンパク質、４．５％の脂肪、４．５％の繊維、６．５％の灰、５４％の糖質）で飼育された。８月後、高脂肪食餌を与えられたマウスは肥満（平均体重＞４５ｇ）となり、上昇した空腹時グルコース濃度を示した（表１２）。
これらのマウスの糖尿病の表現型に調査するために、経口グルコース負荷試験は、Ｄ−グルコースの体重に対し２ｍｇ／ｇの投与量を胃内に投与し、Ａｃｃｕ−検査の血中グルコース計測器（ロシュ）を使用して、通常の間隔で血中グルコース濃度を測定することによって実施された。表１３は、高脂肪食餌のＱβ免疫化マウスは、注射後３０分で３１８．５ｍｇ／ｄｌのピークとなり、チャレンジ後６０分まで有意な減少を示すことが出来なかった；その後で血中グルコース濃度は減少し始めたが、しかしながら２時間の観察期間内に基線レベルに戻らなかった。グルコース・クリアランスにおけるこの重症の障害は、肥満Ｑβ−免疫マウスが糖尿病の表現型を発病したことを示す。肥満のＱβ−ｍＩＬ−１β116-269（Ｄ１４５Ｋ）マウスは、血中グルコース濃度−３１８．６ｍｇ／ｄｌまでの初期増加を示し、直ちに持続性の減少が続き、結果として肥満Ｑβ免疫化の対照マウスよりも一貫して低いグルコール濃度になった。これらのマウスでは、チャレンジ後２時間で、血中グルコール濃度がチャレンジ前の濃度に戻った。表１３に示す反復グルコース測定の結果から曲線下面積を計算する場合、肥満のＱβ−ｍＩＬ−１β119-269免疫マウスは、肥満Ｑβ免疫化の対照マウスに比べて改良されたグルコース・クリアランスを示すことが明らかになった（表１４）。これらのデータをまとめると、Ｑβ−ｍＩＬ−１β119-269（Ｄ１４５Ｋ）による免疫化は、食餌性糖尿病の表現型の明白な改善に結果としてなることを示した。

表１２：平均体重及び絶食５時間後の空腹時血糖（平均±ＳＥＭ）
Figure 2011513369

表１３：２ｍｇ／ｇグルコースの胃内投与の前及びその後の様々な時間ポイントにおける血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄｌ；平均±ＳＥＭ）マウスは、実験前の５時間の間、絶食させた。
Figure 2011513369

表１４：免疫マウスのグルコース・クリアランス。表２に示される連続的なグルコース測定の結果である曲線下面積（ＡＵＣ）は、個々のマウスについて算出された。ＡＵＣのグループ平均はＳＥＭと共に示す。基線下のピークは、解析から除外した。
Figure 2011513369

Claims (26)

  1. 糖尿病、好ましくは２型糖尿病を治療するための組成物であって、
    （ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及び
    （ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原
    を含んでなり、前記少なくとも一つの抗原はＩＬ-１分子を含み、（ａ）と（ｂ）は少なくとも一つの第１の及び第２の付着部位を介して結合し、好ましくは前記ＩＬ-１分子は、（ａ）ＩＬ-１変異タンパク質；（ｂ）ＩＬ-１タンパク質；（ｃ）ＩＬ-１成熟断片；（ｄ）ＩＬ-１断片；及び（ｅ）ＩＬ-１ペプチドからなる群から選択される、組成物。
  2. 前記ＩＬ-１分子は、
    （ａ）ヒトＩＬ-１β117-269（配列番号６４）；
    （ｂ）ヒトＩＬ-１β116-269（配列番号１６５）；
    （ｃ）ヒトＩＬ-１β119-269s（配列番号１６４）；及び
    （ｄ）配列番号６４、配列番号１６５、又は配列番号１６４の何れか1つと、少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなるＩＬ-１β分子である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１β変異タンパク質であって、好ましくは前記ＩＬ-１β変異タンパク質はポリペプチドを含むか又は好ましくはそれからなり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６４のアミノ酸配列から１から４のアミノ酸残基が異なっており、更に好ましくは前記ＩＬ-１β変異タンパク質はポリペプチドを含むか又は好ましくはそれからなり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１３１〜配列番号１４０及び配列番号２０５〜配列番号２０９から選択されるものであり、また更に好ましくは前記ＩＬ-１β変異タンパク質はポリペプチドを含むか又は好ましくはそれからなり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１３６である、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、
    (i)ＩＬ-１β分子であって、配列番号１６５か、又は配列番号１３６であり、好ましくは配列番号１３６である前記ＩＬ-１β分子；及び
    (ii)前記第２の付着部位を含むリンカーであって、ＧＧＣ（配列番号１７８）又はＧＧＣＧ（配列番号１８８）、好ましくはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか又は好ましくはそれから成る前記リンカー
    を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは前記リンカーは、ペプチド結合を通して前記ＩＬ-１β分子のＣ末端に共有結合する、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
  5. 前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は配列番号２２０から２２３の何れか一つであり、好ましくは前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は配列番号２２０である、請求項１から４の何れか一つの組成物。
  6. 前記ＩＬ-１分子が、
    (a)ヒトＩＬ-１α119-271（配列番号６３）;
    (b)ヒトＩＬ-１α119-271（配列番号２０３）;
    (c)マウスＩＬ-１α117-270（配列番号１６３）;及び
    (d)配列番号６３、配列番号１６３、又は配列番号２０３の何れか1つと、少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなるＩＬ-１α分子である、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１α変異タンパク質であって、好ましくは前記ＩＬ-１α変異タンパク質はポリペプチドを含むか又は好ましくはそれからなり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６３のアミノ酸配列から１から４のアミノ酸残基が異なっており、更に好ましくは前記ＩＬ-１α変異タンパク質はポリペプチドを含むか又は好ましくはそれからなり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２１０から配列番号２１８から選択されるものであり、また更に好ましくは前記ＩＬ-１α変異タンパク質はポリペプチドを含むか又は好ましくはそれからなり、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２１０である、請求項１又は６に記載の組成物。
  8. 前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、
    (i)ＩＬ-１α分子であって、配列番号２０３か、又は配列番号２１０であり、好ましくは配列番号２１０である前記ＩＬ-１α分子；及び
    (ii)前記第２の付着部位を含むリンカーであって、ＧＧＣ（配列番号１７８）又はＧＧＣＧ（配列番号１８８）、好ましくはＧＧＣＧ（配列番号１８８）を含むか又は好ましくはそれから成る前記リンカー
    を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは前記リンカーは、ペプチド結合を通して前記ＩＬ-１α分子のＣ末端に共有結合する、請求項１、６又は７の何れか一項に記載の組成物。
  9. 前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、配列番号２２４又は２２５であり、好ましくは前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原は、配列番号２２４である、請求項１、６、７又は８の何れか１項に記載の組成物。
  10. 前記ウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であり、好ましくは前記ＲＮＡバクテリオファージは
    (a) バクテリオファージＱβ;
    (b) バクテリオファージＡＰ２０５;
    (c) バクテリオファージｆｒ;及び
    (d)バクテリオファージＧＡ
    からなる群から選択され、更に好ましくは前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＱβである、請求項１から９の何れか一項に記載の組成物。
  11. 前記ウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成り、好ましくは前記ＲＮＡバクテリオファージは
    (a) バクテリオファージＱβ;
    (b) バクテリオファージＡＰ２０５;
    (c) バクテリオファージｆｒ;及び
    (d)バクテリオファージＧＡ
    からなる群から選択され、更に好ましくは組換えコートタンパク質は配列番号３を含むか又は好ましくはそれからなる、請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物。
  12. 前記第１の付着部位は、少なくとも一つの共有結合を経て前記第２の付着部位に連結され、好ましくは前記少なくとも一つの共有結合は、非ペプチド結合である、請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物。
  13. 前記第１の付加部位が、アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基を含むか、又は好ましくはそれである、請求項１から１２の何れか一項に記載の組成物。
  14. 前記第２の付加部位が、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、又は好ましくはそれである、請求項１から１３の何れか一項に記載の組成物。
  15. 前記第１の付加部位がアミノ基であり、且つ前記第２の付着部位がスルフヒドリル基であり;好ましくは前記第１の付加部位はリジンのアミノ基であり、且つ前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基である、請求項１から１４の何れか一項に記載の組成物。
  16. 前記第１の付着部位はスルフヒドリル基でなく、又は前記ウイルス様粒子と前記少なくとも一つの抗原との前記結合はジスルフィド結合を含まない、請求項１から１５の何れか一項に記載の組成物。
  17. 前記第２の付着部位のただ一つが、少なくとも一つの非ペプチド共有結合を介して、前記第１の付着部位に会合して、それにより前記抗原の前記ウイルス様粒子への結合が単一且つ均一型式となり、前記第１の付着部位と会合する前記ただ一つの第２の付着部位はスルフヒドリル基であり、前記抗原と前記ウイルス様粒子は、前記会合を介して相互作用し規則正しい反復性抗原アレイを形成する、請求項１から１６に記載の組成物。
  18. 前記第１の付着部位は少なくとも一つの共有結合を経て前記第２の付着部位に結合され、前記共有結合はペプチド結合であり;好ましくは前記ウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記少なくとも一つの抗原は、前記組換えコートタンパク質、その変異体又は断片のＮ末端又はＣ末端に融合する、請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物。
  19. 前記ＲＮＡバクテリオファージは、
    (a) バクテリオファージＡＰ２０５;
    (b) バクテリオファージｆｒ;及び
    (c)バクテリオファージＧＡからなる群から選択され、好ましくは前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＡＰ２０５である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記少なくとも一つの第２の付着部位を有する前記少なくとも一つの抗原は更にリンカーを含み、前記リンカーは前記第２の付着部位を含むものであり、前記リンカーは、一つのペプチド結合を介して前記抗原に会合する、請求項１から１９に記載の組成物。
  21. 糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療のためのワクチンであって、請求項１から２０の何れか１つの組成物を、好ましくはその有効量で含むか、あるいはそれから成る、ワクチン。
  22. (i)好ましくは有効量の、請求項１から２０の何れか１つの組成物である第１の組成物であって、前記第１の組成物に含まれるＩＬ-１分子は、好ましくは配列番号１３６又は配列番号１６５のＩＬ-１β分子である第１の組成物；及び
    (ii)好ましくは有効量の、請求項１から２０の何れか１つの組成物である第２の組成物であって、前記第２の組成物に含まれるＩＬ-１分子は、好ましくは配列番号２０３又は配列番号２１０のＩＬ-１α分子である第２の組成物を含む、請求項２１に記載のワクチン。
  23. 前記ワクチンはアジュバントを含まない、請求項２１又は２２に記載のワクチン。
  24. 糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療のための医薬組成物であって、
    (a) 請求項１から２０の何れかの組成物又は請求項２１から２３の何れか一つのワクチン;及び
    （b）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  25. 糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療方法であって、請求項１から２０の何れか一つの組成物の、請求項２１から２３の何れか一つのワクチンの、及び／又は請求項２４の医薬組成物の免疫学的有効量を、動物に、好ましくはヒトに、投与することを含む、方法。
  26. 動物、好ましくはヒトの糖尿病、好ましくは２型糖尿病の治療用医薬の製造における、請求項１から２０の何れか一つの組成物の、請求項２１から２３の何れか一つのワクチンの、及び／又は請求項２４に記載の医薬組成物の使用。
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