KR101371840B1 - 세포 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 칩상에 유지된 1만을 넘는 항원 자극에 대한 림프구의 반응성을 동시에 측정하여, 각 세포에 대해서 그 상태를 개별적으로 파악할 수 있는 방법 및 이의 방법으로 사용하는 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 기재의 일측 주표면에 복수의 웰을 가지며, 상기 웰은 1개의 세포만이 들어가는 크기인 마이크로 웰 어레이이다. 웰의 주변의 주표면에, 웰에 수용되는 세포가 생산하는 물질과 결합성을 가지는 물질의 피복층을 가진다. 상기 마이크로 웰 어레이의 웰에, 피검사대상 물체 세포를 세포의 배양액과 함께 수용하고, 피복층 및 웰을 배양액에 침지하여 배양액에 포함되는 물질의 웰로부터 피복층으로의 확산이 가능한 상태로 세포를 배양하고, 피검사대상 물체 세포에 포함되는 목적 세포에 의해 생산되는 물질에 특이적으로 결합하는 표식 물질을 피복층에 공급하여 피복층의 물질에 결합한, 목적 세포에 의해 생산된 물질을 표식 물질에 의해 검출하고, 목적 세포를 특정하는 목적 세포의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

세포 스크리닝 방법{Cell screening method}
본 출원은, 2007년 8월 2일 출원한 일본 특원 2007－201493호의 우선권을 주장하고, 그 모든 기재는 여기에 특히 개시로서 원용된다.
본 발명은, 세포의 스크리닝 방법 및 이의 방법에서 사용하는 마이크로 웰 어레이에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 특이적 면역 글로블린 생산 세포 및 특이적 사이트카인 생산 세포 등의 면역 세포의 스크리닝 방법 및 이의 방법에 사용하는 마이크로 웰 어레이에 관한 것이다.
종래, 모노 클로날 항체를 제조하기 위해서, 항원 특이적 항체 생산 하이브리도마(hybridoma)가 제작되고 있다. 종래의 하이브리도마의 제작 방법에서는, 하이브리도마를 제작한 후에 항원 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝 한다. 그러나, 하이브리도마의 제작은 효율이 좋은 것은 아니다. 즉, 모든 B림프구가 하이브리도마가 되는 것은 아니고, 골수종(myeloma)과 세포 융합을 일으킨 B림프구의 일부가 하이브리도마가 되기 때문이다. 또, 항원으로 자극한 비장 세포를 사용하여 하이브리도마를 제작하여도, 항원 특이적 항체 생산 하이브리도마만이 만들어지는 것은 아니며, 만들어지는 하이브리도의 대부분은 관계없는 항체를 생산하고 있거나, 항체 자신을 생산하고 있지 않다.
예를 들면, 종래의 방법으로 목적의 항체를 생산하고 있는 하이브리도마를 찾아내려고 하는 경우, 면역된 마우스로부터 취해 온 비장세포를 사용하여 골수종과의 세포 융합을 실시하고, 96 웰 플레이트 10매 정도 뿌린다. 모든 세포를 사용하면 좀 더 뿌릴 수 있지만, 혼자서 스크리닝을 실시하는 경우는 시간적 제한이 있어, 나머지는 냉동하여 보존한다. 이 방법에 의해, 통상 500개 정도의 웰의 하이브리도마를 증식한다.
그러나, 500개의 웰로부터 하이브리도마가 모두 동일하게 스피드 있게 증식되는 것은 아니고, 빨리 증식하는 것도 있으면 천천히 증식하는 것도 있다. 따라서, 500개 전부의 증식을 동시에 체크할 수 없다. 우선, 현미경하에서 어느 웰에서부터 세포가 증식되고 있는지, 항체를 체크하는데 적합한 세포수까지 증식되고 있는지를 체크한다. 또한, 적당한 웰에서부터 세포 상등액을 채취하고, 항원 특이적 항체를 생산하고 있는지를 체크한다. 이 세포의 체크와 세포 상등액의 체크는 빠르게 실시할 필요가 있다. 이것은, 하이브리도마는 점점 증식하므로, 방치하면 너무 증식하여 배양지의 영양상태가 나빠져서 사멸하기 때문이다. 따라서, 원하는 하이브리도마가 죽어 버리지 않을 동안에 스크리닝을 종료해야한다.
또, 목적의 하이브리도마가 증식하고 있는 웰이 발견되었을 경우, 그 웰에는 통상, 목적의 항체를 생산하고 있는 하이브리도마 외에 다른 항체를 생산하고 있는 하이브리도마가 증식하고 있는 것이 종종 있다. 또, 하이브리도마 자체 염색체를 떨어뜨리면서 증식하기 때문에, 항체를 생산하고 있었던 하이브리도마가 항체의 염색체를 상실해 버림으로써 항체를 만들지 않게 되는 경우도 있다. 이러한 세포의 증식은 통상, 항체를 생산하고 있는 하이브리도마보다 빠른 것이 많고, 방치하면 배양하고 있는 세포의 대부분이 항체를 생산하고 있지 않는 세포가 되어 버린다. 따라서, 원하는 하이브리도마가 증식하고 있는 웰이 발견되자마자 그 웰의 세포를 96 웰 플레이트에 1개의 세포가 1개의 웰이 되도록 다시 뿌리고(한계 희석법), 다시 한번, 바라는 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝을 다시 한다(2차 스크리닝). 목적의 하이브리도마를 검출 후, 2차 스크리닝까지를 신속하게 세포의 상태가 나쁘게 되지 않을 동안에 종료할 필요가 있다.
상기와 같이, 모든 제작한 하이브리도마를 스크리닝하지 않고, 일부만을 사용하여 스크리닝하는 일이 있으므로, 빈도가 낮은 항원 특이적 항체 생산 하이브리도마를 얻는 것은 어려워진다.
보다 구체적으로는, 사람의 항원 특이적 항체의 경우, 말초 B림프구를 EB바이러스로 형질 전환하여 성장시켜서 항원 특이적 항체를 생산 세포를 스크리닝하는 방법이 있다(비특허 문헌 1). 이 방법의 경우, 수립할 수 있는 림프구 세포주의 빈도가 낮기 때문에, 항원 특이적 항체 생산 B림프구 세포주를 얻을 수 있는 확률은 매우 낮다. 또, 세포주의 수립에 1개월 정도의 시간이 걸린다. 또한 수립된 B림프구 세포주가 생산하는 항체량은 적다. 마우스의 경우는 하이브리도마를 제작할 수 있지만, 사람의 경우는 효율이 좋은 하이브리도마의 계는 작성되어 있지 않다.
마우스의 경우, 하이브리도마를 제작할 수가 있다. 종래, 하이브리도마의 제작은 마우스를 항원으로 면역하고, 그 마우스로부터 비장 또는 림프절을 꺼내어 림프구를 조제하고, 조제한 약 108개의 림프구와 약 107개의 골수종 세포를 폴리에틸렌 글리콜을 사용하고, 또는 전압을 걸음으로써 융합시켜서, HAT 등의 선택 배양지에서 배양하여 증식해 온 하이브리도마가 항원 특이적 항체를 생산하고 있는지를 ELISA, 유세포 측정법(flow cytometry) 등을 사용하여 스크리닝하고, 항원 특이적 항체 생산하고 있는 하이브리도마를 선택한다(비특허 문헌 2, 3). 이 방법을 사용하는 것으로, 300∼400 웰로부터 하이브리도마가 증식하지만, 그 중에 항원 특이적 항체를 생산하고 있는 하이브리도마가 증식하고 있는 웰은 수%이다. 이 수는 사용한 항원에 따라서 다르지만, 항원 특이적 항체 생산 B림프구의 빈도가 낮은 경우, 이 방법으로 하이브리도마를 제작하는 것은 곤란하다.
따라서, 본 발명자들은, 빈도가 비교적 높은 항원 특이적 림프구는 물론이고 빈도가 낮은 항원 특이적 림프구에 있어서도, 간편하게 특정의 항원에 특이적으로 반응하는 림프구를 선택하고, 이 선택된 항원 특이적 B림프구로부터 항원 특이적 항체 생산 하이브리도마를 제작하는 방법을 검토하고, 어느 항원에 특이적으로 반응하는 B림프구(항원 특이적 B림프구)를 1개 선택하여 선택한 항원 특이적 B림프구를 배양하고, 배양에 의해 증식한 항원 특이적 B림프구를 골수종 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제작하는 것을 포함하는, 항원 특이적 항체를 생산하고 있는 하이브리도마의 제작 방법을 완성하여 먼저 특허 출원하였다 (특허 문헌 1).
또, 세포를 하나하나의 레벨로 특정하여 선별하고, 선별된 세포를 사용하는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면, 하나하나의 림프구의 항원 특이성을 개별적으로 검출하고, 다시 검출된 1개의 항원 특이적 림프구를 회수하고, 회수된 1개의 항원 특이적 림프구를 사용하고, 예를 들면, 항체를 제조하는 것이 검토되고 있다(특허 문헌 2, 3).
WO2004/087911 JP 2004-173681 A JP 2004-187676 A
림프구 기능 검색법(개정 5판) 야노 준이치, 후지와라 미치오 편저, 츄가이 이가쿠샤, 1994년, 「인간 모노 클로날 항체 제작에의 EB바이러스 트랜스 폼 B세포의 사용」미즈노 후미오, 오사토 토시로, pp381－391) 림프구 기능 검색법(개정 5판) 야노 준이치, 후지와라 미치오 편저, 츄가이 이가쿠샤, 1994년, 「B세포 하이브리도마에 의한 모노 클로날 항체 제작법」나리우치 히데오, pp574－576 Monoclonal antibodies in "Antibodies: A Laboratory Manual" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp139-pp244, 1988 In vitro antibody production. In Current Protocols in Immunology. Edited by J.E. Coligan et al., John Wiley & Sons (New York), p. 3.8. 1-3. 8.16, 1991. Babcook, J. S., Leslie, K. B., Olsen, O. A., Salmon, R. A., Schrader, J. W. A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Proc Natl Acad Sci U S A, 93: 7843-7848, 1996. Measurement of polyclonal immunoglobulin synthesis using the ELISPOT assay. In Current Protocols in Immunology. Edited by J.E. Coligan et al., John Wiley & Sons (New York), p. 7.14. 1-7. 14.7, 1991. Assays for antibody production. In Current Protocols in Immunology. Edited by J.E. Coligan et al., John Wiley & Sons (New York), p. 2.1. 1-2. 1.22, 1991. J.C. Love, J.L. Ronan, G.M. Grotenbreg, A.G. van der Veen, H.L. Ploegh, A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature Biotechnology, 24: 703-707, 2006.
상기 특허 문헌 1∼3 및 비특허 문헌 1∼8의 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다.
상술한 종래 법에서는, 매뉴얼에서 하나하나의 림프구의 항원 특이성을 개별적으로 검출하고, 다시 검출된 항원 특이적 림프구를 회수하고 있었다. 특허 문헌 2 및 3에서는, 세포 단위로 세포를 특정하는 것이 확인되었다고 기재되고, 또한, 특정된 세포를 회수하는 것도 가능하다라고 기재되어 있다. 그러나 실제로 항원에 특이적으로 반응한 림프구를 다수의 림프구로부터 검출하는 것은 용이하지 않았다.
검출법으로서는, 예를 들면, 항원에 반응한 림프구에 있어서의 칼슘 이온 농도가 상승하는 것을 이용하여 칼슘 이온 농도의 변화를 형광으로서 검출하고, 항원 특이적 림프구를 특정하고 있다. 그러나 세포(림프구)의 종류에 의해 형광의 발생의 방법이나 강도 등이 반드시 일정하지 않고, 항원 자극을 받으면 즉석에서 칼슘 이온 농도가 상승하고, 그 결과, 형광 강도도 커지는 림프구도 있지만, 항원 자극 후 일정시간 경과 후에 칼슘 이온 농도가 상승하며, 그 결과, 형광 강도도 커지는 세포도 있다. 또, 수센치 사방의 칩 표면에 유지된 1∼20만 정도의 림프구의 형광 강도를 한 번에 거의 동시에 측정할 필요가 있고, 또한 형광이, 1개의 세포마다 기인하는 형광이기 때문에 형광 강도가 낮고, 고감도에서의 형광 검출일 필요도 있다.
그러나 지금까지, 그러한 고집적된 칩 표면상의 다수이면서 미약한 형광 강도를 동시에 측정할 수 있는 방법 및 장치는 존재하지 않았다.
종래부터 있는 장치로서는, 레이저 스캐닝·사이트 미터가 있으며, 레이저 스캐닝·사이트 미터를 사용하면, 수십만 개의 세포를 개개에 세포 내 칼슘 농도를 측정을 할 수 있다. 그러나 1회 스캔에 걸리는 시간은 10분 이상으로 길고, 항원 자극 후 몇 분에 형광 강도가 변화하는 림프구에 대한 검출에는 리얼 타임성이 부족하여 적합하지 않다.
형광 현미경·촬영 장치는, 통상의 형광 현미경에 촬영 장치를 겸비하는 것이다. 형광 현미경·촬영 장치는, 속도에는 문제가 없지만, 통상의 현미경이라면 촬영 범위가 좁고, 한 번에 최대 1000개 정도 밖에 검출하지 못하며, 수만∼수십 만개의 세포로부터의 형광을 한 번에 검출할 수 없었다.
DNA 마이크로 어레이 스캐너를 기본으로 한 세포 칩 검출 장치는, 세포 칩에 어레이 한 세포 형광을 검출하기 위해서 개발되어 세포 내 또는 세포 외 형광을 검출할 수 있는 장치이다. 그러나 레이저를 사용하여 형광 색소를 여기하고, 여기광을 검출하는 시스템이기 때문에, 시간 변화를 쫓는 검출계에서는 레이저에 의한 선스캔 속도가 늦고, 다수의 세포 영역의 동시 검출은 할 수 없다.
상술한 특허 문헌 2 및 3에 기재되어 있는 방법으로, 항원에 대해서 특이적으로 반응하는 세포를 검출하기에는, 반응 검출계에 있어서, 하나의 세포에 대해서 세포 내의 칼슘의 변화를 경시적으로 잡을 수가 있는 리얼 타임성과 다수의 세포 안에 매우 조금 존재(반응)하는 세포를 검출하는 필요성 때문에, 다수의 세포를 개별적으로 동시에 해석할 수 있는 병렬성이 요구된다.
따라서 본 발명의 목적은, 칩상에 보관 유지된 1만을 넘는, 바람직하게는 10만을 넘는 다수의 세포의 상태, 예를 들면, 항원 자극에 대한 림프구의 반응성을, 동시에 측정하여, 각 세포에 대해서 그 상태를 개별적으로 파악할 수 있는 방법을 제공하는 것에 있다.
B림프구는, 세포 표면에 1종류의 항체를 발현하고 있으며, 병원체(항원) 등이 몸에 침입했을 때에, 항원이 세포 표면의 항체에 결합함으로써, 활성화되어 증식·분화하고, 최종적으로 항체 분비 세포로 분화한다. 항체 분비 세포의 특정의 방법은 이미 다수 존재하지만, 1개의 항체 분비 세포를 특정하는 방법으로서는 플라크법과 ELISPOT(Enzyme-linked Immunospot) 법이 대표적이다.
플라크법은 적혈구를 이용하여, 항체 분비 세포 주위의 항원으로 표식한 적혈구에 항체가 결합하여 용혈을 일으키는 것을 지표에 항원 특이적 항체 분비 세포를 특정하는 방법이다(비특허 문헌 4). 플라크법을 사용하여 항원 특이적 항체 분비 세포를 검출하고, 항체 유전자를 회수하는 방법은 이미 실용화되고 있다(비특허 문헌 5).
ELISPOT법은 세포를 항원을 코트한 플레이트에 파종하고, 항체 분비 세포로부터 분비된 항체가 세포 주위의 항원에 결합하여 그것을 효소 표식 항Ig항체 등으로 검출하는 방법이다(비특허 문헌 6). ELISPOT법의 경우, 항원 특이적 항체의 세포 주위에의 결합을 효소 표식 항Ig항체로 검출할 때에 세포 자체는 씻겨져 버리므로, 항원 특이적 항체 분비 세포를 회수할 수 없다.
하이브리도마도 항체를 분비하는 세포이지만, 하이브리도마를 스크리닝할 때에는 통상 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)가 사용된다(비특허 문헌 7). 최근, 이 방법을 발전시켜서, 작은 웰에서 1개의 하이브리도마를 배양하고, 웰 중에 분비된 항체를 형광 표식된 항원 등을 사용하여 검출함으로써, 항원 특이적 항체 분비 세포를 검출하는 방법이 보고되었다(비특허 문헌 8).
본 발명자들은, 상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 비특허 문헌 4∼8에 기재의 방법과는 완전히 다른, 새로운 항원 특이적 항체 분비 세포 등의 면역 세포의 검출 방법을 제공하기 위하여 여러 가지 검토하여 본 발명을 완성시켰다.
이하, 상기 과제를 해결하기 위한 본 발명을 나타낸다.
[1] 기재(base member)의 일측 주표면에 복수의 웰을 가지며, 상기 웰은 1개의 세포만이 들어가는 크기인 마이크로 웰 어레이이고,
적어도 상기 웰의 주변의 상기 주표면의 적어도 일부에, 상기 웰에 수용되는 세포의 적어도 일부가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질의 피복층을 갖는 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
[2] 상기 마이크로 웰 어레이는, 상기 마이크로 웰 어레이의 적어도 일부의 웰에, 세포의 배양액과 함께 세포를 수용하고,
상기 피복층 및 웰을 배양액에 침지하여 배양액에 포함되는 물질의 웰로부터 상기 피복층으로의 확산할 수 있는 상태로 세포를 배양하고,
상기 배양 후의 배양액을 제거한 후에,
상기 웰 중에 수용된 세포의 적어도 일부로부터 생산되는 물질과, 상기 피복층의 물질과의 결합의 유무를 검출하기 위해서 사용되는 [1]에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[3] 상기 웰에 수용되는 세포의 적어도 일부는, 면역 글로블린 생산 세포 또는 사이트카인 생산 세포인 [1] 또는 [2]에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[4] 상기 웰에 수용되는 세포의 적어도 일부가, 면역 글로블린 생산 세포이며, 면역 글로블린 생산 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질이, 항 면역 글로블린 항체 또는 항원인 [1] 또는 [2]에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[5] 상기 결합의 유무의 검출은, 생산되는 면역 글로블린에 대한 항체 또는 항원을 사용하여 실시하는 [4]에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[6] 상기 웰에 수용되는 세포의 적어도 일부가, 사이트카인 생산 세포이고, 사이트카인 생산 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 가지는 물질이 항사이트카인 항체 또는 사이트카인 수용체인 [1] 또는 [2]에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[7] 상기 결합의 유무의 검출은, 생산되는 사이트카인에 대한 항체 또는 사이트카인 수용체를 사용하여 실시하는 [6]에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[8] 상기 웰에 수용되는 세포의 적어도 일부가, 면역 글로블린 생산 세포이고, 면역 글로블린 생산 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 가지는 물질이 사이트카인 수용체 또는 수용체인 [1] 또는 [2]에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[9] 상기 결합의 유무의 검출은, 사이트카인 또는 리간드를 사용하여 실시하는 [8]에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[10] 상기 면역 글로블린 생산 세포 및 사이트카인 생산하는 세포는, 천연형 세포 또는 하이브리도마인 [1]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[11] 상기 기재는 판형상인 [1]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[12] 상기 웰에 수용되는 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질의 피복층을 갖지 않는 상기 주 표면의 적어도 일부는, 블로킹제로 코팅되는 [1]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 마이크로 웰 어레이.
[13] 기재의 일측 주표면에 복수의 웰을 가지며, 상기 웰은 1개의 세포만이 들어가는 크기이고, 또한 적어도 상기 웰의 주변의 상기 주표면의 적어도 일부에, 목적 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질의 피복층을 갖는 마이크로 웰 어레이의 적어도 일부의 웰에 피검사대상 물체 세포를 세포의 배양액과 함께 수용하고,
상기 피복층 및 웰을 배양액에 침지하여 배양액에 포함되는 물질의 웰로부터 상기 피복층으로의 확산이 가능한 상태로 세포를 배양하며,
임의로 배양액을 제거한 후에, 피검사대상 물체 세포에 포함되는 목적 세포에 의해 생산되는 물질에 특이적으로 결합하는 표식 물질을, 상기 피복층에 공급하고,
상기 피복층의 물질에 결합한 목적 세포에 의해 생산된 물질을 상기 표식 물질에 의해 검출하여 목적 세포를 특정하는 것을 포함하는 목적 세포의 스크리닝 방법.
[14] 상기 피검사대상 물체 세포를 포함한 세포는, 미리 소망한 항원으로 자극을 주어 물질을 생산할 수 있는 상태에 있는 세포를 포함하는 [13]에 기재된 스크리닝 방법.
[15] 상기 피검사대상 물체 세포는, 면역 글로블린 생산 세포, 또는 사이트카인 생산 세포를 포함하는 [13] 또는 14에 기재된 스크리닝 방법.
[16] 상기 피검사대상 물체 세포가, 면역 글로블린 생산 세포를 포함하고, 목적 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질이, 항면역 글로블린 항체 또는 항원이고, 목적 세포가 항원 특이적 면역 글로블린 생산 세포인 [13] 또는 [14]에 기재된 스크리닝 방법.
[17] 상기 결합의 유무의 검출은, 생산되는 면역 글로블린에 대한 항체 또는 항원을 사용하여 실시하는 [16]에 기재된 스크리닝 방법.
[18] 상기 피검사대상 물체 세포가, 면역 글로블린 생산 세포를 포함하고, 목적 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질이, 사이트카인 수용체 또는 수용체이고, 목적 세포가 항원 특이적 면역 글로블린 생산 세포인 [13] 또는 [14]에 기재된 스크리닝 방법.
[19] 상기 결합의 유무의 검출은 사이트카인 또는 리간드를 사용하여 실시하는 [18] 에 기재된 스크리닝 방법.
[20] 상기 피검사대상 물체 세포가, 사이트카인 생산 세포를 포함하고, 목적 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 가지는 물질이, 항사이트카인 항체, 또는 사이트카인 수용체이고, 목적 세포가 항원 특이적 사이트카인 생산 세포인 [13] 또는 [14]에 기재된 스크리닝 방법.
[21] 상기 결합의 유무의 검출은, 생산되는 사이트카인에 대한 항체 또는 사이트카인 수용체를 사용하여 실시하는 [20]에 기재된 스크리닝 방법.
[22] 상기 면역 글로블린 생산 세포 및 사이트카인 생산 세포는, 천연형 세포, 하이브리도마, 또는 세포주인 [13]∼[21] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법.
[23] [13]∼[22] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법으로 특정한 목적 세포를 웰로부터 회수하는 것을 포함한 목적 세포의 제조 방법.
[24] 상기 목적 세포가 특이적 면역 글로블린 생산 세포 또는 특이적 사이트카인 생산 세포인 [23]에 기재의 제조 방법.
본 발명에 의하면, 칩상에 유지된 예를 들면, 1만을 넘는, 바람직하게는 10만을 넘는 다수의 세포의 상태, 예를 들면, 항원 자극에 대한 림프구의 반응성을 동시에 측정하고, 각 세포에 대해서 그 상태를 개별적으로 파악할 수 있는 방법과 수단을 제공할 수가 있다.
본 발명은, 특이적 면역 글로블린 생산 세포 및 특이적 사이트카인 생산 세포 등의 면역 세포의 스크리닝 방법으로 관련하는 기술 분야, 예를 들면, 항체 의약 등의 면역 관련 의약 또는 진단 의학 분야에 유용하다.
도 1은 웰의 형상과 표식 물질로부터의 시그널의 형상의 관계를 나타내는 도면이다.
도 2는 항체 분비 세포를 사용했을 경우를 예로 한 본 발명의 방법의 설명도이다.
도 3은 표식 물질이 생산하고 있는 물질과 특이적으로 결합하는 물질인 경우 (1)의 본 발명의 방법의 설명도이다.
도 4a는 제작예 1의 설명도이다.
도 4b는 제작예 1의 설명도이다.
도 5a는 제작예 2의 설명도이다.
도 5b는 제작예 2의 설명도이다.
도 5c는 제작예 2의 설명도이다.
도 6a는 제작예 3의 설명도이다.
도 6b는 제작예 3의 설명도이다.
도 7a는 제작예 4의 설명도이다.
도 7b는 제작예 4의 설명도이다.
도 7c는 제작예 4의 설명도이다.
도 8은 표면 처리 방법의 설명도이다.
도 9는 칩의 습도를 유지하는 보습상자의 설명도이다.
도 10은 실시예 1에 있어서의 항원 특이적 항체를 분비하고 있는 세포가 들어가 있는 웰 위치의 확인 결과이다. A는 Cy3의 시그널에서 분비된 항원 특이적 항체를 검출. B는 Oregon Green에서 세포를 관찰.
도 11은 실시예 1에 있어서의 본 발명의 방법(FLISPOT법)을 사용한 항원 특이적 항체 분비 세포의 마이크로 웰 어레이 칩상에서의 분류 결과이다.
도 12는 실시예 2에 있어서의 본 발명의 방법(FLISPOT법)을 사용한 HEL를 면역한 마우스 비장 세포 중의 HEL 특이적 항체 분비 세포의 검출 결과이다.
도 13은 실시예 2에 있어서의 본 발명의 방법(FLISPOT법)을 사용한 사람 말초피림프구중의 HBs 항원 특이적 항체 분비 세포의 검출 결과이다.
도 14는 실시예 3의 결과이다.
도 15는 실시예 4(사이트카인 생산 세포의 검출)의 결과이다.
도 16은 실시예 6(기능적 항체의 스크리닝에의 응용)의 결과이다.
［마이크로 웰 어레이］
본 발명의 마이크로 웰 어레이는, 기재의 일측 주표면에 복수의 웰을 가지며, 웰은 1개의 세포만이 들어가는 크기인 마이크로 웰 어레이이다. 이러한 구조를 갖는 마이크로 웰 어레이는, 예를 들면, 상기 특허 문헌 1∼3에 기재되어 있는 것을 그대로 사용할 수가 있다.
마이크로 웰 어레이 칩에는, 예를 들면, 복수의 마이크로 웰이 동일 간격으로 종횡으로 배치되고 있다.
마이크로 웰의 형상이나 치수에는 특별히 제한은 없지만, 마이크로 웰의 형상은, 예를 들면, 원통형일 수가 있으며, 원통형 이외에, 복수의 면에 의해 구성되는 다면체(예를 들면, 직방체, 육각 기둥, 팔각기둥 등), 역원추형, 역각뿔형(역삼각뿔형, 역사각뿔형, 역오각추형, 역육각추형, 7각 이상의 역다각추형) 등일 수도 있고, 이들 형상을 2개 이상을 조합한 형상일 수도 있다. 예를 들면, 일부가 원통형이고, 나머지가 역원추형일 수가 있다. 또, 역원추형, 역각뿔형의 경우, 저면이 마이크로 웰의 개구가 되지만, 역원추형, 역각뿔형의 정상에서 일부를 잘라낸 형상일 수도 있다(이 경우, 마이크로 웰의 바닥부는 평탄하게 된다). 원통형, 직방체는 마이크로 웰의 바닥부는 통상, 평탄하지만, 곡면(철면이나 요면)으로 할 수도 있다. 마이크로 웰의 바닥부를 곡면으로 할 수 있는 것은, 역원추형, 역각뿔형의 정상에서 일부를 잘라낸 형상의 경우도 마찬가지이다.
마이크로 웰이 원통형의 경우, 그 치수는, 예를 들면, 직경 3∼100㎛일 수 있으며, 생체 세포가 B림프구의 경우, 바람직하게는, 직경은 4∼15㎛이다. 또, 깊이는 예를 들면, 3∼100㎛일 수 있고, 생체 세포가 B림프구의 경우, 바람직하게는, 깊이는 4∼40㎛일 수가 있다. 단, 마이크로 웰의 치수는, 상기에서 설명한 바와 같이, 마이크로 웰에 수용하려고 하는 생체 세포의 직경과의 마이크로 웰의 치수의 매우 적합한 비를 고려하여 적절히 결정한다.
마이크로 웰의 형상이나 치수는, 마이크로 웰에 수용되어야 할 생체 세포의 종류(생체 세포의 형상이나 치수 등)를 고려하여, 1개의 마이크로 웰에 1개의 생체 세포가 수용되도록 적당히 결정된다.
1개의 마이크로 웰에 1개의 생체 세포가 수용되도록 하기 위해서는, 예를 들면, 마이크로 웰의 평면 형상에 내접하는 최대 원의 직경이, 마이크로 웰에 수용하려고 하는 생체 세포의 직경의 0.5∼2배의 범위, 바람직하게는 0.8∼1.9배의 범위, 더욱 바람직하게는 0.8∼1.8배의 범위인 것이 적당하다.
또, 마이크로 웰의 깊이는, 마이크로 웰에 수용하려고 하는 생체 세포의 직경의 0.5∼4배의 범위, 바람직하게는 0.8∼1.9배의 범위, 더욱 바람직하게는 0.8∼1.8배의 범위인 것이 적당하다.
1개의 마이크로 웰 어레이 칩이 갖는 마이크로 웰의 수는, 특별히 제한은 없지만, 생체 세포가 림프구의 경우, 항원 특이적 림프구의 빈도가 105개에 1개로부터 많은 경우에는 약 500개라는 관점에서, 1㎠당, 예를 들면, 2,000∼1,000,000개의 범위일 수가 있다.
또한, 본 발명의 마이크로 웰 어레이는, 적어도 상기 웰의 주변의 상기 주표면의 적어도 일부에, 상기 웰에 수용되는 세포의 적어도 일부가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질의 피복층을 가진다. 이 점이 본 발명의 마이크로 웰 어레이의 특징이다.
본 발명의 마이크로 웰 어레이는, 기재가 플레이트일 수가 있고(플레이트로 한정되는 의도는 아님), 기체의 주표면에 설치된 복수의 웰의 주변의 주표면의 적어도 일부에 상기 피복층을 설치한다. 본 발명의 마이크로 웰 어레이는, 웰 중에 수용된 세포의 적어도 일부로부터 생산되는 물질과 피복층의 물성과의 결합의 유무를 검출하기 위해서 사용된다.
웰에 수용되는 세포(피검사대상 물체 세포)는, 예를 들면, 면역 글로블린 생산 세포, 또는 사이트카인 생산 세포를 포함한 세포군일 수가 있다. 또한, 면역 글로블린 생산 세포 및 사이트카인 생산 세포는, 천연형 세포, 하이브리도마 또는 세포주일 수가 있다. 천연형 세포는, 포유동물, 예를 들면, 사람, 마우스 등으로부터 채취한 세포일 수 있으며, 하이브리도마는 배경 기술에서 설명한 통상의 법에 의해 작성한 것일 수가 있다. 세포주는 발현형 cDNA 라이블러리 등을 유전자 도입한 것일 수가 있다.
웰에 수용되는 세포가, 면역 글로블린 생산 세포를 포함한 피검사대상 물체 세포일 때는, 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질로서 면역 글로블린 생산 세포가 생산하는 물질인 면역 글로블린과 반응할 수 있는 항 면역 글로블린 항체 또는 항원을 사용한다. 그리고 상기 결합의 유무의 검출은 생산되는 면역 글로블린에 대한 항체 또는 항원을 사용하여 실시한다.
웰에 수용되는 세포가, 사이트카인 생산 세포를 포함한 피검사대상 물체 세포일 수도 있고, 이 경우, 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질로서는, 사이트카인 생산 세포가 생산하는 물질인 사이트 카인과 반응할 수 있는 항사이트카인 항체, 또는 사이트카인 수용체를 사용한다. 그리고 결합의 유무의 검출은 생산되는 사이트카인에 대한 항체 또는 사이트카인 수용체를 사용하여 실시한다.
또는, 웰에 수용되는 세포가, 면역 글로블린 생산 세포를 포함한 피검사대상 물체 세포일 때는, 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 가지는 물질이, 면역 글로블린 생산 세포가 생산하는 물질인 면역 글로블린과 반응할 수 있는 사이트카인 수용체 또는 수용체일 수도 있다. 이 경우, 결합의 유무의 검출은, 사이트카인 수용체 또는 수용체에 반응할 수 있는 사이트카인 또는 리간드를 사용하여 실시한다. 생산되는 면역 글로블린은 사이트카인 수용체 또는 수용체와 결합하면, 결합의 유무의 검출에 사용하는 사이트카인 또는 리간드와의 결합을 블록하여 결합의 유무를 검출할 수 있다.
(1) 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질(결합성 물질),
(2) 웰에 수용되는 세포(피검사대상 물체 세포),
(3) 세포가 생산하는 물질(생산하고 있는 물질) 및
(4) 생산하고 있는 물질을 분류하기 위한 표식 물질(표식 물질)
의 예를 하기 표 1에 나타낸다.
또한, 생산하고 있는 물질을 분류하기 위한 물질을 표식하는 물질은, 예를 들면, 형광 물질일 수가 있다. 단, 형광 물질로 한정되지 않고, 다른 표식 물질일 수 있다. 또, 표식 물질인 항원이나 항체 등의 형광 물질에서의 표식은 공지의 방법을 사용하여 실시할 수가 있다. 또, 표식 물질은, 생산하고 있는 물질과 특이적으로 결합하는 물질인 경우와 결합성 물질과 특이적으로 결합하는 물질인 경우가 있다.
결합성 물질 세포 생산하고 있는 물질 표식 물질
항 면역 글로블린 항체 B림프구 면역 글로블린(항체) IgG, IgM, IgA, IgE 등 모든 항체 항원
항 면역 글로블린 항체 B림프구 면역 글로블린(항체) IgG, IgM, IgA, IgE 등 모든 항체 항 면역 글로블린 항체
항IgG 항체 B림프구 IgG 항원
항IgG 항체 B림프구 IgG 항IgG 항체
항IgM 항체 B림프구 IgM 항원
항IgM 항체 B림프구 IgM 항IgM 항체
항IgA 항체 B림프구 IgA 항원
항IgA 항체 B림프구 IgA 항IgA 항체
항IgE 항체 B림프구 IgE 항원
항IgE 항체 B림프구 IgE 항IgE 항체
항사이트카인 항체 T림프구, 그 외 사이트카인 항사이트카인 항체
항사이트카인 항체 T림프구, 그 외 사이트카인 (가용성) 사이트카인 수용체
(가용성) 사이트카인 수용체 T림프구, 그 외 사이트카인 항사이트카인 항체
항원 B림프구 IgG 항IgG 항체
항원 B림프구 IgM 항IgM 항체
항원 B림프구 IgA 항IgA 항체
항원 B림프구 IgE 항IgE 항체
(가용성) 사이트카인 수용체 B림프구 항체 사이트카인*
(가용성) 수용체 B림프구 항체 리간드**
*사이트 카인의 결합을 블록하는 항체의 검출
**리간드의 결합을 블록하는 항체의 검출
결합성 물질의 피복층의 형성은, 기판의 피복층을 형성하는 주 표면을, 결합성 물질과 주 표면과의 결합성을 확보하기 위하여, 예를 들면, 실란 커플링제로 표면처리하고, 이어서, 결합성 물질을 함유하는 용액을 실란 커플링제 처리한 표면에 적용하는 것으로 형성할 수 있다. 피복층에 있어서의 결합성 물질의 피복량은 결합성 물질의 종류나 세포 및 생산물질의 종류, 또한 표식물질의 종류에 따라서 적절히 결정할 수 있다. 또한, 결합성 물질과 주 표면과의 결합성을 확보하기 위한 표면처리는 실란 커플링제 처리로 한정하지 않고, 단백질 등으로 이루어지는 결합성 물질과 무기재료(예를 들면, 실리콘 재료) 또는 유기재료(예를 들면, 폴리머 재료)로 이루어지는 기판표면과의 결합을 촉진하는 물질이라면 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
결합성 물질을 피복하는 표면은 피복량에 의해서는 결합성 물질이 치밀하게 피복되지 않고, 미피복의 표면의 존재하는 경우가 있다. 그 경우, 특히 상기와 같의 실란 커플링제 처리한 표면인 경우, 세포가 생산한 물질이 기판의 표면에 비선택적으로 결합하는 경우가 있다. 이와 같은 비특이적 결합은 검출의 감도의 정도를 저하시키는 원인이 된다. 따라서, 본 발명에서는 웰에 수용되는 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질의 피복층을 갖지 않는 상기 주표면의 적어도 일부는, 블록킹제로 코트되어 있는 것이 바람직하다. 블록킹제로서는 예를 들면, 세포막을 구성하는 포스파티딜콜린의 극성기와 동일한 구조를 갖는 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(MPC)을 구성 단위로 하는 수용성 폴리머 LIPIDURE(등록 상표)(리피듀아(등록상표))를 들 수가 있다.
［스크리닝 방법］
본 발명의 스크리닝 방법은, 상기 본 발명의 마이크로 웰 어레이를 사용하여 피검사대상 물체 세포를 포함한 세포군으로부터, 목적 세포 스크리닝하는 방법으로, 이하의 공정을 포함한다.
(1) 마이크로 웰 어레이의 적어도 일부의 웰에, 피검사대상 물체 세포를 세포의 배양액과 함께 수용한다.
(2) 피복층 및 웰을 배양액에 침지하고, 배양액에 포함되는 물질의 웰로부터 피복층으로의 확산이 가능한 상태로 세포를 임의의 시간 배양한다.
(3) 배양액을 제거한 후에, 피검사대상 물체 세포에 포함되는 목적 세포에 의해 생산되는 물질에 특이적으로 결합하는 표식 물질을 피복층에 공급한다.
(4) 피복층의 물질에 결합한, 목적 세포에 의해 생산하고 있는 또는 분비된 물질을 표식 물질에 의해 검출하여 목적 세포를 특정한다.
본 발명의 스크리닝 방법으로 사용하는 (1) 세포가 생산하는 물질의 적어도 일부와 결합성을 갖는 물질(결합성 물질), (2) 웰에 수용되는 세포(피검사대상 물체 세포), (3) 세포가 생산하는 물질(생산하고 있는 물질) 및 (4) 표식된 생산물질을 분류하는 물질(표식 분류 물질)은 본 발명의 마이크로 웰 어레이에 있어서 설명한 것과 동일하고, 표 1에 나타내는 것을 예로서 들 수가 있다.
공정(1)
마이크로 웰 어레이의 적어도 일부의 웰에, 피검사대상 물체 세포를 포함한 세포(세포군)를 세포의 배양액과 함께 수용한다. 세포를 수용하기 전에는, 마이크로 웰 어레이의 웰과 그 주변을 배양지에서 세정하고, 결합성 물질의 피복층을 형성했을 때에 표면에 부착한 불순물을 충분히 제거하는 것이 정밀도를 좋게 검출하기 위해서 바람직하다. 세포는 배양액과 함께 웰에 수용한다. 웰에 수용되는 피검사대상 물체 세포는 면역 글로블린 생산 세포, 또는 사이트카인 생산 세포를 포함한 세포군일 수가 있고, 또한 면역 글로블린 생산 세포 및 사이트카인 생산 세포는 천연형 세포 또는 하이브리도마일 수가 있다. 이들의 세포군은 공지의 방법을 사용하여 얻을 수가 있다.
웰에 수용되는 세포는, 미리 소망한 항원으로 자극을 주어 물질을 생산할 수 있는 상태에 있는 세포일 수가 있다. 예를 들면, 면역 글로블린 생산 세포의 경우, 사전에 소망한 항원으로 자극을 주고 면역 글로블린을 생산할 수 있는 상태에 있는 세포인 것이 바람직하다. 동일하게, 사이트카인 생산 세포의 경우, 미리 원하는 항원으로 자극을 주고 사이트카인을 생산할 수 있는 상태에 있는 세포인 것이 바람직하다. 원하는 항원에는, 특별히 제한은 없고, 여러 가지의 단백질, 당류, 지방질, 핵산, 유기 화합물, 무기 화합물, 또 이들 조합(세포를 포함한다) 등으로부터 원하는 것을 적절히 선택할 수가 있다. 배양액은 수용되어 검출되는 세포의 종류에 따라 적절히 결정할 수 있다.
공정(2)
피복층 및 웰을 배양액에 침지하고, 배양액에 포함되는 물질의 웰로부터 피복층으로의 확산이 가능한 상태로 세포를 배양한다. 배양에 의해 세포가 물질을 생산하고, 생산된 물질이 배양액에 방출되어 웰로부터 웰 주변의 피복층에 확산한다. 확산하여, 피복층에 도달한 생산 물질은, 피복층을 구성하는 결합성 물질과 결합한다. 배양 조건은, 세포의 종류에 따라 적절히 결정할 수 있고, 배양 시간은 피복층을 구성하는 결합성 물질과 결합한 생산 물질의 양이 검출 가능한 레벨이 되도록 적절히 결정할 수 있다. 물질을 생산하지 않는 세포를 수용한 웰 주변의 피복층에서는 생산 물질과 결합성 물질과의 결합은 생기지 않는다. 또한, 배양 시간이 너무 길면, 생산 물질이 너무 넓게 확산하여, 생산 물질을 생산하는 세포를 수용한 웰의 특정이 곤란해지는 경우가 있으므로, 배양 시간은 생산 물질을 생산하는 세포를 수용한 웰의 특정이 용이하게 실시될 수 있는 범위에서 적절히 결정하는 것이 바람직하다.
공정(3)
상기 배양 종료 후, 임의로 배양액을 제거한 후에, 피검사대상 물체 세포에 포함되는 목적 세포에 의해 생산되는 물질에 특이적으로 결합하는 표식 물질을, 피복층에 공급한다. 목적 세포에 의해 생산 물질은, 배양중에 확산하여 피복층을 구성하는 결합성 물질과 결합하고 있고, 이 단계에서 상기 표식 물질을 공급하는 것으로, 표식 물질은 피복층에 결합한 생산 물질과 결합하거나, 또는, 피복층에 결합한 생산 물질로 블록되어 있지 않은 피복층과 결합한다. 전자의 경우는, 표식 물질은 생산 물질과 결합성을 갖는 경우이고, 후자의 경우는, 표식 물질은 생산 물질은 아니고, 피복층을 구성하는 결합성 물질과 결합성을 갖는 경우이다. 이 점의 상세한 것에 대하여는 후술한다.
표식 물질을 공급하기 전에, 배양액은 제거하는 것이 바람직하다. 배양액 중에는, 웰에 수용되는 세포가 예를 들면 면역 글로블린 생산 세포의 경우, 항체가 다량으로 분비되고 있으며, 그곳에 예를 들면 항면역 글로블린 항체를 더하면, 칩 표면의 항체에 결합하기 전에 배양액 중의 항체와 결합해 버려, 칩 표면에 결합한 항체의 검출을 할 수 없게 될 가능성이 있기 때문이다. 단, 세포와 결합성 물질과의 조합에 따라서는 배양액을 제거하는 일 없이 표식 물질을 피복층에 공급하여도 문제없이 검출이 가능한 경우도 있다.
공정(4)
피복층의 물질에 결합한, 목적 세포에 의해 생산된 물질을, 표식 물질에 의해 검출하고, 목적 세포를 특정한다. 표식 물질은, 피복층에 결합한 생산 물질과 결합하고 있으며, 거기서 표식 물질을 검출하는 것으로, 피복층에 결합하는 생산 물질을 생산 세포(목적 세포)를 특정할 수가 있다.
표식 물질이 생산 물질과 특이적으로 결합하는 물질인 경우, 웰로부터 웰 주변의 피복층에 확산하고, 피복층에 도달하여 피복층을 구성하는 결합성 물질과 결합한 생산 물질에는 표식 물질이 결합하고, 이 결합한 표식 물질을 검출한다. 한편, 물질을 생산하지 않는 웰 주변의 피복층에서는 생산 물질과 결합성 물질과의 결합은 생기지 않으며, 따라서, 표식 물질의 결합도 없고, 표식 물질의 검출은 없다.
표식 물질이 결합성 물질과 특이적으로 결합하는 물질인 경우, 웰로부터 웰 주변의 피복층에 확산하여, 피복층에 도달하여 피복층을 구성하는 결합성 물질과 결합한 생산 물질은, 표식 물질과 결합성 물질과의 결합을 블록한다. 한편, 생산 물질을 생산하지 않는 웰 주변의 피복층에서는 생산 물질과 결합성 물질과의 결합은 생기지 않고, 따라서, 표식 물질과 결합성 물질과의 결합은 블록되지 않으며, 표식 물질이 결합한다. 이 경우, 생산 물질을 생산하는 웰은, 표식 물질의 검출은 없고, 표식 물질이 검출되는 웰과 식별할 수 있다.
표식 물질은, 예를 들면, 형광 표식인 경우, 형광 현미경이나, 형광 이미지 스캐너, 이미지 리더 등을 사용하여 목적 세포를 특정할 수가 있다.
후술하는 실시예에 있어서, 주로 정육각형의 형상의 웰의 칩(도 1 왼쪽 아래)을 사용하고 있다. 이 경우, 시그널은 거의 동심원 형상으로 퍼져 간다(도 1 왼쪽 위). 그러나 도 1 오른쪽 아래에 나타내듯이 정육각형의 웰에 경사 방향에 슬릿이 들어가 있는 경우, 생산된 항체 등은, 슬릿의 방향으로도 퍼지기 때문에, 도 1 오른쪽 위에 나타내는 바와 같은 은하계와 같은 형태가 된다. 이와 같이, 생산물을 통해 얻어지는 표식 물질로부터의 시그널은 웰의 형상에 따라서 다른 형태가 된다.
표식 물질이 생산 물질과 특이적으로 결합하는 물질인 경우(1)
웰에 수용되는 피검사대상 물체 세포가, 면역 글로블린 생산 세포를 포함한 경우, 세포는 배양함으로써 면역 글로블린을 생산하고, 항면역 글로블린 항체 또는 항원을 결합성 물질로 한 피복층을 사용하면, 생산한 면역 글로블린은 피복층과 결합하여, 생산되어 피복층과 결합한 면역 글로블린은, 이 면역 글로블린에 대한 항체 또는 항원을 사용하여 검출할 수가 있다. 면역 글로블린을 생산하지 않는 세포, 즉, 주어진 항원 자극에서는 면역 글로블린을 생산하지 않는 세포를 수용한 웰의 주변에는, 이 웰로부터 확산한 면역 글로블린은 없고, 면역 글로블린을 산출하는 세포를 수용한 웰과 식별할 수 있다. 이렇게 하여, 목적 세포인 항원 특이적 면역 글로블린 생산 세포를 특정할 수가 있다.
보다 구체적으로는, 도 2를 사용하여 설명한다.
(A) 칩 표면에 항면역 글로블린(Ig) 항체를 결합시킨 실리콘제 마이크로 웰 어레이 칩의 각 웰에 항체 분비 세포를 분주(分注)한다.
(B) 세포를 배양하여 항체를 분비시킨다. 세포로부터 분비된 항체는 웰 주위의 항Ig항체에 결합한다.
(C) 그곳에 형광 표식된 항원을 첨가하면 항원은 웰 주위에 트랩된 항원 특이적 항체에 결합한다.
(D) 형광 현미경, 스캐너 등으로 관찰하면 항원 특이적 항체가 웰 주위에 도너츠 형상으로 퍼지고 있는 것이 관찰된다.
표식 물질이 생산하고 있는 물질과 특이적으로 결합하는 물질인 경우(2)
웰에 수용되는 피검사대상 물체 세포가, 사이트카인 생산 세포인 경우, 세포는 배양함으로써 사이트카인을 생산하고, 항사이트카인 항체, 또는 사이트카인 수용체를 결합성 물질로 한 피복층을 사용하면, 생산한 사이트카인은 피복층과 결합하고, 생산되어 피복층과 결합한 사이트카인은 이 사이트카인에 대한 항체 또는 사이트카인 수용체를 사용해 검출할 수가 있다. 사이트카인을 생산하지 않는 세포, 즉, 주어진 항원 자극에서는 사이트카인을 생산하지 않는 세포를 수용한 웰의 주변에는, 이 웰로부터 확산한 사이트카인은 없고, 사이트카인을 산출하는 세포를 수용한 웰과 식별할 수 있다. 이렇게 하여, 목적 세포로서 사이트카인 생산 세포를 특정할 수가 있다.
표식 물질이 결합성 물질과 특이적으로 결합하는 물질인 경우
웰에 수용되는 피검사대상 물체 세포가, 면역 글로블린 생산 세포인 경우, 세포는 배양함으로써 면역 글로블린을 생산하고, 사이트카인 수용체 또는 수용체를 결합성 물질로 한 피복층을 사용하면, 생산한 면역 글로블린의 일부는 피복층과 결합하고, 생산되어 피복층과 결합한 면역 글로블린의 일부는, 사이트카인 수용체 또는 수용체와 표식 물질인 사이트카인 또는 리간드와의 결합을 블록하여, 표식 물질은 면역 글로블린을 생산하는 세포를 수용 하는 웰의 주위에는 결합하지 않는다. 면역 글로블린을 생산하지 않는 세포, 즉, 주어진 항원 자극에서는 면역 글로블린을 생산하지 않는 세포를 수용한 웰의 주변에는, 이 웰로부터 확산한 면역 글로블린은 없고, 사이트카인 수용체 또는 수용체와 사이트카인 또는 리간드와의 결합은 블록되지 않으며, 또, 면역 글로블린은 생산하지만 해당 면역 글로블린이 사이트카인 수용체 내지 수용체에 결합하지 않는 세포를 수용한 웰의 주변, 또, 면역 글로블린을 생산하여 상기 면역 글로블린이 사이트카인 수용체 내지 수용체에 결합하지만 사이트카인 수용체 또는 수용체와 사이트카인 또는 리간드와의 결합을 블록하지 않는 세포를 수용한 웰의 주변에는, 웰로부터 확산한 면역 글로블린이 결합하고 있지만, 사이트카인 수용체 또는 수용체와 사이트카인 또는 리간드와의 결합은 블록되지 않고, 면역 글로블린을 산출하는 세포를 수용한 웰과 식별할 수 있다. 이렇게 하여, 목적 세포로서 항원 특이적 면역 글로블린 생산 세포를 특정할 수가 있다.
상기 방법을 도 3에 준하여 이하에 설명한다.
(A) 수용체를 칩 표면에 코트 한다.
(B) 항체 분비 세포를 마이크로 웰에 첨가하여 배양한다. 분비된 항체는 확산한다. 수용체 특이적 항체는 웰 주위의 수용체에 결합한다.
(C) 수용체에 결합한 항체가 수용체상의 리간드 결합 부위에 결합했을 경우에는 형광 표식 리간드는 수용체에 결합할 수 없다.
(D) 수용체에 결합한 항체가 수용체상의 리간드 결합 부위 이외로 결합했을 경우에는 형광 표식 리간드는 수용체에 결합할 수 있다.
[목적 세포의 제조 방법]
본 발명은, 본 발명의 스크리닝 방법으로 특정한 목적 세포를 웰로부터 회수하는 것을 포함한 목적 세포의 제조 방법을 포함한다. 목적 세포는, 특이적 면역 글로블린 생산 세포 또는 특이적 사이트카인 생산 세포일 수가 있다.
본 발명에서는, 또한 회수한 목적 세포로부터, 항원 특이적 면역 글로블린 유전자의 mRNA를 회수하여, 항체 cDNA를 발현시켜서, 항원 특이적 항체 단백질을 제작할 수가 있다. 또, 사이트카인을 생산한 세포보다 그 세포가 발현하고 있는 T세포 수용체 유전자의 mRNA를 회수하여, T세포 수용체 cDNA를 회수하고, 그것을 다른 세포에 도입함으로써 T세포 수용체 단백질을 발현시킬 수가 있다.
(실시예)
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명한다.
마이크로 웰 어레이 칩의 제작예를 나타낸다.
(제작예 1)
실리콘 기판을 사용한 제작예를 나타낸다. 도 4a는, 제작예 1에 의한 마이크로 웰 어레이 칩의 예이다. 또, 도 4b에 그 제작 공정예를 나타낸다.
(1) 실리콘 기판(1-b)에 산화막(1-a)을 형성한다.
(2) 기판상에 포토레지스트(1-c), 예를 들면 토쿄 오카 고교(주) OFPR-800을 도포, 노광기로 패턴 전사를 실시한다.
(3) 포토레지스트 1-c로부터 노출한 산화막(1-a)을 완충 불화수소산으로 에칭한다.
(4) 드라이 에칭, 웨트 에칭으로 깊이 10∼20미크론의 마이크로 웰(1-d)를 형성한다. 포토레지스트 1-c는 에칭 방법에 의해 적절히 제거한다.
(5) 항체가 얼룩 없이 결합하는 표면으로 하기 위해, 프라이머로 처리한다. 예를 들면, 시릴화 처리에 의해, 표면, 웰 내벽에 시릴기(1-e)를 형성한다. 또한, 본 처리에 있어서의 재료, 수단은 여러 가지의 것이 있으며, 본 제작예의 처리로 한정되는 것은 아니다.
(6) 본 발명에 의한 항체 분비 세포의 검출을 실시한다.
(제작예 2)
세포로부터 분비된 항체를 더욱 선명히 모니터링 하기 위해서, 웰 주위에 격벽을 설치하는 것도 가능하다. 도 5a에 그 외관, 도 5b에 그 제작예를 나타낸다.
(1) 실리콘 기판(2-b)상에 산화막(2-a)을 형성한다.
(2) 기판상에 포토레지스트(2-c), 예를 들면 토쿄 오카 고교(주) OFPR-800을 도포, 노광기에서 패턴 전사를 실시한다.
(3) 포토레지스트(2-c)로부터 노출한 산화막(2-a)을 완충 불화수소산에서 에칭한다.
(4) 포토레지스트(2-c)를 제거하고, 에칭으로 깊이 1∼5미크론의 오목형상 (2-d)을 제작한다.
(5) 기판상에 재차 포토레지스트(2-e), 예를 들면 토쿄 오카 고교(주) OFPR-800을 도포, 노광기로 패턴 전사를 실시한다. 오목형상이 깊을 때는, 토쿄 오카 고교(주) OMR-85등의 네가티브 레지스터를 사용할 수도 있다.
(6) 드라이 에칭 장치에서 깊이 10∼20미크론의 웰(2-f)을 형성한다.
(7) 항체가 얼룩 없이 결합하는 표면으로 하기 위해, 프라이머로 처리한다. 예를 들면, 시릴화 처리에 의해, 표면, 웰 내벽에 시릴기(2-g)를 형성한다. 또한, 본 처리에 있어서의 재료, 수단은 여러 가지의 것이 있으며, 본 제작예의 처리로 한정되는 것은 아니다.
(8) 본 발명에 의한 항체 분비 세포의 검출을 실시한다. 본 예에서는, 웰 주위에 항체의 확산 억제벽이 형성되기 때문에, 항체 확산에 의한 헝클어짐이 억제되어 화상 인식이 용이하게 된다.
도 5-3은 본 제작예에 의해 시험적으로 제작한 것이다.
(제작예 3)
웰 주위의 표면적을 늘리는 것으로, 분비된 항체를 보다 명확하게 관측하는 것도 가능하다. 표면적은, 예를 들면 다공질 실리콘 구조나 요철 구조를 형성하는 것에 의해 증가하는 것이 가능하다. 다공질 실리콘의 제작 방법은, 예를 들면 일본 특허공개공보 평6－21509호에 기재되어 있다. 요철 구조는, 예를 들면 에칭, 증착 등에 의해 제작 가능하다. 도 6a에 그 외관, 도 6b에 그 제작예를 나타낸다.
(1) 실리콘 기판(3-b)상에 산화막(3-a)을 형성한다.
(2) 기판상에 포토레지스트(3-c), 예를 들면 토쿄 오카 고교(주) OFPR-800을 도포, 노광기로 패턴 전사를 실시한다.
(3) 포토레지스트(3-c)로부터 노출한 산화막(3-a)을 완충 불화수소산에서 에칭한다.
(4) 노출 부분의 통로 표면적을 늘리기 위해, 예를 들면 다공질 구조(3-d)를 제작한다. 다공질 구조는, 양극 화성 처리 등에 의해 형성된다. 불화수소산과 초산의 혼합산에 의해 표면에 나노 구조를 제작할 수도 있다.
(5) 기판상에 재차 포토레지스트(3-e), 예를 들면 토쿄 오카 고교(주) OFPR-800을 도포, 노광기에서 패턴 전사를 실시하고, 드라이 에칭에 의해 깊이 10∼20미크론의 웰(3-f)을 형성한다.
(6) 항체가 얼룩 없이 결합하는 표면으로 하기 위해, 프라이머로 처리한다. 예를 들면, 시릴화 처리에 의해, 표면, 웰 내벽에 시릴기(3-g)를 형성한다. 또한, 본 처리에 있어서의 재료, 수단은 여러 가지의 것이 있고, 본 제작예의 처리로 한정되는 것은 아니다.
(7) 본 발명에 의한 항체 분비 세포의 검출을 실시한다. 본 예에서는, 웰 주위의 표면적 및 형광 표식 결합 밀도도 증가하기 때문에, 형광의 화상 인식이 용이하게 된다.
(제작예 4)
웰 주위에에만 국소적으로 존재시켜서 항체를 결합함으로써, 항체 분비를 더욱 명확하게 관측하는 것도 가능하다. 본 방법은, 웰 주위에만 항체에 대해서 결합 수단이 되는 물질을, 패턴 등에 의해 종단하는 것에 의해 실현된다. 도 7a에 그 외관, 도 7b에 그 제작예를 나타낸다. 실리콘 기판(4-b)상에 산화막(4-a)을 형성한다.
(1) 기판상에 포토레지스트(4-c), 예를 들면 토쿄 오카 고교(주) OFPR-800을 도포, 노광기로 패턴 전사를 실시한다.
(2) 포토레지스트(4-c)로부터 노출한 산화막(4-a)을 완충 불화수소산에서 에칭한다.
(3) 여기서 항체가 얼룩 없이 결합하는 표면으로 하기 위해, 프라이머(4-d)로 처리한다. 예를 들면 실란 커플링제이고, 헥사메틸디실라잔 등으로, 표면을 종단한다. 또한, 본 처리에 있어서의 재료, 수단은 여러 가지의 것이 있으며, 본 제작예의 처리로 한정되는 것은 아니다.
(4) 또한 다시 포토레지스트(4-e), 예를 들면 토쿄 오카 고교(주) OFPR-800을 도포한다.
(5) 포토레지스트(4-e)를 노광기에 의해, 항체 결합 패턴을 형성한다. 항체 결합 패턴 치수는, 웰보다 크게 할 필요가 있으며, 1미크론∼이웃하는 웰 간격의 1/2 이하이다.
(6) 또한, 포토레지스트(4-e)를 노광기에 의해, 웰 패턴에 가공한다.
(7) 드라이 에칭에 의해, 웰 패턴을 깊이 10∼20미크론의 웰(4-f)을 형성한다. 웰 형성시, 포토레지스트(4-e)로부터 보호되어 있지 않은 항체와 결합하는 물질 (4-d)은 동시에 제거된다. 산소 플라스마 등에 의해, 제거할 수도 있다.
(8) 아세톤 등의 유기용제 등에 의해, 포토레지스트(4-e)를 제거한다. 여기서, 웰 주위에만 항체 결합하는 물질이 존재하기 때문에, 항체의 결합 범위를 국소적으로 존재시키는 것이 가능해진다.
(9) 이상의 공정은, 감광성을 갖는 실란커플링제를 사용함으로써, 간소화하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 제작예 1에 따라 가공을 실시한 후, 감광성 실란커플링제를 도포, 원하는 패턴에 노광하는 것으로 본 제작예와 동일한 결과를 얻는 것이 가능하다.
본 제작예에 의해 시험적으로 제작한 마이크로 웰 어레이 칩에 형광 표식 항체를 파종 하고, 그 결합 상태를 보고 관찰한 것이 도 7-3이다. 웰 주변부에만 항체의 결합이 관찰되었다. 또, 본 제작예는, 웰 주위에만 항체 결합 표면을 형성하는 것을 특징으로 하는 것이고, 그 실현에는 여러 가지 방법이 있다. 키시모토 산교 주식회사·dix 시리즈 등을 사용할 수도 있다. 이것은, 폴리파라크실렌 수지 표면에 아미노기를 형성하는 것이고, 본 제작예와 동일한 결합 표면을 실현 가능하다. 또, 필요로 하는 항체 결합 표면 이외의 부분에 항체 결합용 프라이머와 반대의 효과를 갖는 막을 형성하여도 동일한 효과를 얻을 수 있고, 예를 들면, 토요 고세이 고교 주식회사·BIOSURFINE 등을 들 수 있다.
표면 처리 방법(도 8)
항Ig항체를 얼룩 없이 결합시키기 위해, 이하의 방법으로 표면 처리를 실시한다.
1. 기판(5-a) 표면의 기름 성분 등 오염을 제거한다. 오염을 제거하는 방법은, 예를 들면, 유기용제, 산 및 알칼리 세정이며, 산소 플라스마 등의 드라이 세정이다. 기판 재료, 오염에 의해 적당 선택 가능하다.
2. 여기서 기판과 항체 등을 결합하는 프라이머의 표면 결합 밀도를 향상시키기 위해서, 기판 표면에 프라이머로 치환하는 수산기(5-b)를 형성할 수도 있다. 기판 표면에 수산기의 형성과 표면의 미립자를 제거하기 위해서, 예를 들면 1% 정도의 암모니아 물 세정을 실시한다. 그 후, 물로 충분히 린스한다. 실리콘의 경우는, RCA 세정중 SC-1 세정으로 대체를 실시할 수 있다. 다만, 1에 있어서 충분한 프라이머 결합에 적절한 표면 형성이 가능하면, 2에 대해서는 생략 가능하다.
3. 프라이머(5-c)를 표면에 결합시킨다. 실란 커플링제 등에 담궈, 표면의 수산기와 충분히 치환시킨다. 프라이머는, 예를 들면 헥사메틸디실라잔이고, 표면을 소수화한다. 또한, 본 처리에 있어서의 프라이머 재료, 수단은 여러 가지의 것이 있어, 본 표면 처리예로 한정되는 것은 아니다.
프라이머는, 주로 실란 커플링제 또는 시릴화제이고, 유기물과 무기물을 결합하는 것을 특징으로 하며, 표면 개질제로서 사용되어 소수화 표면을 나타낸다. 반도체용으로서는, 헥사메틸디실라잔으로 대표되는 재료가 주로 사용된다. 프라이머는 기판 재료에 의해 적당 선택할 필요가 있고, 예를 들면 신에츠 실리콘사가 판매하고 있는 실란커플링제, 시릴화제 등이 있다.
프라이머의 도포는 여러 가지 방법이 있으며, 딥, 스핀 코트, 가스 확산, N2버블링 등이 있지만, 그 선택은 재료에 가장 적합한 방법으로 할 필요가 있다. 예를 들면 가스확산법의 경우, 5∼10분 정도 기화한 프라이머 밀폐 용기 분위기에 폭로하는 것으로 실시 가능하다.
본 제작예에 의한 마이크로 웰 어레이 칩은, 실리콘으로 한정하지 않고 수지, 금속, 유리 등으로도 형성 가능하다. 또 그 형태는, 재료 단체뿐만 아니라, 기판상에 형성된 막 형상이라도 좋다.
수지는, 예를 들면 아크릴, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, ABS, 폴리우레탄, 에폭시 수지, 열경화형 수지, 광경화성 수지, 광용해성 수지 등을 들 수 있다. 이들 수지는, 사출, 압축, 열경화, 광경화, 드라이 에칭 등에 의해 성형 가능하다. 유리나 실리콘, 금속 기판상에 수지를 제막하여 성형 가공할 수 있다. 마이크로 웰 형상에 성형된 수지는, 실리콘과 동일하게 표면을 프라이머로 처리함으로써, 항체의 결합이 가능하다. 예를 들면, 본 발명에 기재되는 표면 처리 방법에 의해 실현이 가능하다. 또, 감광성 프라이머를 사용함으로써, 실리콘과 동일하게 항체 결합 패턴의 형성도 가능하다. 여기서, 사용하는 프라이머는 수지 재료와의 결합성을 고려하면서 적절히 선택하는 것이 적당하다. 또한, 수지가 그 표면에 항체와의 커플링을 실시하는 결합 수단을 가지며, 항체 결합성을 가지는 것이라면, 더욱 저설비 비용으로의 실현이 가능하다.
금속은, 예를 들면 알루미늄, 알루미늄 합금, 구리합금, 금, 스테인레스 등을 들 수 있다. 이들 금속은, 금형 성형, 에칭 등에 의해 성형 가능하다. 유리나 실리콘, 금속 기판상에 금속막을 제막하여 성형 가공해도 좋다. 마이크로 웰 형상으로 성형된 금속은, 실리콘과 동일하게 표면을 프라이머로 처리함으로써, 항체의 결합이 가능하다. 예를 들면, 본 발명에 기재되는 표면 처리 방법에 의해 실현이 가능하다. 여기서, 사용하는 프라이머는, 금속재료와의 결합성을 고려하면서 적절히 선택하는 것이 적당하다.
유리는 에칭에 의해 마이크로 웰이 형성 가능하다. 또, 수지나, 실리콘, 금속을 표면에 제막하여 마이크로 웰의 형성이 가능하다. 마이크로 웰 형상에 성형된 금속은 실리콘과 동일하게 표면을 프라이머로 처리함으로써, 항체의 결합이 가능하다. 예를 들면, 본 발명에 기재되는 표면 처리 방법에 의해 실현이 가능하다. 여기서, 사용하는 프라이머는 유리, 표면제막 재료와의 결합성을 고려하면서 적절히 선택하는 것이 적당하다.
이하의 실시예에서는, 제작예 1에 따라서 제작한 실리콘제 마이크로 웰 어레이 칩을 사용하였다. 단, 실시예로 사용한 칩의 웰의 표면 형상은 육각형으로 하였다(제작예 1에서는 원).
(실시예 1)
실험 방법(프로토콜 I)
1. [항인간 IgG의 칩에의 코트] 실란 커플링 처리가 끝난 실리콘제 마이크로 웰 어레이 칩에 항인간 IgG 항체를 10㎍/㎖가 되도록 PBS에 희석한 것을 80㎕ 첨가하고, 칩상의 액이 건조하지 않도록 칩의 습도를 유지하는 보습상자(도 9)에 넣고, 실온(15－25℃)에서 1시간 정치하여, 실리콘 칩 표면에 항IgG 항체를 결합시켰다. 이 경우, 하기 공정 2와는 달리, 감압에 의해 탈기하고 있지 않고, 웰 안에 항체는 들어가지 않으며, 웰 주위에 항체가 분포한다(이후, 칩을 인큐베이션 할 때는 항상 상기 보습상자에 넣어 건조를 방지하였다.).
2. [블로킹] 항체 용액을 칩으로부터 제외하여 PBS를 칩에 100㎕ 첨가하고, 그 후 제거하여 세정의 조작을 3회 반복한 후, 0.2%(v/v) Lipidure(노프 코퍼레이션, BL-B03 리피듀아(5wt%))를 포함한 PBS를 칩에 100㎕ 첨가하고, 진공 펌프를 이용하여 감압함으로써 마이크로 웰 내의 기포를 완전하게 제외한 것으로, 칩 표면 및 웰내에 리피듀아액을 채웠다. 15분간 실온(15－25℃)에서 정치함으로써 블로킹을 실시하였다.
3. [세포의 첨가] 칩을 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지 100㎕로 3회 세정 후, 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지에서 2회 세정한 X63/116 세포(B형 간염 바이러스 표면 항원(HBs 항원)에 대한 사람 IgG를 분비) 또는 HyHEL10 110 TC세포(계란 리소자임(HEL)에 대한 마우스/인간 키메라 항체를 분비)을 칩에 첨가하여, 세포가 웰 내에 들어가도록 대략 10분간 실온에서 정치하였다.
4. [세포의 배양] 웰 내에 들어가지 않았던 세포를 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지에서 수차례(여분의 세포가 제거될 때까지) 세정 여과한 후, 칩 상에 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지 80㎕를 첨가하여 칩을 CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내에 넣고 세포를 칩상에서 2∼3시간 배양하였다.
5. [비오틴 표식 항원의 결합] 세포가 웰로부터 나오지 않게 주의하면서, 칩 표면의 버퍼를 제거하고, PBS 약 100㎕를 칩 표면에 첨가하여 다시 제거하는 것을 수차례 반복 칩을 세정한 후, 1㎍/㎖ 비오틴 표식 HEL 또는 비오틴 표식 HBs 항원을 80㎕ 칩에 첨가하여 실온에서 30분간 정치하였다.
6. 5와 동일하게 칩을 PBS로 세정 후, 원액을 1,000배 희석한 Cy3 표식 스트렙트아비딘(SIGMA, S-6402)을 80㎕ 칩에 첨가하여, 동일하게 실온에서 30분 정치하였다.
7. 5와 동일하게 칩을 PBS로 세정 후, 칩에 PBS를 첨가하여 형광 현미경하에서 Cy3의 형광을 관찰하고, 웰 주위에 도너츠 형상으로 Cy3의 형광이 퍼지고 있는 것을 지표에 항원 특이적 항체를 분비하고 있는 세포가 들어가 있는 웰 위치를 확인하였다(도 10).
8. 1㎍/㎖ Oregon Green 80㎕를 칩에 첨가하여 3분간 실온으로 정치함으로써 세포를 Oregon Green으로 표식하였다. 5와 같게 칩을 PBS로 세정 후, 새로운 PBS를 칩에 가세하여 Oregon Green의 형광을 지표에 세포를 보고 관찰하면서, 목적의 항원 특이적 항체를 분비하고 있는 세포를 현미 조작기에서 회수하였다.
본 발명의 방법(FLISPOT법)을 사용한 항원 특이적 항체 분비 세포의 마이크로 웰 어레이 칩상에서의 분류
HyHEL10 110TC세포, X63/116 세포, 110TC세포(음성 콘트롤, 항체를 분비하고 있지 않다)를 항IgG 항체를 코트한 실리콘제 마이크로 웰 어레이 칩상에서 배양 후, 항원 특이적 항체의 분비를 비오틴 표식 HEL 또는 비오틴 표식 HBs 항원 및 Cy3 표식 스트렙트아비딘을 사용하여 검출하였다(도 11a). 도 11a와 동일하게 분비된 항체가 웰 주위에 도너츠 형상으로 검출되었다. 항체를 분비하고 있지 않은 110TC를 첨가한 칩으로는 시그널은 검출되지 않았다. 그 후 Oregon Green로 세포를 염색해 세포를 확인하였다(도 11b).
이 염색은 항원 특이적이고, HyHEL10 110TC세포를 첨가한 칩으로는 비오틴 표식 HEL로 시그널이 검출되었지만 비오틴 표식 HBs 항원에서는 시그널은 검출되지 않았다. 반대로 X63/116 세포를 첨가한 칩으로는 비오틴 표식 HEL로 시그널은 검출되지 않고 비오틴 표식 HBs 항원에서 시그널이 검출되었다(데이터는 나타내지 않음).
FLISPOT법에 의한 항원 특이적 항체 분비 하이브리도마의 분류(프로토콜 I의 응용)
HEL 단백에서 면역한 BALB/c마우스보다 비장 세포를 조제하여, 통상의 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 방법에 의해 X63.Ag8.653 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 제작하였다. HAT 선택 배양지에서 하이브리도마를 선택한 후, 하이브리도마를 항 마우스 IgG 항체를 코트한 마이크로 웰 어레이 칩에 첨가하고, 웰에 수용되지 않은 세포를 세정으로 제거 후, 칩상에서 1시간 30분 배양하였다. HEL에 대한 항체를 분비하고 있는 하이브리도마를 비오틴 표식 HEL와 PE표식 스트렙트아비딘을 사용하여 검출하였다(도 11a). 이어서, Oregon Green을 세포에 첨가하여 세포 위치를 확인하였다(도 11b). (도 11c) A와 B의 조합.
(실시예 2)
실험 방법(프로토콜 II)
마우스 CD138 양성 세포(항체 분비 세포)의 조제
1. 마우스비세포를 조제하였다.
2. 세포 현탁액 100㎕에 항 마우스 CD138 항체를 106 세포당＜1㎍의 양을 첨가하고 4℃, 15분 인큐베이션하였다.
3. 세포를 10㎖의 PBS로 2회 세정 후, 100㎕의 PBS에 세포를 현탁하고, 세포 현탁액에 항 래트(rat) κ쇄 항체 결합 마이크로 비즈를 106 세포당＜1㎍의 양을 첨가하여 4℃, 15분 인큐베이션하였다.
4. 세포를 10㎖의 PBS로 2회 세정 후, 1000㎕의 PBS에 세포를 현탁하고, AutoMACS에서 CD138 양성 세포를 회수하였다.
인간 CD138 양성 세포의 조제
1. 인간 말초혈로부터 정법(피콜을 사용한 비중 원심법)에 의해 림프구를 분리하였다.
2. Fc수용체 블로킹 시약(밀테니 바이오테크(주))를 107 세포당 20㎕첨가 한 후, 항CD138 항체 결합 마이크로 비즈를 106 세포당＜1㎍의 양으로 첨가하고 4℃, 15분 인큐베이션하였다.
3. 세포를 10㎖의 PBS로 2회 세정 후, 1000㎕의 PBS에 세포를 현탁하여AutoMACS에서 CD138 양성 세포를 회수하였다.
실험 방법(프로토콜 II계속)
1. 이하의 실험도 칩을 인큐베이션 할 때에는 프로토콜 I와 동일하게 건조를방지하는 조치를 취하였다.
2. 실란커플링 처리가 끝난 실리콘제 마이크로 웰 어레이 칩에 PBS에 희석한 10㎍/㎖로바 유래 항염소 IgG 항체 80㎕를 첨가하고, 칩상의 액이 건조하지 않게 칩을 보습상자(도 1)에 넣고, 실온(15∼25℃)에서 1시간 정치하여, 실리콘 칩 표면에 로바 유래 항염소 IgG 항체를 결합시켰다.
3. 항체 용액을 칩으로부터 제외하고, PBS 100㎕로 3회 세정 후, 0.2%(v/v) Lipidure(노프 코퍼레이션, BL-B03 리피듀아(5wt%))를 포함한 PBS를 100㎕칩에 첨가하고, 감압함으로써 마이크로 웰내의 기포를 제외한 것으로, 칩 표면 및 웰내에 리피듀아액을 채웠다. 15분간 실온에서 정치함으로써 블로킹을 실시하였다.
4. 칩을 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지 100㎕로 3회 세정 후, PBS 10㎖로 1회 세정한 CD138 양성 항체 분비 세포(1∼2 × 106개의 세포를 PBS로 30㎕에 현탁)를 칩에 첨가하고, 세포가 웰내에 들어가도록 대략 10분간 실온에서 정치하였다.
5. 웰내에 들어가지 않았던 세포를 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지에서 세정 여과한 후, 칩상에 10㎍/㎖염소 유래 항인간(또는 마우스) IgG 80㎕를 첨가하고 실온에서 30분간 정치함으로써, 항체를 칩 표면의 로바 유래 항염소 IgG 항체에 결합시켰다.
6. 세포가 웰로부터 나오지 않게 주의하면서 칩을10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지에서 세정 후, 다시10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지 80㎕를 칩에 첨가하고, 세포를 CO2 인큐베이터내(37℃, 5% CO2)에서 3시간 배양하였다.
7. 이후의 스텝은, 프로토콜 I의 스텝 5 이하를 계속 실시한다.
본 발명의 방법(FLISPOT법) 법을 사용한 HEL를 면역한 마우스 비세포 중의 HEL 특이적 항체 분비 세포의 검출
계란 리소자임(HEL)을 면역한 BALB/c마우스의 비장 세포로부터 CD138 양성 세포를 조제하고, 프로토콜 II에 따라서 세포를 로바 유래 항염소 IgG 항체를 결합시킨 실리콘제 마이크로 웰 어레이 칩에 세포를 첨가하고, 그 후 프로토콜에 따라서 염소 유래 항 마우스 IgG 항체를 칩에 결합시킨 후, 약 3시간 세포를 배양하였다. 그 후, 비오틴 표식 HEL 및 Cy3 표식 스트렙트아비딘을 첨가하여 형광 현미경하에서 HEL 특이적 IgG 항체를 분비하고 있는 세포를 검출하였다(도 12). 그 후 현미 조작기에서 세포를 회수하여, 항체 유전자를 증폭하였다. 그 결과 제작한 7개의 IgG중 6개가 HEL에 결합하였다(데이터는 나타내지 않았다).
본 발명의 방법(FLISPOT법)을 사용한 인간 말초 피림프구 중의 HBs 항원 특이적 항체 분비 세포의 검출
HBs 항원 백신에서 부스트된 정상인 말초혈로부터 프로토콜 II에 따라서 CD138 양성 세포를 조제하였다. 프로토콜 II에 따라서 당나귀 유래 항염소 IgG 항체를 결합시킨 실리콘제 마이크로 웰 어레이 칩에 CD138 양성 세포를 첨가하고, 그 후 프로토콜에 따라서 염소 유래 항인간 IgG 항체를 칩에 결합시킨 후, 약 3시간 세포를 배양하였다. 그 후, 비오틴 표식 HBs 항원 및 Cy3 표식 스트렙트아비딘을 첨가하여 형광 현미경하에서 HBs 항원 특이적 IgG 항체를 분비하고 있는 세포를 검출하였다(도 13).
HBs 백신을 설명과 동의를 얻은 자원 봉사에게 접종 후 7 일째에 100㎖의 혈액을 채취한 말초혈 림프구로부터 CD138 양성 세포를 선택하여, 항인간 IgG를 코트한 칩에 파종하였다. 세포를 배양 후, 비오틴 표식 HBs 항원 및 Cy3 표식 스트렙트아비딘을 사용하여 HBs 특이적 항체 분비 세포를 검출하였다. 전부 24 웰로부터 세포를 회수하였다. HBs 백신 접종 후 8일째에도 100㎖의 혈액을 채취한 말초혈 림프구로부터 동일하게 HBs 특이적 항체 분비 세포를 검출하고, 57 웰로부터 세포를 회수하였다. 이들의 세포로부터 항체의 H쇄 및 L쇄의 cDNA53 페어를 제작하였다. 발현 벡터에 cDNA를 짜넣어 H쇄과 L쇄의 페어를 293 T세포(인간 태아신장 유래 세포주)에 유전자 도입하고, 배양상등액을 회수하고, 상등액 중에 분비된 항체가 HBs 항원에 결합하는지를 ELISA로 해석하였다. 그 결과, 41개의 항체 단백을 생산할 수 있고, 그 중의 36개가 HBs 항원 특이적이었다.
(실시예 3)
실험 방법(프로토콜 III)
1. 실란커플링 처리가 끝난 실리콘제 마이크로 웰 어레이 칩에 항원(HEL 단백)을 10㎍/㎖가 되도록 PBS에 희석한 것을 80㎕첨가하고, 칩상의 액이 건조하지 않게 칩을 보습상자(도 9)에 넣고, 실온(15∼25℃)에서 1시간 정치하여 실리콘 칩 표면에 HEL 단백을 결합시켰다.(이후, 칩을 인큐베이션할 때는 항상 상기 상자에 넣어 건조를 방지하였다.).
2. 항원 용액을 칩으로부터 제외하고, 100㎕ PBS로 3회 세정 후, 0.2%(v/v) Lipidure(노프 코퍼레이션, BL-B03 리피듀아(5wt%))를 포함한 PBS를 100㎕칩에 첨가하고, 감압함으로써 마이크로 웰내의 기포를 제외한 것으로, 칩 표면 및 웰 내에 리피듀아액을 채웠다. 15분간 실온 정치함으로써 블로킹을 실시하였다.
3. HEL를 면역한 마우스의 비장 세포로부터 CD138 양성 세포를 프로토콜 II에 따라서 조제하였다.
4. 칩을 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지에서 세정 후, 10㎖ PBS로 1회 세정한 CD138 양성 세포(1∼2 x106개의 세포를 PBS 3㎕에 현탁)를 칩에 첨가하고, 세포가 웰내에 들어가도록 약 10분간 정치하였다.
5. 웰내에 수용되지 않은 세포를 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지에서 세정 여과한 후, 칩상에10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지 80㎕를 첨가하고, 칩을 CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내에 넣고, 세포를 칩상에서 3시간 배양하였다.
6. 세포가 웰로부터 나오지 않게 주의하면서, 칩 표면의 버퍼를 제거하여 PBS 100㎕를 칩 표면에 첨가하는 것을 수차례 반복하여 칩을 세정 후, 1㎍/㎖ Cy3 표식항 마우스 IgG 80㎕를 칩에 첨가하여 실온에서 30분간 정치하였다.
7. 6과 동일하게 칩을 PBS로 세정 후, 칩에 PBS를 첨가하고 형광 현미경하에서 Cy3의 형광을 관찰하고, 웰 주위에 도너츠 형상으로 Cy3의 형광이 퍼지고 있는 것을 지표에 항원 특이적 항체를 분비하고 있는 세포가 들어가 있는 웰 위치를 확인하였다(도 14).
8. Oregon Green 80㎕를 칩에 첨가하고 3분간 실온으로 정치함으로써 세포를 Oregon Green로 표식하였다. 상기 6과 동일하게 칩을 PBS로 세정 후, 새로운 PBS를 칩에 가세하여 Oregon Green의 형광을 지표에 세포를 보고 관찰하면서, 목적의 항원 특이적 항체를 분비하고 있는 세포를 현미 조작기에서 회수하였다.
(실시예 4)
실험 방법(프로토콜 IV　응용)
형광 표식 항원 또는 형광 표식 항체 대신에 효소를 표식한 항원 내지 효소를 표식한 항체를 사용한다.
변경점
1. 효소 표식 항원 또는 효소 표식 항체를 작용시킨 후, 효소의 기질을 더한 버퍼를 칩에 첨가하고 실온으로 인큐베이션 한다.
2. 기질이 효소에 의해 변화한 산물이 웰의 주위에 링 상태로 침착한다. 그것을 광학 현미경으로 관찰하여 항체 분비 세포를 검출한다.
효소：알카리포스파타제, 기질：BCIP/NBT
형광 색소 대신에 양자점(quantum dot)이 결합한 항원, 항체를 사용하는 것에 의해도 검출할 수 있다.
사이트카인 생산 세포의 검출
1. 항IgG 항체를 칩에 결합시키는 대신에, 항사이트카인 항체를 칩에 결합시켜서 사이트카인을 분비하고 있는 T세포 등을 칩에 파종하여, 사이트카인을 생산 시킨다.
2. 분비된 사이트카인이 웰 주위의 항사이트카인 항체에 결합한다.
3. 이어서, 형광 또는 효소 표식 항사이트카인 항체를 더하면, 웰 주위에 결합한 사이트카인의 링을 검출할 수 있고 사이트카인 분비 T세포 등이 검출된다.
A Immuno Spot Array Assay on Chip (ISAAC)
사이트카인 분비 세포의 검출방법
1. 인간 말초혈로부터 림프구를 조제하고, 10ng/㎖ PMA(phorbol myristate acetate), 1μM ionomycine의 존재하 CO2 인큐베이터내(37℃, 5% CO2)에서 하룻밤 자극하였다.
2. 림프구를 회수 세정하고, 항 인간 IFN γ항체를 코트한 마이크로 웰 어레이 칩에 세포를 가하여 건조를 방지하기 위하여 보습상자(도 9)에 넣은 후, CO2 인큐베이터내(37℃, 5% CO2)에서 5시간 배양하였다.
3. 칩을 PBS-Tween20에서 세정 후, 비오틴 표식 항인간 IFN γ항체를 칩에 첨가하고, 보습상자 내에서 실온에서 30분 인큐베이션하였다.
4. 칩을 PBS-Tween20에서 세정 후, Cy3 표식 streptavidin를 첨가하고, 보습상자 내에서 실온에서 30분 인큐베이션 하였다.
5. 칩을 PBS-Tween20에서 세정 후, 형광 현미경하에서 분비된 사이트카인의 시그널을 관찰하였다(2초 노광).
결과를 도 15에 나타낸다.
(실시예 5(블로킹 항체의 취득))
1. 이하의 실험도 칩을 인큐베이션 할 때에는 프로토콜 I와 동일하게 건조를 방지하는 조치를 취하였다.
2. 실란커플링 처리가 끝난 실리콘제 마이크로 웰 어레이 칩에 PBS에 희석한 10㎍/㎖ TRAIL-R1/Fc80㎕를 첨가하고, 칩상의 액이 건조하지 않게 칩을 보습상자(도 9)에 넣고 실온(15∼25℃)에서 1시간 정치하고, 실리콘 칩 표면에 TRAIL-R1/Fc를 결합시켰다.
3. 항체 용액을 칩으로부터 제거하여, PBS 100㎕로 3회 세정 후, 0.2%(v/v) Lipidure(노프 코퍼레이션, BL-B03 리피듀아(5wt%))를 포함한 PBS를 100㎕칩에 첨가하고, 감압함으로써 마이크로 웰내의 기포를 제거함으로써, 칩 표면 및 웰 내에 리피듀아액을 채웠다. 15분간 실온에서 정치함으로써 블로킹을 실시하였다.
4. 칩을 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지 100㎕로 3회 세정 후, 10㎖로 1회 세정한 CD138 양성 항체 분비 세포 다시 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지 1000㎕로 2회 세정 후(1∼2 x106개의 세포를 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지에서 30㎕에 현탁)를 칩에 첨가하고, 세포가 웰내에 들어가도록 대략 10분간 실온에서 정치하였다.
5. 세포가 웰로부터 나오지 않게 주의하면서 칩을 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지에서 세정 후, 다시 10% FCS를 포함한 RPMI1640 배양지 80㎕를 칩에 첨가하고, 세포를 CO2 인큐베이터 내(37℃, 5% CO2)에서 3시간 배양하였다.
6. 세포가 웰로부터 나오지 않게 주의하면서, 칩 표면의 버퍼를 제거하고, PBS 약 100㎕를 칩 표면에 첨가하고 다시 제거하는 것을 수차례 반복 칩을 세정 후, 1㎍/㎖비오틴 표식 TRAIL를 80㎕ 칩에 첨가하고, 실온으로 30분간 정치하였다.
7. 6과 동일하게 칩을 PBS로 세정 후, 원액을 1,000배 희석한 Cy3 표식 스트렙트아비딘(SIGMA, S-6402)을 80㎕ 칩에 첨가하고, 동일하게 실온에서 30분 정치하였다.
8. 6과 동일하게 칩을 PBS로 세정 후, 칩에 PBS를 첨가하고 형광 현미경하에서 Cy3의 형광을 관찰하고, Cy3의 형광으로 빨강의 칩의 표면에 웰 주위에 Cy3의 형광이 결합하고 있지 않은 곳이 검은 도너츠 형상이 되는 것을 지표에 TRAIL-R1/Fc와 그 리간트인 TRAIL의 사이에 블록하는 것을 분비하고 있는 세포가 들어가 있는 웰 위치를 확인하였다.
9. 1㎍/㎖Oregon Green 80㎕를 칩에 첨가하고 3분간 실온으로 정치함으로써 세포를 Oregon Green로 표식하였다. 6과 동일하게 칩을 PBS로 세정 후, 새로운 PBS를 칩에 가세하여 Oregon Green의 형광을 지표에 세포를 보고 관찰하면서, 목적의 항원 특이적 항체를 분비하고 있는 세포를 현미 조작기에서 회수하였다.
(실시예 6(기능적 항체의 스크리닝으로의 응용))
수용체 단백을 칩 표면에 코트하고, 수용체 단백으로 면역한 마우스의 비세포로부터 조제한 CD138 세포를 칩상에 파종하였다. 세포를 배양 후, 비오틴 표식 리간드 및 Cy3 표식 스트렙트아비딘을 첨가하였다. 칩의 거의 전면에 비오틴 표식 리간드/Cy3 표식 스트렙트아비딘이 결합하고 있지만, 수용체의 리간드의 결합을 블록하는 것 같은 기능적 항체를 생산하고 있는 세포의 웰 주위는 비오틴 표식 리간드/Cy3 표식 스트렙트아비딘의 결합이 저해하기 때문에, 어두워지고 있다. 결과를 도 16에 나타낸다. 왼쪽：비오틴 표식 리간드/Cy3 표식 스트렙트아비딘에 의한 검출 결과. 중간：세포를 Oregon Green에 의해 표식하여 관찰하였다. 오른쪽：왼쪽 중의 도면을 중합시킨 것.

Claims (24)

  1. 기재(base member)의 일측 주표면에 복수의 웰을 가지며, 상기 웰은 1개의 세포만이 들어가는 크기인 마이크로 웰 어레이이고,
    상기 웰의 주변의 상기 주표면에, 상기 웰에 수용되는 일부 세포가 생산하는 물질과 결합성을 갖는 물질의 피복층을 갖는 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 마이크로 웰 어레이의 일부의 웰에 세포의 배양액과 함께 세포를 수용하고,
    상기 피복층 및 상기 웰이 배양액에 침지되며,
    상기 배양액에 포함되는 물질이 상기 피복층으로 확산 가능한 상태에서, 상기 세포가 배양되는 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 웰에 수용되는 세포의 일부는, 면역 글로블린 생산 세포 또는 사이트카인 생산 세포인 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 웰에 수용되는 세포의 일부가, 면역 글로블린 생산 세포이며, 면역 글로블린 생산 세포가 생산하는 물질과 결합성을 갖는 물질이, 항면역 글로블린 항체 또는 항원인 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 결합의 유무의 검출은, 생산되는 면역 글로블린에 대한 항체 또는 항원을 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  6. 청구항 2에 있어서,
    상기 웰에 수용되는 세포의 일부가, 사이트카인 생산 세포이고, 사이트카인 생산 세포가 생산하는 물질과 결합성을 가지는 물질이 항사이트카인 항체 또는 사이트카인 수용체인 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 결합의 유무의 검출은, 생산되는 사이트카인에 대한 항체 또는 사이트카인 수용체를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  8. 청구항 2에 있어서,
    상기 웰에 수용되는 세포의 일부가, 면역 글로블린 생산 세포이고, 면역 글로블린 생산 세포가 생산하는 물질과 결합성을 가지는 물질이 사이트카인 수용체인 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 결합의 유무의 검출은, 사이트카인 또는 리간드를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  10. 청구항 3에 있어서,
    상기 면역 글로블린 생산 세포 및 사이트카인 생산 세포는 천연형 세포 또는 하이브리도마인 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 기재는 판형상인 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 웰에 수용되는 세포가 생산하는 물질과 결합성을 갖는 물질의 피복층을 갖지 않는 상기 주표면은, 블로킹제로 코팅되는 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이.
  13. 기재의 일측의 주표면에 복수의 웰을 가지며, 상기 웰은 1개의 세포만이 들어가는 크기이고, 또한 상기 웰의 주변의 상기 주표면에, 목적 세포가 생산하는 물질과 결합성을 갖는 물질의 피복층을 갖는 마이크로 웰 어레이의 일부의 웰에 피검사대상 세포를 세포의 배양액과 함께 수용하고,
    상기 피복층 및 웰을 배양액에 침지하여 배양액에 포함되는 물질의 웰로부터 상기 피복층으로의 확산할 수 있는 상태로 세포를 배양하며,
    임의로 배양액을 제거한 후에, 피검사대상 세포에 포함되는 목적 세포에 의해 생산되는 물질에 특이적으로 결합하는 표식 물질을 상기 피복층에 공급하고,
    상기 피복층의 물질에 결합한 목적 세포에 의해 생산된 물질을 상기 표식 물질에 의해 검출하여 목적 세포를 특정하는 것을 포함하는 목적 세포의 스크리닝 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 피검사대상 세포를 포함한 세포는, 상기 마이크로 웰 어레이로 도입하기 전에 특정 항원으로 자극을 주어 물질을 생산할 수 있는 상태에 있는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  15. 청구항 13 내지 14에 있어서,
    상기 피검사대상 세포는, 면역 글로블린 생산 세포 또는 사이트카인 생산 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  16. 청구항 13 또는 14에 있어서,
    상기 피검사대상 세포가, 면역 글로블린 생산 세포를 포함하고, 목적 세포가 생산하는 물질과 결합성을 가지는 물질이, 항면역 글로블린 항체 또는 항원이고, 목적 세포가 항원 특이적 면역 글로블린 생산 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 결합의 유무의 검출은, 생산되는 면역 글로블린에 대한 항체 또는 항원을 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  18. 청구항 13 또는 14에 있어서,
    상기 피검사대상 세포가, 면역 글로블린 생산 세포를 포함하고, 목적 세포가 생산하는 물질과 결합성을 가지는 물질이, 사이트카인 수용체이고, 목적 세포가 항원 특이적 면역 글로블린 생산 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 결합의 유무의 검출은 사이트카인 또는 리간드를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  20. 청구항 13 또는 14에 있어서,
    상기 피검사대상 세포가, 사이트카인 생산 세포를 포함하고, 목적 세포가 생산하는 물질과 결합성을 가지는 물질이, 항사이트카인 항체, 또는 사이트카인 수용체이고, 목적 세포가 항원 특이적 사이트카인 생산 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 결합의 유무의 검출은, 생산되는 사이트카인에 대한 항체 또는 사이트카인 수용체를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  22. 청구항 15에 있어서,
    상기 면역 글로블린 생산 세포 및 사이트카인 생산 세포는, 천연형 세포 또는 하이브리도마인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  23. 청구항 13에 기재된 스크리닝 방법으로 특정한 목적 세포를 웰로부터 회수하는 것을 포함한 목적 세포의 제조 방법.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 목적 세포가 특이적 면역 글로블린 생산 세포 또는 특이적 사이트카인 생산 세포인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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