CN110799654A - 密封微孔测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于在密封的小体积中进行微孔分析的方法、系统和试剂盒。本发明的微孔通过微孔和珠子几何形状的配对而被密封，其中珠子的直径大于微孔底部的直径。将珠子装入微孔中的一分析空间，该分析空间位于将样品密封在嵌套的珠子底部和目标微孔底部之间。

Description

密封微孔测定法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月21日提交的、序列号为62/474,283的临时申请的优先权，出于所有目的，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于微孔分析的测定法。更具体地，本发明涉及密封微孔的测定法，用于分析小体积的生物样品。
背景技术
用于生物学测定的微孔阵列已经使用了一段时间。微孔阵列的应用之一是确定单个细胞的表达谱。例如，Fan等人的美国专利申请(公开号为：2016/0289669)公开了基于微孔的设备和系统，其用于单个细胞表达谱分析，其中在进行细胞生物学活性的分析之前，将单个细胞和单个配体包被(ligand-coated)的珠子装载到微孔中，并使沉淀物沉积在微孔的底部。但是，在执行分析时，微孔却保持在未密封的状态。
Fan等人的设备和系统，存在着许多缺陷。首先，微孔的未密封状态允许在微孔之间不受控制地交换目标生物分子，从而导致微孔存在交叉污染以及单个细胞分析的准确性受损。如Yuan和Sims(Scientific Reports 6，Article number：33883(2016))所示，此问题可以通过在微孔上覆盖一层与水不混溶的油来减轻，但这会使得测定变得更加复杂。如最近的出版物(Gierahn等人，Nat Methods.2017Apr；14(4)：395-398)中所描述的基于微孔的测定法，其试图通过使用半透膜来提供密封的微孔配置。但是，这种方法还需要在微孔技术的应用中增加步骤，从而使微孔分析变得复杂。其次，在微孔配置中，珠子(bead)和细胞彼此相邻放置，与细胞的体积相比，其中释放有细胞内容物的培养基的体积相对较大，导致被释放的生物分子的实质稀释，因此降低了与珠子上配体的结合效率。这种限制是基于半透膜的微孔密封方法所固有的。第三，当珠子和细胞在微孔底部彼此相邻放置时，很难将一个珠子与一个细胞精确地配对。第四，在阵列中，各个微孔内的珠子与细胞之间的距离通常不相同，从而导致目标生物分子与珠子之间的结合效率在各个微孔之间(microwell-to-microwell)发生额外的变化。因此，目前的基于微孔的测定法(包括用于单个细胞分析的基于微孔的测定法)的准确性、易用性和效率有待改善。
发明内容
本发明提供了用于增强基于微孔的测定法的准确性和效率的系统、方法、装置和试剂盒。本发明通过微孔和珠子的新型几何配对(geometric pairing)将样品封闭在微孔中的小体积内，从而提高了微孔分析的准确性和效率。这种几何配对具有许多优点。第一，密封样品防止相邻微孔之间的材料交叉污染。第二，通过微孔和珠子的几何配对将样品密封起来，可以减少用于携带样品的培养基的有效体积，从而提高样品的浓度，进而提高配体结合效率。第三，微孔和珠子的几何配对仅允许一个珠子进入微孔，从而防止了微孔中的细胞与一个以上的珠子配对的情况。最后，珠子相对于微孔中细胞的位置保持高度一致。
附图说明
图1示出了本发明的微孔的一些非限制性实施例的透视图；
图2示出了本发明的平截头体形微孔的一些非限制性实施例的透视图；
图3示出了本发明的多边形微孔的一些非限制性实施例的透视图；
图4示出了本发明的平截头体形多边微孔的一些非限制性实施例的透视图；
图5示出了本发明的微孔的非限制性实施例的尺寸；
图6示出了微孔和珠子的几何配对的非限制性实施例的透视图；
图7示出了微孔和珠子的几何配对的非限制性实施例的透视图；
图8A示出了珠子的相关尺寸；
图8B示出了珠子与微孔之间的几何配对的一实施例，其中，珠子位于微孔顶部上方的部分的高度等于珠子的半径；
图8C示出了珠子与微孔之间的几何配对的一实施例，其中，珠子位于微孔顶部上方的部分的高度小于珠子的半径；
图8D示出了珠子与微孔之间的几何配对的一实施例，其中，珠子位于微孔顶部上方的部分的高度大于珠子的半径；
图9示出了本发明的官能化珠子(functionalized bead)的非限制性实施例的构造；
图10示出了用于执行单个细胞表达分析的方法的非限制性实施例的一般过程图；
图11示出了与实施例2结合使用的本发明微孔的一实施例的示意图；
图12示出了从实施例2获得的实验和数值模拟的结果图，其中不同的参数根据时间绘制：与自身荧光性成正比的荧光素浓度，被归一化(normalized)为实验开始时的浓度(圆圈)；数值模拟的荧光素浓度，该数值模拟实心珠子，且珠子与圆锥形侧壁之间的间隙为0.05μm(粗曲线)；数值模拟的荧光素浓度，该数值模拟多孔珠子，且在珠子内部的有效扩散系数为0.062μm2/s(细曲线)。
具体实施方式
本发明涉及提高微孔分析的效率和准确性。更具体地，本发明涉及用于提高微孔分析的效率和准确性的系统、方法、装置和试剂盒。
现有的微孔系统在有效和准确地分析阵列中各个微孔里的样品的能力方面受到严重限制。导致这些限制的部分原因是缺少将样品封闭在阵列中各个微孔内的手段。缺乏密封功能使得目标分析物能够从一个孔中扩散或流动到另一个孔中，进而导致交叉污染，从而损害了样品的分析。在执行单个细胞表达谱分析的情况下，例如在Fan等人的美国专利申请(公开号2016/0289669)中公开的系统和方法中，该缺点可能特别成问题。幸运的是，发明人认识到微孔分析中的这些局限性可以通过微孔和珠子几何形状的新颖组合来克服，这种新颖的组合使得样品可以有效地被密封在一个小的分析空间内。
发明人惊奇地发现，可以通过将微孔的几何形状与珠子的几何形状配对来形成微孔内的密封分析空间，使得珠子的表面接触微孔的壁，从而在微孔-珠子接触面(interface)处形成密封。与目前的微孔分析相比，密封的分析空间具有许多优势。分析空间的密封防止或至少抑制目标分析物进出单个微孔，从而通过防止阵列中相邻微孔的交叉污染来提高测定的准确性。在一些实施方案中，微孔和珠子的几何配对可以仅允许一个珠子进入微孔，从而防止了微孔中的细胞与一个以上的珠子配对的情况。
在本发明的至少一些实施例中，通过将微孔的几何形状和珠子的几何形状配对，使得珠子的宽度大于微孔底部的宽度来获得密封的分析空间。相应地，用于本发明的微孔可以采取任何几何形状，其中微孔顶部(即开口)的宽度大于微孔底部的宽度。适于微孔的几何形状包括但不限于圆柱体、多面体、倒锥体、倒金字塔、半球或其组合。用于微孔的合适形状包括但不限于图1所示的那些。微孔可以是平截头体的形状。微孔可以采用具有倒金字塔、圆柱体、多面体、倒锥体、半球或其组合形状的平截头体。用于微孔的合适平截头体形状包括但不限于图2所示的那些。微孔可以是倒锥体的形状。微孔可以是倒截头圆锥的形状。微孔可以是圆柱体形状，终止于锥形。微孔可以是圆柱体形状，终止于倒金字塔。微孔可以是圆柱体形状，终止于截顶的倒金字塔。微孔可以是圆柱体形状，终止于具有封闭底部的较小圆柱体。微孔可以是圆柱体形状，终止于具有直径比圆柱体小的半球。微孔的顶部以及相连的侧面可以是具有圆形、椭圆形或多边形的横截面。微孔的顶部以及相连的侧面可以是具有三角形、四边形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形或十边形的横截面。具有多边形横截面的合适微孔包括但不限于图3和图4中描绘的那些。
本发明的至少一个方面涉及微孔的尺寸。在图5中描绘了微孔的相关尺寸的非限制性示例。微孔可以具有从微孔的顶部到微孔的底部内表面的深度D1。该深度D1可以在大约5μm和大约300μm之间。如本文所用，术语“约”可以指与该术语组合的规定值，或者是与规定值相差(正或负)最多30％、最多25％、最多20％、最多15％、最多10％、最多9％、最多8％、最多7％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％或最多1％的值。该深度D1最小可以为5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm或300μm。该深度D1最大可以为5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm或300μm。
在一些优选的实施方案中，微孔顶部(即开口)的宽度成比例地大于微孔底部的宽度。参考图5，微孔顶部可以具有约30μm至200μm的宽度(即直径)D2。微孔底部可以具有约5μm和50μm的宽度(例如直径)D3。宽度D2最小可以为30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm或介于这些特定参考宽度之一之间的宽度。宽度D2最大可以为30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm或介于这些特定参考宽度之一之间的宽度。宽度D3最小可以为5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm或介于这些特定参考宽度之一之间的宽度。宽度D3最大可以为5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm或不超过介于这些特定参考宽度之一之间的宽度。在一些优选的实施方式中，宽度D3为15μm。微孔底部的宽度D3与微孔顶部的宽度D2之比可以在约0.99至0.05之间。宽度D3与宽度D2的比率可以高达0.99、0.95、0.90、0.85、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05或介于所列这些特定比率之间的比率。微孔顶部的宽度D2可以是微孔底部的宽度D3的约1倍至约10倍。宽度D2可以是D3的宽度的至少1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。
尽管在图5中描绘了圆锥形的平截头锥体，本领域技术人员将理解，可以以其中微孔顶部的宽度成比例地大于微孔底部的宽度的任何几何形状来实施本发明。用于本发明的微孔可以具有允许微孔用于其预期目的的任何体积。微孔的体积可以在约0.1皮升至约100,000皮升的范围内。在一些实施方案中，每个微孔的体积为约144皮升。
在一些实施方案中，微孔的壁可以是倾斜的，其中正的拔模角在孔的顶部产生较大的开口。在一些实施例中，壁可以正向或负向地倾斜至少1度、2度、3度、4度、5度、6度、7度、8度、9度、10度、11度、12度、13度、14度或15度或更多度。在一些实施例中、壁可以正向或负向地倾斜最多1度、2度、3度、4度、5度、6度、7度、8度、9度、10度、11度、12度、13度、15度或更多度。因此，在这些实施例中，微孔顶部可以具有与微孔底部不同的直径(或平均直径)。在一些优选的实施例中，壁倾斜约10度至约30度范围内的正拔模角。在一些实施例中，微孔的开口角是平均拔模角的两倍。微孔的开口角可以在大约0°至大约60°之间。该开口角最大可以为60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、5°、1°或任何介于这些特定列出的角度之间的角度。开口角度可以高达大约10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、30°、31°、32°、33°、34°、35°、36°、37°、38°、39°、40°、41°、42°、43°、44°、45°、46°、47°、48°、49°、50°、51°、52°、53°、54°、55°、56°、57°、58°、59°或60°。在一些优选的实施方案中，开口角为34°或35°。
本发明的至少一个方面涉及与微孔配对的珠子的几何形状。珠子可以是球形的或基本上呈球形的。珠子可以是微球形的。珠子的宽度(即直径)可以在约10μm至约100μm之间。珠子的宽度可以至少为10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm或介于这些特定宽度之间的宽度。珠子的宽度最大可以为10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm或介于这些特定宽度之间的宽度。对于微孔与珠子的几何配对，微孔底部的宽度与珠子的宽度之比可以是珠子的宽度成比例地大于微孔底部的宽度的任何比率。微孔底部的宽度与珠子的宽度之比可以在约0.05至约0.99的范围内。在一些实施方案中，微孔底部的宽度与珠子的宽度之比可以至多为0.99，0.95、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05。本领域技术人员将理解，该比率可以是介于此处列出的那些比率之间的任何比率，例如0.37。本领域的技术人员将进一步理解，在考虑多个珠子的情况下，本文中提及的珠子宽度可以指平均珠子直径。
用于本发明的珠子可以由选自以下的材料制成：聚甲基丙烯酸甲酯、环氧树脂、硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物、金属、氧化铝、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖和水凝胶、或它们的任何组合。适用于本发明的珠子的例子包括但不限于链霉亲和素共轭珠子(streptavidin conjugated beads)、琼脂糖珠子、磁性珠子、玻璃珠子、
Figure GDA0002314717600000051
微珠子、抗体共轭珠子(例如抗免疫球蛋白微珠子)、蛋白质A共轭的共轭珠子、蛋白质G共轭珠子、蛋白质A/G共轭珠子、蛋白质L共轭珠子、oligo-dT共轭珠子、二氧化硅珠子、二氧化硅类珠子、抗生物素珠子、以及BcMagTM羧基末端珠子。珠子可以是聚甲基丙烯酸甲酯微球。珠子可以具有约1g/cm3至约4g/cm3的密度。珠子的密度可以高达2g/cm3、3g/cm3、4g/cm3或介于具体列出的这些密度之间的密度。珠子的密度可以至少为1g/cm3、2g/cm3、3g/cm3、4g/cm3或介于这些具体列出的密度之间的任何密度。珠子可以与量子点(quantum dots)或荧光染料相关联(例如，被浸渍)，以使它们在一个荧光光学通道或多个光学通道中发出荧光。珠子可以是磁性的。珠子可以与氧化铁或氧化铬缔合以使其为顺磁性或铁磁性。珠子可以被官能化(functionalized)。当涉及珠子使用时，术语“官能化”、“官能性的”等是指珠子在其表面上具有至少一个用于捕获目标分析物的配体。配体可以是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸或其组合。珠子可以是非球形的，例如具有椭圆形纵向横截面和圆形横向横截面的椭圆体。
图6示出了微孔和珠子的几何形状配对的非限制性实施例，其中微孔101与珠子102接触，使得珠子102的底部与微孔101的底部相距一距离D4。在图6的实施例中，珠子102具有与微孔101的开口处的宽度D2相同或近似相同的宽度D5，使得珠子102围绕珠子102的周边接触微孔101的顶部，形成接触面(interface)105。在珠子102围绕接触面105与微孔101接触的情况下，珠子102的底部在距离D4处停留在微孔的底部上方。珠子102与微孔101接触，在接触面105和微孔101底部之间的区域中形成分析空间104。接触面105可以防止或至少抑制分析物从分析空间104的进出。
尽管在图6中示出了珠子和微孔几何形状的特定配对，但是本领域技术人员将理解，只要珠子的宽度大于微孔底部的宽度，其他几何配对也是可能的。例如，人们可能期望在微孔内为珠子提供更深的嵌套(nesting)，以在分析空间中产生更小的体积，使珠子在分析空间内更接近样品，和/或为微孔内的珠子提供更大的锚定强度。因此，珠子和微孔的几何配对可以是珠子的宽度大于微孔的底部，但是小于微孔开口的宽度。这种实施例的非限制性示例在图7中示出。
如图7所示，珠子102的宽度D5可以小于微孔101的顶部(即开口)处的宽度D2，但仍大于微孔底部的宽度。由于珠子D5的宽度小于微孔D2的开口的宽度，因此珠子102在距微孔101的顶部的距离D6的接触面105处与微孔101的壁接触。珠子102与微孔101的壁在接触面105处的接触使得在接触面105和底部微孔101之间的区域形成分析空间104。由于接触面105形成在距微孔101的顶部的距离D6处，因此分析空间104具有比珠子在微孔的顶部形成接触面的实施方式(例如，图6所示的实施方式)更小的相对体积。在本发明的非限制性实施例中，微孔101采用倒锥形状的平截头体，其中深度D1约为50μm，在微孔顶部的宽度D2约为50μm，在微孔底部的宽度D3约为15μm，珠子宽度D5约为30μm，分析空间104的体积为约2pL至约4pL。在本发明的另一个非限制性实施例中，微孔101采用倒锥形状的平截头体，其中深度D1约为75μm，在微孔顶部的宽度D2约为50μm，在微孔底部的宽度D3约为15μm，珠子宽度D5约为30μm。
本领域技术人员将认识到，可以调节微孔和珠子的几何配对，以在微孔的底部和嵌套在微孔内的珠子的底部之间获得所需的距离。例如，技术人员可能希望基于要分析的细胞的平均直径来调整微孔底部和嵌套珠子底部之间的距离，以使官能化珠子表面上的配体进入到足够靠近细胞。类似地，技术人员可能希望减小分析空间的体积以增加反应混合物内的分析物的浓度。参照图6和图7，微孔101和珠子102的几何配对可以被设计成在珠子102的底部与分析空间104内所包含的并且位于微孔101的底部上的细胞106的上表面之间获得期望的距离。珠子102的底部与细胞106之间的距离可以在约1μm与约30μm之间。珠子102的底部与细胞106之间的距离可以至少为1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm或30μm。可以类似地选择微孔和珠子的几何配对，以实现珠子底部和微孔底部之间的空间的所需体积。仍然参照图6和图7，可以选择微孔101和珠子102的几何配对，以提供具有约0.1至约100pL之间的体积的分析空间104。可以选择微孔101和珠子102的几何配对以提供一分析空间104，该分析空间104的体积至少为0.1pL、0.5pL、1pL、5pL、10pL、15pL、20pL、30pL、40pL、50pL、60pL、70pL、80pL、90pL、100pL或介于这些特别列出的体积之间的任何体积。可以选择微孔101和珠子102的几何配对以提供一分析空间104，该分析空间的体积最大为0.1pL、0.5pL、1pL、5pL、10pL、15pL、20pL、30pL、40pL、50pL、60pL、70pL、80pL、90pL、100pL或介于这些特别列出的体积的任何体积。
参照图6和图7，可以通过改变微孔101和珠子102的几何配对来调节距离D4，使得距离D4占微孔深度D1的0.05％至99％之间。距离D4至少可以为深度D1的99％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.2％、0.15％、0.10％或0.5％。距离D4最多可以为深度D1的99％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.2％、0.15％、0.10％或0.5％。
微孔和珠子的几何配对可以被设计成在珠子表面的期望周边处为珠子和微孔之间提供接触。周边可以是球形珠子的外围(即，外表面)。几何配对可以导致微孔壁与珠子的外围之间的接触，其中与珠子外围接触的微孔壁的宽度(例如直径)等于、或小于珠子的宽度(例如直径)。将理解的是，与微孔壁接触的珠子的外周等于珠子在其与微孔壁接触的水平面内的周长。珠子的宽度和与珠子外围接触的微孔壁的宽度之间的比率可以高达1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、或者介于这些特定列出的比率之间的任何比率。微孔和珠子的几何配对可导致珠子的外围与微孔顶部(即开口)处的微孔壁之间的接触。微孔和珠子的几何配对可导致珠子的外围与微孔顶部下方的微孔壁之间的接触。几何配对可导致珠子的外围与微孔壁之间的接触，其中珠子的至少一部分突出于微孔的顶部上方。珠子的突出到微孔顶部上方的部分的高度可以大于、等于或小于珠子的半径。突出到微孔顶部上方的珠子部分的高度与珠子半径之间的比率可以高达2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或介于这些特定列出的比率之间的任何比率。突出到微孔顶部上方的珠子部分的体积占比可以高达珠子体积的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、或介于这些特定列出的百分比之间的任何百分比。珠子与微孔的几何配对可导致珠子的外围与微孔壁之间的接触，其中珠子的顶部位于限定了微孔顶部的平面的下方。
在图8B至图8D中示出了微孔和珠子的几何配对的一些非限制性实施方案。图8A示出了具有直径D和半径R的珠子的相关尺寸。图8B描绘了微孔101和珠子102的几何配对，其中，珠子的突出到微孔101的顶部(即，顶部水平面)上方的部分的高度Y等于半径R。图8C描绘了微孔101和珠子102的几何配对，其中，突出到微孔101的顶部上方的部分的高度Y小于半径R。在图8C中，高度Y与半径R之间的比率可以高达1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、或介于这些特定列出的比率之间的任何比率。图8D描绘了微孔101和珠子102的几何配对，其中，突出到微孔101的顶部上方的部分的高度Y大于半径R。参照图8D中，高度Y与半径R之间的比率可以高达2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1，或介于这些特定列出的比率之间的任何比率。
图8B至图8D进一步示出了本发明的非限制性方面，其中珠子和微孔的几何配对可以被设计为实现微孔的壁与位于珠子中部和底部之间的期望周边之间的物理接触。在图8B中，珠子102在接触面P处接触微孔101，其中接触面P的宽度(即，跨过与微孔壁接触的珠子的相对侧的距离)等于珠子102的直径D。尽管未示出，但是本领域技术人员将理解，图8B至图8D示出了微孔和珠子的几何配对的侧视图，并且接触面P沿着珠子102的与微孔101的壁接触的外围(即圆周)而形成。图8C和图8D示出了实施例，其中接触面P的宽度小于珠子102的直径D。接触面P的宽度可以等于、或小于珠子102的直径D。接触面P的宽度与直径D的比率可高达1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、或介于这些特定列出的比率之间的任何比率。在一个优选的实施例中，接触面P的宽度与直径D的比率可以高达1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或介于这些特定列出的比率之间的任何比率，其中(i)没有部分Y突出到微孔101顶部上方，或者(ii)部分Y的高度小于半径R。人们可能需要这样的配置，以：为珠子实现在微孔内更深的嵌套，以防止珠子由于布朗运动和/或流体在微孔顶部上方的对流流动而从微孔中脱落；获得较小的分析空间体积，该空间由珠子的下半部分的表面(从接触面P向下开始)与微孔101的底部之间的区域限定；和/或使珠子102的底部与微孔101底部的样品(例如细胞)更靠近。
在一些实施例中，珠子与微孔之间的几何配对使得微孔仅可容纳单个珠子。如图6、图8B、图8C和图8D所示，在微孔中锚定的珠子的顶部突出于微孔顶部(即，开口)上方的实施例中，可以实现这种单个珠子装入微孔的功能(即，具有正突起，其中Y>0)。这样的配置可以防止第二珠子进入微孔。当微孔的顶部和珠子的顶部之间的距离足够小时，如图7所示，在嵌套的珠子的任何部分都没有突出到微孔的开口上方的实施例中，也可以实现单个珠子装入微孔的功能。在这样的实施例中，单个珠子以一定深度锚定在微孔内，使得当第二珠子可以进入或停留在微孔中时，该第二珠子可以容易地例如通过柔和的对流流动而被移出。单个珠子到微孔的配置可以使单个细胞表达分析受益，因为它可以防止单个细胞与多个珠子相互作用，从而给人一种错误的印象，即与珠子结合的配体来自一个以上的细胞。
在本发明的至少一些实施例中，如本文所公开的多个微孔形成在基底内以提供微孔阵列。在一些实施方案中，基底包含100至100,000,000个微孔。在一些实施方案中，基底包含100至50,000,000个微孔。在一些实施方案中，基底包含多达100,000,000个微孔。在一些实施方案中，基底包含多达50,000,000个微孔。在一些实施方案中，基底包含10,000至200,000个微孔。制造基底的材料可以选自由硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物、金属、弹性体、聚二甲基硅氧烷、琼脂糖和水凝胶或其任意组合组成的集合。本领域技术人员将理解，当将本文公开的多个微孔结合在基底中以形成微孔阵列时，本文所述的微孔的尺寸可以指此类多个微孔的平均或均值尺寸。
本发明提供了分析样品中生物活性的方法，以及鉴定样品中分析物的存在的方法。该方法实现为：提供包括至少一个微孔的基底，将样品装载到微孔中以及将至少一个珠子装载到基底上。微孔和珠子的几何形状可以配对，从而将珠子装载到基底上会导致珠子嵌套在微孔内并与微孔的壁接触，从而形成将样品包围在珠子和微孔底部之间的空间中的接触面。基底可以是本文公开的微孔阵列。微孔可以是本文公开的微孔中的一个或多个。珠子可以是本文公开的珠子。
在至少一个实施方案中，本发明提供了一种用于分析样品的生物活性的方法。分析样品的生物活性可以包括检测样品中一种或多种分析物的存在或不存在。分析样品的生物活性可以包括确定样品中一种或多种分析物的量。分析物可以是生物分子，其中分析样品的活性包括了鉴定样品中一种或多种生物分子的存在或不存在。分析物可以是生物分子，其中分析样品的活性包括了确定样品中一种或多种生物分子的量。在本文中可互换使用的术语“产物”和“分析物”是指用于分析的感兴趣物质(即目标物质)。分析物可以是生物分子。如本文所用，术语“生物分子”包括但不限于蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸(例如，包括DNA(例如cDNA和基因组DNA)和RNA(例如mRNA和tRNA)、多糖、寡糖、脂质、抗体(例如，重链和轻链多肽抗体)、细胞受体、低重量分子(low weightmmolecules)(例如激素、配体、信号转导物质、低重量有机分子等)、以及它们的复杂分子等。在一些实施方案中，生物分子是mRNA。在一些实施方案中，确定样品的生物活性包括了确定样品中至少一种寡核苷酸的拷贝数。在一些实施方案中，确定样品的生物活性包括了确定样品中至少一种寡核苷酸的拷贝数，其中的样品是细胞。在一些实施方案中，分析物可以是细胞、病毒、细胞器或组织的一部分。在一些实施方案中，分析物可以是多个细胞、多个病毒、多个细胞器或多个组织样本。
珠子可以以悬浮的形式装载到基底(即微孔阵列)上，此时珠子悬浮在液态载体中。珠子可以具有比液态载体更大的密度，使得将悬浮液装载到微孔阵列上时，各个珠子沉降到各个微孔中。装载到基底上的珠子的数量可以成比例地多于、等于或成比例地少于阵列中的微孔的数量。装载到微孔阵列上的珠子的数量可以少于微孔的数量，以限制未锚定在微孔内部的珠子的数量。装载到基底上的珠子的数量可以多于基底中的微孔的数量，以最小化没有珠子锚定在其中的微孔的数量。珠子与微孔可以以1：1、1.1：1、1.2：1、1.3：1、1.4：1或1.5：1的数量之比将珠子装载到基底上。如本文所述，珠子和微孔的几何配对可以促进单个珠子在阵列中的各个微孔内的装载。在珠子有至少一部分突出到微孔顶部上方的实施方案中，珠子的突出到微孔上方的部分可以防止其他珠子进入微孔。在珠子的上表面位于微孔顶部的平面下方的实施方案中，第二珠子可以放置在已经锚定在微孔中的珠子的顶部上。然而，保持该第二珠子的力可以足够弱，使得仅需要最小程度的搅动(例如由于对流运动)即可将第二珠子从其在锚定的珠子顶部的位置移开而不会使锚定的珠子脱离。
样品可以是一个细胞或多个细胞。样品可以是多个克隆细胞、或多个混合细胞。通过本发明公开的方法、系统和试剂盒进行分析的合适样品包括了任何包含多个细胞的样品，例如细胞培养物、血液样品、组织样品(其中的细胞外基质已被消化或溶解以将单个细胞释放到悬浮液中)等等。多个细胞可以源自单个样品、或者源自已经组合的两个或更多个样品，并且可以包括多个相同类型的细胞或多个混合类型的细胞。细胞可以是哺乳动物细胞。细胞可以是人、小鼠、大鼠、兔、山羊、猪或豚鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是其他类型的动物、植物、真菌、细菌或原生质细胞。细胞可以是任何原核或真核细胞。
在一些实施方案中，将细胞以一浓度装载到基底上，其中该浓度为降低超过一个细胞被装载到基底内的单个微孔中的概率的浓度。将不超过一个细胞的细胞装载到单个微孔中，可以通过将一种细胞悬浮液装载到基底上来实现，该细胞悬浮液所含的细胞数少于基底中微孔的数量。在一些优选的实施方案中，调节细胞悬浮液的浓度，以使得用于装载基底的细胞悬液中包含的细胞数量大约是基底中微孔数量的十分之一。装载到基底上的细胞悬浮液可以是基底中包含的微孔数量的大约四分之一、五分之一、六分之一、七分之一、八分之一、九分之一或十分之一。在一些实施方案中，装载包括装载细胞，使得不超过20％的细胞与其他细胞一起处于微孔中。在一些实施方案中，装载包括装载细胞，使得不超过15％的细胞与其他细胞一起处于微孔中。在一些实施方案中，装载包括装载细胞，使得不超过10的细胞与其他细胞一起处于微孔中。在一些实施方案中，装载包括装载细胞，使得不超过5％的细胞与其他细胞一起处于微孔中。在一些实施方案中，装载包括装载细胞，使得不超过1％的细胞与其他细胞一起处于微孔中。在单个微孔中找到给定数目的细胞的概率通常由泊松统计量(Poisson statistics)控制。
在一些实施方案中，本发明提供了鉴定分析物存在的方法。分析物可以是一种或多种生物分子。生物分子可以是寡核苷酸分子、DNA分子、RNA分子、mRNA分子、微RNA分子、tRNA分子等。在一些实施方案中，生物分子可以是肽或蛋白质。生物分子可以是抗体重和轻多肽链(antibody heavy and light polypeptide chains)、和/或受体多肽链(例如，T细胞受体的α和β链)。分析物可以选自抗体、蛋白质、肽、脂质、脂蛋白、氨基酸、碳水化合物、寡核苷酸、病毒、外来体或其组合。
在至少一些实施方案中，珠子具有一种或多种用于捕获(即结合)一种或多种分析物的配体。珠子可以具有一个或多个不同配体的副本，用于捕获不同的目标分析物。配体可以通过共价或非共价方式连接至珠子。配体可以是抗体、蛋白质、肽、寡核苷酸或其组合。珠子可以包含一个或多个用于进行单个细胞表达分析的核苷酸。用于单个细胞表达分析的珠子可以包含(i)多个珠子中每个珠子唯一的细胞识别标记，以及(ii)至少一种用于结合目标生物分子(即分析物)的配体。用于单个细胞表达分析的珠子可以包含一个部分(moiety)，其中每个部分包括(i)多个珠子中每个珠子唯一的细胞识别标记，(ii)用于结合目标生物分子(即分析物)的配体，以及(iii)每个部分唯一的配体索引标记。用于单个细胞表达分析的珠子可以包含多个能够与靶核酸杂交的捕获配体，其中每个捕获寡核苷酸包含(i)每个珠子唯一的寡核苷酸细胞标记，和(ii)每个捕获寡核苷酸所特有的寡核苷酸标签部分。用于根据本发明的方法、系统和试剂盒进行单个细胞表达分析的合适的珠子部分包括但不限于美国专利申请(公开号2016/0289669)中公开的那些，其全部内容基于所有目的通过引用并入本文。用于进行单个细胞表达分析的珠子的一个非限制性实施例在图9中示出。
在一些实施方案中，在将细胞封闭在珠子与微孔底部之间的分析空间中之后，从细胞分泌分析物。可以在足以允许细胞将分析物分泌到分析空间中的条件下孵育细胞。分泌的分析物可以是生物分子。分泌的分析物可以是例如细胞因子、趋化因子、mRNA、外来体、肽、蛋白质、糖蛋白、抗体或氨基酸。在一些实施方案中，可以通过裂解(例如酶促裂解)从细胞释放分析物。在一些实施方案中，将样品中的细胞封闭在珠子和微孔底部之间之后，并在进行分析之前，将其裂解。细胞裂解可以当其中的分析物是细胞内生物分子时的测定中实施。细胞裂解可以通过化学或生化手段、渗透压或通过热裂解、机械裂解或光学裂解来完成。例如，在一些实施方案中，可以通过添加细胞裂解缓冲液来裂解细胞，所述细胞裂解缓冲液包括去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)、有机溶剂(例如甲醇、或丙酮)、或其组合。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于确定靶核酸在细胞样品中的单个细胞中的出现次数的方法。该方法包括：将细胞样品装载到包含多个微孔的阵列上，并将珠子库装载到阵列上。将微孔和库中的珠子的几何形状配对，以使珠子的宽度大于微孔底部的宽度。珠子和微孔的几何形状可以如本文具体公开的那样配对。由于珠子和微孔的几何配对，将珠子装载到微孔中导致在单个珠子的底部和微孔的底部之间的空间中以小体积封闭微孔内的单个细胞。珠子库中的珠子可以包含多个寡核苷酸配体，用于捕获至少一种靶寡核苷酸。寡核苷酸配体可以与(i)对于每个珠子唯一的寡核苷酸细胞标记，和(ii)对于每次出现的寡核苷酸配体都是唯一的寡核苷酸标签共轭。图9中描述了包含有寡核苷酸配体的珠子的一个非限制性实施例。
单个细胞一旦被装入微孔并封闭在珠子底部和微孔底部之间的空间中，就可以在足以允许细胞分泌一种或多种靶寡核苷酸的条件下孵育。在一些实施方案中，裂解细胞以将靶寡核苷酸释放到珠子的底部与微孔底部之间的空间中的小体积中。当靶寡核苷酸处于珠子底部和微孔底部之间的空间中时，该靶寡核苷酸被允许与寡核苷酸配体杂交。收集具有与寡核苷酸配体杂交的靶寡核苷酸的珠子。在一些实施方案中，珠子是磁性的并且使用磁体收集。在一些实施方案中，通过使用密度比珠子密度更高的缓冲溶液(buffersolution)从微孔中移出珠子来收集珠子。一旦收集了珠子，就对杂交的靶寡核苷酸进行扩增以产生多个寡核苷酸共轭物，所述共轭物包含(i)杂交的靶核酸，(ii)与寡核苷酸细胞标记互补的寡核苷酸，和(iii)寡核苷酸标签。然后，将扩增的寡核苷酸共轭物用于确定由细胞样品内的各个细胞表达的靶寡核苷酸的出现次数。在以下参考文献中公开了扩增寡核苷酸共轭物并使它们与单个细胞表达的靶寡核苷酸的出现次数相关的方法，出于所有目的将其全部内容通过引用整体并入本文：公开号为2016/0289669的美国专利申请；Bose etal.Genome Biology(2015)16:120；以及Fan et al.Science(2015)Vol 347,Issue 6222,P.1258367-1。
在至少一个实施方案中，本发明提供了一种将样品装载到微孔中的方法。该方法可通过如本文所公开的将珠子与微孔几何配对，将样品装载到微孔中以及将珠子装载到微孔中来实践，其中将珠子装载到微孔中包括使珠子的外围与微孔壁接触，从而将珠子锚定在微孔中，并将样品封闭在锚定珠子的底部和微孔底部之间的空间内。然后可以分析样品中一种或多种分析物的存在，包括确定分析物的出现次数和/或浓度。样品的生物活性可以被测定。珠子可以包含在多个珠子中，该多个珠子被装载到包括多个微孔的基底上。
在至少一个实施方案中，本发明提供了一种用于分析样品的生物活性的试剂盒。该试剂盒可用于确定样品中一种或多种分析物的存在和/或数量。该试剂盒可包括如本文所公开的几何配对的微孔和珠子，珠子可以装载到微孔中，微孔的壁与珠子的外围接触，从而在微孔底部与珠子底部的表面部分之间形成封闭的空间，该空间在形成于珠的外围和微孔壁之间的接触面的向下方向。该试剂盒可在基底中包含多个珠子和多个微孔。多个珠子可以悬浮在液态载体内。珠子可以与配体共轭以结合本文所公开的感兴趣分析物(例如生物分子)。该试剂盒可包括多个珠子和用于形成包含多个珠子的悬浮液的单独的液态载体。珠子可以包含一种或多种用于捕获本文公开的目标分析物的配体。该试剂盒可包含一种或多种配体和用于将配体附接至珠子的试剂。该试剂盒及其各个组件可以放置在容器、包裹(wrap)(例如收缩包裹)、袋子或其他合适的包装中，并且可以包括说明书，用于分析样品生物活性、包括检测样品中包含的一种或多种分析物的存在和/或量。
实施例1–微孔分析
使用一系列具有多边形或圆锥形截头圆锥体形状的微孔，其底部直径为10-50μm，顶部直径为50-130μm，高度为30-150μm。将微孔充满培养基，并将细胞悬浮液装载到阵列上。细胞与微孔的数量比率通常为1:10，同时努力将细胞尽可能均匀地分布在整个阵列区域上。允许细胞有足够的时间沉淀在微孔底部。之后，将直径在10-100μm范围内的近乎均匀的珠子悬浮液装载到微孔阵列上，通常地，其中的珠子与微孔数量之比为1.1∶1至1.5∶1。通常用寡核苷酸或抗体对珠子的表面进行官能化，以结合细胞释放的分子。允许足够的时间使珠子沉淀到微孔中，并努力将珠子尽可能均匀地散布在整个阵列上，以确保每个微孔中都有珠子。对于不同类型的测定，下一步则是不同的。当目标是为了捕获细胞内容物时，则将微孔中的细胞裂解，并留出足够的时间使从细胞释放的分子与珠子结合。当目标是为了捕获活细胞分泌的分子时，则需要足够的孵育时间以将这些分子捕获在珠子上，在孵育过程中可选地可以刺激细胞。最终，在微孔阵列内部或外部对珠子上捕获的分子进行分析。
实施例2-微孔密封的演示
用珠子密封圆锥形微孔的实用性在一个实验中进行了测试，如图11所示，其中该微孔具有圆锥形圆锥体形状，其底部直径为140μm，深度为200μm，开口角为34°。珠子的直径为225μm，由水凝胶制成。在微孔中填充荧光素溶液(一种小分子荧光染料，分子量为332，在水中的扩散系数为425μm2/s)，填充至深度为5mm。将珠子的悬浮液装载到微孔上，并使珠子沉淀并掉入微孔中。通过重复抽吸和分配缓冲液，将微孔中的培养基交换为普通缓冲液。重复数次后，在没有珠子的微孔中没有检测到荧光，而在有珠子的微孔中，珠子下面的培养基仍然保持强烈的荧光，这表明了珠子下面存在荧光素(见图12)。然后在荧光视频显微镜下测量两个相邻微孔中小珠下的荧光素的荧光随时间的变化。将在实验开始时归一化为平均水平的两个微孔的中心区域的平均荧光水平(减去背景荧光之后)绘制在不同时间点(见图12)。结果表明，～90分钟后，珠子下方的荧光衰减至其初始水平的50％，这表明从珠子下方洗脱的荧光素洗脱得很慢，且表明珠子紧密地密封了微孔。
为了更定量地评估微孔被珠子密封的质量，在Comsol中对荧光素从微孔中珠子下方的扩散进行了数值模拟。对于直径为225μm的实心珠子，该珠子与微孔的锥形侧壁之间的间隙为0.05μm(形状和尺寸与实验中的相同)，模拟结果预测在约6分钟后珠子下方的荧光素浓度将衰减至50％(厚曲线，图12)，这比在实验中观察到的衰减时间短15倍。因此，在实验中观察到的微孔的密封比在珠子和侧壁之间有0.05μm的间隙要有效得多。另一方面，当微孔被荧光素有效扩散系数为0.062μm2/s的多孔珠紧密密封(零间隙)时，实验数据与这种情况下的数值模拟预测结果一致(细曲线，图12)。该数目比荧光素在水中的扩散系数低7,000，而与实验测量的荧光素在珠子的水凝胶材料中的扩散系数一致。因此，数值模拟的结果证实了水凝胶珠紧密地密封了微孔。
实施例3–圆锥形微孔的某些优势的演示以及微孔和珠子几何配对
将微孔配置为圆锥形可以确保只有一个珠子进入每个微孔。在涉及>10,000个单分散珠子的圆锥形微孔阵列测试中，从未观察到有一个以上的珠子进入微孔。
另外，当在圆锥形微孔中时，珠子停在圆锥形侧壁上，并定位在微孔底部上方明确界定的小距离处。当正确选择微孔的参数和珠子的直径时，珠子底部与微孔底部的细胞(或多个细胞)之间的培养基体积可以减少到最小，同时避免珠子和(多个)细胞间不必要的物理接触。该特征使得本发明的微孔对于涉及由细胞或从裂解细胞释放的分子与珠子携带的分子的杂交的测定是有利的。因为杂交以最小的体积发生，并且与细胞(或从多个细胞)释放的分子成比例地高浓度结合，所以目标分子与珠子的高效且快速的结合可以得以实现。
为了演示这一原理，微孔的底部直径制作为15μm，深度为～60μm，开口角度为34°，并将直径为30μm的单分散珠子装载到微孔阵列上。珠子和微孔底部之间的培养基体积<5pL，而珠子的底部在微孔底部上方的距离>10μm，从而在珠子和微孔底部的细胞之间提供了很大的间隙。相比之下，如Gierahn等人(Nat Methods.2017Apr；14(4)：395–398)所教导的，即在用于单个细胞RNA测序的微孔阵列中，其被半透膜覆盖，其中微孔(设计为在其中发生杂交)中的培养基的体积是～50pL，是后者的10倍，并预计会导致由细胞(或从细胞)释放的分子浓度降低10倍，且杂交速度和效率显著降低。此外，在基于液滴的测定中，通常将细胞和珠子限制在体积为1-2nL的液滴培养基中，这使得从细胞释放的分子的浓度比实施本发明的微孔配置时的浓度低至少两个数量级。
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均以相同的程度通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示通过引用整体并入一样。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间发生冲突的情况下，以本文中的术语为准。

Claims (162)

1.一种用于分析样品中生物活性的方法，所述方法包括：
a)提供包括至少一个微孔的基底，其中所述微孔包括顶部和底部；
b)将样品装载到所述微孔中；
c)将珠子装载到所述微孔中，其中将所述珠子装载到所述微孔中，在所述珠子和所述微孔的底部之间存在一空间，所述空间封闭所述样品；以及
d)分析在所述空间中的所述样品的生物活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述珠子的直径大于所述微孔的所述底部的直径。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述微孔的横截面为圆形、多边形或它们的组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述微孔的形状选自圆柱体、多面体、倒锥体、倒金字塔、半球及其组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述微孔为平截头体形状。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述基底是包括多个所述微孔的阵列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述阵列包含1至100,000,000个微孔。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述珠子的宽度大于、等于或小于所述微孔的所述顶部的宽度。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述微孔的所述顶部的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述微孔的所述顶部具有约50μm至约130μm的宽度。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述微孔的所述底部具有约5μm至约30μm的宽度。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述空间的体积为约0.1pL至约100pL。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中将所述珠子装载到所述微孔中，使所述珠子的周边与所述微孔的壁接触，从而将所述样品封闭在所述空间中。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述珠子的至少一部分突出于所述微孔的所述顶部上方。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述部分不超过所述珠子的体积的一半。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述珠子的宽度为约20μm至约100μm。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述珠子悬浮在液态载体中。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述珠子的密度大于所述液态载体的密度。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述珠子是磁性的。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中分析所述样品的生物活性包括检测所述样品中生物分子的存在或量。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述生物分子选自由抗体、蛋白质、肽、脂质、脂蛋白、氨基酸、碳水化合物、寡核苷酸及其组合组成的集合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述生物分子是DNA或RNA。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中，所述珠子包含能够结合所述生物分子的配体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述配体选自由抗体、蛋白质、寡核苷酸及其组合组成的集合。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述样品是一个细胞或多个细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中单个细胞和单个珠子装载到所述微孔中。
28.根据权利要求26所述的方法，其中多个细胞和单个珠子装载到所述微孔中。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，还包括在分析所述样品中的生物活性之前，裂解所述细胞或所述多个细胞。
30.根据权利要求20-29中任一项所述的方法，其中在检测所述生物分子的存在或量之前，将所述生物分子从所述细胞或所述多个细胞分泌到所述空间中。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在检测所述样品中所述生物分子的存在或量之前，在足以使所述细胞或所述多个细胞将所述生物分子分泌到所述空间中的条件下孵育所述细胞或所述多个细胞。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述基底包括多个所述微孔，并且装载所述珠子包括将单个珠子装载到所述多个微孔的至少一部分中。
33.根据权利要求32所述的方法，其中装载所述珠子包括使所述基底与悬浮在液态载体中的多个所述珠子接触。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中装载所述样品包括将一个或多个细胞装载到所述多个微孔的至少一部分中。
35.一种鉴定样品中产物存在的方法，所述方法包括：
a)提供包括至少一个微孔的基底，其中所述微孔具有顶部和底部，并且其中所述微孔的所述顶部的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度；
b)将样品装载到所述微孔中；
c)将珠子装入所述微孔中，其中所述珠子包含结合所述产物的配体，并且将所述珠子装入所述微孔中，在所述珠子和所述微孔的底部之间存在一空间，所述空间封闭所述样品；
d)在足以允许所述配体结合所述产物的条件下将所述样品与所述珠子一起孵育；以及
e)检测所述产物与所述配体的结合，从而鉴定所述产物在所述样品中的存在。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述微孔的横截面为圆形、多边形或它们的组合。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中，所述微孔的形状选自圆柱体、多面体、倒锥体、倒金字塔、半球及其组合。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中，所述微孔为平截头体的形状。
39.根据权利要求35-48中任一项所述的方法，其中，所述基底是包括多个所述微孔的阵列。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述阵列包括1至100,000,000个微孔。
41.根据权利要求35-40中任一项所述的方法，其中，所述珠子的宽度大于、等于或小于所述微孔的所述顶部的宽度。
42.根据权利要求35-41中任一项所述的方法，其中，所述珠子的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度。
43.根据权利要求35-42中任一项所述的方法，其中，所述微孔的所述顶部具有约50μm至约130μm的宽度。
44.根据权利要求35-43中任一项所述的方法，其中，所述微孔的所述底部具有约5μm至约30μm的宽度。
45.根据权利要求35-44中任一项所述的方法，其中，所述空间的体积为约0.1pL至约100pL。
46.根据权利要求35-45中任一项所述的方法，其中包括将所述珠子装载到所述微孔中使所述珠子的周边与所述微孔的壁接触，从而将所述样品封闭在所述空间中。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述珠子的至少一部分在所述微孔的所述顶部上方突出。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述部分不超过所述珠子的体积的一半。
49.根据权利要求35-48中任一项所述的方法，其中，所述珠子的宽度为约20μm至约100μm。
50.根据权利要求35-49中任一项所述的方法，其中，所述珠子悬浮在液态载体中。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述珠子的密度大于所述液态载体的密度。
52.根据权利要求35-51中任一项所述的方法，其中，所述珠子是磁性的。
53.根据权利要求35-52中任一项所述的方法，其中所述配体选自由抗体、蛋白质、肽、寡核苷酸及其组合组成的集合。
54.根据权利要求35-53中任一项所述的方法，其中，所述产物选自由抗体、蛋白质、肽、脂质、脂蛋白、氨基酸、碳水化合物、寡核苷酸、病毒及其组合组成的集合。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述寡核苷酸是DNA或RNA。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述寡核苷酸是mRNA。
57.根据权利要求35-56中任一项所述的方法，其中所述样品是一个细胞或多个细胞。
58.根据权利要求35-57中任一项所述的方法，其中单个细胞和单个珠子装载到所述微孔中。
59.根据权利要求35-57中任一项所述的方法，其中多个细胞和单个珠子装载到所述微孔中。
60.根据权利要求57-59中任一项所述的方法，还包括在所述检测步骤之前裂解所述细胞或所述多个细胞。
61.根据权利要求60所述的方法，其中检测所述产物包括检测细胞内产物。
62.根据权利要求57-59中任一项所述的方法，其中在所述检测步骤之前，将所述产物从所述细胞或所述多个细胞分泌到所述空间中。
63.根据权利要求62所述的方法，其中在所述检测步骤之前，在足以使所述细胞或所述多个细胞分泌所述产物进入所述空间的条件下孵育所述细胞或所述多个细胞。
64.根据权利要求35-63中任一项所述的方法，其中，所述基底包括多个所述微孔，并且装载所述珠子包括将珠子装载到所述多个微孔的至少一部分中。
65.根据权利要求64所述的方法，其特征在于，装载所述珠子包括使所述基底与一组合物接触，所述组合物包含悬浮在液态载体中的多个所述珠子。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中装载所述样品包括将一个或多个细胞装载到所述多个微孔的至少一部分中。
67.一种鉴定样品中分析物的存在的方法，所述方法包括：
a)提供包括至少一个微孔的基底，所述微孔具有顶部和底部；
b)将所述样品装载到所述微孔中；
c)将包含能够结合所述分析物的配体的珠子装载到所述微孔中，其中将所述珠子装载到所述微孔中，在所述珠子和所述微孔底部之间存在一空间，所述空间封闭所述样品；
d)在足以使所述配体结合所述分析物的条件下孵育所述样品；以及
e)检测所述配体与所述分析物的结合，从而鉴定所述样品中所述分析物的存在。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述微孔的横截面为圆形、多边形或其组合。
69.根据权利要求67或68所述的方法，其中，所述微孔的所述顶部的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度。
70.根据权利要求67-69中任一项所述的方法，其中，所述微孔的形状选自圆柱体、多面体、倒锥体、倒金字塔、半球及其组合。
71.根据权利要求67-70中任一项所述的方法，其中，所述微孔为平截头体的形状。
72.根据权利要求67-71中任一项所述的方法，其中，所述基底是包括多个所述微孔的阵列。
73.根据权利要求72所述的方法，其中，所述阵列包括1至约100,000,000个微孔。
74.根据权利要求67-73中任一项所述的方法，其中，所述珠子的宽度大于、等于或小于所述微孔的所述顶部的宽度。
75.根据权利要求67-74中任一项所述的方法，其中，所述珠子的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度。
76.根据权利要求67-75中任一项所述的方法，其中，所述微孔的所述顶部具有约50μm至约130μm的宽度。
77.根据权利要求67-76中任一项所述的方法，其中，所述微孔的所述底部具有约5μm至约30μm的宽度。
78.根据权利要求67-77中任一项所述的方法，其中，所述空间的体积为约0.1pL至约100pL。
79.根据权利要求67-78中任一项所述的方法，其中包括将所述珠子装载到所述微孔中使所述珠子的周边与所述微孔的壁接触，从而将所述样品封闭在所述空间中。
80.根据权利要求79所述的方法，其中，所述珠子的至少一部分突出于所述微孔的所述顶部上方。
81.根据权利要求80所述的方法，其中，所述部分不超过所述珠子的体积的一半。
82.根据权利要求67-81中任一项所述的方法，其中，所述珠子的宽度为约20μm至约100μm。
83.根据权利要求67-82中任一项所述的方法，其中，所述珠子悬浮在液态载体中。
84.根据权利要求83所述的方法，其中，所述珠子的密度大于所述液态载体的密度。
85.根据权利要求67-84中任一项所述的方法，其中，所述珠子是磁性的。
86.根据权利要求67-85中任一项所述的方法，其中所述配体选自由抗体、蛋白质、肽、寡核苷酸或其组合组成的集合。
87.根据权利要求67-86中任一项所述的方法，其中所述分析物选自抗体、蛋白质、肽、脂质、脂蛋白、氨基酸、碳水化合物、寡核苷酸及其组合组成的集合。
88.根据权利要求67-86中任一项所述的方法，其中，所述分析物是DNA或RNA。
89.根据权利要求67-86中任一项所述的方法，其中所述分析物是mRNA。
90.根据权利要求67-89中任一项所述的方法，其中所述样品是一个细胞或多个细胞。
91.根据权利要求90所述的方法，其中单个细胞和单个珠子装载到所述微孔中。
92.根据权利要求90所述的方法，其中多个细胞和单个珠子装载到所述微孔中。
93.根据权利要求90-92中任一项所述的方法，还包括在所述检测步骤之前裂解所述一个或多个所述细胞。
94.根据权利要求93所述的方法，其中检测所述分析物包括检测细胞内分析物。
95.根据权利要求90-92中任一项所述的方法，其中包括在所述检测步骤之前，将所述分析物从所述细胞或所述多个细胞分泌到所述空间中。
96.根据权利要求95所述的方法，其中包括在所述检测步骤之前，在足以使所述细胞或所述多个细胞将所述分析物分泌到所述空间中的条件下孵育所述细胞或所述多个细胞。
97.根据权利要求67-96中任一项所述的方法，其中，所述基底包括多个所述微孔，并且装载所述珠子包括将单个珠子装载到所述多个微孔的至少一部分中。
98.根据权利要求97所述的方法，其中装载所述珠子包括使所述基底与悬浮在液态载体中的多个所述珠子接触。
99.根据权利要求97或98所述的方法，其中装载所述样品包括将一个或多个细胞装载到所述多个微孔的至少一部分中。
100.一种用于进行测定的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)包含至少一个微孔的基底，所述微孔具有顶部和底部；以及
b)至少一个珠子，其中所述珠子的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度。
101.根据权利要求100所述的试剂盒，其中，所述微孔的横截面为圆形、多边形或它们的组合。
102.根据权利要求100或101所述的试剂盒，其中所述微孔的所述顶部的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度。
103.根据权利要求100-102中任一项所述的试剂盒，其中所述微孔具有圆柱体、多面体、倒锥体、倒金字塔、半球或其组合的形状。
104.根据权利要求100-103中任一项所述的试剂盒，其中所述微孔是平截头体。
105.根据权利要求100-104中任一项所述的试剂盒，其中所述基底是包含多个所述微孔的阵列。
106.根据权利要求105所述的试剂盒，其中所述阵列包含1至100,000,000个微孔。
107.根据权利要求100-106中任一项所述的试剂盒，其中所述珠子的宽度大于、等于或小于所述微孔的所述顶部的宽度。
108.根据权利要求100-107中任一项所述的试剂盒，其中，所述珠子的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度。
109.根据权利要求100-108中任一项的试剂盒，其中所述微孔的所述顶部具有约50μm至约130μm的宽度。
110.根据权利要求100-109中任一项所述的试剂盒，其中所述微孔的所述底部具有约5μm至约30μm的宽度。
111.根据权利要求100-110中任一项所述的试剂盒，其中，所述珠子的宽度为约20μm至约100μm。
112.根据权利要求100-111中任一项所述的试剂盒，其中，所述珠子悬浮在液态载体中。
113.根据权利要求112所述的试剂盒，其中，所述珠子的密度大于所述液态载体的密度。
114.根据权利要求100-113中任一项所述的试剂盒，其中，所述珠子是磁性的。
115.根据权利要求100-114中任一项所述的试剂盒，其中所述珠子包含配体。
116.根据权利要求115所述的试剂盒，其中所述配体选自由抗体、蛋白质、肽、寡核苷酸及其组合组成的集合。
117.根据权利要求100-116中任一项所述的试剂盒，其进一步包含裂解剂。
118.一种确定细胞样品中单个细胞生物活性的方法，所述方法包括：
a)提供包括多个微孔的阵列，每个微孔包括顶部和底部，其中所述微孔的所述顶部比所述微孔的所述底部宽；
b)提供珠子库，所述珠子库包含多个珠子，其中每个所述珠子包含至少一个部分，所述部分包含(i)每个珠子唯一的细胞识别标记，和(ii)用于结合生物分子的配体；
c)将包含多个细胞的细胞样品装载到所述阵列上，其中将所述细胞样品装载到所述阵列上包括将单个细胞装载到所述多个微孔的至少一部分中的单个微孔中；
d)将所述珠子库装载到所述阵列上，其中将所述珠子库装载到所述阵列上包括将单个珠子装载到所述多个微孔的至少一部分中，从而将所述单个细胞封闭在一空间中，所述空间位于所述单个珠子和所述微孔的底部之间；
e)在足以使所述配体与所述生物分子结合的条件下孵育所述单个细胞和所述单个珠子；
f)检测所述配体与所述生物分子的结合，并使所述结合与所述唯一的细胞识别标记相关，从而确定所述单个细胞的生物活性。
119.根据权利要求118所述的方法，其中包括将所述单个珠子装载到所述微孔中使所述珠子的周边与所述微孔的壁接触，从而将所述单个细胞封闭在所述空间中。
120.根据权利要求118或119所述的方法，其中，所述单个珠子的至少一部分突出于所述微孔的所述顶部上方。
121.根据权利要求120所述的方法，其中，所述部分不超过所述单个珠子的体积的一半。
122.根据权利要求118-121中任一项所述的方法，其中，所述珠子库中的所述珠子的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度。
123.根据权利要求118-122中任一项所述的方法，其中所述微孔的所述顶部具有约50μm至约130μm的宽度。
124.根据权利要求118-123中任一项所述的方法，其中，所述微孔的所述底部具有约5μm至约30μm的宽度。
125.根据权利要求118-124中任一项所述的方法，其中，所述微孔的横截面为圆形、多边形或它们的组合。
126.根据权利要求118-125中任一项所述的方法，其中，所述微孔的形状选自由多面体、倒锥体、倒金字塔、半球及其组合组成的集合。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述微孔为平截头体的形状。
128.根据权利要求118-127中任一项所述的方法，其中，所述空间的体积为约0.1pL至约100pL。
129.根据权利要求118-128中任一项的方法，其中所述珠子库中的每个珠子包含多个部分，每个部分包含(i)每个珠子唯一的细胞识别标记，(ii)用于结合所述生物分子的配体，和(iii)每个部分唯一的配体索引标记，并且其中所述检测步骤包括检测所述生物分子与所述多个部分的每个配体的结合，并使所述结合与所述唯一的细胞识别标记和每个配体索引标记相关，从而鉴定所述单个细胞的生物活性。
130.根据权利要求118-129中任一项所述的方法，其中所述生物分子是DNA或RNA。
131.根据权利要求118-129中任一项所述的方法，其中所述生物分子是mRNA。
132.根据权利要求118-131中任一项所述的方法，其中所述配体是寡核苷酸。
133.根据权利要求118-132中任一项所述的方法，其中每个部分包括寡核苷酸，所述寡核苷酸编码所述细胞识别标记、所述配体和所述配体索引标记。
134.根据权利要求118-133中任一项所述的方法，其中在所述孵育步骤之前裂解所述单个细胞。
135.根据权利要求118-133中任一项所述的方法，其中所述孵育包括使所述单个细胞暴露于足以允许所述单个细胞分泌所述生物分子的条件。
136.根据权利要求118-135中任一项所述的方法，其中，所述阵列包括至少100个所述微孔。
137.根据权利要求118-136中任一项所述的方法，其中，所述珠子库中的所述珠子具有约20μm至约100μm的宽度。
138.根据权利要求118-137中任一项所述的方法，其中，所述珠子库悬浮在液态载体中。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述珠子库中的所述珠子的密度大于所述液态载体的密度。
140.根据权利要求118-139中任一项所述的方法，其中，所述珠子库中的所述珠子是磁性的。
141.根据权利要求118-140中任一项所述的方法，其中包含单个珠子和单个细胞所述多个微孔的部分为约10％至约90％。
142.一种确定靶核酸在细胞样品中单个细胞中出现的数量的方法，所述方法包括：
a)提供包括多个微孔的阵列，每个微孔包括顶部和底部，其中所述微孔的所述顶部比所述微孔的所述底部宽；
b)提供珠子库，所述珠子库包含多个比所述微孔的所述底部宽的珠子，其中所述珠子包含能够与所述靶核酸杂交的多个捕获寡核苷酸，其中每个所述捕获寡核苷酸包括(i)每个珠子唯一的寡核苷酸细胞标记部分，和(ii)寡核苷酸标签部分，其中所述标签部分对于每个所述捕获寡核苷酸是唯一的；
c)将所述珠子库和包含多个细胞的细胞样品装载到所述阵列上，其中将所述珠子库和所述细胞样品装载到所述阵列上包括将单个细胞和单个珠子装载到所述多个微孔的至少一部分中的单个微孔中，并且其中所述单个珠子在一空间中封闭所述单个细胞，所述空间位于所述单个珠子和所述微孔的底部之间；
d)允许所述单个细胞释放所述靶核酸并使从所述单个细胞释放的所述靶核酸与所述单个珠子上的至少一部分所述捕获寡核苷酸杂交；
e)进行反应以产生多个寡核苷酸共轭物，每个共轭物包含所述至少一种杂交的靶核酸、与所述细胞标记部分互补的寡核苷酸和与所述标签部分互补的寡核苷酸；
f)扩增所述多个寡核苷酸共轭物；以及
g)通过使所述靶核酸与每个细胞标记部分和每个标签部分相关，确定在所述多个寡核苷酸共轭物中所述靶核酸的出现次数。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述微孔的横截面为圆形、多边形或它们的组合。
144.根据权利要求142或143所述的方法，其中，所述微孔的所述顶部的宽度大于所述微孔的所述底部的宽度。
145.根据权利要求142-144中任一项所述的方法，其中所述微孔的形状选自由圆柱体、多面体、倒锥体、倒金字塔、半球及其组合组成的集合。
146.根据权利要求142-145中任一项所述的方法，其中所述微孔为平截头体的形状。
147.根据权利要求142-146中任一项所述的方法，其中，所述阵列包括1至100,000,000个微孔。
148.根据权利要求142-147中任一项所述的方法，其中，所述珠子的宽度大于、等于或小于所述微孔的所述顶部的宽度。
149.根据权利要求142-148中任一项所述的方法，其中所述微孔的所述顶部具有约50μm至约130μm的宽度。
150.根据权利要求142-149中任一项所述的方法，其中所述微孔的所述底部具有约5μm至约30μm的宽度。
151.根据权利要求142-150中任一项所述的方法，其中，所述空间的体积为约0.1pL至约100pL。
152.根据权利要求142-151中任一项所述的方法，其中将所述珠子库装载到所述阵列上使所述单个珠子的周边与所述微孔的壁接触，从而将所述单个细胞封闭在所述空间中。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述单个珠子的至少一部分突出在所述微孔的所述顶部上方。
154.根据权利要求153所述的方法，其中，所述部分不超过所述单个珠子的体积的一半。
155.根据权利要求142-154中任一项所述的方法，其中，所述多个珠子的宽度为约20μm至约100μm。
156.根据权利要求142-155中任一项所述的方法，其中，所述多个珠子悬浮在液态载体中。
157.根据权利要求156所述的方法，其中，所述多个珠子的密度大于所述液态载体的密度。
158.根据权利要求142-157中任一项所述的方法，其中，所述多个珠子是磁性的。
159.根据权利要求142-158中任一项所述的方法，其中允许所述单个细胞释放所述靶核酸包括裂解所述单个细胞。
160.根据权利要求159所述的方法，其特征在于，所述靶核酸是细胞内核酸。
161.根据权利要求142-158中任一项所述的方法，其中在所述杂交步骤之前，从所述单个细胞分泌所述靶核酸。
162.根据权利要求161所述的方法，其中允许所述单个细胞释放所述靶核酸包括在足以允许所述单个细胞分泌所述靶核酸的条件下孵育所述单个细胞。
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