CN115667490A - 用于快速数字检测的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于样品靶分子的方法和系统。在一些实施方式中，提供了检测多个样品中靶核酸的方法。

Description

用于快速数字检测的装置和方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2020年5月26日提交的美国临时专利申请号63/030,134的优先权，该申请通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
Roth等的美国公开的专利申请2007/0281311描述了用于测量来自与荧光染料或标签偶联的微球或珠的发光的系统，其中荧光染料或标签大致指示或者是生物反应的比例。珠是磁性的，并且在成像体积中通过磁体固定，同时它们通过CCD一次多珠成像。将该系统与使用流式细胞仪的现有技术系统进行比较，在流式细胞仪中一次一个地连续检测荧光颗粒，据信在Chandler等的美国专利号5,981,180中描述了该系统。
Roth的美国公开的专利申请2007/0064990描述了用于分析荧光颗粒图像的图像处理方法，包括分析具有均匀荧光材料浓度的颗粒的第一图像和具有未知荧光材料浓度的颗粒的第二图像的方法。
发明内容
在一些实施方式中，提供了检测多个样品中靶核酸的方法。一些实施方式中，所述方法包括：
使包含样品核酸的不同样品与不同数量的固体支持物接触以形成不同的混合物，
其中所述固体支持物包含多个捕获分子，所述捕获分子结合样品靶核酸或包含所述样品靶核酸的载剂，和
其中与不同样品接触的固体支持物具有区别于与不同样品接触的其他固体支持物的特征；
使所述捕获分子与靶核酸或包含靶核酸的载剂结合，其中混合物中的固体支持物的数量高至足以使至少一些固体支持物不与靶核酸或包含靶核酸的载剂结合；
合并不同的混合物以形成批料(bulk)混合物；
将包含结合的靶核酸或载剂的固体支持物引入孔阵列中，其中各孔可以包含一种但不超过一种固体支持物或者其中孔可以包含超过一种(例如，不超过2、3、4、5或更多)固体支持物；
在各孔中检测(i)样品核酸的存在与否和(ii)固体支持物的特征；和
确定各样品的靶核酸数量，其中所述确定包括确定具有检测到的样品核酸的孔的数量，其中样品类型(identity)由检测到的固体支持物的特征确定。在一些实施方式中，确定还包括确定缺少检测到样品核酸的孔的数量。在一些实施方式中，确定还包括确定孔中珠的数量。
在一些实施方式中，固体支持物上的多个捕获分子是相同的。
在一些实施方式中，在结合之后和合并之前或之后，从固体支持物上清洗未结合的样品组分。
在一些实施方式中，孔包含亲和剂，所述亲和剂将靶核酸或包含靶核酸的载剂与孔结合。
在一些实施方式中，在引入之后，将孔覆盖。在一些实施方式中，通过油、凝胶或固体透明盖、或弹性体盖或涂有粘合剂的柔性膜覆盖孔。在一些实施方式中，扩增样品靶核酸。在一些实施方式中，在扩增样品靶核酸后，通过与孔连接的亲和剂使样品靶核酸附接于孔。
在一些实施方式中，固体支持物是珠。在一些实施方式中，珠的直径在0.1-100μm(例如，1-50μm)之间。
在一些实施方式中，特征是固体支持物的颜色。
在一些实施方式中，在引入之后和检测之前，扩增与捕获寡核苷酸杂交的样品核酸，并且其中所述检测包括检测来自孔中试剂的信号，其基于扩增的核酸的存在与否而改变。在一些实施方式中，扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。在一些实施方式中，信号是荧光。在一些实施方式中，试剂是双链结合染料、水解探针、杂交探针或CRISPR/CAS蛋白和在CRISPR/CAS蛋白旁系(collateral)切割时被切割的标记的探针。
在一些实施方式中，检测包括引入与第一靶核酸特异性结合的探针并检测探针与第一靶核酸的特异性结合。在一些实施方式中，该方法还包括从孔洗去探针，然后引入与第二靶核酸特异性结合的第二探针并检测第二探针与第二靶核酸的特异性结合。
在一些实施方式中，样品包含细胞或病毒。
在一些实施方式中，靶核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA逆转录成cDNA。在一些实施方式中，RNA在引入之前被逆转录。在一些实施方式中，RNA在引入后被逆转录。
在一些实施方式中，孔阵列是包含10,000-10,000,000个孔的载玻片。
在一些实施方式中，孔阵列具有多种不同的尺寸或体积。在一些实施方式中，固体支持物是直径比孔开口直径小不少于10％的珠。
在一些实施方式中，固体支持物的直径与孔的直径之比为1:1、或1:2、或1:3或1:4。
在一些实施方式中，孔的集合彼此分开，使得各个样品可以沉积在各孔中。在一些实施方式中，孔的集合通过垂直防溅罩分隔。
在一些实施方式中，孔具有六边形开口。
在一些实施方式中，与样品接触的所有固体支持物具有相同的捕获分子。
在一些实施方式中，与样品接触的固体支持物具有至少两种类型，其中第一类型包括与第一样品靶核酸或包含第一样品靶核酸的载剂结合的捕获分子，和第二类型包括与第二样品靶核酸或包含第二样品靶核酸的载剂结合的捕获分子。
在一些实施方式中，混合物中固体支持物的数量多于样品中靶核酸的数量。
在一些实施方式中，捕获分子是与样品靶核酸互补的寡核苷酸，并且结合包括杂交。
在一些实施方式中，包含样品靶核酸的载剂是细胞、病毒或颗粒。
还提供了检测多个样品中靶核酸的方法，该方法包括：
使包含样品核酸的不同样品与不同的多个固体支持物接触以形成不同的混合物，其中所述固体支持物包含多个捕获分子，所述多个捕获分子与样品靶核酸或包含样品靶核酸的载剂结合，任选地，其中所述多个固体支持物上的捕获分子的数量是相同的；
使捕获分子与样品靶核酸结合，其中混合物中固体支持物的数量高至足以使至少一些固体支持物不与靶核酸或包含靶核酸的载剂结合；
任选地，从固体支持物洗去未结合的样品组分；
将固体支持物引入孔阵列中，所述固体支持物包含结合的样品靶核酸或包含样品靶核酸的载剂，其中各孔可以包含不超过一种固体支持物或者其中孔可以包含超过一种(例如，不超过2、3、4、5或更多)固体支持物，其中对接收样品珠的孔的位置进行记录，从而记录对应不同样品的孔；
在各孔中检测(i)样品靶核酸的存在与否和(ii)孔的位置；和
确定各样品的靶核酸数量，其中所述确定包括确定具有检测到的样品核酸的孔的数量，其中样品类型由孔的位置确定。在一些实施方式中，确定还包括确定缺少检测到样品核酸的孔的数量。在一些实施方式中，确定还包括确定孔中珠的数量。
在一些实施方式中，该方法包括从固体支持物洗去未结合的样品组分，例如在结合和引入之间。
在一些实施方式中，孔的集合彼此分开，使得各个样品可以沉积在各孔中。在一些实施方式中，孔的集合通过垂直防溅罩分隔。
在一些实施方式中，孔包含亲和剂，所述亲和剂将靶核酸或包含靶核酸的载剂与孔结合。
在一些实施方式中，在引入之后，将孔覆盖。在一些实施方式中，用油覆盖孔。在一些实施方式中，扩增样品靶核酸。在一些实施方式中，在扩增样品靶核酸后，通过与孔连接的亲和剂使样品靶核酸附接于孔。
在一些实施方式中，固体支持物是珠。
在一些实施方式中，珠的直径在0.1-100μm(例如，1-50μm)之间。
在一些实施方式中，在引入之后和检测之前，扩增与捕获寡核苷酸杂交的样品核酸，并且其中所述检测包括检测来自孔中试剂的信号，其基于扩增的核酸的存在与否而改变。在一些实施方式中，扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。在一些实施方式中，信号是荧光。在一些实施方式中，试剂是双链结合染料、水解探针、杂交探针或CRISPR/CAS蛋白和在CRISPR/CAS蛋白旁系切割时被切割的标记的探针。
在一些实施方式中，检测包括引入与第一靶核酸特异性结合的探针并检测探针与第一靶核酸的特异性结合。在一些实施方式中，该方法进一步包括从孔中洗去探针然后引入与第二靶核酸特异性结合的第二探针并检测第二探针与第二靶核酸的特异性结合。
在一些实施方式中，样品包含细胞或病毒。
在一些实施方式中，靶核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA逆转录成cDNA。在一些实施方式中，RNA在引入之前被逆转录。在一些实施方式中，RNA在引入后被逆转录。
在一些实施方式中，孔阵列是包含10,000-10,000,000个孔的载玻片。
在一些实施方式中，孔具有六边形开口。
在一些实施方式中，与样品接触的所有固体支持物具有相同的捕获分子。
在一些实施方式中，与样品接触的固体支持物具有至少两种类型，其中第一类型包括与第一样品靶核酸或包含第一样品靶核酸的载剂结合的捕获分子，和第二类型包括与第二样品靶核酸或包含第二样品靶核酸的载剂结合的捕获分子。
在一些实施方式中，混合物中固体支持物的数量多于样品中靶核酸的数量。
在一些实施方式中，捕获分子是与样品靶核酸互补的寡核苷酸，并且结合包括杂交。
在一些实施方式中，包含样品靶核酸的载剂是细胞、病毒或颗粒。
还提供了一种用于从样品中检测靶核酸的自动化系统。在一些实施方式中，该系统包括下述中的一项或多项：
第一站，将其设置成包含样品处理容器(receptacle)的阵列，
第二站，将其设置成包含孔阵列，所述第二站与流体输送系统、热系统和检测系统偶联，其中将孔设置成在各孔中仅捕获一个珠，
转移系统，将其设置成将珠从第一站转移到第二站，
和计算机处理器，
其中第二站设置成将多个珠捕获到孔阵列中，其中各孔中仅捕获一种珠，
其中所述流体递送系统设置成将靶核酸扩增和检测试剂从试剂储库递送到孔中，
其中所述热系统设置成在孔中进行等温或热循环扩增反应，
其中所述检测系统设置成对孔阵列进行成像并对带有可检测的靶核酸产物的孔进行计数，和
所述计算机处理器设置成接收来自检测系统的信号并将计数与在第一站中与珠相关联的样品相关联。
定义
除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。通常，本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室步骤均为本领域熟知和常用的。使用标准技术进行核酸和肽合成。按照本领域和各种通用参考文献所述的常规方法进行这些技术和步骤(通常参见，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2版(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold SpringHarbor,N.Y.)，其通过引用纳入本文)，全文中提供这些参考文献。本文所用的命名以及下述分析化学和有机合成中的实验室步骤均为本领域熟知且常用。
术语“扩增反应”指用于以线性或指数方式倍增核酸靶序列拷贝的各种体外方法。这类方法包括但不限于双引物方法，例如聚合酶链反应(PCR)；连接酶方法，例如DNA连接酶链式反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202，《PCR方案：方法和应用指南》(PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications)(Innis等编，1990))(LCR)；基于QBeta RNA复制酶和基于RNA转录的扩增反应(例如，涉及T7、T3或SP6引导的RNA聚合)，例如转录扩增系统(TAS)，基于核酸序列的扩增(NSABA)，和自主维持序列复制(3SR)；等温扩增反应(例如，单引物等温扩增(SPIA))；以及本领域技术人员已知的其它方法。
“扩增”指将溶液置于足以扩增多核苷酸的条件下的步骤(如果反应的所有组分是完整的)。扩增反应的组分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”通常指靶核酸的“指数型”增长。然而，本文所用的“扩增”也可指核酸的选择靶序列数量的线性增长，如由循环测序或线性扩增所得。示例性实施方式之一中，扩增指采用第一和第二扩增引物的PCR扩增。
术语“扩增反应混合物”指包含用于扩增靶核酸的各种试剂的水性溶液。这些试剂包括酶、水性缓冲剂、盐、扩增引物、靶核酸和三磷酸核苷。扩增反应混合物还可包含稳定剂和其它添加剂以优化效率和特异性。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是指靶双链DNA的特定区段或子序列得以几何级数式扩增的一种方法。PCR是本领域技术人员所熟知的；参见例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990。示例性PCR反应条件一般包括两步循环或三步循环。两步循环具有变性步骤和之后的杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，之后是杂交步骤，之后是独立的延伸步骤。
“引物”指与靶核酸上的序列杂交并且用作核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以是各种长度的并且通常长度小于50个核苷酸，例如长度为12-30个核苷酸。可基于本领域技术人员已知的原理设计用于PCR的引物的长度和序列，参见例如Innis等(同上)。引物可以是DNA、RNA或DNA部分与RNA部分的嵌合体。在一些情况中，引物可包括一个或多个带修饰或非天然的核苷碱基。在一些情况中，引物被标记。
核酸或其部分与另一核酸“杂交”的某些条件使得生理缓冲液(例如，pH 6-9，25-150mM盐酸盐)中限定温度下的非特异性杂交最少。一些情形中，核酸或其部分与靶核酸组的共有保守序列杂交。在一些情况中，如果包括与超过一个核苷酸伴侣互补的“通用”核苷酸在内有至少约6、8、10、12、14、16或18个连续的互补核苷酸，引物或其部分能杂交至引物结合位点。或者，如果在至少约12、14、16、18或20个连续核苷酸上有0或少于2或3个互补错配，则引物或其部分能杂交至引物结合位点。一些实施方式中，发生特异性杂交的温度是室温。一些实施方式中，发生特异性杂交的温度高于室温。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度至少约37、40、42、45、50、55、60、65、70、75或80℃。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度是37、40、42、45、50、55、60、65、70、75或80℃。
本文所用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于给核酸配体碱基或核酸配体整体提供化学基团的那些修饰，所述化学基团引入附加电荷、极化性、氢键、静电相互作用、连接点和官能团。这类修饰包括但不限于：肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺修饰、4-硫尿核苷取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶取代、骨架修饰、甲基化、稀有碱基配对组合如异碱基(isobase)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸还可以包含非天然碱基，例如硝基吲哚。修饰还可包括3'和5'修饰，包括但不限于用荧光团(例如，量子点)或其他部分加帽。
附图简要说明
图1描绘了其中不同的样品在不同的容器中与具有不同颜色的不同珠混合的工作流程。珠上的寡核苷酸与样品中的核酸杂交，然后将混合物合并成一个批料混合物。随后将来自批料混合物的珠引入阵列中单独的孔中，其中靶核酸与孔内珠的颜色一起被扩增和检测。
图2描绘了类似于图1的工作流程，除了珠的颜色不同，珠是相同的，并且不形成批料混合物。相反，将来自各样品的珠的地址记录在阵列的孔中，以便来自特定孔的信号可以与原始样品匹配。
图3描绘了与图2类似的实施方式，但将两种不同的珠引入各样品中，其中两种珠具有不同的捕获分子以捕获不同的靶分子。不同的珠可以通过特征例如珠颜色来区分。
图4描绘了示例性系统，其包括8通道独立移液器，具有预先等分的含有RNA捕获珠的裂解缓冲液的96孔板，针对各样品编码颜色的珠，其能够对具有百万个微孔的载玻片(阵列)进行样品鉴定，允许各样品至少10,000个分区。示例性方案可以是：10分钟裂解和结合，然后是20分钟实时LAMP(或快速PCR)，以及在孔中进行检测，其中在50分钟内发生96个样品到结果(Sample-to-Result)。在一些实施方式中，可以每30分钟加载新的样品集合，从而能够在8小时内完成1536个样品。
图5描绘了用于实施本文所述方法的鸟瞰视图。图5显示了系统的托盘(deck)，其显示了用于同时处理96个临床样品的各种消耗品。
图6描述了这样的工作流程，其中不同颜色的珠与不同的样品混合，去除未结合的组分，然后将结合的靶分子引入六边形孔中。
图7是图6工作流程的延续。一旦将结合的靶分子引入孔中，就引入油覆盖层并且扩增靶核酸。检测靶信号以及珠颜色。
图8描绘了这样的实施方式，其中第一探针用于检测孔中的第一靶标，然后洗去第一探针并将第二探针用于检测第二靶标。
图9描绘了图9显示了微孔阵列载玻片。
图10描绘了96通道微流体反应器筒，其可以处理96个临床样品，完成从临床样品捕获靶核酸到在同一微流体反应器中扩增和检测的整个过程。各样品通道都有珠反应器，如上右分图所示。该反应器能够以单层形式容纳多个珠(例如，10,000个珠)。珠从连接到样品入口端口的入口微通道引入。多个直径较小的孔通道(例如，15微米孔通道，用于捕获20微米大小的珠)从珠反应器发出，然后全部合并到出口微通道中。多路复用筒内置多个反应器，其中各样品都有自己专用的样品入口端口(例如，样品入口1-96)，但它们都有一个出口端口，以共享同一个出口储库，该储库可连接到单个真空源以使样品和试剂流动通过不同的反应器。各反应器在反应器的一个表面上与单独可控的热循环加热器或大型组合热循环加热器配合。反应器还通过荧光扫描仪成像以检测反应器中珠的存在和/或检测珠表面上反应产物的存在。
图11显示了系统的托盘，其显示了用于同时处理96个临床样品的各种消耗品。
图12描绘了用于数字PCR的塞子(plug)。病毒颗粒(或其他靶标)与高密度捕获珠和低密度珠的浆液混合在一起。低密度珠可以用热膨胀，例如Expancel珠或溶胶-凝胶(sol-gel)珠，如在刺激下(例如加热)溶解并在去除刺激时固化的琼脂糖。在将病毒颗粒或RNA(或其他靶标)捕获到致密的捕获珠上后，添加扩增试剂，例如支持LAMP的试剂。将具有扩增试剂的整个珠浆液添加到微孔中。在珠沉降后，施加刺激，以在微孔的顶部形成塞子。例如，Expancel珠将通过在60℃下加热孔来形成塞子。另一个示例是琼脂糖珠在高于其Tm的温度下会熔化。使孔立即冷却将使其形成塞子。发生扩增反应，通过塞子将产物捕获在孔中。高密度捕获珠可以用可磁化捕获珠取代，这使得它们可以通过使用外部磁体从低溶液中下拉到微孔底部。
图13：使用CAS12的数字检测。病毒颗粒(或其他靶核酸)与捕获珠和低密度珠混合在一起。捕获珠包含固定在固体支持物上的正向和反向引物。在病毒裂解并将RNA捕获到捕获珠上的两种引物之一(例如正向引物)之后，添加扩增试剂并发生桥式扩增以产生双链DNA。CAS12复合物与双链靶标结合，导致报告分子的旁系切割产生荧光。
图14：通过荧光成像鉴定扩增后的DNA阳性孔。(上图)HEX图像。可以观察并标记含有珠的孔。(下图)Cy5图像。由于通过PCR聚合酶水解探针，载有DNA阳性珠的孔在45个PCR循环后发荧光。
具体实施方式
引言
发明人已经发现了用于检测靶分子的快速方法，该方法可以包括从多个样品中同时检测。与捕获分子连接的固体支持物可以与单个样品接触，以结合样品靶分子。可以选择固体支持物的数量，从而使得一些固体支持物保持空置(未结合)，例如但不限于因为存在比靶分子更多的固体支持物。这允许靶分子与固体支持物的数字(即存在或不存在)结合。然后，可以将结合靶分子的固体支持物引入孔阵列中，从而使各孔包含不超过一种固体支持物。在将样品引导至阵列上的物理位置的另一个实施方式中，可以将结合靶分子的固体支持物引入孔阵列中，从而使各孔包含一种或多种固体支持物。可以使用任何数量的检测试验来测定孔阵列是否存在靶核酸。各样品的阳性孔数量表示使用泊松分布统计的原始样品中靶标的数量。
可以同时测定多个样品。一方面，不同的样品与具有后期可以相互区分的特征的不同的固体支持物接触。该方面允许将批料中具有结合的靶分子的固体支持物组合和任选地操作在一起，然后添加到孔阵列中的孔中。各样品固体支持物的不同特征可以用于确定孔中分子的样品来源。或者，不需要固体支持物的不同特征，在这种情况下，具有结合靶分子的不同样品固体支持物不混合在一起，而是以已知各样品在阵列中位置的方式应用于阵列，从而能够根据阵列中的地址(位置)确定阵列中的样品来源。在已知各样品在阵列中位置，能够基于阵列中的地址(位置)确定阵列中的样品来源的情况下，可以将超过一种固体支持物加载到各孔中。
具有或怀疑具有待测定的靶分子的任何样品都可以用于本文所述的方法中。在一些实施方式中，包括靶核酸的样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、病原体(例如细菌或病毒)或任何其他生物体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(例如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(例如鸡)、或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液，血液级分或血液产品(如血清、血浆、血小板、红细胞等)，痰液或唾液，组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物，外植体，和转化的细胞，干细胞，粪便，尿液等。在一些实施方式中，样品是包含细胞的样品。在一些实施方式中，样品是含有无细胞核酸(DNA、RNA)或无细胞外泌体(包括但不限于可源自血浆、血清或尿液的外泌体)的样品。在一些实施方式中，样品可以是环境样品，例如废水、处理厂水、井水。在一些实施方式中，样品可以是经加工的食品样品，例如肉制品、蔬菜、奶酪或磨碎的种子。
本文所述的方法和系统能够同时操纵和测定多个样品。这可以例如通过将来自样品的靶分子与本文所述的固体支持物连接，然后基于不同固体支持物的类型追踪来自不同样品的靶分子来实现。或者，这可以通过定位结合样品靶分子的固体支持物在孔阵列中的特定已知位置(例如，“地址”)来实现，从而可以使来自特定位置的信号追踪到样品。
各样品可以在分开的容器中与固体支持物分别混合。固体支持物与结合样品靶分子的捕获分子相连。在一些实施方式中，可以提供预先装载有与捕获分子连接的固体支持物的容器。或者，可以将连接到捕获分子的固体支持物添加到容器中的样品中。任选地，可以将其他组分添加到混合物以改善捕获分子与样品靶分子或含有样品靶分子的载剂的结合。例如，在一个示例中，可以将一种或多种细胞或病毒裂解试剂添加到混合物中以释放细胞或病毒内容物。混合物中也可以包括缓冲剂、盐或其他赋形剂。可以使用聚结剂(crowding agent)如PEG。可以添加变性剂如硫氰酸胍以溶解混合物。可以添加蛋白酶K、离子去污剂和非离子去污剂来裂解混合物中的氨基酸。通过使用以下添加剂也可以防止对表面的非特异性吸收：例如，BSA、非多聚腺苷酸化转移RNA、随机序列寡核苷酸和多核苷酸的均聚物。可能发生分子生物学反应以改善捕获的底物对固体支持物的稳定性，例如逆转录、DNA延伸、连接和标签化。
可以使用任何种类的固体支持物，随后可将其如下所述递送进阵列中的孔中。示例性的固体支持物是珠，例如微球或其他颗粒。适用于将寡核苷酸或其他捕获分子附接到的固体支持物上的固体支持物包括可控孔度玻璃(CPG)(可购自Glen Research公司，弗吉尼亚州斯特灵)，草酰-可控孔度玻璃(参见，如Alul等，Nucleic Acids Research 1991,19,1527),TentaGel支持物(其是氨基聚乙二醇衍生化支持物(参见例如Wright等，Tetrahedron Letters 1993,34,3373))，聚苯乙烯，二氧化硅，玻璃，琼脂糖，藻酸盐，Poros(其是聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物)，或可逆交联丙烯酰胺，或其聚合物共混物。固体支持物可以是不同材料的组合，例如含有不同材料的较小微粒的凝胶珠。在一些实施方式中，复合支持物材料可以是具有特定直径(例如，20-50微米)但包含多个微米尺寸的磁性颗粒的凝胶珠。在一些实施方式中，复合支持物材料可以是凝胶珠(例如，20-50微米)，其含有多个亚微米尺寸的含有纳米颗粒的亲和分子。固体支持物可以是在表面上涂覆有亲和层的凝胶珠。在一些实施方式中，固体支持物是具有可逆交联的聚丙烯酰胺珠，例如基于Bac(N,N'-双(丙烯酰基)胱胺)的那些。许多其他固体支持物是可商购的并且可用于将寡核苷酸附接于其上。固体支持物还可以具有结合在其表面上对核酸具有亲和力的分子，例如聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，聚酰胺胺，组氨酸，N-2-乙酰氨基-2-氨基乙磺酸(ACES)，N-2-乙酰氨基-2-亚氨基二乙酸(ADA)；N,N-双2-羟乙基-2-氨基乙磺酸(BES)；N,N-双-2-羟乙基甘氨酸(BICINE)；双-2-羟乙基亚氨基三羟甲基甲烷(Bis-Tris)；1,3-双三羟甲基甲基氨基丙烷(Bis-Tris丙烷)；3-N,N-双-2-羟乙基氨基-2-羟基丙磺酸(DIPSO)；2-羟乙基哌嗪-N-3-丙磺酸(EPPS)；2-羟乙基哌嗪-N-4-丁磺酸(HEPBS)；2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)；2-羟乙基哌嗪-N-2-丙磺酸(HEPPSO)；2-N吗啉代乙磺酸(MES)；4-N-吗啉代丁磺酸(MOBS)；3-N-吗啉代丙磺酸(MOPS)；3-N-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)；哌嗪-NN-双-2-乙磺酸(PIPES)；哌嗪-N-N-双-2-羟基丙磺酸(POPSO)；N-三羟甲基-甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)；3-N-三羟甲基-甲基氨基-2-羟基丙磺酸(TAPSO)；N-三羟甲基-甲基-2-氨基乙磺酸(TES)；N-三羟甲基甲基甘氨酸(TRICINE)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；多羟基化咪唑；和三乙醇胺二聚物。表面涂层还可以包括但不限于金属，例如金、银、钢、铝、硅和铜，或非金属，例如石墨、碳纳米管、石墨烯等。
在一些实施方式中，固体支持物是珠(例如，硅胶、玻璃(例如，可控孔度玻璃)、磁珠、塑料、金属、聚苯乙烯或聚合物珠)。在一些实施方式中，珠具有直径约1μm至约100μm的尺寸。可以基于分区的尺寸(例如，本文讨论的微流体通道或液滴的尺寸)来选择珠直径。
本领域已知包含与固体支持物表面偶联的寡核苷酸的珠，包括条形码标记的寡核苷酸，以及制备此类颗粒的方法。参见例如US 6,133,436；US2011/0028334；和国际申请号PCT/US2015/037525，通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，珠的直径在0.1-100微米之间，例如1-50微米。如本文所述，选择固体支持物的侧面和孔开口，从而使只有一种固体支持物适合于阵列的孔内。在一些实施方式中，珠具有足够的密度以在水性溶液中沉降在孔底部并且在液体(例如油)流过孔的开口时保持。在一些实施例中，珠是有浮力和磁性的，能够使用磁体将其拉下，但在磁力释放时释放并能够逆重力漂浮。
捕获分子可以任何方便的方式附接于固体支持物。在一些实施方式中，介入接头部分可以用于将捕获分子与固体支持物连接。在一些实施方式中，接头分子可以是PEG分子或树枝状大分子。接头分子还可以在接头和核酸结合部分之间具有与其附接的可裂解部分。例如，寡核苷酸可以偶联至作为凝胶聚合底物的聚合物部分，例如丙烯酸亚磷酰胺(acrydite)。生物素化的寡核苷酸可以直接与链霉亲和素偶联的珠结合。在一些实施方式中，捕获分子探针通过“点击”化学部分附接于固体支持物。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的叠氮化物和炔的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述，参见Kolb等，Agnew Chem 40:2004-2021(2001)。
可以使用可以结合靶分子的任何分子。在靶分子是核酸的实施方式中，捕获分子可以是多核苷酸，例如寡核苷酸。寡核苷酸可以是任何长度。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为5-500或5-100个核苷酸。寡核苷酸可以包括与靶核酸部分或完全互补的捕获序列。捕获序列可以具有适当的长度和互补性，以在该方法的条件下与靶核酸杂交。在一些实施方式中，捕获序列具有至少5、7、9、10、12、15、20或更多个与靶核酸互补的连续或非连续核苷酸。在一些实施方式中，其中mRNA是靶核酸，捕获序列可以是多聚T序列。在一些实施方式中，捕获序列是随机序列或基因特异性序列。在一些实施方式中，通过在特定酸性pH下呈现正电荷的分子捕获核酸，并在中性或碱性pH下释放核酸。在一些实施方式中，核酸仅为RNA。在一些实施方式中，核酸包含散布的DNA和RNA核苷酸。在一些实施方式中，封闭捕获寡核苷酸的3'端，例如，通过反向T。在一些实施方式中，捕获寡核苷酸可以含有LNA、PNA和/或MGB基序。
在其他实施方式中，捕获分子可以是蛋白质、多糖、适体或结合靶标的其他化学部分。例如，蛋白质可以是特异性结合靶分子的抗体。在一些实施方式中，捕获分子可以包含与生物素化靶分子结合的链霉亲和素。在一些实施方式中，捕获分子可以包含与链霉亲和素偶联的靶分子结合的生物素。在一些实施方式中，捕获分子可以是与细胞表面上呈递的抗体结合的抗原。
在一些实施方式中，选择捕获分子，以特异性地捕获靶分子。例如，特定的核苷酸序列或蛋白质。在其他实施方式中，选择捕获分子，以捕获一类分子(具有共同的结构特征)，例如所有核酸，具有多聚A序列的mRNA，特定类型的所有蛋白质等。
在许多实施方式中，附接于固体支持物的捕获分子将以多个拷贝出现。在一些实施方式中，特定固体支持物上的所有捕获分子将是相同的。在一些实施方式中，不同的固体支持物可以附接于相同捕获分子的相同拷贝，即使得与样品接触的所有固体支持物具有仅一种捕获分子的多个拷贝。在其他实施方式中，与相同样品接触的不同固体支持物将具有不同的捕获分子。例如，样品可与具有针对靶标A的相同捕获分子的第一固体支持物(或多个第一固体支持物)和具有针对靶标B的相同捕获分子的第二固体支持物(或多个第二固体支持物)接触，从而通过固体支持物捕获靶标A和B。或者，固体支持物可以各自包括两种或更多种不同的(结合不同靶标的结合分子。在该方面中，固体支持物将具有例如结合靶标A的结合分子(或多个)和结合靶标B的单独的结合分子(或多个)。在另一个实施方式中，固体支持物不仅具有用于使用特异性或非特异性结合从裂解物中捕获核酸的分子，并且固体支持物还具有能够在微球表面进行桥式扩增的靶特异性正向和反向引物。
如本文所述，在一些实施方式中，与不同样品接触的固体支持物具有不同的可检测的特征，从而可以将该特征用于追踪固体支持物与何种样品接触。在一些实施方式中，可以通过视觉检查来评估特征，任选地使用照相机和/或扫描仪。例如，在一些实施方式中，固体支持物具有不同的颜色或反射不同波长的光，从而可以视觉检测和区分与不同样品接触的固体支持物。区分参数可以来自影响光散射的尺寸、组成、物理特性，赋予珠不同发射光谱和/或散射特性的可激发荧光或有色染料，或一种或多种荧光染料的不同浓度。当区分参数是荧光染料或颜色时，可以将其涂覆在珠的表面，包埋于珠中，与固体支持材料的分子(例如捕获分子)直接结合，或与固体支持材料的分子(例如捕获分子)间接结合。例如，与捕获分子互补的荧光寡核苷酸可以共价或可逆方式与捕获分子结合。在另一实施方式中，使用单一颜色，但各样品批次具有不同的阶梯状荧光强度。在一些实施方式中，使用包括不同阶梯强度的各单个固体支持物的颜色组合来产生珠颜色特征。在一些实施方式中，荧光在照明期间具有不同的猝灭率以区分不同的样品批次珠类型。
在一些实施方式中，固体支持物与荧光半导体聚合物点(pdot)偶联或包含pdot，从而能够区分不同的固体支持物。这种点的示例述于例如，Wu,C.,等,Chem.Mater.21:3816-3822(2009)；Rahim,N.A.A.,等,Adv.Mater.21:3492-3496(2009),Rong等,ACS Nano7(1):376-84(2013)；专利公开US2013/0266957；WO 2012/054525；和US 2012/0282632。发色pdot可以通过将聚合物塌缩成稳定的亚微米尺寸的颗粒来产生。本文提供的pdot纳米颗粒可以通过本领域已知的用于使聚合物塌缩的任何方法形成，包括但不限于依赖于沉淀的方法、依赖于乳液(例如微乳液或微乳液)的形成的方法和依赖于缩合的方法。pdot纳米颗粒大小取决于用于生成pdot的聚合物的分子量(参见例如，Zhang,Y.,等,Chem Sci.6(3):2102-2109(2015)和美国专利9382473)。
在针对不同样品的固体支持物具有不同特征的实施方式中，在不同的固体支持物与不同的样品接触并将样品中的靶分子与固体支持物上的捕获分子结合后，通过捕获分子与靶分子结合的固体支持物可以合并成批料混合物。因为可以根据不同的特征将不同的固体支持物可以连接回其所接触的样品，所以可以追踪各珠来自何种样品。由于随后将固体支持物置于单独的孔中，可以单独地分析各个珠。
作为使用具有区别特征的固体支持物的替代方案，在一些实施方式中，固体支持物是相同的或至少基本相同的。在这些方面中，在捕获各样品的靶分子之后，来自不同样品的固体支持物保持彼此分离(它们并不混合)并且可以并行进行捕获的靶分子的任何反应或操作。在任何处理之后，将来自各样品的珠置于孔阵列中的已知位置(下文将更详细地讨论)，从而使得这些位置的地址指示获得靶分子的样品。
如本文所述，具有捕获分子的多种固体支持物与各样品接触。选择所使用的固体支持物的数量，从而在与样品接触后，使一些固体支持物保持没有结合的靶分子。这可以例如通过使用比靶分子多的珠来实现。或者，由于结合剂彼此之间的泊松分布，在一些实施方式中，使用的珠比靶分子少，但是实际上，一些固体支持物将结合至处于泊松分布的多个靶分子。
在将样品与附接有捕获分子的固体支持物混合后，可以在允许捕获分子与样品中靶分子结合的条件下孵育混合物。例如，在一些实施方式中，条件允许捕获寡核苷酸与靶核酸杂交。可以将样品引入到容器(可以是预包装的)中，该容器包含附接有捕获分子的固体支持物，以及任选地包含促进结合的缓冲液、盐或其他组分的溶液。在一些实施方式中，容器可以包括其他成分，例如试剂，诸如去污剂(NP-60、SDS、吐温、曲通X-100等)，变性剂(UREA、硫氰酸胍、甲酰胺)、还原剂(DTT、TCEP)，酶(Labiasem溶葡球菌酶、溶菌酶、无色肽酶(Achromopeptidase)、溶细胞酶、蛋白酶K、DNA酶)和样品调节分子(EDTA、离子、BSA、运载体核酸、PEG)，它们裂解细胞或协助靶分子与样品中的固体支持物结合。
在一些实施方式中，捕获分子与包含或含有靶分子的载剂结合。例如，载剂可以是合成构建体，例如珠，例如水凝胶、液滴、支化聚合物或交联的DNA/蛋白质结构或天然载剂，可以包括但不限于细胞、病毒，或外泌体。
一旦固体支持物上的捕获分子已经捕获了靶分子(或包含靶分子的载剂)，并且任选地来自不同样品(例如，2、5、3、5、10、20、50、96、384、1536或更多)的固体支持物已经合并，那么将固体支持物递送至一个或多个孔阵列，从而使固体支持物置于孔阵列中。固体支持物可以诸如美国专利号9,103,754和10,391,493中所述基本上随着递送细胞至孔中而递送至孔中。单个固体支持物捕获优选通过将含有一组固体支持物(具有捕获靶分子)的等分试样沿平行方向(例如，基本平行，在0.1度的平行度内、1度的平行度内、45度的平行度内、完全平行等)在孔阵列上的流体层内流动或分配至基材的宽表面来实现，并且一旦固体支持物在重力的影响下通过流体层下降到孔阵列就捕获固体支持物。或者，单个固体支持物捕获可以通过将含有一组单一固体支持物的等分试样以垂直于基材的宽表面的方向递送至孔阵列上的流体储库所提供的流体层中，并且一旦固体支持物在重力或磁力的影响下通过流体层下降到孔阵列中就捕获固体支持物。然而，在一些变体中，单个固体支持物捕获可以另外或替代地通过促进单一固体支持物转移到孔集合中孔中的任何合适的机制来实现。此外，任选地，将该系统设置成阻止不希望存在的流体流，该不希望存在的流体流可以将固体支持物从基材提升或者将固体支持物从捕获固体支持物捕获并将其完全保留在其中的孔腔中移动。然而，在一些变体中，该系统可以设置成促进固体支持物以任何合适的方式移动。流体通过系统的流动路径优选多向且均匀的，从而使系统中的各固体支持物经历一致的条件(例如，沿流动性质如压力、密度、温度、溶液组成和其他合适的特性的流动路径的梯度长度尺度很大程度上相对于系统的长度尺度)；然而，流动路径也可以是单向的、双向的，或具有任何其他合适的一种或多种特性。
任选地，可以洗涤固体支持物(例如，用缓冲液)以去除未结合的分子。如果存在，洗涤可以在来自不同样品的固体支持物合并之前或之后和/或在将固体支持物引入孔阵列之前或之后发生。在一些实施方式中，在基于乙醇的溶液中将固体支持物递送至孔中。一旦固体支持物位于孔中，允许乙醇干燥，在孔中留下带有结合的靶标的固体支持物。
任选地，可将固体支持物捕集于孔内。在一些实施方式中，溶胶形式(sol form)或粉末悬浮液的周围水凝胶基质与固体支持物一起流入孔中，然后当固体支持物位于孔中时将其转化为固体形式。在一个实施方式中，将较小珠的浆料与固体支持物一起加载，阻止固体支持物在加载后移动。在一个实施方式中，在加载固体支持物后，将半透膜置于孔上。如下文更详细讨论的，孔可以包括能够使来自固体支持物的靶分子与孔表面结合的官能化表面。
如果靶分子是RNA，那么可以通过在来自不同样品的固体支持物合并之前或之后以及在将固体支持物引入孔阵列之前或之后引入逆转录酶和合适的试剂来进行逆转录(RT)，以形成第一链cDNA。或者未将来自不同样品的固体支持物合并成混合物的情况中，可以在将固体支持物引入孔阵列之前或之后进行RT。
在一些实施方式中，设置孔阵列的尺寸，使得孔中能够具有一种且仅有一种固体支持物。固体支持物通常是球形的(例如珠)。然而，在一些实施方式中，孔的尺寸可以大至足以使各孔接受多达2、3、4、5、6、7、8、9或10种固体支持物。孔阵列可以是不同深度的孔的组合，从而可以在微孔中容纳不超过量子(0、1、2、3、4、5等)数量的相同尺寸的珠并且预先确定具有特定深度的各种类型的微孔的位置。
示例性的孔阵列和孔的描述可以在例如美国专利号9,103,754和10,391,493中找到。孔阵列(微孔集合、微孔、孔)用于捕获固体支持物，任选地在可寻址的已知位置。因此，优选地，将孔阵列设置成促进以单一固体支持物形式或任选地以如上所述的小组固体支持物中的至少一种形式进行固体支持物捕获。
优选地，将孔阵列限定在基材的上宽表面，孔阵列中的各孔包括限定在基材内并且靠近第二侧(例如下宽表面)的底部表面，直接与底部表面相对并靠近上宽表面的开口表面，以及在底部表面和限定孔的孔腔体的开口表面之间延伸的壁集合。
孔阵列可以限定在基材的活动区，其中该活动区可以是基材的任何合适的基材面积(例如，1平方英寸，10cm，2平方英寸，3平方英寸，4平方英寸等)。优选地，基材的活动区(和孔阵列)可以通过系统100的其他组件访问，其包括成像子系统、流体递送模块、热控制模块和/或提取模块，从而如本文所述进行隔离、处理和分析固体支持物和捕获的靶分子。孔阵列120可以包括任何合适数量的孔(例如，100、1,000、10,000个孔、50,000个孔、100,000个孔、100万个孔、200万个孔、300万个孔、400万个孔、500万个孔、600万个孔、700万个孔、900万个孔、1000万个孔、5000万个孔等的规模)。在优选的变体中，孔阵列包括至少250,000个孔。在具体示例中，孔阵列包括大约100万个孔。然而，孔阵列可以设置成任何其他合适的方式。
优选地，开口表面是基材中的开口，其提供通向孔的底部表面的通路，并且设置成从垂直于基材上宽表面的方向接收固体支持物。因此，开口表面可以具有大于、小于或等于底部表面的特征尺寸(例如，宽度、直径、周长等)。在一个示例中，底部表面或开口表面的尺寸可以在20-100微米之间，并且孔腔的高度可以在20-200微米之间。在另一个变体中，底部表面和/或开口表面的特征尺寸可以在20-100微米之间，并且孔腔的高度可以在10-200微米之间。然而，在其他变体中，孔阵列内任何尺寸的孔，包括孔腔高度和孔腔宽度，可以是0.5微米-50微米之间的任何值，并且任选地，可以基于系统将进行的测试和/或固体支持物的尺寸来选择。孔阵列的开口面积(即，孔集合中各孔的开口表面的加和总面积)优选大于限定孔的基材区域的总面积的50％；更优选开口面积大于总面积的80％。然而，开口面积可以是任何合适的部分面积或基材总面积的百分比。
各孔的开口表面优选与基材的上表面齐平对齐(例如，在表面平面处)，但也可以略微嵌入基材或以其他方式设置。优选地，孔阵列的孔的开口表面与基材的表面平面对齐，其中开口表面的水平轴与表面平面同轴。在一个示例中，表面平面可以是具有平行于基材上宽表面的侧面的平面，并且限定在基材的上宽表面和基材上宽表面上方的空间区域的交叉处。在一个具体示例中，表面平面是空间边界，布置在基材上宽表面和位于孔阵列上方流体储库的下部区域之间，并且限定在孔阵列的开口表面和流体储库内的流体路径之间。在一些实施方式中，流体流在孔的开口表面无法接触到表面平面下方孔中接收到的固体支持物，因此认为孔的孔腔完全保留了这些固体支持物，而流体流可以接触到横穿表面平面或保留在表面平面之上的固体支持物，并沿流体路径下游传输，因此认为孔腔部分保留这些固体支持物和/或未保留这些固体支持物。然而，表面平面可以附加地和或替代地相对于基材和/或孔阵列的任何尺寸布置。此外，各孔的开口表面可以相对于基材、流体储库和/或流体路径的任何区域定位。
在优选的变体中，各孔的开口表面与流体路径直接流体偶联并直接位于孔阵列的上方和横向上方。为了增强流过孔阵列开口表面的流体流动，各孔的开口表面可以任选地包括涂层(例如疏水的、亲水的、静电材料、化学吸引的等)或物理特征(例如纹理化、缺口、脊状等)。此外，各孔的开口表面可以任选地包括被动或主动保留特征以保留和保持单一或少量固体支持物(例如，当孔腔被占据时，物理或化学触发以增加或减少孔的开口表面)。在其中开口表面具有小于底部表面的特征尺寸的一个示例中，孔可以具有形成开口表面的边界的边缘，从而提供小于底部表面的特征尺寸。边缘可以是平面的或非平面的，并且可以进一步促进将单个细胞或单个细胞簇保留在孔中。各孔的开口表面的变化可以定义用于将细胞和/或颗粒接收到孔腔中的任何几何形状，包括圆形开口、矩形开口、六边形开口或任何其他合适的形状是可能的。然而，开口表面可以包括促进流体流动或从孔阵列的孔接收固体支持物的任何其他合适特征。
底部表面优选地平行于、对称于并且直接相对于开口表面；然而，在一些变体中，底部表面可以替代地与开口表面不平行、不对称和/或偏离。类似于基材的上宽表面，底部表面可以是平面或非平面，并且在具有非平面表面的底部表面的变体中，非平面表面可以包括具有任何合适的几何特征的凸出和/或凹入部分。附加地或替代地，底部表面可以是下述中的任何一种或多种：纹理化的(例如，以促进所需的流体流动行为，以吸引或排斥给定的颗粒类型等)，以所需孔隙度为特征的，以所需表面处理为特征的，以固定的颗粒或生化部分为特征的，和以任何其他合适的特征为特征的，所述任何其他合适的特征以任何其他合适的方式促进细胞接收和/或保留。虽然在一些变体中，底部表面是封闭的，使得没有流体从腔室的开口表面流过腔室的底表面，但是可以将底部表面任选地设置成包括一个或多个流体通道以允许流出特征尺寸小于目标单元的颗粒，从而离开孔腔。然而，可以任何其他合适的方式设置底部表面。
关于底部表面和开口表面，各孔优选具有在底部表面和开口表面之间延伸的至少一个壁(例如，壁集合)。在变体中，各孔的壁至少将单个孔与至少一个其他相邻孔部分物理地和流体地分开，限定孔的深度、宽度和/或横截面尺寸，并且优选垂直于开口表面水平轴所限定的平面。优选地，壁的壁厚在4-5微米之间，但可以是小于10微米的任何尺寸。壁可以从开口表面所限定的平面垂直延伸到底部表面以限定孔腔；如此，在一些变体中，孔阵列中各孔的孔腔可以是棱柱形的(例如，圆柱棱柱形、六角棱柱形、多边形棱柱形、非多边形棱柱形等)。在一个具体示例中，各孔的孔腔限定为六棱柱。然而，在其他变体中，壁可以任何其他合适的方式在开口表面和基部表面之间延伸(例如，曲面的壁、直的壁、弯曲的壁等)。例如，壁可以从开口表面到底部表面(例如，通过形成离散的台阶，以具有任何合适斜率的线性或非线性方式通过逐渐调整特征尺寸)逐渐减小孔的特征尺寸(例如，直径、水平横截面、垂直横截面)。然而，在一些变体中，孔可能不具有垂直于由开口表面限定的平面的明确界定的壁(例如，底部表面可以某种方式直接延伸到开口表面，而不形成垂直于开口表面的壁)。在示例中，底部表面和开口表面可以在有或没有壁的情况下分开0.5微米-50微米(例如，大约25微米或大约40微米)的距离(例如，孔腔的高度)。然而，孔阵列的孔可以设置成具有任何其他物理特性和/或尺寸，从而进行方法中描述的分离、处理和分析步骤。在一些实施方式中，方法可以包括根据希望捕获的靶标固体支持物的尺寸以及使用系统(例如本文所述的系统)进行特定试验所需的其他参数来选择具有特定尺寸、数量、几何形状、空间布置和/或任何其他合适的特征的孔阵列。附加地或替代地，壁集合可以包括通道集合，所述通道将各孔流体偶联到孔阵列中至少一个相邻的孔。在这类变体中，通道集合中的一个或多个通道可以限定在相邻孔之间的基材区域内，或者可以通过相邻孔的重叠部分来限定。在特定示例中，通道可以具有5微米的特征尺寸，并且在特定示例的变体中，通道可以具有范围从0.5微米-75微米的特征尺寸。
优选地，孔阵列的壁由与基材相同的材料构成(如前一节所述)，但是任选地，可以由任何其他合适的材料构成，以赋予孔阵列的孔腔体所需的物理或化学性质。例如，可以将壁设置成对于已经进入孔腔的溶液中的各种颗粒或流体是不可渗透的或半渗透的，并且附加地或替代地，将其设置成永久或非永久刚性的、柔性的或变形的(例如，具有膨胀打开或折叠关闭的能力)，以控制细胞和/或颗粒进入孔。
孔阵列中各孔的孔腔的内表面(例如，任选地，面向孔腔内部的壁的侧壁可以设置成与保留在孔腔内的内容物(例如，捕获的固体支持物、生物材料、非生物材料、非细胞颗粒、细胞-颗粒对等)相互作用。为了允许这类相互作用，内表面可以包括位于孔腔所有侧壁的表面结合部分或官能性特征(物理或化学)，但是其也可以位于孔腔的任何合适部分或特定区域(例如，在底部表面、靠近开口表面、沿着侧壁等)。在第一变体中，内表面包括官能性表面涂层，将其设置成结合捕获的固体支持物已经释放的核酸内容物。官能性表面涂层可以是合成的、动物来源的、人来源的或植物来源的蛋白质。在一个实例中，官能性表面涂层允许生物素化的表面化学物质(例如，生物素-链霉亲和素接头)与包括官能性接头的探针结合。然而，可以将孔的内表面的官能性表面涂层设置成以任何其他合适的方式结合保留在孔腔内的任何内容物。在第二变体中，将官能性表面涂层设置成物理地保留和/或操纵捕获的内容物，例如使捕获的颗粒朝向特定方向以进行下游分析(例如，光学成像)。在一个实例中，官能性表面涂层包括提供粘性层以粘附于捕获的靶细胞区域的聚合物或蛋白质(例如，聚合物粘合剂、儿茶酚-聚苯乙烯、聚-D-赖氨酸、纤连蛋白、胶原、玻连蛋白等)。在另一示例中，官能性表面涂层包括将细胞吸引到孔的开口表面的聚合物或蛋白质，或者是位于孔的开口表面以控制颗粒进入孔的半永久性屏障。在第三变体中，将孔的内表面设置成添加化学试剂(例如，与细胞相互作用的药物、控制孔内溶液pH值的试剂、控制孔内流体密度的试剂)，生物化学试剂(例如荧光标志物、抗体等)和/或处理试剂(例如，包含在定时释放的递送载剂/微球中的裂解缓冲液等)，从而对捕获的细胞进行下游测定和分析。在第四变体中，孔的内表面可以包括物理特征以增加、减小或改变表面积(例如，孔腔内的脊、突起、孔、凹痕)。此外，物理特征可以包括已固定在孔内的官能化微粒，增强对孔内保留的内容物的光学访问和光学询问的反射组件，和/或操纵孔内细胞或颗粒位置的磁性元件。
虽然孔阵列中的各个孔可以是基本上相同的，但是任选地，孔阵列可以包括在任何合适的特征(例如，尺寸、形态特征、机械特征、表面涂层特征、导热特征、导电特征等)上彼此不相同的孔。因此，该系统的一些变体可以设置成在可寻址的位置中捕获多种颗粒类型和多种格式的颗粒中的至少一种，用于处理和分析。
在包括孔子集的变体中，子集可以彼此分离。在第一变体中，各子集可以通过其中未限定孔的基材的部分(例如，宽表面的平坦区域)与其他子集分开。在第二变体中，子集可以是连续排列的孔的流体隔离区域，其中特定子集的孔都未与另一子集的孔流体偶联。在一个实施方式中，可以使用分开的可寻址子集来接收来自不同样品的固体支持物(例如，其中来自不同样品的固体支持物已经混合并且通过它们在阵列中的位置进行跟踪)。在一些实施方式中，可以通过垂直防溅罩将子集分隔，所述垂直防溅罩防止从基材上方施加流体时污染不同子集。在一个具体示例中，基材限定孔阵列的不同子集，例如，排列在2×6的网格中，这些子集通过宽表面的平坦区域与相邻子集分开，阵列边缘之间具有均匀的间距(例如，1mm、100微米、3mm等)。孔的子集可以进一步分组(例如，在250,000个孔的孔集合的20,000个孔的子集中的7孔组)，并且可以通过各孔的通道集合提供孔之间(例如，子集中、组之间等)任何合适的相互连接。这样的构造能够允许通过孔的组进行高效的珠捕获(例如，通过包括7个相互连接的孔的组)，同时允许孔集合暴露于多个不同的样品(例如，各孔集合的子集一个样品)。在一个示例中，孔可以是直径为大约30微米、深度为30微米和壁厚度为4-5微米(例如，提供了更高效的细胞捕获)。然而，在相关变体中，任选地，孔阵列可以任何合适的方式细分和/或互连。孔子集和/或孔组可以任何合适的方式布置。例如，子集可以以直线方式布置(例如，孔子集的网格布局)，组可以堆积构造(例如，六边形密堆、正方形格等)布置，反之亦然；组和子集的布置优选彼此独立，但是任选地，可以基于彼此(例如，子集以直线方式布置，因为组以直线方式布置)。此外，系统100的各基材110可以具有单个孔阵列，或者可以具有以任何合适的方式(例如，辐射状构造、矩形构造、线性构造、曲线构造、随机构造等)限定于基材的多个孔子集。
在孔阵列的具体示例中，可以使用光刻蚀刻工艺将孔阵列压印到塑料(例如，材料COP480R)中。然后可以在包含孔阵列的活性区域周围提供流体储库(例如，胶合的或以其他方式附接)，所述流体储库能够在使用期间放置相对大的液体样品(例如，0.5mL-5mL)。在一些实施方式中，可以包括两个微通道，它们用作与活性区域处的孔阵列流体偶联的储库的入口和出口。可以将包含固体支持物的样品(例如，体积高达1ml)分配到流体储库中，所述流体储库由围绕基材活性区域的流体输送模型的第一板的凹入区域形成。随着时间的推移，样品中存在的固体支持物将通过储库中的流体层沉降(例如，重力诱导的进入)，并通过孔的开口表面进入孔腔的内部。在特定应用中，沉降时间取决于固体支持物的大小。一旦固体支持物进入孔腔，使得固体支持物的全部体积完全包含在孔腔内(例如，完全保留、下降到表面平面下方、下降到孔开口表面下方)，以单一固体支持形式(或如本文在某些情况下所讨论的，以少于10个、少于5个等为一组)将其捕获。因为孔阵列中各孔之间的壁很薄(例如，小于10微米厚、小于5微米厚等)，所以大多数固体支持物倾向于沉降在内部并完全保留在孔内，而不是在孔的顶部或由孔部分保留。在一些实施方式中，孔的深度不超过固体支持物直径的1.2、1.3、1.4、1.5、1.6或1.7倍。
此外，孔阵列优选布置在堆积阵列中，但是可以任选地以任何其他合适的方式布置。在一个示例中，孔阵列可以布置成六边形密堆阵列。在另一个示例中，孔阵列可以布置成矩形阵列。在另一个示例中，孔阵列可以以任何合适的不规则或不均匀的方式布置，例如，以促进流体从孔阵列的一部分流到孔阵列的另一部分。或者，可以孔之间任何合适的间距(例如，以密堆或非密堆构造)并以任何其他合适的方式布置孔阵列。
在孔集合的特定示例性构造中，孔阵列以六边形密堆构造布置，其中孔阵列的各孔包括与基材的宽表面(例如，表面平面)对齐的六边形开口表面。此外，各孔在与六边形开口表面相对的底部表面处包括六边形印记(footprint)。在一些实施方式中，孔阵列的各孔具有形成六角棱柱的孔腔(例如，包括厚度为约5微米、高度为约25或40或20-30微米和特征宽度为约25(例如20-30)微米的壁集合)，并且在一些实施方式中，固体支持物是直径为18-22例如20微米的珠。然而，孔阵列可以设置成任何其他合适的方式。
在系统的一些变体中，孔阵列的一个或多个孔可以进一步包括促进刺激和/或检测孔阵列一个或多个孔处参数(例如，存在或不存在检测到的靶分子参数)的任何其他合适的元件。在一个示例中，孔阵列的一个或多个孔可以包括在孔表面处包埋于基材中的电极，从而有助于检测来自孔的内容物的生物电信号，和/或有助于刺激孔的内容物。在示例的变体中，可以将电极包埋并在底部表面和孔壁之一具有暴露部分。在其他示例中，一个或多个孔可以与通道偶联，所述通道有助于将处理试剂递送至孔处的细胞/细胞簇或有助于从孔中提取孔的内容物(例如，处理的胞内内容物)。然而，该系统可以包括有助于处理和/或分析处于单细胞格式和单个簇格式中至少一种的细胞的任何其他合适的元件。
如上所述，在一些实施方式中，阵列中的孔的尺寸(例如，体积、开口尺寸、容纳固体支持物数量的容量)可以变化。或者，所有孔可以具有统一尺寸。在其中孔具有统一尺寸的一些实施方式中，不同的固体支持物的尺寸可以变化并且各自的特性(例如但不限于颜色)可以变化。在孔尺寸或固体支持物尺寸变化的任一种情况下，可能会发生这样一种情况，即超过一种固体支持物可以在同一个孔中积累。因为在这些实施方式中，超过一种分子可以结合单个固体支持物并且具有结合靶标的多个支持物可以在单个孔中积累，所以各孔的相对信号强度(例如，与各孔中固体支持物的数量成比例)可以变化。孔之间的信号强度差异以及各孔中信号的存在与否可用于测量样品中靶分子的浓度。在这些实施方式中，固体支持物的数量低于使孔的所有容量饱和的数量，即在孔中的积累超过一种固体支持物。参见例如，Si等,Sensors and Actuators B:Chemical,第318卷,2020年9月1日，以及在其他情况下对此类确定的讨论。
如上所述，在一些实施方式中，阵列中的孔可以包括与靶分子结合的亲和剂。这能够从固体支持物上的捕获分子洗脱靶分子，从而能够根据所需对靶分子进行其他操作。例如，可以对孔进行洗涤以去除孔中溶液的组分，同时不置换仍通过亲和剂保持结合的靶分子。在一个实施方式中，捕获剂是捕获寡核苷酸并且亲和剂是具有比固体支持物上捕获寡核苷酸更高Tm的不同的捕获寡核苷酸。在一个实施方式中，亲和剂固定于孔壁，与孔壁结合的固体支持物和/或在孔中固化的水凝胶基质。在一个实施方式中，在扩增期间，由于热循环期间的高温或亲和剂在溶液中，靶分子不与亲和剂结合，从而当扩增完成时，由于温度降低和/或亲和剂固定在孔中，使靶分子与亲和剂结合。例如，将丙烯酸亚磷酰胺寡聚物用作发生在孔中聚丙烯酰胺溶液基质中的PCR扩增过程中的引物。扩增完成后，聚丙烯酰胺交联开始。λ核酸外切酶可以用于降解未受保护的非丙烯酸亚磷酰胺链。然后可以用连续轮次的荧光分子信标探测单链扩增子产物以检测序列变异。
在将固体支持物引入阵列的孔中之后，可以将孔覆盖以防止蒸发、扩散到相邻孔中和/或保留固体支持物。可以使用任何类型的覆盖物。在一些实施例中，覆盖物是固体的，而在一些实施方式中是半透明的或透明的，以允许检测孔内的信号。在另一个实施方式中，覆盖物是置于孔顶部的油层。在另一示例中，覆盖物可以是凝胶层。示例性的凝胶是丙烯酰胺凝胶，但也可以使用其他类型的凝胶。在另一示例中，覆盖物可以是存在于盖子底部的弹性体层，用于从顶部覆盖孔并与所有孔的上表面机械配合。在另一个示例中，可以将比具有捕获部分的固体支持物小的珠的珠浆料添加到孔，以将较大的固体支持物包埋在较小的珠的基质中。
在一些实施方式中，可以珠的形式将凝胶层递送至各孔，所述珠随后熔化(例如通过加热)或溶解(例如通过破坏将凝胶珠结构保持在一起的交联)。在一些实施方式中，提供凝胶层的珠可以是与捕获分子连接的珠。在其他实施方式中，提供凝胶层的珠是分开的珠。
在其中靶分子是核酸的实施方式中，核酸可以在孔中扩增(任选地在如上所述的盖下)，然后可以检测扩增的靶核酸，优选地，可以光学检测扩增的产物的存在与否。扩增可以在等温或热循环条件下进行。例如，扩增可以包括逆转录(RT)、RT-PCR、环介导的等温扩增(LAMP)(等温的)、RT-LAMP或桥式扩增。
任选地，可以在检测之前的方法中的某个点移除覆盖。例如，如果在检测之前需要对孔的内容物进一步操作，那么可以在移除覆盖后向孔中添加用于检测的其他试剂(例如，通过使包含试剂的溶液在孔下方或上方流动)。
可以放大的靶分子的检测可以任何对产生可检测信号有用的方式进行。优选地，可以光学检测信号，例如使得自动扫描仪可以检测各孔中信号的存在、不存在或数量。信号可以在靶分子存在时增加，或者在其他实施方式中，信号可以降低(例如，在靶分子存在时猝灭信号的情况中)。
在一些实施方式中，孔包含一种或多种光学可检测试剂，例如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的且可以使用的。(参见例如英杰公司(Invitrogen)，《荧光探针和标记技术指导手册(The Handbook—A Guide toFluorescent Probes and Labeling Technologies)》，第10版(2005))。荧光剂可包括各种有机和/或无机小分子或各种荧光蛋白及其衍生物。在一些实施方式中，试剂是荧光团。大量荧光团为文献所报道，并且许多可以从生物技术产业的供应商方便地购得。荧光团的文献来源包括Cardullo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(1988)；Dexter,D.L.,J.of Chemical Physics 21:836-850(1953)；Hochstrasser等,Biophysical Chemistry45:133-141(1992)；Selvin,P.,Methods in Enzymology 246:300-334(1995)；Steinberg,I.Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,L.Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978)；Wang等,Tetrahedron Letters 31:6493-6496(1990)；Wang等,Anal.Chem.67:1197-1203(1995)。荧光团的非限制性示例包括花青、荧光素(例如，5'-羧基荧光素(FAM)、俄勒冈绿和Alexa 488)、HEX、罗丹明(例如，N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC))、伊红、香豆素、芘、四吡咯、芳基甲川、噁嗪、聚合物点和量子点。
在一些实施方式中，可检测试剂是嵌入剂。嵌入剂在嵌入双链核酸时产生信号。示例性嵌入剂包括例如9-氨基吖啶，溴化乙锭，菲啶染料，EvaGreen，PICO GREEN(P-7581，分子探针公司(Molecular Probes))，EB(E-8751，西格玛公司(Sigma)，碘化丙啶(P-4170，西格玛公司)，吖啶橙(A-6014，西格玛公司)，噻唑橙，噁唑黄，7-氨基放线菌素D(A-1310，分子探针公司)，花青染料(例如，TOTO、YOYO、BOBO和POPO)、SYTO、SYBR Green I(美国专利号5,436,134：N',N'-二甲基l-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-啉)甲基]-1-苯基喹啉-1-鎓-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺)，SYBR Green II(美国专利号5,658,751)，SYBR DX，OliGreen，CyQuant GR，SYTOX Green，SYTO9，SYTO10，SYTO17，SYBR14，FUN-1，DEAD Red，碘化己锭、溴化乙锭、二氢乙锭、乙锭同源二聚体、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶，DAPI，DIPI，吲哚染料，咪唑染料，放线菌素D，羟芪巴脒(hydroxystilbamidine)，LDS 751(美国专利号6,210,885)和Georghiou,光化学和光生物学(Photochemistry and Photobiology),26:59-68,盖蒙出版社(Pergamon Press)(1977)；Kubota,等,Biophys.Chem.,6:279-284(1977)；Genest,等,Nuc.Ac.Res.,13:2603-2615(1985)；Asseline,EMBO J.,3:795-800(1984)；Richardson,等,美国专利号4,257,774；和Letsinger,等,美国专利号4,547,569中描述的染料。
一种检测扩增产物的方法是5'-3'外切核酸酶“水解”PCR试验(也称为TaqManTM试验)(美国专利号5,210,015和5,487,972；Holland等,PNAS USA 88:7276-7280(1991)；Lee等.,Nucleic Acids Res.21:3761-3766(1993))。该试验通过在扩增反应期间杂交和裂解双重标记的荧光探针(TaqManTM探针)来检测特定PCR产物的积累。荧光探针由荧光报告染料和猝灭剂染料标记的寡核苷酸组成。在PCR过程中，当且仅当探针与被扩增的区段杂交时，该探针被DNA聚合酶的5'-外切核酸酶活性切割。探针的裂解令报告染料的荧光强度增加。
依赖于使用能量转移的另一种检测扩增产物方法是Tyagi和Kramer,NatureBiotech.14:303-309(1996)所述的“信标探针”方法，其也是美国专利号5,119,801和5,312,728的主题。该方法使用可以形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端(5'或3'末端)有供体荧光团而另一端有受体部分。在Tyagi和Kramer方法的情况下，该受体部分是猝灭剂，即受体吸收供体释放的能量，但自身不发荧光。因此，当信标处于开放构象时，供体荧光团的荧光是可检测的，而当信标处于发夹(闭合)构象时，供体荧光团的荧光被猝灭。当用于PCR时，与PCR产物的一条链杂交的分子信标探针处于开放构象并检测到荧光，而那些保持未杂交的将不会发出荧光(Tyagi和Kramer,Nature Biotechnol.14:303-306(1996))。结果，荧光的量将随着PCR产物量的增加而增加，并因此可以用作PCR进展的度量。本领域技术人员将认识到，其他定量扩增方法也是可用的。
因此，在一些实施方式中，可检测试剂是分子信标寡核苷酸探针。“信标探测”方法依赖于使用能量转移。该方法使用可以形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端(5'或3'末端)有供体荧光团而另一端有受体部分。在Tyagi和Kramer方法的情况下，该受体部分是猝灭剂，即受体吸收供体释放的能量，但自身不发荧光。因此，当信标处于开放构象时，供体荧光团的荧光是可检测的，而当信标处于发夹(闭合)构象时，供体荧光团的荧光被猝灭。
在一些实施方式中，可以使用SHERLOCK方法(特异性高灵敏度酶报告物解锁(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)检测样品核酸。该方法提供了基于报告物ssDNA的核酸扩增和旁系切割的高(或单分子)灵敏度的体外核酸检测平台，能够实时检测靶标。在SHERLOCK中使用CRISPR的方法详述于例如，Gootenberg,等"使用CRISPR-Cas13a/C2c2进行核酸检测(Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2),"Science,356(6336):438-442(2017)和美国专利公开号20180340219中。
在一些实施方式中，可以使用碱基配对并包含猝灭剂和荧光报告基因的非天然核苷酸。例如，递减(step-down)技术例如可获自Luminex，名称为
Figure BDA0003967069780000281
技术。在该技术中，报告物标记的第一非天然核苷酸与猝灭剂标记的互补非天然核苷酸在扩增过程中的位点特异性相互作用导致荧光降低。
在一些实施方式中，可以用多个不同的探针同时探测(其中来自两个或更多个探针的可检测信号是分别可检测的)或者依次测试各个孔，在用不同探针探测之间将探针从孔中洗去。
可以根据需要检测孔中的信号或信号变化。例如，检测系统可以设置成对孔阵列进行成像并用可检测的靶核酸产物和任选的固体支持物的可检测特征对孔进行计数，从而使孔信号可以连接特定样品。因此，系统可以还包括成像子系统，其用于对孔集合的内容物进行成像，并且可以进一步用于将在孔集合中捕获的靶标对象(例如，CTC、标记的细胞、微球)与引入系统中的样品中的其他细胞或对象区分开来。成像子系统优选包括荧光显微镜，但可以附加地或替代地包括任何合适的成像机构(例如，光学显微镜、CCD相机、CMOS相机、光电二极管阵列、发光二极管、反射器、一个或多个处理器等)。荧光显微镜优选是可操作的(例如，在鉴定模式、检测模式等)，以检测一个或多个孔集合中靶标对象发射的荧光信号，并由此鉴定一个或多个孔包含的靶分子。在特定示例中，成像系统(例如，荧光成像系统)可以在用于提供根据试验处理的样品的实时或近实时荧光成像的模式下操作。成像子系统优选位于基材下方并定位，以通过基材的透明(或半透明)材料对孔集合的内容物进行成像；或者，可以将成像子系统置于基材上方并定向，以对未被基材本身的材料阻挡的孔集合的内容物进行成像。然而，成像子系统可以任何合适的方式以其他方式定位。任选地，成像子系统可以检测信号强度以及信号的存在与否。数据处理可用于标准化信号，例如将样品信号与背景信号区分开来。孔阵列还可以具有加热系统，整合成以等温孵育或快速热循环的程序化方式将微孔的内容物加热至所需温度和/或探针杂交(hydridization)和/或熔化操作。
在一些所述方法中，该系统包括一个或多个设置成接收来自检测系统的信号的计算机处理器。来自检测子系统的信号可以包括来自靶分子检测的信号或信号强度，表示固体支持物(如果存在)可区分特征的信号或信号强度，和/或任选地，阵列中孔的位置(地址)。样品中靶分子的相对或绝对拷贝数可以基于具有存在靶分子的信号的孔的数量确定，并且任选地，考虑在超过一种固体支持物可以适合孔的实施方式中信号的强度。还可以确定具有来自样品的固体支持物的孔的总数并用于计算样品中靶分子的拷贝数。
在固体支持物是可区分的实施方式中，检测子系统还可以基于区分特征将各固体支持物的样品来源递送至一个或多个计算机处理器。或者，检测子系统可以将各检测到的信号的各孔的位置递送至一个和多个计算机处理器，能够通过样品来源对靶分子数据进行分类，从而能够处理多个样品。
在存在该选项的实施方式中，处理器还可以基于单个孔内多个固体支持物所引起的信号的强度来计算靶分子的浓度。
计算机处理器可以设置多种不同的硬件组件并可制成多种尺寸和样式(例如台式PC、笔记本、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可包含标准组件，如监视器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机与网络相连时，可通过任何合适的传输介质(例如有线、光和/或无线介质)和任何合适的通信协议(例如TCP/IP)来提供连接；主机可包括合适的网络硬件(例如调制解调器、以太网卡、WiFi卡)。主机可使用多种操作系统中的任一种，包括UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOS或任何其他操作系统。
可用多种语言编写用于实施本发明的各项内容的计算机代码，包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他的可在主机上执行或可经编译在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可用低级语言编写或分配，例如汇编语言或机器语言。
可在用于储存和/或传输的多种计算机可读取介质上编码整合了本发明多项特征的脚本或程序。合适的介质的例子包括：磁盘或磁带、光学储存介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘))、闪速存储器以及经由遵循各种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)的适用于传输的载波信号。
图4描绘了示例性系统。该系统的子系统可以包括下述一项或多项，例如：
(a)计算机和用户界面显示器；
(b)xyz龙门(gantry)系统，其可以将z头移动到托盘上以进行各种液体处理操作；
(c)包含多个(例如，8通道)移液器和摄像机的z头，以读取各种耗材的条形码并提供各种消耗品状态的反馈；
(d)4色荧光检测系统，其能够对微孔载玻片(阵列)进行均匀照明并以部分微孔尺寸的分辨率检测微孔载玻片区域的荧光图像。
(e)加热器，其可以对微孔载玻片进行热循环或提供等温加热；和
(f)包括一个或多个耗材的托盘。
托盘上的示例性消耗品可以包括以下一种或多种：
a.多孔载玻片(阵列)，其可以具有例如105 -10 7或更多个孔，其中来自不同样品的珠捕获于微孔中并进行实时数字PCR(或其他扩增反应)；
b.多孔(例如，96或384孔)板，其中含有核酸的样品经裂解，随后使核酸与珠结合。任选地，也可以在同一96孔板中洗涤珠，以从珠去除污染物；
c.试剂盒，包含洗涤试剂、扩增和检测试剂和油，以及将扩增和检测试剂转移到多孔载玻片的吸头和将油转移到多孔载玻片的吸头；
d.一个或多个移液器吸头盒，其中包含用于下述用途的吸头：
i.将样品从样品管转移至96孔板；在珠已经结合来自样品的核酸或其他靶分子后，同一吸头可以任选地用于混合和去除上清液；
ii.清洗珠，以去除污染物；
iii.将珠转移至多孔载玻片；
e.样品架
i样品架能够将含有样品的8孔管条加载到仪器中。各样品获得独特的条形码，该条形码将临床样品与样品架中样品的精确位置连接。在运行设置期间，用户将样品ID与样品管ID结合起来。
图5显示了仪器的托盘，其显示了用于同时处理96个临床样品的各种消耗品。示例性的消耗品可以包括以下一种或多种：
(a)样品管：
(b)多孔(例如，96或384孔)板，其含有裂解试剂和珠，用于制备核酸并将核酸或其他靶分子与珠结合；
(c)试剂盒，任选地包含洗涤试剂、扩增试剂、油和用于将试剂加载到多孔(阵列)载玻片中的吸头中的一种或多种；
(d)多孔载玻片(阵列)，其可以具有例如105 -10 7或更多个孔，其同时进行96个样品(例如，10,000个珠/样品)实时数字PCR；
(e)一个或多个吸头盒。
可以在图5的仪器上如下所述进行运行96个样品的过程：
(a)用户在样品条中加载临床样品。各样品可以具有独特的条形码。例如，样品可以在8个条中加载。在所描述的实施方式中，最多96个样品可以加载到仪器中。
(b)用户加载其他消耗品，例如：
a.多孔载玻片(阵列)。
b.96孔板，任选地包含一种或多种裂解试剂和珠。
c.试剂盒
d.一个或多个吸头盒
(c)xyz龙门将相机在各种消耗品上移动，检查条形码并确定托盘已加载所有必要的消耗品以处理所有96个样品。
(d)移液器以8个一组从吸头盒中取出吸头，从样品管中转移样品(约100μl)并将其分配到96孔板的管1-8中。混合试剂，导致核酸裂解和结合到珠。
(e)移液器将吸头弃入吸头盒中并继续操作下一个样品，直到所有样品转移到96孔板以开始裂解和结合。
(f)给予处理后的样品足够的时间以进行孵育。在孵化过程结束时，通过重力将各样品中的珠沉降到底部。
(g)将上清液转移到样品管中。
(h)将洗涤液添加到96孔板的各孔中。
(i)然后将珠从微孔转移到多孔载玻片。在该过程中，多孔载玻片的盖子保持打开，以便可以从顶部接触微孔。
(j)在将96个样品的所有珠(例如，各样品10,000个珠)分配到多孔载玻片中后，等待几分钟，使珠沉降到其微孔中。移液器可用于轻轻搅动，以促进所有珠找到其微孔。
(k)使用盖打开/关闭工具，使用移液器关闭多壁载玻片的铰链盖。
(l)将扩增试剂从入口端口递送到多孔载玻片中，从而使所有微孔接收扩增和检测试剂。
(m)然后将油分配到多孔载玻片的入口端口，以将微孔彼此隔开。
(n)加热器接合在盖子的顶部，以根据扩增反应所需进行热孵育。
(o)在预定的时间间隔内，在明场和荧光中对所有微孔进行成像，以使用4色荧光系统监测扩增反应的进展。
(p)使用处理器和预定算法，确定各样品的珠数量为阳性，然后以定量方式显示各样品的结果。
图9显示了微孔阵列载玻片。如图所示，在微基材的上表面上微加工数以百万计的微孔。包含入口端口、出口端口和微孔的流体歧管与包含微孔阵列的微基材结合以形成复合微孔载玻片。可拆卸的加热器盖能够从上表面访问所有微孔。
图11显示了仪器的托盘，其显示了用于同时处理96个临床样品的各种消耗品。示例性的消耗品是：
(a)样品管
(b)包含裂解缓冲液珠、洗涤缓冲液和扩增检测试剂的试剂盒
(c)96样品珠反应器阵列盒
(d)一个或多个吸头盒
实施例
预示实施例1：
可以使用例如图5中描绘的系统执行以下操作。用于一次处理96个样品的自动化仪器的托盘通过以下方式制备：
A)吸头盒
B)试剂盒装有基于SSC(柠檬酸钠)的洗涤缓冲液、逆转录酶(RT，R(everse)T(ranscriptase))主混合物、热启动PCR主混合物、引物和探针、PCR兼容油和用于将这些试剂加载到百万孔(Million Well)Celsingle载玻片的吸头，
C)含有病毒裂解试剂和20微米聚苯乙烯寡核苷酸-dT(20)VN的96孔板珠。通用标签序列位于寡核苷酸-dT轨道上游，如下所示：
珠寡核苷酸序列：
5’-GCCTGTCCGCGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’；
病毒裂解试剂含有离液盐硫氰酸胍和蛋白酶K。各孔都预加载大约10 000个珠。珠通过封闭的荧光偶联的(FluorophoreX)反向互补寡核苷酸与通用标签序列结合：
荧光团X-GTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTCCGCGGACAGGC-反向T；
D)百万孔Celsingle载玻片。
运行96个样品的方案概述如下：
(a)用多达400uL无菌PBS润洗芯片外的干拭子，最多处理96个样品。
(b)将临床样品加载到样品条中，各条包含8个试管。各样品管具有独特的条形码。
(c)xyz龙门将相机在各种消耗品上移动，检查条形码并确定托盘已加载所有必要的消耗品以处理所有96个样品。
(d)自动化移液器从吸头盒中取出吸头，每组8个，然后将大约100uL的各样品从样品管转移到含有裂解试剂和珠的96孔板。
(e)移液器将吸头弃入吸头盒中并继续操作下一个样品，直到所有样品转移到96孔板以开始裂解和结合。
(f)将裂解缓冲液中的样品孵育15分钟以完全消化材料。在裂解结束时，珠通过重力沉降到试管底部。
(g)弃去上清液。
(h)移液器将珠重悬于洗涤缓冲液中。使珠通过重力沉降到试管底部。
(i)重复步骤g-h两次。
(j)最后一次洗涤后，将珠重悬于RT主混合物中，以在15分钟的孵育期内合成cDNA。
(k)使用移液器将珠洗涤一次并使其沉降到试管底部。
(l)用移液器添加PCR主混合物。
(m)添加引物和探针，并与捕获珠和PCR主混合物混合。
(n)然后将珠从96孔板转移到百万孔载玻片上。在该过程中，百万孔载玻片的盖子保持打开，以便可以从顶部接触微孔。
(o)在将96个样品的所有珠(例如，各样品10,000个珠)分配到百万孔载玻片中后，使珠沉降到其微孔中。移液器可用于轻轻搅动，以促进所有珠插入其微孔。
(p)使用盖打开/关闭工具，使用移液器关闭百万孔载玻片的铰链盖。
(q)然后将油分配到百万孔载玻片的入口端口，以将微孔彼此隔开。
(r)加热器接合在盖子的顶部，以根据PCR扩增反应所需进行热孵育。使温度升高，以通过PCR酶的热启动来启动反应。
(s)在预定的时间间隔内，在明场和荧光中对所有微孔进行成像，以使用4色荧光系统监测扩增反应的进展。
(t)使用处理器和预定算法，确定各样品的珠数量为阳性，然后以定量方式显示各样品的结果。
预示实施例2：
以下步骤概述了在扩增和检测操作期间使用图9的微孔载玻片：
(1)盖子保持打开状态。
(2)使用移液器从微孔中分配珠。
(3)使珠通过重力沉降到微孔中。
(4)使用加热器盖关闭微孔，形成封闭的流体网络。
(5)将PCR试剂分配到入口端口，使得PCR试剂通过微孔对流传输到出口。通过扩散，PCR试剂进入微孔。
(6)将油分配到入口端口，从而覆盖盖子和微孔阵列上表面之间的间隙，从而将微孔彼此物理上隔开。存在于微孔中的PCR试剂不会被油置换，因为试剂仅通过扩散进入微孔，并没有对流流穿透流入微孔中以使油置换水性试剂。
(7)使用加热器，进行PCR，并使用荧光扫描仪进行实时检测。
预示实施例3：
可以使用例如图11中描绘的系统执行以下操作。运行96个样品的过程概述如下：
(a)用户在样品条中加载临床样品。各样品具有独特的条形码。样品可以在8个条中加载。仪器中最多可加载96个样品。
(b)用户加载其他消耗品：
a.96样品珠反应器阵列盒
b.试剂盒
c.吸头盒
(c)xyz龙门将相机在各种消耗品上移动，检查条形码并确定托盘已加载所有必要的消耗品以处理所有96个样品。
(d)珠反应器阵列的出口孔最初处于关闭位置。
(e)移液器从吸头盒中取出吸头1-8并从试剂盒中吸取约100μL含有珠的裂解缓冲液(各样品约10,000个珠)，然后将它们分配到珠反应器阵列盒的样品端口1-8中。
(f)移液器从样品管1-8中吸取100μl样品，并将它们与珠反应器阵列位置1-8中的珠裂解缓冲液混合。
(g)移液器将吸头弃入吸头盒中并继续操作下一个样品，直到所有样品转移到96孔板以开始裂解和结合。
(h)等待大约10分钟，以使靶核酸裂解并与珠结合。
(i)用一定真空压力拉动出口端口，使所有流体样品向珠反应器阵列移动，从而将珠捕获在珠反应器中。
(j)将洗涤液添加到96孔板的各孔中，并拉动洗涤液通过珠反应器阵列以去除任何未结合的材料。
(k)将PCR试剂(扩增和检测试剂)添加到珠反应器阵列盒的各样品入口。
(l)打开与珠反应器阵列相关联的加热器，以通过反应方案对反应器内容物进行孵育/热循环。反应产物在各珠的表面上扩增。
(m)在预定的时间间隔内，在明场和荧光中对所有微孔进行成像，以使用4色荧光系统监测扩增反应的进展。
(n)使用处理器和预定算法，确定各样品的珠数量为阳性，然后以定量方式显示各样品的结果。
本发明的示例实施方式的上述描述是为了阐述和说明的目的。它们并非旨在穷举或将本发明限制为所描述的确切形式，并且可能根据上述教导进行多种修改和变化。
述及“一个”、“一种”或“该”旨在表示“一个(种)或多个(种)”，除非有相反的具体指示。使用“或”旨在表示“包含性的或”，而不是“排他性的或”，除非有相反的具体指示。
实施例
该实验证明珠可用于结合DNA，然后珠-靶标递送到微孔中，使得各微孔加载一个珠。孔密封、PCR扩增和荧光检测扩增的靶标证明在微孔中发生了珠模板化的扩增。
将直径约90mm的DNA结合珠以1000个珠/μL与50ng/μL基因组DNA混合，含有Tris-EDTA和盐的杂交溶液提供高离子强度，能够在室温下孵育15分钟。然后洗涤珠以从溶液中去除未结合的DNA并置于PCR溶液中。
为了分离单个珠，将载有DNA的珠通过移液直接加载到含有微孔的芯片中。塑料芯片隔离孔中的单个珠：由于珠的直径为90μm并且各孔是边长为100μm的立方体，所以各孔只适合一个珠。当芯片通过来自上方弹性盖的压力密封时，珠被隔离在各个孔中。
使用45个PCR循环，在单个微孔中热扩增珠递送的DNA。热循环在平板加热器上实现，其温度受到监测和控制。
检测扩增的DNA使用依赖于探针扩增的水解来实现，所述水解导致Cy5中的荧光。图14描绘了使用HEX和Cy5通道进行的载玻片成像，以分别检测哪些孔具有珠以及哪些孔已经经历了珠模板化扩增。
通过比较光照孔与黑暗孔的相对存在，可以对扩增阳性孔进行评分，并且在知晓原始溶液中DNA浓度的情况下，可以使用泊松统计来对DNA进行定量。无珠孔的可视化能够将这些孔排除在分析之外。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。所有均不承认是现有技术。

Claims (61)

1.一种检测多个样品中靶核酸的方法，所述方法包括：
使包含样品核酸的不同样品与不同数量的固体支持物接触以形成不同的混合物，
其中所述固体支持物包含多个捕获分子，所述捕获分子结合样品靶核酸或包含所述样品靶核酸的载剂，任选地，其中所述固体支持物上的多个捕获分子是相同的，和
其中与不同样品接触的固体支持物具有区别于与不同样品接触的其他固体支持物的特征；
使所述捕获分子与所述靶核酸或包含靶核酸的载剂结合，其中混合物中的固体支持物的数量高至足以使至少一些固体支持物不与靶核酸或包含靶核酸的载剂结合；
合并不同的混合物以形成批料混合物；
将包含结合的靶核酸或载剂的固体支持物引入孔阵列中，其中各孔能够包含一种但不超过一种固体支持物或者其中孔能够包含超过一种固体支持物；
在各孔中检测(i)所述样品核酸的存在与否和(ii)所述固体支持物的特征；和
确定各样品的靶核酸数量，其中所述确定包括确定具有检测到的样品核酸的孔的数量，其中样品类型由检测到的固体支持物的特征确定。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在结合之后和合并之前或之后，从所述固体支持物洗去未结合的样品组分。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述孔包含亲和剂，所述亲和剂将所述靶核酸或包含靶核酸的载剂与孔结合。
4.如权利要求1所述的方法，其中，在所述引入之后，将所述孔覆盖。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述孔通过油、凝胶、固体透明盖、弹性体盖或涂有粘合剂的柔性膜覆盖。
6.如权利要求4或5中任一项所述的方法，其中，扩增所述样品靶核酸。
7.如权利要求6所述的方法，其中，在扩增所述样品靶核酸后，通过与所述孔连接的亲和剂使所述样品靶核酸附接于孔。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是珠。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述珠的直径在0.1-100μm(例如，1-50μm)之间。
10.如权利要求1或8或9所述的方法，其中，所述特征是所述固体支持物的颜色。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，在所述引入之后和所述检测之前，扩增所述与捕获寡核苷酸杂交的样品核酸，并且其中所述检测包括检测来自所述孔中试剂的信号，其基于扩增的核酸的存在与否而改变。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。
13.如权利要求11所述的方法，其中，所述信号是荧光。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述试剂是双链结合染料、水解探针、杂交探针或CRISPR/CAS蛋白和在CRISPR/CAS蛋白旁系切割时被切割的标记的探针。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述检测包括引入与第一靶核酸特异性结合的探针并检测所述探针与所述第一靶核酸的特异性结合。
16.如权利要求15所述的方法，其还包括从所述孔洗去探针，然后引入与第二靶核酸特异性结合的第二探针并检测所述第二探针与所述第二靶核酸的特异性结合。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述样品包含细胞或病毒。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸是RNA。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述RNA逆转录成cDNA。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述RNA在所述引入之前经逆转录。
21.如权利要求19所述的方法，其中，所述RNA在所述引入之后经逆转录。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述孔阵列是包含10,000-10,000,000个孔的载玻片。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述孔阵列具有多种不同的尺寸或体积。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述固体支持物是直径比孔开口直径小不少于10％的珠。
25.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述固体支持物的直径与所述孔的直径之比为1:1、或1:2、或1:3或1:4。
26.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，孔的集合彼此分开，使得各个样品能够沉积在各孔中。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述孔的集合通过垂直防溅罩分隔。
28.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述孔具有六边形的开口。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中，与样品接触的所有固体支持物具有相同的捕获分子。
30.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中，与样品接触的固体支持物具有至少两种类型，其中第一类型包括与第一样品靶核酸或包含第一样品靶核酸的载剂结合的捕获分子，和第二类型包括与第二样品靶核酸或包含第二样品靶核酸的载剂结合的捕获分子。
31.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述捕获分子是与所述样品靶核酸互补的寡核苷酸，并且所述结合包括杂交。
32.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述包含样品靶核酸的载剂是细胞、病毒或颗粒。
33.一种检测多个样品中靶核酸的方法，所述方法包括：
使包含样品核酸的不同样品与不同的多个固体支持物接触以形成不同的混合物，其中所述固体支持物包含多个捕获分子，所述多个捕获分子与样品靶核酸或包含样品靶核酸的载剂结合，任选地，其中所述多个固体支持物上的捕获分子的数量是相同的；
使捕获分子与样品靶核酸结合，其中混合物中固体支持物的数量高至足以使至少一些固体支持物不与靶核酸或包含靶核酸的载剂结合；
将所述固体支持物引入孔阵列中，所述固体支持物包含结合的样品靶核酸或包含样品靶核酸的载剂，其中各孔能够包含不超过一种固体支持物或者其中所述孔各自能够包含超过一种固体支持物，其中对接收样品珠的孔的位置进行记录，从而记录对应不同样品的孔；
在各孔中检测(i)样品靶核酸的存在与否和(ii)孔的位置；和
部分基于包含检测到的样品靶核酸的孔的数量来确定各样品的样品靶核酸数量，其中样品类型通过所述孔的位置确定。
34.如权利要求34所述的方法，其还包括在所述结合和引入之间从所述固体支持物洗去未结合的样品组分。
35.其中所述孔包含亲和剂，所述亲和剂将靶核酸或包含靶核酸的载剂与孔结合。
36.如权利要求34所述的方法，其中，在所述引入之后，将所述孔覆盖。
37.如权利要求36所述的方法，其中，用油孔覆盖所述孔。
38.如权利要求34所述的方法，其中，孔的集合彼此分开，使得各个样品可以沉积在各孔中。
39.如权利要求38所述的方法，其中，所述孔的集合通过垂直防溅罩分隔。
40.如权利要求36或37中任一项所述的方法，其中，扩增所述样品靶核酸。
41.如权利要求38所述的方法，其中，在扩增所述样品靶核酸后，通过与所述孔连接的亲和剂使所述样品靶核酸附着于孔。
42.如权利要求34-39中任一项所述的方法，其中，所述固体支持物是珠。
43.如权利要求40所述的方法，其中，所述珠的直径在0.1-100μm(例如，1-50μm)之间。
44.如权利要求34-42中任一项所述的方法，其中，在所述引入之后和所述检测之前，扩增所述与捕获寡核苷酸杂交的样品核酸，并且其中所述检测包括检测来自所述孔中试剂的信号，其基于扩增的核酸的存在与否而改变。
45.如权利要求43所述的方法，其中，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。
46.如权利要求43所述的方法，其中，所述信号是荧光。
47.如权利要求43所述的方法，其中，所述试剂是双链结合染料、水解探针、杂交探针或CRISPR/CAS蛋白和在CRISPR/CAS蛋白旁系切割时被切割的标记的探针。
48.如权利要求34-46中任一项所述的方法，其中，所述检测包括引入与第一靶核酸特异性结合的探针并检测所述探针与所述第一靶核酸的特异性结合。
49.如权利要求47所述的方法，其还包括从所述孔洗去探针，然后引入与第二靶核酸特异性结合的第二探针并检测所述第二探针与所述第二靶核酸的特异性结合。
50.如权利要求34-48中任一项所述的方法，其中，所述样品包含细胞或病毒。
51.如权利要求34-49中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸是RNA。
52.如权利要求50所述的方法，其中，所述RNA逆转录成cDNA。
53.如权利要求51所述的方法，其中，所述RNA在所述引入之前经逆转录。
54.如权利要求51所述的方法，其中，所述RNA在所述引入之后经逆转录。
55.如权利要求34-53中任一项所述的方法，其中，所述孔阵列是包含10,000-10,000,000个孔的载玻片。
56.如权利要求34-54中任一项所述的方法，其中，所述孔具有六边形的开口。
57.如权利要求34-55中任一项所述的方法，其中，与样品接触的所有固体支持物具有相同的捕获分子。
58.如权利要求34-55中任一项所述的方法，其中，与样品接触的固体支持物具有至少两种类型，其中第一类型包括与第一样品靶核酸或包含第一样品靶核酸的载剂结合的捕获分子，和第二类型包括与第二样品靶核酸或包含第二样品靶核酸的载剂结合的捕获分子。
59.如权利要求34-58中任一项所述的方法，其中，所述捕获分子是与所述样品靶核酸互补的寡核苷酸，并且所述结合包括杂交。
60.如权利要求34-59中任一项所述的方法，其中，所述包含样品靶核酸的载剂是细胞、病毒或颗粒。
61.一种用于从样品中检测靶核酸的自动化系统，所述系统包括：
第一站，将其设置成包含样品处理容器的阵列，
第二站，将其设置成包含孔阵列，所述第二站与流体输送系统、热系统和检测系统偶联，其中将孔设置成在各孔中仅捕获一个珠，
转移系统，将其设置成将珠从所述第一站转移到所述第二站，
和计算机处理器，
其中所述第二站设置成将多个珠捕获到所述孔阵列中，其中各孔中仅捕获一种珠，
其中所述流体递送系统设置成将靶核酸扩增和检测试剂从试剂储库递送到孔中，
其中所述热系统设置成在孔中进行等温或热循环扩增反应，
其中所述检测系统设置成对所述孔阵列进行成像并用对带有可检测的靶核酸产物的孔进行计数，和
所述计算机处理器设置成接收来自所述检测系统的信号并将计数与在第一站中与珠相关联的样品相关联。
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