CN103063844A

CN103063844A - 一种检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法

Info

Publication number: CN103063844A
Application number: CN2012104278727A
Authority: CN
Inventors: 李红英; 王志飞; 郑爽; 何农跃
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明公开了一种检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，先利用层析技术将待测分子捕获到检测位点，再利用催化作用，将检测信号进行催化放大。本发明以催化纳米材料对生物分子如抗体蛋白等进行标记，结合免疫层析技术与化学镀技术对检测信号进一步放大，提高了灵敏度；由于纳米催化剂的催化体系较多，它不仅可以催化银，还可以催化钴镍等磁性材料的沉积，所以在检测信号时可以读取磁信号，达到定量检测和半定量分析的目的。

Description

一种检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法

技术领域

本发明属于纳米催化领域，涉及一种基于免疫层析试纸的生物检测方法。

背景技术

免疫层析方法出现于上世纪80年代初期，它是一种独特的免疫分析方式，该方法的核心技术是以纤维层析材料为固相，通过毛细管作用使样品溶液在层析材料上泳动，并同时使样品中经标记物标记的待测物与包被在层析材料上针对待测物的受体发生高特异、高亲和性的免疫反应富集在检测带上，通过酶反应或直接运用可目测的标记物得到直观的实验现象。

免疫层析方法的应用很广，根据抗体蛋白标记方式的不同，可以进一步分为酶免疫标记、荧光免疫标记、放射性同位素免疫标记等经典检测技术。近十几年来，随着纳米技术的蓬勃发展，胶体金免疫层析技术因其操作方便、快速且不需要昂贵的检测仪器等特点，而大有取代前三种技术之趋势。胶体金免疫层析技术是以胶体金为标记物的一种免疫层析方法，它以纳米金的良好光学特性为基础，通过颗粒在测试线或对照线位的聚集，形成醒目的红色条带而进行信号辨别的一种技术。该技术既可采用双抗体夹心法测抗原，又可用间接法测抗体。目前利用双抗体夹心法开发成功的胶体金快速诊断试剂有检测HCG、LH、AFP、CEA、PSA、HBsAg、血红素等，这些试剂均已用于临床检测。尽管如此，由于受到胶体金免疫层析试纸检测灵敏度低及不能定量等缺点的限制，目前更多以胶体金为基础的诊断试剂开发受到制约。根据前面介绍，大家知道，要想使胶体金在测试线或对照线区域呈现出达到肉眼能辨认的红色带，在免疫层析时，检测样品中的待测抗原的浓度必须达到一定浓度。如低于该浓度，即使有少量金颗粒被捕获于测试线，也因人肉眼辨别能力的限制，被默认为检测样品中的待测抗原为阴性，造成假阴性结果。为此，国内的一些研究人员为了提高检测灵敏度或进行定量分析，尝试各种方法，并纷纷提出专利保护如：一种银染增强技术胶体金免疫层析试纸盒及其制备方法（CN102135536）、一种定量检测炭疽芽孢的磁性免疫层析试纸条及制备方法（CN102353776）、快速检测TTX的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备（CN102426222）、一种量子点荧光免疫层析高灵敏定量检测的方法（CN102520165）等。但是，金标银染技术由于银染过程通常要在暗室中进行，同时银自动沉积的速度也很快，检测信号在短时间内很容易被继续沉积的银模糊，造成非特异性比较严重，检测信号区分困难；直接以磁性纳米材料取代胶体金作为标记物，检测磁信号，虽达到定量检测的目的，但是依然不能解决检测灵敏度低的问题；荧光容易易淬灭，不稳定。为此，继续以其它纳米材料为基础，发展新型的免疫层析分析方法将是一个重要的技术发展趋势。

而相对于金纳米颗粒来说，纳米催化剂具有更好的催化活性，目前广泛应用于催化领域，它不仅可以催化银、铜，还可以催化钴、镍此类带有磁性的金属，而且近年来，对纳米催化剂进行生物分子标记已经不是难题。所以，以纳米催化剂为标记物，来取代现行检测的纳米金标记，通过纳米催化剂对金属离子还原过程的催化作用，进行检测信号放大，将是前面各种检测技术路线的一个很好改进。此时，溶液中只需少量的待检测物与纳米催化剂标记物结合，经催化放大后，通过迅速沉积在检测部位上的其它金属材料，进行相应的信号检测。后者过程中，既可以很直接的用肉眼观察检测结果，而且若被还原得到的金属（如镍、钴）具有磁性的话，还可以进行磁性检测。因此以纳米催化剂为标记物不仅大大地降低了目标分子的检测浓度，有效地放大了检测信号，而且还可以对结果进行半定量分析。

发明内容

技术问题：本发明提供了一种路线简单、成本经济、操作简便的检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，利用纳米催化剂对金属离子的催化还原作用，不仅可以将检测信号进一步放大，提高检测的灵敏度，而且还可以通过检测磁信号，达到定量检测的目的。

技术方案：本发明的检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，包括以下步骤：

1）采用纳米催化剂作为标记物，对抗体蛋白进行标记，所述纳米催化剂是以下物质的任一种：a．钯粒子或铂粒子，b．钯粒子、铂粒子和金粒子中任意两种或三种的混合，c．钯、金或铂中任意两种或三种的合金，d．所述a类、b类或c类物质负载于碳纳米球、二氧化硅纳米球、三氧化二铝纳米球或聚苯乙烯球上形成的复合颗粒；

2）在免疫层析试纸的硝基纤维膜（3）上喷制对照线（6）和测试线（5），结合垫（2）处吸附所述步骤1）中用纳米催化剂标记好的抗体蛋白，然后组装成完整的免疫层析试纸；

3）将待测样品滴置于样品垫（1）处，静置2~5min，然后采用竞争法或双抗夹心法将待测样品捕获于测试线（5）处；

4）将催化放大反应液滴于测试线（5）和对照线（6）上，利用化学镀技术进行信号催化放大；

5）观察测试线（5）和对照线（6）的颜色，如果所述步骤3）中采用竞争法进行的待测样品捕获，则在对照线（6）的部位出现一条颜色条带的为阳性，在对照线和测试线（5）各出现一条颜色条带为阴性，如果步骤3）中采用双抗夹心法进行的待测样品捕获，则在对照线（6）的部位出现一条颜色条带的为阴性，在对照线（6）和测试线（5）各出现一条颜色条带为阳性。

本发明中，纳米催化剂为粒径1~500纳米的球形、管状或不规则形状颗粒。

本发明中，步骤1）中的抗体蛋白是指由B淋巴细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类能与抗原特异性结合、具有免疫功能的球蛋白。

本发明的步骤1）中，采用物理吸附法或化学修饰法对抗体蛋白进行标记，所述物理吸附法是在纳米催化剂表面与抗体蛋白之间用静电力形成复合物，所述化学修饰法是在纳米催化剂表面与抗体蛋白之间用表面羧基化耦联、表面氨基化耦联或表面醛基化耦联。

本发明中，步骤4）中的催化放大反应液为镍、钴、银或铜化学镀液。

本发明中，步骤4）中的催化放大反应液含有钴离子和镍离子中的一种或两种，所述步骤5）中，免疫层析试纸使用磁性性分析仪读取磁信号，然后结合标准曲线，计算出待测样品中待测物的浓度。

为了更好地说明本发明的内容，示意图2中给出检测信号催化放大的免疫层析试纸的检测过程。从免疫层析试纸的组成来看：与传统的胶体金免疫层析试纸很相似，都包括吸收垫、底板、硝基纤维膜、样品垫、结合垫以及在硝基纤维膜上喷制对照线和测试线等几个部分，但在本发明中，结合垫处沉积的是纳米催化剂与抗体的复合物，而在传统胶体金免疫层析试纸中，是胶体金与抗体形成的复合物。而从检测过程来看，存在以下异同点：从相同点看，两者均先将待测样品（如尿液）滴于样品垫，然后利用毛细管作用液体带着结合垫处的纳米复合物一起向测试线或对照线方向移动，最终如样品中含有大量待测抗原，将利用抗体与抗原之间的特异性相互作用，在测试线与对照线两处被捕获。如样品中不含有待测抗原，将只在对照线处聚集。不同点在于，对于传统胶体金免疫层析试纸，此时就直接利用颜色的变化来确认样品中是否含有待测抗原，而在本发明中，我们将以上分离完的试纸进一步浸入催化放大反应液中，进行信号放大。如放大后，没有颜色条带确定样品中的待测抗原。，对于钴或镍染过程，还将根据其所发出的磁性信号强弱，来确定待测抗原的含量。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本发明与传统的胶体金免疫层析试纸相比，不仅可以提高检测灵敏度，还可以进行定量检测。相较于银染增强技术胶体金免疫层析试纸盒，本发明信号放大后，非特异性小，信号分辨率高，易于保存，不仅可以定性分析而且能够通过检测磁信号，进行定量检测。相较于磁性材料直接作标记物的免疫层析试纸，本发明通过催化放大检测信号，极大地提高了检测灵敏度。本发明检测信号催化放大的免疫层析试纸适合于所有胶体金免疫层析试纸条，具有操作简单、稳定性好、结果清晰、易于判断保存、检测成本低、速度快和耗时少的优点。

同时，该方法还可以被进一步延伸到大量的样品快速检测中；作为一种通用检测方法，还将适于多种产品种类的检测。因此本发明具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为纳米材料免疫层析试纸条的组装示意图；

图2以双抗免疫层析试纸条疫层析试纸检测原理示意图；

图3为双抗免疫层析试纸条信号催化放大原理示意图

图4为胶体钯投射电镜图；

图5为钴条带的磁滞回归曲线。

图中有：样品垫1、结合垫2、硝基纤维膜3、吸收垫4、测试线5、对照线6、底板7。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步具体说明。实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的特批权利要求范围内。

本发明的检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，包括以下步骤：

2）在免疫层析试纸的硝基纤维膜3上喷制对照线6和测试线5，结合垫2处吸附步骤1）中用纳米催化剂标记好的抗体蛋白，然后组装成完整的免疫层析试纸；

3）将待测样品滴置于样品垫1处，静置2~5min，然后采用竞争法或双抗夹心法将待测样品捕获于测试线5处；

4）将催化放大反应液滴于测试线5和对照线6上，利用化学镀技术进行信号催化放大；

5）观察测试线5和对照线6的颜色，如果步骤3）中采用竞争法进行的待测样品捕获，则在对照线6的部位出现一条颜色条带的为阳性，在对照线6和测试线5各出现一条颜色条带为阴性，如果步骤3）中采用双抗夹心法进行的待测样品捕获，则在对照线6的部位出现一条颜色条带的为阴性，在对照线6和测试线5各出现一条颜色条带为阳性。

本发明的步骤1）中，采用物理吸附法或化学修饰法对抗体蛋白进行标记，物理吸附法是在纳米催化剂表面与抗体蛋白之间用静电力形成复合物，化学修饰法是在纳米催化剂表面与抗体蛋白之间用表面羧基化耦联、表面氨基化耦联或表面醛基化耦联。

本发明中，步骤4）中的催化放大反应液含有钴离子和镍离子中的一种或两种，步骤5）中，免疫层析试纸使用磁性分析仪读取磁信号，然后进行定量检测，结合标准曲线，计算出待测样品中待测物的浓度。

实施例1：双抗夹心法测定人绒毛膜促性腺激素（HCG）

（1）纳米材料的制备：以c（柠檬酸三钠）/c（H₂PdCl₄）=20，c（H₂PdCl₄）=0.5mM为例，向100ml的圆底烧瓶中加入15ml H₂PdCl₄溶液（2mM），0.1784g柠檬酸三钠，2ml乙醇和43mlddH₂O，机械搅拌,115℃加热回流3h。溶液由黄色到棕黄色再变成棕褐色，即得到柠檬酸三钠稳定的Pd溶胶。

（2）纳米材料标记抗体：所制得的Pd溶胶高速离心（13000rpm，10min），除去上清液，5倍浓缩后再重新溶解于1ml ddH₂O中，调整至最适pH9.0，加入β-HCG单克隆抗体，室温下培育一小时后加入100μL 10%BSA，反应30分钟，4℃×12000rpm×20min离心留沉淀，去上清。用1mL PBS（1%BSA）清洗标记物，并再次离心。将得到的黑色沉淀分散在1mL缓冲溶液（20mmolL-1Na₃PO₄·12H₂O,5%BSA,0.25%Tween20,10%sucrose）中。即得到纳米钯标记的抗体。

（3）试纸条的组装：

免疫层析试纸的各部分组成与常规试纸条的结构类似（见示意图1），组装方式也相同，我们采用经典的双抗夹心法对各组分进行组装前的预处理。首先，我们以双抗夹心法说明各组分的预处理。分为三个步骤：a测试线5的喷制：用缓冲液1稀释鼠源性α-HCG单克隆抗体至浓度为1.0～1.5mg/mL，调整BIO-Dot仪器，喷涂于硝基纤维膜3上测试线5处，靠近结合垫端，距结合垫2约9.5mm，使α-HCG单克隆抗体包被于硝基纤维素的测试线5处；b对照线6的喷制：用缓冲液1稀释羊抗鼠多克隆抗体至1.0~1.5mg/mL，以5μL/cm用BIO-Dot喷制硝基纤维膜3（NC）的对照线6处，对照线6距吸水垫6约9mm。测试线5与对照线6的距离约5~8mm，喷线最好粗细均匀。将硝基纤维膜3在37℃烘干，封装备用；c结合垫2的制备：用缓冲溶液2浸泡玻璃纤维膜，37℃烘干，取胶体钯标记的鼠源性β-HCG单克隆抗体体积的3/8离心后用重悬液重悬后，喷涂在预处理后的聚酯膜上，用量为4μL/cm，37℃干燥，真空包装，置4℃备用；d样品垫1的制备：用缓冲溶液3均匀凃洒样品垫1，45mL/片，37℃烘干，用铝箔袋封装，备用。然后，组装整个免疫层析试纸条（如示意图1）：分别将硝基纤维膜3、样品垫1、结合垫2和吸收垫4依次粘在PVC板上，硝基纤维膜3上的对照线6靠近吸收垫4端，测试线5靠近样品垫1端，再切割成宽4mm的试纸条，密封包装，干燥，4℃保存。

注明各种缓冲溶液的配方：

缓冲液1：1%PVA、0.71%Na₃PO₄、1%BSA、0.05%NaN₃、0.1%Tween20、0.01MPBS（pH 7.0）；

缓冲液2：1%PVA、0.71%Na₃PO₄、1%BSA、0.05%NaN₃、0.1%Tween20；

缓冲液3：0.05M Borax、0.01M PBS（pH 7.0）、0.1%Sodium Casein、1%PEG20000、2%BSA、0.05%NaN₃。

重悬液：1%BSA、5%蔗糖、3%PEG20000，0.01M PBS（pH 7.0）。

（3）样品检测：首先将制备好的双抗免疫试纸条放在试剂盒当中（如示意图2），用pH7.4PBS（0.03%KH₂PO₄、0.15%Na₂HPO₄、0.8%NaCl、0.02%KCl）将HCG值标准检测液（25mIU/mL）稀释为10~20mIU/mL，然后像注样孔中滴加约2~5滴，静置约2~5min，进行信号催化放大。

（4）信号催化放大：将已配置镍催化放大反应液的金属反应液与还原液直接混合，用塑料滴管吸取混合液滴加到检测盒的检测孔内，55℃加热10min后，如果在对照线6的部位出现一条黑色带则为阴性，如果在对照线6和测试线5各出现一条黑色条带则为阳性。免疫层析试纸使用磁性分析仪读取磁信号进行定量检测，结合标准曲线，计算出待测样品中待测物的浓度。

结果表明，其最低检测线为0.5mIU/mL，最低定量限为1mIU/mL，在定量检测范围内，相关系数R²>0.99，且批内与批间重复性均较好，可为早早孕诊断提供参考。

实施例2：竞争法测定苯并芘

（1）纳米材料的制备：首先，将0.0355g PdCl₂与47μL浓盐酸溶液（12M）溶于100mL水中，经加热、超声分散，配成2mM的H₂PdCl₄溶液。接着，分别称取0.045g MUA和0.1g水合肼，将其置于三颈瓶中，并加入15mL水。待MUA完全溶解后，利用0.1M NaOH溶液将其pH调至12，同时控制溶液温度为35℃。然后，在机械搅拌下将5mL以上制备的2mM H₂PdCl₄溶液缓慢滴入三颈瓶（速度为1ml/5min）。随着反应进行，溶液颜色逐渐由原来的无色变为黑色。反应结束后，在13000rpm下，将以上溶液离心20分钟，去除上清液后，重新将其分散水中。重复以上过程5次，除去其中多余的稳定剂。以浓度为1×10^-9mol/L溶解于ddH₂O中，取其中的1/10加入10^-3M的氯金酸，100摄氏度搅拌0.5h，即得到钯金合金纳米材料。

（2）纳米材料标记抗体：所制得钯金合金高速离心（13000rpm，10min），除去上清液，5倍浓缩后再重新溶解于1ml ddH₂O中，调整至最适pH9.0，加入β-HCG单克隆抗体，室温下培育一小时后加入100μL 10%BSA，反应30分钟，4℃×12000rpm×20min离心留沉淀，去上清。用1mL PBS（1%BSA）清洗标记物，并再次离心。将得到的黑色沉淀分散在1mL缓冲溶液（20mmolL-1Na₃PO₄·12H₂O,5%BSA,0.25%Tween20,10%sucrose）中。即得到纳米钯金标记的抗体。

（3）试纸条的组装：双抗夹心法适用于大分子的检测，而竞争法更适用于小分子的检测，竞争免疫试纸条的制备方法与双抗夹心法类似，这里我们用具体事例简要说明它的制备方法，但由于有些试剂的制备方法不是本发明的重点，我们就不再具体阐述。

首先，将玻璃纤维膜浸泡浓度为2μg/mL的苯并芘多克隆抗体溶液中20分钟，37℃干燥，真空包装，置4℃备用，即得到结合垫2。在硝基纤维素膜上的测试线5部位喷涂浓度为500μg/mL的苯并芘-卵清蛋白，对照线6部位喷涂浓度为200μg/mL的羊抗兔IgG作对照线6，37℃烘干，封装备用。样品垫1的制备方法与实施例3中的方法相同。然后按照实施例3中的方法将各组分组装后，干燥，密封包装，4℃储存。然后，组装整个免疫层析试纸条（如示意图1）：分别将硝基纤维膜3、样品垫1、结合垫2和吸收垫4依次粘在PVC板上，硝基纤维膜3上的对照线6靠近吸收垫4端，测试线5靠近样品垫1端，再切割成宽4mm的试纸条，密封包装，干燥，4℃保存。

（4）样本检测：首先将制备好的竞争免疫试纸条放在试剂盒当中（如示意图2），用pH7.4PBS（0.03%KH₂PO₄、0.15%Na₂HPO₄、0.8%NaCl、0.02%KCl）将HCG值标准检测液（25mIU/mL）稀释为10~20mIU/mL，然后像注样孔中滴加约2~5滴，静置约2~5min后，进行信号催化放大。

（5）信号催化放大：将已配置的铜催化反应液的金属反应液与还原液直接混合，用塑料滴管吸取混合液滴加到检测盒的检测孔内，过10min后，如果在对照线6的部位出现一条红色带则为阴性，说明待测物中含有苯并芘；如果在对照线6和测试线5各出现一条红色条带则为阳性，说明待测物中没有苯并芘，或者苯并芘的含量极低，不会导致对人体的伤害。

实施例3：纳米材料的制备

以上实施例我们只是选择了两种纳米材料具体说明，其实还有很多种纳米材料可以应用在本发明中，如：

a.钯粒子或铂粒子的制备：

（1）钯粒子的制备：以c（柠檬酸三钠）/c（H₂PdCl₄）=20，c（H₂PdCl₄）=0.5mM为例，向100ml的圆底烧瓶中加入15ml H₂PdCl₄溶液（2mM），0.1784g柠檬酸三钠，2ml乙醇和43mlddH2O，机械搅拌,115℃加热回流3h。溶液由黄色到棕黄色再变成棕褐色，即得到柠檬酸三钠稳定的Pd溶胶。

（2）铂粒子的制备：以c（柠檬酸三钠）/c（H₂PtCl₄）=20，c（H₂PtCl₄）=0.5mM为例，向100ml的圆底烧瓶中加入15ml H₂PtCl₄溶液（2mM），0.1784g柠檬酸三钠，2ml乙醇和43mlddH2O，机械搅拌,115℃加热回流3h。溶液为黄色时，即得到柠檬酸三钠稳定的Pt溶胶。

b.钯粒子、铂粒子和金粒子中任意两种或三种的混合：

金粒子的制备：取1mL 1%氯金酸，加热沸腾；搅动下准确加入1.5mL 1%柠檬酸钠，继续煮沸15min，冷却后去离子水恢复到原体积即可得到胶体金粒子。

（1）钯粒子与铂粒子混合：上述制备的钯粒子与铂粒子以1:1的体积混合。

（2）钯粒子与金粒子混合：上述制备的钯粒子与金粒子以1:1的体积混合。

（3）铂粒子与金粒子混合：上述制备的铂粒子与金粒子以1:1的体积混合。

c.钯、金或铂中任意两种或三种的合金

（1）钯金合金的制备：上述制备的钯粒子以浓度为1×10^-9mol/L溶解于ddH₂O中，取其中的1/10加入10^-3M的氯金酸，100摄氏度搅拌0.5h，即得到钯金合金纳米材料。

（2）铂金合金的制备：上述制备的铂粒子以浓度为1×10^-9mol/L溶解于ddH₂O中，取其中的1/10加入10^-3M的氯金酸，100摄氏度搅拌0.5h，即得到钯金合金纳米材料。

（3）钯铂金合金的制备：上述制备的钯铂混合粒子以浓度为1×10^-9mol/L溶解于ddH₂O中，取其中的1/10加入10^-3M的氯金酸，100摄氏度搅拌0.5h，即得到钯金合金纳米材料。

d.a类、b类或c类物质负载于碳纳米球、二氧化硅纳米球、三氧化二铝纳米球或聚苯乙烯球上形成的复合颗粒：负载方法即将所制备的各种粒子，与所要负载的物质如碳纳米球、二氧化硅纳米球、三氧化二铝纳米球或聚苯乙烯球，混合震荡20h，即得到复合纳米材料。

实施例4：催化放大反应液

本发明利用化学镀的方式将检测信号放大，下面重点介绍四种渡液：镍催化放大反应液、钴催化放大反应液、银催化放大反应液和铜催化放大反应液。

1．钯标镍染

镍催化放大反应液的配制方法具体为：32g/L硫酸镍，16g/L柠檬酸钠，8g/L乳酸溶于双蒸水中，调节pH=±6.5;B瓶中溶液配方：0.4g/L二甲氨基甲硼烷（DMAB）溶于双蒸水中，金属反应液与还原液的体积比为4:1。金属反应液中的溶液为绿色，还原液为无色，使用时，将两种溶液直接混合即可。取实施例3获得的试纸，以双抗夹心法为例在样品区滴加待检测样品,2min后，用滴管吸取混合液滴加到检测盒的检测孔内，过10min后，如果在对照线6的部位出现一条黑色带则为阴性，如果在对照线6和测试线5各出现一条黑色条带则为阳性。该黑色条带可以用肉眼直接观察颜色，也可以用磁性分析仪，进行磁性扫描，磁性信号越强，待测物的浓度越大。

2．钯标钴染

钴催化放大反应液的配置方法具体为：10g/L氯化铵，6g/L氯化钴，8g/L乙二胺四乙酸用于双蒸水中，调pH=±7.0;B瓶中溶液配方：8.5g/L的二甲氨基甲硼烷（DMAB），金属反应液与还原液的体积比为2:1。金属反应液的溶液为红色，还原液为无色，使用时，将两种溶液直接混合即可。取实施例3获得的试纸，以双抗夹心法为例，在样品区滴加待检测样品,2min后，用塑料滴管吸取混合液滴加到检测盒的检测孔内，55℃加热10min后，如果在对照线6的部位出现一条黑色带则为阴性，如果在对照线6和测试线5各出现一条黑色条带则为阳性。该黑色条带可以用肉眼直接观察颜色，也可以用磁性分析仪，进行磁性扫描，磁性信号越强，待测物的浓度越大。

3．钯标银染

银催化放大反应液的配制方法具体为：183g/L柠檬酸，33g/L柠檬酸钠，16g/L硝酸银溶于双蒸水中。配置时应先将柠檬酸与柠檬酸钠充分溶解，再将硝酸银溶于其中，且硝酸见光易分解，需置于黑瓶中，避光保存。还原液配方：56g/L对苯二酚溶于双蒸水中，金属反应液与还原液的体积比为1:1。溶液均为无色，使用时，将两种溶液直接混合即可。取实施例3获得的试纸，以双抗夹心法为例，在样品区滴加待检测样品,2min后，用塑料滴管吸取混合液滴加到检测盒的检测孔内，过2min后，如果在对照线6的部位出现一条黑色带则为阴性，如果在对照线6和测试线5各出现一条黑色条带则为阳性。该黑带可用肉眼观察颜色，得出结果。

4．钯标铜染

铜催化放大反应液的配制方法具体为：金属反应液配方：37.5g/L硫酸铜，113g/L酒石酸钾钠，40g/L氢氧化钠溶于双蒸水中，还原液为质量分数为37％的分析纯甲醛，金属反应液与还原液的体积比为12.5：1。金属反应液为蓝色，还原液为无色，使用时，将两种溶液直接混合即可。取实施例3获得的试纸，以双抗夹心法为例，在样品区滴加待检测样品,2min后，用塑料滴管吸取混合液滴加到检测盒的检测孔内，过10min后，如果在对照线6的部位出现一条红色带则为阴性，如果在对照线6和测试线5各出现一条红色条带则为阳性。

补充说明：我们将黑色条带的钴或镍斑点收集，利用SQUIT测量了其磁滞回归曲线。如示意图5，所沉积的Co表现出较高的饱和磁化强度（可达100emu／g）与剩余磁化力（70%），矫玩力几乎为零。还可以利用一些超灵敏的磁检测传感器如磁隧道结（MTJ）等微、纳磁头进行检测，参照一种类似于硬盘工作方式的机制，通过微、纳磁头在芯片表面的滑动，快速的将磁标记点读出信号，达到定量检测的目的。

Claims

1.一种检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，其特征在于，所述纳米催化剂为粒径1~500纳米的球形、管状或不规则形状颗粒。

3.根据权利要求1或2所述的检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，其特征在于，所述步骤1）中的抗体蛋白是指由B淋巴细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类能与抗原特异性结合、具有免疫功能的球蛋白。

4.根据权利要求1或2所述的检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，其特征在于，所述的步骤1）中，采用物理吸附法或化学修饰法对抗体蛋白进行标记，所述物理吸附法是在纳米催化剂表面与抗体蛋白之间用静电力形成复合物，所述化学修饰法是在纳米催化剂表面与抗体蛋白之间用表面羧基化耦联、表面氨基化耦联或表面醛基化耦联。

5.根据权利要求1或2所述的检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，其特征在于，所述步骤4）中的催化放大反应液为镍、钴、银或铜化学镀液。

6.根据权利要求1所述的检测信号催化放大的免疫层析试纸检测方法，其特征在于，所述步骤4）中的催化放大反应液含有钴离子和镍离子中的一种或两种，所述步骤5）中，将免疫层析试纸用磁性分析仪读取磁信号，然后结合标准曲线，计算出待测样品中待测物的浓度。