CN117330744A - 一种基于sers技术检测psa的侧流免疫层析试纸条及其制备与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条及其制备与检测方法，属于免疫学检测技术领域，所述SERS免疫层析试纸条制备方法包括以下步骤：1)制备修饰有内标GO的NC膜，即GO/Au@NC膜；2)制备SERS免疫探针Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs；3)将样品垫、结合垫、GO/Au@NC膜、吸水垫按照顺序组装于PVC板上；所述SERS免疫层析试纸条对于PSA具有优异的灵敏度，可快速准确地检测出血清中的PSA，其可视化最低检测限为1ng/mL，通过拉曼信号测定的最低检测限为0.08ng/mL，并且该试纸具有良好的特异性，与其他非靶标相比，仅对血清前列腺特异性抗原PSA有明显信号响应，此外该试纸还能够满足检测对基底均匀性、重复性和可靠性的要求，为临床快速高灵敏定量检测血清中的PSA提供了新的方法。
Description
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条及其制备与检测方法。
背景技术
血清前列腺特异性抗原(PSA)发现于1971年，被认为是早期检测、分期和监测前列腺癌(PCa)最重要的生物标志物。PSA是一种33-34kDa的糖蛋白，主要由前列腺产生。当血清PSA水平超过4ng/mL的临界值时，就被认为与PCa有关。因此，检测PSA对早期诊断前列腺癌具有重要意义。
目前，已开发出多种检测PSA的方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、电化学免疫测定、表面等离子体共振和荧光免疫测定等。然而，这些方法大多需要昂贵的实验室仪器、熟练的人员和耗时的操作。这些局限性阻碍了它们在医疗点的广泛检测应用。因此，我们仍然迫切需要一种简单、廉价且易于使用的诊断系统，以满足临床诊断需求和监控病情发展。
侧流免疫层析试纸条技术是一种简单、快速、经济、用户友好的即时诊断技术，可用于多种生物分析应用。免疫侧流试纸条的工作原理在于与待测物偶联的纳米探针在毛细管作用力下沿着硝酸纤维素膜(NC膜)向吸水垫方向移动，期间与喷涂在NC膜上的捕获抗体相结合而被固定在该区域，可显示出特定颜色从而直接判定结果。然而，传统免疫层析试纸条的检测灵敏度有限，只能对目标物进行定性和半定量分析。基于表面增强拉曼光谱(SERS)的免疫层析试纸条技术将SERS的高灵敏度和特异性与免疫层析试纸条的简便、高效和无需专业知识相结合，使其成为床旁检测(POCT)的理想选择。因此通过进一步研究在本领域开发一种用于检测PSA的SERS侧流免疫层析试纸条，是一项非常有前景与意义的技术探索。
公开号为CN106257271A的发明专利公开了一种基于表面增强拉曼散射技术的复合材料及其制备方法，所述复合材料包括表面修饰有第一靶分子的微球与表面修饰有拉曼信号分子和经第二靶分子修饰的高分子的第二组分；并且，在含待测物溶液中，所述待测物与所述微球和所述第二组分通过所述第一靶分子和所述第二靶分子结合形成易于离心沉淀的复合物，但是此复合材料主要解决降低假阳性和假阴性效应的技术问题，并且检测的物质除了PSA，还包括人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)以及疾病标志物，因此在特异性与选择性方面还需要进一步的优化；公开号为CN106525814A的发明专利提供了一种基于磁核金卫星组装体的PSA检测方法，将修饰有PSA适配体PSAaptamer的磁性纳米颗粒，和修饰有与适配体部分互补的序列PSACS的金纳米颗粒，组装形成核卫星组装体，当存在待测物PSA时，该组装体的结构改变引起体系中上清液的拉曼信号的变化，基于此，可实现对PSA含量的检测，但此发明中并没有提出专门针对提升检测限的技术特征，且由于该磁核金卫星组装体的各原料混合比例会分别影响到实验过程中背景信号以及实验结果，故还需调控各物质之间特定的用量关系。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明利用侧流免疫层析技术，构建一种基于SERS技术检测PSA的新型免疫检测试纸条，该试纸能够满足检测对基底选择性、灵敏性、均匀性、重复性和可靠性的要求，实现血清中PSA的临床快速定量检测。
本发明的技术方案如下：
本发明目的之一在于提供一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条，包括PVC板、样品垫、SERS免疫探针预处理的结合垫、GO/Au@NC膜以及吸水垫，其中样品垫、结合垫、GO/Au@NC膜与吸水垫按照顺序组装于PVC板上，GO/Au@NC膜上依次包被有检测线T线和质控线C线，结合垫上包被有Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs。
本发明目的之二在于提供一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备SERS免疫探针Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs，并将其包被在结合垫上；
(2)制备GO/Au@NC膜，并在膜上依次包被检测线T线和质控线C线，其中氧化石墨烯/金纳米粒子GO/Au NPs作为内标IS分子负载在硝酸纤维素NC膜的测试线T线上；
(3)将样品垫、结合垫、GO/Au@NC膜以及吸水垫按照顺序组装于PVC板上，各部分重叠2mm，制得侧流免疫层析试纸条。
进一步的，所述步骤(1)中Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs的制备过程为：
1)在Au NPs中加入1mM MBN进行孵化改性，离心去除多余的MBN；
2)将1wt％柠檬酸钠C6H5Na3O7溶液、0.1M氢氧化钠NaOH分别加入到改性的Au NPs中，再先后加入1mM硝酸银AgNO3溶液与10mM抗坏血酸AA溶液，反应后离心重悬得到Au@MBN@Ag NPs溶液；
3)向Au@MBN@Ag NPs溶液加入5mM二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯DSP进行反应，而后加入1mg/mL血清前列腺特异抗原PSA抗体孵育，以5mg/mL牛血清白蛋白BSA重悬，在4℃下封闭保存制得SERS免疫探针Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液。
进一步的，所述步骤1)中VAu NPs/VMBN为100：1；
所述步骤2)中V C6H5Na3O7/VAu NPs为3：100；VNaOH/VAu NPs为1：100；VAgNO3/VAu NPs为1：10；VAA/VAu NPs为1：25；
所述步骤3)中VDSP/VAu NPs为1:500；
进一步的，所述Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs的溶液pH调节在7～10之间。
进一步的，使用碳酸钾溶液(K2CO3)调节Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液的pH，Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液与K2CO3的体积比为1：0.16；所述碳酸钾溶液的摩尔浓度为0.3M。
进一步的，将步骤(1)中所述Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液滴涂在结合垫上，于35-39℃鼓风烘箱中烘干1-3h从而使其包被在结合垫上。
进一步的，所述步骤(2)中GO/Au@NC膜的制备过程为：
1)将2mg/mL GO水溶液和1％柠檬酸钠C6H5Na3O7水溶液加入去离子水中，搅拌加热至沸腾后快速加入1％氯金酸HAuCl4溶液，并在搅拌下继续加热；
2)关闭加热，将溶液连续搅拌直至冷却到室温，离心得到GO/Au NPs，将其在4℃下保存；
3)将所制备的GO/Au NPs浓缩后分配到NC膜上的T线，即得到GO/Au@NC膜。
进一步的，所述步骤1)中VGO水溶液/V C6H5Na3O7为1：3，VGO水溶液/V HAuCl4为(1～16)：32。
进一步的，所述步骤3)中GO/Au NPs浓缩倍数为20～100。
进一步的，所述步骤(2)中检测线T线和质控线C线由划膜仪按照1μL/cm的用量在NC膜上划出，其中检测线T线包被PSA抗体浓度为1mg/mL，质控线C线包被anti-lgG浓度为1mg/mL，T线和C线之间的距离为4mm。
本发明目的之三在于提供一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的检测方法，将待检血清滴在样品垫处或将试纸条的样品垫部分插入到待检样品液体中，平放15～20min后即可观察结果。
进一步的，包括以下步骤：
S1、利用上述侧流免疫层析试纸条构建不同浓度的PSA(0～100ng/mL)与MBN相对强度之间的标准工作曲线。
S2、将上述侧流免疫层析试纸条的样品垫部分插入待测血清中，平放15～20min后观察结果。在可视化检测中，若T线和C线均显色，则待测血清中含PSA，且该检测结果有效；若T线不显色，C线显色，则待测血清中含有痕量或不含PSA。
S3、利用拉曼光谱仪器扫描T线处收集相应光谱曲线，并根据标准工作曲线计算出血清中PSA的浓度。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用侧流免疫层析技术，构建了一种基于SERS技术检测PSA的新型免疫检测试纸条，此试纸条制备了GO/Au NPs并将其修饰在NC膜T线上，不仅提高了金属纳米粒子的稳定性，而且通过π-π堆叠或静电相互作用富集目标分子。此外，GO在1312cm-1的拉曼散射强度还可以作为SERS中定量分析的内标材料，本发明将氧化石墨烯/金纳米粒子(GO/AuNPs)作为内标(IS)分子负载在硝酸纤维素(NC)膜的测试线上，并将Au@MBN@Ag@PSANPs作为SERS免疫探针用于特异性识别PSA，通过同时测量测试线上免疫探针和内标分子的信号并计算它们的信号强度比来动态校准特征信号，校准由于NC膜上热点的不均匀分布而引起的分子的拉曼强度波动，修正检测结果的线性关系，从而有效提高了SERS-LFA平台的检测准确性。
2、本发明所构建的新型侧流免疫层析试纸条基于SERS的侧流免疫层析试纸条具有更高的灵敏度，可视化最低检测限可达1ng/mL，通过拉曼信号测定的最低检测限为0.08ng/mL，不同浓度的PSA(0至400ng/mL)与此侧流免疫层析试纸条1073cm-1(MBN)/1312cm-1(GO)拉曼强度比所建立的标准工作曲线线性方程为y＝0.0414x+0.6761，线性回归值(R2)为0.9948，证明两者之间存在良好的线性关系，回归效果显著，模型拟合优度比较高。
3、本发明所公开的新型侧流免疫层析试纸条具有良好的特异性和选择性，在特异性实验中，对于其他类似蛋白(IgG、IL-6、PCT和TNF-α)的响应性较差，仅对血清前列腺特异性抗原PSA有明显信号响应，并且此试纸条在重复性实验中各条带测试线上相对应的强度直方图RSD值为3.17％，表明此侧流免疫层析试纸条同时还具有良好的重复性和可靠性。此外，本发明中所制备的试纸条中GO/Au@NC膜具有良好的均匀性，其RSD的值为9.76％，远低于20％，满足检测对基底均匀性的要求。
附图标记
图1为本发明所述侧流免疫层析试纸条的工作原理图；
图2为本发明性能测试中GO/Au@NC膜的表征结果图，其中图2A为GO/Au NPs的TEM图；图2B为用不同体积的GO制备的GO/Au NPs在1312cm-1处的拉曼强度图；图2C为用不同倍数浓缩的GO/Au NPs溶液修饰的NC膜在1312cm-1处的拉曼强度图；图2D为GO/Au@NC膜上随机选取100个点在1312cm-1处的拉曼强度图；
图3为本发明性能测试中SERS免疫探针偶联优化结果，其中图3A为SERS免疫探针Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs偶联的pH优化结果；图3B为SERS免疫探针Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs偶联的体积优化结果；
图4为本发明实施例2中不同PSA浓度下侧流免疫层析试纸条的检测结果图，其中图4A为不同PSA浓度下免疫层析试纸条的可视化结果；图4B为在不同浓度的PSA下在T线上获得的拉曼光谱图；图4C为不同浓度的PSA对1073cm-1(MBN)/1312cm-1(GO)拉曼强度比所建立的标准工作曲线；
图5为本发明侧流免疫层析试纸条的性能测试结果图，其中图5A和5B为特异性实验结果；图5C和5D为重复性实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和较佳实施例对本发明做进一步的说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；
本发明实施例中PSA抗原、PSA抗体以及lgG抗体均购自中国领潮生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条，工作原理如图1所示，制备方法包括如下步骤：
S1、制备SERS免疫探针Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs：在Au NPs中以100：1(VAu NPs/VMBN)加入1mM MBN孵化1h改性，在11000rpm下离心10min去除多余的MBN；以3：100(VC6H5Na3O7/VAu NPs)、1：100(VNaOH/VAu NPs)加入C6H5Na3O7(1wt％)和NaOH(0.1M)，5min后，以1：10(VAgNO3/VAu NPs)加入AgNO3(1mM)，10min后以1：25(VAA/VAu NPs)加入AA(10mM)，反应30min后在8500rpm离心10min获得Au@MBN@Ag NPs溶液；以1:500(VDSP/VAu NPs)加入DSP(5mM)反应3h后，按2μg PSA抗体：1ml Au@MBN@Ag@DSP NPs加入PSA抗体(1mg/mL)，在37℃下孵育1.5h后，以BSA(5mg/mL)重悬，封闭0.5h，置于4℃保存所制得SERS免疫探针Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液；
S2、调节SERS免疫探针溶液的pH：使用K2CO3(0.3M)调节Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液的pH为9，Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液与K2CO3的体积比为1：0.16；
S3、包被SERS免疫探针：将Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液滴涂在结合垫上，于37℃鼓风烘箱中烘干2h；
S4、制备GO/Au@NC膜：以1：3(VGO水溶液/V C6H5Na3O7)将GO(2mg/mL)和C6H5Na3O7(1％)加入去离子水中，搅拌加热至沸腾后以1：4(VGO水溶液/V HAuCl4)将HAuCl4(1％)快速加入到该混合物中，并在搅拌下继续加热；10min后关闭加热，将溶液连续搅拌直至冷却到室温，11000rpm下离心7min得到GO/Au NPs；将所制备的GO/Au NPs浓缩后分配到NC膜上的T线，浓缩倍数为60，得到GO/Au@N膜；
S5、包被检测线T线和质控线C线：使用划膜仪按照1μL/cm的用量在NC膜上划出T、C线，其中，T线包被PSA抗体浓度为1mg/mL，C线包被anti-IgG浓度为1mg/mL，T线和C线之间的距离为4mm；
S6、将样品垫、结合垫、GO/Au@NC膜以及吸水垫按照顺序组装于PVC板上，各部分重叠2mm，制得侧流免疫层析试纸条。
上述实施例中还可根据实际操作调整VGO水溶液/V HAuCl4为1：32或1：2，调整GO/Au NPs的浓缩倍数为20或100，调节Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液pH为7或10，鼓风烘箱中烘干条件还可以为39℃，1h或者35℃，3h。
实施例2
本实施例利用实施例1所述侧流免疫层析试纸条定量检测血清中的PSA，检测方法包括如下步骤：
S1、将实施例1所述侧流免疫层析试纸条的样品垫部分插入100μL不同浓度(0～400ng/mL)的PSA溶液中，在15～20min后观察结果。
S2、利用拉曼光谱仪器扫描T线处收集相应光谱曲线，基于GO/Au@NC膜上GO和Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs中MBN的拉曼信号强度比，建立PSA浓度的标准工作曲线，相关结果如图4所示。
S3、根据标准工作曲线计算出血清中PSA的浓度。
如图4A所示，在可视化的情况下，当PSA浓度为1ng/mL时试纸条T线呈现浅色但可识别的红色；
图4B中不同PSA浓度下的SERS谱图显示，随着PSA抗原浓度的增大，SERS免疫探针在T线上的SERS信号逐渐增强；
在图4C中不同浓度的PSA对1073cm-1(MBN)/1312cm-1(GO)拉曼强度比表现出良好的线性关系，线性方程为y＝0.0414x+0.6761，线性回归值(R2)为0.9948。
性能测试
1、GO/Au@NC膜表征测试
S1、将12.5、25、50、100、200μL GO水溶液(2mg/mL)和300μL柠檬酸钠水溶液(1wt％)加入到30mL的去离子水中，搅拌加热至沸腾；
S2、3min后将400μL HAuCl4(1wt％)快速加入到该混合物中，并在搅拌下继续加热10min。之后，关闭加热，将溶液连续搅拌直至冷却到室温；
S4、在11000rpm下离心7分钟得到GO/Au NPs，并将其重新分散在去离子水中，然后在4℃下保存以备进一步使用。将所制备的GO/Au NPs浓缩20、40、60、80、100倍后取2μL分配到NC膜上的T线，即得到氧化石墨烯/金复合纳米材料负载的GO/Au@NC膜。
对本实施例合成的GO/Au NPs的形貌进行表征，如图2A所示，通过TEM图可明显看出，Au NPs修饰在GO薄膜上，分布较为密集；
为了获得具有最佳SERS信号的GO/Au纳米复合材料，对反应体系中GO的体积进行优化，如图2B所示，当添加GO的体积为100μL时，GO/Au NPs的SERS信号达到最佳；
为了使GO修饰的NC膜达到最佳的信号增强效果，将所制备的GO/Au NPs溶液浓缩修饰到NC膜上，如图2C所示，当溶液浓缩80倍时，GO/Au@NC膜在1312cm-1处能产生更强的内标信号；
对本实施例合成的GO/Au@NC膜中GO的SERS信号强度及其均匀性进行表征，如图2D所示，在一块GO/Au@NCM上随机选取100个点进行SERS检测对其均匀性进行评估，结果表明所制备的GO/Au@NCM具有良好的均匀性，RSD的值为9.76％，远低于20％，满足检测对基底均匀性的要求。
2、SERS免疫探针偶联pH测试
以0.3M K2CO3调节Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs的pH为7、8、9、9.5、10，随后将Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs喷涂在结合垫上，干燥后进行试纸条组装，测试PBS溶液，观察T线、C线上的显色情况并进行SERS检测。
实验结果如图3A所示，Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs的pH会影响试纸条的假阳性，当pH为9时试纸条的假阳性消失，当溶液为PBS时，有且仅有C线出现显色，因此优选pH为9。
3、SERS免疫探针体积测试
将不同体积的Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液滴涂于结合垫上，得到滴涂有SERS免疫探针的结合垫，在37℃下烘干2h，然后组装试纸条。将试纸条的样品垫部分插入100μL50ng/mL PSA溶液中，15～20min后观察结果。利用拉曼光谱仪器扫描T线处收集相应曲线，根据检测结果确定免疫探针最佳体积。
实验结果如图3B所示，当结合垫上SERS免疫探针的添加量为5μL时，SERS信号最佳。
4、侧流免疫层析试纸条特异性测试
将实施例1所述侧流免疫层析试纸条的样品垫部分插入100μL 50ng/mL IgG、IL-6、PCT和TNF-α溶液中，在15～20min后观察结果，利用拉曼光谱仪器扫描T线处收集相应曲线。
图5A和图5B显示了与其他非靶标相比，所述侧流免疫层析试纸条对PSA有明显信号响应，意味着本发明所公开的试纸条在特异性区分PSA与其他非靶标方面具有良好的特异性。
5、侧流免疫层析试纸条重复性测试
分别制备8个不同批次的免疫层析试纸条，将100μL浓度为50ng/mL的PSA抗原加载到样品垫上，测试每个条带T线上的SERS信号。
从图5C各条带测试线上的SERS谱图和图5D各条带测试线上相对应的强度直方图可以看出，所开发的试纸条具有良好的重复性，RSD值为3.17％，证实本发明的侧流免疫层析试纸条具有良好的重复性和可靠性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条，其特征在于，包括PVC板、样品垫、SERS免疫探针预处理的结合垫、GO/Au@NC膜以及吸水垫，其中样品垫、结合垫、GO/Au@NC膜与吸水垫按照顺序组装于PVC板上，GO/Au@NC膜上依次包被有检测线T线和质控线C线，结合垫上包被有Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs。
2.一种如权利要求1所述基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备SERS免疫探针Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs，将其包被在结合垫上；
(2)制备GO/Au@NC膜，在膜上依次包被检测线T线和质控线C线，其中氧化石墨烯/金纳米粒子GO/Au NPs作为内标IS分子负载在硝酸纤维素NC膜的测试线T线上；
(3)将样品垫、结合垫、GO/Au@NC膜以及吸水垫按照顺序组装于PVC板上，各部分重叠2mm，制得侧流免疫层析试纸条。
3.如权利要求2所述一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs的制备过程为：
1)在Au NPs中加入1mM MBN进行孵化改性，离心去除多余的MBN；
2)将1wt％柠檬酸钠C6H5Na3O7溶液、0.1M氢氧化钠NaOH分别加入到改性的Au NPs中，再先后加入1mM硝酸银AgNO3溶液与10mM抗坏血酸AA溶液，反应后离心重悬得到Au@MBN@AgNPs溶液；
3)向Au@MBN@Ag NPs溶液加入5mM二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯DSP进行反应，而后加入1mg/mL血清前列腺特异抗原PSA抗体孵育，以5mg/mL牛血清白蛋白BSA重悬，在4℃下封闭保存制得SERS免疫探针Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液。
4.如权利要求3所述一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中VAu NPs/VMBN为100：1；
所述步骤2)中VC6H5Na3O7/VAu NPs为3：100；VNaOH/VAu NPs为1：100；VAgNO3/VAu NPs为1：10；VAA/VAu NPs为1：25；
所述步骤3)中VDSP/VAu NPs为1:500；
所述Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs的溶液pH调节在7～10之间。
5.如权利要求2所述一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，将步骤(1)中所述Au@MBN@Ag@PSA抗体NPs溶液滴涂在结合垫上，于35-39℃鼓风烘箱中烘干1-3h从而使其包被在结合垫上。
6.如权利要求2所述一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中GO/Au@NC膜的制备过程为：
1)将2mg/mL GO水溶液和1％柠檬酸钠C6H5Na3O7水溶液加入去离子水中，搅拌加热至沸腾后快速加入1％氯金酸HAuCl4溶液，并在搅拌下继续加热；
2)关闭加热，将溶液连续搅拌直至冷却到室温，离心得到GO/Au NPs，将其在4℃下保存；
3)将所制备的GO/Au NPs浓缩后分配到NC膜上的T线，即得到GO/Au@NC膜。
7.如权利要求6所述一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中VGO水溶液/VC6H5Na3O7为1：3，VGO水溶液/VHAuCl4为(1～16)：32。
8.如权利要求6所述一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中GO/Au NPs浓缩倍数为20～100。
9.如权利要求2所述一种基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中检测线T线和质控线C线由划膜仪按照1μL/cm的用量在NC膜上划出，其中检测线T线包被PSA抗体浓度为1mg/mL，质控线C线包被anti-lgG浓度为1mg/mL，T线和C线之间的距离为4mm。
10.一种采用如权利要求1所述基于SERS技术检测PSA的侧流免疫层析试纸条的检测方法，其特征在于，将待检血清滴在样品垫处或将试纸条的样品垫部分插入到待检样品液体中，平放15～20min后即可观察结果。
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