CN114994311A - 一种基于sers技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条及其制备方法。所述免疫侧流试纸条及其制备方法包括以下步骤：1）制备特异性纳米探针，并在结合垫上包被纳米探针；2）制备修饰了拉曼信号分子的NC膜，即NC@拉曼信号分子@Au膜，并在膜上依次包被检测线T线和质控C线；3）将样品垫、结合垫、NC@拉曼信号分子@Au膜以及吸水垫按照顺序组装于PVC板上，得到免疫侧流试纸条本发明的试纸条对待测物特异性高，灵敏度好，检测限低，可快速准确地检测出复杂样本中的待测物，有望成为适用于各种环境下快速、简便、特异、敏感的免疫检测试纸条。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，涉及一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条及其制备方法。
背景技术
试纸条技术因其操作简单、快捷、结果直观等优点被广泛应用于医学、环境监测等各个领域，其中传统免疫侧流试纸条凭借着快速、无需专业训练等优点适用于日常基层检测需求。传统免疫侧流试纸条的工作原理在于与待测物偶联的纳米探针在毛细管作用力下沿着硝酸纤维素膜(NC膜)向吸水垫方向移动，期间与喷涂在NC膜上的捕获抗体相结合而被固定在该区域，可显示出特定颜色从而直接判定结果。但是，传统免疫侧流试纸条的判定结果与颜色的深浅相关，仅能对待测物进行半定量，无法实现精确定量，影响分析结果的准确性。
表面增强拉曼技术(SERS)具有超灵敏的检测能力，特殊条件下可在单分子水平上进行表征，在生物医学应用领域具有巨大的潜力。迄今为止，已有大量研究将SERS技术与免疫试纸条结合检测各类待测物，大大提高了传统免疫试纸条的灵敏度，但是也存在一定的局限性，如复杂的生理样本、仪器波动等外界因素对拉曼信号的干扰，所以有必要对NC膜进行改进以提高检测结果的精确性和可靠性。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条及其制备方法，实现快速、灵敏、准确地检测复杂样本中的待测物。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条，包括以下步骤：
S1：制备特异性纳米探针
Au NPs以100:1(v/v)加入1mM的拉曼信号分子1，孵化2～2.1h后，以9500rpm离心10min去除多余的拉曼信号分子1；
以1:10(VAgNO3/VAu NPs)、1:10(VAA/VAu NPs)加入1mM的AgNO3和0.01M的抗坏血酸(AA)，反应30～35min，获得Au@拉曼信号分子1@Ag NPs溶液；
以1:1000(VDSP/VAu NPs)加入5mM的二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯(DSP)，反应3～3.2h后加入一定量的具有生物识别功能的分子，在37℃下孵育1.5～1.6h后，以0.1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)重悬，封闭0.5～0.6h，得到特异性纳米探针溶液，置于4℃保存；
S2：制备修饰了拉曼信号分子的NC膜，即NC@拉曼信号分子2@Au膜
将NC膜浸至10～50mM氨水溶液中1～1.2h后，转移至10～50mM三氟乙酸银溶液中，于65℃水浴条件下反应2～4h，得NC@Ag膜；将NC@Ag膜浸泡至0.1mM的拉曼信号分子2的PBS溶液中，孵育3～3.2h，得NC@Ag@拉曼信号分子2膜；接下来，将NC@Ag@拉曼信号分子2膜放置于生长液中30～35min后，将0.1mM的氯金酸溶液(HAuCl4)以0.2ml/min加入其中，最后于37℃、250rpm下在摇床中反应4～4.2h，可得NC@拉曼信号分子2@Au膜；
S3：NC@拉曼信号分子2@Au膜包被检测T线和控制C线
使用划膜仪按照1μL/cm的用量在NC膜上划出T线、C线。
S4：结合垫包被特异性纳米探针
将结合垫浸泡至特异性纳米探针溶液中1～1.2h，于37℃鼓风烘箱中烘干；
S5：依次将样品垫、结合垫、NC@拉曼信号分子2@Au膜以及吸水垫按照顺序组装于PVC板上，得到免疫侧流试纸条
进一步地，所述拉曼信号分子1、拉曼信号分子2为4-巯基苯甲酸(MBA)、2,3,5,6-四氟-4-巯基苯甲酸(TFMBA)、亚甲基蓝(NBA)、4-巯基苯硼酸(MPBA)等拉曼信号分子中的任意两种，且拉曼信号分子1、拉曼信号分子2具有不同拉曼特征峰。
进一步地，步骤S1中的特异性纳米探针溶液选用NaOH或K2CO3调节pH至最佳反应值。
进一步地，步骤S1中具有生物特异性识别功能的分子为抗体、抗原、适配体等中的任意一种。
进一步地，步骤S2中生长液的组成为：PVP(1mM)、AA(100mM)和NaOH(200mM)，三者体积比为5:0.75:0.75。
进一步地，步骤S3中T线和C线之间的距离为2mm。
本发明还提供了一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条检测实际样本的方法，包括以下步骤：
S1：利用上述免疫测流试纸条构建不同浓度的待测物与信号分子相对强度之间的标准工作曲线。
S2：在上述免疫测流试纸条的样品垫处滴入实际样本或将样品垫部分插入实际样本中，平放10～15min后观察结果。在可视化检测中，若T线和C线均显色，则实际样本中含有待测物(阳性)；若T线不显色，C线显色，则实际样本中不存在待测物(阴性)。随后，利用拉曼光谱仪器扫描T线处收集相应曲线，并根据标准工作曲线计算出待测物的浓度。
进一步地，所述实际样本的体积为50～100μL，优选70μL。
本发明中，基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条检测实际样本的工作原理为：当样品在该试纸条流动时，如果存在待测物，则被固定在结合垫上的特异性纳米探针结合；随着偶联样品继续沿着条带移动，待测物与T线上的识别分子再次结合，从而使得与待测物结合的特异性纳米探针截留在T线上，显示出检测橘红色线；如果样品不含待测物，则在测试区没有标记的复合物结合，也没有观察到线。剩余的特异性纳米探针沿着NC@拉曼信号分子2@Au膜移动到控制线区，C线捕获了多余的特异性纳米探针，表明流体已经通过NC@拉曼信号分子2@Au膜充分迁移。在进行所有有效检测期间，无论样本是否含有待测物，C线都会出现一条红紫色的线。最后，利用拉曼光谱仪器，可在T线上收集相应的拉曼光谱曲线。以NC@拉曼信号分子2@Au膜和特异性纳米探针上的特征峰强度比值构建了待测物的标准工作曲线，最终实现对实际样本中待测物的定量检测。
从以上技术方案可以看出，本发明的有益效果在于：以原位合成的方式在NC膜上修饰上具有内标的纳米粒子，信号强度均匀，且检测线上特异性捕获的纳米粒子也携带不同的信号分子，因此可通过两者信号强度比率避免仪器等外界因素导致的信号波动，可极大程度地降低结果的假阳性或假阴性，提高检测结果的重现性、准确度和可靠性；另一方面，基于SERS灵敏度高以及双抗夹心法高特异性的优势，相较于传统免疫试纸条，本发明对复杂样本中的待测物特异性高，大大提高了检测灵敏度，进一步降低检出限和检测限。
附图说明
图1为本发明制得的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的工作原理；
图2.A为本发明实施例1中制得的NC@TFMBA@Au膜的SEM图；
图2.B为本发明实施例1中制得的NC@TFMBA@Au膜的SERS mapping图；
图3为本发明实施例2中特异性纳米探针的pH优化结果；
图4.A为本发明实施例3中不同CEA浓度下，本发明制得的基于SERS技术定量检测CEA的免疫侧流试纸条的可视化结果；
图4.B为利用本发明实施例3制得的一种基于SERS技术定量检测CEA的免疫侧流试纸条建立CEA浓度的标准工作曲线；
图5.A为本发明实施例4中不同待测物下，制得的基于SERS技术定量检测CEA的免疫侧流试纸条的可视化结果；
图5.B为本发明实施例4中制得的一种基于SERS技术定量检测CEA的免疫侧流试纸条的抗干扰实验结果。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例涉及一种基于SERS技术定量检测CEA的免疫侧流试纸条，实施例中CEA抗原、CEA抗体以及lgG抗体均购自中国领潮生物科技有限公司。
实施例1合成NC@TFMBA@Au膜
本实施例选取TFMBA作为拉曼信号分子2对NC膜进行改进
将NC膜浸至50mM氨水溶液中1h后，转移至10mM三氟乙酸银溶液中，于65℃水浴条件下反应2h，得NC@Ag膜；将NC@Ag膜浸泡至0.1mM TFMBA(PBS)溶液中，孵育3h，得NC@Ag@TFMBA膜；接下来，将NC@Ag@TFMBA膜放置于生长液中30min后，将3.6mL HAuCl4(0.1mM)以0.2ml/min加入其中，最后于37℃、250rpm下在摇床中反应4h，可得NC@TFMBA@Au膜。其中生长液A的组成为5mL PVP(1mM)、0.75mL AA(0.1M)、0.75mL NaOH(0.2M)。
对本实施例合成的NC@TFMBA@Au膜的形貌进行表征，如图2.A所示，通过SEM图可明显看出，NC膜上成功地原位合成了金银复合纳米粒子。进一步地，对本实施例合成的NC@TFMBA@Au膜中TFMBA的SERS信号强度及其均匀性进行表征，如图2.B所示，通过SERSmapping图可看出，制备所得的膜上TFMBA的信号较强且均匀，RSD为20％，满足检测对基底均匀性的要求。
实施例2定量检测CEA蛋白的免疫侧流试纸条及其制备方法
探究特异性纳米探针偶联的最佳pH
本实施例中选取4-MBA作为拉曼信号分子1合成Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs，在此基础上，探究Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs偶联的最佳pH。
制备特异性纳米探针，即Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs。首先，10mL Au NPs加入10μLMBA(1mM)，孵化2h后，以9500rpm下离心10min去除多余的MBA。然后，加入1mL AgNO3(1mM)和1mLAA(0.01M)，反应30min，可获得Au@MBA@Ag NPs溶液；其次，2mL Au@MBA@Ag NPs加入2μLDSP(5mM)反应3h后，按加入2μLCEA抗体(1mg/ml)，在37℃下孵育1.5h后，以0.1mg/ml BSA重悬，封闭0.5h，得到Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs，置于4℃保存。
调节Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs的pH。以0.2M K2CO3将Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs的pH调节为7.4、8、8.5、9、10。随后将Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs喷涂在结合垫上，干燥后进行试纸条组装。将样品垫、结合垫、NC@TFMBA@Au膜(预先使用划膜仪按照1μL/cm的用量在NC膜上划出T线、C线)、吸水垫按照顺序进行组装后，使用PBS溶液进行测试，观察T线、C线上的显色情况。
实验结果如图3所示，Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs的pH会影响试纸条的假阳性，当pH为9，试纸条的假阳性消失，当溶液为PBS时，有且仅有C线出现显色，因此优选pH为9。
实施例3建立CEA的标准工作曲线
在实施例2的基础上，改变CEA的浓度，利用制备所得的免疫侧流试纸条建立CEA的标准工作曲线。
在制备所得的免疫测流试纸条的样品垫处滴入或将样品垫部分插入70μL0、1、5、10、20、50、100、150、200、400、600、800、1000ng/mL CEA溶液中，平放10～15min后观察结果。利用拉曼光谱仪器扫描T线处收集相应曲线，基于NC@TFMBA@Au膜上TFMBA和Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs中MBA的特征峰相对强度，建立CEA浓度的标准工作曲线。
在可视化的情况下，如图4.A所示，当CEA浓度低于5ng/mL时，无法通过肉眼直观观察到T线上的颜色情况。随后，我们利用NC@TFMBA@Au膜上TFMBA和Au@MBA@Ag@CEA抗体NPs中MBA的特征峰相对强度建立了CEA的标准工作曲线，如图4.B所示，两者之间存在良好的线性关系，曲线为y＝0.005x+0.258，R2＝0.9925。
实施例4抗干扰实验
在实施例2的基础上，改变待测物的种类。
在制备所得的免疫测流试纸条的样品垫处滴入或或将样品垫部分插入70μL100ng/mL CEA、NSE、PSA、IL-6、lgG、白蛋白溶液中，平放10～15min后观察结果。利用拉曼光谱仪器扫描T线处收集相应曲线。
在可视化的情况下，如图5.A所示，当在同一浓度下，当且仅当待测物为CEA时，本发明制得的免疫侧流试纸条在T线和C线上可观察到明显的颜色反应，而其他待测物的情况下，均未在T线上的观察到明显颜色出现。进一步地，我们可从图4.B拉曼光谱曲线中明显发现，仅有当CEA存在时，拉曼光谱曲线中才出现MBA的特征峰。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备特异性纳米探针，并在结合垫上包被纳米探针；
2)制备修饰了拉曼信号分子的NC膜，即NC@拉曼信号分子@Au膜，并在膜上依次包被检测线T线和质控C线；
3)将样品垫、结合垫、NC@拉曼信号分子@Au膜以及吸水垫按照顺序组装于PVC板上，得到免疫侧流试纸条。
2.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1)中特异性纳米探针的制备过程为：
在Au NPs中加入拉曼信号分子1，孵化2～2.1h后，离心去除多余的拉曼信号分子1，得到Au@拉曼信号分子1NPs溶液；
将硝酸银溶液、抗坏血酸溶液依次加入Au@拉曼信号分子1NPs溶液中，反应30～35min，获得Au@拉曼信号分子1@Ag NPs溶液；
加入二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯反应3～3.2h后，加入具有生物特异性识别功能的分子，然后后在37℃下孵育1.5～1.6h，以牛血清白蛋白重悬，封闭0.5～0.6h，得到特异性纳米探针溶液。
3.根据权利要求2所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，所述特异性纳米探针溶液中加入NaOH或K2CO3调节pH至最佳反应值。
4.根据权利要求2所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，所述具有生物特异性识别功能的分子为抗体、抗原、适配体中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤2)中NC@拉曼信号分子@Au膜的制备过程为：将NC膜浸至氨水溶液中1～1.2h后，转移至三氟乙酸银溶液中，于65℃水浴条件下反应2～4h，得NC@Ag膜；将NC@Ag膜浸泡至拉曼信号分子2溶液中，孵育3～3.2h，得NC@Ag@拉曼信号分子2膜；将NC@Ag@拉曼信号分子2膜放置于生长液中30～35min后，将氯金酸溶液以0.2ml/min加入其中后继续反应4～4.2h，获得NC@拉曼信号分子2@Au膜。
6.根据权利要求5所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，所述拉曼信号分子1、拉曼信号分子2为4-巯基苯甲酸、2,3,5,6-四氟-4-巯基苯甲酸、亚甲基、4-巯基苯硼酸中的任意两种，且拉曼信号分子1、拉曼信号分子2具有不同拉曼特征峰。
7.根据权利要求6所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，生长液A由聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和NaOH组成。
8.根据权利要求6所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤2)中，使用划膜仪按照1μL/cm的用量在NC@拉曼信号分子2@Au膜上划出检测线T线和质控C线。
9.根据权利要求1～8任一项所述的制备方法得到的基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条。
10.采用如权利要求9所述的基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用免疫测流试纸条构建不同浓度的待测物与信号分子相对强度之间的标准工作曲线；
2)在疫测流试纸条的样品垫处滴入实际样本或将样品垫部分插入实际样本中，平放10～15min后观察结果。
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