CN103076327A - 一种金标银染定量检测铅离子的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金标银染定量检测铅离子的方法及其试剂盒，特点是包括将载玻片加热清洗干燥，浸入APTES溶液中，于室温下硅烷化处理再用乙醇洗净后，于110-130℃真空干燥1-3h后得到硅烷化载玻片的步骤；将DNA和纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育加水稀释得到特异性DNA-纳米金探针溶液的步骤；将特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液混合后，滴在硅烷化载玻片上室温至试样点完全干燥后，滴银染试剂暗箱静置后，立即用蒸馏水冲洗再干燥的步骤；最后进行金标银染信号的定量分析，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度的步骤，优点是具有高灵敏度、高选择性且可定量分析铅离子浓度，不仅操作简单而且可现场检测。
Description
技术领域
本发明涉及重金属检测技术领域，尤其是涉及一种金标银染定量检测铅离子的方法及其试剂盒。
背景技术
铅（Pb），是重金属之一，在生物体内和环境中残留时间长，对人体神经系统有严重损害，对人体健康产生严重威胁。自然界中的铅主要以离子形式（Pb2+）存在，故实现对铅离子的准确、灵敏、快速的现场检测非常重要。
目前检测铅离子的方法主要有：原子发射光谱法、ICP-MS法、原子吸收光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法、紫外—可见分光光度法、重金属快速测定仪法、试纸条法等。原子发射光谱法、ICP-MS法、原子吸收光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法，准确度和灵敏度高，但均需使用特定的仪器，价格昂贵，操作繁琐，且要求检测人员具备一定的专业知识，分析成本高，无法应用于现场检测，难以普及；紫外—可见分光光度法选择性差，检出限高；重金属快速测定仪法可应用于现场检测，但灵敏度不高、选择性差，样品预处理复杂；试纸条法虽然快速、简便而在现场检测中别具优势，但其只能够定性分析铅离子浓度是否达到该试纸条的检测限，而不能准确定量检测铅离子的浓度。
金标银染（Gold label silver stain）技术将纳米金颗粒与DNA杂交系统结合在一起后，浸入含银离子的银染试剂中，由于纳米金颗粒对银离子的还原有催化作用，银染试剂中的银离子在纳米金颗粒表面被还原为单质银而沉积，呈现出黑色的银染信号。纳米金颗粒数目越多，银染信号的灰度值越大，而纳米金颗粒数目取决于体系中靶DNA或者其他研究对象的数目，因此根据银染信号的灰度值即可定量检测靶DNA或者其他研究对象的浓度。目前，国内外还没有关于将金标银染技术应用于定量检测铅离子的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性且可定量分析铅离子浓度的金标银染定量检测铅离子的方法及其试剂盒。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种金标银染定量检测铅离子的方法，具体包括以下步骤：
（1）硅烷化载玻片的制备
将载玻片置于piranha洗液中，于90-100℃加热20-40min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入1-3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130℃真空干燥1-3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7:3的比例混合得到；
（2）特异性DNA-纳米金探针溶液的制备
a．将10μL的100μM序列为SEQ ID NO:1所示的1DNA与10μL的100μM序列为SEQ ID NO:2所示的2DNA混合均匀，在90°C水浴反应5min，自然冷却至室温后得50μM的脱氧核酶结合物溶液；
b．将500μL23.5nM的纳米金溶液与7.1μL50μM的脱氧核酶结合物溶液混合，4℃培育22-26h后，用蒸馏水稀释100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液；
（3）特异性DNA-纳米金探针与样品反应及银染放大
将步骤（2）所得的特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1-3:2-6混合，振荡摇匀10-20min后，加入1uL的1mM EDTA二钠盐（乙二胺四乙酸二钠），混匀后，取2-4uL混合溶液滴在硅烷化载玻片上，于室温下至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂4-6uL，室温下暗箱静置20-30min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，然后干燥载玻片；
（4）金标银染信号的定量分析
将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度。
步骤（2）中所述的纳米金颗粒的直径为15-30nm，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构如下所示
步骤（3）中所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含0.25g/mL的AgNO3溶液，组分B为0.0425g/mL的氢醌、0.064g/mL的柠檬酸、0.059g/mL的柠檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3:100混合即得银染试剂。
步骤（4）的具体过程如下：
A．用扫描仪将载玻片上的金标银染试样点扫描成图片；
B．利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，令信号的灰度值=255—读出的灰度值，使信号的灰度值仍介于0至255之间，无色最小为0，全黑色最大为255，颜色越深，信号的灰度值越大；
C．设置信号的灰度值阈值为10，取信号的灰度值>10时的有效像素点，求出有效像素点数目；
D．将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，即得金标银染信号的灰度总值；
E．用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，即得到金标银染信号的灰度平均值；
F．配制一系列不同浓度的铅离子溶液，按照前述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系；
G．根据上述步骤获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度。
一种金标银染定量检测铅离子的试剂盒，包括硅烷化载玻片、特异性DNA-纳米金探针和银染试剂，所述的特异性DNA-纳米金探针在纳米金上结合有特异性DNA，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构序列如下所示。
所述的纳米金颗粒的直径为15-30nm。
所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含0.25g/mL的AgNO3溶液，组分B为0.0425g/mL的氢醌、0.064g/mL的柠檬酸、0.059g/mL的柠檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3:100混合即得银染试剂。
发明原理：每个纳米金颗粒表面有30个左右的特异性DNA（脱氧核酶结合物），通过这些特异性DNA，纳米金颗粒可以与其他的纳米金颗粒相连，使纳米金颗粒聚集，这种聚集状态的纳米金颗粒表面较小，对银离子的还原能力较弱。当遇到含有铅离子的溶液时，铅离子会使纳米金颗粒之间的特异性DNA发生断裂，从而使聚集状态的纳米金颗粒转变为分散状态的纳米金颗粒，表面积增大，其对银离子的还原能力增强，还原出来的单质银数量增加，产生的金标银染信号颜色变深，信号灰度平均值升高。铅离子浓度越高，纳米金颗粒的分散状态越好，其对银离子的还原能力越强，还原出来的单质银数量越多，产生的金标银染信号颜色越深，信号灰度平均值越高。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）高灵敏度，检测限达到0.1nM的Pb2+。
（2）高选择性，常见金属离子如Hg2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+对检测均无干扰。原因在于：特异性DNA-纳米金探针对铅离子具有高特异性的识别能力，其它金属离子的干扰可忽略。
（3）操作简单，无需使用特定的仪器，一台扫描仪即可，价格低廉，操作简单，不要求检测人员具备一定的专业知识，分析成本低，可应用于现场检测，易于普及。
（4）可定量分析，通过建立金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，可以得到待测铅离子溶液的准确浓度。采用本方法铅离子溶液浓度在0.1-100nM范围内时，金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度的对数之间呈现良好的线性关系，可用于准确定量检测铅离子浓度。
附图说明
图1为本发明金标银染信号灰度平均值与铅离子浓度的对数之间的线性关系图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
本发明一种金标银染定量检测铅离子的方法，具体包括以下步骤：
（1）硅烷化载玻片的制备
将载玻片置于piranha洗液中，于90-100℃加热20-40min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入1-3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130℃真空干燥1-3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7:3的比例混合得到；
（2）特异性DNA-纳米金探针溶液的制备
a．将10μL的100μM序列为SEQ ID NO:1所示的1DNA与10μL的100μM序列为SEQ ID NO:2所示的2DNA混合均匀，在90°C水浴反应5min，自然冷却至室温后得50μM的脱氧核酶结合物溶液；
b．将500μL23.5nM的纳米金溶液与7.1μL50μM的脱氧核酶结合物溶液混合，4℃培育22-26h后，用蒸馏水稀释100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液；
（3）特异性DNA-纳米金探针与样品反应及银染放大
将步骤（2）所得的特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1-3:2-6混合，振荡摇匀10-20min后，加入1uL的1mM EDTA二钠盐（乙二胺四乙酸二钠），混匀后，取2-4uL混合溶液滴在硅烷化载玻片上，于室温下至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂4-6uL，室温下暗箱静置20-30min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，然后干燥载玻片；其中特异性DNA-纳米金探针的结构如下：
（4）金标银染信号的定量分析
将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度，具体过程如下：
A．用扫描仪将载玻片上的金标银染试样点扫描成图片；
B．利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，每个像素点读出的灰度值介于0至255之间，全黑色最小为0，无色最大为255。考虑数据处理的方便，令信号的灰度值=255—读出的灰度值，通过这种处理，信号的灰度值仍介于0至255之间，无色最小为0，全黑色最大为255，颜色越深，信号的灰度值越大；
C．由于金标银染信号大致为圆形，扫描出的图片周围有很多空白，不能计为有效像素点。因此，设置信号的灰度值阈值为10，也就是信号的灰度值>10时才计为有效像素点，求出有效像素点数目；
D．将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，即得金标银染信号的灰度总值；
E．用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，即得到金标银染信号的灰度平均值；
F．配制一系列不同浓度的铅离子溶液，按照前述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系；
G．根据上述步骤获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度。
具体实施例二
本发明一种金标银染定量检测铅离子的试剂盒，包括硅烷化载玻片、特异性DNA-纳米金探针和银染试剂，特异性DNA-纳米金探针在纳米金上结合有特异性DNA，特异性DNA-纳米金探针的结构序列如下所示。
在此具体实施例中，纳米金颗粒的直径为15-30nm；银染试剂由组分A和组分B组成，组分A为含0.25g/mL的AgNO3溶液，组分B为0.0425g/mL的氢醌、0.064g/mL的柠檬酸、0.059g/mL的柠檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3:100混合即得银染试剂。
在此具体实施例中，硅烷化载玻片过程为：将载玻片置于piranha洗液中，90-100℃加热20-40min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入1-3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130℃真空干燥1-3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7:3的比例混合得到。
具体实施例三
本发明金标银染信号灰度平均值铅铅离子浓度的定量关系的建立，具体包括以下步骤：
（1）载玻片的硅烷化
将载玻片置于piranha洗液中，90℃加热40min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液于室温下硅烷化处理6h，再用乙醇洗净后110℃真空干燥3h，上述piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水以7:3的体积比例混合得到；
（2）特异性DNA-纳米金探针溶液的制备
a．将10μL的100μM序列为SEQ ID NO:1所示的1DNA与10μL的100μM序列为SEQ ID NO:2所示的2DNA混合均匀，在90°C水浴反应5min，自然冷却至室温后得50μM的脱氧核酶结合物溶液；
b．将500μL23.5nM的纳米金溶液与7.1μL50μM的脱氧核酶结合物溶液混合，4℃培育24h后，用蒸馏水稀释100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液；其中特异性DNA-纳米金探针结构如下：
（3）探针与样品反应及银染放大
将10μL步骤（2）所得的特异性DNA-纳米金探针溶液，分别与20μL浓度为0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1.0nM、2.0nM、5.0nM、10.0nM、20.0nM、50.0nM、100.0nM、200.0nM、500.0nM、1000.0nM的硝酸铅溶液混合，振荡摇匀15min后，分别加入1uL的1mM EDTA二钠盐（乙二胺四乙酸二钠）混匀后，取3uL混合溶液滴在硅烷化载玻片上，于室温下至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂5uL，室温下暗箱静置25min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，然后干燥载玻片；上述银染试剂由组分A、组分B组成，其中，组分A为含0.25g/mL的AgNO3溶液，组分B为0.0425g/mL的氢醌、0.064g/mL的柠檬酸、0.059g/mL的柠檬酸三钠的混合溶液，临用前将组分A、组分B按体积比3:100混合即得银染试剂；
（4）金标银染信号的定量分析
第一步、用扫描仪将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片；
第二步、利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，每个像素点读出的灰度值介于0至255之间，全黑色最小为0，无色最大为255。考虑数据处理的方便，令信号的灰度值=255—读出的灰度值，通过这种处理，信号的灰度值仍介于0至255之间，无色最小为0，全黑色最大为255，颜色越深，信号的灰度值越大；
第三步、因为金标银染信号大致为圆形，扫描出的图片周围有很多空白，不能计为有效像素点。因此，设置信号的灰度值阈值为10，也就是信号的灰度值>10时才计为有效像素点，得到有效像素点数目分别为：0.05nM42517个、0.1nM50314个、0.2nM39754个、0.5nM39789个、1.0nM41587个、2.0nM49675个、5.0nM38765个、10.0nM51421个、20.0nM47569个、50.0nM43587个、100.0nM46810个、200.0nM45111个、500.0nM41065个、1000.0nM45678个；
第四步、将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，得到金标银染信号的灰度总值为0.05nM577581、0.1nM681336、0.2nM666047、0.5nM905802、1.0nM1201331、2.0nM1671351、5.0nM1549763、10.0nM2293562、20.0nM2376887、50.0nM2441031、100.0nM2781129、200.0nM2688040、500.0nM2450571、1000.0nM2729715；
第五步、用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，得到金标银染信号的灰度平均值为0.05nM13.58471、0.1nM13.54168、0.2nM16.75421、0.5nM22.76514、1.0nM28.88717、2.0nM33.64572、5.0nM39.97841、10.0nM44.6036、20.0nM49.96715、50.0nM56.00365、100.0nM59.41313、200.0nM59.58769、500.0nM59.67541、1000.0nM59.75995；
第六步、由以上步骤获得的金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系；
以灰度值(y)为纵坐标，铅离子浓度(x,nM)为横坐标作图，如图1所示，金标银染信号灰度平均值与铅离子浓度的对数之间呈现线性关系，线性方程为：y=28.61155+15.88886*logx。线性相关系数R=0.9991。
具体实施例四
本发明金标银染定量检测样品溶液中铅离子的方法，具体步骤如下：
（1）载玻片的硅烷化
将载玻片置于piranha洗液中，95℃加热30min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液于室温下硅烷化处理4h，再用乙醇洗净后120℃真空干燥2h，上述piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水以7:3的体积比例混合得到。
（2）特异性DNA-纳米金探针溶液的制备
a．将10μL的100μM序列为SEQ ID NO:1所示的1DNA与10μL的100μM序列为SEQ ID NO:2所示的2DNA混合均匀，在90°C水浴反应5min，自然冷却至室温后得50μM的脱氧核酶结合物溶液；
b．将500μL23.5nM的纳米金溶液与7.1μL50μM的脱氧核酶结合物溶液混合，4℃培育24h后，用蒸馏水稀释100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液；
（3）探针与样品反应及银染放大
取10μL上述步骤（2）所得的特异性DNA-纳米金探针溶液，与20μL的未知浓度的Pb2+试样混合，振荡摇匀15min后，分别加入1uL的1mM EDTA二钠盐（乙二胺四乙酸二钠）混匀后，取3μL所得的混合溶液滴在硅烷化处理过的载玻片上，室温至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂5μL，准确计时，室温下暗箱静置25min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，干燥载玻片；上述银染试剂由组分A、组分B组成，其中，组分A为0.25g/mL的AgNO3溶液，组分B为含0.0425g/mL的氢醌、0.064g/mL的柠檬酸、0.059g/mL的柠檬酸三钠的混合溶液，临用前将组分A、组分B按体积比3:100混合即得银染试剂；
（3）金标银染信号的定量分析
第一步、用扫描仪将载玻片上的金标银染信号扫描成图片；
第二步、利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，每个像素点读出的灰度值介于0至255之间，全黑色最小为0，无色最大为255。考虑数据处理的方便，令信号的灰度值=255—读出的灰度值，通过这种处理，信号的灰度值仍介于0至255之间，无色最小为0，全黑色最大为255，颜色越深，信号的灰度值越大。
第三步、因为金标银染信号大致为圆形，扫描出的图片周围有很多空白，不能计为有效像素点。因此，设置信号的灰度值阈值为10，也就是信号的灰度值>10时才计为有效像素点，得到有效像素点数目为43601个。
第四步、将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，得到金标银染信号的灰度总值为2314005。
第五步、用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，得到金标银染信号的灰度平均值为53.07229。
第六步、未知浓度的铅离子溶液，按照上述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，根据实例2建立的金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，求算出其准确浓度。根据求得的平均灰度值，带入线性方程y=28.61155+15.88886*logx，可知Pb2+浓度为34.6nM。
具体实施例五
高选择性和高灵敏性的检测试验
按照实施例3的方法分别检测混合溶液（含Hg2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+，各离子浓度均为0.1mM）、0.1nM的Pb2+溶液及空白溶液，结果如表1所示，说明本发明金标银染铅离子定量检测方法具有高选择性。
表1
| 空白溶液 | 混合溶液 | 0.1nM的P52+溶液 | |
| 平均灰度值 | 10.93605 | 11.29004 | 13.54168 |
表1所示的数据表明：混合溶液（含Hg2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+，各离子浓度均为0.1mM）的平均灰度值与空白溶液的平均灰度值基本一致，而显著小于0.1nM的Pb2+溶液的平均灰度值，表明本检测方法具有高选择性且具有高灵敏度，常见金属离子Hg2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+对检测无干扰。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种金标银染定量检测铅离子的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）硅烷化载玻片的制备
将载玻片置于piranha洗液中，于90-100℃加热20-40min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入1-3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130℃真空干燥1-3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7:3的比例混合得到；
（2）特异性DNA-纳米金探针溶液的制备
a．将10μL的100μM序列为SEQ ID NO:1所示的1DNA与10μL的100μM序列为SEQ ID NO:2所示的2DNA混合均匀，在90°C水浴反应5min，自然冷却至室温后得50μM的脱氧核酶结合物溶液；
b．将500μL23.5nM的纳米金溶液与7.1μL50μM的脱氧核酶结合物溶液混合，4℃培育22-26h后，用蒸馏水稀释100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液；
（3）特异性DNA-纳米金探针与样品反应及银染放大
将步骤（2）所得的特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1-3:2-6混合，振荡摇匀10-20min后，加入1uL的1mM EDTA二钠盐（乙二胺四乙酸二钠），混匀后，取2-4uL混合溶液滴在硅烷化载玻片上，于室温下至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂4-6uL，室温下暗箱静置20-30min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，然后干燥载玻片；
（4）金标银染信号的定量分析
将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度。
2.根据权利要求1所述的一种金标银染定量检测铅离子的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的纳米金颗粒的直径为15-30nm，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构如下所示
3.根据权利要求1所述的一种金标银染定量检测铅离子的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含0.25g/mL的AgNO3溶液，组分B为0.0425g/mL的氢醌、0.064g/mL的柠檬酸、0.059g/mL的柠檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3:100混合即得银染试剂。
4.根据权利要求1所述的一种金标银染定量检测铅离子的方法，其特征在于：步骤（4）的具体过程如下：
A．用扫描仪将载玻片上的金标银染试样点扫描成图片；
B．利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，令信号的灰度值=255—读出的灰度值，使信号的灰度值仍介于0至255之间，无色最小为0，全黑色最大为255，颜色越深，信号的灰度值越大；
C．设置信号的灰度值阈值为10，取信号的灰度值>10时的有效像素点，求出有效像素点数目；
D．将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，即得金标银染信号的灰度总值；
E．用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，即得到金标银染信号的灰度平均值；
F．配制一系列不同浓度的铅离子溶液，按照前述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系；
G．根据上述步骤获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度。
5.一种金标银染定量检测铅离子的试剂盒，其特征在于：包括硅烷化载玻片、特异性DNA-纳米金探针和银染试剂，所述的特异性DNA-纳米金探针在纳米金上结合有特异性DNA，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构如下所示
6.根据权利要求5所述的一种金标银染定量检测铅离子的试剂盒，其特征在于：所述的纳米金颗粒的直径为15-30nm。
7.根据权利要求5所述的一种金标银染定量检测铅离子的试剂盒，其特征在于：所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含0.25g/mL的AgNO3溶液，组分B为0.0425g/mL的氢醌、0.064g/mL的柠檬酸、0.059g/mL的柠檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3:100混合即得银染试剂。
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